Bol. San. Veg. Plagas, 24: 581-602, 1998

La «seca» de olivos jóvenes II: Identificación y patogenicidadde los hongos asociados con podredumbres radiculares

M. E. SÁNCHEZ HERNÁNDEZ, A. Ruiz DÁVILA y A. TRAPERO CASAS

En este trabajo se han identificado los aislados fúngicos asociados a las podredum-bres radiculares de olivo, el factor más importante incluido bajo la denominación gené-rica de «seca» de olivos jóvenes en Andalucía, así como los aislados asociados a lamuerte de plántulas («damping-off») en viveros de olivo. La patogenicidad de aisladosseleccionados de cada especie fúngica se evaluó en plantones y estaquillas enraizadasde olivo del cultivar «Picual», en condiciones parcialmente controladas. De todas lasespecies ensayadas, cinco mostraron claramente su patogenicidad en olivo: Cylindro-carpon destructans, Phytophthora megasperma, P. palmivora, Pythium irregulare ySclerotium rolfsii, reproduciendo los síntomas de podredumbre radicular y marchitezfoliar en las plantas inoculadas. Otras especies asociadas a podredumbres radicularesen campo y vivero {Fusarium acuminatum, F. eumartii, F. oxysporum, F. solani, Ma-crophomina phaseolina y Rhizoctonia solani) resultaron débilmente o nada patogéni-cas. La patogenicidad de Phytophthora megasperma, P. palmivora y Pythium irregula-re resultó dependiente del contenido hídrico del suelo, ya que los aislados ensayadossólo causaron necrosis extensas del sistema radicular y muerte de las plantas inocula-das en condiciones de saturación continua del suelo. La elevada frecuencia de aisla-miento de Phytophthora megasperma en suelos encharcados (parte I) y su dependenciapatogénica del exceso de agua en el suelo sugieren que este hongo puede jugar unpapel importante en la generalmente aceptada sensibilidad de los olivos jóvenes a la«asfixia radicular».

M. E. SÁNCHEZ HERNÁNDEZ, A. Ruiz DÁVILA y A. TRAPERO CASAS: Departamento deAgronomía, ETSIAM, Universidad de Córdoba, Apdo. 3048, 14080-Córdoba.

Palabras clave: Cylindrocarpon destructans, Fusarium acuminatum, Fusarium eu-martii, Fusarium oxysporum, Fusarium solani, Macrophomina phaseolina, Olea euro-paea, Phytophthora megasperma, Phytophthora palmivora, Pythium irregulare, Rhi-zoctonia solani, Sclerotium rolfsii

INTRODUCCIÓN

La «seca» del olivo, una desecación deramas y marchitez generalizada que estáafectando a olivares jóvenes de toda Anda-lucía, y que puede llevar a la muerte de losárboles afectados (parte I), ha sido asociadaa diferentes agentes bióticos y abióticos, eincluso a la actividad de insectos o roedores(parte I). De entre la diversidad de factoresasociados detectados en campo, destaca elelevado porcentaje de olivos jóvenes afecta-dos en los que se observa la podredumbre

de su sistema radicular. De las muestras deolivos enfermos recibidas por la Sección deSanidad Vegetal de Córdoba entre los años1989 y 1995, se comprobó que en el 30,6%de los casos los olivos presentaban necrosisradiculares. En estos casos se pudieron ais-lar de los tejidos enfermos hongos causantesde podredumbres radiculares en olivo, comoArmillaria sp. y Dematophora necatrix (DEANDRÉS, 1991), así como otros hongos que,no habiendo sido descritos en España espe-cíficamente en olivo, podrían resultar tam-bién patógenos, como especies de Fusa-

rium, Cylindrocarpon, Rhizoctonia y Scle-rotium (parte I). Con esta información preli-minar, desde el año 1994 se han realizadoprospecciones en Córdoba, Jaén y Sevilla enolivares afectados de muerte de plantones,con especial atención a aquellos casos en losque aparecen podredumbres radiculares. Enel primer grupo de prospecciones, realizadodurante un período de sequía severa en1994-95, se encontró que únicamente en un10% de los casos la «seca» estaba asociadaa la aparición de podredumbres radiculares.Sin embargo, en las prospecciones de 1996se registraron abundantes precipitacionesque llegaron a producir un prolongado en-charcamiento del suelo en buena parte delolivar andaluz. En estas condiciones, el por-centaje de olivares jóvenes afectado demuerte de plantones asociada a podredum-bres radiculares ascendió al 65% de loscampos estudiados, aislándose hongos radi-culares, especialmente Phytophthora me-gasperma, asociados a las raíces afectadas(parte I).

En el presente trabajo se ha llevado a cabola identificación y la determinación de la pa-togenicidad de los hongos asociados a estaspodredumbres radiculares del olivo, correla-cionando su naturaleza y frecuencia de apa-rición con las características climáticas, edá-ficas y agronómicas específicas en cadacaso. Además, también se ha estudiado lapatogenicidad de los hongos radicularesasociados a la muerte de plántulas de olivoen vivero (damping-off), con objeto de de-terminar si, como se ha señalado para laVerticilosis del olivo (BLANCO LÓPEZ et al.,1984), alguno de los hongos presente encondiciones de campo pudiera tener su ori-gen en el material de propagación.

MATERIAL Y MÉTODOS

Todos los aislados fúngicos obtenidos apartir de raíces de olivos afectados de«seca», tanto en las prospecciones de campocomo en vivero, se agruparon en función de

la morfología que presentaron sus coloniasen cultivo puro y de cada uno de estos gru-pos se eligieron varios aislados para proce-der a su identificación específica. Una vezidentificadas, para determinar su patogenici-dad en olivo, se eligieron aquellas especiesconsistentemente aisladas de las raíces po-dridas y que no habían sido descritas conanterioridad en España como patógenas delolivo. Además, también se seleccionaronaislados de aquellas especies que, aun sinconsistencia, resultaron muy frecuentementeaisladas tanto en campo como en vivero. Elorigen y frecuencia de aislamiento de las es-pecies fúngicas seleccionadas se muestra enel cuadro 1.

Identificación de los aislados fúngicos

Los aislados fúngicos seleccionados setransfirieron a un medio de mantenimientohasta su posterior identificación por mediode la observación macro y microscópica desus colonias, así como de sus estructuras ve-getativas y reproductivas producidas en di-ferentes medios de cultivo. Como medio ge-neral de mantenimiento se utilizó PDA 2%(patata-dextrosa-agar), que se sustituyó porCMA (harina de maíz-agar) (DHINGRA ySINCLAIR, 1985) para los aislados de hongospitiáceos. Las observaciones microscópicasse realizaron bien directamente sobre laplaca de Petri utilizando un microscopio in-vertido, o bien en montajes teñidos confuchsina acida en lactofenol, empleando unmicroscopio convencional. Para la observa-ción al microscopio de conidioforos y célu-las conidiógenas producidas por especies deFusarium y Cylindrocarpon, se realizaronmicrocultivos en portas sobre medio PDA(DHINGRA y SINCLAIR, 1985) y para aque-llos aislados que formaban microconidiascon dificultad, se utilizó el medio de hoja declavel (carnation leaf agar, CLA) para favo-recer su formación (NELSON et al, 1983).

En el caso de aislados de los géneros Pyt-hium y Phytophthora, se utilizaron los me-

Cuadro 1.-Origen e identificación de los aislados fúngicos utilizados en los ensayos de patogenicidad

Especie

Cylindrocarpondestructans

Fusariumoxysporum

Fusariumsolani

Fusariumeumartii

Fusariumacuminatum

Macrophominaphaseolina

Phytophthoramegasperma

Phytophthorapalmivora

Pythiumirregulare

Rhizoctoniasolani

Sclerotiumrolfsii

Frecuencia deaislamiento encampo (%) (a)

83,06,0

83,0

66,0

_

_

33,0

94,0

_

_

33,0

0,8

Aislado

CD1CD2CD3CD4

FO1FO2

FS1FS2

FE1

FA1FA2

MP1MP2

PM1PM2

PP1

PI1

RS1RS2

SR1

Origen

Vivero (Córdoba)Olivar (N.Carteya)

Olivar (Lucena)Olivar (Lucena)

Olivar (Lucena)Olivar (Montilla)

Olivar (Montilla)Vivero (Córdoba)

Invernadero (Córdoba)

Vivero (Córdoba)Vivero (Córdoba)

Olivar (Cabra)Olivar (Lucena)

Olivar (Córdoba)Olivar (La Carlota)

Vivero (Córdoba)

Invernadero (Córdoba)

Olivar (Castro del Rio)Invernadero (Córdoba)

Olivar (Fuentepalmera)

Fecha deaislamiento

Ago. 1995May. 1995Jun. 1996Jun. 1996

Feb. 1995Jun. 1995

Jun. 1995Ago. 1995

Abr. 1996

Jul. 1996Jul. 1996

May. 1995May. 1995

Mar. 1996May. 1996

Jul. 1996

Jun. 1996

Feb. 1995Abr. 1996

Mar. 1995

(a) Porcentaje de campos con aislamiento positivo respecto al total de campos afectados por podredumbre radicular(114 muestras recibidas por la Sección de Sanidad Vegetal de Córdoba 1989-95, ó 6 y 49 campos en las prospeccionesde 1994-95 y 1996, respectivamente) (Ver Parte I).

dios CA (extracto de zanahoria-agar) yCMA (DHINGRA y SINCLAIR, 1985) para in-ducir la formación de estructuras sexuales.Los aislados se cultivaron sobre estos me-dios a 20 °C en oscuridad durante 10 días.Para inducir la formación de estructuras ase-xuales se sembraron en placas con CA y seincubaron durante 2 semanas en oscuridad a20 °C. Posteriormente, se extrajeron discosde agar de 2 cm de diámetro de las placas yse colocaron en placas de Petri estériles enlas que se añadieron 50 mi de solución sali-

na de Schmitthenner (RIBEIRO, 1978). Estasplacas se incubaron a 20 °C en oscuridad obajo luz y con o sin agitación continua a 60r.p.m., durante 5 días, transcurridos los cua-les se observaron al microscopio. Además,en el caso del género Phytophthora, los ais-lados se cultivaron en medio líquido de ex-tracto de zanahoria y las colonias obtenidasse lavaron al chorro de agua y se dispusie-ron en placas estériles a las que se añadióagua de charca, extracto de suelo o la solu-ción salina de Schmitthenner (DHINGRA y

SINCLAIR, 1985). Estas placas se incubarona 15 y 20 °C bajo luz/oscuridad y se obser-varon al microscopio al cabo de 48 h.

Para inducir la formación de estructurasasexuales de las especies del género Pythiumtambién se tomaron discos de agar de placasde CMA en las que crecía el hongo y se co-locaron en placas de Petri estériles a las quese añadieron 15 mi de solución salina deSchmitthenner. Sobre estos discos se colo-caron trozos de hojas de césped, que previa-mente habían sido hervidos 10 minutos enagua desionizada (PLAATS-NITERINK, 1981)y se incubaron las placas en oscuridad a20 °C durante 15 días. Transcurrido estetiempo sufrieron un choque térmico para in-ducir la formación de zoosporas, que consis-tió en la exposición durante 12 h a una tem-peratura de 4 °C. Posteriormente, se renovóla solución salina y se incubaron las placas a20 °C durante 5 h, tras lo cual se realizaronlas observaciones microscópicas.

En todos los casos las observaciones ymediciones de estructuras microscópicasse realizaron sobre 25 estructuras porplaca, medio de cultivo y aislado. Paracada género fúngico las referencias biblio-gráficas utilizadas para la identificación deespecies fueron las siguientes: Cylindro-carpon (BOOTH, 1966), Fusarium (BOOTH,1971, 1977; TOUSSOUN y NELSON, 1976),Macrophomina (DHINGRA y SINCLAIR,1978; HOLLIDAY y P U N I T H A L I N G A N ,1970), Phytophthora (WATERHOUSE,1963; STAMPS et al., 1990; ERWIN y RI -BEIRO, 1996), Pythium (WATERHOUSE,1967; PLAATS-NITERINK, 1981), Rhizocto-nia (SNEH et al, 1991; CARLING y SUM-NER, 1992) y Sclerotium (MORDUE, 1974;PUNJA y RAHE, 1992).

dos seleccionados. Como medio de mante-nimiento y crecimiento se utilizó CMA 2%para los aislados de hongos pitiáceos (espe-cies de Phytophthora y Pythium) y PDA2% para el resto de aislados (DHINGRA ySINCLAIR, 1985). Para cada uno de los ais-lados ensayados el inoculo se preparó conuna batidora, mezclando a la velocidad má-xima durante 3 min, 600 ml de agua estérily el contenido de 6 placas de Petri de 9 cmde diámetro en las que el cultivo correspon-diente había crecido durante 10-15 días enlas condiciones adecuadas para la forma-ción de abundantes estructuras infectivas.Estas condiciones fueron: 20-22 °C en laoscuridad para las especies de Phytophtho-ra y Pythium, y 20-22 °C, 5-7 días en oscu-ridad y el resto del tiempo bajo un régimende 14 h de luz diarias para las especies deFusarium y Cylindrocarpon. Las especiesde Rhizoctonia, Macrophomina y Sclero-tium se incubaron en estas mismas condi-ciones pero a una temperatura de 29-31 °C(AYCOCK, 1966; DHINGRA y SINCLAIR,1978,1985).

Material vegetal

En los cuatro experimentos realizados seutilizaron plantas del cultivar 'Picual' pro-cedentes de un vivero de la zona y propaga-das por enraizamiento de estaquillas semile-ñosas bajo nebulización (CABALLERO y DEL

RÍO, 1994). En un primer experimento, decarácter preliminar, se emplearon plantonesde 1 año, mientras que en los tres experi-mentos restantes se utilizaron estaquillas de4-6 meses.

Ensayos de patogenícidad

Inoculo

Todos los inóculos se prepararon a partirde cultivos puros de cada uno de los aisla-

Inoculación

En el primer experimento (Exp. 1) se uti-lizaron plantones que, tras ser inoculadosmediante un riego con 50 mi de la suspen-sión de inoculo por plantón, se dispusieron

junto con los testigos sin inocular en condi-ciones de invernadero (10-30 °C, 25-95%HR) aplicando un riego semanal con aguade grifo. El número de plantones por inocu-lo ensayado fue de 10, más 10 plantones tes-tigo no inoculados.

En los tres experimentos restantes se utili-zaron estaquillas de 4-6 meses. En estoscasos la inoculación se realizó como sigue:las plantas se sacaron de los envases en losque crecían en el vivero y se lavaron cuida-dosamente las raíces al chorro de agua. Unavez limpias, se sumergieron durante 5 min enla suspensión de inoculo correspondiente.Posteriormente, se trasplantaron a macetas deplástico de 12 cm de diámetro por 9 cm dealtura, previamente desinfestadas con lejíacomercial al 20% y que contenían 600 mi desuelo esterilizado (arena: limo: turba, 1: 1: 1)más 50 mi de inoculo. Se inocularon 12 plan-tas por aislado fúngico ensayado, más otras12 plantas testigo sin inocular.

En el experimento 2 (Exp. 2) las estaqui-llas fueron colocadas en invernadero (10-30 °C, 40-95% HR) con un riego semanal.El experimento 3 (Exp. 3) se llevó a cabo encámaras de cultivo con condiciones de luz,temperatura y humedad parcialmente con-troladas, tratando de reproducir al máximolas condiciones óptimas para la infección ydesarrollo de la enfermedad descritas paracada una de las especies fúngicas ensayadas(AYCOCK, 1966; DHINGRA y SINCLAIR,1978; 1985). Para las plantas inoculadas conaislados de los géneros Cylindrocarpon yFusarium, las condiciones fueron 18-22 °C,50-86% HR y 14 h de luz diarias, regandouna vez por semana. Para las que se inocula-ron con aislados de Macrophomina, Rhizoc-tonia y Sclerotium, la temperatura se ajustóa 25-30 °C y el riego a una vez cada dos se-manas.

En el cuarto experimento (Exp. 4) se eva-luaron los aislados de Pythium y Phytopht-hora. En este caso los ensayos de patogeni-cidad se realizaron, tanto en condiciones deinvernadero como en cámara de crecimien-to, bajo dos condiciones hídricas del suelodiferentes: en suelo regado una vez por se-

mana, como ya se ha descrito, y en suelocontinuamente saturado de agua. En este úl-timo caso, las macetas con las plantas testi-go y las inoculadas se colocaron por separa-do dentro de bandejas de plástico que se re-llenaron con agua. El nivel de agua en lasbandejas se mantuvo entre 4 y 6 cm por de-bajo de la superficie del suelo añadiendoagua periódicamente.

Evaluación de los resultados y análisisestadísticos

Para todos los experimentos, la severidadde los síntomas aéreos fue evaluada perió-dicamente en cada una de las plantas conuna escala de 0 a 4, según el porcentaje deamarillez, flaccidez o necrosis foliar quepresentara (0 = 0%, 1 = 1-33%, 2 = 34-66%, 3 = 67-100%, 4 = planta muerta). Alfinal de cada experimento se evaluó tam-bién la podredumbre radicular usando lamisma escala de 0 a 4. A estos datos de se-veridad de síntomas aéreos y radiculares seles aplicó el análisis de la varianza y los va-lores medios fueron comparados con lasmedias de los testigos no inoculados me-diante el test de Dunnett (STEEL y TORRIE,1985). En el Exp. 4 se aplicó además el testLSD (mínima diferencia significativa), yaque permitía un análisis más detallado delos datos. Además, se tomaron muestras deraíz, tanto de las plantas testigo como de lasinoculadas en cada experimento, y se sem-braron en los medios PDA, PARP (harinade maíz-agar-pimaricina-ampicilina-rifam-picina-PCNB) y PARPH (PARP-himexa-zol) (JEFFERS y MARTIN, 1986) para tratarde reaislar la especie fúngica inoculada, asícomo otros hongos que pudieran encontrar-se invadiendo los tejidos radiculares. El tra-tamiento de estas muestras de raíz y lascondiciones de incubación de las placasfueron las descritas para las muestras decampo en la parte I. Los métodos emplea-dos para la identificación específica de loshongos reaislados fueron descritos en elapartado anterior.

RESULTADOS

Identificación de los aislados

Cylindrocarpon

Las observaciones realizados de estegrupo de aislados coinciden con las des-cripciones de Cylindrocarpon destructans(Zinssmeiter) Scholten (BOOTH, 1966), es-tado anamorfo de Nectria radicicola Ger-lach, a falta de confirmar la formación declamidosporas, que en nuestros aislados nose produjo. Todos los aislados formaron co-lonias de color pardo amarillento en super-ficie y marrón oscuro en el reverso de laplaca (Fig. la). Microconidias ovales oelipsoides, con una septa o aseptadas, y dedimensiones aproximadas de 7,5 x 4 um,formadas en fiálidas laterales o terminales.Macroconidias cilindricas con los bordesredondeados, con 1-3 septas (3 septas lamayoría) y dimensiones entre 25-38 x 5 um,formadas en fiálidas similares a las anterio-res (Figura Ib, le).

Fig. 1 .-Cylindrocarpon destructans: a) coloniaen medio PDA mostrando la coloración amarillenta

característica de la formación de esporodoquios,b) conidias y fiáiidas (objetivo 40x), c) detalle

de las macroconidias (objetivo lOOx).

Fusarium

Atendiendo a características morfológi-cas, los aislados de este género se clasifica-ron en 4 grupos:

- Grupo FO. Estos aislados formaron co-lonias con micelio aéreo abundante, algodo-noso y denso, de color blanco en oscuridad yrosa salmón bajo luz. Microconidias abun-dantes, generalmente aseptadas, normalmen-te elipsoides, de tamaño variable entre 4-12x 1,5-4 um, producidas en fiálidas cortas si-tuadas en conidioforos simples. Las macro-conidias fueron regularmente fusiformes,con 3-5 septas y dimensiones comprendidasentre 20-50 x 2-4 um, siendo producidas enfiálidas similares a las de las microconidias,que a veces se agrupaban formando esporo-

doquios. Las clamidosporas fueron más fre-cuentemente terminales, solitarias y algunasveces en cadenas, de forma esférica o limo-niforme y diámetro variable entre 5-16 um.Por todas estas características, los aisladosde este grupo se identificaron como Fusa-rium oxysporum Schlenchtend.: Fr. (BOOTH,1971; TOUSSOUN y NELSON, 1976).

- Grupo FS. Los aislados de este grupoformaron colonias con micelio aéreo pocodenso, de color blanco grisáceo tanto en os-curidad como bajo luz. Microconidias ova-les-elipsoidales, generalmente aseptadas (al-gunas con una septa), de tamaño aproxima-do 10 x 2,5 um y formadas en fiálidas lar-gas, cilindricas, rectas y situadas en conidio-foros escasamente ramificados (Fig. 2b).Macroconidias abundantes, fusiformes, con1-4 septas (más frecuentemente 3), de tama-ño variable entre 22-38 x 5 um y formadasen fiálidas cortas similares a las de F. oxys-porum (Fig. 2b). En los cultivos viejos seformaron abundantes esporodoquios quedaban a la colonia una coloración amarillen-ta. Clamidosporas abundantes en cultivosviejos, formadas terminal o intercalarmente,simples o en parejas, de forma esférica u

Fig. 2.-Fusarium spp; a) colonia de F. eumartii en medio PDA mostrando coloraciones amarillentas y verdosascaracterísticas de la formación de esporodoquios, b) macroconidias, microconidias y fiálidas de F, solani

(objetivo 40x), c) macroconidias y fiálidas de F. acuminatum (objetivo lOOx), d) F. acuminatum: clamidosporassimples o en cadena, terminales e intercalares (objetivo lOOx).

oval, con diámetro medio de 10 |jm. Losaislados de este grupo se identificaron comoFusarium solani (Mart.) Sacc. (BOOTH,1971; TOUSSOUN y NELSON, 1976).

- Grupo FE. Estos aislados fueron identi-ficados como Fusarium eumartii Carpenter,aunque en los dos sistemas taxonómicos se-guidos no se incluye como especie, sinocomo forma especial de F. solani. Las ca-racterísticas taxonómicas que separan a estaespecie de F. solani son el tamaño y la sep-tación de las macroconidias (DOMSCH et ai,1980; GERLACH y NiREMBERG, 1982). Estegrupo formó predominantemente macroco-nidias de 5 septas, de dimensiones 30-70 x2.5-5 um. El resto de las características fue-ron similares a las de F. solani, además, laproducción de esporodoquios hizo que lascolonias adquiriesen una coloración verdosacaracterística (Fig. 2a).

- Grupo FA. Los aislados de este grupose identificaron como Fusarium acumina-tum Ellis & Everhart (BOOTH, 1971; TOUS-SOUN y NELSON, 1976). Formaron coloniasde color blanco rosado en oscuridad y sal-món oscuro bajo luz. En el reverso de laplaca de Petri la coloración era marrón roji-za. No se observó en ningún caso la forma-ción de microconidias. Las macroconidiaseran fusiformes, con las células terminales

Fig. 2>.-Macrophomina phaseolina: a) coloniacon abundantes esclerocios en medio PDA, b) hifas

y esclerocios (objetivo 40x), c) conidias y pareddel picnidio (objetivo 40x).

Macrophomina

Las características observadas en los cul-tivos de este grupo de aislados se correspon-dieron con las descripciones del hongo celo-miceto Macrophomina phaseolina (Tassi)Goidanich, cuyo estado esclerocial es Scle-rotium bataneóla Taub. (= Rhizoctonia ba-taticola (Taub.) Butler). El estado esclero-cial fue el más frecuentemente observado enlos aislados de esta especie. El crecimiento

elongadas, 3-5 septas y de dimensiones 17-38 x 2,5-5 um, formándose en fiálidas cor-tas (Fig. 2c). Las clamidosporas fueronabundantes, formadas en pares o simples,terminales o intercalares, esféricas u ovoi-des, y de 12-15 um de diámetro (Fig. 2d).

en cultivo de los aislamientos obtenidos fuesuperior a temperaturas próximas a 30 °Cque a temperaturas inferiores, produciéndo-se colonias con micelio aéreo arborescente ysuelto, de color marrón a negro y formandoabundantes esclerocios (Figura 3a). Las hifas,hialinas al principio, adquirieron después unacoloración marrón o gris oscuro. Los esclero-cios fueron de color marrón al principio y ne-gros una vez maduros, esféricos u ovales, y amenudo irregulares (Figura 3b). Los picni-dios fueron de color marrón oscuro a negro,globosos, y en su interior se formaron coni-dias hialinas, no septadas, de paredes delga-das y de forma elipsoidal y oval (Fig. 3c),con medidas aproximadas 24 x 8 um queconcordaron con la relación 3: 1 (longitud:anchura), característica de este género(DHINGRA y SINCLAIR, 1978).

Phytophthora

- Grupo PM. Los aislados de este grupofueron identificados como Phytophthora me-gasperma Drechsler (ERWIN y RIBEIRO,1996). Formaron en medio CMA coloniascon micelio hialino y arborescente, adheridoal sustrato, y en medio CA colonias blanque-cinas de aspecto petaloide, con abundanteproducción de estructuras sexuales (Fig. 4a).Los oogonios fueron esféricos, de pared nototalmente lisa, con diámetros variables entre25 y 48 um (x = 40,3 ± 3,4), con los que

contactaron anteridios predominantementeparaginos (65%) (Fig. 4b), aunque tambiénse observaron anfiginos (35%) (Fig. 4c).Estos oogonios dieron lugar a oosporas aple-róticas, con diámetros variables entre 20 y 46um (x = 35,9 ± 3,2), con paredes de grosorvariable entre 2,5 y 10 um (x= 6,3 ± 1,3)(Fig. 4b, c). En algunos aislados no se obser-varon estructuras sexuales.

Los aislados de P. megasperma produ-jeron esporangios a 15 °C en colonias su-mergidas en extracto de suelo, solución sali-na o agua de charca, formándose con másdificultad en las mismas condiciones a20 °C. Los esporangios se observaron a par-tir de las 48 h de someter las colonias a lascondiciones descritas y fueron no papilados,persistentes, con forma desde ovoide hastapiriforme y dimensiones variables entre 25y 100 um de longitud (x = 46,4 ± 14,7) yentre 10 y 43 um de anchura (x = 26,6 ± 6,9)(Fig. 4d). Los esporangióforos presentaronproliferación interna y ramificación simpo-dial. Se observó la formación de zoosporasdentro de los esporangios que salían almedio líquido o germinaban en su interior,dando lugar a hifas. También se observaronengrosamientos hifales (Fig. 4e).

- Grupo PP. Los aislados de este grupoformaron en CMA colonias con micelio hia-lino y adherido al sustrato, y en CA coloniasblanquecinas con micelio aéreo algodonosode localización difusa. No se observó la for-mación de estructuras sexuales en los me-

Fig. A.-Phytophthora megasperma: a) colonia de aspecto petaloide en medio CA,b) oospora aplerótica con anteridio paragino (objetivo lOOx),

Fig. A.—Phytophthora megasperma: c) oospora aplerótica con anteridio anfigino (objetivo lOOx),d) esporangio no papilado (objetivo lOOx), e) engrosamientos hifales (objetivo lOOx).

Phytophthorapalmivora: f) esporangio papilado (objetivo lOOx).

dios de cultivo in vitro, pero sí de abundan-tes esporangios papilados, con pedicelocorto, dehiscentes y con proliferación sim-podial (Fig. 40- La longitud de los esporan-gios varió entre 32 y 58 um (x = 50,3 ±4,6), y su anchura entre 17 y 33 pm (x = 26 ±2,6). A falta de confirmar si, como parece,este aislado es heterotálico, el resto de suscaracterísticas coinciden con la descripciónde Phytophthora palmivora (Butler) Butler(ERWIN y RIBEIRO, 1996).

Pythium

Los aislados de este grupo fueron identifi-cados como Pythium irregulare Buisman(PLAATS-NITERINK, 1981). Formaron colo-nias de crecimiento rápido y micelio adheri-do al sustrato y después aéreo y difuso enlos medios CMA y CA. Las estructuras se-

xuales se formaron con facilidad en elmedio CMA. Los oogonios tenían un diá-metro variable entre 17y38um(x = 21,4±± 4,5), presentando en la pared proyeccio-nes o irregularidades que distorsionaban suforma esférica (Fig. 5a). Las oosporas for-madas fueron apleróticas, con diámetro va-riable entre 12 y 20 um (x = 16,0 ± 1,5), ycon pared de grosor inferior a los 2,5 um(Fig. 5a). Los anteridios se observaron condificultad, resultando monoclinos o diclinos,predominantemente monoclinos y con pedi-celo largo. Los esporangios, formados sobretodo en cultivos a los que se añadieron hojasde césped y solución salina, fueron interca-lares, de forma esférica o elipsoidal, longi-tud entre 20 y 25 um y anchura entre 12 y20 um (Fig. 5b). Los tubos de expulsiónfueron difíciles de observar, no siendo posi-ble la observación de las vesículas en lasque se diferenciaron las zoosporas.

Fig. 5.—Pythium irregulare: a) oosporas marcadamente apleróticas con la pared del oogonio deformaday con proyecciones (objetivo lOOx), b) oosporas, esporangios y zoosporas. Obsérvese un esporangio vacío

con el tubo de descarga (objetivo lOOx).

Rhizoctonia

Las características observadas en los culti-vos de este grupo de aislados se correspon-den con las descripciones de Rhizoctonia so-lani Kühn, fase esclerocial de Thanatepho-rus cucumeris (Frank) Donk (SNEH et aL>1991). Los aislados de esta especie dieronlugar a colonias con micelio aéreo arbores-cente, de color blanquecino a pardo, sin pro-ducción de conidias (Fig. 6a). Las hifas pre-sentaban la ramificación característica en án-gulo recto, con una constricción en el puntode origen de la ramificación y una septacerca de este punto (Fig. 6b). Los esclerociosfueron de textura uniforme y tejido no dife-renciado, generalmente irregulares.

Fig. 6,—Rhizoctoniü solani: a) colonia en medio PDA, donde se aprecia el comienzo de la formación de esclerocios,b) ramificación de la hifa. septación y constricción en la base de la ramificación características (objetivo lOOx).

Sclerotium rolfsii: c) colonia en medio PDA y esclerocios característicos.

Sclerotium

Las observaciones de este aislado coinci-den con las descripciones de Sclerotium ralf-sii Sacc. (MORDUE, 1974; PUNJA y RAHE,1992), estado esclerocial de Athelia rolfsii(Curzi) Tu & Kimbrough. El crecimiento enPDA del aislado dio lugar a colonias con mi-celio blanco, inicialmente adherido al sustra-to y después aéreo, en el que se formaronabundantes esclerocios de color pardo, esfé-ricos, de 1 a 2 mm de diámetro (Fig. 6c) ycon diferenciación celular de sus tejidos encubierta externa, corteza y médula.

Ensayos de patogenicidad

El cuadro 1 muestra la identificación yorigen de los aislados seleccionados de cadauna de las especies fúngicas para realizar losensayos de patogenicidad.

Experimento I

Los resultados de este experimento prelimi-nar realizado con plantones de olivo en inver-nadero se resumen en la Figura 7. En casitodos los casos se reprodujeron los síntomasde desecación y marchitez de la parte aérea ynecrosis radicular en un número elevado deplantas (Fig. 8a, b). Asimismo, un númeroelevado de plantones testigo (6 de 10) mostra-ron también síntomas similares. A pesar deque la severidad media de los síntomas aéreosy radiculares fue menor en las plantas testigo,los valores medios no difirieron significativa-mente de los de las plantas inoculadas debidoa la alta varianza de los datos. En cuanto a larecuperación del agente inoculado del tejidoradicular, sólo se alcanzaron valores elevadospara las plantas inoculadas con aislados de F.oxysporum, F. solani y C. destntctans. De lasraíces necróticas de los plantones testigo sepudieron aislar C. destntctans, F. oxysporumy F. solani, aunque en baja proporción.

Fig. 7.-Patogenicidad de los aislados fúngicos en plantones del cultivar de olivo «Picual» en invernadero*.

Los plantones de 1 año de edad crecieron en suelo infestado con aislados de Cylindrocarpon destntctans(CD1, CD2), Fusarium oxysporum (FO1, FO2). F. solani (FS1, FS2), Macropiwmina phaseolina (MP1, MP2)y Rhizoctonia solani (RS1).

Fig. 8.-Patogenicidad de hongos radicularesen plantones y estaquillas del cultivar «Picual»:a) testigo no inoculado (izquierda) y plantones

con distinto grado de severidad de síntomas aéreos,b) síntomas radiculares: raíz necrosada con pérdida

de tejido cortical en los ápices, c) vista generaldel Exp. 2, d) planta testigo (izquierda) y estaquillas

inoculadas con Sclerotium rolfsii, en los que seaprecia la marchitez de la parte aérea, e) síntomasen el cuello y punto de inserción de las raicillas

en estaquillas inoculadas con S. rolfsii, en los que seobserva el micelio blanco del hongo

Fig. 8.-Patogenicidad de hongos radicularesen plantones y estaquillas del cultivar «Picual»:

f> plantas testigo (izquierda) y estaquillas inoculadascon Phytophthora megasperma sometidas a saturación

continua de agua en el suelo. Nótese la marchitezde la parte aérea, g) estaquilla testigo (izquierda)

e inoculada con P. megasperma. Síntomas aéreos:desecación y flaccidez foliar, h) raíz de una plantatestigo (izquierda) y de una estaquilla inoculada

con P. megasperma. ambas sometidas a saturacióncontinua de agua en el suelo. Obsérvese el comienzode la emisión de raicillas en la base de la estaquilla

sintomática (derecha).

Experimento 2

La Figura 9 muestra los resultados del testde patogenicidad sobre estaquillas de olivoen condiciones de invernadero (Exp. 2)(Fig. 8c). Las plantas testigo sufrieron ciertogrado de necrosis radicular y mostraron sín-tomas aéreos aunque de escasa importancia.De las demás plantas, sólo aquellas inocula-das con los aislados SR1 y FO1 mostraronuna incidencia y severidad de síntomas sig-nificativamente mayores que las de las plan-tas testigo. El aislado de S. rolfsii (SR1)produjo una marchitez generalizada (Fig.8d) y la necrosis extensa de la base de lasestaquillas inoculadas que afectaba al cuelloy a los puntos de inserción de las raicillas(Fig. 8e), mientras que el aislado de F. oxys-

porum FO1, dio lugar a la necrosis de lasraicillas. 5. rolfsii fue reaislado al 100% enel tejido del cuello de la raíz, y F. oxyspo-rum se reaisló en un 83% de las raicillas ne-crosadas. Las estaquillas inoculadas con elresto de los aislados que se ensayaron sólomostraron cierto grado de necrosis radiculary baja incidencia de síntomas aéreos, no di-firiendo significativamente de los valoresmedios de severidad de síntomas que pre-sentaban las estaquillas testigo. No obstante,hay que resaltar el elevado porcentaje de re-aislamiento (100%) de F. solani y R. solania partir de las raicillas de las plantas inocu-ladas con los aislados FS y RS respectiva-mente. En las estaquillas testigo, estas dosespecies fueron también aisladas de las raí-ces necrosadas, aunque sin consistencia.

Fig. 9.-Patogenicidad de los aislados fúngicos en estaquillas del cultivar de olivo «Pieual» en invernadero*.

* Las estaquillas de 4-6 meses de edad crecieron en suelo estéril infestado con aislados de Sclerotium ralfsii (SR 1),Fusarium oxysporum (FO1, FO2), Cylindrocarpon destructans (CD1), Rhizoctonia solani (RSI), F. solani(FS1. FS2) y Macrophomina phaseolina (MP1). Los asteriscos indican los valores medios que difierensignificativamente del testigo según el test de Dunnet (P = 0.05).

Experimento 3

El tercer experimento de patogenicidad sellevó a cabo en condiciones parcialmentecontroladas, más favorables para el desarro-llo de las infecciones. Los resultados delExp. 3 (Fig. 10) corroboran los obtenidos encondiciones de invernadero y, además, pu-sieron de manifiesto la patogenicidad en es-taquillas de olivo de los aislados de C. des-tructans (CD3 y CD4), obtenidos en lasprospecciones de 1996. Las plantas inocula-das con los aislados CD3 y CD4 mostraronuna podredumbre radicular severa, que afec-taba sobre todo a las raicillas. Tanto paraestos dos aislados como para el aislado SR1,los valores medios de severidad de síntomasaéreos y radiculares resultaron significativa-mente elevados con respecto a los de lasplantas testigo, siendo también muy elevadoel nivel de reaislamiento de las especies ino-

culadas (100%). Para el aislado SR1, ade-más de la necrosis extensa de la base de lasestaquillas, ya observada en el Exp. 2, fueposible observar el micelio blanco delhongo creciendo alrededor del cuello de lasplantas inoculadas. Al igual que en el Exp.2, F. solani fue reaislado al 100% de las rai-cillas de las plantas inoculadas con el aisla-do FS1, a pesar de que las estaquillas mos-traron un nivel muy bajo de necrosis radicu-lar sin expresión de síntomas aéreos. Tam-bién se registraron altos niveles de reaisla-miento en plantas inoculadas con F. acumi-natum (75% para las inoculadas con el aisla-do FAl y 100% para las inoculadas conFA2), M. phaseolina (100% para las plantasinoculadas con ambos aislados, MP1 yMP2) y R. solani (66% para las plantas ino-culadas con el aislado RS1 y 100% para lasinoculadas con el aislado RS2). Las plantastestigo no presentaron síntomas aéreos, pero

Fig. lO.-Patogenicidad de los aislados fúngicos en estaquillas del cultivar de olivo «Picual» en cámara de crecimiento*.

* Las estaquillas de 4-6 meses de edad crecieron en suelo estéril infestado con aislados de Sclerotium rolfsii (SR 1),Cylindrocarpon destructans (CD3, CD4). Fusarium acuminatum (FA1, FA2), Rhizoctonia solani (RSI, RS2),F. solani (FS1), F. eumartii (FE1) y Macrophomina phaseolina (MP1, MP2). Los asteriscos indican los valoresmedios que difieren significativamente del testigo según el test de Dunnet (P = 0,05).

se observó un cierto grado de podredumbreradicular. A partir de las raicillas necrosadasse pudo aislar C. destructans y, en menorgrado, F. solani y P. palmivora, aunque nin-guna de estas especies se obtuvo con consis-tencia.

Experimento 4

Los resultados de las pruebas de patogeni-cidad con los aislados de hongos pitiáceosbajo condiciones de invernadero se mues-tran en la Figura 11. En condiciones de unriego semana], se registró una muy baja in-cidencia de síntomas aéreos, tanto en plan-tas inoculadas como en testigos. Sin embar-go, en condiciones de encharcamiento conti-nuo del suelo, todas las plantas, incluidas lastestigo sin inocular, mostraron síntomas aé-reos (Fig. 8f, 11A). La severidad media de

estos síntomas fueron significativamentemayores para las plantas inoculadas con losaislados PM1 y PM2, en comparación conla severidad media de las plantas testigo(Fig. 8g), ya se trate de las plantas testigosometidas a encharcamiento del suelo (Cl)o no (C2). El análisis estadístico tambiénmostró que no había diferencias significati-vas entre ambos grupos de plantas testigo(Cl y C2) en cuanto a la severidad media desíntomas aéreos. Con respecto a la podre-dumbre radicular (Fig. I IB), los valores deseveridad de síntomas en condiciones de en-charcamiento fueron significativamente ma-yores en las plantas inoculadas con todos ycada uno de los aislados ensayados, en com-paración con sus correspondientes plantastestigo (Cl) (Fig. 8h). Bajo condiciones deun riego semanal, la severidad de síntomasradiculares fue también mayor que la severi-dad media mostrada por los correspondien-

Fig. 11 .-Patogenicidad de los aislados de hongos pitiáceos en estaquillas del cultivar de olivo «Picual» en invernadero.Las plantas crecieron en suelo estéril (Cl. C2) o en suelo infestado con dos aislados de Phytophthora megasperma(PM1. PM2). un aislado de P. palmivora (PPI) o un aislado de Pythium irregulare (PI1). Barras con letras difieren

significativamente según el test LSD protegido de Fisher (P = 0,05).

tes testigos (C2). Por otra parte, la severidadde síntomas radiculares fue significativa-mente mayor para las plantas testigo someti-das a encharcamiento (Cl) en comparacióncon los valores de severidad de los testigos

sin encharcar (C2). No se observaron dife-rencias de patogenicidad entre los dos aisla-dos de P. megasperma evaluados. Los por-centajes de reaislamiento de las especiesinoculadas a partir de las raíces necrosadas

fueron muy altos en todos los casos para lasplantas mantenidas en condiciones de en-charcamiento del suelo. No se recuperó nin-guna de las especies ensayadas a partir delas raíces de las plantas testigo, tanto en eltratamiento Cl como en el C2. Ocasional-mente, se recuperó R. solani y F. solani delas raíces de las estaquillas C2, y únicamen-te F. solani de las raicillas de las plantas Cl.

Este experimento también se realizó encondiciones de cámara de cultivo. En estecaso, todos los aislados ensayados, inclusoPI1, causaron la muerte de las plantas some-tidas a condiciones de encharcamiento, alcabo de 2 semanas tras la inoculación. Lasplantas testigo encharcadas permanecieronlibres de síntomas aéreos, mostrando noobstante, cierto grado de podredumbre radi-cular que resultó significativamente menorque la mostrada por las plantas inoculadas.En este corto período de tiempo no se obser-varon síntomas aéreos en las plantas que seregaron una vez por semana, ya fueran testi-gos o plantas inoculadas. En cambio, sí seobservaron síntomas radiculares, pero su se-veridad no difirió significativamente de losque presentaron las plantas testigo.

DISCUSIÓN

Todas las especies fúngicas que se ensa-yaron en las pruebas de patogenicidad sonhongos de suelo descritos como patógenosradiculares en diferentes huéspedes. Fre-cuentemente, estos hongos han sido asocia-dos con podredumbres radiculares en olivo(BOULILA et al, 1995; ClCCARONE, 1976;WILHELM et al, 1962). Si exceptuamos a P.irregulare y a la especie provisionalmenteidentificada como P. palmivora, el resto delas especies que resultaron patógenas ennuestros experimentos ya habían sido pre-viamente aisladas de olivo. Así, GEORGO-POULOS y THANASOULOPOULOS (AYCOCK,1966) mencionaron a S. rolfsii en Greciacomo patógeno de olivo y KOUYEAS yCHITZANIDIS (1968) hicieron lo mismo conP. megasperma. En Italia, ZAZZERINI y

MARTE (1976) demostraron la patogenici-dad de C. destructans en olivo. Por otraparte, varias especies de Phytophthora, in-cluyendo P. citricola y P. drechsleri, hansido asociadas con podredumbres radicula-res del olivo en California (TEVIOTDALE,1994). Pythium ultimum y otras especies noidentificadas de Pythium y Phytophthoratambién se han aislado de raíces podridas deolivo (FARR et al, 1989; WILHELM et al,1962).

Nuestras pruebas de patogenicidad de-muestran que varios aislados de cinco espe-cies fúngicas (C. destructans, P. megasper-ma, P. palmivora, P. irregulare y S. rolfsii)son claramente patógenas de olivo y repro-ducen los síntomas de podredumbre radicu-lar y marchitez foliar en estaquillas del cul-tivar Picual. Además, la patogenicidad de P.megasperma, P. palmivora y P. irregulareviene determinada por el contenido hídricodel suelo, ya que los aislados ensayadossólo causaron una podredumbre extensa dela raíz y la muerte de la planta afectadacuando el suelo se encontraba continuamen-te saturado de agua. En condiciones de riegonormales para el olivo, sólo 5. rolfsii y dosaislados de campo de C. destructans causa-ron claramente una podredumbre severa quedio lugar a la expresión de los típicos sínto-mas aéreos. También los aislados de P. me-gasperma causaron cierto grado de necrosisradicular en condiciones de un riego sema-nal, pero sin llegar a desarrollar síntomasaéreos. Por el contrario, los aislados de vi-vero de Pythium y Phytophthora sí causaronuna podredumbre radicular significativa enestas condiciones, aunque tampoco dieranlugar a la aparición de síntomas aéreos. Esimportante señalar que el aislado de viverode C. destructans resultó débilmente pato-génico, y que esta situación fue similar parael resto de aislados no pitiáceos ensayadosprocedentes de vivero. Dado que P. palmi-vora y P. irregulare nunca han sido aisladosen muestras de campo, se puede concluirque los patógenos radiculares que afectan alos plantones de olivo en campo no parecentener su origen en el vivero, al menos en el

caso de los viveros localizados en la zona deestudio. La muerte de plantones en viverosde olivo (damping-off) parece deberse a laconfluencia de dos factores: por un lado lapresencia de patógenos radiculares y porotro, a la existencia de riegos excesivos y/ocondiciones de drenaje deficientes.

Como el material vegetal empleado en laspruebas de patogenicidad provenía de un vi-vero comercial, ésta pudo ser la razón por lacual no fue posible trabajar con plantas to-talmente libres de patógenos. Este hechopudo determinar la falta de resultados posi-tivos en el Exp. 1, en el que no se esterilizóel suelo, así como la aparición de ciertogrado de necrosis radicular en las plantastestigo del resto de experimentos, a pesar derealizarse en suelo estéril y lavando cuida-dosamente las raíces antes de la inoculación.Esto, a su vez, pudo interferir con las eva-luaciones, ya que los hongos presentes enlas raíces de las plantas utilizadas pertenecíana la misma especie que alguno de los aisla-dos ensayados, como es el caso de C. des-tructans, F. solani o F. oxysporum.

La importancia real en condiciones decampo o vivero de los hongos asociados conpodredumbres radiculares de olivo, tanto losque han resultado patógenos como los nopatogénicos, es difícil de precisar, ya quefrecuentemente se aislaron varias especiesdel mismo campo o árbol y, dadas sus ca-racterísticas patogénicas, podrían actuarcomo patógenos secundarios en situacionesde estrés. Dos excepciones son S. rolfsii y P.megasperma. El primero sólo se obtuvo en

un campo (cuadro 1). En cambio, P. megas-perma se aisló muy consistentemente decampos con problemas de encharcamiento,lo que se corresponde con los resultados denuestras inoculaciones y sugiere que estepatógeno puede jugar un papel importanteen la generalmente aceptada sensibilidad delolivo a la «asfixia radicular». Este hechopodría tener una especial relevancia, ya queel cultivar «Picual» se ha considerado tradi-cionalmente muy sensible al exceso de aguaen el suelo y, por sus características agronó-micas, está siendo utilizado de forma gene-ralizada en las nuevas plantaciones de olivaren Andalucía, incluso en zonas de drenajedeficiente.

Por ello, se hace necesario continuar eltrabajo experimental tanto en condicionescontroladas como en condiciones de campo,con objeto de caracterizar las poblacionesde P. megasperma, su patogenicidad sobredistintos cultivares de olivo y su dependen-cia del contenido hídrico del suelo. Estostrabajos son fundamentales para establecerestrategias futuras en el control de esta en-fermedad.

AGRADECIMIENTOS

Los autores quieren expresar su agradeci-miento a F. Luque y M. Navas por su exce-lente apoyo técnico. Este trabajo de investi-gación ha sido financiado por el ProyectoAGF93-0342 de la Comisión Interministe-rial de Ciencia y Tecnología.

ABSTRACT

SÁNCHEZ HERNÁNDEZ, M. E.; RUIZ DÁVILA, A. y TRAPERO CASAS, A., 1998: La«seca» de olivos jóvenes II: Identificación y patogenicidad de los hongos asociadoscon podredumbres radiculares. Bol. San. Veg. Plagas, 24(3): 581-602.

This work deals with the identification of fungal isolates associated with root rot,the major factor included in the «drying and death syndrome» («seca») of young olivetrees in Andalucía, southern Spain. Fungi associated with damping-off in olive treenurseries were also identified. Several isolates from every fungal species were testedfor pathogenicity in nursery plants and rooted cuttings of olive cultivar 'Picual'. Patho-genicity tests demonstrated that five fungal species -Cylindrocarpon destructans, Phy-tophthora megasperma, P. palmivora, Pythium irregulare and Sclerotium rolfsii- wereclearly pathogenic to olive trees and reproduced symptoms of root rot and foliar wil-ting. Other fungal species associated with root rot of olive trees in the field or in thenurseries, including Fusarium acuminatum, F. eumartii, F. oxysporum, F. solani, Ma-crophomina phaseolina and Rhizoctonia solani, were weakly or not pathogenic. Patho-genicity of Phytophthora megasperma, P. palmivora and Pythium irregulare dependedon soil water content, since isolates tested only caused extensive root rot and suddenplant death when the soil was continuously waterlogged. The high frequency of P. me-gasperma (part I) and its dependence for pathogenicity on soil water content suggestthat this pathogen may play an important role in the well known sensitivity of youngolive trees to «root asphyxiation».

Key words: Cylindrocarpon destructans, Fusarium acuminatum, Fusarium eumar-tii, Fusarium oxysporum, Fusarium solani, Macrophomina phaseolina, Olea europaea,Phytophthora megasperma, Phytophthora palmivora, Pythium irregulare, Rhizoctoniasolani, Sclerotium rolfsii.

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(Recepción: 24 marzo 1998)(Aceptación: 20 julio 1998)