UNIVERSIDAD MAYOR Facultad de Medicina Escuela de Enfermera Bioqumica

AUTORES: Alejandra Moreno O., Maribel Arnes S.

LABORATORIO N 3

ENZIMOLOGA I. - INTRODUCCIN

A) ESPECTROFOTOMETRIA:

Utilizando trminos quizs excesivamente simplistas puede definirse la espectrofotometra de absorcin, como la medida de la atenuacin que el material a estudiar (muestra) efecta sobre una radiacin incidente sobre el mismo con un espectro definido. En general, las medidas se realizan dentro del espectro comprendido entre 220 y 800 nm, y este espectro, a su vez, puede dividirse en dos amplias zonas: la zona de la radiacin visible, situada por encima de 380 nm, y la zona de la radiacin ultravioleta situada por debajo de estos 380 nm. La regin del infrarrojo se sita por encima de los 800 nm.

La energa de una onda electromagntica est dada por la ecuacin: E = h, donde h es la constante de Planck y v es el nmero de onda (el recproco de la longitud de onda ).

La energa de la luz UV y visible es capaz de excitar electrones y electrones no enlazantes desde su estado basal a un nivel energtico mayor (estado excitado) y, en consecuencia, se dice que la molcula que contiene estos electrones absorbe luz a la longitud de onda correspondiente. Generalmente, este tipo de electrones se encuentran en molculas conjugadas (molculas que poseen dobles enlaces separados por un enlace simple). La conjugacin aumenta la longitud de onda de la absorcin al disminuir la diferencia energtica entre el estado basal y el estado excitado, de modo que un dieno conjugado absorbe luz de alrededor de 215 nm, mientras que un compuesto con un alto nmero de enlaces conjugados, como el -caroteno absorbe a 450 nm. La estructura de enlaces conjugados que permite la absorcin de luz se denomina cromforo.

Si una luz blanca pasa a travs de una solucin que contiene compuestos que actan como cromforos, ciertas longitudes de onda son absorbidas selectivamente. El color resultante de la solucin se debe a la luz transmitida. La absorcin de luz por parte de una sustancia es una propiedad caracterstica de ella, que puede ser utilizada para su identificacin y cuantificacin, ya que un compuesto determinado tiene un espectro de absorcin caracterstico, por lo tanto la comparacin del espectro de este compuesto puro con los espectros de compuestos conocidos permitir su identificacin.

Leyes de la absorcin de energa radiante

Se refieren a las relaciones existentes entre la cantidad de absorbente y el grado con el que es absorbida la energa radiante. En trminos generales, puede decirse que hay dos variables capaces de afectar al grado de absorcin: la concentracin del absorbente y la longitud del trayecto que el rayo luminoso recorre a travs de la solucin.

La Ley de Lambert - Beer establece que la absorcin es proporcional al nmero de molculas de la sustancia absorbente presente en la solucin por donde pasa el haz electromagntico. La expresin matemtica para esta ley es:

A = l c

Donde es la absortividad molar (una medida de la radiacin absorbida), que es un valor constante para cada sustancia a cada longitud de onda . Cuando la concentracin, c, es expresada en moles por litro se denomina coeficiente de extincin molar y cuando es expresada en gramos por litro coeficiente de extincin especfico. El trmino l representa el espesor de la capa absorbente y est en unidades de cm.

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Cuando las medidas se efectan utilizando siempre la misma cubeta (o bien un grupo de cubetas estandarizadas que posean un paso de luz constante) y los efectos pticos debidos a la cubeta son reproducibles, el trmino l de la expresin de la absorbancia se hace constante. Dado que , es tambin constante para un determinado absorbente y una concreta longitud de onda, resulta entonces que la absorbancia es directamente proporcional a la concentracin:

A = k c (k = l).

La absorbancia es adimensional, presenta valores entre 0 y 2 unidades de absorbancia o densidad ptica, dentro de cuyo rango generalmente se cumple la Ley de Lambert - Beer

Caractersticas de un espectrofotmetro La medida de absorbancia se lleva a cabo con la ayuda de un espectrofotmetro: Estos equipos contienen los siguientes componentes bsicos:

Posee una fuente de luz capaz de emitir luz a las longitudes de onda que se quiere medir. El selector de longitud de onda permite el paso de la luz a la longitud de onda deseada. Una rendija u orificio define la intensidad de luz incidente sobre la muestra dispuesta en una celda o cubeta que posee un dimetro de 1 cm y no interfiere con el paso de la luz, y finalmente, la luz emitida despus de su paso por la celda es cuantificada por un detector.

Los espectrofotmetros dan la lectura directa de la absorbancia (A) o bien, el porcentaje de transmitancia (%T). La relacin entre ambos es:

A = 2 - log % T

La ventaja fundamental que ofrece el empleo de la Absorbancia en lugar de la Transmitancia es que la relacin existente entre la concentracin y la absorbancia es lineal, cosa que no sucede con el %T.

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100 80 % 60 Absorbancia Transmitancia 40 20

concentracin (g/l) concentracin (g/l) La absorbancia de una solucin es la resultante de la absorbancia del soluto cuya concentracin se desea conocer y la de otros componentes del sistema (solventes, reactivos) que absorben tambin a esa longitud de onda. Estos compuestos se denominan interferencias. Se debe descartar la absorbancia de las interferencias, para ello es necesario hacer siempre una muestra que contenga todos los componentes del sistema menos aquel que se desea medir. Esta muestra se llama blanco y la absorbancia de ste debe restarse a las muestras problema y a los patrones, o bien, con el blanco se calibra el instrumento a absorbancia igual a 0, o sea 100% de transmisin.

Curvas de calibracin

Una curva de calibracin relaciona las A %T con las concentraciones y su empleo es necesario en los trabajos cuantitativos en los que hay que calcular la concentracin del absorbente. Siempre que sea posible, es aconsejable la construccin de una curva de calibracin que cubra la zona de concentraciones que se van a encontrar en la prctica.

La elaboracin de la curva debe ser la fase primera al montar y estandarizar cualquier procedimiento fotomtrico. Las concentraciones pueden expresarse en cualquier tipo de unidades de medida; sin embargo, la medida ms conveniente es emplear para las curvas las mismas unidades en las que se debe expresar el resultado final.

Ejemplo: curva de la Hemoglobina.

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B) ENZIMAS:

La mayora de las reacciones qumicas que ocurren en los sistemas vivos, si siguieran sus propios mecanismos, ocurriran demasiado lentas. Se requiere de catalizadores para que estas reacciones transcurran a velocidades que realmente sean tiles para la clula. En los sistemas biolgicos, los catalizadores de dichas reacciones qumicas son las enzimas. Qu es catlisis? Qu es lo que hace la catlisis? Para entenderlo, consideremos una reaccin qumica simple: A + B C + D

Si la reaccin ocurre sin interferencia, eventualmente, parecer como si se detuviera. Lo que sucede realmente es que tanto la reaccin directa como la inversa estn ocurriendo a la misma velocidad. Esto es lo que conocemos como equilibrio qumico y podemos expresar su constante de equilibrio:

Esta constante es caracterstica de la reaccin. Un catalizador aumenta la velocidad a la que la reaccin se acerca al equilibrio, pero no altera la naturaleza del estado de equilibrio. Otra propiedad importante de los catalizadores es que son muy efectivos en cantidades muy pequeas, con respecto a las cantidades a catalizar.

La Cintica Enzimtica, es una rama especializada de la cintica qumica, que est basada en la

teora cintica de la materia. En esta teora, se ve que una solucin est hecha de un grupo de molculas y que cada una de ellas se mueve a una velocidad particular. En este movimiento, ellas chocan entre s, cada colisin involucra una cierta cantidad de energa. Si la colisin no involucra suficiente energa, la reaccin no ocurre. Si la energa es suficiente, las molculas se combinan para formar un intermediario activado, estableciendo un estado de transicin. La energa mnima que se requiere para la formacin de este intermediario es la Energa de Activacin. Esto lo podemos representar mediante:

A B* C

Esta reaccin la podemos graficar de la siguiente manera:

En una reaccin catalizada por una enzima, esta acta agregando pasos a la reaccin, de

manera que la energa de activacin requerida sea menor:

[ ][ ]

[ ][ ]BD

ACKeq =

A

B*

C

Donde B* es el estado de transicin

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Note que en las reacciones catalizadas por enzimas, al reaccionante se le llama sustrato. El cambio de Energa libre G, es la diferencia de energa lib