Laura Córdoba García Departamento de Estructura de Macromoléculas

CNB-CSIC, Madrid Jueves, 4 de Julio de 2013

Sunday, July 17, 2011 Sunday, July 17, 201

Parte 1: Adenovirus

- Patógeno en animales y humanos

- Virus icosaédricos sin envuelta

- ADN bicatenario lineal

- Fibras o espinas implicadas en la unión celular

Waehler R, et al. Nat Rev Gen, 2007

Fibra

Dominio globular

Dominio fibroso

Base pentona

CAR Integrina

Estudio estructural de las fibras:

- Identificación de receptores celulares

- Estabilidad de las fibras virales y

descubrimiento de nuevos

plegamientos

- Uso como vectores en terapia génica

Las fibras de los adenovirus

PAdV-4 fibre galectin domain bound to tri-N-acetyl-lactosamine

(Mastadenovirus) TAdV-3 fibre head

(Siadenovirus)

Determinación de la estructura del dominio cabeza de fibras de nuevos adenovirus

Dominio globular

Dominio fibroso

Base pentona

Snake adenovirus (SnAd1)

Farka S.L., et al. Virus Res, 2008

- Perteneciente al género Atadenoviridae

- Genoma compuesto por 27kbp

- Proteína de la fibra compuesta por 415 aminoácidos

Clonaje y mutagénesis dirigida

234:HISTAGPSPPSKTSLDIAEELQNDKGVSFAFQAREEELGAFTKRTLFAYSGDGLTGPFKAPASAELSSFLTAHPKGRWLIAFPLGTGIVSVDEGILTLEISRSLPEVGSGSSFYLTEK:345

234:HISTAGPSPPSKTSLDIAEELQNDKGVSFAFQAREEELGAFTKRTLFAYSGDGLTGPFKAPASAELSSFLTAHPKGRWLIAFPLGTGIVSVDEGIMTMEISRSLPEVGSGSSFYLTEK:345

Cambio de los aminoácidos leucina 322 y 324 por metionina

Ligación

Dominio C-terminal de la fibra de SnAd1 Quick change site-directed

mutagénesis kit (Agilent Technologies, Inc.)

Expresión, purificación y cristalización - Cepas de expresión: BL21(DE3) y BL834(DE3)

- Purificación en dos pasos:

columna de níquel cromatografía de intercambio iónico

14kDa

Proteína nativa

14kDa

Proteína mutada (SeMet)

Vista frontal Vista lateral SnAd1

hAd2

Estructura atómica

Myoviridae

Podoviridae

Siphoviridae

- Infectan bacterias - Genoma DNA de doble cadena - Cabeza icosaédrica - Cola especializada en la

inyección del DNA en la célula hospedadora

- Placa basal a la que se unen

una o más fibras responsables del primer reconocimiento celular Vessler D.,et al. MMBR 2011

Orden Caudovirales

Parte 2: Bacteriófagos

Escherichia coli fago T7

- Familia Podoviridae

- Lítico

- Cápsida icosaédrica , 40 kb DNA

- Cola corta no contráctil de 20-nm de longitud

- Seis fibras compuestas por la proteína gp17

Bo Hu, et al. Science 2011

Las fibras de T7 Dominio de

unión al virus Dominio proximal

Dominio distal

Dominio cabeza

Dominio pirámide

Cápsida

Fibra

Cola

Estudios estructurales de las fibras:

- Tipado de bacterias

- Terapia fágica

V482A F516A

S483A I517A

V484A A518L

N501A D520A

N502A S541A

S503A R542A

W504A S543A

Y515A

V544A

Todos los mutantes expresaron proteína soluble, lo que sugiere que debe plegarse correctamente

Mutaciones introducidas en gp17 usando el Quick change site-directed mutagénesis kit

(Agilent Technologies, Inc)

Identificación de aminoácidos implicados en la unión al receptor celular

Mutación amber (TAG)

• Introducción de un codón stop prematuro pérdida de la función de la proteína

• Virus con mutaciones amber infectan solo ciertas cepas bacterianas supresoras de amber

• Herramienta útil para la generación de fagos con proteínas recombinantes fácil aislamiento en cepas no supresoras

Introducción de la mutación amber en gp17

ATG GCT AAC GTA ATT AAA ACC GTT TTG ACT TAC CAG TTA GAT GGC TCC AAT CGT GAT TTT AAT ATC CCG M A N V I K T V L T Y Q L D G S N R D F N I P

T7 wild-type

T7_gp17 mutante amber ATG GCT AAC GTA ATT AAA ACC GTT TTG ACT TAC TAG TTA GAT GGC TCC AAT CGT GAT TTT AAT ATC CCG M A N V I K T V L T Y L D G S N R D F N I P

*

Construcción del mutante amber gp17 mediante recombinación homóloga

Transformación * su+ E. coli Cultivo de E. coli

recombinantes

Infección con wild-type T7

*

T7 DNA

*

Clonaje del gen mutado

Recombinación homóloga

108 cells/ml

Wild-type T7

Progenie

Amber T7

su+

su-

+ + + +

- + + +

Stock viral amber

Secuenciación

MOI=0.1

(1010 pfu/ml)

*

Generación de virus T7 con fibras mutadas mediante complementación

mRNA

Proteína de la fibra mutada

E. coli su-

T7 DNA

Complementación

* gp17Am

*

* *

* *

Transformación

Infección

Progenie

petDuet-1

108 cells/ml

Cultivo de E. coli recombinantes

E. coli su-

IPTG

Contaje de placas

16 fibras mutantes

Diluciones virus T7 amber Genotipo 10-7 10-8 10-9

Wt_exp+ 40 3 0

Null 0 0 0 V482A 47 6 0 S483A 0 0 0 V484A 0 0 0 N501A 0 0 0 N502A 44 5 0 S503A 39 0 0 W504A 0 0 0 W515A 0 0 0 F516A 0 0 0 I517A 0 0 0 A518L 0 0 0 D520A 0 0 0 S541A 0 0 0 R542A 48 6 0 S543A 0 0 0 V544A 0 0 0

Diluciones virus T7 amber

Genotipo 10-7 10-8 10-9

Wt_exp+ 68 6 2

Null 0 0 0 V482A 45 1 0

S483A 31 3 1

V484A 10 2 0

N501A 5 0 0

N502A 20 2 1

S503A 63 4 1

W504A 5 0 0

W515A 1 0 0 F516A 0 0 0 I517A 13 2 0

A518L 0 0 0 D520A 0 0 0 S541A 0 0 0 R542A 12 0 0 S543A 55 5 0 V544A 50 10 0

Infectividad de los mutantes en BLRDE3 and TOP10

BLRDE3 (E. coli B) TOP10 (E. coli K12)

Secuencia wild-typeT7 5’- CTGGCCCCGATGGAATCTACTTCATAGCCTCTGATGGTGGATGGTTACGA- 3’ Secuencia degenerada 5’- CTGGCCCCGATGGAATCTACTTCNNGNDNNWNNNRGGTGGATGGTTACGA- 3’

Mutaciones aleatorias en aminoácidos 517-520

Secuencia wild-typeT7 5’-TCGGATTCAAGAATATTGCAGACAGTCGTTCAGTACCTAATGCAATCATGG- 3’ Secuencia degenerada 5’- TCGGATTCAAGAATATTGCAGACNDNNHNNWNNVNCCTAATGCAATCATGG- 3’

R=AG , W=AT, D=AGT, H=ACT, V=ACG, N=ACGT

Mutaciones aleatorias en aminoácidos 541-544

Construcción de una librería de fagos T7 con mutaciones aleatorias en la fibra

PRIMERS DEGENERADOS

Construcción de una librería del gen gp17

Librería del gen gp17

* * * *

Transformación

wt gp17 wt gp17

Mutante 517-520

E. coli BL21

E. coli BL21

E. coli BL21

E. coli BL21

E. coli BL21

Mutante 541-543

Pool 517-520

Pool 540-544

Producción de virus mutantes mediante recombinación homóloga

Cultivo de bacterias recombinantes

Infección con el mutante amber gp17

*

T7 DNA

Recombinación homóloga

*

*

* * *

*

E. coli BL21

E. coli BL21

E. coli BL21

E. coli BL21

E. coli BL21

E. coli BL21

Acknowledgements

Mark van Raaij lab (CNB-CSIC) - Abhimanyu Kumar Singh - Marta Sanz - Carmela Garcia-Doval - Meritxell Granell - Thanh Hong Nguyen