INTRODUCCIÓNINTRODUCCIÓN

La identificación en el menor tiempo posible y de una forma fiable de organismos patógenos es fundamental para mininizar los daños que producen. Sin embargo, para algunos hongos,

sobre todo los que atacan al sistema radicular, la determinación tradicional basada en la observación de estructuras morfológicas y en propiedades fisiológicas no es suficiente para obtener

una identificación fiable. El desarrollo de técnicas moleculares, sobretodo con el descubrimiento en 1985 de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), ha permitido establecer la

identidad de cada organismo y sus relaciones filogenéticas, lo que ha revolucionado la sistemática de hongos (EDEL, 1998).

Las aplicaciones de la técnica PCR son muy amplias y en la actualidad se utiliza en la detección e identificación de virus, bacterias, hongos, nematodos, etc. (CENIS, 1993). El éxito de esta

técnica consiste en su sencillez teórica y en la rapidez en su ejecución, ya que permite la identificación de un patógeno en un día. El poder aplicar con garantías técnicas moleculares supone

una enorme ganancia en tiempo que beneficia el control de la enfermedad. Por este motivo el objetivo de este trabajo fue adaptar un protocolo de PCR, complementado con el análisis de la

longitud de fragmentos de restricción (RFLP), para los géneros fúngicos Armillaria, Phytophthora y Fusarium.

CONCLUSIONESCONCLUSIONESEl género Armillaria presentaba grandes dificultades en la identificación de especies y los métodos propuestos resultaban complicados, de mucha duración

(entre cuatro o quinco semanas) y con resultados la mayor parte de las veces confusos. La aplicación de la técnica PCR junto con el análisis RFLP ha posibilitado la identificación de las especies en menos de un día de una forma fiable. Para Phytophthora y Fusarium, estas técnicas constituyen, por el momento, un buen complemento al diagnóstico por la metodología tradicional, pero estudios posteriores permitirán sin duda un mejor desarrollo de las mismas.

(1) Diputación Provincial de Pontevedra. Servicio Agrario. Estación Fitopatológica Do Areeiro. Subida a la Robleda, s/n. 36153 Pontevedra. Www.efa-dip.org(2) Departamento de Producción Vegetal, Universidad de Santiago de Compostela, Campus Universitario, 27002 Lugo

LA REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR) COMO TÉCNICA DE DIAGNÓSTICO EN FITOPATOLOGÍA FORESTAL

LA REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR) COMO TÉCNICA DE DIAGNÓSTICO EN FITOPATOLOGÍA FORESTAL

O. Aguín (1); M. Sabarís (1); A. Abelleira (1); C. Pintos (1) y J.P. Mansilla (1, 2)

MATERIAL Y MÉTODOSMATERIAL Y MÉTODOS

Se utilizó el EZNA fungal DNA miniprep KitExtracción del ADN

HONGOS CEBADORES CONDICIONES DE AMPLIACIÓN (*)

- 95 segundos a 951C.

Armillaria 0-1: 5'-AGTCCTATGGCCGTGGTAT-3' - 35 ciclos: 60 segundos a 601C

120 segundos a 721C

-LR12R: 5' CTGAACGCCTCTAAGTCAGAA-3' 60 segundos a 951C

- 10 minutos a 721C

- 120 segundos a 961C

Phytophthora ITS4: 5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3' - 35 ciclos: 60 segundos a 961C

60 segundos a 551C

ITS5: 5'-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3' 120 segundos a 721C

- 10 minutos a 721C

- 182 segundos a 951C

Fusarium ITS1: 5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3' - 35 ciclos: 60 segundos a 95 1C

60 segundos a 551C

P3: 5'-CCTTGGTCCGTGTTTCAAGACGGG-3' 60 segundos a 721C

- 3 minutos a 721C

* Condiciones propuestas para Armillaria (PÉREZ et al, 1999), Phytophthora (RISTAINO et al, 1998) y Fusarium (EDEL et al, 1996).

Secuencias de cebadores y condiciones de amplificación para los géneros Armillaria, Phytophthora y Fusarium.

AMPLIFICACIÓN Se utilizaron las Ready-To-Go-PCR beads

RFLP

ARMILLARIA: Alu I, Bsm I, Nde I

PHYTOPHTHORA I:

Rsa I, Hae III, Msp

Material fúngico utilizado:

ARMILLARIA:

Micelio sobre plantaMicelio en medio de cultivo

PHYTOPHTHORA: Micelio en medio de cultivo

FUSARIUM: Micelio en medio de cultivo

RESULTADOSRESULTADOSLa amplificación del ADN de las muestras fúngicas permitió observar una banda situada aproximadamente a 900 pb en el caso de Armillaria y Phytophthora, mientras que para Fusarium los

cebadores amplificaron una región de 1200 pares de bases.

En las muestras con Armillaria, se produjo éxito en la amplificación en todos los casos, identificándose cuatro especies : A. mellea, A. ostoyae, A.cepistipes y A. gallica, en distintos hospedadores.

En el caso de Phytophthora, mediante la aplicación de las técnicas PCR-RFLP se han detectado hasta el momento tres especies: P. cinnamomi, P. cactorum y P. capsici.

En las muestras de Fusarium solo se ha llegado a determinar el género mediante PCR; estudios posteriores con las enzimas de restricción adecuadas permitirán la diferenciación de especies.

500

100

Gel de agarosa al 3%, mostrando los fragmentos de restricción obtenidos

al digerir el DNA amplificado de muestras de Armillaria con Alu I

500

100

Gel de agarosa al 2%, mostrando los fragmentos de restricción obtenidos al

digerir el DNA amplificado de muestras de Phytophthora con Rsa I y Hae III

Rsa I Hae III

Gel de agarosa al 1%, mostrando el DNA amplificado de muestras

de Fusarium

1000

1500

III Congreso Forestal Español, Sierra Nevada (Granada) 25-28 septiembre 2001 III Congreso Forestal Español, Sierra Nevada (Granada) 25-28 septiembre 2001