leptospirosis generalidades y diagnostico · • la leptospirosis es una enfermedad que afecta a...

LEPTOSPIROSISGENERALIDADES Y

DIAGNOSTICO

Leptospirosis

• La Leptospirosis en una enfermedad infecto-contagiosa, aguda y febril causada por una bacteria del género Leptospira que afecta sobre todo a los animales salvajes y domésticos, que sirven como fuente de infección para el hombre.

Orden: SpirochaetalesFamilia: LeptospiraceaeGénero: LeptospiraSp.: interrogans

biflexaSerogrupo: PomonaSerovar: PomonaCepa: Pomona

• Clasificación: género Leptospira • dividido en 2 especies: • saprofítica L. biflexa s. l. • patogénica L. interrogans s. l.

• El género Leptospira está dividido en varias genomospecies

• Al menos 9 para leptospiras patógenas. • Pero hasta ahora para diagnóstico

experimental y epidemiológico la clasificación serológica se sigue utilizando.

• Las especies patógenas – L. interrogans, L. kirschneri, L. noguchi,

L. fainei, L. borgpetersenii, L. santarosai,L. weilii, L. inadai y L. alexanderi.

• No patógenas – L. biflexa, L. meyeri y L. wolbachi.

Características de la Bacteria

CARACTERISTICAS DE SUPERVIVENCIA

-Humedad

-pH

-Sales en el suelo

-Temperatura, Clima

-MO presentes naturalmente

Características de la Bacteria

CARACTERISTICAS MORFOLOGICAS

-Forma

-Diámetro

-Flexibilidad

-Movilidad

Bacterias Aerobias Estrictas

-Tiempo generacional 7-12 hs.-Temperatura 30 ºC-Medios enriquecidos

líquidos: Korthof, TA 80 (EMJH)semisólidos- 0,2 % agar: Fletchersólidos- 1%- 2% agar: TA 80 (EMJH)

Ciclo epidemiológico

Portador renal

Susceptibilidad

TRANSMISION

HORIZONTAL

DIRECTAIA- Coito- Orina- Secreciones

Organos

INDIRECTAAgua- Pastos-Barro (Insectos)

VIAS DE INFECCION(Transmisión)

VIAS DE INFECCION(Transmisión)

VERTICAL

CONGENITA (Transplacentaria)

Diagnóstico

CLINICO Manifestaciones Clínicas

MICROBIOLOGICO Detección del agente etiológicoAislamiento -Microscopía de COTincionesIFD - IHQ

MOLECULAR PCR- VNTR

SEROLOGICO MATTests Rápidos: ANTIGENO

TERMORESISTENTE TR ELISA

Métodos directos• Microscopia de campo oscuro• Coloraciones

GiemsaRojo congoImpregnación argéntica

• Inmunofluorescencia Directa

• Cultivos: Fletcher- EMJH

• Tecnicas moleculares

• Inoculación en animales de laboratorioCobayosHamsters

Método indirecto: serología

• Técnicas de tamizaje (Screening)Test de ELISAMacroaglutinación (Atg. TR)ContrainmunoelectroforesisInmunofluorescencia indirectaHemoaglutinación indirecta

• Técnica de confirmaciónTest de microaglutinación (MAT)

Foto de cobaya prenadaFOtos CD archivo 16467

X3-e.jpg

Foto H&E Foto W-S Microscopiode trasmision

TR MAT ELISA

MAT

• Prueba de referencia (gold standard)• Personal entrenado• Antígenos vivos• Mantenimiento del cepario• Interpretación• Chequeo del antígeno

SUEROS

CANINOS

BallumCanicola

IcterohaemorragiaePomona

Pyrogenes

CastellonisCanicola

CopenhageniPomona

Pyrogenes

Castellon 3Hond Utrecht IV

M20PomonaSalinem

SEROGRUPO SEROVAR CEPA

SUEROS EQUINOSPORCINOSBOVINOSOVINOS

CAPRINOS

BallumCanicola


GrippotyphosaSejroe

Tarassovi

CastellonisCanicola

CopenhageniPomona

GrippotyphosaWolfii-Hardjo

Tarassovi


M20Pomona

Moskva V3705

Perepelicin


MAT ELISA IgM

TEST RAPIDOS

Sensibilidad 100% 90 – 98% > 97%

Especificidad 100% 90 – 97% > 93%

Técnicas de biología molecular

• Reacción en cadena de la polimerasa (PCR)• Electroforesis en campo pulsado (PFGE)• Ribotipificación• Hibridación DNA-DNA• Análisis de multiples locus de VNTR

• OTROS METODOS DE TIPIFICACIONAnticuerpos monoclonalesAglutinación absorción cruzada

Aislados en la República ArgentinaBovinos: Pomona-Canicola-Hardjo

Ovinos: Pomona -Castellonis

Porcinos: Pomona-Icterohaemorrhagiae-Tarassovi-Canicola

Caninos:Canicola-Icterohaemorrhagiae

Animales silvestres-Ratas: Canicola-Icterohaemorrhagiae-Pomona-Grippotyphosa-Bataviae

Humano:Canicola-Icterohaemorrhagiae-Pomona-Grippotyphosa-Canicola

FIEBRE ABORTOS

ANOREXIA MORTANDAD PERINATAL

DIARREA FETOS AUTOLITICOS

CONJUTIVITIS RETENCION PLACENTARIA

NEUMONIA ATIPICA INFERTILIDAD

ENCEFALITIS DERMATITIS NECROTICA

HEMORRAGIAS MUERTE EMBRIONARIA

ANEMIA POLIARTRITIS EN TERNEROS

ICTERICIA ULCERA DE 3º PARPADO

NEFRITIS MASTITIS

AGALACTIA

Síntomas clínicos en bovinos

LEPTOSPIROSIS• LA LEPTOSPIROSIS ES UNA ENFERMEDAD QUE AFECTA

A LOS ANIMALES DOMESTICOS Y SILVESTRES, SIENDO DE DIFICIL ERRADICACION

• ESTA ENFERMEDAD ES DE DIAGNOSTICO COMPLEJO DEBIDO AL POLIMORFISMO DE SU PRESENTACION CLINICA

• LOS DAÑOS ECONOMICOS QUE PROVOCA SON DIFICILES DE CUANTIFICAR POR LA IMPRECISIÓN DE SUS INDICADORES

• LA VACUNACION ES EL MEDIO VALIDO DE CONTROL DE ESTA ZOONOSIS

Muchas Gracias!!!

Instituto de Patobiología del CICVy A INTA Castelar

MAT

SUERO SANGUINEOSUERO SANGUINEO OTRAS MUESTRAS

-HUMANO: 1/ 50 ORINA: 1/ 10-BOVINO: 1/ 200 LCR: 1/ 2-A. SILVESTRES: 1/ 50 LECHE: 1/ 2-OTRAS ESPECIES: 1/ 100 HUMOR ACUOSO: 1/ 2

DILUCIONES SIGUIENTES EN PROGRESION GEOMETRICA DE 2

SEROVARESREPRESENTATIVOS

TODOS LOSSEROGRUPOS

SUEROS

HUMANOS

SUEROSANIMALES

SILVESTRES Y DELABORATORIO

SUEROS

FELINOS

SUEROS

CANINOS

BallumCanicola


Pyrogenes

CastellonisCanicola

CopenhageniPomona

Pyrogenes


M20PomonaSalinem


SUEROS EQUINOSPORCINOSBOVINOSOVINOS

CAPRINOS

BallumCanicola


GrippotyphosaSejroe

Tarassovi

CastellonisCanicola

CopenhageniPomona

GrippotyphosaWolfii-Hardjo

Tarassovi


M20Pomona

Moskva V3705

Perepelicin


FARM ANIMALS NUMBER OF

SAMPLES

POSITIVES(%)

Bovine 2394 61,50%

Equine 223 59,64%

Porcine 125 57,00%

MAT

MAT ELISA IgM

TEST RAPIDOS

Sensibilidad 100% 90 – 98% > 97%

Especificidad 100% 90 – 97% > 93%

Laboratorio Referencia OIE

• Servicios Diagnósticos: MAT. Acreditación ISO 17025

IF

Aislamiento

Tipificación

• Asesoramiento técnico

• Proveedor de cepas de referencia

• Capacitación

Actividades del Laboratorio de Leptospirosis

1) USO DE INHIBIDORES

• 5-fluoruacilo: utilizado por los gérmenes contaminantes como materia prima para la síntesis de sus ácidos nucleicos.100-200 µg /ml

– Neomicina: bacteriostático o bactericida según su concentración. 300 µg/ml en medio EMJH y 5 µg/ml en medio de Fletcher o EMJH.

2) FILTRACIÓN

Filtro con membrana de celulosa con poro de 0,22 µm. Las leptospiras pasan a través de los poros mientras que los contaminantes quedan retenidos.

• VACUNACION

• Anual, la 1º dosis a los 4 meses de edad

• TIPOS DE VACUNAS

• Multivalente• Serotipos endémicos para cada

región• Cepas locales

C o n t r o l

AÑO

1

2

3

4

5

A: TOTAL DE LA POBLACION B: NACIDOS AÑO 1C: NACIDOS AÑO 2 D: NACIDOS AÑO 3 E: NACIDOS AÑO 4 F: NACIDOS AÑO 5

Plan de vacunación en bovinos

Laboratorio deLeptospirosisInvestigación

Servicios a terceros

Instituto de Patobiología del CICVy A

INTA Castelar

• La etapa de extracción del ADN es el punto critico

• Debe ser ajustada a los tejidos y fluidos, previniendo la presencia de substancias inhibidoras que podrán afectar el rendimiento de la PCR y alterar su resultado

Ex: pH extremos, congelación y descongelación , quelación de los iones Mg, hemoglobina, sales biliares, cloroformo y fenol

Extracción del ADN

Variedad de primers ha sido descrita, basada en los genes, mayoría género específicos 16S o 23S rRNA y algunos serovares específicos

para los genes de los elementos repetidores -IS

Primers leptospiras patogenas, hapl

Primers leptospiras saprofitas, 16S rRNA

Elección del primer para el diagnostico de la leptospirosis

animal


Género específico

MÈRIEN et al.;1992 - Lep1 y Lep2 , la región blanco :16S rARN de Leptospira interrogans serovar Canicola-331pb- patogenicas y saprófitasLEP 1: 5’ GGC GGC GCG TCT TAA ACA TG 3’LEP 2: 3’ TTC CCC CCA TTG AGC AAG ATT 5’

Gravekamp et al., 1993-G1 y G 2, ADN blanco del gene secY- Amplifican una secuencia de 285 pb, no amplifica los serovares L. kirschneri , necesita complementar con otro par de primerG1 5’-CTG AAT CGC TGT ATA AAA GTG2 5’-GGA AAA CAA ATG GTC GGA AG

B64I y B64II, Amplifican una secuencia de 563 pbB64I 5’-ACT AAC TGA GAA ACT TCT ACB64II 5’-TCC TTA AGT CGA ACC TAT GA


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