las proteínas enzimáticas están formadas por una gran cantidad de aminoácidos (aa), que cumplen...
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Las proteínas enzimáticas están formadas por una gran cantidad de aminoácidos (AA), que cumplen funciones diferenciadas:
No esenciales, estructurales, de unión y catalíticas.
•Los AA no esenciales pueden ser reemplazados y, en algunos casos, eliminados sin pérdida significativa en la función o conformación de una enzima.
•Los AA estructurales = conforma ción de la enzima, "forman su esqueleto".
•Los AA de unión = asociación entre la enzima y el sustrato.
•Los AA catalíticos = transformación del sustrato.
Estructura de una enzima
Enzima y su sustrato
Unión al centro activo
Formación de productos
E + S E + S ES ES E + E + P P
Complejo enzima-sustratoComplejo enzima-sustrato
Reacción catalizada por una Reacción catalizada por una enzima:enzima:
centro activocentro activo región concreta de la enzima donde el sustrato región concreta de la enzima donde el sustrato se unese une
un un sitio de uniónsitio de unión formado por los aminoácidos que formado por los aminoácidos que están en contacto directo con el sustrato y están en contacto directo con el sustrato y
un un sitio catalíticositio catalítico, formado por los aminoácidos , formado por los aminoácidos directamente implicados en el mecanismo de la directamente implicados en el mecanismo de la reacciónreacción
El El centro activocentro activo comprendecomprende
Centro activo: Es el sitio donde están los AA de unión al SS y los AA que median el efecto catalítico de la enzima. (uniones intermoleculares de la enzima c/el S en una orientación tal que encajan correctamente, como las piezas en un rompecabezas).
Sitio de unión: Sitio de unión: es el que le da la especificidad a la enzima
Sitio Sitio
catalíticcatalíticoo
El sustrato El sustrato se unese une a la enzima luego se inicia la a la enzima luego se inicia la catálisiscatálisis
MODO DE ACCIÓN DE MODO DE ACCIÓN DE LAS ENZIMASLAS ENZIMAS
La acción de los catalizadores consiste en disminuir La acción de los catalizadores consiste en disminuir la Energía de activaciónla Energía de activación
Las enzimas son catalizadores especialmente eficaces, ya Las enzimas son catalizadores especialmente eficaces, ya que disminuyen la Ea aún más que los catalizadores que disminuyen la Ea aún más que los catalizadores inorgánicos. inorgánicos.
Por ej, la descomposición del agua oxigenada (HPor ej, la descomposición del agua oxigenada (H22OO22) puede ) puede ocurrir ocurrir – sin catalizador Esin catalizador Eaa= 18 = 18
Kcal/molKcal/mol– con un catalizador inorgánico (platino) Econ un catalizador inorgánico (platino) Eaa= 12 Kcal/mol= 12 Kcal/mol– con una enzima específica (catalasa) Econ una enzima específica (catalasa) Eaa= 6 Kcal/mol= 6 Kcal/mol
Así, se puede calcular que el Así, se puede calcular que el platino acelera la reacción platino acelera la reacción 20.000 veces20.000 veces, mientras que la , mientras que la catalasa la acelera 370.000 catalasa la acelera 370.000 vecesveces. .
Dos modelos sobre la forma en que el sustrato Dos modelos sobre la forma en que el sustrato se une al centro activo del enzima:se une al centro activo del enzima:el modeloel modelo llave-cerradura llave-cerradura el modelo del el modelo del ajuste inducidoajuste inducido
MODO DE ACCIÓN DE LAS MODO DE ACCIÓN DE LAS ENZIMASENZIMAS
MODELO LLAVE-CERRADURAMODELO LLAVE-CERRADURA
La estructura del sustrato y la del centro activo La estructura del sustrato y la del centro activo son complementariasson complementarias
Este modelo es válido en muchos casos, pero Este modelo es válido en muchos casos, pero no es siempre correcto no es siempre correcto
MODELO DEL AJUSTE INDUCIDO MODELO DEL AJUSTE INDUCIDO
el centro activo adopta la el centro activo adopta la conformaciónconformación idónea sólo en idónea sólo en presencia del sustratopresencia del sustrato. .
La unión del sustrato al centro activo de la enzima La unión del sustrato al centro activo de la enzima desencadena un cambio conformacional que da lugar a la desencadena un cambio conformacional que da lugar a la formación del producto.formación del producto.
Modelos de la interacción E Modelos de la interacción E - S- S
Cofactores - Cofactores - CoenzimasCoenzimas
A veces, una enzima requiere p/su A veces, una enzima requiere p/su función la presencia de sustancias no función la presencia de sustancias no proteicas que colaboran en la catálisis:proteicas que colaboran en la catálisis: Los Los cofactorescofactores. Pueden ser iones . Pueden ser iones inorgánicos como el Feinorgánicos como el Fe++++, Mg, Mg++++, Mn, Mn++++, , ZnZn++++ etc. Casi un tercio de las enzimas etc. Casi un tercio de las enzimas conocidos requieren cofactores. conocidos requieren cofactores.
Cuando el Cuando el cofactor es una molécula cofactor es una molécula orgánicaorgánica se llama se llama coenzimacoenzima. .
Cofactores - Cofactores - CoenzimasCoenzimas Muchas de estas coenzimas se sintetizan a partir Muchas de estas coenzimas se sintetizan a partir
de vitaminas. de vitaminas.
Cuando los cofactores y las coenzimas se Cuando los cofactores y las coenzimas se encuentran unidos covalentemente a la enzima encuentran unidos covalentemente a la enzima se llaman se llaman grupos prostéticosgrupos prostéticos. .
La forma catalíticamente activa de la enzima = La forma catalíticamente activa de la enzima = holoenzima. La parte proteica de una holoenzima holoenzima. La parte proteica de una holoenzima se llama apoenzima (inactiva), de forma que: se llama apoenzima (inactiva), de forma que:
apoenzima + grupo prostético= apoenzima + grupo prostético= holoenzimaholoenzima
Coenzima: NADCoenzima: NAD++
Deriva de la Vitamina BDeriva de la Vitamina B55 (ácido nicotínico)(ácido nicotínico)
Coenzima: Coenzima: FADFAD
FAD forma oxidada
FADH2 forma reducida
Deriva de la Vitamina BDeriva de la Vitamina B22 (flavina) (flavina)
Es grupo prostéticoEs grupo prostético
APOENZIMA
La La cinética enzimáticacinética enzimática estudia la estudia la velocidad de las reacciones catalizadas velocidad de las reacciones catalizadas por enzimaspor enzimas. .
La La velocidad velocidad de una reacción catalizada por de una reacción catalizada por una enzima una enzima puede medirse con relativa puede medirse con relativa facilidadfacilidad, ya que en muchos casos , ya que en muchos casos no es no es necesario purificar o aislar la enzimanecesario purificar o aislar la enzima. .
Estos estudios proporcionan información Estos estudios proporcionan información directa acerca del directa acerca del mecanismomecanismo de la reacción de la reacción catalítica y de la catalítica y de la especificidadespecificidad de la enzima. de la enzima.
CINÉTICA ENZIMÁTICA CINÉTICA ENZIMÁTICA
CINÉTICA ENZIMÁTICA CINÉTICA ENZIMÁTICA
CINÉTICA ENZIMÁTICA CINÉTICA ENZIMÁTICA
MODELO CINÉTICO DE MODELO CINÉTICO DE MICHAELIS-MENTENMICHAELIS-MENTEN
Finales del siglo XIX: estudios sistemáticos del efecto de la concentración inicial del sustrato s/la actividad enzimática. En 1882 se introdujo el concepto del complejo enzima-sustrato como intermediario del proceso de catálisis enzimática.
En 1913, Leonor Michaelis y Maud Menten desarrollaron esta teoría y propusieron una ecuación de velocidad que explica el comportamiento cinético de las enzimas.
La velocidad de una reacciónLa velocidad de una reacción
La medida se realiza siempre en:La medida se realiza siempre en:
Condiciones óptimas Condiciones óptimas de pH, temperatura, presencia de pH, temperatura, presencia de cofactores, etc, de cofactores, etc,
C/concentraciones saturantes de sustratoC/concentraciones saturantes de sustrato. .
En estas condiciones, la velocidad de reacción En estas condiciones, la velocidad de reacción observada es la velocidad máxima (Vmax). observada es la velocidad máxima (Vmax).
Se expresa en Se expresa en aparición de los productos o la aparición de los productos o la desaparición de los reactivosdesaparición de los reactivos
MODELO CINÉTICO DE MICHAELIS-MODELO CINÉTICO DE MICHAELIS-MENTENMENTEN
CÁLCULO DE LA CÁLCULO DE LA KKMM Y DE LA Y DE LA VVmamaxx DE UN ENZIMA DE UN ENZIMA
v = vv = v33 = k = k
33 [ES] [ES]
V = velocidad de la reacción catalizada por la enzima
La representación gráfica de la ecuación de Michaelis-Menten es una hipérbola . La Vmax corresponde al valor máximo al que tiende la curva experimental, y la KM
corresponde a la concentración de sustrato a la cual la velocidad de la reacción es la mitad de la Vmax.
La constante de Michaelis-Menten (La constante de Michaelis-Menten (KKMM) es un ) es un parámetro cinético importante por varias parámetro cinético importante por varias razones:razones:
KKMM = [S] para la cual la velocidad de = [S] para la cual la velocidad de reacción es la mitad de la velocidad reacción es la mitad de la velocidad máxima.máxima.
El valor de KEl valor de KMM da idea de la afinidad de la da idea de la afinidad de la enzima por el sustrato: enzima por el sustrato:
– a a menor Kmenor KMM, , mayor afinidad mayor afinidad del enzima por el del enzima por el sustrato, y sustrato, y
– a a mayor Kmayor KMM, , menor afinidadmenor afinidad. .
Hay enzimas que no obedecen la ecuación de Michaelis-Hay enzimas que no obedecen la ecuación de Michaelis-Menten. Se dice que su cinética Menten. Se dice que su cinética no es Michaelianano es Michaeliana. .
Esto ocurre con las Esto ocurre con las enzimas alostéricasenzimas alostéricas, cuya gráfica , cuya gráfica de v frente a [S] no es una hipérbola, sino una sigmoide de v frente a [S] no es una hipérbola, sino una sigmoide
En la En la cinética sigmoideacinética sigmoidea, pequeñas variaciones en la , pequeñas variaciones en la [S] en una zona crítica (cercana a la KM) se traduce en [S] en una zona crítica (cercana a la KM) se traduce en grandes variaciones en la velocidad de reacción.grandes variaciones en la velocidad de reacción.
Regulación de la actividad Regulación de la actividad enzimáticaenzimática
Como ocurre con toda proteína, la actividad de una enzima depende de factores tales como:
la temperatura,
el pH,
las disoluciones salinas,
los solventes,
los activadores y los inhibidores,
el tiempo de reacción.
Factores que afectan la Factores que afectan la cinética enzimáticacinética enzimática
La actividad puede estar afectada por:La actividad puede estar afectada por:
pH - Temperatura - Fuerza iónica - InhibidorespH - Temperatura - Fuerza iónica - Inhibidores
Efecto el pHEfecto el pH
La mayoría de las enzimas son muy sensibles a los cambios de pH. Desviaciones de pocas décimas del pH óptimo pueden afectar drásticamente su actividad. Por ello, los seres vivos han desarrollado sistemas más o menos complejos para mantener estable el pH intracelular
Variaciones del pH del medio producen cambios en el estado de ionización de algunos grupos de una enzima, afectando su estructura tridimensional y su actividad. El cambio en la ionización de grupos químicos del sitio activo puede alterar el reconocimiento del sustrato o la reactividad de los AA del sitio activo. Todas las enzimas tienen dos valores límites de pH entre los cuales son efectivas, más allá se desnaturaliza y deja de actuar.
Efecto de la TemperaturaEfecto de la Temperatura
Factor temperaturaSi aumenta la temperatura, aumenta la energía cinética de las partículas y su movilidad produciéndose un aumento en el número de colisiones y la velocidad de la transformación. Si la temperatura continúa aumentando, se comienzan a romper unio nes intermoleculares (responsables de la conformación) y, así, comienza a disminuir su actividad. Si la TºC es excesiva, la enzima se desnaturaliza perdiendo totalmente sus propiedades catalíticas.
IrreversiblesIrreversiblesE + I E + I EI EI
se unen fuertemente a la E y el complejo no se se unen fuertemente a la E y el complejo no se disociadisocia
ReversiblesReversiblesE + I E + I ⇄⇄ EI EI
Factores que afectan la cinética Factores que afectan la cinética enzimática: enzimática: INHIBIDORESINHIBIDORES
Ciertas moléculas pueden inhibir la acción catalítica de una enzima: son los inhibidores.
Inhibidores ReversiblesInhibidores Reversibles
Pueden actuar de 3 modos:Pueden actuar de 3 modos: ocupan temporalmente el ocupan temporalmente el centro activo centro activo por por
semejanza estructural con el semejanza estructural con el SS original: original: inhibidor competitivoinhibidor competitivo
Se unen a Se unen a otro sitio otro sitio en la en la EnzEnz y alteran su y alteran su conformación espacial, impidiendo su unión conformación espacial, impidiendo su unión al al SS: : inhibidor no competitivoinhibidor no competitivo
Se unen al Se unen al complejo E-S complejo E-S impidiendo la impidiendo la catálisis del sustrato: catálisis del sustrato: inhibidor inhibidor acompetitivoacompetitivo
Inhibidores ReversiblesInhibidores Reversibles inhibidor competitivoinhibidor competitivo
Inhibidores ReversiblesInhibidores Reversibles inhibidor no competitivoinhibidor no competitivo
Inhibidores ReversiblesInhibidores Reversibles inhibidor acompetitivoinhibidor acompetitivo
SPP
Inhibidores ReversiblesInhibidores Reversibles inhibidor acompetitivoinhibidor acompetitivo
S
II PP
Regulación de la catálisis Regulación de la catálisis enzimáticaenzimática
las las concentraciones del sustrato y concentraciones del sustrato y de los productos finalesde los productos finales
presencia depresencia de inhibidores inhibidores modulación alostéricamodulación alostérica modificación covalentemodificación covalente activación por activación por proteolisisproteolisis
(zimógenos)(zimógenos) isoenzimasisoenzimas
MODULACIÓN ALOSTÉRICA DE MODULACIÓN ALOSTÉRICA DE
LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICALA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA Hay enzimas que pueden adoptar 2 conformaciones interconvertibles llamadas R (relajada) y T (tensa).
R es la forma más activa porque se une al sustrato con más afinidad. Las formas R y T se encuentran en equilibrio R <==> T
ACTIVADORES ALOSTÉRICOSACTIVADORES ALOSTÉRICOS
Ciertas sustancias tienden a estabilizar la estabilizar la forma R forma R actuando s/una región de la Enz distinta del centro activo.
Son los llamados moduladores positivos ó moduladores positivos ó activadores alostéricos.
El propio SS es a menudo un modulador positivo.
INHIBIDORES ALOSTÉRICOSINHIBIDORES ALOSTÉRICOS
Las sustancias que favorecen la forma T favorecen la forma T y actúan en lugares distintos del centro activo de la enzima y disminuyen la actividad enzimática: son los moduladores alostéricos negativosmoduladores alostéricos negativos.
Regulación de la actividad Regulación de la actividad enzimática por enzimática por MODIFICACIÓN MODIFICACIÓN COVALENTE COVALENTE
Hay enzimas que pasan de la forma Hay enzimas que pasan de la forma inactiva a la activa inactiva a la activa por unión por unión covalente a un grupo químicocovalente a un grupo químico de pequeño de pequeño tamaño como el tamaño como el PiPi o el o el AMPAMP..
También se da el También se da el caso inverso caso inverso (E activa -> E inactiva)(E activa -> E inactiva)
El enzima no fosforilado es inactivo
El enzima fosforilado es
activo
Regulación de la actividad Regulación de la actividad enzimática por enzimática por ACTIVACIÓN ACTIVACIÓN PROTEOLÍTICA PROTEOLÍTICA
Algunos enzimas no se sintetizan como E activa, sino Algunos enzimas no se sintetizan como E activa, sino como proteínas precursoras sin actividad enzimática. como proteínas precursoras sin actividad enzimática. Estas proteínas se llaman Estas proteínas se llaman proenzimas proenzimas o o zimógenoszimógenos. .
Para activarse, los zimógenos sufren Para activarse, los zimógenos sufren hidrólisishidrólisis que que origina la origina la liberaciónliberación de uno o varios de uno o varios péptidospéptidos. .
El resto de la molécula proteica adopta la El resto de la molécula proteica adopta la conformación y las propiedades de la conformación y las propiedades de la enzima activaenzima activa. .
Ej.: enzimas digestivas se secretan en forma de Ej.: enzimas digestivas se secretan en forma de zimógenos y en el tubo digestivo se convierten en la zimógenos y en el tubo digestivo se convierten en la forma activa. Es el caso de la forma activa. Es el caso de la quimotripsinaquimotripsina, que se , que se sintetiza en forma de sintetiza en forma de quimotripsinógenoquimotripsinógeno
Regulación de la actividad Regulación de la actividad enzimática por ACTIVACIÓN enzimática por ACTIVACIÓN PROTEOLÍTICA PROTEOLÍTICA
REGULACIÓN DE LA ACTIVIDAD REGULACIÓN DE LA ACTIVIDAD
ENZIMÁTICA POR MEDIO DE ENZIMÁTICA POR MEDIO DE ISOENZIMASISOENZIMAS
Algunos enzimas tienen distinta estructura molecular aunque Algunos enzimas tienen distinta estructura molecular aunque su función biológica es similar. Se llaman su función biológica es similar. Se llaman isozimas o isozimas o isoenzimasisoenzimas. .
Estas Estas diferencias de estructura diferencias de estructura se traducen en ligeros se traducen en ligeros cambios en sus cambios en sus propiedadespropiedades, de forma que cada isozima se , de forma que cada isozima se adapta perfectamente a la función que debe realizar. adapta perfectamente a la función que debe realizar.
Así, podemos observar la existencia de isoenzimas en función Así, podemos observar la existencia de isoenzimas en función de:de:– el el tipo de tejidotipo de tejido: Por ejemplo, la lactato deshidrogenasa : Por ejemplo, la lactato deshidrogenasa
presenta isoezimas distintas en músculo y corazón. presenta isoezimas distintas en músculo y corazón.
– el el compartimento celularcompartimento celular donde actúa: Por ejemplo, la malato donde actúa: Por ejemplo, la malato deshidrogenasa del citoplasma es distinta de la de la mitocondria. deshidrogenasa del citoplasma es distinta de la de la mitocondria.
– el el momento concreto del desarrollomomento concreto del desarrollo del individuo. Ej: algunos del individuo. Ej: algunos enzimas de la glicolisis del feto son diferentes de los mismos enzimas de la glicolisis del feto son diferentes de los mismos enzimas en el adulto. enzimas en el adulto.
Creatin fosfo quinasaCreatin fosfo quinasa
Dímero: M (músculo) – B (cerebro) Dímero: M (músculo) – B (cerebro) separables por electoforesis (método separables por electoforesis (método de estudio)de estudio)
Cerebro = BB (CPK1 - rápida)Cerebro = BB (CPK1 - rápida) Músculo esquelético= MM (CPK3 - Músculo esquelético= MM (CPK3 -
lenta)lenta) Corazón = MB (CPK2 - intermedia) h. Corazón = MB (CPK2 - intermedia) h.
6% de la CPK total = 10-50 UI/L a 30ºC.6% de la CPK total = 10-50 UI/L a 30ºC.
CPK o CKCPK o CK
FosfocreatinaFosfocreatina
ATP + Creatina ATP + Creatina (Ác. Alfa-metil guanido-(Ác. Alfa-metil guanido-acético)acético)
ADADPP
HOHO33P-P-CH3
Lactato deshidrogenasa ó Lactato deshidrogenasa ó LDHLDH
Tetramérica c/2 subunidades distintas: Tetramérica c/2 subunidades distintas: HH de corazón y de corazón y MM de músculo, que se de músculo, que se combinan de 5 formas.combinan de 5 formas.LDH1 – LDH1 – HHHHHHHH – Miocardio y – Miocardio yLDH2 – LDH2 – HHHMHHHM - Miocardio y GR - Miocardio y GRLDH3 - LDH3 - HHMMHHMM – Cerebro y riñón – Cerebro y riñónLDH4 – LDH4 – HMMMHMMM – Hígado y Músc. – Hígado y Músc. Esquel.Esquel.LDH5 – LDH5 – MMMMMMMM – Músculo Esquelético – Músculo Esquelético
Isoenzimas de Amilasa Isoenzimas de Amilasa (AMI)(AMI)
alfa-Amilasaalfa-Amilasa ó ó α-amilasaα-amilasa, , EC EC 3.2.1.1 (1,4-α-D-glucan glucanohidrolasa; 3.2.1.1 (1,4-α-D-glucan glucanohidrolasa; glicogenasa) metaloenzima (dependiente de Ca). glicogenasa) metaloenzima (dependiente de Ca). Corta enlaces glicosídicos alfa-1,4 al azar o at random. En animales es la mayor enzima digestiva y su pH óptimo es 6.7-7.0.En el Hº amilasa salivar y pancreática son alfa-amilasas. Esta forma es también hallada en plantas, hongos y bacterias (Bacillus).
β-Amilasa (EC 3.2.1.2 ) (1,4-α-D-glucan maltohidrolasa; glicogenasa) es también sintetizada por bacterias, hongos y plantas. Cataliza la hidrólisis del segundo enlace α-1,4 glicosídico desde el extremo no reductor, separando 2 unidades de glucosa (maltosa). Presente en semillas y granos de cereales; en muchos microorganismos que degradan el almidón extracelular. Los tejidos animales no contienen β-amilasa, pero puede estar presente en microorganismos del TD. El pH óptimo es 4.0-5.0.
γ-Amilasa (EC 3.2.1.3 ) ó Glucan 1,4-alfa-glucosidasa ó amiloglucosidasa ó Exo-1,4-α-glucosidasa ó glucoamilasa; α-glucosidasa lisosomal; 1,4-α-D-glucan glucohidrolasa.
Rompe los enlaces α(1-6) glicosídicos, como también el último enlace α(1-4)glicosídico del extremo no reductor de amilosa y amilopectina, produciendo glucosa. Es más activa a pH 3.