leche bioquimica
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En el cuarto informe de laboratorio de la asignatura de BIOQUIMICA DE
ALIMENTOS, el cual se titula, “CARACTERISTICAS DE LOS
COMPONENTES DE LA LECHE”. La leche es una secreción nutritiva de color
blanquecino opaco producida por las glándulas mamarias de las hembras (a
veces también por los machos) de los mamíferos . La leche de los mamíferos
domésticos forma parte de la alimentación humana corriente en la inmensa
mayoría de las civilizaciones: de vaca, principalmente, pero también de oveja,
cabra, yegua, camella.
Las proteínas del suero son compactas, globulares, con un peso molecular que
varía entre 14,000 y 1,000,000 de daltones, y son solubles en un amplio
intervalo de pH (se mantienen intactas cuando la leche se corta de manera
natural, ya que no ha habido presencia de calor que desnaturalice las
proteínas). En estado natural no se asocian con las caseínas, pero en la leches
tratadas térmicamente y homogeneizadas, una parte de estas proteínas sí lo
hace. Las proteínas del suero constan por lo menos de 8 fracciones diferentes,
todas sensibles a temperaturas altas (procesos térmicos) y por ello son las
primeras en degradarse con procesos como la pasteurización o la UHT. La
razón por la que la leche no se descompone estando fuera de refrigeración una
vez tratada térmicamente es porque las proteínas del suero, al
desnaturalizarse, liberan un grupo sulfhidrilo que reduce la actividad de la
oxidación de manera parcial.
Por la importancia del tema nuestro objetivo es el siguiente:
Identificar los principales componentes de la leche.
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Bioquímica de Alimentos-Ing. Livia Gutiérrez
2.1. Leche
La leche es un alimento completo, capaz de nutrir, hacer crecer y conseguir el
desarrollo normal de un neonato en sus primeros meses de vida. Los análisis de
laboratorio nos muestran que es rica en proteínas, carbohidratos, grasas, minerales y
vitaminas de una forma totalmente asimilable por el lactante. Por este motivo nos han
hecho creer, que si no tomamos lácteos se nos debilitarán los dientes, descalcificarán
los huesos y nuestros hijos no tendrán un índice normal de crecimiento. Y es lógico
pensar de ese modo, teniendo en cuenta que socioculturalmente la leche ha sido y es
un alimento introducido, comúnmente, como nutriente habitual e indispensable en las
dietas de millones de seres humanos.
Sin embargo, el sentido común nos conduce a pensar que la leche es necesaria para
el lactante y si observamos el comportamiento de los animales adultos en la
naturaleza, vemos que no maman y menos de una hembra de otra especie. De hecho
en cuanto se ordeña, empieza a contaminarse y a estropearse de forma rápida, siendo
capaz de doblar la población microbiana en 35 horas, a pesar de estar conservada en
el refrigerador. El hombre lo ha solucionado esterilizándola con calor en el proceso de
la pasteurización, pero de este modo no tiene los mismos beneficios y no resulta ser
igual de asimilable la leche de bovino que la que se mama de la madre (Santos, 1987).
Cuadro 1.Composición de nutrientes en un litro de leche
PROTEÍNAS 34g
Carbohidratos 49g
Lípidos 35g Sales
minerales 9g
Vitaminas
82% Caseínas
Lactosa Grasas saturadas 1,25 g Calcio
0’3 mg Tiamina
18% Lacto
albúmina Colesterol 1 g Fósforo 1’7mgRiboflavi
na
1,5 g Potasio
1mg Niacina
0’5 g Sodio 10mg Ácido ascórbico
150 UI vitamina A
FUENTE: Alais(1987)
2.2. Comparativa entre la leche humana y la leche de vaca diluida
Es de sabiduría popular el hecho de que para alimentar a un lactante con leche de
vaca es necesario diluirla, pero aún así no se consiguen líquidos idénticos.
La cantidad de proteínas de la leche humana, es 4 veces menor que la de la leche de
vaca y su diferente composición queda de manifiesto cuando se "cortan". En la
humana el 80% queda en el suero y el 20% en la cuajada, mientras que en la de vaca
es a la inversa, el 80% queda en la cuajada y el 20% queda en el suero. La parte
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proteica que cuaja está compuesta en su mayoría de caseínas y la que queda
solubilizada en el suero de L - albúmina.
La excesiva cantidad de caseína de la leche de vaca neutraliza la acidez gástrica
favoreciendo las infecciones intestinales. Además la caseína se coagula en gruesos
grumos que no pueden ser bien digeridos por el lactante. Las proteínas de la leche de
vaca "formulada" por la industria para bebés, son estables en el estómago durante
setenta minutos, mientras que las de la leche materna lo son sólo quince. Las
proteínas extrañas entran en el intestino delgado intactas, produciendo una
sensibilización prematura que puede ser una causa importante en el desarrollo
del asma y eccema infantiles.
También la composición de aminoácidos de las proteínas lácteas puede acarrear
algún desequilibrio, tal como ocurre con la cistina, que aunque se encuentra en la
misma cantidad en la de vaca y en la materna al diluirla puede ocasionar un déficit de
este aminoácido en el período neonatal. Con la dilución de la leche tampoco en
posible solucionar la proporción relativa de dos minerales importantes como son el
calcio (Ca) y el fósforo (P). La leche de vaca contiene 6 veces más fósforo (P) y 4
veces más calcio (Ca) que la humana, por lo que una dilución al 50% no puede
corregir la proporción calcio fósforo. Esto acarrea un estímulo permanente de las
glándulas paratiroideas y en consecuencia una excreción urinaria del exceso de
fósforo (lo que podría ser responsable de las tetanias neonatales que ocurren en la
primera semana de vida)(Alais,1987).
El hecho de que la leche humana sea más pobre en calcio (un 33% frente a un 118%
en la de vaca), cumple una misión muy concreta: favorecer la absorción intestinal de
los lípidos que de otra manera formarían jabones insolubles difíciles de absorber.
2.3. Desnaturalización de proteínas
Las proteínas se desnaturalizan cuando pierden su estructura tridimensional
(conformación espacial) y así el característico plegamiento de su estructura.
Las proteínas son filamentos largos de aminoácidos unidos en una secuencia
específica. Son creadas por los ribosomas que "leen" codones de los genes y
ensamblan la combinación requerida de aminoácidos por la instrucción genética. Las
proteínas recién creadas experimentan una modificación en la que se
agregan átomos o moléculas adicionales, como el cobre, zinc y hierro. Una vez que
finaliza este proceso, la proteína comienza a plegarse sin alterar su secuencia
(espontáneamente, y a veces con asistencia de enzimas) de forma tal que los
residuos hidrófobos de la proteína quedan encerrados dentro de su estructura y los
elementos hidrófilos quedan expuestos al exterior. La forma final de la proteína
determina cómo interaccionará con el entorno.
Si la forma de la proteína es alterada por algún factor externo (por ejemplo,
aplicándole calor, ácidos o álcalis), no es capaz de cumplir su función celular. Éste es
el proceso llamado desnaturalización(Santos,1987).
2.4.Cómo la desnaturalización afecta a los distintos niveles
En la desnaturalización de la estructura cuaternaria, las subunidades de proteínas
se separan o su posición espacial se corrompen.
La desnaturalización de la estructura terciaria implica la interrupción de:
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a. Enlaces covalentes entre las cadenas laterales de los aminoácidos (como
los puentes disulfuros entre las Cisteínas).
b. Enlaces no covalentes dipolo-dipolo entre cadenas laterales polares de
aminoácidos.
c. Enlaces dipolo inducidos por fuerzas de Van Der Waals entre cadenas laterales
no polares de aminoácidos.
En la desnaturalización de la estructura secundaria las proteínas pierden todos los
patrones de repetición regulares como las hélices alfa y adoptan formas aleatorias.
La estructura primaria, la secuencia de aminoácidos ligados por enlaces
peptídicos, no es interrumpida por la desnaturalización.
2.5. Efecto del pH sobre la estructura de las proteínas Los iones H+ y OH- del agua provocan efectos parecidos, pero además de afectar a la
envoltura acuosa de las proteínas también afectan a la carga eléctrica de los
grupos ácidos y básicos de las cadenas laterales de los aminoácidos. Esta alteración
de la carga superficial de las proteínas elimina las interacciones electrostáticas que
estabilizan la estructura terciaria y a menudo provoca su precipitación.
La solubilidad de una proteína es mínima en su punto isoeléctrico, ya que su carga
neta es cero y desaparece cualquier fuerza de repulsión electrostática que pudiera
dificultar la formación de agregados.(Alais,1987).
2.6. Efecto de la temperatura sobre la estructura de las proteínas
Cuando la temperatura es elevada aumenta la energía cinética de las moléculas con lo
que se desorganiza la envoltura acuosa de las proteínas, y se desnaturalizan.
Asimismo, un aumento de la temperatura destruye las interacciones débiles y
desorganiza la estructura de la proteína, de forma que el interior hidrófobo interacciona
con el medio acuoso y se produce la agregación y precipitación de la proteína
desnaturalizada.(Alais,1987).
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3.1. Materiales
Nombre Figura
Vasos de precipitación
Papel filtro
Embudo de filtración
Rejilla de asbesto
Gradilla
Cocinilla
3.2. Muestra
Nombre Figura
Leche
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3.3. Reactivos
Nombre Figura
Ácido acético
Papel pH
Carbonato de sodio
Solución del fheling A y B
Solución de Sudam III
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3.4. Metodología
Leche
Se precipito
(Caseína)
Se agito hasta neutralizar Se analizó las proteínas (Biuret)
Suero
Hirvió
Se precipito
Hirvió
Liquido claro
Se analizó azúcar reductor
(Fehling A y B)
Se analizó la grasa
(Sudam III)
Se analizó las proteínas
(Biuret)
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En la figura siguiente se muestra los pasos que se realizó en la práctica en la cual se
analizo los componentes de la leche (proteína, grasa y azúcar reductos)
cualitativamente.
Precipitación de la leche:
PH inicial = 6.5
Figura 1. Análisis cualitativo de la leche.
Agregar aprox 1.2ml de acido
acético para llegar hasta pH 4.5
50 ml
de
leche
Prec
Liq.
Filtrar
S
u
e
r
o
Realizar: Análisis de proteína
y de grasa
Liq
cl
ar
o
Realizar: Análisis de
Azúcar reductor
Precip.2
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4.1. Descripción de los análisis realizados
De la figura anterior, del precipitado 1 y 2 se analizo presencia de proteína y
grasa de la forma siguiente:
Para obtener el precipitado 2, al suero se agrego un poco de bicarbonato de
sodio lo cual aumento el pH de 4,5 a 6, luego se sometió a ebullición por 3
minutos, en lo cual se observo la precipitación de este y finalmente se separo
por filtración obteniendo precipitado 2 y el líquido claro.
Del liquido claro se analizo presencia de azúcar reductor, para lo cual se tomo:
4.2. Resumen del análisis cualitativo de la Leche
En el cuadro 1, se muestra los análisis realizados cualitativamente para cada
componente de la leche para lo cual se precipito dos veces, primero la leche luego el
suero con diferentes reactivos y al final se analizo el liquido claro.
Muestra Análisis de
proteína (Biuret) Análisis de grasa
(Sudam III)
Análisis de azúcar reductor (Fheling A y B)
Precipitado 1 Positivo Positivo -----------------
Precipitado 2 Positivo Positivo ------------------
Liquido claro --------------- --------------- Positivo
2ml de precipitado + 2ml de
reactivo de Biuret(2ml de
NaOH +1gota de sulfato de cobre)
Dio coloración violeta
(por presencia de
proteína)
2ml de precipitado + 4gotas
de reactivo de Sudam III
Dio coloración
Rosado (por presencia
de grasa).
2 m l de líquido claro +
2 ml de Soluciones de
Fheling(A y B)
Cambio de color (indica
que hay presencia de
azúcar reductor)
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Discusiones:
De acuerdo a la tabla 1, en la primera precipitación de la leche se observo que
posee proteína de acuerdo al reactivo de Biuret ya de inmediato viro la
coloración a violeta, mientras que en el segundo precipitado (suero) la color de
viraje ya fue mas débil la cual nos señalaría que habrá menor cantidad de
proteína ya que al cortar la leche sus proteínas pasan en mayor porcentaje a
la cuajada y en menor cantidad al suero. Al respecto Alais menciona que en la
leche de vaca cuando se cortan el 80% de proteína queda en la cuajada y el
20% queda en el suero.
Para obtener el segundo precipitado al suero se le agregó bicarbonato y fue
sometido a ebullición es decir a sometido a temperatura alta, entonces la
temperatura alta destruye las interacciones débiles y desorganiza la estructura
de la proteína, de forma que el interior hidrófobo interacciona con el medio
acuoso y se produce la agregación y precipitación de la proteína
desnaturalizada.
También se observo queen ambos precipitados al agregarle el reactivo de
Sudam III cambio la mezcla a color rosado lo cual nos indica que hay presencia
de grasa en estos, pero se podría mencionar que la cantidad de grasa en
estos no será la misma cantidad ya el primero es directamente de la leche
mientras que el segundo se precipito a partir del suero.
El análisis cualitativo realizado de azucares reductores al líquido claro se vio
un cambio de color, de color blanco a rojo ladrillo. La reacción se da en un
medio alcalino, el cobre procedente del CuSO4 se encuentra en forma de
hidróxido cúprico, y se forma la correspondiente sal Na2SO4.Cuando el
Cu(OH)2(color azul)se calienta en presencia de un compuesto reductor se
forma oxido cuproso(color rojo ladrillo).El cambio de color se debe por el
cambio de estado de oxidación de +2 a +1 del cobre.
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1. ¿Cómo se podría evaluar en forma cuantitativa las proteínas, carbohidratos y
grasa presente en la leche?
A. Determinación de proteína en leche
A 10ml de muestra agregar 0.4 ml de solución saturada de oxalato de potasio(K)
y 0.5 ml de fenolftaleína, agitar y dejar reposar 2 minutos, neutralizar con
hidróxido de sodio 0.1 N hasta obtener un color rosa pálido, agregar 2 ml de
formaldehído, dejar reposar 2 minutos y titular la nueva acidez producida con
hidróxido de sodio0.1N hastaobtener un color rosa pálido (el cual perdure por un
tiempo de 10 a 15 segundos) que indica el punto final de la reacción, titular
simultáneamente un blanco con 10 ml de agua 2 ml de formaldehído y 0.5 ml de
fenolftaleína.
g/l de proteína = (V1-V2) X 1.74 X 10
Dónde: V1= volumen de hidróxido de sodio 0.1N gastados para titular la
muestra.
V2= a volumen de hidróxido de sodio 0.1N gastados para titular el blanco. 1.74 =
factor empírico.10 ml = de la muestra.
B. Determinación de grasa en leche
Método de gerber
Por lo general consiste en la separación de la materia grasa por disolución en
ácido sulfúrico de todos los componentes, seguida por centrifugación en tubos
especialmente calibrados.
El método emplea también alcohol amílico que ayuda a romper la emulsión de
las grasas y previene la carbonización de las mismas.
Reactivos:
H2SO4 PARA Gerber (dens. 1.813-1.817 a 20- aprox 90 %)
Alcohol amílico puro (dens. 0,809-0,813 a 20º), libre de grasa.
Medir con pipeta 11 ml de H2SO4 para Gerber e introducirlos en el butirómetro
evitando mojar las paredes internas del cuello. Luego, agregar con rapidez 11
ml de leche con pipeta aforada, cuidando que forme un estrato encima del
ácido y no se mezcle con él, e inmediatamente agregar 1 ml de alcohol amílico.
Se tapa el butirómetro con el tapón especial correspondiente y se agita en
forma efectiva pero con cuidado, teniendo en cuenta que se produce una fuerte
elevación de la temperatura. Se pone el butirómetro en un baño de agua a 65-
70 ºC por 5-10 min. (Con el tapón hacia abajo). Retirado del baño, se seca
exteriormente y se centrifuga 3-5 min. La centrífuga consiste en un plato chato
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en el cual, mediante tubos metálicos, se adaptan los butirómetros dispuestos
de forma tal que los tapones de cierre queden dirigidos hacia afuera y la
porción graduada hacia el eje de la centrífuga. Se vuelve al baño de agua por
4-5 min., se lee inmediatamente el espesor de la capa de grasa acumulada en
la parte superior calibrada del butirómetro. Por ajuste adecuado del tapón de
cierre, se puede hacer coincidir la base de la columna de grasa con el cero de
la escala. Leyendo a la altura del menisco de la columna de grasa, se obtiene
directamente el% de grasa de leche. Si no es posible ajustar la superficie
inferior de la columna de grasa a cero, se ajusta a la marca de % completo más
próxima, y se tiene en cuenta al efectuar la lectura del menisco superior.
C. Determinación de carbohidratos totales
Normalmente, cuando se hace un análisis de principios inmediatos se
determina: humedad, proteína bruta, lípidos (grasa bruta) y cenizas. Los
hidratos de carbono normal mente se dan por diferencia.
Si queremos evaluar los hidratos de carbono, se siguen las siguientes etapas:
a. Desecación de la muestra.
b. Eliminación de lípidos (extracción con éter).
c. Extracción de hidratos de carbono.
d. Purificación y cuantificación por técnicas cromatográficas (HPLC).
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Alais L.(1987).Ciencia de la Leche. Editorial. Acribia. España
Santos Moreno (1987).Leches y derivados. Editorial Trilla. México
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Cálculos realizados
Operación realizada para la preparación del acido acético al 10% p/v
⁄
X=10 g de CH3COOH
LUEGO:
100G de reactivo → 99.8G DE CH3COOH
X de reactivo → 10g
X = 10.020g de CH3COOH
→ 10.020g ----------------100%
X --------------- 99.8%
X = 10.040g de CH3COOH
⁄
Volumen de CH3COOH = 9.56 ml
% de p/p (pureza) = 99.8%
Densidad de CH3COOH = 1.05 g/ml