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MANUAL

DEL DIAGNOSTICO MICROSCOPICO

DE LA

MALARIA

Publicación Científica No. 46 Marzo, 1960

ORGANIZACION PANAMERICANA DE LA SALUDOficina Sanitaria Panamericana, Oficina Regional de la

ORGANIZACION MUNDIAL DE LA SALUD1501 New Hampshire Avenue, N.W.

Washington 6, D. C., E.U.A.

1960

CONTENIDO

Página

1. Introducción ..........................-.... v

2. Microscopios ...................--.......- - 1

3. Iluminación -...........................- 5

4. Parasitología del diagnóstico de la malaria ........--... 11

5. La sangre en relación con el diagnóstico de lamalaria ....-.....-....-......-...-........... 13

6. Definiciones --............................ 16

7. La infección malárica en el mosquito .................-... 18

8. Técnica del examen microscópico ........................... 20

9. Comportamiento de las infecciones por P. falci-parum y P. vivax en el hígado del hombre ............ 25

10. Comportamiento general de las diferentes especiesen la sangre periférica ................-................. 31

11. Comportamiento individual de las especies en lasangre periférica .--..............-....-.-....... 35

12. Preparaciones de gota gruesa .......-..-...................... 46

13. Teoría de la coloración de la sangre ................ :-.... 48

14. Técnicas de coloración en general ..................... 54

15. Técnicas de coloración detalladas ......................... 58

16. Portaobjetos ...........-............-.... 6317. Servicios de laboratorio .............................--....... 75

In

INTRODUCCION

Este Manual ha sido preparado con la finalidad principal

de dar uniformidad a las técnicas de laboratorio usadaspara el diagnóstico microscópico de la malaria en los pro-gramas de erradicación de esta enfermedad. Tiene porobjeto, también, contribuir a la enseñanza de la parasitolo-gía en los centros de adiestramiento para la erradicaciónde la malaria patrocinados por la OSP/OMS o que fun-

cionan con su colaboración. Además, facilitará asimismoel trabajo de los técnicos de laboratorio en los exámenescorrientes de láminas de sangre, en especial de las nega-tivas, que serán la mayoría una vez pasadas las primerasetapas de la erradicación.

Las técnicas que se recomiendan son sencillas y se basanen el examen de una gota gruesa de sangre conveniente-mente preparada. El resultado de la utilización de lastécnicas indicadas se traducirá no sólo en un diagnósticorápido y de alta calidad, sino también en un aumento en laproducción del trabajo diario del microscopista.

Además de las técnicas de laboratorio, figura en esteManual un mínimo de información básica relativa a losciclos vitales de los plasmodios.

Los principios y recomendaciones que contiene este Ma-nual, redactado con la mayor sencillez, permiten su apli-cación a cualquier programa de erradicación de la malaria.

v

MICROSCOPIOS

En los programas de erradicación de la malaria se utili-zan tres clases de microscopios:

1) El microscopio compuesto;2) El microscopio estereoscópico;3) La lupa o lente de mano con un aumento de 2x a 10x.La lupa, que se considera principalmente como un instru-

mento para los trabajos de entomología, resulta de granutilidad para el examen de varias partes del microscopiocompuesto, tales como roscas de tornillo gastadas, crema-lleras deterioradas, partículas endurecidas de aceite y polvoen superficies lisas o de cristal. El microscopio estereoscó-pico puede servir, de esta manera, como complemento dela lupa, y es indispensable para el examen de objetivos cuyaresolución óptica es débil.

Los microscopios compuestos están provistos de soportesmonoculares o binoculares. Algunos fabricantes suminis-tran también, con estos últimos, un tubo monocular.

Según puede observarse en el DIAGRAMA 1 ..... '".'.'".diagrama 1, el cuerpo monocularconsiste en un solo tubo. Por ra-zones de comodidad, se suele in-clinar el microscopio monocularsobre su base, dando al ocularuna dirección semejante a la delos binoculares. Cuando sólo sedispone de monoculares, es con-veniente suministrar tubos mo-noculares inclinados. Si éstos tie-nen una ampliación de 1.5x, debeusarse un ocular proporcional-mente más débil.

Un cuerpo binocular inclinado(diagrama 2) permite al observa- ilililii

dor utilizar el microscopio duranteperíodos prolongados con mucho ii..i imenos cansancio que con un mono- :i" lcular. En el mismo diagrama ......se observará que, para obtenerla misma imagen en ambos ojos,se emplea un equipo óptico adi-.cional considerable. Cabe señalar .:....

.. SkY~ ~ ·1 ............ que no sólo la luz total que va alportaobjetos a través del espejo ydel condensador, queda dividida/ee dos hlaces en el tubo del mi-croscopio, sino que, además, cadalente o prisma, en el sistema bi-nocular, reduce la cantidad deluz que llega al ojo. Por lo tanto,es evidente que la luz necesariapara obtener resultados satisfac-torios con el microscopio monocu-

...... lar, puede resultar totalmenteinadecuada para el binocular.

Por otra parte, cuando unsimple movimiento del tornillomicrométrico es suficiente paraconseguir la máxima resoluciónen la lente monocular, antes deutilizar el aparato se debe prac-ticar un centrado del tubo ocular

ajustable que corresponda al poder resolutivo del ocular enel tubo fijo. El uso del microscopio binocular se complica porel mayor peso del tubo, que al cabo de algún tiempo tiende adeslizarse y no se mantiene enfocado. Por esta razón, sedebe aprender, desde un principio, a ajustar el regulador,que se ha de mantener a constante tensión.

Algunos cuerpos binoculares, frecuentemente de fabrica-ción europea, debido a su complejo sistema de lentes prismá-ticas, pueden aumentar la amplificación de la imagen y, porconsiguiente, llevan las indicaciones de 1.25x, 1.5x, 1.6xy hasta 2.5x. Un binocular de fabricación europea sinaumento de la amplificación lleva en el cuerpo la indicación"lx".

En cuanto a las demás características del microscopiocompuesto, no existe diferencia alguna entre los cuerposmonoculares y binoculares. Cada uno tiene un portaobje-tivo giratorio con tres o cuatro aberturas en las que se fijanlos objetivos. La platina debe tener, encima o incorporadoa ella, un aditamento que sujeta los portaobjetos (carromecánico) que pueda moverse mecánicamente y con preci-sión hacia atrás, hacia adelante y de un lado a otro. Puestoque, prácticamente, todos los trabajos sobre la malaria sonde investigación metódica, no se puede tener la seguridad

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de no haber inspeccionado repetidamente los mismos cam-pos, a menos que se utilice un carro mecánico.

A través de la abertura de la platina, se puede ver lasuperficie más alta de la lente superior del condensadorAbbé, la cual, cuando se encuentra centrada, está exacta-mente en relación con la superficie inferior del portaobjetosque contiene la muestra. La función del condensador es lade concentrar al máximo, en la superficie superior del porta-objetos, toda la luz reflejada por el espejo plano a travésde la lente principal del condensador. El espejo que semantiene fijo directamente debajo del condensador se utilizapara reflejar haces de luz, relativamente paralelos, desdela fuente de la luz al condensador. Para obtener el máximoefecto del condensador se emplea solamente el espejo plano;el cóncavo se utiliza para aquellas operaciones en que sequita el condensador.

La función de todo microscopio es la de aumentar laimagen hasta un tamaño en que puedan apreciarse muchosdetalles con la máxima claridad.

El aumento total que se obtiene en el microscopio com-puesto utilizando el objetivo de inmersión en aceite (por logeneral de 90x a 100x), puede variar de 450x a 1,500x segúnlas lentes u oculares de que se disponga. La experienciademuestra que el aumento en la amplificación del ocular,cuando excede de un punto óptimo, disminuye la claridaddel detalle, es decir la resolución óptica obtenida.

En general, los objetivos que tienen la mayoría de losmicroscopios son de baja potencia ó 10x, de alta potencia ó43x, y de inmersión en aceite, generalmente de 100x, comoya se ha señalado. Los de baja potencia se pueden utilizarconvenientemente con el fin de inspeccionar la preparaciónde sangre para su colocación en el portaobjetos, el aspectogeneral y la coloración, así como la distribución de leu-cocitos. El objetivo de 43x resulta de poca utilidad en lostrabajos malariológicos y se puede eliminar; en su lugarse puede colocar en el portaobjetivo giratorio un indicadorcon el fin de marcar con un círculo los objetos interesantespara nuevo examen. El aumento total se puede calcularcombinando los correspondientes aumentos de los elementosópticos de que se trata, es decir, el ocular, el objetivo y eldel tubo, si existiera. Los técnicos en período de adiestra-miento apreciarán más detalles con un aumento óptimo de600x a 800x. Una vez que hayan adquirido experiencia, tal

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vez observen que con un aumento de 500x realizan su tra-bajo con mayor rapidez, lo cual se debe, por lo general, aque el incremento en la cantidad de luz compensa amplia-mente la pérdida de detalles por la disminución en tamaño.Se pueden utilizar oculares de 5x con aumentos del tubosuperiores a lx. Hay también aumentos del ocular de 6x,6.3x, 6.4x, 7x, 7.5x, 8x y 10x. Este último resulta demasia-do grande para el uso ordinario con el objetivo de inmer-sión en aceite.

En los últimos años se han venido tratando todas lassuperficies de las lentes y prismas expuestos al aire con un"revestimiento" * que compensa la desigualdad de la longi-tud de onda de los colores del espectro. El resultado es unaimportante reducción en la difusión de la luz, de maneraque las lentes y prismas así tratados pueden funcionar ade-cuadamente con mucha menos luz que los que no han sidorevestidos.

Vistas con luz incidental, las superficies revestidas sepueden distinguir por la presencia de un color violeta azu-lado. Este tratamiento se utiliza cada vez más en muchosmicroscopios modernos (véase Iluminación).

En los climas cálidos y húmedos, es indispensable con-servar los microscopios durante la noche, en un armarioo alacena provisto de bombillas u otro medio de calefacción,a fin de que la temperatura no exceda de 35°C. aproxima-damente. Este sencillo procedimiento impedirá el desarrollode micelios fungosos en la superficie de las lentes y prismas.

Algunas veces sucede que, cuando el binocular se enfríaconsiderablemente, por abajo de la temperatura del cuerpohumano, durante la noche, o cuando el instrumento haestado fuera de uso, la resolución, que al principio puedeser buena, de pronto se vuelve confusa. Cuando el calorde la cara del examinador calienta el aire alrededor de losprismas del binocular, puede formarse humedad rápida-mente sobre las superficies frías, la que desaparece tanpronto como las temperaturas del aire y la superficie seigualan.

Un inconveniente que hay con los oculares inclinados,en el trópico y en otros lugares, es que las pestañas se lle-nan de sudor y la grasa pasa a la parte superior del ocular.Lavándose la cara frecuentemente con agua y jabón se

Pelicula contra la reflexión.

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reducirá esta molestia, y se podrá controlar bastante si setienen siempre a mano pedazos de "Kleenex".

ILUMINACION

Los objetos microscópicos en las láminas portaobjetosse buscan y examinan con luz reflejada por el espejo delmicroscopio, a través del condensador. Esta luz atraviesala preparación y llega a los oculares. Estos convierten losrayos luminosos en una imagen que puede ser identificadapor el ojo. Esa luz se llama luz "transmitida", mientrasque la luz que permite el reconocimiento de bandas blancasen los palpos de un mosquito con el microscopio simple(estereoscópico), es luz "incidente". Los pigmentos sólidosde varios colores del espectro aparecen en esos mismoscolores contra la luz incidente; pero con luz transmitida,siendo sólidos, obstruyen el paso de luz y se ven grises onegros.

La luz "blanca" está constituida por todos los colores delespectro y puede ser demostrada con cualquier prisma.Cada color tiene diferente longitud de onda. Cuando laluz blanca encuentra a su paso una superficie de vidrio,cierta porción de rayos es reflejada por la superficie lisa,pero no es reflejada como luz blanca; cada color es refle-jado en diferente ángulo de acuerdo con su longitud deonda específica. El efecto puede ser comparado con unacapa de finas burbujas o espuma en una superficie de aguaa través de la cual se desea ver. La luz que pasa a travésdel agua es obstruida por esta espuma y se necesita muchamás luz para observar lo que está bajo la superficie, quesi no existieran las burbujas. El revestimiento de lentescon una capa contra la reflexión reduce al mínimo la con-fusa reflexión de distintas longitudes de onda y permitetrabajar con una fuente luminosa menor tan bien como seharía con lentes no revestidas y mayor cantidad de luz.El brillo azul-violeta en la superficie de las lentes, vistascon luz incidente, distingue las lentes revestidas de lasordinarias. Algunos fabricantes indican, por medio de unpuntito rosa o violeta en el soporte de metal de la pieza,que ha sido aplicado este tratamiento.

Los microscopios binoculares con sus prismas y a menudocon lentes adicionales, requieren una gran cantidad de luz

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en comparación con el microscopio monocular. La luz totalobtenida se divide entre los dos oculares. Para el micros-copio binocular se requiere cuando menos el doble de luzque para el monocular; por lo tanto, el sistema de revesti-miento en el cuerpo del binocular es una ventaja indiscu-tible.

Quizá ningún otro aspecto de la medicina requiera tanalto grado de microscopia como el que demanda el recono-cimiento de los pequeños parásitos de la malaria que pue-dan encontrarse en una gota gruesa de sangre deshemo-globinizada, generalmente las bacterias pequeñísimas yotros organismos se tiñen solamente de un color y fácil-mente se distinguen por contraste en un fondo de otrocolor. Para el diagnóstico de la malaria es de gran impor-tancia que el fondo sea lo más claro y blanco posible a finde que se destaquen los objetos más pequeños (de 0.5 a2 micras de diámetro) coloreados de rojo y azul.

En comparación, la gota delgada, con una sola capa deglóbulos rojos esparcidos en la superficie de la lámina yde aspecto mayor que el normal, por haber sido extendidosen una superficie muy lisa, puede examinarse con luzmínima y permite reconocer los detalles fácilmente. Poresta razón, nunca debe usarse un extendido para valorarlo adecuado de la luz y la calidad de la imagen. Para conse-guir este propósito particular, debe tenerse a mano, unagota gruesa bien preparada y bien coloreada.

Además el campo microscópico, esto es, el campo micros-cópico de inmersión en aceite, debe iluminarse uniforme-mente con luz blanca azulada en todo momento. Es nece-sario colocar el microscopio, la lámpara y los filtros enforma que permita obtener la mayor cantidad posible deluz. Logrado esto, la luz se puede reducir, por medio deldiafragma iris del condensador, en el grado que desee cadatrabajador.

En un tiempo se pensó que sólo la luz del día era la idealpara el microscopio de entonces, es decir el mónocular; losantiguos observadores se colocaban cerca de una ventanaorientada hacia el norte y el espejo se instalaba para re-flejar la luz de las nubes blancas. Empleada en esa formala luz del día, a pesar de que es inconstante, puede seguirconsiderándose como una buena fuente de iluminación parael microscopio monocular. Para el binocular, solamente laelectricidad puede proveer una fuente constante de luz uni-

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forme. Sin embargo, la electricidad agrega un factor im-portante: la marcada coloración amarillenta que tiene fre-cuentemente.

Hay muchos tipos especiales de lámparas para micros-copio excelentes para los trabajos malariológicos, así comohay otras que no satisfacen las necesidades de las mismas.Hay que reconocer que muchas lámparas de alta calidadhan sido diseñadas específicamente para microfotografía,y esas lámparas no se necesitan en los programas de erra-dicación de la malaria. Para ellos resulta plenamente ade-cuado el empleo de aparatos más sencillos.

Por lo tanto no hay ni que pensar en fuentes de ilumina-ción que dependan del uso de tipos especiales de focos.Deben adoptarse sólo aquéllas en las que se puedan usarlámparas obtenibles en el mercado local; a las lámparas conenchufes especiales deben cambiárseles éstos siempre quesea posible. No deben comprarse fuentes de iluminaciónincorporadas al propio microscopio sino que se debenpedir los espejos usuales.

Como no es posible utilizar luz directa del sol para losmicroscopios, debido al resplandor, tampoco es posible usarfocos de vidrio transparente. Si los focos son transparentes,es necesario utilizar un filtro de vidrio esmerilado incorpo-rado a la lámpara o situado directamente debajo del con-densador del microscopio. Cuando se usan fuentes de luzde poca intensidad, es preferible usar un filtro delgado deesmeril fino, y, por el contrario, cuando se utilice una fuenteluminosa más intensa, el filtro deberá ser más grueso. Fre-cuentemente el grado de esmerilado del filtro suministradojunto con la lámpara es tan grueso, que impide considera-blemente el paso de luz de tal manera que la que llega almicroscopio resulta insuficiente. A menudo, también secombina el filtro de vidrio esmerilado con un filtro azul ylos dos juntos reducen la luz a un nivel inferior al necesariopara el trabajo.

Es indispensable usar algún tipo de filtro azul con elobjeto de obtener un fondo azul-blanco necesario para laobservación completa de leucocitos, parásitos y plaquetas.Frecuentemente los círculos de vidrio azul usados bajo elfiltro son demasiado azules para la fuente de luz, o biencuando se usan en combinación con el filtro de vidrio esme-rilado se reduce la luz excesivamente.

Los focos de 110 voltios dan un calor proporcional al

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número de vatios, de aquí la necesidad de transformadoresy lámparas especiales de bajo voltaje. Sin embargo, conuna ventilación apropiada, el calor de los focos de 100 vatioso menos, puede tolerarse. No pueden usarse bombillasdescubiertas o sin protección porque el resplandor deslum-bra al operador o a los que se encuentran a su alrededor.

La explicación anterior se refiere sólo al uso del objetivode inmersión en aceite, pues muchas fuentes de iluminaciónson satisfactorias para observaciones anatomopatológicasy exámenes de materias fecales, de orina, etc., pero no pro-ducen bastante luz para observar los parásitos de la ma-laria.

Un ejemplo de iluminación adecuada para microscopiosmonoculares es la bombilla ordinaria de 60 vatios, de lasllamadas "luz del día" azul-blanca. Esta bombilla colocadaen una base de porcelana y convenientemente oculta portres lados da una cantidad adecuada de luz azul-blanca, sinque se requiera filtro alguno.

Aproximadamente se necesitan 150 vatios para un micros-copio binocular de uso común; pero como el color azul yel grado de esmerilado es el mismo que el de un foco de60 vatios, el azul resulta insuficiente para tanta luz yentonces se requiere otro filtro azul. Cualquier lámpara de150 vatios da una luz que produce un calor excesivo paraque resulte práctica. Una lámpara dotada de una serie defiltros, usualmente tiene una bombilla transparente especialcomo fuente luminosa y no debe ser usada. El modelo AHTCat. No. 6598 es un antiguo diseño alemán para observa-ción en campo obscuro (precio Dls. 33.00). No es necesarioutilizar el foco transparente de 200 vatios destinado a laobservación en campo obscuro, ni tampoco el filtro de vidrioesmerilado y su soporte; estos últimos deben desmontarse.Una bombilla esmerilada corriente de 100 vatios colocadadetrás de un matraz de 250-300 cc., es muy adecuado si elagua que contiene dicho matraz se tiñe ligeramente de azul.Para lograr esto, se agrega al agua del matraz un númerosuficiente de gotas de una solución de "luz de día artificial"(9 cc. de solución de sulfato cúprico al 20g + 1 cc. deanilina azul al 0.6%. Esta solución se cambia conforme seanecesario.

La fuente luminosa debe estar rodeada de algún mate-rial opaco, excepto donde brilla sobre el espejo del micros-copio. El tipo "Chalet" de iluminador (American Optical

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No. 361 sin vidrio esmerilado o azul, Dls. 16.00) puedecontrolar el resplandor y aguantar el foco de 60 ó 100 vatiossuspendido en la parte de arriba. El matraz azul se colocasobre bloques en una posición apropiada entre la lámpara yel espejo.

DIAGRAMA 3

-- 25I -I a

Las instalaciones anteriormente descritas pueden serfácilmente improvisadas usando cartón obscuro (papelaislante), una base o un portalámparas de porcelana y dosmetros de alambre. Como se observa en el diagrama 3,la posición de la zona más brillante del foco, el centro delmatraz esférico, que actúa como lente, y el espejo, coloca-dos a las alturas convenientes cada uno en relación conel otro, tiene la mayor importancia si se desean obtenerresultados óptimos. Se pueden usar algunos bloques demadera de 1 a 2 cm. de grueso, para que el foco y el matrazestén a la altura apropiada.

Un fotómetro electrónico que marque el número de bu-jías/pies que alcanza al ojo, es muy útil para demostrar alestudiante que sus esfuerzos para obtener el máximo de luzse pueden mejorar. Una pieza de equipo muy valiosa paraenseñar cuál es la iluminación apropiada de un microscopioy para demostrar con exactitud qué cantidad de luz real-mente llega al ojo, es el fotómetro de la Photovolt Corpora-

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tion, modelo No. 200-M. Una delicada célula fotoeléctricaregistra las bujías/pies en una escala de 100 divisiones.Cuando el marcador indica "HI" la escala completa repre-Qnt+r dr1n hiía/nipQ H dP 0.02 huiis/ripo npor división;cuando marca "LO" la sensibilidad se reduce un 10:1. Unadaptador especial que sirve con cualquier ocular mide laluz al nivel de la pupila de los ojos. Con el marcador en"HI" la aguja se ajusta en algún punto, como 20 ó 30, loque le permite oscilar libremente. Los resultados se expre-san en número de divisiones recorridas o en decimales debujías/pies. El promedio de lectura de luz que se usa gene-ralmente con un microscopio binocular es de 1.5 a 4 divi-siones. A menudo se puede mejorar de 8 a 12 divisionesmás, haciendo un ajuste adecuado de todos los factores enjuego.

Los mismos principios que se demuestran en el diagramaNo. 3 pueden ser aplicados a una lámpara improvisadacomo la que se representa a la izquierda del diagrama 4.Este diagrama 4 es un dibujo a escala de esta lámpara, la

DIAGRAMA 4PORTAOBJETOS SECANDOSE

PATRON

8/" ,4,.--" -T"------

PARA DOS MlCROSCOPiOS 1T/. ,, - , , PARA UN MICROSCOPIO

cual se une por medio de sujetapapeles de bronce. Cuandodos trabajadores se sientan uno frente al otro se usan dosaberturas. Cuando se trabaja frente a la pared no essiempre necesario el aparato completo; a la derecha (dia-grama No. 4) figura una variante de la lámpara, en formade máscara.

Los focos esmerilados de 100 vatios varían considerable-mente, no sólo en forma y tamaño, especialmente en longi-tud, sino también en la cantidad de luz que dan y el gradode deterioro al ser usados. Algunos de calidad inferior

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obscurecen de tal manera el interior del esmerilado quellegan a producir una pérdida de 306%.

La ceguera para los colores afecta la labor del micros-copista. Sería conveniente, en la medida de lo posible,someter a los candidatos a una de las pruebas de la visiónpara los colores.

PARASITOLOGIA DEL DIAGNOSTICODE LA MALARIA

La parasitología es una rama de la ciencia que trata delos parásitos de todas clases. Los parásitos constituidospor una sola célula se llaman protozoarios, y los integradospor más de una célula, hasta llegar a millones de ellas, sonconocidos con el nombre de metazoarios.

La posición de los parásitos de la malaria, en el esquemageneral de los protozoarios, puede observarse en la gráficamural que se muestra como explicación, sin que se pretendaque sea retenida en la memoria. Los parásitos unicelulareso protozoarios no sólo incluyen los plasmodios de la malariahumana sino también las amibas, como la que causa ladisentería (Endamoeba histolytica); los tripanosomas quecausan la enfermedad de Chagas y la enfermedad del sueño;las leishmanias que causan enfermedades de la piel y mani-festaciones patológicas generales tales como la úlcera delos chicleros, el Kala-azar infantil, etc.

Además de los que producen enfermedades, hay muchosparásitos completamente inofensivos, y se requiere un adies-tramiento especial para distinguirlos. Afortunadamente,los parásitos de la malaria no tienen un equivalente de tipoinofensivo que complique su identificación.

La amiba puede servir como ejemplo de célula única uorganismo unicelular del amplio grupo o "phylum" llamadoprotozoario, y una descripción breve de ella ayudará alestudiante que quiera consultar libros al respecto.

La amiba consiste en una masa de substancia gelatinosallamada protoplasma, cuya porción periférica, que es másdensa, forma una membrana que sirve de límite. Dentrodel protoplasma se encuentra una estructura circular demayor densidad llamada núcleo. El núcleo puede presentaruna mancha central más densa que es el nucléolo.

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El protoplasma que se encuentra alrededor del núcleo sedenomina citoplasma; la porción granular recibe el nombrede endoplasma y la parte clara y transparente, el de ecto-nplasma. Dentrn del itnnlama se podrá apnreciar un clarollamado vacuola, en donde se digieren las partículas ali-menticias englobadas por el citoplasma.

Las amibas se reproducen por fisión binaria o fisipari-dad; el núcleo se divide en dos partes, y diferentes porcio-nes del citoplasma acompañan a cada uno de los frag-mentos en que se dividió el núcleo.

La amiba se mueve y rodea su alimento proyectando pro-tuberancias en la membrana dentro de la que fluye el cito-plasma. Estas protuberancias se llaman pseudópodos. Losparásitos de la malaria pueden moverse igualmente. Elmaterial nuclear recibe el nombre de cromatina. Cuandollegan a la madurez, sus núcleos se dividen en muchos frag-mentos (8-30), lo cual se denomina esquizogonia.

A continuación presentamos un diagrama de la amibay los parásitos.

PLASMODIUM

ANILLOS O TROFOZOITOS JOVENES TROFOZOITOS ESQUIZONTES

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LA SANGRE EN RELACION CON ELDIAGNOSTICO DE LA MALARIA

La sangre es el medio en que se hallan los parásitos dela malaria. El hecho de que no se revelen en los exámenesmicroscópicos no quiere decir que no estén presentes en elmomento en que se toma la sangre, sino que posiblementesu número es demasiado pequeño para ser determinado enexámenes ordinarios. Por ejemplo, en Ghana, en una clí-nica prenatal, algunas mujeres fueron cuidadosamente vigi-ladas mediante exámenes regulares de gota gruesa de 100campos en cada caso. Se encontraron gametocitos de P.falciparum en un 7 %. Cuando se prepararon 10 gotasgruesas simultáneamente, y se hicieron exámenes de 100campos en cada una de ellas, el 20%o mostraron gameto-citos. Como dato interesante, observamos que seis exá-menes fueron suficientes para encontrar un 18 % de casospositivos, y cuatro exámenes posteriores solamente pro-dujeron otros dos casos.

El único modo de confirmar que una persona no tieneparásitos en la sangre, consiste en subinocular 2-400 cc. desangre a un voluntario humano. Si no hay parasitemia,se puede afirmar que la sangre es negativa.

Hay que tener en cuenta también, que la sangre de unindividuo sano y bien nutrido, puede ser completamentediferente de la de una persona que ha padecido de malariao de alguna otra enfermedad debilitante, durante un tiem-po considerable. Se pueden producir cambios en elaspecto normal de los parásitos por alteraciones en losglóbulos rojos, muy independientemente de la especie deinfección malárica de que se trate.

A pesar de la aparición de parásitos en la gota gruesadeshemoglobinizada, los parásitos de la malaria no puedentener una existencia independiente. Excepto en los brevesperíodos en que se mueven de una célula a otra, son intra-celulares, y se encuentran principalmente en los glóbulosrojos. Puesto que la sangre es el vehículo que trae el pará-sito a nuestro campo visual, es importante saber algo acercade ella.

La sangre está constituida por un liíquido llamado plasmaen el cual se encuentran los glóbulos blancos o leucocitos,los glóbulos rojos o eritrocitos, y las plaquetas sanguíneas.Cuando la sangre integral se deja en reposo en un tubo deensayo, se coagula debido a la interacción de las plaquetas

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y elementos del plasma que producen fibrina. Cuando lamasa esponjosa de fibrina, que contiene la mayor parte deglóbulos rojos, se contrae y forma un coágulo, el sueroamarillo claro se separa al dejarse el contenido del tubo enreposo. Una gota de sangre en un portaobjetos, a menosque sea extendida rápidamente, se coagulará exactamentedel mismo modo que en el tubo, con un cambio considerableen el plasma, que afecta el modo en el que la preparaciónse adhiere al portaobjetos. Si se remueve la sangre despuésque comienza la coagulación, se producirán áreas de dife-rentes espesores, y distintas concentraciones de células, quepueden reconocerse fácilmente al ser examinadas con elobjetivo de baja potencia. Se verán hileras o aglomera-ciones de leucocitos, en vez de la distribución regular y uni-forme de los mismos en la preparación esparcida rápida-mente.

La parte líquida de la sangre contiene tantos anticuerposcomo produce el organismo y proporciona un medio liíquidode mantener húmedos los parásitos y las células. La faltade humedad destruye a ambos. La porción celular pro-porciona una variedad de elementos en las preparacionesde la sangre, que no solamente ofrecen información acercadel paciente sino que ayudan a evaluar la calidad de lapreparación y su coloración.

Elementos celulares (eritrocitos, leucocitos y plaquetassanguíneas) se desarrollan en su mayoría en la médula óseay pasan a la circulación periférica según los requerimientosdel organismo.

Las plaquetas sanguíneas son fragmentos del citoplasmade una especie de células de la médula ósea llamadas mega-cariocitos. Pueden ser irregulares en tamaño, forma ydensidad, pero todas presentan variaciones de un mismocolor en una determinada preparación. En sangre des-fibrinada o que se haya secado lentamente, su aspecto puedevariar enormemente.

Los eritrocitos también se derivan de un tipo de célulasde la médula ósea y los estados primarios contienen núcleo.Justamente antes de ser liberados a la circulación el núcleose pierde y los glóbulos rojos jóvenes, de tamaños variables,pueden contener elementos fáciles de teñir de azul (loscuales se ven solamente con coloraciones extremas del ex-tendido) que se describen como "reticulum" (de reticulo-

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citos), policromasia y basofilia punctata; todos los cualesdesaparecen en un período de 1 a 3 días.

Una gota de sangre fresca colocada en un portaobjetoscubierta con un cubreobjetos y examinada con luz muyreducida por la cerradura del diafragma iris, puede serexaminada bajo objetivos de baja potencia (10x) y de altapotencia (43x). El objetivo de inmersión en aceite tambiénse puede usar si la acción de enfocar no mueve las células.Los eritrocitos son discos bicóncavos que aparecen aislados,o en grupos como pilas de monedas. Cuando se presionasuavemente el cubreobjetos se ve que pueden ser objeto degran distorsión sin sufrir ruptura. Son de color amarillentoo amarillo obscuro, por su contenido abundante de hemo-globina, en la cual los parásitos, si están presentes, sólopueden ser reconocidos si son lo suficientemente grandescomo para contener pigmento. Por lo tanto, el examen desangre fresca no es práctico. Los glóbulos rojos tienen unaduración máxima de vida de 120 días.

Bajo condiciones variables a su alrededor, la aparienciade los glóbulos rojos puede alterarse enormemente. Ensuero o solución de 0.85% de cloruro de sodio, conservansus bordes periféricos lisos. Si la cantidad de sal se dismi-nuye a 0.5%, la célula muestra pequeñas protuberanciasen su superficie exterior, semejando una mina submarinade contacto. Estas células se denominan de "crenación" ypueden conservar este aspecto aún después de coloreadas.Las soluciones que conservan las células en su estado nor-mal se llaman soluciones normales (sueros fisiológicos).El exceso o la insuficiencia de sal causan la ruptura de losglóbulos rojos liberando su hemoglobina, y el agua se tornay permanece rojiza.

La exposición a fuertes alcoholes o al calor, o simple-mente al transcurso del tiempo, "fijarán" la hemoglobinade las células y no se producirá deshemoglobinización. Deahí la necesidad de colorear las gotas gruesas tan prontocomo sea posible una vez que han sido extraídas.

Leucocitos. La aptitud para reconocer los glóbulosblancos más comunes una vez coloreados, permite unadescripción exacta del campo microscópico de una prepara-ción de sangre. En preparaciones de sangre fresca losleucocitos son transparentes y muy "refringentes" y pue-den mostrar movimiento del citoplasma. Su núcleo toma uncolor violeta azulado cuando se colorea. El núcleo varía en

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tamaño y forma, y el citoplasma puede ser claro o granu-lar, de acuerdo con el tipo de célula. La vida de un leu-cocito es breve, de unos cuantos días solamente, de modoque la apariencia de algunos de los tipos polimorfonuclearesvaría desde elementos sólidos, perfectamente definidos, bienteñidos, a células grandes, pálidas e irregulares y a menudodesfiguradas.

El diagrama 6 ofrece una breve descripción de los leu-cocitos más comunes.

DEFINICIONESTérminos relativos a formas del parásito en el hombre

Trofozoitos

Esquizontes

Esquizontes maduros

Merozoitos

Eritrocíticas

Exoeritrocíticas

Gametocitos

-parásitos asexuales, jóvenes, nodivididos; los trofozoitos másjóvenes de cada especie se deno-minan generalmente "anillos" o"formas anulares".

-todas las formas adultas asexua-les, con dos o más divisiones delnúcleo.

-esquizontes totalmente desarrolla-dos en los cuales los merozoitosestán completamente formados.

-producto de la segmentación deun esquizonte hepático o un esqui-zonte eritrocítico. Pueden estarseparados del esquizonte originalo contenidos en él.

-todas las fases del parásito dentrode los glóbulos rojos.

-fases hepáticas en el hombre. Pre-eritrocítica cuando se deriva delos esporozoitos; exoeritrocíticacuando se deriva de otras faseshepáticas. Estas últimas no ocu-rren en las infecciones de falci-parum.

-formas sexuales que se desarro-llan y maduran en el mismo gló-bulo rojo. Los gametocitos de P.falciparum se denominan común-mente "medias lunas".

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DIAGRAMA 6

LEUCOCITOS S

POL MORFONCL EARES

EOSINOFILO

ERITROCITOS

MONOClTO

LINFOCITOS

PLAQUETAS

yL. ~ .- :.1 1.7

MICRO MACRO

18

Esporozoitos

Ooquiste

Hematina o

-formas infectivas que resultan dela última división del ooquiste enel mosquito.

-se desarrolla del gameto fertili-zado entre las células de revesti-miento del estómago del mosquito.

hemazoina-nombre que se le da al pigmentoque se encuentra en los parásitosen desarrollo y completamentedesarrollados.

Cromatina -el material nuclear coloreado ro-jo, del parásito.

Citoplasma -protoplasma teñido azulado delparásito.

Términos secundarios:Granulaciones de manifestaciones que aparecen enSchüffner la parte no infectada del glóbuloPuntos de Maurer rojo que contiene infecciones dePuntos de Ziemann vivax, falciparum o malariae

respectivamente.Son visibles únicamente en los extendidos debido a que elcolorante que se utiliza es de calidad superior.

LA INFECCION MALARICA EN EL MOSQUITO

La siguiente descripción deberá ser omitida si se exhibela película editada por el Prof. Shortt. Esta película setitula "Ciclo de vida del parásito de la malaria" y la distri-buye la Imperial Chemical Industries. Hay ediciones eninglés y en español.

La película corta en blanco y negro, producida por elCentro de Enfermedades Transmisibles, Servicio de SaludPública de los Estados Unidos, Atlanta, Georgia, presentaen cinemicrofotografía la picadura del mosquito, y deberáproyectarse siempre que sea posible, con el fin de demostrarque la inyección de esporozoitos es esencialmente intra-vascular, más bien que como se describe en la otra películaantes mencionada.

La necesidad de obtener sangre para la maduración delos huevos ya fertilizados, es lo que induce al mosquito ano-feles hembra a picar a un animal de sangre caliente, Si

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ese animal es un hombre que padece una infección biendefinida de alguna de las especies maláricas, la sangrecontendrá formas sexuales del parásito, así como formasasexuales que son las causantes de los síntomas.

Estas últimas, al llegar al estómago del mosquito muerenrápidamente y son digeridas, pero las primeras, los game-tocitos, escapan de su correspondiente glóbulo rojo. Elgametocito macho más pequeño rápidamente produce ele-mentos espermatozoides movibles que se desprenden de sunúcleo y se alejan en el líquido que lo rodea. El gametocitohembra más grande sufre un proceso de maduración quecapacita a un microgameto movible a entrar y moverseactivamente dentro del citoplasma del macrogamento.

En unas cuantas horas un oocineto activamente moviblese desarrolla y se introduce entre las células de revesti-miento del estómago del mosquito para venir a descansarbajo la membrana que separa las células de revestimientode la cavidad del cuerpo del mosquito. Aquí el materialnuclear unido comienza a multiplicarse en la célula grandealtamente refringente que aún conserva el pigmento origi-nal del gametocito hembra. Un ooquiste esférico comienzaa crecer más y más, proyectándose más adelante en la cavi-dad alrededor del tracto intestinal del mosquito. Despuésde dos o tres semanas el ooquiste, dilatado con miles decuerpos diminutos como vellos, llamados esporozoitos, conte-niendo cada uno un pequeño trozo de cromatina, revientadescargando los esporozoitos maduros en la cavidad, llenade fluido, del mosquito. La corriente de fluido del cuerpoconduce los esporozoitos al tórax del mosquito. Una vezen las células de las glándulas salivales, permanecen allíaguardando su destino.

La película corta sobre la picadura del mosquito demues-tra que la proboscis sondea repetidamente hasta que llegaal lumen de un capilar o pequeña vena. Durante las opera-ciones de picar y absorber, se expulsa saliva y los esporozoi-tos que ésta contiene son inyectados intravascularmentecomo lo haría una aguja en una vena. Por subinoculación,éstos se pueden ver circulando hasta 10 minutos, rara vezhasta 30 minutos. Puesto que toda la sangre pasa a travésdel hígado cada tres minutos, es relativamente fácil quemuchos esporozoitos penetren en las células del hígado,adyacentes a los sinusoides llenos de sangre. Indudable-mente muchos son atrapados por los fagocitos; pero

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aquéllos que logran su objeto comienzan a multiplicarseinmediatamente en el hígado, lo que dura de 6 a 8 ó 9 díascompletos. La forma creciente en el citoplasma de las célu-las del hígado se extiende y su núcleo se divide repetida-mente hasta que se rompe el esquizonte maduro, grande, deforma irregular. Numerosos merozoitos del hígado se abrenpaso entre las células vecinas al sinusoide más cercano quecontenga glóbulos rojos. La fase pre-eritrocítica, termina, yla enfermedad que produce la fase eritrocítica comienza. Alfinal de cada período de 48 horas muchos esquizontes eri-trocíticos maduros revientan y grupos de pequeñísimosmerozoitos se apresuran a penetrar en otros glóbulos rojos,antes de ser capturados por los monocitos fagocíticos yotras células.

TECNICA DEL EXAMEN MICROSCOPICO

Según puede observarse en las demostraciones micros-cópicas, las gotas gruesas de sangre exigen una cantidadde luz considerablemente mayor que los frotis o extendidos.

Para evitar la pérdida de tiempo, por no prestar atencióna detalles aparentemente insignificantes, se sugiere elempleo habitual del siguiente procedimiento en el examende todo espécimen sanguíneo nuevo:

Colóquese una gota de aceite de inmersión*cerca del borde de la gota gruesa de sangre.Sitúese el portaobjetos cuidadosamente en posi-ción entre las agarraderas del carro mecánico dela platina de manera que quede bien firme. Estoes importante porque frecuentemente hay que exa-minar de nuevo objetos dudosos o sospechosos.Se puede perder mucho tiempo tratando de centrarnuevamente los objetos perdidos de vista por nosujetar debidamente el portaobjetos en la platina.

Cuando se encuentra un área que contiene leucocitos bienconservados, se situarán uno o más de los mejores en elcentro del campo. Mientras se observan, se mueve amplia-mente el regulador de precisión (tornillo micrométrico) en

* Nunca debe utilizarse aceite de cedro. Existen varios productos sintéticosmodernos del mismo índice refractor, tales como los de Cargille (Shillaber), Crown.de densidades gruesas y finas. Se puede preparar un aceite de inmersión muy delgadosatisfactorio con 82 partes de petrolato liquido pesado, Farmacopea, E.U.A. (Nujol).y 18 partes de alfa-bromonaftalina (se puede obtener en Destillation Products In-dustries, 775 Ridge Road West, Rochester 3, New York).

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una distancia de 40 a 60 micras. Si los leucocitos parecenmoverse radialmente en cualquier dirección, se debe ajustaral espejo plano hasta que, con el movimiento del tornillo mi-crométrico, parezca que esos leucocitos se desplazan sobreel mismo punto sin indicios de movimientos radiales. Lamisma maniobra puede demostrar también que la ilumina-ción, en las debidas condiciones, es menos amarilla queantes. De no ser así, se debe comprobar si el condensadorestá en su punto máximo; si la luz sigue amarilla, esnecesario comprobar su fuente y los filtros para ver siestán en posición adecuada y son del color apropiado. Sila luz es demasiado azul, hay que alterar las condicionesbásicas para corregir esta irregularidad.

Se observan entonces los colores de los núcleos de losleucocitos. Han de tener éstos un color azul-violeta intenso;el citoplasma de los linfocitos debe aparecer azul pálido, elcitoplasma de los neutrófilos polimorfonucleares debe mos-trar gránulos de tamaño irregular, variando el color deazul a rojo. Los gránulos del citoplasma de los eosinófilos,regulares en tamaño y forma, deben ser de un matiz cobre-rojizo intenso, más bien que el acostumbrado color rosavivo de los tejidos coloreados con eosina. Se deben encon-trar plaquetas en grupos de dos, tres o más, y notar su coloren cada preparación. Este color puede variar entre rojoclaro, violeta y azul claro. En ciertas muestras de sangreel área clara entre los leucocitos puede mostrar áreasazuladas, bien sean brumosas o formadas por densos puntosazules, que son los restos de los glóbulos rojos de más re-ciente formación después de la coloración y deshemo-globinización simultáneas.

La cuidadosa atención a esta forma de valoración aho-rrará mucho tiempo. Unicamente cuando se encuentran esoscolores en los elementos normales de la sangre, se puedeesperar que los parásitos presentes se revelen en suscolores apropiados. Así, si el núcleo es excesivamente rojoen un área determinada de una muestra, es poco probableque se descubra color azul en el citoplasma de los parásitos.Por otra parte, si los leucocitos son demasiado azules conpoco violeta en su núcleo, no es probable que la cromatinadel parásito muestre color rojo suficiente. En estas dosúltimas condiciones es conveniente recorrer ampliamente lagota gruesa en busca de un área donde los leucocitos esténmejor coloreados. Esto último se puede conseguir rápida-

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mente, extendiendo aceite sobre toda el área de la sangrecoloreada y observándola con el objetivo de baja potencia(10x).

Durante estas operaciones se observará si las células enque se examina el color aparecen o no con imágenes com-pletas, buenas y claras; es decir, si la resolución del contornode un polimorfonuclear intacto se ve claramente y en de-talle. Por supuesto, si la imagen es manifiestamente pococlara, se tendrá que localizar y corregir la causa, antes decontinuar el examen.

Estamos ahora en condiciones de examinar la muestra.Debido a que hay pocos campos microscópicos, con el obje-tivo de inmersión en aceite, que son completamente planos,cuesta mucho tiempo tratar de examinar en detalle cadauno de los objetos del área iluminada. Todo objeto que re-quiera examen cuidadoso, se debe situar en el centro delcampo donde la resolución es mejor. Por lo tanto, para finesde investigación, el campo microscópico puede limitarse ala parte central del campo que se encuentra en un focobastante claro, simultáneamente con el punto central. Estopuede incluir a lo sumo 2/3 del área efectiva (campo micros-cópico práctico).

Comenzando en un borde de la gota gruesa, el porta-objetos se mueve en forma de zig-zag debajo del objetivo,con la máxima rapidez compatible con la visualización deesta área central, y cada vez que se examina una nuevaárea de las mismas dimensiones, se considera que consti-tuye un campo microscópico.

Para compensar las variaciones personales de los obser-vadores, el examen de una muestra no se debe medir por lacantidad de minutos invertidos, sino por el número decampos observados. El número de campos observados portécnicos, bajo supervisión, ha variado de 39 a 215, duranteel mismo período de observación. Una gota gruesa de san-gre, aproximadamente de 3 a 4 cm. cuadrados, puede con-tener de 500 a 800 campos microscópicos. Es evidente quesólo en circunstancias muy especiales, como en las pruebasde infecciones y ensayos de drogas, puede hacerse el examende toda la preparación. En los casos en que los síntomasen un paciente febril son producidos por la malaria, por logeneral los parásitos se encuentran fácilmente, es decir, hayvarios en cada campo. Cuando son escasos se puede anotar

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la proporción correspondiente a 100 campos microscópicos;Ej :37/100.

Si el observador ha estado examinando portaobjetos conpreparaciones similares durante el mismo día, la identifi-cación de la cromatina será automática, pero si no se hausado el microscopio durante algunos días, es convenienteencontrar algunos parásitos que no sean dudosos a fin deorientarse en cuanto a la densidad específica y caracterís-tica que uniformemente presenta la cromatina. Cuando enuna preparación aparezca un solo parásito, hay que pro-ceder con cautela en el diagnóstico: hay que encontrar porlo menos tres parásitos. Ya no se buscan formas específicasdel parásito, sino más bien se examinan tantos parásitosdefinidos como sea posible observar, para determinar eltamaño del mayor, el del menor y el de la mayoría. Sesugiere que una buena lámina positiva se examine por lomenos en 50 campos a fin de no pasar desapercibida laevidencia de una infección secundaria.

Si se desea investigar cualquier hallazgo poco corriente enla gota gruesa de sangre, se puede examinar el frotis oextendido con la esperanza de encontrar formas que puedanexplicar una apariencia poco frecuente, por ejemplo, lasformas de rosca, de esquizontes y pre-esquizontes de P.vivax y P. malariae. Resultaría poco prudente tratar dediagnosticar las especies en el extendido con menos de 10parásitos.

Como se explicará más adelante, el único diagnósticoposible para cualquier muestra de sangre, puede ser ex-presado por la combinación de alguna de las abreviaturassiguientes:

1. P. falciparum-anillos solos (F)2. P. falciparum-anillos y gametocitos (F + g)3. P. falciparum-gametocitos solos (Fg)4. P. vivax-todos los estadios juntos o (V)

en algún momento durante e! ciclode 48 horas

5. P. malariae-todos los estadios juntos (M)o en algún momento durante elciclo de 72 horas

6. P. ovale-todos los estadios juntos o (0)'en algún momento durante el ciclode 48 horas

I No es aplicable al Hemisferio Occidental. En los países en que está presente elP. ovale, se debe utilizar la palabra "nada" para caso negativo.

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Si se encuentran presentes dos especies plasmodiales,debe indicarse una proporción numérica entre la infeccióndominante y la secundaria: por ejemplo: 75V, 7Fg/100campos; 75V significa que la infección dominante es vivax;mientras que la falciparum es solo una infección secun-daria.

La palabra "negativo" tiene un alcance relativo, perogeneralmente indica que no se encontraron parásitos en elexamen de 100 campos ni en ningún otro examen deter-minado.

Medidas para el examen microscópico correcto de unagota gruesa de sangre

1. Utilícese una silla de altura apropiada.2. Quítese todo rastro de aceite de inmersión, polvo, hue-

llas digitales, etc., de todo el aparato, usando para elloun trapo suave o papel fino tipo "Kleenex." Cercióresede que el carro del microscopio se mueve libremente enambas direcciones.

3. Compruébese si el condensador ha sido colocado en suposición correcta, es decir, lo más arriba posible, que eldiafragma iris está completamente abierto y que elespejo plano tiene la inclinación que le permita reflejarel máximo de luz.

4. Límpiense perfectamente las superficies externas de losoculares y del condensador.

5. Compruébese si la altura del foco es la óptima, enrelación con el matraz azul y de que la altura y proxi-midad de ambos permitan obtener el máximo de luzsobre el espejo. Obsérvese diariamente si la soluciónque contiene el matraz no presenta precipitados, nipérdida de color.Si hay que observar la preparación con el objetivo 10xes necesario cerrar un poco el diafragma iris.

6. Determínese el área de la gota gruesa que tenga lasmejores condiciones de coloración, con el objetivo 10x.Las áreas demasiado rojas no mostrarán el color azul,las demasiado azules no revelarán el rojo.Colóquese sobre esta área, una gota de aceite de in-mersión y vigilando por el lado izquierdo del micros-copio, haga descender el objetivo de inmersión enaceite hasta que casi toque la lámina, sumergiéndoloen el aceite.

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7. Hágase aparecer la imagen de la preparación moviendoel tornillo macrométrico hacia arriba.

8. Utilícese la mano izquierda para enfocar constante-mente el tornillo micrométrico, y la derecha para cam-biar los campos con los controles del carro del micros-copio. Obsérvese el color del campo microscópico; sies blanco, azul-blanco, amarillo o azul, muévase rápida-mente el tornillo micrométrico, mirando a través deambos oculares, en una amplitud de veinte divisionespor lo menos. Si los leucocitos parecen desplazarseradialmente en algún sentido, es indispensable arreglarla inclinación del espejo o la posición de la lámparahasta lograr que al enfocar o desenfocar las células nose produzca ningún desplazamiento aparente. Se acos-tumbra a examinar en una preparación determinadaun mínimo de 100 campos microscópicos.

9. Al terminar las observaciones microscópicas, sáqueseel portaobjetos y quítese el aceite de inmersión de lapreparación y del objetivo de inmersión, utilizando"Kleenex".

10. Colóquese nuevamente el carro en una posición central.11. El objetivo 10x ha de quedar hacia abajo y se ha de

bajar el tubo hasta llegar al seguro automático. Estoes absolutamente indispensable porque las lentes delobjetivo de inmersión en aceite pueden deteriorarsefácilmente si se dejan hacia abajo mientras no se utili-zan. Coloque la cubierta al instrumento y devuélvasea su lugar numerado en el armario con calefacción.

COMPORTAMIENTO DE LAS INFECCIONES POR P.FALCIPARUM Y P. VIVAX EN EL

HIGADO DEL HOMBRE 1

Las fases exoeritrocíticas de los plasmodios se descubrie-ron primero en el retículoendotelio de las aves y por ellose supuso durante mucho tiempo que esas fases en el hom-bre se producirían en el mismo lugar; pero no ha sido así.

Varios años antes de que se descubrieran las fases hepá-ticas presentadas esquemáticamente en la película prepa-rada por el Profesor Shortt, los experimentos realizados enAustralia durante la Segunda Guerra Mundial con el fin de

1 Falciparum-6

díasVivax-8 díasOvale-9 díasMalariae-11 días

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conocer exactamente el resultado producido por la conocidadroga atebrina, demostraron en forma concluyente y com-pleta las fases exoeritrocíticas del P. falciparum y el P.vivax en el hombre. Sólo faltaba por descubrir en qué lugarse producían esas fases ya que dichos experimentos fueroncompletos y minuciosos.

Se utilizó un número ilimitado de voluntarios no inmunesen un área donde no existía malaria. Se trajeron mosquitosy cepas de P. vivax y P. falciparum de áreas hiperendé-micas de la región del Pacífico Sudoccidental. Se empleóla subinoculación de 300 a 500 cc. de sangre para demostrarla presencia o ausencia de formas asexuales en la circu-lación periférica. Este fue el aspecto más destacado de laspruebas, ya que anteriormente sólo se habían inoculado de10 a 50 cc. a un número muy reducido de individuos.

Estos experimentos se pueden resumir en los siguientestérminos:

P. falciparum.-Se permitió que mosquitos con esporo-zoitos demostrables de P. falciparum picaran en el brazoderecho de un voluntario mientras, simultáneamente, seextraían 300 cc. de sangre de una vena del brazo izquierdoy se inyectaban inmediatamente a otro voluntario. Ambosdesarrollaron parasitemia y síntomas, al final del períodocorriente de incubación de 11 días. Sin embargo, una mues-tra similar de sangre extraída media hora después de lapicadura, no infectó en ningún caso al segundo individuo.Ni la sangre extraída e inyectada diariamente durante 5días demostró signo alguno de enfermedad en aquél. Enrealidad no se informó de que hubiera dado resultadopositivo ninguna subinoculación hasta después de trans-curridas 140 horas. Esto significa que hubo un período de6 días completos antes de que la sangre de la persona quesufrió la picadura pudiera inducir infección en un individuosubinoculado. Después, las subinoculaciones produjeroninfecciones, a diario, sin interrupción ni excepción, hastaque la persona recibió tratamiento curativo con atebrina odesarrolló inmunidad adecuada para la curación espon-tánea. A muchos de estos enfermos se les aplicaron pos-teriormente subinoculaciones semanales, y en ningún casoen que se demostró actividad subsiguiente, dejaron estaspruebas semanales de producir infección. Cuando se obteniauna reacción negativa, la sangre no volvía a ser positivaaún cuando se continuara la observación durante un año.

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Esto demostró de manera concluyente que existía unperíodo bien definido de 6 días completos, durante los cualescontinuaba, fuera de la circulación periférica, cierto tipode desarrollo de la infección por P. falciparum. Una vezque cesó la infección asexual en la sangre periférica novolvió a presentarse (las fases sexuales persistieron aproxi-madamente durante 30 días antes de que desaparecieranespontáneamente).

Se demostró repetidamente que un individuo que recibíadiariamente 100 mg. de atebrina, desde siete días antes delas picaduras del P. falciparum infectivo, y continuaba reci-biendo después este tratamiento durante un mínimum detres semanas, jamás desarrollaba parasitemia o síntomasvisibles, a pesar de que las subinoculaciones hechas delnoveno al decimotercero días resultaban de vez en cuando,positivas. Esta fue la primera prueba experimental de unadroga que eliminaba por completo la infección por P. falci-parum. Se demostró igualmente que tres tabletas de ate-brina, de 100 mg., administradas diariamente durante 8días, podían también producir una curación radical de lainfección con esta especie.

No se podía confiar en la quinina para la curación dela malaria por P. falciparum, aunque se lograron curacionesen determinados casos. La prueba de esta observación esla desaparición virtual de la fiebre hemoglobinúrica deaquellas regiones en que ya no se usa la quinina para lasupresión ni para el tratamiento.

P. vivax.-Estos mismos experimentos se repitieron conel P. vivax, obteniendo el mismo éxito, pero con resultadosnotablemente diferentes. Las subinoculaciones con P. vivaxresultaron negativas tanto el séptimo como el octavo día.Hasta que transcurrieron 8 días completos no se manifestóla infección, ni aún en los casos de individuos sometidossimultáneamente a la picadura de mosquitos infectados conP. vivax y mosquitos infectados de P. falciparum. La in-fección de P. falciparum se manifestó al 7° y 8° días; al9° día aparecieron ambas infecciones y el número de pará-sitos de P. falciparum predominó rápidamente.

La sangre de la persona infectada con P. vivax continuósiendo positiva durante todo el ataque primario de 3 a 5semanas de duración o hasta que se instituyó tratamientoterapéutico. Se transformó entonces en negativa y las sub-inoculaciones semanales, por un término de 2 a 5 meses, no

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lograron infectar a los individuos que las recibieron. Hastaque se aproximó el tiempo en que normalmente puedeocurrir una recidiva, no aparecieron las primeras subinocu-iaciones positivas. Cuando una recidiva con su parasitemiay síntomas visibles cedía, las subinoculaciones continuabansiendo positivas durante varios días y luego se convertíanen negativas, permaneciendo así durante unos días antesde la siguiente recidiva, si es que ésta ocurría. Con laadministración diaria de atebrina en la forma arriba indi-cada, no se encontraron parasitemias pasajeras comoocurre con el P. falciparum, pero aún continuando el trata-miento durante tres semanas después de la picadura, losparásitos y síntomas aparecían generalmente en el pacientepoco después de suspenderse la administración de la droga.El tratamiento curativo con atebrina, tan eficaz en el P.falciparum, controló siempre el ataque primario y eliminóla parasitemia, pero no impidió que ocurriera una recidiva.

En los casos de pacientes infectados no por la picadurade mosquitos sino por inoculación de sangre, la situaciónera muy distinta. Esos individuos recibieron sólo lasformas eritrociticas asexuales. Mientras éstas persistieronen la sangre, las subinoculaciones resultaron, naturalmente,positivas, aun cuando el número de parásitos en el inóculofuera submicroscópico. Esos enfermos, ya fueran infecta-dos por P. falciparum o por P. vivax, se curaron rápida-mente con cantidades más pequeñas de drogas, y una vezque llegaban a ser negativos a la subinoculación continua-ban así. Esos experimentos demostraron sin lugar a dudas,que existía una fase pre-eritrocítica en la infección por P.falciparum, de 6 días de duración, al cabo de los cualesdesaparecía, y que, una vez eliminada la infección asexual,el paciente quedaba completamente curado.

En los casos de infección por P. vivax la situación eracompletamente diferente. La fase pre-eritrocítica duraba8 días completos, pero evidentemente no desaparecía entera-mente, ya que transcurrido un período en que no se observa-ban en la sangre formas en circulación, ocurrían con fre-cuencia, aunque no forzosamente, una o más repeticionesde parasitemia y actividad clínica. Esto no ocurrió jamáscuando las infecciones se provocaron con inyecciones desangre. Las deducciones derivadas de esos experimentosindicaron la existencia de una fase oculta de desarrollo quese producía en el P. falciparum, merozoitos que infectaban

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sólamente a los glóbulos rojos. Tratándose del P. vivax,se suponía que esta fase oculta producía formas, no sóloinfectivas para los glóbulos rojos, sino también para ciertascélulas capaces de mantenerlas en un sitio todavía descono-cido.

Al parecer, la idea de explorar el hígado para descubriresas fases ocultas fue sugerida por una observación hechapor el Profesor Garnham en Africa Oriental. Este pro-fesor observó pequeñas vesículas en la superficie del hígadode monos en cuya sangre se encontraron gametocitos de P.kochi (Hepatocistis). Esos quistes, que más tarde se demos-tró que contenían numerosos merozoitos, no se observaronnunca en animales no infectados. Las fases hepáticasfueron demostradas por primera vez por Shortt y Garn-ham en un mono infectado de P. cynomolgi, y poco despuésen un caso humano de infección provocada de P. vivax.Pronto se demostró en Inglaterra y poco después en losEstados Unidos, la fase hepática del P. falciparum. En 1953,se demostró que el P. ovale tiene una fase hepática de 9 díasde duración. En las tres especies, las fases hepáticas tienenuna apariencia similar. Las formas más jóvenes se encuen-tran en los citoplasmas de una célula del hígado; la croma-tina se divide por fisión binaria. En la madurez, el P.vivax y el P. ovale contienen centenares de merozoitos,mientras que el quiste de P. falciparum puede contenervarios millares. El único daño para el hígado parece seruna compresión de algunas células adyacentes, pues no seha observado infiltración celular reaccionaria. Al romperseel quiste, los merozoitos descubiertos se incrustan en lascélulas adyacentes del hígado hasta encontrar un sinusoideque contenga glóbulos rojos. A partir de entonces comienzala fase eritrocítica.

De los experimentos antes descritos se deducen las si-guientes conclusiones:

1) La malaria por P. falciparum es perfectamente cura-ble, mediante una sola dosis de remedios apropiados.

2) No todas las infecciones por P. vivax producen reci-divas; la proporción de las que no las producen llegaa un 30%.

3) La medicación que erradicará la infección por P. falci-parum no eliminará la recidiva por P. vivax que, encaso de ocurrir, rara vez persiste más de tres años.

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4) Es posible que la medicación supresiva prolongadaerradique también el P. falciparum, pero el P. vivaxpuede reaparecer clínicamente cuando se suspende eltratamiento.

No fue hasta 1959 que se descubrió la fase pre-eritro-citaria de P. malariae cuyo proceso dura 11 días, lo mismoque P. in¡ni de los monos.

Otro plasmodio de los monos, el P. knowlesi, tiene unciclo eritrocítico de 24 horas y una fase pre-eritrocítica quedura cinco días y medio y ha sido usado repetidamente parainfectar artificialmente al hombre.

DIAGRAMA 7

DIAGRAMA ESQUEMATICO DEL PAPEL QUE DESEMPENA LA FASE EXOERITROCITICAEN EL ACCESO PRIMARIO Y LA RECAIDA, EN LA MALARIA VIVAX

ACCESO PRIMARIO SIN RECAIDAS

Zr 4o RECAIDA

15000 - INMUNIDAD -*

E %

IDOS/' ~ i t !

5 8 4423

NUMERO S( :9 . * '3 J :. 3 i .HlPOTETlCO

DE MEROZOITOSHEPATICOSV a0, 441

Este, diagrama esquemático, completamente imaginario,constituye una tentativa de explicar el papel de la fase exo-eritrocítica de la malaria vivax en:

a) Un ataque primario sin recaída.

b) Una recaída después de un ataque primario.

La línea compacta indica la parasitemia medida por laslíneas horizontales, que representan diferencias de 5000

parásitos por mm. cúbico. El nivel de parásitos es submi-croscópico allí donde la línea se convierte en intermitente.

La línea de puntos sugiere el grado de inmunidad; laslíneas perpendiculares marcan la duración de un ciclo exo-eritrocítico completo de vivax o bien 8 días.

La fila superior de puntos en disminución sugiere el nú-mero de merozoitos hepáticos que llegan a la circulacióndespués de sucesivas esquizogonias hepáticas. Estos nú-

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meros decrecen con cada ciclo, hasta que cesa la formaciónde esquizontos hepáticos.

La fila inferior de racimos de puntos representa un nú-mero mucho mayor de merozoitos hepáticos liberados cada8 días. Sólo se requiere una fracción de ellos para iniciarla parasitemia de una recaída (al final del 18 ° ciclo hepá-tico), a condición de que la inmunidad sea tan baja quela progenie de la esquizogonia eritrocítica eluda la destruc-ción e invada con éxito nuevas células rojas.

COMPORTAMIENTO GENERAL DE LAS DIFERENTES

ESPECIES EN LA SANGRE PERIFERICA

Los parásitos varían en tamaño, forma y aspecto, exacta-mente igual que cualquier animal multicelular.

,Algunas formas de una especie, es decir, las fases menosdesarrolladas de tipo gametocítico del P. vivax, puedenparecer idénticas a fases mayores del P. malariae. Enrealidad, sólo hay una forma de parásito que pueda con-siderarse como única, y es la del gametocito del P. falci-parum. Para obtener un diagnóstico exacto de las especies,es necesario que se encuentre presente suficiente número dediferentes ejemplares del parásito para que revele el tipode variación que es constante en cada especie. No bastacon retener en la memoria una lista de los diversos aspectosque se han observado comúnmente en los frotis sanguíneosde diversas especies y a los que se han atribuido caracte-rísticas especiales que no siempre son ciertas. Es necesarioque el examinador sepa cuáles son las posibles variacionesde formas, no sólo en cada una de las distintas especiessino también en las diversas condiciones de la sangre (dia-grama 8).

El examinador debe fiscalizarse siempre a sí mismo.Cada vez que observa una nueva forma parasitaria se hade preguntar: a) ¿Es esto un verdadero parásito?; b) ¿Co-incide esto con mis conocimientos acerca de la variaciónde formas parasitarias que cabe esperar en la presuntaespecie?

La contestación a la primera pregunta se suele obtenerbuscando en las inmediaciones un parásito sobre el cual nohaya duda de ninguna clase. Se evalúa el color y la densi-dad de la cromatina, lo mismo que el aspecto del citoplasma.

32

e90*l«!ae o ° a DIAGRAMA 8

M:F ESQUEMA DEL CICLO

ERITROCITICO EN EL HOMBRE

Desarrollo cíclico por el que pasan todas las especies, tantosi están presentes en la sangre como si no lo están.-a

PIGMENT

Si estas características no son similares en el nuevo objetoencontrado, es probable que no se trate de un organismogenuino.

Una vez que nos decidimos a considerarlo como un verda-dero parásito, surge la siguiente pregunta: ¿Está com-prendida su fase de desarrollo dentro de las modalidadesque, según nos enseñan la observación y la experiencia, sepueden presentar en determinado momento en el ciclo dela especie "X"?

Se plantea con frecuencia la siguiente cuestión tácita:¿Puede ser ésta una fase que no se presente nunca en elciclo de la especie "X"?

Para determinar esta variación se necesita un mínimode 50 campos de sangre positiva, antes de formular undiagnóstico definitivo. Si es evidente que no todas las for-mas pertenecen a la especie "X", se necesitarán otros

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exámenes para confirmar la sospecha de que se han encon-trado también algunas muestras de una segunda especie.

Camadas.-Como muestra sucintamente la película, enel P. vivax, todas las especies pueden tener más de unacamada de parásitos al mismo tiempo. Aunque los P. falci-parum, P. vivax y P. ovale requieren 48 horas para lamadurez de las formas asexuales, es también posible, y noes raro, que produzcan un paroxismo diario. Este paroxis-mo diario indica la existencia de dos camadas de una de lasespecies precedentes, o puede reflejar la presencia de trescamadas de P. malariae. Parece que el organismo no puedeproducir más de una reacción completa en 24 horas, o que,una vez determinada la predominante, todas las demásquedan suprimidas.

Se originan distintas camadas cuando viene la liberaciónde merozoitos del hígado en diferentes momentos del ataqueprimario de una infección provocada por mosquitos. Tam-bién puede ocurrir que aparezcan espontáneamente en unainfección continua que haya mostrado, durante algúntiempo, una sola camada de periodicidad regular. Paraque se desarrolle una segunda camada no es necesario quela infección sea de origen esporozoítico. Parece que laesquizogonia de una infección de una sola camada requiereque, al final de cada período de 48 horas, la mayoría de lascélulas parasitadas se rompan dentro de la misma horamientras que las restantes completan su división a interva-los diversos, antes o después que la mayoría. Supongamosque para completar la esquizogonia se necesitan 5 horas.La mayoría de las células se rompen durante la 3ra. hora;algunas no se dividen hasta dos horas más tarde. Las queiniciaron el proceso esquizogónico, lo hicieron dos horasantes que la mayoría.

Un ciclo más tarde, el grupo que empezó la esquizogonia,lo hizo 4 horas antes que la mayoría (los últimos grupos,4 horas más tarde). Después de algunos ciclos, habrá unconsiderable número de parásitos madurados 24 horasantes y 24 horas después que la mayoría. Todos estosjuntos pueden constituir un número suficiente para pro-ducir una esquizogonia adicional 24 horas antes de la queproduce la mayoría, es decir, la camada predominante. Deesta manera se crea otra camada, independientemente dela fase exoeritrocítica.

El diagrama 9 representa en forma esquemática todo el

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ciclo de desarrollo de las tres especies de parásitos de lamalaria comunes en el hombre. Aunque cubre de un ex-tremo a otro de la gráfica, el ciclo es continuo y la formamenor se encuentra inmediatamente después de las ruptu-ras de esquizontes. Si mentalmente situamos el organismorecién descubierto en el lugar que le corresponde en esteciclo del diagrama, se facilitará considerablemente el diag-nóstico de la especie.

COMPORTAMIENTO INDIVIDUAL DE LASESPECIES EN LA SANGRE PERIFERICA

Se observan varias diferencias en el comportamiento delas distintas especies que originan no sólo los síntomas queexperimenta el paciente, sino también las formas presentesen la sangre.

P. falciparum.-Parece ser que cuando el merozoito delP. falciparum penetra en un glóbulo rojo, su simple pre-sencia produce alteraciones inherentes a los propios gló-bulos rojos, que podrían describirse como una pegajosidadde su capa o membrana externa.

Posiblemente esta situación es la causa de la frecuenciacon que los parásitos del P. falciparum de más recienteformación se encuentran en la periferia de la célula. Nose debe, indudablemente, a ninguna propiedad específicade la célula, puesto que los merozoitos de P. falciparumpenetran indistintamente en los glóbulos rojos jóvenes yviejos, en contraposición a los merozoitos del P. vivax quemuestran preferencia por las células jóvenes, de la mismamanera que el P. malariae se inclina decididamente por lascélulas viejas.

El diagrama 10 presenta esquemáticamente los hallazgosde la autopsia de una infección mortal de P. falciparum.Tal vez convendría explicar, en primer término, que nocabe esperar en las secciones de tejidos el conocido aspectoque presentan las células parasitadas de una muestra desangre bien coloreada. Con la acostumbrada coloración dehematoxilina y eosina, raramente se ven los parásitos, perosu presencia está indicada por una cantidad de pigmentoque es proporcional al tamaño del parásito viviente. Unexamen de cualquier tejido, especialmente del cerebro,demostrará la frecuencia con que los glóbulos rojos parasi-

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DIAGRAMA 10

APARICION, EN LA AUTOPSIA, DE LA INFECCION FATAL POR P. falciporum

tados se encuentran en las paredes de los pequeños vasossanguíneos donde tanto la corriente sanguínea como lapresión son bajas. En los vasos menores, en que se pro-duce muy poco, o ningún movimiento no se desalojan estosglóbulos rojos parasitados y ligeramente adheridos. Porconsiguiente, una pequeña vénula puede mostrar su bordetotalmente cubierto de glóbulos rojos parasitados, mientrasque en el lumen del vaso, lleno de glóbulos rojos, rara vezse observa la presencia de parásitos (A). De una maneramás definida, en los capilares se observa casi siempre quecada uno de los glóbulos rojos tiene una mancha de pig-mento que es todo lo que queda de lo que fue un parásitoviviente. El fenómeno que se ha producido puede com-prenderse si se encuentran hemorragias petequiales de uncapilar roto. Ninguno de los glóbulos rojos que formanla hemorragia contendrá un parásito, puesto que en estosespacios limitados, las células parasitadas se adhieren alrevestimiento retículoendotelial (B). Con su conocida fa-cilidad para acomodarse a una diversidad de constriccionesy obstrucciones, mientras exista alguna presión, las célulasno parasitadas pueden "culebrear" (C) en torno a las célu-las fijas y salir por la apertura que se produce a conse-cuencia del grave daño sufrido por algunas de las célulasde revestimiento. Mientras el reticuloendotelio permaneceintacto no se presentan hemorragias.

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La muerte no se origina como resultado de la presenciade alguna substancia tóxica emanada por los parásitos,sino más bien por la interferencia en la función normal delendotelio vascular. Es evidente que la muerte se producecuando el número de células parasitadas es tan elevado quelos tejidos, cuya existencia depende de este suministrovascular, quedan desprovistos de oxígeno, electrólitos, etc.,especialmente si esta situación ocurre con respecto a cen-tros vitales. No es probable que la muerte se produzca enel momento de la esquizogonia, sino más bien inmediata-mente después de que un número máximo de células reciénparasitadas se retiren de la sangre y se sitúen sobre lasuperficie del endotelio vascular. Es probable que el nota-ble mejoramiento que se observa, con frecuencia, en infec-ciones cerebrales graves, coincida con una esquizogonia quetemporalmente libera al endotelio de las células que loobstruyen. Al aumentar el número de células infectadascomo consecuencia de esta esquizogonia queda ocupada unaparte del retículoendotelio, superior a la que se puede re-sistir. En consecuencia, sobreviene la muerte, probable-mente de 15 a 24 horas después de la esquizogonia final.

Es muy probable que la diferencia de patología entreun caso mortal de P. falciparum y un caso grave que serestablece sea sólo de grado. Aunque resulta cada vez másdifícil encontrar infecciones graves de P. falciparum, conelevada parasitemia, se cree que si éstas ocurren en centrosque cuenten con servicios adecuados, se pueden intentarbiopsias hepáticas por aguja, y punción del intestinogrueso, con el fin de demostrar el cuadro patológico.

Si se tiene en cuenta lo que antecede, se comprenderáfácilmente por qué en la sangre periférica se encuentransolamente las formas jóvenes del parásito. Si se produce"shock", pueden ocurrir y ocurren los fenómenos obstruc-tivos mencionados, puesto que, evidentemente, se originaalgún cambio en el endotelio que libera todos los glóbulosrojos "pegajosos" de su posición.

Se supone que el crecimiento y desarrollo de los gameto-citos del P. falciparum tienen lugar en los glóbulos rojos yque lo mismo ocurre con aquéllos en el revestimiento delendotelio; pero con la madurez de los gametocitos y suelongación, el glóbulo que los contiene se libera en la circu-lación.

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La característica de alta parasitemia es posible queocurra porque esos vasos sanguíneos, cuyo revestimientoestá ocupado por células parasitadas, están también llenosUe células noIu iniiectauas. Luos esquizontLes que se rompen

en su posición fija liberan merozoitos que materialmentequedan comprimidos contra centenares de células. Cual-quiera que sea la edad de la célula, uno o más merozoitospenetraran rápidamente en los glóbulos rojos de la sangreque se encuentran más próximos.

En un ataque primario de malaria por P. falciparum, laparasitemia aparece a los diez o doce días, y va seguida,en el término de 24 horas, de la aparición de síntomas. Siel individuo puede producir gametocitos, no comenzarána aparecer hasta 8 ó 10 días después; si se dejan sin tratar,las formas anulares y los gametocitos pueden persistirjuntos durante varios días o semanas, hasta que hayainmunidad suficiente para eliminar las formas asexuales.No se producen más gametocitos cuando desaparecen lasformas asexuales, pero los que ya se encuentran presentespueden continuar circulando de 2 a 4 semanas. Por lo tanto,un método apropiado para notificar los hallazgos de lasangre y que describe exactamente la fase de la infecciónen el individuo examinado es el siguiente: a) solamenteformas anulares: F; b) formas anulares y gametocitos:F + g; c) gametocitos solamente: Fg.

P. falciparum , DIAGRAMA 11

A.~~~~

lo/u-

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Conviene que el principiante inspeccione el mayor nú-mero posible de parásitos del P. falciparum y que dediquea esta labor el máximo tiempo de que disponga. Se debehacer un esfuerzo para identificar la variedad de los quese descubran. Hay que evaluar tanto los anillos más pe-queños como los mayores que se observen. Los anillos deP. falciparum se dividen en pequeños, medianos y grandes.Cuanto más cerca esté de la esquizogonia el momento enque se tome la muestra de sangre, mayor será la proporciónde anillos pequeños. Si la proporción de anillos grandes esmayor, hay que suponer que el número total de parásitosdisminuirá notablemente dentro de seis horas. Convieneaclarar también que cuando se trata de una infección deuna sola camada, los parásitos pueden estar totalmenteausentes de la sangre durante varias horas, tal como seindica en el diagrama 9. Por otro lado, las infecciones deuna sola camada son raras en las poblaciones semi-inmunes.

Es posible, naturalmente, que haya todavía más de unacamada de P. falciparum compitiendo, con el resultado deque los parásitos nunca desaparezcan de la sangre peri-férica, aunque su número pueda variar considerablemente.

P. vivax.-La palabra vivax significa vivaz y expresamuy bien la actividad casi frenética que con frecuenciamuestra esta especie. El merozoito de P. vivax tiene una

P. vivax DIAGRAMA 12

4D,rA

IOu-

,A

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clara preferencia por los glóbulos rojos jóvenes, que sonmás elásticos que los más maduros y, en consecuencia,pueden dilatarse para acomodar mejor al parásito en de-sarro!!o. Sin embargo, no se observa ninguna viscosidad delos glóbulos rojos que los contienen como ocurre con losP. falciparum, de manera que los glóbulos rojos parasita-dos circulan todo el tiempo durante el ciclo o series deciclos eritrocíticos mientras la esquizogonia se produce encirculación abierta. El período en que los merozoitos libera-dos buscan una nueva célula huésped es mucho más pro-longado que el que se observa cuando se trata de P. falci-parum y, de este modo, el número de parásitos fagocitadoses mucho mayor y la duración de este período no excede,probablemente, de cinco minutos. Las parasitemias totalesnunca son tan elevadas. Los merozoitos del P. vivax, en suapremio por encontrar nuevo albergue, a veces invaden unanueva célula en la que penetran uno, dos o más de ellos.En su segmentación no es raro encontrar más de unamancha de cromatina en el nuevo parásito; la segundamancha de cromatina es, con frecuencia, menor que laprimera. Aunque estos parásitos relativamente jóvenesparecen ya experimentar segmentación, no es éste el caso.Además el parásito del P. vivax recién introducido en losglóbulos rojos, se mueve por toda la célula produciendopseudópodos citoplásinicos que llegan a todas las partes dela célula. Esto da lugar a la aparición de formas extrañas,tan numerosas y variables que hace imposible tratar dedescribir más de un reducido número de ellas. El resultadoes que un parásito grande irregular no puede describirseen su totalidad. Ocurre con frecuencia que una parte delparásito es compacta y, quizás, contiene -todo el pigmentode la cantidad total del citoplasma, lo que da por resultadoque cantidades más pequeñas de citoplasma que se encuen-tran próximas se ignoren. De hecho, para estimar loque constituye todo el parásito en una gota gruesa, se re-quiere muchas veces examinar todo lo que se ve dentrode un área que tenga el tamaño del polimorfonuclear mayor.La confusión que frecuentemente se produce en el diag-nóstico del P. vivax y del P. malariae se debe a que estasgrandes y densas partes se consideran como parásitosenteros. Muchas veces, los pequeños bastoncillos de cito-plasma que unen varias partes son demasiado finos paraser percibidos (diagrama 13).

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APARICION DE PARASITOS DE P. vivax EN LA GOTA GRUESA, A INTERVALOS DE 12 HORAS

Los glóbulos rojos infectados con P. vivax continúancirculando sin interrupción porque en ellos no se produceviscosidad alguna. En lugar de hacerse "pegajosos", losglóbulos rojos experimentan ciertas alteraciones, que alcolorearse con el frotis fino producen una serie de gránulosrojizos, de tamaño, forma y distribución regulares, en laenvoltura de la célula. Estos gránulos, que al principioson finos, pero luego se hacen mayores y más prominentes,se conocen con el nombre de puntos de Schtffner. En lagota gruesa, especialmente en la periferia, este fenómenode coloración aparece como un halo rosado alrededor delos parásitos, del tamaño y forma del glóbulo rojo que loscontiene. Esta coloración de Schiffner sólo se produce enel caso de infecciones de P. vivax y de P. ovale. Hay queaprovechar únicamente la oportunidad de su presencia, node su ausencia, puesto que para demostrar este fenómenose requiere una coloración de cierta calidad. Sólo un 10%de los colorantes corrientes muestran estas alteraciones.

A medida que el parásito de P. vivax madura se vuelveredondo y regular, y cuando alcanza el pleno desarrollo, elpre-esquizonte adulto se parece tanto al gametocito que noes fácil distinguir uno de otro. Los gametocitos aparecenmuy pronto una vez establecida la parasitemia. Contraria-mente al P. falciparum, aquéllos, como sucede también con

]

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los gametocitos de P. malariae no persisten más de 12 a 48horas después de desaparecer las formas asexuales. Adiferencia del P. falciparum, las medicinas que destruyenlas formas asexuales del torrente circulatorio, lo hacentambién con los gametocitos.

La proporción del ciclo total que se encuentra en una solagota de sangre oscila entre 2/3 ó 1/4 del ciclo, según loscasos. El número de merozoitos en los esquizontes madurosjustamente antes de la segmentación, usualmente varíaentre 14 y 24. Cuando existen dos camadas es posible en-contrar todas las fases del parásito.

Puesto que comúnmente en una sola gota de sangre seencuentran todas las fases del parásito, es innecesario des-cribir como trofozoitos, esquizontes y gametocitos las for-mas del parásito que se encuentran en cada espécimen.

Una simple V implica que se hallan presentes todas esasformas. Aunque a veces se alega que sólo se pueden encon-trar formas anulares de P. vivax, esto sucede muy rara vezy un examen minucioso revelará numerosas fases pocodesarrolladas, irregulares, que no se encuentran jamás enel P. falciparum y con toda probabilidad si se investigacuidadosamente se verán también formas segmentadasavanzadas.

Como se ha dicho ya, el P. falciparum domina al P.vivax y el P. vivax domina al P. malariae, pero es pocousual encontrar otra combinación que no sea el P. vivaxacompañada de gametocitos de P. falciparum. Las denomi-nadas infecciones mixtas no existen clínicamente, salvopor períodos de 24 a 48 horas, cuando luchan las dos espe-cies presentes. El P. falciparum domina constantementeal P. vivax y el P. vivax regularmente domina al P. mala-riae (cuartana), esto es: F > V > M.

Una cierta indicación de los números proporcionalesdaría una idea más exacta. La infección agregada se puedeindicar incluyendo un símbolo entre (), por ejemplo:F +++ (M17/100) campos. En el sentido clínico, porlo menos, esto no constituye una infección mixta.

P. malariae.-La infección de cuartana que produce elP. malariae suele estar presente siempre que se encuen-tran las otras dos especies, y se subordina por lo común aellas, razón por la cual se la denomina "especie de la esta-ción de sequía". Debido a que los gametocitos son general-mente escasos, la transmisión por mosquitos en el labora-

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torio es extremadamente difícil. El período pre-eritrocí-tico dura once días y los parásitos pueden aparecer en lasangre en cualquier tiempo entre el 19 ° y el 300 día. Esbien conocida la persistencia de las infecciones por P. mala-riae. Se conoce un caso en el que ha estado activa durante52 años. A causa de su susceptibilidad a las modernas dro-gas esquizontocidas, es poco probable que,- en el futuro, seencuentren infecciones de tan larga duración.

Las infecciones por P. malariae difieren de aquéllascausadas por las otras dos especies más importantes, enque producen efectos secundarios que aquéllas no causan(afectan los riñones, y la pérdida de hemoglobina excedede la producida únicamente por la rotura de las célulasparasitadas). En contraste con el P. vivax, el merozoitodel P. malariae prefiere los glóbulos rojos más viejos. Esto,unido a su promedio de esquizogonia de 8 a 12 divisiones,resulta en una parasitemia total más baja que la del P.vivax. El aumento de 50% en el tiempo necesario para sucompleto desarrollo, y la actividad claramente más bajaque muestra en comparación al P. vivax, dan lugar a unaproducción más temprana y mayor de pigmento. Una vezdentro de la célula el parásito de la cuartana permaneceinmóvil, alimentándose por ósmosis. No hay expulsión depseudópodos. Las etapas avanzadas de pre-segmentacióny segmentación a veces presentan considerable irregulari-dad en su forma anular a consecuencia de que todo el pará-sito alojado en la parte periférica de los discos bicóncavosde los glóbulos rojos contiene una cantidad de hemoglobinainferior a la normal. Formas semejantes se encuentran enlas infecciones por P. vivax que han persistido el tiemposuficiente para disminuir los valores hematológicos y dehemoglobina. Una sola gota de sangre muestra una partemenor del ciclo que la que se observa en el P. vivax (dia-grama 14). Tres camadas existen cuando todas las fasesdel ciclo de P. malariae se encuentran en un espécimen desangre.

Poco tiempo después que termina la fase anular hastallegar a los esquizontes maduros, la característica generalde los parásitos de P. malariae es la densidad, la pigmenta-ción acentuada y la uniformidad y regularidad de forma.Se encuentra también un tipo de punteado, pero para conse-guirlo se requiere un grado de excelencia técnica que raravez alcanzan las preparaciones ordinarias.

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P. malariae DIAGRAMA 14

A B

A)-Gldbulo rojo normal, de frente y de perfil

B)-Ampliación de glóbulo rojo joven, en elcual la porción central es extraordinarlamente E

la parte central de la célula en Al y solo ocupala parte periférica en B)

No es raro encontrar que el 1-4%o de parásitos caracte-rísticos de cuartana persisten en una infección que, porotra parte, es claramente de P. falciparum o de P. vivax.Un error común que da lugar a diagnósticos erróneos demalariae, se debe a los casos en que la sangre que contienesolamente gametocitos de P. falciparum se seca tan lenta-mente que da tiempo a que los parásitos se redondeen.Especialmente si esas formas son bastante numerosas seconsiderarán de manera errónea, parásitos de cuartana.

Sin embargo, las verdaderas infecciones mixtas no ocu-rren con una frecuencia suficiente que justifique una co-lumna separada para ellas en los formularios de notifica-ciones. La presencia de esa columna implica una frecuenciaque no existe; su importancia, en realidad, es muy poca yfavorece el diagnóstico descuidado y la coloración de peorcalidad. Se espera que las notificaciones y los registrossean un reflejo exacto de las infecciones de la poblaciónmás bien que un informe recargado de hallazgos parasito-lógicos, cuyo valor es más académico que práctico.

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P. ovale.-Las verdaderas infecciones por P. ovale sonsumamente raras y los microscopistas del Hemisferio Occi-dental que tengan que atender a otros trabajos, no debendedicar demasiado tiempo al estudio de una sospecha deovale. Las infecciones prolongadas por P. vivax cuandola sangre es suficientemente subnormal pueden pasar porun período en el cual los glóbulos rojos sean deficientes enhemoglobina. Los cambios producidos en las células para-sitadas presentan aspectos indistinguibles morfológica-mente del verdadero P. ovale. Por lo tanto, es peligrosotratar de establecer un diagnóstico de P. ovale sobre unabase morfológica solamente. Un diagnóstico de P. ovalepuede considerarse correcto únicamente si el supuesto P.ovale se transfiere a otra persona cuya sangre esté en bue-nas condiciones, ya sea por medio de una aguja o por unmosquito, y la nueva infección que resulta tiene las carac-terísticas propias de la infección producida por P. ovale.

La infección de P. ovale se encuentra con más frecuenciaen la costa occidental de Africa pero también está presenteen el Africa Oriental, en el Medio Oriente, Malaya, Indo-nesia y en las Filipinas. Es esencialmente una infeccióncuartana, con un ciclo de 48 horas y la presencia de puntosde Schiffner en la parte no infectada del glóbulo rojo quecontiene al parásito. En realidad, si el colorante no muestrala coloración rojiza de Schtffner alrededor de los parásitosen una gota gruesa, como se ve frecuentemente en infec-ciones de P. vivax, puede ocurrir que no se identifique laespecie. Anteriormente se creía que esta especie era, hastacierto punto, inocua, pero algunas cepas han mostradoseveridad igual a la del P. vivax. A diferencia de lo queocurre con este último, los negros son generalmente suscep-tibles al P. ovale.

El óvalo de los glóbulos rojos franjeados en que se en-cuentran los parásitos a los que se debe el nombre dado ala especie no se ve en los frotis o extendidos, salvo cuandoéstos se toman en lugares húmedos y se secan rápidamente.Los puntos de cromatina accesorios son tan frecuentes comoen el caso del P. vivax. Se considera que el aspecto oblongode las grandes masas de cromatina de los esquizontes tieneimportancia para el diagnóstico.

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PREPARACIONES DE GOTA GRUESA

Como ya se indicó en otro lugar del presente Manual,las gotas gruesas sanguíneas ya no se preparan tan gruesascomo antes ni se revuelven, ni desfibrinan.

Los portaobjetos limpios se empaquetan en lotes de 5,10 ó 15. El paquete de 5 es probablemente el más apropiadopara los trabajos de campo (véase Portaobjetos). Se rasgaen diagonal uno de los extremos del paquete, dejando aldescubierto los extremos de los portaobjetos. Dos de éstosse colocan sobre el paquete, y se busca una superficie plana,limpia y clara. Si no se dispone de ninguna mesa, bancoo silla, se puede utilizar un pedazo de cartón fuerte, quesiempre se deberá tener a mano para este propósito. Si elsuelo o el banco no es plano, se puede encomendar a unayudante voluntario, entre los espectadores que nuncafaltan, que sostenga el cartón. Es conveniente utilizar unpapel blanco liso cuando se extiende la sangre. Se puedeproporcionar a los principiantes un modelo o guía parala posición en el portaobjeto, de las gotas gruesas simpleso múltiples.

La sangre se extraerá del lóbulo de la oreja, si es bastantecarnoso, o bien del dedo gordo del pie, si se trata de unlactante,, o bien de un dedo de la mano. La punción se haráal costado del dedo más bien que en la yema, con un punzónbien agudo, ya sea de los que se utilizan una sola vez, yade los que son de uso repetido. El más común consiste enla mitad de una plumilla corriente de acero. Los tiposespeciales de agujas de resorte raramente son suficiente-mente agudas y causan molestias que no guardan propor-ción con la importancia real de la operación. Para el tra-bajo diario continuo, merece tenerse en cuenta la cuchillaBard-Parker de tipo puntiagudo. Esta cuchilla se une alcorcho de una botella de boca moderadamente ancha decapacidad de 30-50 cc. Se puede mantener limpia y afiladasi, al empezar los trabajos cotidianos, o cuando sea nece-sario, se frota con papel esmerilado (No. 0 ó 00). Una hojade este papel, de 4 x 6 cm., se enrolla en la botella de ma-nera que la parte esmerilada quede junto al vidrio, y sesujeta con una goma; así estará constantemente a mano.La botella se llena de alcohol de 90 grados. Para limpiarla cuchilla, el papel esmerilado se extiende sobre el paquetede portaobjetos o sobre cualquier otra superficie firme yse frota en él la punta de la cuchilla, hasta que desaparezca

OBTENCION DE MUESÍTRAS DE SANGRE

Figura 2

Figura 10

Figura 15

miz·7

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31-LAPIZo

DIAMANTE

DIAGRAMA 15

IN S T R U C C IO N E SFigura 1 Los paquetes de portoobjetos nuevos se abren rasgando en uno de losextremos el papel de lo envoltura, procurando, en todo momento, sostenerlos por los bordeso por los extremos con el dedo pulgar y el índice, a fin de no tocar los superficies.

Figura 2 Se puede utilizar como lanceta cualquier cuchillo puntiaguda limpio; ésta seinserto en el corcho de un frasquito de poca altura y de boca ancho, con el fin de mantenerlaconstantemente sumergida en alcohol cuando no esté en uso.

Figura 3 La botella con lo lanceta llevará un pedazo de papel de esmeril sujeto con unaliga. Este papel se utiliza para limpiar la lanceta y también para afilarla.

Figura 4 Para afilar la lanceta se coloca el papel de esmeril sobre un paquete de por-taobjetos u otro superficie sólida.

Figura 5 Focilítese toda la información requerido en la hoja de notificación de casos defiebre, sin olvidar el número del puesto del colaborador y el número de serie de la muestra.

Figura 6 Limpiese la punta de la lanceta con un pedazo de gasa o algodón hidrófilohumedecido con alcohol. Colóquese la lanceta limpia sobre lo mesa con el corcho descansandosobre uno de sus lados de tal manero que la punta de aquélla no toque ningún lugar u objeto;en otro caso, se puede colocar nuevamente en la boca de la botella sin ejercer presión.Figura 7 Se limpia bien la piel alrededor del lugar donde se pretende hacer la punción,con un poco de gaosa o algodón hidrófilo humedecido con alcohol y exprimido ligeramente poromquitar el exceso.

Figura 8 Punciónese el dedo, en el lugar indicado con una "x", mediante un golpe secode la lanceto.

Figura 9 Límpiese cuidadosamente la primer gota de sangre del dedo con un pedazo degasa o de algodón seco.Figura 10 Presionando el dedo con un movimiento similar al que se realiza para ordeñar,se hace salir otra gota de sangre.

Figura 11 Sosteniendo por el extremo un portaobjetos limpio, se apoya el borde delmismo contra el dedo indice de la mano izquierdo que sujeto el dedo en que se ha hecho lapunción; hecho esto, el portaobjetos se va inclinando suavemente hasta que lo mitad superiordel mismo entre en contacto con la porte superior de la gota de sangre y quede una porte deésta adherida a él; se debe evitar que el portaobjetos toque lo piel. Si queda sangre suficienteen el dedo, se coloca en el portaobjetos una segunda gota menor y situado 2 cms. bajo la pri-mera, anticipondo así lo operación de lo fig. 13.Figura 12 Colóquese el portaobjetos en uno hoja de papel cuidando que la sangre quedehacia arribo, y, utilizando unos 5 mms. del borde inferior de un segundo portaobjetos, extién-dose la sangre hasto formar un cuadro o rectángulo.

Figura 13 Con la mismo esquino del segundo portaobjetos, recójase otro poco de losangre que quede en el dedo.

Figura 14 Esta sangre o lo segundo gota mencionado en lao Fig. 11 se extiende paro for-mar una superficie delgada.

Figura 15 El dedo del enfermo se debe limpiar con un pedazo de algodón o gasa satu-rodo con alcohol y, si continúo sangrando, se presiono la punción con un pedazo de algodónseco, hasta que no sangre más.

Figura 16 Para secar lo sangre abaníquese el portaobjetos con una cartulina hasta que losangre pierda el brillo.Figura 17 Empleando el lápiz número 1 6 B escribase en loa segundo mancha de sangre elnúmero del puesto del colaborador, el número de serie de la placa y lao fecha en que fuepreparadoa.Figura 18 En los casos en que haya de tomarse un gran número de muestras al mismotiempo se pueden colocar tronsversalmente en el mismo portaobjetos cinco gotaos gruesaos yestrechos. La sangre puede extenderse hasta uno de los bordes del portaobjetos, pora indicarlo muestro que se tomó primero. El número del paciente al que se tomó esta primera muestrasirve poro todo el grupo del mismo portaobjetos y se marca al lodo derecho de la primera gota,o, mejor, si es posible, con ayudo de un á1piz de diamante en el vidrio, en el ángulo inferiorderecho del portaobjetos. Esos números terminarán siempre en 1 6 6.Figura 19 Se pueden envolver en sus hojas de anotación uno o dos portaobjetos siempreque sea sangre de una mismo persona. También se pueden colocar juntos tres o más y empo-quetarlos firmemente con uno envoltura pora portaobjetos. Loas hojas de anotación se coloan,entonces, en tomo al paquete compacto.

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todo resto de sangre seca, orín, etc., y que el borde y lapunta estén tan afilados que no se puedan ver fácilmentesin la ayuda de una lupa.

Con un algodón o gasa humedecidos en alcohol se limpiala parte en que se va a hacer la punción, restregando bienpara quitar cualquier suciedad y sudor seco, y luego sefrota nuevamente con un algodón o gasa secos. Convieneutilizar algodón de fibras largas mas bien que el de calidadinferior, que tiene más hilachas. La gasa o una venda detejido claro, cortada en pequeños pedazos, es probable-mente la más satisfactoria. La cuchilla o la plumilla sehumedece con alcohol, se seca y se clava ligera y rápida-mente en la piel; las primeras gotas de sangre se limpiancon una gasa seca. Si la punción se hace en el dedo, el quepractica la operación lo sujetará con la mano izquierda deuna manera constringente. Después de la punción se aprie-ta suavemente la punta del dedo hasta que sale la sangreformando una gota esférica sobre la piel seca (diagrama15).

Inmediatamente, sosteniendo por el extremo un porta-objetos limpio, se apoya el borde del mismo contra el dedoíndice del que efectúa la operación; luego, se va inclinandosuavemente el portaobjetos hasta que su superficie entreen contacto con la parte superior de la gota. La cantidadde sangre tomada determinará si es necesaria otra gota,en cuyo caso se colocará esta segunda gota al lado de laprimera. Se apoya rápidamente el portaobjetos sobre unasuperficie plana y lisa, de preferencia blanca, y utilizandounos milímetros de la esquina de un segundo portaobjetosse extenderá la sangre hasta formar un cuadro o rectángulodel espesor debido. Con el resto de sangre que quede enel lugar de la punción, se forma una capa más delgada desangre o un frotis parcial delgado para ser utilizado comomarbete, en el que se puede escribir, una vez que se sequela sangre, con un lápiz blando del número 1. El espesoradecuado de una gota gruesa es, naturalmente, el espesormáximo a través del cual se puede ver bajo inmersión enaceite después de la coloración. Esto puede calcularse pre-parando primero una gota decididamente demasiadogruesa. Esta se extiende de manera insuficiente y el porta-objetos se coloca perpendicularmente o sobre su borde;enseguida se formará una gota en el borde inferior. Conotro portaobjetos, se extiende más ampliamente una canti-

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dad similar de sangre y se levanta de nuevo el portaobjetos.Si se forma la gota rápidamente, se extiende todavía máshasta que la sangre recién extendida ya no corra hacia elborde inferior, sino que sólo se deslice muy lentamente. Lagota gruesa definitiva debe ocupar la mitad interior de losdos tercios del centro del portaobjetos, dejándose un espaciolibre de 1.5 cm. a la izquierda de cada extremo del porta-objetos para facilitar su manipulación mientras está to-davía húmedo.

El lugar en que se escribe la identificación puede cubrirsecon sangre que haya quedado en la superficie de la piel,pero la gota gruesa no debe ser nunca de esta sangre. Debeextenderse inmediatamente. Si el servicio de malaria notiene ninguna clave o símbolo particular para identificaral donante, se inscribirán la iniciales de éste y la fechacon un lápiz blando del número 1, utilizando la numeraciónromana para indicar el mes; por ejemplo: KLM 17 V 8, osea, 17 de mayo de 1958.

Cuando la humedad es alta, se puede abanicar el porta-objetos con una cartulina. Un higroscopio * económicoresulta útil para indicar los cambios de humedad que afec-tan el secado de los portaobjetos.

En el mismo portaobjetos se pueden colocar transversal-mente cinco gotas gruesas estrechas, si así se desea, quese identificarán por el símbolo o número escrito con un lápizdel número 1, en el extremo inferior de la primera gota,o marcado con un lápiz de punta de diamante en la esquinainferior derecha del portaobjetos. Asimismo, para indicarla gota que se extrajo primero, la sangre de ésta puede ex-tenderse hasta uno de los bordes del portaobjetos.

TEORIA DE LA COLORACION DE LA SANGRE

La coloración de la sangre ha sido siempre complicadapor la gran variación inherente al azul de metileno. Virtual-mente, todos los colorantes de la sangre se derivan origi-nalmente del azul de metileno preparado de diversas ma-neras. Sabiendo que el empleo de los mismos lotes deazul de metileno e idénticos procedimientos pueden pro-ducir resultados sumamente variables, es fácil comprender

*A. Daigger and Co., 159 West Kinzie St., Chicago 10, Illinois.

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que no hay coloración de Giemsa, de Wright, ni de Leish-man que pueda dar resultados siempre uniformes. Enalgunos casos la diferencia suele ser tanta, que inutilizaalgunos lotes de colorante.

La Comisión de Coloración Biológica se constituyó enlos Estados Unidos en 1925, para ensayar todos los lotesde cada uno de los colorantes, con la esperanza de eliminarlos lotes que resultaren poco satisfactorios. Por lo tanto,es muy conveniente, al adquirir colorantes para sangre,buscar uno que tenga un número de certificación de laComisión de Coloración, lo que asegura que, por lo menosen el momento en que se ensayaron, los resultados fueronsatisfactorios para el tipo de trabajo que se iba a realizar.

Con respecto al colorante de Giemsa, de máximo interésen las actividades de la malaria, algunos laboratorios toda-vía preparan sus colorantes con los componentes usadosoriginalmente, a menudo con muy buenos resultados. Sinembargo, se aconseja al principiante que, salvo en circuns-tancias excepcionales, no trate de utilizar este método,porque no siempre es satisfactorio. Aunque en el mercadomundial se dispone de numerosos colorantes de Giemsa,todos buenos y a veces excelentes, no es posible recomendarcon seguridad uno especial. El procedimiento más seguroes obtener pequeñas muestras (1 a 5 gm), por lo menosde tres fuentes diferentes, que se deben ensayar extensa yrepetidamente con las técnicas y en las condiciones de lalocalidad. Sólo entonces puede hacerse un pedido en grancantidad.

Esto puede explicar la firme confianza que algunos in-vestigadores de larga experiencia tienen en marcas o tiposdeterminados de colorantes y puede explicar también,por qué algunos colorantes de Giemsa dan resultados satis-factorios si se disuelven en una marca de alcohol metílicopuro, y son manifiestamente menos satisfactorios con otrasmarcas. Los elementos disueltos se encuentran evidente-mente en un equilibrio químico tan delicado que cambios dereacción muy débiles pueden producir resultados sorpren-dentes.

El constituyente básico del colorante de la sangre con-siste en algún tipo de eosinato de azul de metileno disueltobien sea en alcohol metílico puro o en una proporción igualpor peso de ese alcohol y glicerina pura. Generalmente elalcohol metílico está libre de acetona, pero no todos los

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alcoholes libres de acetona dan resultados satisfactorios.Esta solución alcohólica de colorante de Giemsa es sólo unmedio conveniente para preparar la solución acuosa queen realidad colorea los elementos rojos, azules y violeta dela sangre. Es poco probable que los elementos disueltos per-manezcan en solución más de 45 a 90 minutos, después decuyo tiempo comienzan a precipitarse y desprenderse de lasolución. Esto tiene importancia en dos sentidos: 1) todaslas soluciones de Giemsa se deben preparar inmediatamenteantes de usarlas y 2) si el agua contamina la solución alco-hólica madre, se precipitarán de ésta valiosas porciones deelementos de coloración, en proporción a la cantidad deagua presente. Los resultados de la introducción diaria deuna pipeta húmeda en la solución madre, pueden ser desas-trosos. La contaminación acuosa del colorante alcohólicomadre es la más frecuente y sutil debido a la inherentecapacidad de los alcoholes puros para absorber humedad.Si se permite el acceso de aire a la solución alcohólica,especialmente en los trópicos donde la humedad es elevada,esto puede ocurrir rápidamente y es el origen de la antiguacreencia de que generalmente los colorantes de la sangrese deterioran en los trópicos. Por lo tanto, los tapones derosca de las botellas se deben apretar a intervalos, y lostapones de corcho se deben renovar cuando pierden elasti-cidad. En caso de usar tapones de vidrio esmerilado, sedeben limpiar cada vez que se hayan de tapar los frascos,para evitar que el polvo de colorante impida cerrarlosherméticamente.

A fin de impedir este deterioro invisible y continuo delcolorante de Giemsa, es conveniente usar botellas pequeñasde ensayo cuya capacidad sea suficiente para uno o dos díasde trabajo, a las cuales se agrega un pequeño tubo rectode ensayo para sostener un cuentagotas que sólo se usapara extraer directamente el líquido colorante de Giemsa.Pequeñas botellas de plástico con cuentagotas y herméti-camente cerradas con tapas de rosca, como las utilizadaspara perfumes y algunas medicinas, son ideales para traba-jar con el colorante Giemsa. Por lo tanto, las botellasmadre sólo se abren cuando es necesario llenar de nuevolas botellas de ensayo.

Las mismas precauciones descritas para el colorante deGiemsa, se deben adoptar con todos los otros tipos de colo-rante Romanowsky, como los de Wright y Leishman,

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aunque ordinariamente no se use glicerina. Se disuelvenen alcohol metílico puro en la proporción de 0.15-0.18 gm.por 100 cc. de alcohol metilico puro, mientras que la deGiemsa se mezcla como sigue:

Colorante Giemsa en polvo (certificado) 0.75 gm.Alcohol metílico puro 65.00 cc.Glicerina pura 35.00 cc.

A falta de Giemsa, a veces se obtienen excelentes resulta-dos usando los polvos de Wright o de Leishman en la mismaconcentración del Giemsa, y, naturalmente, con la mismatécnica.

Durante mucho tiempo, el método recomendado para lapreparación de los colorantes ha sido el de mezclarlos enun mortero. La pulverización prolongada con glicerina oalcohol metílico, o con ambos, sigue siendo un procedi-miento corriente. Es probable que esto pueda hacerse sinmayores consecuencias, en los climas secos, pero con estemétodo la exposición a la atmósfera es demasiado pro-longada. Además, invariablemente se adhieren terronesde polvo colorante húmedo a los lados del mortero y a lamano del mismo, donde generalmente se pierden para elproducto final. En lugar de este procedimiento, desde hacevarios años se ha recomendado y utilizado con resultadosatisfactorio, el de colocar el polvo seco directamente enuna botella de tamaño apropiado que contenga la cantidadadecuada de la mezcla de alcohol-glicerina, en la que tam-bién se introducen un mínimum de 50 cuentas de vidriomacizo, de pequeño tamaño, cuyo diámetro no exceda de 5mm. y que estén perfectamente limpias. Esta botella seagita intensamente a intervalos determinados, 6 a 10 vecesal día, durante un mínimum de 3 días. Después se extraendiariamente pequeñas muestras, que se filtran a través deun papel de filtro de grosor medio y se ensayan con sangrefresca. Cuando todos los elementos de la sangre aparecenen sus colores apropiados, se filtra una cantidad suficientedel colorante para una o dos botellas, y así, queda listo parasu uso; la cantidad restante del colorante se almacena sinfiltrar hasta que se necesite. En razón a la posible varia-ción de los distintos ingredientes, la botella madre debellevar una etiqueta grande en la que se enumerarán cuida-dosamente cada uno de aquéllos, así como la fecha de lapreparación.

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Hay que insistir en que todos los envases que contengancolorante liquido deben mantenerse herméticamente cerra-dos en todo momento. Si se siguen meticulosamente lasinstrucciones antes citadas, se observará que, con el tiempo,esos colorantes mejoran, en lugar de deteriorarse, bien sea"en los trópicos" o en cualquier otra región.

Diluentes.-Como solamente las soluciones acuosas reciénhechas de colorantes de la sangre dan a las preparacioneslos colores conocidos, tiene mucha importancia la clase dediluente que se utilice. En la coloración de la sangre sehan empleado como diluentes las siguientes clases de agua:

Agua de grifoAgua de ríoAgua de pozoAgua de manantialAgua de lluviaAgua destiladaAgua destilada dos y tres veces (en ampollas)Agua amortiguada o tamponadaAgua neutralizada

Hay que señalar que no es posible establecer una reacciónque resulte adecuada para todas las coloraciones. La pruebadefinitiva de la adaptabilidad o reacción del diluente con-siste únicamente en la apariencia de la sangre vista através de los oculares del microscopio. Por lo tanto, sedebe utilizar cualquier combinación que, de un modo cons-tante, proporcione buenos resultados, por poco ortodoxaque pueda parecer. En algunas zonas donde el agua sub-terránea pasa a través de bosques y prados, y terrenos are-nosos o arcillosos y rocas, el agua de grifo puede resultarsumamente conveniente para dicha finalidad. Por otraparte, cuando el agua pasa a través de rocas porosas y yeso-sas, o piedra caliza, puede ser inservible. El agua que hayaadquirido bacterias aerógenas, fermentos o algas puede re-sultar igualmente inadecuada. Se deben descartar todas lasaguas que no sean cristalinas.

La adición de sales amortiguadoras al agua diluyenteprodujo inmediatamente, en la mayoría de los casos, unnotable mejoramiento de la calidad de las preparacionespara la coloración de la sangre. En general, la reacción delos diluentes que produjeron esa mejora en la calidad, se

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acercaba al punto de neutralidad (pH 7.0). La experienciaha demostrado que no hay un pH estándar para todos lostipos de colorantes y que se debe buscar la reacción másadecuada para la coloración de que se trata. En la prácticavaría generalmente entre pH 6.6 y 7.4.

El fosfato de sodio (Na2 HPO4) y el fosfato de potasio(KH2PO4) son las sales amortiguadoras de uso corriente.Debido a que el fosfato de sodio cristalino contiene 12 molé-culas de agua de cristalización, al quedar expuesto al aire,no tarda en cubrirse de polvo blanco, por lo que no es posi-ble determinar su peso exacto. Cuando se mezcla con otroscristales, se forma una masa húmeda. Por lo tanto, es in-dispensable especificar que el fosfato monohidrógeno desodio sea anhidro; el fosfato dihidrógeno monopotásicopuede mezclarse así con la sal de sodio anhidra en cualquierproporción y sigue permaneciendo seco. En la práctica, sepueden preparar rápidamente soluciones eficaces agregandoun gramo de una mezcla de las sales de sodio y de potasioa cada litro de agua destilada en la proporción de 6 a 5o en cualquier otra que haya resultado satisfactoria. Semezclan perfectamente las cantidades correctas de esassales y se pulverizan en un mortero, y el polvo homogéneose pesa en lotes de 1 gramo (o más) y se coloca en pequeñostubos herméticamente cerrados o, si se va a utilizar inme-diatamente, se puede envolver en papel glasina, o disolveren pequeñas cantidades de agua.

Para la coloración adecuada de los frotis o extendidosde sangre, el agua destilada debidamente neutralizada paraesta finalidad, puede resultar mejor que las aguas amor-tiguadas. La preparación se hace neutralizando el aguadestilada a un indicador rojo de fenol con un álcali débilcomo el carbonato de litio al 0.2%. Se agita repetidamentehasta que el color deseado se mantenga por lo menos du-rante 20 minutos, y entonces puede usarse con colorantesde Wright o Leishman. Esta agua neutralizada no sólo esusada como diluente del colorante alcohólico sino que tam-bién deberá utilizarse para el enjuague final. Las salesamortiguadoras actúan como una especie de materialquímico elástico para inactivar (dentro de una esfera limi-tada) diversas cantidades de ácido y álcali. Por otra parte,la neutralización es una reacción química fija que no per-mite variaciones.

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TECNICAS DE COLORACION EN GENERAL

Los frotis se preparan extendiendo una gota muy pequeñade sangre fresca con el borde de un portaobjetos liso y sindespostillar. El espesor óptimo que se ha de obtener, debeconsistir en una capa de células sanguíneas, del mismo espe-sor que el de una célula; en contraste, la gota gruesa puedecontener de 6 a 20 veces esa cantidad de sangre, extendidasobre un área aproximadamente rectangular de 1.5 por 1.2cm. En el frotis de sangre, una sola capa de células seextiende horizontalmente sobre la superficie del vidrio. Lagota gruesa de sangre contiene numerosas capas de célulasen su acostumbrada formación de "rouleaux" (pilas demonedas) y el eje de las distintas células puede estar encualquier dirección. La coloración de la capa plana de lascélulas en el frotis o extendido de sangre, tiene por objetodemostrar, con el máximo detalle, las células sanguíneasy su contenido. Por lo tanto, esas preparaciones se fijanmediante la aplicación de alcohol metílico puro a fin deretener la hemoglobina en las células y de que puedan sercoloreadas. Es relativamente fácil ver a través de una solacapa de eritrocitos coloreados.

Si se colorearan así los glóbulos rojos de la sangre con-tenidos en la gota gruesa, no se podría ver nada, salvo enlos bordes extremos. Es necesario, por lo tanto, removerseparadamente la hemoglobina de las células rojas, utili-zando algunos de los diferentes métodos, o mejor duranteel proceso de coloración. Antes se utilizaban solucionesdébiles de ácido acético, agua destilada o bien otras mezclas,para remover la hemoglobina antes de agregar el colorantede la sangre. Esto producía frecuentemente no sólo unalisis completa de las células rojas de la sangre, sino tambiéndeterioro parcial, lisis y deformación de los leucocitos yotros elementos de la sangre. Después se estableció elmétodo de efectuar la deshemoglobinización en la solucióncolorante.

Los métodos de coloración de las gotas gruesas y losfrotis o extendidos son, por lo tanto, diametralmente opues-tos. Tanto el tiempo como el calor tienden a "fijar" lahemoglobina en los glóbulos rojos ya sea en frotis o engotas gruesas. Por lo tanto, es evidente que cuanto másrápidamente se coloreen las gotas gruesas, más completaserá la deshemoglobinización, y mientras mayor tiempoestén sin colorear, menos claras resultarán las prepara-

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ciones. En un clima cálido y húmedo pueden bastar de 7a 10 días para que una gota gruesa de sangre resulte inade-cuada para el examen, después de la coloración. Por otraparte, los frotis o extendidos pueden presentar una apa-riencia bastante buena.

Para demostrar lo que sucedería si se "fijaran" las gotasgruesas, basta con verter alcohol metílico puro sobre lamitad interior de una gota sostenida perpendicularmente,y exponerla a la técnica corriente de coloración para gotasgruesas.

Gotas Gruesas.-La coloración original de las gotas grue-sas consistía en cubrir una gota espesa bastante grandecon azul de metileno diluido. Como prácticamente noexistía visibilidad en la parte central, se pensó que si seagitara bien la sangre, el examen sería más fácil. Siguióun largo período en el que se consideró imprescindible ladesfibrinación, aún cuando un poco menos de sangre en lagota hubiera producido el resultado deseado. Práctica-mente sólo se usaba la coloración de Giemsa y se generalizóla dilución de una gota de la solución madre en 1 cc. de aguadestilada. Los portaobjetos con gotas gruesas se colocabana través de unas varillas de vidrio y la dilución de colo-rantes de Giemsa se vertía sobre ellos, dejando que ejercie-ra su acción durante una hora aproximadamente, despuésde lo cual ya estaban listos para examinar. Las cantidadesmayores se coloreaban, apoyadas verticalmente en losbordes o en los extremos, en vasos o cajas de coloraciónrectangulares de mayor o menor profundidad.

En 1929, Barber y Komp colocaron las gotas gruesasen un extremo de los portaobjetos y los separaron pormedio de una pieza de cartón bastante gruesa, de una pul-gada cuadrada, situada en el otro extremo. Por este pro-cedimiento, se podrían colorear simultáneamente gruposde 25 a 50 portaobjetos, colocándolos verticalmente en unacaja de coloración; de aquí surgió la práctica de colocarla gota gruesa de sangre en el extremo del portaobjetos. Sien uno de los portaobjetos de tales grupos existía una in-fección de P. falciparum muy acentuada, debida principal-mente a la debilitación de la sangre, algunas partes de éstaque contenían parásitos, ocasionalmente contaminaban losportaobjetos contiguos. El cuidadoso enjuague o el empleode un detergente puede evitar este inconveniente.

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Después del descubrimiento hecho por Pampana en rela-ción con la acción deshemoglobinizante de las solucionesisotónicas de azul de metileno, Field originó su método decoloración rápida para gota gruesa, que fuera usado tanextensamente durante la Segunda Guerra Mundial. Esteconsistía en una sumersión de uno a tres segundos en solu-ción "A", (una mezcla de azul de metileno y fosfatos),seguida de un enjuague breve en agua destilada, y unasumersión similar en solución "B" (una mezcla de eosinay fosfatos). La rapidez del método no daba tiempo parauna deshemoglobinización completa; pero mostraba tantoleucocitos como parásitos, coloreados con claridad y brillan-tez. Una modificación de esta misma coloración se desa-rrolló en la India, y es conocida como Coloración J.S.B.

Entre 1920 y 1930, un fabricante de equipos, en Londres,diseñó un dispositivo para coloración, ligeramente curvo,de tal manera que cuando en su curva se colocaba un porta-objetos invertido quedaba debajo del mismo un espacio de3 a 5 mm. de profundidad en el cual se vaciaba el colorante.Debido al peso característico de la molécula de hemoglo-bina, esta posición invertida de la gota gruesa permitía unadeshemoglobinización total en comparación con las otrasposiciones en las que los portaobjetos habían sido colorea-dos anteriormente. La medida de sumergir la lámina unsolo segundo en la mezcla de azul de metileno fosfatado(azul de metileno 1.0 gm.; Na 2HPO4 anhídrico, 3.0 gm.;KH2PO4, 1.0 gm. mezclado bien en un mortero, UNGRAMO DE LA MEZCLA disuelto en 300-350 cc. de aguadestilada), preservaba en gran parte los elementos celularesde la sangre sin interferir en la deshemoglobinización cuan-do la solución Giemsa era vertida bajo el portaobjetos colo-cado en la placa curva o en el dorso de una bandeja rectan-gular esmaltada, como la que muestra el diagrama 17 E. Seencontró que este tratamiento previo facilitaba la colora-ción con Giemsa, la cual ocurría después de la exposición desólo 6 a 10 minutos a la solución de Giemsa.

La coloración de la combinación popular de gota gruesa-extendido, requiere que el extendido sea "fijado" por sepa-rado con alcohol metílico antes de que la lámina sea colo-reada, con alguna variación de las técnicas antes mencio-nadas.

Los extendidos solos, pueden ser coloreados con Giemsadespués de haber sido "fijados" previamente, o con colo-

TRATAMIENTO PREVIO DE LAMINAS DE GOTA GRUESA POR LOSCOLABORADORES VOLUNTARIOS

Fig. 1

(a) Aspecto de la lámina de gota grueso de songre antes deltratamiento previo.

(b) Equipo sencillo que uso el coloborador paro tratar láminasde gota grueso con una solución fosfatado de azul demetileno. Consiste en una botella bien enjuagada quecontenga 300 cc. de agua destilado o de agua de Iluvia,un vaso pequefo y un platillo o bandeja pequeia.

(c) El cortucho de envio postol, que cuondo se devuelve alcolaborador contiene froscos pequeios de solución fosfatadade azul de metileno y sales amortiguadoras y un paquetede 3 portaobjetos.

(d) Bloc de hojas para la notificación de cosos de fiebre ypaquete de papel para envolver, que se suministran regu-larmente al colaborador.

Fig. 2Viértanse las sales amortiguadoras (el polvo blanco) en lo

botella de agua.

Fig. 3Una vez disueltas los sales, llénese con este liquido unas tres

cuartas portes del vaso. El agua con sales amortiguadoras puedeguardarse y utilizarse hasta que se enturbie.

Fig. 4Sujetando el portaobjetos formando un ángulo de 20 ° sobre el

platillo o bandeja, viértase rápidamente sobre aquél suficiente solu-ción fosfatada de azul de metileno (solución azul) hasta cubrir lasangre. Un segundo es suficiente para la acción de la solución azul.

Fig. 5Sumérjase inmediatamente el portaobjetos en el vaso que con-

tiene la solución amortiguadora.

Fig. 6Muévase suavemente el portaobjetos de un lado o otro en la

solución amortiguadora, hasta que la placa de gota gruesa desangre pierda el color rojo. Cuando se vuelva de un color azulfuerte, substitúyose el liquido por solución nueva de la botella.

Fig. 7Apóyese el portaobjetos contra una botella o cualquier otra

superficie adecuada, para que se seque. Se puede ver el portaob-jetos tal como aparece después del tratamiento y bastante trans-parente.

Fig. 8Envoltura del portaobjetos en su hoja de "Notificación de caso

febril".

Fig. 9Colocación del portaobjetos envuelto dentro del tubo de envío

postal, poro ser remitido al laboratorio.

II

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rantes May-Grunwald, Wright o Leishman, con los cualesse obtiene la fijación aplicando primero el colorante sindiluir y después el diluente.

Cuando las láminas de gota gruesa se demoran en llegara un laboratorio en el que se puede usar la técnica Giemsa,hay la posibilidad de tratarlas previamente con azul demetileno fosfatado y una sumersión en solución amorti-guadora de modo que cuando lleguen al laboratorio algunassemanas más tarde, puedan aún ser coloreadas con Giemsay se pueda obtener una preparación de calidad razonablepara ser examinadas. El diagrama 16 muestra como pue-den tratarse unos pocos portaobjetos en la casa de un cola-borador. Cuando se trata de numerosos portaobjetos (dia-grama 17) sólo se requieren las medidas A y B; se muevensuavemente hacia adelante y hacia atrás los portaobjetos enla segunda agua amortiguadora hasta que queda sólo unvestigio de color. Las gotas gruesas, después de muchosdías, probablemente se encuentran tan "fijadas" por eltiempo transcurrido que la solución de azul de metilenofosfatado no les surte efecto. Bajo tales circunstancias estamedida puede ser omitida.

Los portaobjetos que han sido pobremente coloreados,pueden algunas veces ser desteñidos con alcohol metílicopuro y vueltos a colorear de varios modos, algunas vecescon éxito considerable. Sin embargo, no se ha ideado to-davía una técnica que por sí sola dé resultados general-mente satisfactorios.

Recientemente han sido introducidos frascos plásticos degoteo cuya capacidad es de 30 a 150 cc. El coloranteGiemsa, al ser introducido en dichos frascos, se encuentramucho mejor protegido contra la contaminación con hume-dad que en cualquier recipiente previamente usado, el cualrequería una pipeta separada para contar el número apro-piado de gotas. Por lo tanto, el personal de evaluaciónestará equipado para colorear las láminas en el campo, ysolamente el pre-tratamiento de láminas puede ser hechopor los colaboradores. Lo único que se necesitaría paraequipar al personal de evaluación además del equipo yarecomendado, sería un pequeño abastecimiento adicionalde agua amortiguadora y una superficie limpia con unadepresión, según puede verse en el diagrama 17 E. Todaslas láminas tomadas por el personal de evaluación pueden,de esta forma, ser coloreadas en el campo una vez que se

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haya acumulado un número adecuado de ellas, basándoseen la colección diaria o cada dos días. Este método proveeráa los microscopistas con la mejor posible preparación parael examen.

Observaciones: La proporción de polvo de colorante re-querida es sólo un promedio y puede variarse la cantidadde acuerdo con los resultados obtenidos. Por ejemplo, sialgún colorante de Giemsa da buen resultado cuando hasido disuelto en cierta proporción con glicerina y alcohol,esas cantidades podrán ser aceptadas. Cuando la soluciónalcohólica es muy fuerte y los leucocitos están ligeramentesobrecoloreados, 5 ó 6 gotas en 10 cc. de diluente puedenser suficientes. Es mejor diluir el colorante con más alcoholy glicerina y de todas formas mantener la proporción uni-versal'de una gota de solución madre de colorante por 1 cc.de solución amortiguadora.

Lo mismo sucede con las soluciones amortiguadoras;se debe lograr la proporción de sales que dé resultados ópti-mos. Se prepara una serie con diferentes cantidades defosfato de sodio y fosfato de potasio, en las siguientesproporciones: 2:5, 4:5, 6:5, 8:5 y 10:5. Se colorean variaspreparaciones de la misma sangre con la misma Giemsa,usando la solución amortiguadora de un gramo de cadauna de estas proporciones con un litro de agua destilada.Se eligen aquéllas que den los mejores resultados. La pro-porción de 6:5 es la que seguramente se emplea con másfrecuencia.

TECNICAS DE COLORACION DETALLADA

Las gotas gruesas se solían colorear únicamente conGiemsa. Los portaobjetos se colocaban hacia arriba sobrevarillas de vidrio a una distancia de 5 cm. una a otra, ycuidadosamente niveladas; se vertía sobre los portaobjetossolución Giemsa fresca, 1 gota a 1 cc. de agua destilada oamortiguada, dejándose actuar durante 30 a 60 minutos.Después, se enjuagaban con el mismo diluente, se escurríany se secaban con calor.

Para colorear portaobjetos con Giemsa se disponía devasos de Coplin y cajas de coloración rectangulares y losbloques de portaobjetos arriba mencionados, se coloreabandel mismo modo.

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El tiempo de coloración varía con cada lote de colorantey debe ensayarse minuciosamente. La deshemoglobiniza-ción no es tan completa con el método de Field como conla técnica de azul de metileno de Giemsa, pero los coloresen los márgenes de la gota gruesa son aproximadamentelos mismos con los dos métodos.

Coloración de las Gotas Gruesas de Sangre (Walker)(Diagrama 17)

1. Compruébese minuciosamente la identificación del espé-cimen. Utilícese lápiz blando de grafito del No. 1 paracorrecciones o cualquier anotación. No debe usarse unlápiz grasoso.

2. Sumérjase el portaobjetos durante un segundo-no más-(dígase mentalmente: "ciento uno") en la soluciónde azul de metileno fosfatado; el portaobjetos puedeponerse en contacto con una toalla de papel u otra super-ficie absorbente para quitar rápidamente el exceso deazul. Para no cambiar tantas veces el agua amortigua-dora después de sumergir el portaobjetos en solución deazul de metileno fosfatado el extremo libre del porta-objetos debe ponerse en contacto con un paño de algo-dón o una toalla de papel bien mojados y escurridos.

3. Sumérjase de cinco a diez veces en solución amortigua-dora (1 gm. de la mezcla en la proporción 6:5 de lassales amortiguadoras por litro de agua destilada), comose usa para diluir Giemsa. Usense dos recipientes deboca ancha, de cristal, para más de 10 láminas y cámbie-se la solución cuando empiece a ponerse demasiadoazul. En caso de disponer de poca solución amortigua-dora se puede usar agua destilada.

4. Colóquense las láminas "hacia abajo" sobre la depre-sión de 4-6 mm. de una placa curva para coloración ode una charola esmaltada.

5. Déjese deslizar solución Giemsa recientemente prepa-rada (1 gota-1 cc. solución amortiguadora) por debajodel portaobjetos hasta que llene la depresión. Quítenselas burbujas que se formen en la gota gruesa o cercade ella.

6. Déjese obrar el colorante durante 6-10 minutos.7. Sumérjase el portaobjetos en solución amortiguadora

para eliminar el exceso de Giemsa.

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SOLUCION

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8. Escúrrase y séquese el portaobjetos con calor.9. Examínese con aceite de inmersión.

Coloración de extendidosLa coloración de extendidos se lleva a cabo, normalmente,

de una de las dos maneras siguientes:A. Fijación con alcohol y coloración con colorante

Giemsa en agua amortiguadora.B. Coloración con colorante de Wright o de Leishman

diluido con agua adecuadamente neutralizada.El primer procedimiento es más común pero el segundo

puede ofrecer resultados hematológicos mejores.Tal vez sea necesario utilizar una solución amortigua-

dora especial de proporciones de 3:5 a 5:5, en lugar de laproporción habitual de 6:5, para obtener la coloración delos puntos de Schüffner.

El agua neutralizada se prepara añadiendo de 20 a 40gotas de solución roja de fenol a 100-300 ml. de agua desti-lada. Se agrega carbonato de litio (0.2 por ciento), gotaa gota, hasta obtener un color rosa-violeta que permanezcaasí después de agitar bien la solución; el color debe perma-necer inalterado durante unos 20 minutos y si se aclararápidamente debe añadirse más carbonato de litio. El pHvaría entre 6.6 y 7.4, y el color que da buenos resultadoscon un determinado lote de colorante de Wright es el quese necesita, cualquiera que sea su pH.

Medidas a seguir en el método A1. Fíjense los extendidos con alcohol metílico puro, de-

jándolos a una distancia de 5 centímetros uno de otro.2. Colóquense los portaobjetos sobre varillas de vidrio hori-

zontales.3. Cúbranse con colorante Giemsa fresco preparado con

una gota de Giemsa por cada cc. de agua amortiguadoraen proporción 4:5.

4. Coloréense durante 30-60 minutos.5. Enjuáguese el colorante con abundante cantidad de agua

amortiguadora en proporción 4:5.6. Déjese salir el agua o utilícese papel secante.7. Séquense los frotis con calor suave.

Medidas a seguir en el método B1. Colóquense los portaobjetos sobre varillas de vidrio

horizontales.

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2. Cúbranse con colorante de Wright o de Leishman nodiluido.

3. Agréguense 1-2 volúmenes de agua neutralizada.4. Mézclese moviendo suavemente las varillas. No se debe

soplar.5. Enjuague el colorante con abundantes cantidades del

mismo diluente.6. Déjese salir el agua o utilícese papel secante.7. Séquense los frotis con calor suave.

Con cualquiera de los dos métodos de coloración los gló-bulos rojos se muestran de color de ante.

PREPARACION DE VARIAS SOLUCIONES PARAEL DIAGNOSTICO DE LA MALARIA

1. Fosfato de azul de metilenoAzul de metileno, medicinal .............. .. 1.0 gm.Ortofosfato disódico, anhidro (Na2HPO 4) ....... 3.0 gm.Ortofosfato monopotásico (KH2PO4 ) .............. 1.0 gm.Se mezclan completamente en un mortero seco y se colo-

can cantidades de 1 gramo en frascos pequeños bien tapo-nados. El contenido de un frasco se disuelve en 250-350 cc.de agua destilada o filtrada si es necesario.2. Colorante Giemsa, certificado, líquido, o

Colorante Giemsa en polvo, certificado .........- 0.75 gm.Alcohol metílico puro .................... 65.0 cc.Glicerina pura .....-............- 35.0 cc.Agítese bien en una botella con cuentas de vidrio tres

veces al día hasta que quede todo completamente mezclado.Manténgase siempre bien taponado. Fíltrese si es nece-sario. Si no se puede disponer de polvo Giemsa, se puedeutilizar polvo de Wright en la misma proporción.3. Agua amortiguadora

Ortofosfato monopotásico anhidro (NaHPO4) :. .6 gm.Ortofosfato monopotásico (KH2 PO) ......... .......... 5 gm.Mézclese totalmente en un mortero 1 gm. de mezcla para

1,000 ml. de agua destilada.4. El colorante de Field consiste en dos soluciones acuosas:

Solución A:Azul de metileno 0.8 gm.Azur 1 = Azur B 0.5 gm.Na2 HPO 4 anhidro 5.0 gm.KH2PO 4 6.3 gm.Agua destilada 500 cc.

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Solución B:Eosina amarilla s.a. 1.0 gm.Na.,HPO4 anhidro 5.0 gm.KH2,PO4 6.3 gm.Agua destilada 500 cc.

Para colorear, sumérjase el portaobjetos durante un se-gundo (1-3 seg.) en la solución A; lávese suavemente enagua destilada o amortiguadora; sumérjase durante dossegundos (1-4 seg.) en la solución B; después se lava suave-mente, se deja escurrir y se seca.5. Colorante de Wright, certificado, liquido o

Colorante de Wright en polvo, certificado ....0.15-0.18 gm.Alcohol metílico puro .................... 100 ml.Agítese bien en una botella con cuentas de vidrio y

manténgase perfectamente taponado en botellas pequeñas.Fíltrese si es necesario.

PORTAOBJETOS

Al parecer, la mayoría de la gente cree que estos objetoscorrientes y tan conocidos son unas piezas de cristal delongitud, anchura, grosor y calidad estándar. Sin embargo,esto no es así. Los portaobjetos de diferentes fabricantesy diversos países varían ligeramente en grosor, longitudy anchura. Antes de formular un pedido de portaobjetospara microscopio, hay que tener en cuenta la manipulacióna que han de ser sometidos. Se habrán de lavar y secarfrotándolos con fuerza, tendrán que enviarse a lugaresdistantes, en diversas condiciones, y se tendrán que alma-cenar y distribuir. Es muy posible que antes de que sedepositen sobre ellos las muestras de sangre, hayan tenidoque ser transportados a grandes distancias en "jeep", acaballo, en barco o a pie. Luego los portaobjetos llevaránmuestras de sangre cuya obtención puede costar desde unoscentavos hasta muchos pesos. Y pasarán por muchas manosantes de que la muestra sea finalmente examinada, verifi-cada y, por último, almacenada para futura referencia. Losportaobjetos han de tener suficiente resistencia para so-portar todas esas operaciones.

Si se tienen en cuenta todos estos puntos, no será proba-ble que se dé más importancia a la economía que a lasventajas que ofrece un portaobjetos de buena calidad.

Si sólo se dispone de portaobjetos ya usados, en grancantidad, se deben examinar uno por uno y descartar aqué-

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llos que presenten aunque sólo sea un principio de corro-sión, separando los restantes en grupos de idéntico color,grosor, longitud y anchura. Hecho esto, se deben lavar yempacar en grupos de conformidad con las normas con-tenidas en las instrucciones que figuran a continuación.

Entre los mejores portaobjetos para microscopio de quese dispone figuran los Micro, Red Label, Special A.H.T.No. 7030, no corrosivos. Son éstos muy uniformes y fuertesy de un grosor de 1.10 a 1.30 mm., con bordes pulidos yesquinas ligeramente redondeadas; el borde largo está lige-ramente biselado, lo que reduce considerablemente el riesgode cortes en los dedos durante la limpieza. El precio decatálogo es de $1.80 por gruesa. Los "clínicos" No. 7030-Bson idénticos a los descritos, pero sin borde biselado. Suprecio de catálogo es de $1.45 por gruesa.

Se pueden obtener en el mercado varias marcas de porta-objetos denominados "pre-cleaned" (pre-limpios). Si seajustan a las mencionadas condiciones y se demuestra queestán suficientemente limpios con la coloración Giemsa ysin grasa alguna, pueden ensayarse. Posiblemente podríanfrotarse con alcohol de 90 grados y de esta manera, utili-zarlos, aunque resultan caros.

El portaobjetos denominado de "seguridad" (safety-grip), de bordes irregulares, es también delgado y de menosde 1 mm. de grosor. Pero es dudoso que quede tan per-fectamente limpio como el de bordes pulidos.

Los portaobjetos nuevos, que no hayan sido usados, peroque hayan permanecido almacenados durante meses, encondiciones favorables, pueden presentar diferentes gradosde corrosión. De ser posible, no se deben utilizar paraexámenes de sangre, sino más bien darles otro uso.

Los portaobjetos nuevos se reciben generalmente en cajasde cartón, en las que sobra todavía un pequeño espaciodespués de haber colocado en ellas 72 portaobjetos. Si sellena ese espacio con un número adecuado de portaobjetoslimpios, generalmente de 3 a 8, queda el paquete en buenascondiciones para el embarque o almacenamiento. Paraenvío por correo es conveniente reforzar las cajas con car-tón acanalado y envolverlas en papel fuerte. Todas lascajas de cartón de esta clase se deben conservar para taluso.

Cuando esté indicado hacer frotis (hematología, pococomún, médula ósea) para la demostración de algún aspecto

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determinado de la infección malárica, es muy conveniente elempleo de los portaobjetos No. A-1463, Clay-Adams "mar-gin-free", para la preparación de buenos frotis delgados.

DIAGRAMA 18

LAMINA DE "MARGEN LIBRE"

Limpieza de los portaobjetos de microscopioLa coloración de los parásitos de la malaria y otros que

se encuentran en la sangre, es en realidad, una reacciónquímica muy delicada que se altera fácilmente por contactocon ácidos o álcalis muy diluidos, jabones, desinfectantesy materiales absorbentes, tales como suero o sudor secos.Un vestigio de grasa o aceite dificulta la penetración delcolorante y es la causa más común de que la sangre se des-prenda del portaobjetos en forma de pequeñas escamas.

Por esta razón no se ha encontrado hasta ahora unaforma de simplificar la limpieza de los portaobjetos. Nobasta con que las superficies estén muy pulidas, sino quehay que frotarlas fuertemente con un paño limpio hastaque no quede nada adherido al cristal. En realidad, serequiere tanta presión para hacer esto, que los principiantesfrecuentemente quiebran un buen número de portaobjetosal aprender a frotarlos debidamente. Los portaobjetos bienlimpios reducen también el número de elementos de confu-sión que puedan aparecer en cualquier preparación san-guínea.

Se halla muy generalizada la idea de que los portaobjetosnuevos, de una caja recién abierta, son los mejores. Pero

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esto no es cierto en modo alguno, porque los portaobjetosnuevos están frecuentemente contaminados por las materiasquímicas empleadas durante el proceso de pulimento, yéstas rara vez se eliminan lavando o sumergiendo largotiempo en agua los portaobjetos, antes de apretarlos unoscontra otros, para que despidan el agua sobrante.

Es indispensable contar con cajas de coloración quemantengan los portaobjetos separados unos de otros mien-tras se lavan, sumergen y enjuagan (diagrama 19). Estascajas van provistas de una tapa de ajuste flojo y tienenranuras para colocar los portaobjetos a fin de mantenerlosseparados (AHT No. 9194). Cada una de las personasque realicen los trabajos debe disponer, como mínimo, decuatro cajas.

CPortaobjetosJA RCTANuevos.-EstGULR Pportaobjetos CLORmeten alCON

Portaobjetos nuevos.-Estos portaobjetos se someten alsiguiente tratamiento: se colocan en bandejas de vidrio,con ranuras, que los mantienen separados unos de otros, yse sumergen, por lo menos de 12-24 horas, en un liquidopara limpiar cristal, que se prepara disolviendo 100 gr. debicromato potásico en un litro de ácido sulfúrico al 10%;esta solución se vierte nuevamente en la botella por mediode un embudo ancho, una vez utilizada. Los portaobjetosse enjuagan en agua corriente sin retirarlos del soporte.Si no se dispone de agua corriente, se cambia el agua variasveces hasta que desaparezca todo vestigio de ácido. Si sedispone de abundante agua destilada (que puede ser aguade lluvia recogida en una cubeta esmaltada bien limpia, colo-

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cada a medio metro del suelo), los portaobjetos se enjua-gan finalmente en ella antes de secarlos frotándolos firme-mente en dirección longitudinal. A continuación los por-taobjetos se colocan, uno por uno, sobre un cartón, mesa obanco muy limpios, para que se sequen totalmente lasorillas.

Si esta operación se hace bien, no habrá necesidad desumergir los portaobjetos en alcohol de buena calidad paraeliminar completamente la grasa. Si se utiliza alcohol, losportaobjetos deberán secarse antes de sumergirlos en él.Una vez secos, los portaobjetos se empaquetan, bien apreta-dos, en lotes de 10, 15 ó 20 (si son delgados) y quedan dis-puestos para su uso. Es conveniente indicar la fecha enque fueron empacados, porque, a veces, la humedad y lacontaminación del aire por los gases y derivados del petró-leo hacen necesario volver a lavar los portaobjetos antes deutilizarlos, cuando han permanecido empaquetados variosmeses.

Portaobjetos usados.-En todos los portaobjetos usadosqueda, después del examen, una cantidad mayor o menorde aceite de inmersión. Si se desea conservarlos para otroexamen, se puede verter en ellos unas gotas de tolueno debuena calidad y colocarlos en un escurridero de maderapara que se sequen. Después de esta operación, los portaob-jetos se envuelven en papel cebolla, de unos 11 x 21 cm.,y sobre el envoltorio se anota su identificación con lápizde plomo. Los portaobjetos coloreados, cubiertos de aceitese deterioran rápidamente si se dejan expuestos a la luzdel sol o esparcidos sobre un banco o mesa.

DIAGRAMA 20

Se ha de disponer de una vasija de vidrio, de esmalte oplástico (diagrama 20), que tenga por lo menos 10 cm. de

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profundidad y que se llenará hasta la mitad, con una fuertesolución (al 5%) de jabón o detergente (1/2 %) en la quese depositarán los portaobjetos que se han de lavar. Cual-quiera de los compuestos de limpieza para laboratorio simi-lares al de A.H.T. No. 3298, reseca menos las manos quelos detergentes comerciales de tipo corriente. Los porta-objetos no deben dejarse nunca a remojo en vasijas pocoprofundas, tales como platos o cubetas planas, pues casisiempre se dejan olvidados y la evaporación lenta del aguao de la solución deja unas marcas de corrosión en la super-ficie del portaobjetos que pueden ser permanentes. Nuncadeberán permanecer los portaobjetos en agua sola más detres días, pues ésta puede hacerse viscosa y formarse en lasuperficie una espuma muy desagradable. Cada dos a tresdías, los portaobjetos sumergidos en la solución de deter-gente o de jabón deben trasladarse a un recipiente de al-macenamiento mayor y más profundo. Si, mientras estánhúmedos, se pasan entre el dedo pulgar y el índice, la mayorparte de la sangre coloreada y del aceite se quedará en elprimer recipiente. Estos portaobjetos pueden colocarsejuntos, para su almacenamiento, en una solución débil dedetergente, pero para que queden bien limpios se debenseparar uno a uno o se han de manipular en las cajas decoloración mencionadas anteriormente.

En esas cajas se someten los portaobjetos al agua co-rriente durante media hora o bien se cambia el agua 20veces. Los portaobjetos nuevos pueden colocarse en aguacorriente, frotándolos ligeramente con los dedos, y enjua-gándolos durante media hora, también en agua corriente.

Puesto que los portaobjetos usados han sido expuestosal aceite, es, con frecuencia, más difícil dejarlos libres degrasa. Después de sacarlos del agua y dejarlos secar com-pletamente, se colocan en alcohol de 90-95°; se secan denuevo con un trapo limpio y se empacan. El alcohol puedeutilizarse varias veces si se pasa por un filtro de papel y sevuelve a guardar en la botella.

Observaciones.-Parecerá tal vez, que todo esto es muchotrabajo pero su necesidad se comprenderá sólo con ver ungrupo de varios portaobjetos preparados por un ayudantedescuidado y observar que, después de la coloración, noqueda en ellos mas que un círculo de sangre de la muestraextraída de una persona que quizás ya se encuentre a 100Km. de distancia.

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El método bacteriológico de flamear los portaobjetosantes de utilizarlos no es indispensable y, por otro lado,puede aumentar la fragilidad de éstos y acelerar la corro-sión. Tampoco se necesita hervirlos.

Los portaobjetos limpios se pueden guardar hasta que senecesiten, sumergidos en la misma cantidad de alcohol, enfrascos de boca ancha, de 5 cm. de diámetro por 10 cm. dealtura. Se frotan con trapos limpios especiales para vidrioy se empaquetan antes de utilizarlos.

Importancia de la limpieza de las toallas

Para lograr la meticulosa limpieza que se' requiere enlos objetos de vidrio, conviene disponer de abundantes toa-llas de un tejido de algodón adecuado y que tengan la menorcantidad posible de pelusas. El material no debe ser ni muygrueso ni muy delgado, y se le debe quitar todo el aprestolavándolo repetidas veces. Para confeccionar las toallas sepuede emplear una tela del tipo de la llamada "cabeza deindio", cortándola en piezas de 40 x 60 cm., y confeccio-nando los correspondientes dobladillos en los bordes. Estastoallas se han de utilizar solamente para secar la cristalería,y no deben emplearse jamás para las manos o la cara nipara secar la mesa o el fregadero.

Hay que tener en cuenta que estos paños de algodón raravez se ensucian si se utilizan únicamente para secar vidrio,pero como las manos de los individuos que las manipulanestán siempre más o menos sudadas, según el clima, lospaños absorben constante e imperceptiblemente el sudor.Por consiguiente, se deben lavar con frecuencia.

Las toallas sucias se remojan en agua y se enjabonanbien con un jabón de buena calidad, o se sumergen en unafuerte solución de detergente y se dejan en remojo durante15 ó 30 minutos o durante toda una noche. Después deremoverlas bien y de frotar con fuerza donde haya manchasvisibles, se enjuagan varias veces hasta que desaparece todovestigio de jabón o detergente. Cuando se dispone de abun-dante agua destilada, es conveniente utilizarla para unúltimo enjuague. Nunca se deben almidonar las toallas, ysi se entregan a lavanderías comerciales se han de enjuagarbien antes de utilizarlas. La plancha es innecesaria, salvoen el caso de que se desee secar las toallas más rápidamente.

Una vez lavados y secos, los portaobjetos usados se cla-sifican en grupos por el tamaño y color, teniendo en cuenta

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la longitud, anchura y grosor; después de clasificados, seempaquetan, bien apretados, en cantidades de 5, 10 ó 15.Si los paquetes contienen portaobjetos desiguales, el papelque los envuelve se rompe pronto. El diagrama 21 muestrala diferencia entre un paquete de portaobjetos seleccio-nados y otro sin seleccionar.

No es recomendable guardar los portaobjetos limpiosen los estuches corrientes de madera, de 25, 50 ó 100ranuras, porque están expuestos al polvo cada vez que seabre el estuche. Además, al mover la caja constantementese produce polvo de madera y aún de vidrio. Particular-mente los estuches de mayor tamaño se han de reforzarpara el transporte o el envío por correo y resultan volu-minosos. Cada laboratorio central debiera dedicar de 1 a 3estuches de esa clase a guardar portaobjetos con fines dereferencia y enseñanza.

DIAGRAMA 21

PORTAOBJETOS IRREGULARES

DISTINTOS TIPOS DE BORDES

PORTAOBJETOS SELECCIONADOS LISTOS PARA EMPAQUE

Manipulación, almacenamiento y transportede los portaobjetos

El empaque moderno de las mercancías dispone el con-tenido de tal modo que refuerza el envase. Cajas de cartónrelativamente delgado quedan fuertemente reforzadas porla disposición compacta de lo que en ellas se encierra. Salvoen el caso de aparatos extraordinariamente delicados, las

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cajas de madera o de metal, con paja o virutas, han sidosubstituidas enteramente por el embalaje en cajas de car-tón, "muy ajustadas," que ahorran espacio y peso.

Los portaobjetos acabados de preparar, se colocan, tanpronto como se secan, en paquetes bien apretados y compac-tos por grupos de 8 a 15-nunca más-como se ve en eldiagrama 22.

DIAGRAMA 22

Se cortan pedazos de cualquier papel fino y resistente,como el papel cebolla, junto con pedazos de cartón fuertede las siguientes medidas: 11.5 cm. x 21.5 cm.; para estaoperación, lo mejor es utilizar una guillotina de imprenta.Se colocan 50 de estas hojas entre dos pedazos de cartónde las dimensiones indicadas, que se sujetan con una goma,para mantener las hojas planas y los bordes iguales (laanchura del papel puede ser de unos 8 cm. si se hacenpaquetes de cinco portaobjetos).

El número necesario o previamente determinado deportaobjetos uniformes se colocan atravesados en la partemás estrecha del papel, de modo que por cada lado sobre-salga una parte igual de papel. Este se dobla sobre tresbordes del grupo de portaobjetos, a la vez que se mantienefirmemente la parte libre del papel, y el paquete se terminadando vuelta al grupo de portaobjetos hacia la parte libredel papel. Luego se doblan los extremos del papel y seaprietan firmemente contra los extremos del paquete. Secomprenderá la importancia de que los bordes sean unifor-mes, ya que, de esta manera, el paquete, de preparacióncompacta, se puede mantener en una posición firme.

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Cualquier intento de introducir papel entre los portaob-jetos contradice el principio mismo del empaque. El métodode envolver los portaobjetos en papel higiénico da lugar apaquetes flojos, en comparación con el que acaba de descri-birse, además de lo engorroso que resulta envolver y desen-volver los portaobjetos. Los portaobjetos con muestras desangre se transportarán mejor si se empaquetan de estemodo, que reduce al mínimo el movimiento entre ellos.

Cualquier identificación que sea necesaria se escribe conun lápiz blando en el "borde" de esos paquetes, para que nosea necesario abrirlos para identificar el contenido. En lospaquetes de portaobjetos recién limpios conviene escribirla fecha en que se limpiaron. Estos bloques o paquetes deportaobjetos se guardan en las cajas de cartón en que serecibieron, ya sea en la caja entera o en la parte inferior osuperior de la misma. Los "moldes de horno" metálicos,rectangulares de 18 x 28 x 3.5 cm. dan cabida a una cantidadde paquetes de portaobjetos que se pueda manejar bien,teniendo en cuenta su peso.

Las cajas de cartón para portaobjetos, llenas de estospaquetes, forman el embalaje más compacto y apropiadopara el transporte. Sólo se necesita colocar cartón acana-lado bien cortado para cubrir todos los lados, y atarlo fuer-temente con cordel, antes de envolver la caja en papelfuerte de empacar.

Los paquetes sueltos o las cantidades de portaobjetos queno sean suficientes para llenar una de esas cajas puedenembalarse por separado empleando tiras de cartón de an-chura apropiada. Las tiras de cartón acanalado se cortan dediversa anchura, con una hoja de afeitar "Gem", con unacuchilla, o, mejor todavía, con una guillotina de imprenta.Hay dos tipos principales: aproximadamente de 2.5 a 7.5cm. de ancho, en piezas sucesivas, cada una 0.5 cm. másancha que la anterior. Los canales han de estar en posicióntransversal y la longitud no ha de exceder de 60 cm. Luego,estas piezas se cortan de acuerdo con el tamaño del paqueteo paquetes de portaobjetos. Las tiras se colocan alternada-mente en cada eje longitudinal y se atan por separado, hastaque se logre cubrir suficientemente la masa de vidrio (véaseel diagrama 23). Finalmente, todo ello se envuelve conpapel de embalar. Estos paquetes pueden resistir una caídadesde gran altura contra metales, piedras o cemento.

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DIAGRAMA 23

> B

Un embalaje acostumbrado para enviar solamente unoo dos portaobjetos es la caja de madera reversible Thomas-7056. Tanto si se usa por pares como en serie, sóloexige una envoltura exterior de papel.

Cajas de cartón Adams, para un portaobjetos,A-1630, millar a .............-.......................... $26.00Cajas de cartón Adams, para dos portaobjetos,A-1625, millar a ........................................ $37.00Sobres para correo, millar a .............................. $12.50

Para mayor seguridad, se puede colocar una capa de car-tón a cada lado de estos embalajes, sujetándola con un papelfuerte de empacar, en vez de confiar solamente en el sobrede correo. Hay que recordar siempre que las muestras desangre de los portaobjetos representan un importante gastode tiempo y esfuerzo, así como considerables desplaza-mientos por parte de quien las tomó. Debe hacerse todo loposible para asegurarse de que esos esfuerzos no se perde-rán por extravío o rotura de los portaobjetos.

Los embalajes de cartón Adams, para cuatro portaobje-tos, A-1615, a $0.55 cada uno, puedn ser muy útiles parael personal de campo, en cuanto a la protección de los por-taobjetos contra las moscas, etc., hasta que estén secos yse empaqueten provisionalmente. Las bandejas Adamspara 20 portaobjetos, A-1605, a $12.60 por docena, per-miten distribuir y recoger rápidamente los portaobjetospara estudiantes o para el adiestramiento.

Los estuches corrientes de portaobjetos, con ranuraspara 25, 50 ó 100, resultan más útiles para el almacena-miento de material de demostración y especial que para suempleo en el campo, donde los portaobjetos restantes están

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expuestos al polvo, a la humedad y a las moscas, hasta quetodos han sido empleados.

Los portaobjetos positivos y otros de material excep-cional o de especial interés han de almacenarse de manerauniforme y ostentar etiquetas claras, por separado y engrupos, de tal modo que puedan encontrarse fácilmente.

Con frecuencia se puede disponer de envases tubularesde cartón con tapa de rosca y base metálica que miden12.1 x 3.2 cm. Estos envases pueden contener un paquetede 15 portaobjetos o dos paquetes de siete cada uno, conlas correspondientes tiras de papel bien dobladas.

DIAGRAMA 24

f<¿ ib

Este mismo envase se puede utilizar para portaobjetosy tubos destinados a colaboradores que se encuentren enlugares que no permitan que los portaobjetos con muestrasde sangre lleguen al laboratorio en menos de cinco días.El envase contiene un paquete de tres portaobjetos limpiosy tres tiras de papel dobladas, junto con dos pequeñosfrascos bien taponados de 4.5 x 1.3 cm. (véase diagrama24). Uno de estos frascos contiene 3-5 cc. de solución deazul de metileno fosfatado, y el otro sales amortiguadorassecas (0.2 gm.) suficientes para disolver en una botella deCoca-Cola de agua destilada o de agua de lluvia, que puedeverterse en una taza o vaso limpio. La primera soluciónse vierte sobre la muestra de sangre durante un segundo

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solamente, y luego se enjuaga el portaobjetos con el aguaamortiguadora hasta que sólo queda un vestigio de colorrojo.

SERVICIOS DE LABORATORIO

La finalidad de un laboratorio de diagnóstico de lamalaria es examinar, de una manera competente y rápida,el mayor número posible de muestras de sangre. Además,el laboratorio debe tener a su cargo todos los aspectosrelativos a esta labor especializada.

Hay que tener siempre presente que el examen de unamuestra de sangre para determinar la presencia de parási-tos es, realmente, una prueba muy limitada cuando elnúmero de parásitos es muy reducido. Por consiguiente,se debe adoptar un tipo de examen mínimo, como porejemplo 100 campos microscópicos por espécimen, a fin deno perder tiempo indebidamente en análisis inútiles desangres negativas.

Para que un servicio de laboratorio funcione de manerasatisfactoria es importante que todo el personal supervisorsepa exactamente lo que puede esperarse de los micros-copistas y cuáles son sus limitaciones. Los "jefes" inme-diatos del laboratorio han de recibir la suficiente instruc-ción técnica en cuanto a los procedimientos, a fin de quecada uno de ellos pueda descubrir las pequeñas desvia-ciones de los métodos prescritos y corregirlas antes de queafecten a la calidad general de la labor. Ejemplo de elloes el caso del trabajador que pide o utiliza algún productocontenido en una botella sin marbete, que se la facilita elmozo de limpieza o cualquier otra persona sin preparaciónalguna.

Asimismo, se deben determinar previamente los princi-pios y prácticas y estandarizar todos los procedimientossiempre que sea posible. Las modificaciones que ofrezcanmejores resultados pueden comprobarse minuciosamenteen el laboratorio central y adoptarse inmediatamente des-pués que demuestren ser satisfactorias. Esta rígida uni-formidad permite la rápida inspección del equipo y de losmétodos y facilita el intercambio de personal para serviciostemporales de observación, estudio o relevo.

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PersonalJefe del servicio de laboratorios.-Se dará preferencia

a una persona que posea el grado de Doctor en Medicina,y la selección debe hacerse atendiendo a las aptitudes yenergía más bien que a los títulos e instrucción oficial.

Este jefe del servicio de laboratorios deberá dedicar elprimer mes a la práctica de todos los procedimientos delaboratorio; deberá inspeccionar detalladamente los locales,las instalaciones, los microscopios, las lentes y todo el equiporestante de cada laboratorio bajo su supervisión, y deter-minar, al mismo tiempo, las limitaciones de este equipo.Exigirá el mayor grado de limpieza, y estudiará y tra-tará de resolver las dificultades que haya para mantenerlo.También deberá investigar personalmente cualquier defectode los métodos o materiales y corregirlo debidamente. Eljefe del servicio de laboratorios será la persona clave encuanto a la contratación de colaboradores.

Técnico jefe.-También en este caso, son más importantesla aptitud y la energía que los propios títulos y diplomas.Este funcionario tendrá a su cargo el laboratorio centraly todos los diagnósticos; confirmará todas las placas posi-tivas y, de vez en cuando, alguna negativa, y supervisarátodos los registros e informes.

Microscopistas.-El número de microscopistas dependerádel volumen de trabajo mensual, a base de un mínimo de75 exámenes de gota gruesa al día, más el personal quehabrá de reemplazarlos durante las vacaciones y períodosde más trabajo. Los microscopistas se someterán, al prin-cipio del período de adiestramiento, a un examen para de-terminar su visión de los colores.

Limpiadores.-Este personal recibirá instrucción sobrelas precauciones especiales que requiere este tipo de tra-bajo. A los que muestren un interés espontáneo se lesdeberá dar oportunidad de efectuar trabajos de micros-copio en cuanto se familiaricen con la marcha de las activi-dades.

Personal de oficina.-Este personal está constituido porescribientes, encargados del registro y secretarios, segúnlos métodos utilizados en el' determinado servicio y elvolumen de trabajo.

Adiestramiento de personal en general.--El adiestramien-to de personal no debe limitarse a un curso preparativo

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oficial, sino que debe ser una actividad constante. El estu-diante necesita dedicarse, por lo menos durante seis meses,a la observación de portaobjetos corrientes, a fin de familia-rizarse con los diversos aspectos de la sangre normal. Ellaboratorio central puede servir de campo de adiestramientoo ser una especie de internado, en que los técnicos proce-dentes de lugares alejados y laboratorios particulares pue-den turnarse después de aprender los procedimientos ycriterios modernos.

Se debe mantener el criterio de conceder la mayor impor-tancia a la gota gruesa y reducir al mínimo los extendidos.Hay que desalentar al estudiante en cuanto al empleo delos términos clásicos, tales como accolé, tira, "infeccionesmixtas", etc. Debe aprender la terminología actual y diag-nosticar con más precisión. Esto último abarca tres dis-tintas fases de P. falciparum. En lugar de anotar "infec-ciones mixtas", deben indicarse claramente las especiesdominantes y subordinadas, con abreviaturas tales comoF/8M/100 = dos más P. falciparum con 8 formas deP. malariae por 100 campos. Puesto que todas las especiesno falciparum muestran las diversas fases de desarrollo enla sangre periférica, independiente del momento de extrac-ción de la sangre, y puesto que sus gametocitos no per-sisten después que desaparecen las formas asexuales, resul-ta inútil y pedante mencionar la presencia de trofozoitos,esquizontes y gametocitos, cuando se entienden con lasletras, V, M y O.

Al principiante se le facilitará solamente el mejor ma-terial de estudio posible, hasta que conozca completamenteel diagnóstico de las especies. La calidad de los portaobjetoscon especímenes se puede ir reduciendo gradualmente hastallegar a los peores, procedentes del campo.

Todo intento de combinar aspectos de extendidos san-guíneos con diagnóstico de gota gruesa se presta a con-fusiones y no debe permitirse. El personal debe recibirconstante instrucción hasta que adquiera completa confian-za en la gota gruesa sola. Para muchos, el examen minu-cioso de varias infecciones constituye una gran ayuda puesles facilita una sólida base para comprender que los pará-sitos son dinámicos, se desarrollan y reaccionan frente a sumedio como cualquier otro animal. Su aspecto puede variarconsiderablemente pero el comportamiento de la infecciónen conjunto sigue pautas muy definidas.

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Equipo

Normas mínimas de calidad y cantidad, operación y man-tenimiento.-Para montar un laboratorio apropiado, seutilizarán, naturalmente, los edificios, habitaciones u otroslocales de que se disponga. En la práctica, en el labora-torio se hacen también trabajos entomológicos. Siempreque sea posible, el laboratorio de diagnóstico deberá estarseparado de todas las demás actividades, porque la natura-leza del trabajo que se realiza requiere un medio tranquilo.

El objetivo de un laboratorio de esta naturaleza consisteen el examen técnico de tantas muestras de sangre comosea posible. Debido a la creciente falta de muestras desangre positivas que estimulen el interés de los investiga-dores, el trabajo resulta cada vez más tedioso. Dentro deciertos límites se debe procurar la mayor comodidad a laspersonas que realizan esa fatigosa labor.

Es imprescindible disponer de una habitación amplia,bien ventilada y bien iluminada. Un ventilador eléctrico,preferiblemente en el techo, contribuye tanto al éxito delos procedimientos técnicos, como al bienestar físico delos que trabajan en los lugares calurosos y húmedos. Huel-ga decir que todo el local ha de estar protegido adecuada-mente con tela metálica y deben observarse rigurosamentetodas las medidas aplicables al control de las moscas. Enlos climas húmedos debe disponerse desde un principio,de un armario que se mantenga a temperatura templada,de tamaño adecuado para guardar por las noches los micros-copios en uso, y que estará provisto de bombillas eléctricasu otros dispositivos que permitan mantenerlo a una tem-peratura constante que no exceda de 35 ° C. aproximada-mente. Esto evitará eficazmente la acumulación de hongosen las lentes o prismas.

Las mesas y bancos deben ser de construcción sólida, deamplio tamaño y en número suficiente. Los bordes de lasmesas deben estar bien redondeados a fin de proteger losantebrazos de las personas que usan los microscopios. Laparte superior debe estar pintada de color negro opaco.La altura será de 75 a 85 cm. y de un ancho mínimo de 80cm. que permitirá usar la mayoría de los tipos de ilumina-ción.

No es esencial, ni siquiera preferible disponer de mobilia-rio especial de laboratorio. Una mesa de fabricación

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casera, estable, sólida, con un travesaño cómodo para des-cansar los pies, suele ser más conveniente que los tipos deescritorio o banco diseñados especialmente para uso delaboratorio.

Además de la mesa con travesaño y amplio espacio paralas rodillas, se deben proporcionar sillas, taburetes, u otraclase de asientos que se puedan adaptar a la estatura de lapersona que los utiliza tales como las sillas ajustables deescritorio, o se pueden utilizar almohadillas de manera quela postura no cause fatiga innecesaria. A este fin sueleser conveniente disponer de taburetes de diferentes alturas.

Asimismo, es indispensable contar con uno o más lava-deros con agua corriente, puesto que la limpieza de los porta-objetos y de toda la cristalería que se usa para la coloraciónes de la mayor importancia. Resulta muy conveniente tenerun gabinete o estantería que cierre herméticamente paraguardar la cristalería, botellas de colorantes y otros reacti-vos, y también disponer de archivadores y de un escritoriopara los trabajos de secretaría y registro.

Si se usa una balanza o báscula de buena calidad, senecesitará una mesa pequeña, independiente y firme, paraevitar los daños que pudiera causar el movimiento constante.

Hay que disponer constantemente de suficiente agua desti-lada. Quizá sea necesario recoger debidamente agua delluvia y conservarla en grandes recipientes de cristal. Unamoderna destiladora eléctrica proporciona abundante aguadestilada de excelente calidad.

A continuación figura una lista del equipo básico necesariopara un solo investigador. Puede aumentarse proporcio-nalmente al número de microscopistas que se calcule quetrabajarán en el laboratorio.

Lista de equipo de laboratorio para un solo investigadorMultiplíquese por el número de investigadores y estu-

diantes.1 microscopio binocular, limpio, con lentes apropiados parael factor de multiplicación dado para su cuerpo binocu-lar, por ejemplo:

1.5x y 1.6x1.25xlxlente 5x6x7x, 7.5x ú 8x

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1 carro mecánico, sólido y de fácil funcionamiento.1 cubierta de plástico para proteger del polvo.1 fuente de luz abundante de color blanco-azulado. Los

iluminadores empotrados que usen bombillas transpa-rentes (especiales) de menos de 25 vatios son inadecua-dos. Filtros de vidrio fino esmerilado azul claro debenacompañar al microscopio y al iluminador. La lámpara dela Optica Americana, tipo "Chalet", sin el cristal esmeri-lado y los filtros azules, se puede combinar con un matrazde bola lleno de agua teñida de azul, lo cual da una exce-lente luz si en este tipo de lámpara se usa una bombillade vidrio esmerilado ordinaria de 100 vatios. La partesuperior plana de la lámpara sirve de fuente de calorpara secar portaobjetos (A.H.T. 6958-E). La lámparade fabricación casera da los mismos resultados (dia-grama 4).

1 unidad de calefacción que dé una temperatura hasta35°C. instalada en un armario, para proteger los prismasy lentes del microscopio contra los hongos en los climascálidos y húmedos.

1 pequeño frasco para aceite de inmersión Shillaber "B"o Crown (ordinariamente los frascos aplicadores de 20cc. con varilla de cristal de 0.75 a 1 dólar por docena,resultan mejores que los que suministran las compañíasde óptica).

2 toallas que no desprendan pelusa, de 40 x 60 cm.4 fuentes rectangulares para coloración, de 7 x 9.5 x 4.5

cm. (véase el diagrama 19).2 lápices de plomo, blandos, No. 1.1 paquete de 50 hojas de papel cebolla de la mejor calidad,

usado para copias, 12 x 21.5 cm. Las hojas deberán estarcolocadas entre cartones de su mismo tamaño.

1 cuchilla puntiaguda Bard-Parker colocada en el corchode una botella de 2 oz. con boca de 2 cm.

1 hoja 00 ó 000 de papel de esmeril para mantener la puntade la cuchilla brillante, limpia y afilada.

1 paquete de gasa, un rollo pequeño de gasa o vendas, y sino se dispone de él, un rollo pequeño de algodón absor-bente de buena calidad y de fibra larga.

Equipo para colorear:

1 cronómetro de 1 min. a 2 horas, con timbre de alarmaque suene hasta que se haga parar.

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1 botella de 120 cc. de boca ancha, con una mezcla de fos-fato de azul de metileno.

2 vasos pequeños, de cristal o plástico, de forma cilíndrica

más bien C que cónica para el agua amor-

tiguadora de lavado.

1 botella de 30 cc. de colorante Giemsa bueno, o frasco-cuentagotas de plástico.

1 pequeño cuentagotas de plástico, que se mantendrá enposición vertical y seco en el interior de una botellapequeña y gruesa.

1 tubo de ensayo graduado, de 10-25 cc. (preferiblementede plástico), o tubos de ensayo marcados a 5, 10 y 15 cc.,que dan el mismo buen resultado.

1 bandeja de colorear, curva, o su equivalente con depre-sión de 4-6 mm., o una vasija rectangular de esmalteblanco (véase el diagrama 17 D y E).

1 botella ordinaria de vidrio o plástico, de 500, 750 ó1000 cc. de capacidad.

1 botella de sales de fosfato mezcladas y 6 pequeños tuboscon corchos, que puedan contener 0.5, 0.75 ó 1.0 gm. dela mezcla.

1 taco de madera dura de 1.8 x 2.5 x 12.5 cm. con cortestransversales de 1.3 mm. aproximadamente de ancho y5 mm. de profundidad.

1 paquete de toallas de papel.1 caja de material plástico para 25 portaobjetos, que pueda

contener, si es posible, gotas gruesas de sangre parademostración.

1 hoja de afeitar tipo Gem.2 piezas de cartón ordinario de empacar (acanalado).

Varios artículos necesarios para transportar, secar yempacar portaobjetos (cordel y papel de estraza paraenvolver).

Artículos complementarios para un laboratoriode zona o central

1 objetivo de repuesto de inmersión en aceite y 10 paresde lentes de 7x ó 7.5x si se van a usar microscopiosdiversos que carecen de lentes intermedios.

1 marcador para trazar círculos a los objetos micros-cópicos.

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12-24 matraces de 250-300 cc.1 lámina del tipo Ishihara para la prueba de visión de los

colores.Una serie de tacos de madera de 1 cm. y 2 cm. de grosor

y 6-8 cm. x 6 cm. de largo.Corchos de repuesto para todas las botellas, especialmente

las pequeñas botellas de trabajo Giemsa.1 botella cuentagotas de 30-60 cc. para tolueno puro, por

cada tres estudiantes.1 vasija oblonga, esmaltada, para colorear, de 34 x 25 x 5.5

cm., por cada tres estudiantes.1 pinta de aceite Cargille o Crown (de menor densidad).Giemsa-Ya sea solución madre de alta calidad comprobada

de Giemsa, o:4 x 5 gms. de un lote comprobado de polvos de Giemsatales como National Aniline NGel6.3 x 1 lb. de alcohol metílico puro libre de acetona, de lamejor calidad (a $2.00 cada una).2 lbs. de glicerina pura de la mejor calidad.1/2 lb. de cuentas de cristal sólidas.

Sales Amortiguadoras:

8 x /, lb. Na.HP04, anhidro.1 lb. de polvo fino o cristales KHPO4.10 gms. de azul de metileno, medicinal.1 botella de 2 litros de capacidad con ácido crómico (di-

cromato de potasio y ácido sulfúrico).1 embudo de 7.5 cm. para recoger el sobrante de las bande-

jas rectangulares de colorear.3 litros de alcohol de buena calidad para limpiar los porta-

objetos.Vasijas esmaltadas o de plástico, para la solución deter-

gente en que se colocan los portaobjetos utilizados.1-2 cubos esmaltados o plásticos.

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LOS "PECADOS MORTALES" EN LA MICROSCOPIADE LA GOTA GRUESA

1. MALA RESOLUCION

2. MALA ILUMINACION

3. NO MOVER CONSTANTEMENTE EL TORNILLOMICROMETRICO

4. PERMITIR QUE LOS LEUCOCITOS SE DESPLA-CEN AL PARECER RADIALMENTE

5. NO FAMILIARIZARSE CON EL ASPECTO DE LOSLEUCOCITOS, PLAQUETAS Y RESTOS DE ERI-TROCITOS, YA QUE ESTOS APARECEN EN CADAPREPARACION QUE HAYA DE OBSERVARSE

6. PERDER TIEMPO OBSERVANDO IMAGENES DU-DOSAS O CAMPOS MAL TENIDOS

7. USAR ESPEJO CONCAVO

8. USAR FRASCOS O BOTELLAS SIN ETIQUETAS

9. NO PROTEGER CONTRA EL AGUA, EN CUAL-QUIER PROPORCION, LAS SOLUCIONES ALCO-HOLICAS DE COLORANTE