la quinasa humana vrk2a, un nuevo modulador … · 4 1.1 cáncer de mama 17 3 1.2 marcadores...
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INSTITUTO DE BIOLOGÍA MOLECULAR Y CELULAR DEL CÁNCERINSTITUTO DE BIOLOGÍA MOLECULAR Y CELULAR DEL CÁNCER
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Isabel Fernández Fernández
Salamanca 2011
D. PEDRO A. LAZO-ZBIKOWSKI, PROFESOR DE INVESTIGACIÓN DEL
CONSEJO SUPERIOR DE INVESTIGACIONES CIENTÍFICAS (C.S.I.C.)
CERTIFICA
Que la memoria titulada “La quinasa humana VRK2A, un nuevo modulador negativo de la ruta
de señalización de ERK1/2” presentada por la licenciada ISABEL FERNÁNDEZ
FERNÁNDEZ ha sido realizada bajo su dirección en el Instituto de Biología Molecular y
Celular del Cáncer y reúne, a su juicio, originalidad y contenidos suficientes para que sea
presentada ante el tribunal correspondiente y optar al grado de Doctor por la Universidad de
Salamanca.
Y para que así conste, a efectos legales, expide el presente certificado en Salamanca a 9 de
Febrero de 2011.
Fdo. Pedro A. Lazo-Zbikowski
Esta memoria ha sido realizada siendo Isabel Fernández Fernández beneficiaria de una beca
de Iniciación a la Investigación y una beca Predoctoral I3P del Consejo Superior de
Investigaciones Científicas para el desarrollo de la tesis doctoral (2005-2009).
La investigación en el laboratorio ha sido financiada por los siguientes proyectos:
• Ministerio de Educación y Ciencia (SAF2004-02900; SAF2007-60242 y CSD-2007-
0017).
• Junta de Castilla y León, Consejería de Educación (CSI05A05; CSI14A08 y GR-15).
• Junta de Castilla y León, Consejería de Sanidad
(SAN/1052/SA04/05;SAN/673/SA05/08).
• Federación de Cajas de Ahorro de Castilla y León.
• Fundación Sandra Ibarra.
Esta memoria está dedicada a todos aquellos que alguna vez sintieron
curiosidad, a los que se formularon preguntas, y muy en especial, a los que
tuvieron el valor para intentar responderlas.
A mis padres y a José.
A Iván
ÍÍÍNNNDDDIIICCCEEE
Introducción 15
3
31. Cáncer 17
4
1.1 Cáncer de mama 17
3 1.2 Marcadores moleculares en cáncer de mama 18
3 1.3 Diferentes patrones de expresión génica permiten agrupar los
tumores primarios y líneas celulares de mama para su empleo como
modelos en el cáncer de mama 19
a3
32. Las proteínas quinasas: relevancia biológica 21
3
2.1 La familia de quinasas VRK (Vaccinia-related kinases) 23
a 2.2 Estructura de las quinasas VRK 25
3 2.3 La quinasa humana VRK1 27
3 2.3.1 Implicación de VRK1 en proliferación y progresión de ciclo celular 27
3 2.3.2 Regulación de factores de transcripción por VRK1 29
3 2.3.3 VRK1 en la dinámica de ensamblaje de la envoltura nuclear 30
3 2.3.4 Fosforilación de la histona H3 por VRK1 e implicaciones
en la condensación de la cromatina 32
3 2.3.5 VRK1 como mediadora de la fragmentación del aparato de Golgi 32
3 2.3.6 Regulación de VRK1 33
3 2.4 La quinasa humana VRK2 33
3 2.5 La quinasa humana VRK3 37
3 2.6 Ratones Knock-out para VRK1 y VRK2 38
3
33. Señalización iniciada en los receptores ErbB y su importancia en
3cáncer de mama 39
3 3.1 La familia de receptores ErbB 39
3 3.2 El receptor ErbB2 en cáncer de mama 41
3 3.3 Señalización intracelular a través de los receptores
de la familia ErbB 43
33333333
34. Las vías de señalización de MAPKs 44
333
4.1 La ruta de señalización de ERK1/2 46
3 4.1.1 Las proteínas quinasas MEK1/2 48
3 4.1.2 Las proteínas quinasas ERK1/2 49
3 4.1.3 Regulación temporal de la ruta de ERK1/2 51
3 4.1.4 Regulación de la señalización de ERK1/2 a través de diferentes
proteínas scaffolds 51
3 4.1.5 Regulación espacial de la ruta de señalización de ERK1/2 53
3 4.1.6 Inhibidores de la ruta de señalización de ERK1/2 54
3 4.1.7. Regulación de la ruta de ERK1/2 por mecanismos de
retroalimentación negativa y positiva 58
3 4.1.8 Regulación de ERK1/2 a través de fosfatasas de especificidad dual 58
3
35. La proteína KSR1 59
3
5.1 KSR1 en la ruta de señalización de ERK1/2 60
3 5.2 Fenotipos relacionados con el silenciamiento de KSR 62
3
Objetivos 63
2 Resultados 65
3 1. Características de VRK2 endógena 67
3
1.1 Localización subcelular de VRK2 en relación a VRK1 67
3 1.2 Patrones de expresión de VRK2 en tejidos de mama 69
3 1.3 Estudio de los patrones de expresión de VRK2 en un panel de
líneas celulares de mama 73
3
2. Estudio de la relación entre VRK2 y la señalización dependiente de ErbB2 77
3 2.1 Modulación negativa de la ruta de señalización de ERK1/2 por VRK2A 81
3 2.1.1 VRK2A inhibe la señalización de H-Ras de forma independiente
de su actividad quinasa 81
3 2.1.2 VRK2A modula negativamente la ruta de señalización de ERK1/2
actuando por debajo de MEK1 83
3 2.1.3 Modulación negativa de la respuesta a EGF por VRK2A 85
2.2 Efecto del silenciamiento de la expresión de VRK2 en la ruta de
señalización de ERK1/2. 87
3 2.2.1 Estudios en la línea celular HeLa 87
3 2.2.2 Estudios en la línea celular MDA-MB-231 93
3
3. Valoración de proteínas de la ruta de señalización de ERK1/2 candidatas a
interaccionar con VRK2 95
3 3.1 VRK2A no interacciona con las principales fosfatasas de la ruta de
señalización de ERK1/2 95
3 3.2 VRK2A no interacciona con las quinasas B-Raf ni ERK1/2 98
3 3.3 VRK2A interacciona con la quinasa MEK1, a través de su
extremo amino terminal 99
3 3.4 VRK2A y la proteína scaffold KSR1 100
3 3.4.1 KSR1 es necesaria para una correcta
respuesta a EGF 101
3 3.4.2 VRK2A y KSR1 colocalizan a nivel del retículo endoplasmático 102
3 3.4.3 VRK2A y KSR1 interaccionan 105
3 3.4.4 VRK2A no fosforila a KSR1 ni a MEK1 109
3 3.4.5 VRK2A, KSR1 y MEK1 forman un complejo 110
33.5 VRK2A modula negativamente la ruta de señalización de ERK1/2
por un mecanismo dependiente de KSR1 111
3
3.5.1 KSR1 es necesario para la modulación negativa de la ruta de
señalización de ERK1/2 por VRK2A 112
3 3.5.2 VRK2A contribuye a retener a una subpoblación de KSR1 en
complejos de elevado peso molecular 115
3
Discusión 119
3 31 La quinasa VRK2 endógena 121
3 1.1 Expresión y localización subcelular 121
3 1.2. Expresión de VRK2 en tumores de mama 122
3 1.3 Expresión de VRK2 en un panel de líneas celulares de mama 124
32. VRK2 como modulador de la ruta de ERK1/2 126
3 2.1 Modulación negativa de la ruta de señalización de ERK1/2 por la quinasa
humana VRK2A 126
3 2.2 Estudio del mecanismo de acción por el que VRK2A inhibe la ruta de
señalización de ERK1/2 130
3 2.3 Relevancia, a nivel fisiológico, del papel de VRK2A como modulador
negativo de la ruta de señalización de ERK1/2 137
3
Conclusiones 139
3 Materiales y métodos 141
3 31.Técnicas de manipulación de ácidos nucleicos 143
3 1.1 Extracción de ADN plasmídico de E. Coli 143
3 1.2 Cuantificación de ácidos nucleicos 143
3 1.3 Electroforesis de fragmentos de ADN 143
32. Generación de vectores recombinantes de ADN 144
33. Transformación 144
34. Purificación de proteínas de fusión 144
3 4.1 Purificación de proteínas de fusión con GST 144
3 4.2 Purificación de proteínas de fusión con el epítopo 6x His 146
35. Tinción de Coomassie 146
36. Cuantificación de proteína 146
3
37. Precipitación de proteína 146
38. Purificación de anticuerpos policlonales frente a la proteína VRK2 mediante
columna de afinidad 147
39. Electroforesis en geles SDS-PAGE y Western Blot de
extractos proteicos 147
310. Cultivo de líneas celulares 149
311. Transfecciones transitorias de ADN en células eucariotas
en cultivo 149
3 11.1 Transfección con fosfato cálcico 150
3 11.2 Transfección con el reactivo comercial JetPEI 150
3 11.3 Transfección con el reactivo comercial Lipofectamine 151
312. RT-PCR cuantitativa en tiempo real 151
313. Determinación de la actividad transcripcional de promotores génicos ligados
a un gen reportero de luciferasa 152
314. Ensayos de interacción entre proteínas 152
3 14.1 Ensayos de coinmunoprecipitación 152
3 14.2 Ensayos de interacción por precipitación de proteínas de fusión
con GST (“Ensayos de Pull-Down”) … 153
3 14.3 Ensayos de interacción in Vitro 154
315. Cromatografía de exclusión molecular FPLC “Fast protein liquid
chromatography” 154
316. Reactivos y estimulaciones 155
317. Supresión de la expresión de proteínas mediante ARNi 155
318. Inmunofluorescencias 155
319. Inmunohistoquímicas 156
320. Ensayos quinasa 156
..21. Abreviaturas.......................................................................................................................157
Tablas de materiales empleados 159
3
Bibliografía 165
Agradecimientos .185
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Introducción
- 17 -
1. Cáncer
El cáncer es una enfermedad heterogénea, que se caracteriza por la acumulación
dinámica de cambios a nivel genómico, lo que finalmente da lugar al establecimiento de una o
varias poblaciones celulares con capacidad de proliferación incontrolada. Seis alteraciones
principales caracterizan a la célula tumoral: independencia de señales de crecimiento,
insensibilidad a señales inhibitorias del crecimiento, evasión de los programas de muerte
celular, capacidad de división ilimitada, angiogénesis y metástasis (invasión de otros tejidos)
(Hanahan and Weinberg, 2000; Kang et al., 2008; Klerkx et al., 2009b).
La célula tumoral adquiere independencia de los factores de crecimiento a través de
diversas estrategias. En muchos casos, estas células son capaces de generar sus propios factores
de crecimiento, en un proceso de señalización autocrina. En otros casos, la sobreexpresión de
receptores de membrana, tal y como ocurre con el receptor HER2/Neu en determinados tumores
de mama y estómago (Slamon et al., 1987), permite incrementar la respuesta proliferativa aún
ante niveles basales de factores de crecimiento. Por otro lado, la señalización independiente de
ligando se puede conseguir a través de mutaciones estructurales en los receptores de membrana.
Sin embargo, el mecanismo más complejo por el cual la célula tumoral adquiere autonomía de
los factores de crecimiento, es por alteraciones en los componentes de los circuitos de
señalización intracelular. De hecho, es probable que todos los tumores humanos acumulen
alteraciones a nivel de las rutas de señalización intracelular (Hunter, 1997). Así, la ruta de
señalización de SOS-Ras-Raf-MAPK (que se detallará en la página 46) juega un papel crucial
ya que aproximadamente un 25% de los tumores humanos acumulan mutaciones estructurales
en Ras (Medema and Bos, 1993). A día de hoy, aún se siguen describiendo moléculas efectoras
que interactúan y modulan la cascada de señalización de SOS-Ras-Raf-MAPK y que en muchos
casos tumorales aparecen mutadas o se ven sujetas a una regulación anómala (Downward,
1998).
1.1 Cáncer de mama
El cáncer de mama representa uno de los mayores problemas de salud en los países
desarrollados tanto por su incidencia como por su elevada tasa de mortalidad. A pesar de los
enormes avances realizados en los últimos años en cuanto a detección precoz, diagnóstico y
tratamiento, es aún el tumor maligno más frecuente y una de las primeras causas de mortalidad
por cáncer entre las mujeres. Esta enfermedad causó en 2004 aproximadamente unas 519.000
muertes en todo el mundo según la organización mundial de la salud, afectando también a
hombres aunque con una incidencia 150 veces menor que en mujeres según Cancer Research
UK.
Introducción
- 18 -
1.2 Marcadores moleculares en cáncer de mama
Los avances en medicina y biología molecular han llevado a identificar toda una serie
de marcadores moleculares en cáncer de mama. Algunos de estos marcadores tienen valor
pronóstico ya que correlacionan con las tasas de supervivencia. Otros, en cambio, tienen valor
predictivo ya que permiten seleccionar a pacientes por su buena respuesta a una determinada
estrategia terapéutica. Algunos marcadores tienen tanto valor pronóstico como predictivo
(Esteva and Hortobagyi, 2004).
Entre los marcadores más establecidos en la actualidad podemos citar:
• Marcadores de proliferación como el antígeno nuclear Ki-67 y el antígeno nuclear de
proliferación celular, PCNA (Esteva and Hortobagyi, 2004).
• Receptores de estrógeno y progesterona. Existen 2 receptores de estrógenos (ER),
ERα y ERβ, encargados de regular la transcripción génica de forma estrógeno-
dependiente. La sobreexpresión del receptor ERα es un marcador tanto pronóstico como
predictivo muy bien establecido. En cambio, el valor pronóstico del receptor ERβ no
está claro. La sobreexpresión del receptor ERα correlaciona positivamente con un
menor grado tumoral, diploidía y una menor fracción celular en fase S (todos ellos
parámetros de buen pronóstico). Además, los pacientes ER positivos se benefician de
las terapias con hormonas (Esteva and Hortobagyi, 2004). Aquellos tumores que
sobreexpresan el receptor de progesterona (PR), se asocian en general a un mejor
pronóstico a corto plazo y menor crecimiento celular. Sin embargo, las implicaciones de
este marcador molecular continúan siendo debatidas (Mc Cormack et al., 2007).
• El receptor HER2/neu/ErbB2 (epidermal growth factor receptor 2). Amplificaciones
del gen que codifica este receptor de membrana o sobreexpresión de la proteína se
detectan en un 20-30% de los cánceres de mama en humanos y correlacionan con un
mal pronóstico (Slamon et al., 1987). Sin embargo, una de las principales utilidades
clínicas de este marcador es la selección de pacientes susceptibles de ser tratados con
determinados tipos de fármacos como el anticuerpo monoclonal Trastuzumab.
• Los genes BRCA-1 y BRCA-2 (breast cancer 1 y 2). Estos genes codifican proteínas
que actúan como supresores de tumores, cuya pérdida o mutación constituye un
importante factor de riesgo en el cáncer de mama de tipo familiar (Miki et al., 1994).
• Estado mutacional de TP53. Mutaciones en el gen TP53 (que codifica la proteína p53)
son indicadores de mal pronóstico y una mala respuesta a las terapias sistémicas (Berns
et al., 2000; Borresen et al., 1995).
Introducción
- 19 -
• Existen además otros tipos de marcadores moleculares que continúan siendo estudiados
tales como activadores e inhibidores del plasminógeno, marcadores pronósticos
relacionados con la angiogénesis y marcadores pronósticos relacionados con apoptosis.
1.3 Diferentes patrones de expresión génica permiten agrupar los tumores primarios y
líneas celulares de mama para su empleo como modelos en el cáncer de mama
Las glándulas mamarias humanas se componen de dos tipos de células epiteliales muy
bien diferenciadas: células basales y células luminales. Ambos subtipos se diferencian por su
posición en el epitelio de la glandula mamaria, de manera que las células basales se disponen en
la base del epitelio mientras que las células luminales se disponen en contacto con el lumen de
la glándula mamaria. Además, estos dos tipos celulares se diferencian también mediante
técnicas inmunohistoquímicas. Así, las células epiteliales basales son positivas para las
queratinas 5, 6 y 14, mientras que las células luminales son positivas para las queratinas 8, 18 y
19 (Perou et al., 2000; Petersen and Polyak, 2010; Taylor-Papadimitriou et al., 1989).
Debido a la enorme variabilidad tanto a nivel histológico o molecular como en su
respuesta terapéutica que caracteriza a los tumores de mama, diversos grupos de investigación
se han centrado en estudiar los patrones de expresión génica de los tumores primarios tratando
de buscar grupos de tumores que se asocien a la expresión bien diferenciada de determinados
genes.
Así, Perou y colaboradores en estudios iniciales empleando tumores primarios de
mama, observan que estos tumores expresan los genes característicos de células basales
(queratina 5/17, integrina β1 o laminina) o bien los genes característicos de células luminales
(queratina 8/18), pero no ambos a la vez. Otra observación sorprendente es que los tumores
primarios pueden clasificarse en dos grandes grupos como ER negativos y ER positivos,
caracterizándose estos últimos por la expresión de genes característicos de las células tipo
luminal. Los tumores que expresan genes característicos de células tipo basal resultaban ser ER
negativos y constituían un 15% del total. Por último, también destacaba la existencia de un
tercer grupo ErbB2 positivo, que se caracterizaba por expresar grupos específicos de genes y
niveles bajos de expresión de ER (Perou et al., 1999; Perou et al., 2000) . Distinguían por tanto
tres grandes subgrupos:
• Tipo luminal /ER+
• Tipo basal/ER-
• ErBb2 positivos
Posteriormente, Sorlie y colaboradores amplían esta clasificación de manera que el grupo de
tipo luminal se subdivide a su vez en tres diferentes subgrupos: A, B y C. El subtipo luminal A
Introducción
- 20 -
incluye aquellos tumores con elevada expresión de ERα y otras proteínas como GATA binding
proteín 3 o X-box binding proteín 1. Los subtipos luminal B y C se caracterizan por una baja o
moderada expresión de ER y genes relacionados. Por otro lado, los subgrupos basal y ErbB2
positivos correlacionan con peores tasas de supervivencia (Sorlie et al., 2001).
El estudio de los cambios a nivel genómico y transcripcional durante los procesos
tumorales ha llevado a la identificación de numerosos oncogenes y supresores tumorales. En el
caso del cáncer de mama, se han descrito cientos de genes sujetos a una regulación anómala. Sin
embargo, dado que muchos de estos estudios se han llevado a cabo en líneas celulares, resulta
imprescindible plantearse con cuanta fidelidad las líneas de mama reflejan las aberraciones
presentes en los tumores primarios. Con este objetivo, el grupo de Gray ha estudiado una
colección de 51 líneas celulares tumorales de mama. Como conclusión general observan que las
líneas celulares tumorales de mama presentan una elevada heterogeneidad en cuanto a número
de copias génicas y respuestas heterogéneas a las terapias dirigidas al igual que los tumores
primarios. Además, estas líneas celulares, también se agrupan en función de sus patrones de
expresión en líneas celulares de tipo basal y líneas celulares de tipo luminal (Neve et al., 2006).
Identifican así los siguientes grupos de líneas celulares tumorales de mama (Figura1) en función
de sus patrones de expresión:
• Tipo luminal. ERBB3+/ESR1+.
• Tipo basal. ESR1-/CAV1+. Este a su vez se subdivide en dos subgrupos:
o Tipo basal A. queratina 5-/queratina 14+.
o Tipo basal B. Este es el subgrupo más alejado respecto a los anteriores, con un
patrón de expresión tipo célula madre que tal vez podría reflejar los tumores
triple negativos (ER-/PR-/ErbB2-).
Tipo Luminal(ER+) :
Tipo Basal(ER-)
ErbB2 +
Tipo Luminal
Tipo Basal A
AB
C
Tipo Basal B
Alta invasividadAspecto mesenquimal
Morfología diferenciadaUniones intercelulares fuertes
Tumores primarios de mama Líneas celulares de mama
Tipo Luminal(ER+) :
Tipo Basal(ER-)
ErbB2 +
Tipo Luminal
Tipo Basal A
AB
C
Tipo Basal B
Alta invasividadAspecto mesenquimal
Morfología diferenciadaUniones intercelulares fuertesTipo Luminal
(ER+) :
Tipo Basal(ER-)
ErbB2 +
Tipo Luminal(ER+) :
Tipo Basal(ER-)
ErbB2 +
Tipo Luminal
Tipo Basal A
Tipo Luminal
Tipo Basal A
AB
C
Tipo Basal B
Alta invasividadAspecto mesenquimal
Morfología diferenciadaUniones intercelulares fuertes
Tumores primarios de mama Líneas celulares de mama
Figura 1. Esquema comparativo de la clasificación de los tumores primarios de mama y las líneas celulares de mama, en función de sus perfiles transcripcionales.
Introducción
- 21 -
Existe una clara asociación entre cada uno de estos subgrupos y la morfología y el
potencial invasivo. De esta manera, las líneas celulares de mama tipo luminal resultan tener un
aspecto de célula más diferenciada y forman uniones intercelulares estrechas y fuertes. Estas
células expresan genes como GATA3, TOB1, ERBB3, y SPDEF, que se asocian a un fenotipo
no invasivo. En cambio, las líneas tipo basal B presentan un aspecto morfológico tipo
mesenquimal, menos diferenciado. Las líneas celulares tipo basal A pueden tener un aspecto
similar a las luminales o bien a las basales tipo B. Además, las líneas tipo basal B resultan
altamente invasivas (Neve et al., 2006).
Recientemente, se ha ampliado la clasificación de los tumores primarios y líneas de mama
añadiendo un nuevo grupo con baja expresión de las proteínas Claudina 3,4 y 7 (proteínas que
participan en las uniones estrechas), denominado “Claudin-low”. Se trata de tumores
generalmente triple negativos (ER -, PR -, ErbB2 -), de mal pronóstico y que se caracterizan
por una expresión baja de genes implicados en la adhesión célula-célula y de genes del tipo
luminal (Prat et al., 2010; Prat and Perou, 2010).
Resulta interesante constatar que, al contrario que en los tumores primarios, no existe en
las líneas celulares tumorales de mama un patrón transcripcional específico que agrupe a las
células ErbB2 positivas, estando las líneas ErbB2 positivas dispersas entre los grupos luminal y
basal A. Además, el subgrupo luminal es homogéneo en las líneas celulares mientras que el
subgrupo basal se subdivide en dos. Otra diferencia respecto a los tumores primarios es la
mayor frecuencia de aberraciones y amplificaciones génicas presentes en las líneas celulares, lo
cual puede ser debido a que estas líneas se seleccionaron a partir de tumores en estadios muy
avanzados o muy probablemente a que una mayor acumulación de aberraciones genómicas
proporciona una ventaja para su crecimiento y selección in vitro (Neve et al., 2006).
2. Las proteínas quinasas: relevancia biológica
Las proteínas quinasas son enzimas que catalizan la transferencia de un grupo fosfato, a
residuos de serina, treonina o tirosina de proteínas diana. Estas enzimas se caracterizan por una
elevada homología en el dominio quinasa o dominio catalítico, consistente en una secuencia de
250-300 aminoácidos (Hanks and Hunter, 1995; Hanks et al., 1988). Hay tres subgrupos
principales de quinasas en función del tipo de residuos que son capaces de fosforilar: las
serín/treonín quinasas, las tirosina quinasas y las quinasas duales que fosforilan los tres tipos de
residuos. Las fosforilaciones son modificaciones covalentes reversibles que a nivel celular son
contrarrestadas por otras enzimas denominadas fosfatasas, las cuales son las encargadas de
eliminar enzimáticamente el grupo fosfato añadido previamente por una quinasa.
Introducción
- 22 -
Las proteínas quinasas median la mayor parte de los procesos de señalización
intracelular en las células eucariotas. La fosforilación de proteínas, como modificación
postraduccional, resulta muy adecuada cuando se requiere una rápida modulación de los
factores de transcripción en respuesta a un estímulo extracelular. A través de la fosforilación, las
quinasas modifican la actividad de sus sustratos y controlan múltiples procesos celulares
incluyendo transcripción, progresión del ciclo celular, metabolismo, motilidad, apoptosis o
diferenciación. Desempeñan, así, papeles esenciales en la comunicación intercelular durante el
desarrollo embrionario o el funcionamiento del sistema nervioso e inmune (Hanks and Hunter,
1995; Karin and Hunter, 1995; Kostich et al., 2002; Manning et al., 2002a; Manning et al.,
2002b). No es extraño que la alteración y desregulación de proteínas quinasas esté implicada en
la génesis de múltiples enfermedades incluyendo el cáncer (Colucci-D'Amato et al., 2003;
Hunter, 1997).
Manning y colaboradores han catalogado filogenéticamente todas las quinasas humanas
en lo que se ha denominado el “Quinoma humano”, haciendo uso de las bases de datos
genómicas disponibles, los ADN codificantes y las EST (“expressed sequence tags”)
introducidas en el “GenBank” (Manning et al., 2002a; Manning et al., 2002b). Identifican 518
quinasas potenciales y 106 pseudogenes de quinasas (copias no funcionales de quinasas).
En el trabajo de Manning se amplia la clasificación inicial de las quinasas humanas
realizada por Hanks y Hunter (Hanks and Hunter, 1995) añadiendo 4 nuevos grupos, siendo uno
de ellos el de las caseín quinasas de tipo I (CK1), dentro del cual se encuadra la familia de
quinasas VRK (Vaccinia-related kinases), objeto de nuestro estudio (Figura 2).
Muchos de los genes identificados en este estudio y en el realizado por Mitch Kostich
codifican quinasas inactivas (Kostich et al., 2002). En torno a un 10% de los dominios quinasa
podrían carecer de actividad enzimática debido a sustituciones en aminoácidos clave. Sin
Figura 2. Representación esquemática del grupo de las Caseín quinasas de tipo I dentro del cual se encuadra la familia de quinasas VRK (Manning et al., 2002b).
Introducción
- 23 -
embargo dado que, salvo por dichas sustituciones estos sitios catalíticos están bien conservados,
tienden a retener el plegamiento característico y se postula que puedan actuar como proteínas de
ensamblaje de complejos multiproteicos (proteínas scaffold). Además del dominio catalítico
existen en las quinasas otros dominios relevantes, que permiten regular la actividad quinasa, la
unión con otras proteínas o la localización subcelular. La regulación de las quinasas puede
ocurrir a múltiples niveles, incluyendo control transcripcional, modificaciones
postraduccionales, unión de proteínas reguladoras y localización subcelular, siendo el
mecanismo más frecuente de regulación la fosforilación de residuos clave en la quinasa
(Kostich et al., 2002).
2.1 La familia de quinasas VRK (Vaccinia-related kinases)
La familia de quinasas VRK consta de tres miembros en humanos: VRK1, VRK2 y
VRK3. Nezu y colaboradores describen inicialmente la quinasa humana VRK1, mediante el
empleo de una librería de ADNc enriquecida en genes fetales de hígado diseñada para la
búsqueda de quinasas que se expresen de forma diferencial en tejidos altamente proliferativos
(Nezu et al., 1997). La secuencia completa de este gen se empleó, a través de una búsqueda en
bases de datos de EST, para identificar otro gen con un 62% de homología con el anterior que
codifica la quinasa humana VRK2 (Nezu et al., 1997). Ambas proteínas presentan una
importante homología de secuencia con la serín/treonín quinasa B1R del virus Vaccinia, vital
para la replicación del ADN viral (Banham and Smith, 1992; Lin et al., 1992; Rempel et al.,
1990; Rempel and Traktman, 1992) . VRK1 tiene un 40% de identidad sobre 305 aminoácidos
de B1R y VRK2 un 38,7% sobre 300 aminoácidos. Posteriormente se identificó, también
mediante busquedas en bases de datos, una tercera quinasa perteneciente a esta familia
denominada VRK3 (Vega et al., 2003). Estudios de northen blot muestran que las tres quinasas
tienen una distribución ubicua (Nezu et al., 1997). Tanto la quinasa humana VRK1 como la
murina son capaces de complementar el fenotipo de virus Vaccinia, sensibles a la temperatura y
defectivos en la quinasa B1R. Es decir, VRK1 es capaz de rescatar la síntesis de ADN en dichos
virus carentes de B1R (Boyle and Traktman, 2004).
La familia de quinasas VRK se relaciona de forma distante con las caseín quinasas de
tipo 1 (CKI), pero la conservación del dominio quinasa es débil presentando sustituciones en
residuos clave (Manning et al., 2002a; Scheeff et al., 2009). Se cree que un único gen ancestral
para las proteínas VRKs se duplicó dos veces a lo largo de la evolución de la rama de los
vertebrados generando tres genes de la familia VRK, mientras que los invertebrados han
mantenido un único gen.
Introducción
- 24 -
No existen ortólogos de las proteínas VRK en levaduras. Sin embargo, encontramos en
estos organismos isoformas de la caseín quinasa tipo 1, como el gen Hrr25 de Saccharomyces
cerevisiae y su ortólogo el gen hhp1 de Schizosaccharomyces pombe, que por su homología de
secuencia con las VRKs, podrían ser los ancestros en levaduras. La proteína HRR25 participa en
la respuesta al daño al ADN, y en la regulación del transporte vesicular desde el retículo
endoplasmático al aparato de Golgi. Además, el mutante de este gen muestra un crecimiento
lento y retraso en la entrada en fase G2 (Ho et al., 1997; Hoekstra et al., 1991; Murakami et al.,
1999). La proteína HPP1 está implicada en la regulación de la reparación del daño al ADN
(Dhillon and Hoekstra, 1994).
En el nematodo Caenorhabditis elegans (C. elegans) existe un único ortólogo, el gen
F28B12.3 que codifica la proteína VRK-1. El silenciamiento de este gen mediante ARN de
interferencia provoca un fenotipo letal en el embrión con defectos en la división celular y la
formación del huso mitótico (Gorjanacz et al., 2007; Kamath et al., 2003; Piano et al., 2002;
Simmer et al., 2003). La proteína VRK-1 de C. elegans fosforila a la proteína BAF regulando su
localización y participación en el ensamblaje de la envoltura nuclear, por lo que el
silenciamiento de cualquiera de estas dos proteínas provoca defectos en la formación de la
envoltura nuclear (Gorjanacz et al., 2007). Recientemente se ha descrito la importancia de este
gen para la formación de los órganos reproductores del gusano, debido a su papel como
regulador de la invasión celular y la señalización a través de EGL-17/FGF (Klerkx et al.,
2009a). Además, en células germinales VRK-1 parece estar implicada en la modulación de la
actividad de CEP-1 (ortólogo de p53) (Waters et al., 2010).
El ortólogo de las proteínas VRK en Drosophila melanogaster, la quinasa NHK-1, fue
descubierta por su capacidad para fosforilar a la histona H2A en mitosis (Aihara et al., 2004).
Posteriormente, se observó que resultaba esencial para la correcta organización del huso
mitótico y la segregación de los cromosomas, siendo necesaria para la progresión mitótica y
meiótica (Cullen et al., 2005). Mutaciones de este gen provocan esterilidad (Ivanovska et al.,
2005). En concordancia con lo descrito en C. elegans se ha descrito recientemente cómo la
fosforilación de BAF-1 por NHK-1 reduce su afinidad por el ADN y las proteínas de la
envoltura nuclear, liberando los cromosomas de la envoltura nuclear para la formación del
cariosoma durante la meiosis (Lancaster et al., 2007).
En el ratón, Mus musculus, existen tres ortólogos al igual que en humanos. Inicialmente
la proteína VRK1 murina fue descrita como 51PK, quinasa nuclear con elevada auofosforilación
en residuos de serina (Zelko et al., 1998). Las tres quinasas murinas se expresan durante todo el
desarrollo en el hígado, leucocitos de sangre periférica, bazo y timo fetal, órganos que
experimentan una alta tasa de proliferación celular durante el desarrollo embrionario. Sin
Introducción
- 25 -
embargo, los niveles de expresión de VRK2 son muy inferiores (unas diez veces) a los de
VRK1 y VRK3 (Vega et al., 2003). En los tejidos adultos de ratón el nivel de expresión de las
tres quinasas es dependiente del tejido celular (Kang and Kim, 2008; Vega et al., 2003; Zelko et
al., 1998).
Existen además ortólogos en otros organismos como el pez cebra Dario rerio, el anfibio
Xenopus laevis o el chimpancé Pan troglodytes.
2.2 Estructura de las quinasas VRK
La quinasa VRK1 es una proteína de 396 aminoácidos cuyo gen se localiza en la región
cromosómica 14q32. El extremo amino es bastante homólogo al de la caseín quinasa de tipo 1
(Lopez-Borges and Lazo, 2000), conteniendo un sitio activo de unión a ATP (residuos 43-71) y
un sitio serina-treonina quinasa activo (residuos 173-185). Sin embargo, el extremo carboxilo
que contiene una secuencia de localización nuclear (SLN) (residuos 356-360) no presenta
homología con otras proteínas conocidas y se cree que constituye el dominio regulador de la
proteína (Lopez-Borges and Lazo, 2000; Nichols and Traktman, 2004). Además, en la región
carboxilo existe un dominio básico-ácido-básico (motivo BAB, residuos 356-396) altamente
conservado entre los ortólogos (Figura 3) (Aihara et al., 2004). Las tres quinasas de la familia
VRK difieren bastante en su región reguladora, pero no en su dominio catalítico, lo que sugiere
que pueden compartir sustratos, si bien su regulación y localización subcelular puede ser muy
diferente (Blanco et al., 2006; Lopez-Borges and Lazo, 2000).
Figura 3. Estructura de las quinasas VRK. Principales motivos y dominios presentes en las quinasas de la familia VRK. VRK1 y VRK2 presentan una elevada similitud en el dominio catalítico pero difieren en su región carboxilo terminal.
ATP
ATP
ATP
43-71
35-61
35-61
173-185
162-174
162-174
K356KRKKSLN
BAB
BAB
BABRT
SLN
N
N
N
N
C
C
C
C
VRK1
VRK2A
VRK2B
VRK3
Sitio de unión al ATP
Sitio quinasa activo
(SLN) Secuencia de localización nuclear
BAB Dominio Básico-Ácido-Básico
Región Transmembrana (RT)
Dominio quinasa degenerado
ATP
ATP
ATP
43-71
35-61
35-61
173-185
162-174
162-174
K356KRKKSLN
BAB
BAB
BABRT
SLN
N
N
N
N
C
C
C
C
VRK1
VRK2A
VRK2B
VRK3
Sitio de unión al ATP
Sitio quinasa activo
(SLN) Secuencia de localización nuclear
BAB Dominio Básico-Ácido-Básico
Región Transmembrana (RT)
Dominio quinasa degenerado
Introducción
- 26 -
El gen de VRK2 se localiza en la región cromosómica 2p16 y codifica 2 proteínas
diferentes generadas por un procesamiento alternativo del ARN mensajero (ARNm),
denominadas isoforma VRK2A e isoforma VRK2B (Blanco et al., 2006). VRK2A, de 508
aminoácidos, posee en su extremo amino un sitio quinasa activo (región 162-174) y un sitio de
unión al ATP (residuos 35-61). El extremo carboxilo presenta una secuencia hidrofóbica
(residuos 492-508) que constituye una región transmembrana (RT) (Blanco et al., 2006; Nichols
and Traktman, 2004), junto con dos motivos BAB solapados. La isoforma VRK2B, de 397
aminoácidos, es idéntica a VRK2A hasta el aminoácido 394 a partir del cual el nuevo exón del
procesamiento alternativo introduce un codon de terminación prematuro que reemplaza los
aminoácidos 395-508 de VRK2A por tres residuos (VEA) (Blanco et al., 2006). VRK2B no
presenta, por tanto, la región transmembrana y el motivo BAB aparece truncado (Figura 3).
Tanto VRK1 como VRK2 son serín/treonín quinasas activas, con intensa
autofosforilación, si bien la autofosforilación de VRK2 es menor. A diferencia de las Caseín
quinasas de tipo I, son capaces de fosforilar proteínas tanto ácidas como básicas (Barcia et al.,
2002; Lopez-Borges and Lazo, 2000; Nichols and Traktman, 2004).
En cuanto al gen de VRK3 se localiza en la región cromosomica 19q13.33 y codifica
una proteína de 474 aminoácidos y que tiene poca homología con VRK1 y VRK2. Presenta en
su extremo amino una secuencia de localización nuclear (SLN) y en su extremo carboxilo un
dominio quinasa degenerado, debido a la sustitución de aminoácidos clave. Carece, por tanto, de
actividad quinasa (Kang and Kim, 2006; Nichols and Traktman, 2004; Scheeff et al., 2009).
Recientemente, se ha resuelto la estructura tridimensional de los dominios catalíticos de
VRK2 y VRK3. Los dominios catalíticos de ambas presentan el típico plegamiento de las
proteínas quinasas. Sin embargo, en VRK3, varios residuos de glicina del loop-G (GxGxfG)
(encargado en las quinasas de posicionar adecuadamente el ATP para la catálisis) son
remplazados por residuos con cadenas laterales de mayor tamaño, lo que impide la unión del
ATP. Estos cambios junto con otras modificaciones fuera del loop-G hacen de VRK3 una
pseudoquinasa. Además, existe en la cara opuesta al dominio catalítico de VRK3 una región de
aminoácidos altamente conservados a lo largo de la evolución y que probablemente constituye
una superficie de unión para otras quinasas (Scheeff et al., 2009). Esto apoya la teoría de que el
mantenimiento de la estructura de VRK3 a pesar de la pérdida de la actividad quinasa, pueda
deberse a la necesidad de retener interacciones clave con otras proteínas como ocurre con otras
pseudoquinasas. Cabe destacar, además, que la estructura y la falta de conservación del dominio
de activación sugiere que las quinasas VRK puedan ser constitutivamente activas (Boudeau et
al., 2006; Scheeff et al., 2009).
Introducción
- 27 -
2.3 La quinasa humana VRK1
VRK1 es, sin lugar a dudas, el miembro mejor caracterizado de la familia VRK. El
ARN mensajero de VRK1 se expresa en todos los tejidos estudiados. La mayor expresión de
VRK1 humana se detecta en hígado, timo, testículos fetales y líneas celulares tumorales, tejidos
con una alta tasa proliferativa. La localización subcelular de VRK1 varía en función del tipo
celular y las condiciones de crecimiento. Además, anticuerpos con afinidad para diferentes
epítopos en la proteína reconocen diferentes poblaciones subcelulares (Valbuena et al., 2007a).
Se trata mayoritariamente de una quinasa nuclear, capaz de asociarse a la cromatina pero
presente también en el nucleoplasma (Kang et al., 2007; Valbuena et al., 2007a; Vega et al.,
2004). Estudios proteómicos han detectado la presencia de VRK1 en complejos de la
maquinaria de iniciación transcripcional, asociados a la cromatina (Guermah et al., 2006). Sin
embargo, existen poblaciones citosólicas, concretamente una de ellas asociada al aparato de
Golgi (Figura 4) (Valbuena et al., 2007a).
Se han descrito múltiples procesos en los que participa la quinasa VRK1,
posicionándola como una quinasa esencial para la correcta progresión del ciclo celular a través
de la regulación de factores de transcripción, la modulación de los niveles de p53, el control del
ensamblaje de la envoltura nuclear, la fosforilación de histonas o la fragmentación del aparato
de Golgi (Figura 5). A continuación, se detallan los principales procesos celulares en los que
participa esta quinasa.
2.3.1 Implicación de VRK1 en proliferación y progresión de ciclo celular
Desde la caracterización inicial de VRK1 por Nezu y colaboradores, ya se postulaba una
posible implicación de esta quinasa en el control de la proliferación celular (Nezu et al., 1997).
Desde entonces, estudios de diferentes autores han confirmado que, a través de diferentes
funciones, VRK1 es necesaria para una correcta progresión de ciclo celular (Figura 5).
Figura 4. Localización subcelular de VRK1. La quinasa VRK1 se localiza en el núcleo a nivel de la cromatina y del nucleoplasma. Presenta, también, una localización difusa por el citosol y se han identificado poblaciones en el aparato de Golgi (Kang et al., 2007; Valbuena et al., 2008a; Valbuena et al., 2007a; Vega et al., 2004) .
VRK1
VRK1VRK1
VRK1
VRK1
Citosol
Núcleo
Introducción
- 28 -
En epitelios escamosos normales, esta quinasa se expresa cerca de la capa basal, en el
mismo compartimento que el marcador de proliferación Ki67 (Santos et al., 2006). En epitelios
escamosos de faringe, la expresión de VRK1 disminuye a medida que las células abandonan el
compartimento de amplificación de la misma manera que el marcador p63 (Valbuena et al.,
2008b). En tumores de cabeza y cuello de célula escamosa correlaciona con marcadores de
proliferación celular tales como CDK2, CDK6, Ciclina A, Ki67 o Survivina, comportándose,
por tanto, como un marcador proliferativo (Santos et al., 2006). Por otro lado, la supresión de
VRK1 mediante ARN de interferencia se acompaña de una reducción en los niveles de ciclina
D1, ciclina A, PCNA y otros marcadores de proliferación, provocando una parada de ciclo en la
fase G1 (Valbuena et al., 2008b; Vega et al., 2004).
De las observaciones anteriores, se deduce que esta quinasa resulta indispensable para la
correcta progresión del ciclo celular y, por tanto, se expresa mayoritariamente en células y
tejidos altamente proliferativos. Esto explica que su expresión se muestre alterada en
determinados tipos tumorales. Así, en carcinomas de pulmón la expresión de VRK1 varía en
función del subtipo de carcinoma de pulmón, existiendo en los carcinomas de pulmón de célula
escamosa una correlación entre elevados niveles de VRK1 y el estado mutacional de p53
(Valbuena et al., 2007b). VRK1 se encuentra sobreexpresada en sarcomas de tejidos blandos
(Nishijo et al., 2009). Por otro lado, existen evidencias de que la expresión de VRK1 puede
constituir un marcador de mal pronóstico en cáncer de mama. Así, en tumores de mama, bajos
niveles de VRK1 junto con bajos niveles de genes relacionados con mitosis podrían ser un
marcador de buen pronóstico (Fournier et al., 2006). De forma similar una elevada expresión de
16 quinasas relacionadas con ciclo celular, entre ellas VRK1, correlaciona con un mal
pronóstico en cáncer de mama (Finetti et al., 2008). La única enfermedad, no tumoral, descrita
Fase G0-G1
Fase G2-MFase S
Expresión de Ciclina D1
Niveles adecuados de p53
Desensamblaje envoltura nuclearCondensación cromatina mitóticaFragmentación del aparato de Golgi
Fase G0-G1
Fase G2-MFase S
Expresión de Ciclina D1
Niveles adecuados de p53
Fase G0-G1
Fase G2-MFase S
Expresión de Ciclina D1
Niveles adecuados de p53
Desensamblaje envoltura nuclearCondensación cromatina mitóticaFragmentación del aparato de Golgi
Figura 5. Esquemas de las diferentes funciones desempeñadas por VRK1 a lo largo del ciclo celular. A lo largo de todo el ciclo celular, VRK1 fosforila a p53 manteniendo unos niveles basales adecuados de esta proteína. En cambio, otras funciones son desempeñadas por VRK1 de forma específica en una determinada fase del ciclo celular (Kang et al., 2007; Kang et al., 2008; Lopez-Sanchez et al., 2009; Nichols et al., 2006; Valbuena et al., 2008b; Vega et al., 2004).
Introducción
- 29 -
hasta el momento asociada a una mutación en el gen de VRK1 es el síndrome de atrofia
muscular espinal con hipoplasia pontocerebelosa (SMA-PCH), en el cual un codón prematuro
de parada en la secuencia de localización nuclear de VRK1 es el responsable de la enfermedad,
probablemente debido a una proteína incapaz de translocarse al núcleo, inestable o incapaz de
interaccionar con determinados sustratos (Renbaum et al., 2009).
2.3.2 Regulación de factores de transcripción por VRK1
Algunas de las dianas de fosforilación de VRK1, descritas hasta el momento, son
factores de transcripción. El supresor de tumores, p53, es considerado “el guardián del genoma”
dado que previene la acumulación de alteraciones genéticas, a través de la inducción de la
parada de ciclo celular para permitir la reparación del ADN dañado o de la entrada en apoptosis
de la célula dañada. Este factor de transcripción es fosforilado por VRK1 en el residuo treonina
18 (Barcia et al., 2002; Lopez-Borges and Lazo, 2000). VRK1 induce la acumulación de p53 a
través de la fosforilación en treonina 18, dado que esta fosforilación impide la unión de su
regulador negativo Mdm2 y favorece la unión del cofactor p300, que lo estabiliza. Así, VRK1
estabiliza a p53 a través de Mdm2 pero también por mecanismos independientes de Mdm2 al
incrementar la acetilación de p53 en lisina 373 y lisina 382, residuos típicamente acetilados por
el cofactor p300 (Vega et al., 2004). De esta manera, VRK1 controla la actividad y estabilidad
de p53. Por otro lado, p53 establece un loop auto-regulatorio por el cual induce la degradación
de su regulador positivo VRK1, a través de la vía lisosomal (Valbuena et al., 2006). Esta
degradación de VRK1 parece ser dependiente de un gen desconocido, regulado por p53, dado
que mutantes en los dominios de unión al ADN y oligomerización de p53 son incapaces de
inducir la degradación de VRK1 (Valbuena et al., 2006). Esta hipótesis se apoya también en la
observación de que la degradación de VRK1 por p53 se evita al sobreexpresar las acetil-
transferasas p300 y pCAF, probablemente debido a que son capaces de dirigir la transcripción
mediada por p53 hacia dianas muy específicas (Valbuena et al., 2008a).
Otras dianas de fosforilación de VRK1 son los factores de transcripción c-jun y ATF2,
los cuales se unen a sitios AP1 para regular la expresión génica. El factor de transcripción c-jun
es fosforilado por MAPKs (Mitogen-activated protein kinases) como ERK1/2 (Extracellular
signal-regulated kinases) y JNK (c-Jun N-terminal kinase), en respuesta a factores de
crecimiento y señales de estrés (Angel and Karin, 1991). VRK1 fosforila a c-jun en serina 63 y
serina 73 e interacciona con él, estabilizándolo y activándolo transcripcionalmente. De forma
similar, VRK1 fosforila a ATF2 en treonina 73 y serina 62, estabilizándolo y cooperando con
JNK en su activación transcripcional (Sevilla et al., 2004b). La figura 6 muestra los principales
sustratos de fosforilación de VRK1.
Introducción
- 30 -
VRK1 fosforila, también, al factor de transcripción CREB (cAMP response element-
binding) en serina 133 e interacciona con él, activándolo (Kang et al., 2008). A través de la
activación de CREB y ATF2, VRK1 incrementa la unión de estos al promotor de la ciclina D1,
induciéndose la expresión de esta ciclina que resulta un factor clave en la transición de fase G1
a fase S (Figura 6). Además, el factor de transcripción Myc, promueve la expresión de VRK1 a
nivel de su promotor, induciéndose así la expresión de ciclina D1 (Kang et al., 2008).
2.3.3 VRK1 en la dinámica de ensamblaje de la envoltura nuclear
La proteína BAF (Barrier To Autointegration Factor) resulta esencial para el
mantenimiento de una correcta arquitectura nuclear (Haraguchi et al., 2001). Esta proteína
forma homodímeros que se unen al ADN de forma independiente de secuencia, pudiendo
además unirse también a proteínas de la membrana nuclear interna que contienen dominios
LEM (lamin-interacting proteins). Durante la interfase BAF se sitúa mayoritariamente en la
membrana nuclear interna, donde interviene en el anclaje de la cromatina a la envoltura nuclear.
A medida que se inicia la mitosis, BAF adquiere una distribución difusa, probablemente debido
a que es fosforilado durante profase liberándose de su unión a la cromatina y proteínas de la
envoltura nuclear. Esto va a permitir la condensación de la cromatina y el desensamblaje de la
Figura 6. Diagrama mostrando las principales dianas de fosforilación de VRK1 en relación a rutas de señalización bien caracterizadas, que también median la fosforilación de esos mismos sustratos. Se especifican tan sólo los residuos fosforilados por VRK1(Kang et al., 2007; Kang et al., 2008; Klerkx et al., 2009b; Lopez-Borges and Lazo, 2000; Marta Sanz-García, 2010; Nichols et al., 2006; Sevilla et al., 2004a; Sevilla et al., 2004b) .
Introducción
- 31 -
envoltura nuclear al comienzo de la mitosis. En cambio, en la anafase tardía, BAF colocaliza
con los telómeros de los cromosomas donde recluta a determinadas proteínas de la envoltura
nuclear. En este punto, BAF resulta indispensable para el ensamblaje de la envoltura nuclear
que se había desensamblado al comienzo de la mitosis (Figura 7) (Haraguchi et al., 2001;
Nichols et al., 2006).
VRK1, VRK2A y B1R fosforilan a BAF en su extremo amino terminal, en los residuos
de serina 4, treonina 2 y 3. Estas fosforilaciones tienen un modesto efecto en la capacidad de
BAF para unirse a las proteínas con motivos LEM, pero reducen drásticamente la capacidad de
BAF de unirse al ADN y alteran su localización subcelular (Nichols et al., 2006).
Probablemente, VRK1 a través de la fosforilación de BAF en profase, hace que este se
libere de su unión al ADN permitiéndose así la condensación de la cromatina y el
desensamblaje de la envoltura nuclear. De esta manera, al igual que se había descrito en otros
organismos, VRK1 a través de la fosforilación de BAF juega un importante papel en las
dinámicas de ensamblaje-desensamblaje de la envoltura nuclear.
BAF
BAF
BAF
BAFBAFBAF
BAF
BAF
Por otro lado, se sabe que BAF facilita la integración del ADN viral, de determinados
virus como el MMLV (Moloney Murine Leukemia Virus) o el HIV-1 (Human
Immunodeficiency virus), en el ADN de la célula infectada. Esto se debería a la capacidad de
BAF de actuar como puente entre el ADN viral y el humano. Un trabajo de reciente publicación
sugiere que tanto VRK1 como VRK2 murinas, desde su localización citosólica, actuarían a
través de la fosforilación de BAF oponiéndose a la integración en el ADN nuclear, del ADN
viral, durante la infección por retrovirus (Suzuki et al., 2010).
Figura 7. Ruptura de la envoltura nuclear al inicio de la mitosis y su posterior ensamblaje durante la anafase. Durante interfase, BAF se sitúa en la envoltura nuclear interna donde interacciona con el ADN (cromatina) y proteínas de la envoltura interna con dominios LEM. Durante la mitosis, se produce la ruptura de la envoltura nuclear (EN) y las proteínas situadas en ella se redistribuyen por el retículo endoplasmático (RE). Estos eventos son desencadenados a través de la fosforilación de proteínas de la envuelta por quinasas mitóticas como Cdk1 y a través de la fosforilación de BAF por VRK1. Al final de la mitosis la envoltura nuclear se reorganiza de nuevo.
Introducción
- 32 -
2.3.4 Fosforilación de la histona H3 por VRK1 e implicaciones en la condensación de la
cromatina
Las histonas son objeto de numerosas modificaciones postraduccionales, entre las que
se cuentan la acetilación, fosforilación, metilación, ubiquitinación y sumoilación. La mayoría de
estas modificaciones ocurren en los extremos amino y carboxilo terminales de las colas de las
principales histonas (H2A, H2B, H3, H4) (Berger, 2007). De esta manera se controlan múltiples
procesos celulares como la transcripción o la condensación de la cromatina en cromosomas
durante la mitosis para la segregación del material genético. VRK1 se localiza en la cromatina y
fosforila a la histona H3 en los residuos treonina 3 y serina 10. Estas fosforilaciones ocurren
tanto in vivo como in vitro, de manera que en el caso de la fosforilación en el residuo serina 10,
VRK1 coopera con la quinasa Aurora B (Kang et al., 2007). Además, la sobreexpresión de una
forma constitutivamente activa de VRK1 es capaz de inducir la condensación de la cromatina.
Se cree que la fosforilación de la histona H3 en su región amino terminal es importante para la
condensación de la cromatina mitótica, si bien también se observa en la cromatina laxa de
determinados genes transcripcionalmente activos en interfase (Johansen and Johansen, 2006).
Las histonas H2A, H2B y H4 son también fosforiladas por VRK1 pero muy débilmente.
Probablemente, VRK1 contribuye a la condensación de los cromosomas en la transición G2/M
a través de la fosforilación de histonas (Kang et al., 2007).
2.3.5 VRK1 como mediadora de la fragmentación del aparato de Golgi
La redistribución de los orgánulos celulares en dos células hijas durante la mitosis, es un
proceso imprescindible para la división celular. En este proceso juega un papel muy importante
la fosforilación reversible de proteínas (Acharya et al., 1998). En concreto, el proceso que lleva
a la fragmentación del aparato de Golgi en mitosis es relativamente desconocido. Se sabe, sin
embargo, que las quinasas MEK1 (Mitogen-activated protein kinase kinase 1) y Plk3 (Polo-like
kinase 3) participan en este proceso, promoviendo la fragmentación del aparato de Golgi
(Acharya et al., 1998; Ruan et al., 2004). VRK1 es fosforilada por la quinasa Plk3 en el residuo
serina 342. Ambas quinasas interaccionan y colocalizan a nivel del aparato de Golgi. La
supresión de VRK1 mediante ARN de interferencia bloquea parcialmente la fragmentación del
aparato de Golgi inducida tanto por MEK1 como por Plk3. Además, la sobreexpresión del
mutante quinasa inactivo de VRK1 o del mutante de VRK1 no fosforilable en serina 342,
bloquean también parcialmente la fragmentación del aparato de Golgi inducida por Plk3
(Lopez-Sanchez et al., 2009). Estos datos sugieren que VRK1 se sitúa al final de una ruta de
señalización formada por MEK1-Plk3-VRK1, que es necesaria para la fragmentación del
aparato de Golgi en la transición G2-M.
Introducción
- 33 -
2.3.6 Regulación de VRK1
Existen hasta el momento múltiples datos acerca del papel biológico de la quinasa
humana VRK1 y, sin embargo, son pocos los datos referentes a su regulación. La adición o
eliminación de suero del medio de cultivo celular (con los mitógenos y factores que este
contiene) es capaz de regular la expresión de VRK1. La eliminación del suero del medio de
cultivo se traduce en una disminución de la expresión de VRK1 mediada por mecanismos
transcripcionales, a nivel de su promotor (Valbuena et al., 2008b). Por otro lado, se han descrito
dos factores de transcripción capaces de promover la expresión de VRK1 a nivel de su
promotor: E2F1 y Myc (Kang et al., 2008; Santos et al., 2006; Vernell et al., 2003). Además, la
irradiación de células con luz ultravioleta induce un rápido incremento en los niveles de VRK1,
paralelo a la inducción de p53 (Valbuena et al., 2006). En cuanto a la regulación de los niveles
de VRK1 por mecanismos postraduccionales, tal y como se ha citado con anterioridad, el
supresor de tumores p53 es capaz de inducir la degradación de VRK1 a través de la vía
lisosomal (Valbuena et al., 2008a; Valbuena et al., 2006).
Finalmente, en cuanto a la regulación de la actividad quinasa de VRK1, a través de
técnicas proteómicas se ha identificado a la GTPasa Ran (Ras-related nuclear) como un
inhibidor de la actividad quinasa de VRK1, VRK2A y VRK2B (Sanz-Garcia et al., 2008).
2.4 La quinasa humana VRK2
Existen muy pocos datos referentes a la función y regulación de esta quinasa, cuyo
estudio centrará este trabajo. VRK2 tiene una expresión ubicua y bastante homogénea, con
menores niveles de expresión en riñón y cerebro y mayores niveles en músculo esquelético,
corazón, leucocitos de sangre periférica, páncreas o testículos (Nezu et al., 1997). Tal y como se
ha mencionado previamente, a partir del gen que codifica la quinasa VRK2, situado en el
cromosoma 2p16, se generan dos isoformas VRK2A y VRK2B por un procesamiento
alternativo del ARN mensajero (Blanco et al., 2006).
Figura 8. Localización subcelular de VRK2A y VRK2B. La isoforma VRK2A se localiza anclada a membranas de retículo endoplasmático y mitocondrias en el citosol. Cuando se estudia su localización por inmunofluorescencia se observa también un anillo perinuclear. Además, los fraccionamientos subcelulares muestran una pequeña fracción nuclear de VRK2A, lo que sugiere que probablemente esté anclada a la envoltura nuclear. La isoforma VRK2B se localiza libre predominantemente en el núcleo celular pero también, a veces, en el citosol.
Introducción
- 34 -
La isoforma VRK2A (de 508 aminoácidos) se localiza anclada de forma integral a
membranas del retículo endoplasmático, mitocondrias y probablemente envoltura nuclear,
debido a la región hidrofóbica presente en su extremo carboxilo terminal. La isoforma VRK2B
(de 397 aminoácidos) carece de la región hidrofóbica, encontrándose libre predominantemente
en el núcleo celular (Figura 8) (Blanco et al., 2006; Nichols and Traktman, 2004).
VRK2A se expresa en todas las líneas celulares estudiadas hasta el momento. Por el
contrario, VRK2B se expresa sólo en determinados tipos celulares (Blanco et al., 2006).
Ambas isoformas son serín/treonín quinasas con intensa capacidad de autofosforilación
principalmente en residuos de treonina. Cuando se estudia su capacidad de fosforilar un panel
de sustratos comúnmente empleados para la caracterización de quinasas relacionadas con la
caseín quinasa tipo I, se observa que son capaces de fosforilar in vitro a sustratos como la
caseína, la histona H2B, la histona H3 o la proteína básica de mielina (MBP) (Tabla 1) (Blanco
et al., 2006; Nichols and Traktman, 2004; Sanz-Garcia et al., 2008).
Con posterioridad se ha descrito como VRK2 es capaz de fosforilar in vitro a p53 en el
residuo treonina 18 y a BAF en los residuos de serina 4 y treonina 2 y 3 (Tabla 1) (Blanco et al.,
2006; Nichols et al., 2006).
Dada la absoluta similitud de VRK2A y VRK2B, en su extremo catalítico hasta el
aminoácido 394, ambas isoformas tienden a compartir sustratos de fosforilación in vitro entre sí
y con VRK1. Sin embargo, debido a las enormes diferencias en su región carboxilo responsable
de su localización subcelular y regulación, es probable que difieran en su capacidad para
fosforilar a estos sustratos in vivo (Blanco et al., 2006).
Sustratos de fosforilación de VRK2
Caseína
Histona H2B
Histona H3
Proteína básica de mielina (MBP)
p53
BAF
VRK2A VRK2B
p53
P Thr18
MDM2
EstabilizaciónActivación transcripcional
Figura 9. Regulación del factor de transcripción p53 por VRK2B. La isoforma VRK2B se localiza libre tanto en el citosol como en el núcleo y tiende a compartir sustratos y funciones con VRK1. Al igual que ésta fosforila a p53 en el residuo treonina 18 induciendo su acumulación. En cambio, la quinasa citosólica VRK2A no es capaz de estabilizar a p53, lo que sugiere que no sea capaz de mediar su fosforilación in vivo.
Tabla 1. Sustratos de fosforilación de VRK2. La Histona H3 sería fosforilada in vitro en los residuos treonina 3 y serina 10 (Sanz-Garcia et al., 2008). El factor de transcripción p53 es fosforilado en el residuo treonina 18, por la isoforma nuclear VRK2B (Blanco et al., 2006). La proteína BAF es fosforilada en los residuos serina 4 y treonina 2 y 3 durante la mitosis (Kolch, 2005; Nichols et al., 2006).
Introducción
- 35 -
Así, aunque ambas isoformas fosforilan a p53 in vitro, tan sólo la isoforma nuclear VRK2B
lleva a cabo esta función in vivo, dado que es la única capaz de mediar la estabilización y
acumulación de p53 al reducir su ubiquitinación y promover su acetilación por el cofactor p300
(Figura 9) (Blanco et al., 2006). De forma similar, se ha descrito la fosforilación in vitro de la
Histona H3 por ambas isoformas, sin embargo, las implicaciones de estas fosforilaciones in vivo
sólo se han estudiado en el caso de VRK1 y parece poco probable que la isoforma citosólica
VRK2A fosforile in vivo a sustratos nucleares como la histona H3 (Kang et al., 2007; Nichols et
al., 2006; Sanz-Garcia et al., 2008).
Al igual que ocurría con VRK1, p53 es capaz de inducir la degradación de VRK2A y
VRK2B (Valbuena et al., 2008a). Además, se ha propuesto que VRK2B puede tener una
función parcialmente redundante con VRK1, pudiendo reemplazar funcionalmente a VRK1 en
el núcleo en aquellas líneas celulares en las que VRK1 es citosólica (Blanco et al., 2006).
La mayor parte de los datos referentes al papel biológico desempeñado por las quinasas
VRK2 provienen del estudio de su implicación en respuestas a estrés celular. La respuesta a
estrés celular ante condiciones de hipoxia contribuye a decidir la supervivencia o entrada en
apoptosis de la célula hipóxica. Se sabe que en esta respuesta a hipoxia participa, la MAPK,
JNK que es estimulada induciendo la transcripción de genes con sitios de respuesta a AP1. Otra
de las proteínas necesarias para mediar la respuesta a hipoxia es la proteína scaffold JIP1 (JNK-
interacting proteín) (Whitmarsh et al., 2001), encargada de ensamblar los complejos de MAPKs
que incluyen a MLK, MKK7 y JNK, la cual fosforila al factor de transcripción c-jun. dfcfe
VRK2A
ATP35 61 162
BAB RT492 508174
TAK1397 508
JIP1
1 320
Ran256 320
Sitio catalítico
BHRF401 508
ATP35 61 162
BAB397174
Sitio catalítico
VRK2B
Ran256 320
JIP1
1 320
MKK7
VRK2A
ATP35 61 162
BAB RT492 508174
TAK1397 508
JIP1
1 320
Ran256 320
Sitio catalítico
BHRF401 508
ATP35 61 162
BAB397174
Sitio catalítico
VRK2B
Ran256 320
JIP1
1 320
VRK2A
ATP35 61 162
BAB RT492 508174
TAK1397 508
JIP1
1 320
Ran256 320
Sitio catalítico
BHRF401 508
ATP35 61 162
BAB397174
Sitio catalítico
VRK2B
Ran256 320
JIP1
1 320
MKK7
Figura 10. Esquema mostrando las proteínas capaces de interaccionar con VRK2A y VRK2B, descritas hasta el momento. Se indican las regiones de interacción de JIP1 (extemo amino terminal), TAK1 y BHRF (región carboxilo terminal) y Ran (aminoácidos 256-397) con VRK2A y VRK2B. En el caso de MKK7, no se ha descrito región de interacción, sin embargo, dado que interacciona con VRK2A y no con VRK2B probablemente interaccione a través de la zona carboxilo terminal.
Introducción
- 36 -
Además, en esta respuesta a hipoxia participa también, la MAPKKK, TAK1 (TGF-β activated
kinase) (Blanco et al., 2007). Las señales de hipoxia activan a TAK1 y promueven el
ensamblaje de un complejo oligomérico que incluye TAK1, MKK7, JNK y JIP1. VRK2A y
VRK2B interfieren con la respuesta a hipoxia mediada por TAK1, de forma independiente de su
actividad quinasa, a través de su incorporación a dichos complejos de señalización (Figura 11).
Tanto VRK2A como VRK2B, interaccionan de forma estable con JIP1. Sin embargo,
sólo VRK2A interacciona de forma directa con TAK1 y MKK7, mientras que la interacción de
VRK2B con estas es indirecta a través de su interacción con JIP1 (Figura 10) (Blanco et al.,
2007). De forma similar, VRK2A y en menor medida VRK2B regulan negativamente la
respuesta a IL-1β que se transmite vía TAK1-JNK. La modulación, tanto de la respuesta a
hipoxia como a IL-1β, ocurre de forma independiente de la actividad quinasa de VRK2 e
implica una menor incorporación y activación de JNK en los complejos de señalización
ensamblados por JIP1 (Figura 11) (Blanco et al., 2008).
Por otro lado, se ha descrito como VRK2A es capaz de proteger a las células de la
apoptosis a través de la interacción con la proteína viral BHRF1, del Epstein-Barr virus.
BHRF1 es homóloga de la proteína antiapoptótica Bcl2 y como ésta posee actividad
Figura 11. Esquema del mecanismo de modulación de la respuesta a interleuquina 1 e hipoxia por VRK2 Ambas isoformas inhiben la señalización a través del módulo JIP1/TAK1/MKK7/JNK (Blanco et al., 2007; Blanco et al., 2008).
Introducción
- 37 -
antiapoptótica, que favorece la estrategia viral de evitar la muerte celular para maximizar la
propagación del virus. Estos autores proponen que VRK2A no interacciona con Bcl2, y presenta
por si sola una modesta actividad antiapoptótica, pero a través de la interacción por su extremo
carboxilo terminal con BHRF1, permite incrementar la supervivencia celular tras la infección
del virus (Li et al., 2006). La figura 10 muestra las regiones de VRK2A y VRK2B implicadas
en la interacción con diferentes proteínas, según los datos disponibles hasta el momento.
2.5 La quinasa humana VRK3
El gen que codifica la quinasa humana VRK3 se localiza en el cromosoma 19q.13 y,
como se ha mencionado previamente, codifica una pseudoquinasa carente de actividad
catalítica. La expresión de esta quinasa se ha estudiado en tejidos murinos, resultando ser ubicua
con niveles elevados en testículos, riñón e hígado. A nivel subcelular, VRK3 muestra una
localización nuclear (Kang and Kim, 2008; Nichols and Traktman, 2004; Vega et al., 2003).
Los únicos datos existentes acerca de la función biológica de esta quinasa hacen
referencia a su capacidad para regular negativamente la ruta de señalización de ERK1/2, a
través de la interacción y activación de la fosfatasa VHR (vaccinia H1 related) (Kang and Kim,
2006). VHR/DUSP3 es una fosfatasa de expresión ubicua. Se localiza tanto en el citosol como
en el núcleo y su expresión se regula a lo largo del ciclo celular (Rahmouni et al., 2006). Se han
descrito los siguientes sustratos para esta fosfatasa: p38, STAT5, ERK1/2 y JNK. Sin embargo,
existe una cierta controversia en cuanto a la relevancia biológica de estos sustratos,
especialmente en el caso de ERK1/2. VRK3 forma un complejo ternario con VHR y ERK1/2 en
el cual la actividad fosfatasa de VHR es estimulada por VRK3, lo que se traduce en una
disminución de los niveles de fosforilación de ERK1/2 (Figura 12). En concordancia con lo
opjjkj
Figura 12. Modulación negativa de la ruta de señalización de ERK1/2 por VRK3 (Kang and Kim, 2006, 2008).
Introducción
- 38 -
anterior, tras el silenciamiento de VHR , VRK3 no es capaz de regular negativamente la ruta de
señalización de ERK1/2. VHR es capaz de desfosforilar a ERK1/2 in vivo, sin embargo in vitro,
ERK1/2 resulta un mal sustrato para esta fosfatasa (Rahmouni et al., 2006; Zhou et al., 2002).
Esta aparente contradicción se podría explicar por la existencia de una proteína scaffold
encargada de poner en contacto a la fosfatasa con su sustrato, papel que a nivel nuclear podría
ser desempeñado por VRK3 (Bayón, 2010).
Además, se ha descrito como los niveles de expresión de VRK3 se regulan
positivamente por PMA (acetato de forbol miristato) a nivel génico y también por la
sobreexpresión de una forma constitutivamente activa de MEK1. En cambio la expresión de
VRK3 se regula negativamente por la sobreexpresión de una forma dominante negativa de
ERK2 (Kang and Kim, 2006). Es decir, ERK1/2 regularía positivamente la expresión de su
regulador negativo VRK3 (Figura 12).
A pesar de su capacidad para regular la ruta de señalización de ERK, VRK3 no parece
estar relacionada directamente con procesos de proliferación celular, dado que su expresión es
elevada tanto en tejidos con alta tasa de proliferación como en otros con baja tasa proliferativa
(Kang and Kim, 2008).
2.6 Ratones Knock-out para VRK1 y VRK2
Recientemente, se han generado y estudiado ratones hipomórficos, en los que una
inserción en el gen de VRK1 se traduce en una expresión de tan sólo el 15% de VRK1 en
comparación con los ratones silvestres. Estos ratones son viables pero estériles, tanto machos
como hembras. Esta esterilidad resulta de un defecto progresivo en la capacidad proliferativa de
las células espermatogénicas, que lleva a la ausencia total de eventos mitóticos y meióticos en el
testículo adulto de ratón (Choi et al., 2010; Wiebe et al., 2009). Por lo demás, el hecho de que
estos ratones sean aparentemente saludables en otros aspectos, sugiere una menor importancia
de VRK1 en otros tejidos no tan sensibles al silenciamiento parcial de la quinasa. Por otro lado,
podría existir un cierto nivel de redundancia con las otras quinasas de la familia VRK, tal y
como se ha descrito para otras familias de proteínas (Boyle and Traktman, 2004; Malumbres et
al., 2004; Ohmachi et al., 2002).
Curiosamente, con anterioridad se había estudiado de forma secundaria el efecto de la
alteración del gen murino de VRK2 por el grupo de Bishop. Al comparar los ratones (gcd) que
presentan una mutación recesiva que altera los genes de Vrk2 y Pog (dado que se transcriben en
direcciones opuestas), pudieron observar como los ratones Vrk2(-/-)/ Pog(-/-) presentan una
esterilidad más severa que los ratones Pog(-/-) (Lu and Bishop, 2003) . Esto sugiere que al igual
que VRK1, VRK2 puede estar desempeñando un papel importante durante la espermatogénesis.
Introducción
- 39 -
3. Señalización iniciada en los receptores ErbB y su importancia en cáncer de mama
3.1 La familia de receptores ErbB
Los receptores de la familia ErbB fueron descubiertos en los años 80 debido a su
homología con el producto del gen v-erbB del virus tumoral del eritroblastoma, que codificaba
una forma aberrante de la proteína ErbB1 o EGFR. Estos receptores juegan un papel crucial
durante el desarrollo embrionario, dado que los ratones Knock-out para cualquiera de estos
genes mueren en la etapa embrionaria. Desempeñan también papeles importantes en el
organismo adulto, por ejemplo, durante la proliferación y diferenciación del tejido mamario
(Lee et al., 1995; Schroeder and Lee, 1998; Sibilia and Wagner, 1995).
La familia de receptores tirosín quinasa ErbB incluye cuatro miembros,
EGFR/ErbB1/HER1, ErbB2/Neu/HER2, ErbB3/HER3 y ErbB4/HER4 (Figura 13). Todos ellos
se caracterizan por tener una región extracelular de unión a ligando, una región transmembrana
y un dominio intracelular tirosín quinasa. El dominio quinasa intracelular se encuentra muy
conservado, si bien en el caso de ErbB3 presenta sustituciones en aminoácidos clave que lo
hacen inactivo. En cambio, el dominio extracelular está menos conservado, probablemente
debido a la especificidad de unión a ligando. La activación de los receptores ErbB se produce a
través de la unión de ligandos de la familia EGF (epidermal growth factor), producidos por las
propias células que expresan los receptores EGF (secreción autocrina) o por células
circundantes (secreción paracrina) (Riese and Stern, 1998; Yarden and Sliwkowski, 2001).
Los ligandos de la familia EGF se caracterizan por presentar un dominio tipo EGF y se
pueden clasificar en tres grupos principales. El primer grupo está compuesto por aquellos que se
unen específicamente al receptor EGFR (como el EGF o el TGF-α). Un segundo grupo de
ligandos formado por aquellos que se unen tanto a EGFR como a ErbB4 (como la betacelulina,
el factor de unión a heparina, HB-EGF y la epirregulina, EPR). El tercer grupo de estos factores
Figura 13. Esquema de los diferentes ligandos de la familia EGF y los receptores de la familia ErbB a los que se unen (Massague and Pandiella, 1993; Normanno et al., 2006; Riese and Stern, 1998).
Introducción
- 40 -
se compone de las neurregulinas (NRGs) algunas de las cuales se unen tanto a ErbB3 como a
ErbB4, mientras que otras se unen sólo a ErbB4. No se conoce ningún ligando de la familia
EGF capaz de unirse a ErbB2 (Figura 13) (Massague and Pandiella, 1993; Normanno et al.,
2006; Riese and Stern, 1998; Yarden and Sliwkowski, 2001).
Estos ligandos se sintetizan como precursores transmembrana, cuyos dominios
extracelulares son procesados proteolíticamente para liberar los factores de crecimiento solubles
(Massague and Pandiella, 1993). La unión de estos ligandos a los dominios extracelulares de los
correspondientes receptores, induce la homodimerización o la heterodimerización con otros
receptores ErbB, lo que conlleva la activación de los dominios tirosín quinasa y su
autofosforilación y transfosforilación en residuos específicos de tirosina (Olayioye et al., 2000;
Schlessinger, 2000). Estos residuos de tirosina fosforilados sirven como secuencias de anclaje
de una gran variedad de moléculas adaptadoras, cuyo reclutamiento lleva a la activación de
diversas rutas de señalización intracelular (Figura 14).
EGFRErbB2ErbB4
EGFRErbB2ErbB3ErbB4
Dimerización inducida por ligandoFosforilación en Tyr
y unión de proteínas adaptadoras
Residuo de tirosina fosforilado
Shc, Crk, Grb2, Grb7, Gab1, Src, Chk, PI3K, Shp1, Shp2...
En el caso de ErbB3, que carece de actividad quinasa, sólo puede ser fosforilado y
activado cuando heterodimeriza con otro receptor de la familia ErbB. De forma similar ErbB2,
que sí presenta actividad quinasa pero no es capaz de unir ligandos, sólo resulta activado cuando
heterodimeriza con otros receptores ErbB unidos a ligando. Sin embargo, ErbB2 juega un papel
esencial en la familia dado que es el miembro preferido para la heterodimerización del resto de
Figura 14. Representación esquemática de la dimerización de receptores ErbB tras la unión a ligando y su fosforilación en residuos de tirosina de la cola C-terminal. La unión del ligando permite la auto y la transfosforilación y la consecuente unión de proteínas adaptadoras, quinasas o tirosina fosfatasas a dichos residuos.
Introducción
- 41 -
los receptores (Graus-Porta et al., 1997). Además, los heterodímeros que contienen ErbB2 son
responsables de una potente activación de las rutas de señalización intracelulares (Graus-Porta
et al., 1995). De entre todos los dímeros posibles con ErbB2, el dímero ErbB2/ErbB3 parece ser
el más potente en términos de inducción de proliferación celular y capacidad transformante,
debido a su elevada capacidad de activar las rutas de ERK1/2 y PI3K (Phosphatidylinositol 3-
kinase) (Citri et al., 2003).
Tras la dimerización, los receptores son habitualmente internalizados por endocitosis y,
o bien se unen a la ubiquitín-ligasa c-cbl que los marca para degradación, o en caso contrario
son reciclados a la membrana (Citri and Yarden, 2006; Normanno et al., 2006; Yarden and
Sliwkowski, 2001).
3.2 El receptor ErbB2 en cáncer de mama
El receptor de membrana tirosín quinasa ErbB2/Neu/HER2, se encuentra
sobreexpresado en un 20-30% de los tumores de mama, así como en otros tipos tumorales
(Slamon et al., 1987). De hecho, elevados niveles de ErbB2 predicen una baja tasa de
supervivencia en estos tumores. Por otra parte, existe una significativa y consistente correlación
inversa entre la expresión del receptor de estrógenos y los receptores ErbB1 y ErbB2 (Harari
and Yarden, 2000). Los tumores receptor de estrógenos negativos tienden a sobreexpresar
ErbB2 y ser más agresivos. Diversos estudios han demostrado la existencia de una regulación
mutua entre el receptor de estrógenos y ErbB2, de manera que cada uno de ellos reprime la
expresión del otro. Así, los estrógenos reprimen la expresión de ErbB2 y las neurregulinas la
expresión del receptor de estrógenos (Grunt et al., 1995; Mueller et al., 1995).
El mecanismo frecuentemente asociado a la tumorigenicidad de ErbB2 es la
amplificación génica, si bien se puede observar también sobreexpresión del receptor asociada a
una mayor transcripción o bien la presencia de formas mutantes o truncadas del receptor que
dan lugar a una elevada activación basal del mismo (Barros et al., 2010; Molina et al., 2002). La
sobreexpresión de ErbB2 impone en la célula tumoral un elevado grado de activación de las
rutas de señalización reguladas por este receptor (las cuales se discutirán más adelante en la
figura 15 y en la tabla 2). El resultado final es una regulación defectuosa del ciclo celular,
debido principalmente a la formación de elevados niveles de complejos activos de ciclina D-
CDK4/6. Las expresión de las ciclinas tipo D (D1, D2 y D3) es uno de los factores limitantes
para la progresión a través de la fase G1 del ciclo celular. Estas ciclinas son inducidas por
numerosos estímulos mitogénicos. Una sobreexpresión aberrante de ciclina D1 juega un papel
esencial en el desarrollo del cáncer de mama, donde un 40% de los tumores y un 70% de las
líneas tumorales de mama, sobreexpresan esta proteína (Weinstat-Saslow et al., 1995; Worsley
Introducción
- 42 -
et al., 1997). Empleando el mutante oncogénico de ErbB2 (NeuT; Val664/Glu), se ha demostrado
su elevada capacidad para incrementar la expresión de ciclina D1 (Lee et al., 2000). Esto ocurre
por un mecanismo transcripcional, a través de las rutas de Ras y Rac, activadas por ErbB2, pero
también por un mecanismo de estabilización postraduccional. ErbB2 estabiliza de forma
indirecta a la lábil ciclina D1 al regular negativamente a GSK3β (Glycogen synthase kinase 3),
responsable de promover la degradación proteolítica de la ciclina D1 (Diehl et al., 1998). Por
otro lado, otro efecto importante de la sobreexpresión de ErbB2 es el conferir una cierta
quimiorresistencia. De esta manera, este oncogén permite a la célula evadir no sólo las
restricciones habituales durante la progresión del ciclo celular sino también la apoptosis, lo cual
explica su elevada tumorigenicidad.
La expresión ectópica de ErbB2, a niveles similares a los observados en tumores de
mama, incrementa la tumorigenicidad en sistemas modelo (Di Fiore et al., 1987). Esto
probablemente sea debido a su elevada autofosforilación basal y a su mayor disponibilidad, al
ser sobreexpresado, para la formación de heterodímeros con ErbB1 y ErbB3. Además, estos
heterodímeros son capaces de evadir los mecanismos de atenuación de la señal, lo que se
traduce en una activación prolongada (Sorkin et al., 1993).
ErbB2 es capaz de evadir los procesos de inactivación de la señalización a través de
diversos mecanismos:
• Disminución de la tasa de disociación de ligandos como el EGF y neurregulinas
de sus receptores.
• Baja tasa de endocitosis de este receptor (Sorkin et al., 1993).
• Los dímeros ErbB1/ErbB2 tienen una mayor tasa de reciclaje a la membrana y
una menor tasa de degradación (Lenferink et al., 1998).
La activación del receptor ErbB2 resulta controvertida de explicar dado que, si bien no
une ligando, su sobreexpresión es capaz de promover la transformación celular en ausencia de
ligando, lo que sugiere que posee una actividad constitutiva (Di Fiore et al., 1987). Algunos
autores proponen un modelo que podría explicar estas características, basándose principalmente
en los datos de la cristalización de los receptores ErbB. ErbB2 se encontraría de forma
constitutiva en una conformación semiactiva debido principalmente a que parte de su dominio
de unión a ligando se encuentra ocupado por parte de los subdominios I y III (Garrett et al.,
2003). Este receptor presentaría así una conformación extendida aun en ausencia de ligando, lo
que le permitiría unirse a otros receptores sin necesidad de ser estimulado por la unión de un
ligando. Aunque se cree que la formación de homodímeros de ErbB2 tras la sobreexpresión del
receptor puede contribuir a la tumorigenicidad, numerosas observaciones sugieren que el
Introducción
- 43 -
principal mecanismo que contribuye al desarrollo tumoral es la heterodimerización de ErbB2 y
su cooperación con otros receptores (Holbro et al., 2003; Olayioye et al., 2000).
3.3 Señalización intracelular a través de los receptores de la familia ErbB
La unión del ligando a su correspondiente receptor ErbB1, ErbB3 o ErbB4 activa la
dimerización de los receptores y la fosforilación en residuos de tirosina de la región intracelular
de los receptores ErbB (Figura 14). Algunas tirosín quinasas de la familia Src tales como Src y
Abl son capaces también de fosforilar estos residuos de tirosina de los receptores ErbB. A
continuación, estos residuos de tirosina fosforilados actúan como sitios de unión de proteínas
adaptadoras tales como Grb2, Shc, Nck, Crk, Grb7, Gab, quinasas como Src, Chk, la subunidad
p85 de PI3K o JAK (Janus Kinase), así como fosfatasas. A partir de aquí, se produce una gran
diversificación de la señal dado que estas proteínas adaptadoras desencadenarán múltiples
cascadas de señalización (Figura 15) (Henson and Gibson, 2006; Olayioye et al., 2000). ErbB1
recluta principalmente a las proteínas adaptadoras Grb2 (Growth factor receptor-bound protein
2) y Shc, las cuales, a su vez, van a anclar a la proteína SOS (son of sevenless) que cataliza la
activación de la GTPasa Ras (Rat Sarcoma), desencadenando así la cascada de señalización de
ERK1/2. Además, ErbB1 puede reclutar también a la quinasa JAK y al factor de
jfjnejknffrgrggk
Figura 15. Representación esquemática de las diferentes rutas de señalización activadas tras la unión de los receptores ErbB a ligando. Una multitud de proteínas adaptadoras media la activación de diferentes cascadas de señalización lo que se traduce en una variada respuesta transcripcional. Casi todos los receptores ErbB y ligandos activan la vía de MAPK, en cambio aunque la ruta de PI3K-AKT es también desencadenada por la mayoría, es ErbB3 quién la activa de forma más eficiente (Citri and Yarden, 2006; Yarden and Sliwkowski, 2001).
Introducción
- 44 -
transcripción STAT (Signal Transducer and Activator of Transcription), permitiendo que JAK
fosforile a STAT y activando así esta ruta de señalización.
Por otro lado, se ha demostrado que ErbB1 puede translocarse al núcleo en células
tumorales de mama, donde se asocia al ADN y al factor STAT3 cooperando con él para
promover la supervivencia celular ante condiciones de apoptosis. En cambio, ErbB1 no puede
reclutar a PI3K pero sí activar esta ruta de forma indirecta a través de Ras (Citri and Yarden,
2006; Henson and Gibson, 2006).
ErbB3 por su parte, al heterodimerizar y ser fosforilado por su pareja, resulta muy
eficiente reclutando a PI3K, quien a su vez activa a AKT, desencadenando esta cascada de
señalización responsable de mediar la supervivencia celular. Además, también puede reclutar a
Shc.
A su vez, ErbB4 es capaz de reclutar tras su activación a Grb2, Shc y JAK/STAT. Tan
solo una isoforma de ErbB4 es capaz de activar a PI3K.
En cuanto a ErbB2 (tal y como hemos mencionado antes) no une ligando pero
heterodimeriza con otros receptores unidos a ligando, contribuyendo, así, a la activación de
todas las rutas de señalización moduladas por estos (Citri and Yarden, 2006). A modo de
resumen, en la Tabla 2, se indican algunas de las cascadas de señalización más importantes
desencadenadas tras la fosforilación de los receptores ErbB y las respuestas celulares que
controlan en su conjunto.
4. Las vías de señalización de MAPKs Las proteínas quinasas activadas por mitógenos (MAPKs), son enzimas de transducción
de señales cuya función se ha conservado a lo largo de la evolución desde las levaduras a
humanos. Las MAPKs representan una familia de serina/treonina quinasas encargadas de
transmitir señales generadas en la superficie de la membrana, a través de cascadas de
fosforilaciones. En mamíferos, existen al menos 4 grupos de MAPKs: ERK 1/2, JNK1/2/3, p38
Tabla 2. Principales rutas de señalización activadas por los receptores ErbB y procesos celulares que controlan. La activación preferente de unas u otras rutas de señalización va a depender del tipo de dímeros de receptores ErbB que se formen y va a determinar el efecto celular final.
ProliferaciónApoptosis/Supervivencia
MigraciónAdhesiónDiferenciación
ERK JNKPI3KJAK-STATPLCγPKC
Procesos celulares que controlan
Principales rutas de señalización activadas por
receptores ErbB
ProliferaciónApoptosis/Supervivencia
MigraciónAdhesiónDiferenciación
ERK JNKPI3KJAK-STATPLCγPKC
Procesos celulares que controlan
Principales rutas de señalización activadas por
receptores ErbB
Introducción
- 45 -
α/β/γ y ERK5 (Figura 16) (Chang and Karin, 2001; Johnson and Lapadat, 2002; Karin and
Hunter, 1995; Raman et al., 2007).
Las MAPKs forman parte de un módulo secuencial de transducción de señales
compuesto por 3 quinasas: una MAPKKK activa por fosforilación a una MAPKK quien, a su
vez, cataliza la doble fosforilación de una MAPK en una secuencia (Thr-Xaa-Tyr) de su bucle
de activación. Posteriormente, las MAPKs van a fosforilar a sus sustratos en secuencias
específicas compuestas por una serina o treonina seguida de una prolina (Chang and Karin,
2001).
La ruta de señalización de ERK1/2 se activa en respuesta a factores de crecimiento,
ligandos de unión a receptores acoplados a proteínas G (GPCR), ésteres de forbol, citoquinas o
despolimerización de microtúbulos. Los estímulos de estrés, tales como daño al ADN,
radiación ionizante, estrés oxidativo, hipoxia o choque térmico así como citoquinas
proinflamatorias o factores de crecimiento, activan la ruta de JNK1/2/3 (Figura 16).
Figura 16. Organización modular de las vías de señalización de MAPKs. Estos módulos de señalización aparentemente simples y bien jerarquizados son capaces de provocar una innumerable variedad de respuestas celulares tanto durante el desarrollo embrionario como en el organismo adulto. Las MAPKs interpretan las señales del microambiente extracelular y responden de forma precisa a cada estímulo, para lo cual es imprescindible una fina regulación de estas cascadas (Johnson and Lapadat, 2002; Nishimoto and Nishida, 2006; Raman et al., 2007; Turjanski et al., 2007).
Introducción
- 46 -
A su vez, la señalización a través de p38 α/β/γ se activa en respuesta a señales de estrés
tales como choque osmótico, hipoxia o irradiación y menos frecuentemente por factores de
crecimiento. Finalmente, la señalización a través de ERK5 se activa en respuesta a estrés
oxidativo, osmótico y factores de crecimiento. Esta última vía de señalización, de reciente
descubrimiento, comparte numerosas similitudes con la ruta de ERK1/2, como su papel
determinante en la regulación de la proliferación y diferenciación celular. Sin embargo, mientras
que ERK1/2 desempeña un papel fundamental en el desarrollo del mesodermo, la ruta de ERK5
es esencial durante el desarrollo embrionario del sistema cardiovascular y la diferenciación
neural (Nishimoto and Nishida, 2006; Raman et al., 2007; Turjanski et al., 2007).
4.1 La ruta de señalización de ERK1/2
ERK1 y ERK2 (extracellular signal-regulated kinases) fueron identificadas
inicialmente como serín/treonín quinasas capaces de fosforilar a MAP-2 (proteína asociada a los
microtúbulos), en respuesta a la activación por insulina (Boulton and Cobb, 1991; Ray and
Sturgill, 1987). A estas quinasas se las conoce como p44 y p42 y son activadas por un gran
repertorio de factores de crecimiento, citoquinas, suero, GPCRs y algunos tipos de estrés
(Cooper et al., 1984). Así, por ejemplo, la unión del factor de crecimiento epidérmico (EGF) al
receptor EGFR1 desencadena la dimerización y activación de este. A continuación, proteínas
con dominios SH2 (Src homology 2) o dominios PTB (phosphotyrosine binding), tales como
Grb2 o Shc, se unen a los motivos fosforilados en tirosina de los receptores y son capaces de
reclutar a SOS (son-of-sevenless), que es una proteína GEF (factor de intercambio de
nucleótidos de guanina). Diferentes proteínas GEF, como SOS, son capaces de inducir una
rápida disociación del nucleótido GDP de las proteínas G pequeñas (como Ras), permitiendo
que estas unan GTP y se activen. La inactivación de Ras se produce a través de proteínas Ras-
GAP que aceleran la hidrólisis del GTP (Citri and Yarden, 2006; Olayioye et al., 2000).
La ruta de señalización de Ras (mejor caracterizada) ocurre a nivel de la membrana
plasmática y está mediada por SOS. SOS es reclutado a la membrana a través de su interacción
con Grb2, que de esta manera lo pone en contacto con Ras (Figura 17). La localización de los
diferentes miembros de la familia Ras anclados a membranas va a depender de modificaciones
postraduccionales en su región carboxilo-terminal hipervariable (HVR). Aunque todas las
proteínas Ras sufren farnesilación y carboxi-metilación, que hace que se localicen en el retículo
endoplasmático, sus regiones HVRs poseen diferentes motivos que pueden mediar su
localización subcelular final (McKay and Morrison, 2007).
Durante muchos años, se creyó que la activación de Ras ocurría exclusivamente a nivel
de la membrana plasmática. Sin embargo, hoy en día se sabe que las proteínas Ras activadas se
sitúan también a nivel de varios orgánulos intracelulares tales como el aparato de Golgi, retículo
Introducción
- 47 -
endoplasmático o endosomas (Figura 17) (Burke et al., 2001; Chiu et al., 2002; Inder et al.,
2008; Jiang and Sorkin, 2002; McKay and Morrison, 2007);(Bivona and Philips, 2003; Caloca
et al., 2003). Los miembros de la familia Ras (K-Ras, H-Ras, N-ras), una vez activados, van a
interaccionar con la familia de proteínas Raf (A-Raf, B-Raf, C-Raf) (Figura 17).
RAS
RAS
Raf
MEK
ERK
Paxi
llina
La activación de Raf es un proceso complejo. Todas las proteínas Raf se encuentran
inactivas en el citosol, con su extremo amino terminal actuando como inhibidor de la región
carboxilo terminal. Dímeros de las proteínas 14-3-3 se unen a sitios de fosforilación tanto de la
región amino como carboxilo terminal. La activación de Ras induce la desfosforilación del
residuo S259 de Raf, por las fosfatasas PP1 y PP2A. Esto desplaza a las proteínas 14-3-3 y
permite el reclutamiento de Raf a la membrana, donde interacciona con Ras-GTP. La liberación
de las proteínas 14-3-3 de la región amino-terminal permite, además, la fosforilación del
dominio quinasa carboxilo terminal (por quinasas como CK2 y c-Src) y la consecuente
activación de Raf (Ory et al., 2003; Ramos, 2008; Wellbrock et al., 2004). La proteína scaffold
KSR1 facilitaría este proceso actuando como plataforma de ensamblaje de los complejos Raf-
Figura 17. Señalización de ERK1/2 desde diferentes orgánulos subcelulares. La activación de Ras se puede producir a nivel de diferentes orgánulos subcelulares. Hasta el momento, se han descrito algunas proteínas scaffold tales como KSR1, MP1 o Paxillina que se cree que serían las responsables de la activación de la ruta de ERK1/2 en diferentes orgánulos. Igualmente, diferentes proteínas GEFs serían responsables de la activación de Ras en diferentes localizaciones subcelulares (Chiu et al., 2002; Luttrell et al., 2001; Torii et al., 2004; Kolch, 2005; McKay and Morrison, 2007; Bivona and Philips, 2003; Caloca et al., 2003)
Introducción
- 48 -
MEK-ERK. De forma similar a lo descrito para Raf, la desfosforilación del residuo serina 392
de KSR1 por la fosfatasa PP2A es crítica para su reclutamiento a la membrana tras la
estimulación (Abraham et al., 2000; Ory et al., 2003). Este modelo se complica, aún más, si
tenemos en cuenta que numerosos autores describen como la homodimerización y
heterodimerización de las diferentes proteínas Raf juega un papel muy relevante en el proceso
de señalización a través de esta ruta, regulando el nivel de activación de la cascada en función
del tipo de dímeros que se forman (Farrar et al., 1996; Karreth et al., 2009; Weber et al., 2001).
Además, la formación de heterodímeros KSR1/Raf también parece desempeñar un papel en la
activación de Raf (Rajakulendran et al., 2009).
Una vez activados los miembros de la familia Raf van a activar a MEK 1/2, que a su
vez van a activar a ERK1/2. Todo parece indicar que el principal activador de MEK1/2 a nivel
celular es B-Raf, mientras que A-Raf y C-Raf participarían más bien en una modulación más
específica de la ruta de ERK1/2 (Wellbrock et al., 2004). Tanto MEK1/2 como ERK1/2 se
activan totalmente a través de la fosforilación de sus segmentos de activación, localizados en
sus dominios quinasa (Ser217 y Ser221 en el caso de MEK1 y Thr202 y Tyr204 en el caso de
ERK1) (Alessi et al., 1994; Payne et al., 1991; Turjanski et al., 2007; Wellbrock et al., 2004).
Tras su activación, ERK1/2 son capaces de fosforilar a una gran variedad de sustratos tanto
citosólicos como nucleares.
4.1.1 Las proteínas quinasas MEK1/2
Existen varias isoformas de la proteína quinasa MEK: una isoforma de 45 kDa MEK1,
una variante de procesamiento alternativo de 43 kDa denominada MEK1b y finalmente una
isoforma de 46 kDa MEK2 (Shaul and Seger, 2007). Tal y como se ha mencionado, MEK1/2 se
activan por fosforilación en 2 residuos de serina (Ser217 y Ser221) de su loop T (Figura 18)
(Alessi et al., 1994). La desfosforilación de estos residuos por la fosfatasa PP2A es el principal
mecanismo de inactivación de MEK1/2, si bien no se puede descartar el papel de otras
fosfatasas. Tras su activación, MEK1/2 van a fosforilar a sus únicos sustratos ERK1/2 de forma
altamente específica. Por otro lado, el nivel de activación de MEK1/2 es regulado por su
sustrato ERK1/2 que fosforila a MEK1/2 en varios residuos (incluyendo el residuo Thr292),
estableciendo así un mecanismo de retroalimentación negativa (Shaul and Seger, 2007).
La figura 18 refleja los principales dominios de la proteína MEK1 que incluyen un sitio
de unión a ERK (dominio D), una región de regulación negativa, una secuencia de exportación
nuclear y un dominio quinasa que incluye el loop T de activación y una región rica en prolina.
El papel de la región de regulación negativa (residuos 32-51) ha sido estudiado a través
de numerosos experimentos mutacionales. Deleciones en esta región (mutantes Δ44-51, Δ32-51,
Introducción
- 49 -
Δ47-49) se traducen en una activación constitutiva de la proteína (Fischmann et al., 2009;
Mansour et al., 1994). A su vez, la región rica en prolina es necesaria para la señalización de
MEK1.
Las proteínas MEK1/2 se localizan en el citosol de células no estimuladas, debido a su
señal amino terminal de exportación nuclear pero también por su unión a diferentes proteínas
scaffold tales como KSR1, Sef, Paxillina y otras. Además, se sabe que se distribuyen también en
las membranas mitocondriales aunque no está totalmente claro su papel en esta localización
(Poderoso et al., 2008). Hoy en día, se sabe que tras la estimulación, una parte importante del
reservorio citosólico de MEK1/2 sufre una rápida traslocación al núcleo y de nuevo al citosol
(Jaaro et al., 1997). Se cree que uno de los papeles desempeñados por MEK1/2 en el núcleo es
la exportación de proteínas nucleares que carecen de secuencia de exportación nuclear, tales
como ERK1/2 (Zehorai et al., 2010).
4.1.2 Las proteínas quinasas ERK1/2
Las proteínas ERK1 y ERK2 son codificadas por 2 genes altamente conservados a lo
largo de la evolución. Han sido descritas, además, diversas variantes generadas por
procesamientos alternativos. Tal y como se ha mencionado, las proteínas ERK1/2 se activan por
doble fosforilación en dos residuos de treonina y tirosina de su segmento de activación (Ramos,
2008). Esta doble fosforilación parece ser mediada exclusivamente por MEK1/2.
Las quinasas ERK1/2 se componen de un dominio amino terminal, un dominio
carboxilo terminal y un sitio catalítico situado entre ambos dominios (Turjanski et al., 2007).
Dentro de la región carboxilo terminal de ERK1/2 se encuentra un motivo denominado CD
Figura 18. Estructura de la proteína MEK1. Principales dominios de la proteína MEK1. Numerosos estudios enzimáticos y experimentos mutacionales han permitido localizar las principales regiones catalíticas y regulatorias de esta proteína, así como de las construcciones mutantes de MEK1 con actividad constitutiva (Alessi et al., 1994).
Sitio de unión de ERK
Señal de Exportación
nuclearReg Neg
Dominio quinasa
1 11 32 43 55 262 307 369 392
Región de regulación negativa
Loop T de activación (ser217, Ser221)
Región rica en prolina
ERK
Ser217 Ser221
Sitio de unión de ERK(Dominio D)
Señal de exportación nuclearRaf
Sitio de unión de ERK
Señal de Exportación
nuclearReg Neg
Dominio quinasa
1 11 32 43 55 262 307 369 392
Región de regulación negativa
Loop T de activación (ser217, Ser221)
Región rica en prolina
ERK
Ser217 Ser221
Sitio de unión de ERK(Dominio D)
Señal de exportación nuclearRaf
Introducción
- 50 -
(Common Docking) responsable de la interacción tanto con MEK1/2 como con otras proteínas,
ya sean sustratos o proteínas activadoras o inactivadoras (Tanoue et al., 2000).
Una vez activadas, las quinasas ERK1/2 fosforilan a sus sustratos en la secuencia
consenso Pro-Xaa-Ser/Thr-Pro. Entre los sustratos de ERK1/2 se cuentan numerosos factores de
transcripción como c-Myc, c-Jun, c-Fos, Elk-1, p53, Ets1, STAT o SMAD, los cuales
desempeñan papeles cruciales en la regulación de la proliferación y los procesos tumorales
(Chambard et al., 2007; Ramos, 2008; Turjanski et al., 2007). Otro sustrato relevante es la
quinasa p90RSK (p90 ribosomal S6 kinase), que va a fosforilar a sustratos nucleares y
citosólicos regulando la transcripción, traducción, migración, apoptósis y progresión del ciclo
celular (Anjum and Blenis, 2008). La figura 19 muestra los principales tipos de sustratos de
ERK1/2, entre los que se encuentran también proteínas del citoesqueleto o proteínas de
membrana (Klemke et al., 1997).
La inactivación de ERK1/2 ocurre debido a la eliminación de los grupos fosfato de uno
o ambos residuos de treonina o tirosina de su motivo de activación. Este proceso puede ser
llevado a cabo por serina/treonina fosfatasas (PPs), por tirosina fosfatasas (PTP-SL) o por
fosfatasas de especificidad dual (DUSPs).
Figura 19. Sustratos de fosforilación de ERK1/2. Se han descrito más de 100 sustratos de ERK1/2 que participan en múltiples funciones. A nivel del núcleo, ERK1/2 fosforila a factores de transcripción y quinasas nucleares. En el citosol, sus sustratos son quinasas citosólicas y proteínas estructurales. Además, en la membrana plasmática fosforila a proteínas encargadas de regular la adhesión celular, la comunicación celular y la supervivencia. Esto sugiere que la respuesta final a la activación de ERK1/2 va a depender de en que región intracelular sea activada ERK1/2 y los sustratos disponibles en esa localización (Ramos, 2008).
Introducción
- 51 -
Por otro lado, una vez activadas, las proteínas ERK1/2 participan en circuitos de
autorregulación negativa a través de la fosforilación de SOS, Raf y MEK1/2. Además, van a
activar e inducir la expresión de varias fosfatasas (Ramos, 2008).
4.1.3 Regulación temporal de la ruta de ERK1/2
La activación de la señalización de ERK1/2 puede mediar procesos celulares opuestos,
tales como, proliferación, diferenciación, migración o senescencia. Esto es debido a una estricta
regulación espacial y temporal de la activación de la señalización de ERK1/2.
Así, la duración e intensidad de la señal van a determinar la respuesta fisiológica final.
Estudios en la línea celular PC12 (derivada de un feocromocitoma de médula suprarrenal de
rata) han demostrado que la estimulación con EGF causa una activación fuerte pero transitoria
de la ruta de ERK1/2, que finalmente promueve la proliferación. En cambio, la estimulación con
NGF (factor de crecimiento neuronal) es responsable de una activación fuerte pero sostenida,
que lleva a la diferenciación neuronal (Dikic et al., 1994; Murphy and Blenis, 2006).
4.1.4 Regulación de la señalización de ERK1/2 a través de diferentes proteínas scaffolds
La localización subcelular de ERK1/2 es un componente clave a la hora de regular su
actividad. Las quinasas ERK1/2 se distribuyen de forma, más o menos, ubicua en la célula. Se
localizan libres por el núcleo o citosol, pero también se asocian a la membrana plasmática y
lisosomas o bien a orgánulos tales como retículo endoplasmático, aparato de Golgi o
mitocondrias (Arozarena et al., 2004; Casar et al., 2009; Chiu et al., 2002; Feng et al., 2007;
Inder et al., 2008; Poderoso et al., 2008). Aproximadamente, un 50% de ERK1/2 se asocian en
el citosol a los microtúbulos, en menor proporción se asocian también a los contactos focales y
en general tras la estimulación con determinados ligandos se traslocan al núcleo (Raman et al.,
2007). Chiu y colaboradores demuestran como H-Ras se puede activar, in situ, de forma
eficiente a nivel del retículo endoplasmático, sin necesidad de endocitosis de los receptores. H-
Ras activado en este orgánulo es competente para activar a Raf y ERK1/2 en respuesta a la
estimulación con EGF y otros estímulos (Chiu et al., 2002). La figura 19 muestra un resumen de
los diferentes tipos de sustratos de fosforilación de ERK1/2 presentes en diferentes
localizaciones subcelulares. Parece probable que la respuesta final a la activación de ERK1/2
vaya a depender de la región intracelular en que sean activadas ERK1/2 y de los sustratos que
allí se localicen (Ramos, 2008).
Numerosos trabajos proponen que diferentes proteínas de ensamblaje o scaffolds son
responsables de la activación de las quinasas ERK1/2 en diferentes localizaciones subcelulares
(Figura 17). Estas scaffolds, cuando se expresan a niveles adecuados, ensamblan los complejos
Introducción
- 52 -
de señalización de ERK1/2 actuando como plataformas que ponen en contacto a los diferentes
componentes, incrementando, así, la señalización a través de esa ruta. La estequiometría de
estas scaffolds (respecto a las diferentes proteínas que ensamblan) es muy importante, dado que
cuando se expresan en exceso pueden inhibir la señalización al separar a los componentes de la
ruta formando complejos inactivos (Kolch, 2005; Kortum and Lewis, 2004).
Se ha propuesto que la proteína KSR1 (Kinase Ras supressor) es la scaffold responsable
de favorecer la activación de ERK1/2 a nivel de la membrana plasmática. KSR1 es una proteína
citosólica, que interacciona de forma constitutiva con MEK1 y de forma dependiente de
estímulo con Raf y ERK1/2, así como con numerosas proteínas más. El hecho de que
fibroblastos embrionarios de ratones KSR1-/- presenten una menor activación de la ruta de
ERK1/2, tras la estimulación con suero o EGF, corrobora la implicación de esta scaffold en la
ruta de ERK1/2 (Kortum and Lewis, 2004; Lozano et al., 2003; Nguyen et al., 2002).
La proteína CNK (Connector enhancer of KSR) es capaz de interaccionar con Raf en
mamíferos. Así, promueve la activación de Raf por Ras y Src (Therrien et al., 1998; Ziogas et
al., 2005). En cambio, CNK no interacciona con otras proteínas de la ruta de ERK1/2 por lo que
su posible papel como scaffold de la ruta de ERK1/2 es controvertido (Kolch, 2005).
Otra posible proteína scaffold de la ruta de ERK1/2 es MP1 (MEK partner 1). MP1
forma heterodímeros con la proteína p14 que la ancla a endosomas tardíos. MP1 se une de
forma específica a MEK1 y ERK1, pero no MEK2. De esta manera, promueve la activación de
ERK1 a nivel endosomal. Esto sugiere que a la activación inicial de ERK1 a nivel de la
membrana plasmática le sigue una activación posterior a nivel endosomal. Por este proceso,
MP1 incrementa la señalización nuclear de ERK1 (Schaeffer et al., 1998; Teis et al., 2002).
Además, MP1 regula la activación de MEK1 por la quinasa PAK1 (p21-activating kinase)
durante los procesos de migración y adhesión celular (Pullikuth et al., 2005).
La proteína IQGAP interacciona con numerosas proteínas y contribuye a regular la
polimerización de la actina, la migración y la adhesión. IQGAP interacciona con Ras, B-Raf,
MEK1/2 y ERK1/2 y tanto su silenciamiento como su sobreexpresión disminuyen la activación
de ERK1/2 por EGF o IGF-1 (insulin-like-growth factor-1). Se ha demostrado que IQGAP es
necesaria para la activación de B-Raf por EGF. También, se ha descrito que puede formar un
complejo con ERK2 y Cdc42 que promueve la migración celular. Por lo tanto, IQGAP podría
ser otra de las scaffolds encargadas de regular la activación de la ruta de ERK1/2, durante los
procesos relacionados con el citoesqueleto de actina y la migración y adhesión celular
(Bourguignon et al., 2005; Briggs and Sacks, 2003; Nojima et al., 2008; Ren et al., 2007).
Otras proteínas scaffolds de la ruta de ERK1/2 serían las β-arrestinas 1 y 2 (Figura 17).
Estas proteínas se identificaron inicialmente como proteínas capaces de inactivar la señalización
Introducción
- 53 -
de los receptores acoplados a proteínas G (GPCR), al promover su internalización.
Posteriormente, se demostró que actuaban también como plataformas de ensamblaje de la ruta
de ERK1/2 a nivel de lisosomas. Interaccionan con C-Raf1, MEK1 y ERK2, facilitando la
activación de ERK1/2 por Raf a nivel lisosomal. La unión de los ligandos a los receptores
GPCR causa la disociación de las proteínas G en subunidades. Esto recluta a las quinasas
GRK2 (G protein-coupled receptor kinase 2) que fosforilan a los receptores GPCR aumentando
su afinidad por las β-arrestinas. Los diferentes componentes de la ruta de ERK1/2 se
ensamblarían sobre las β-arrestinas, activándose la señalización de ERK1/2. La endocitosis de
los complejos de receptor/β-arrestinas/Raf/MEK/ERK, en vesículas recubiertas de clatrina,
conduciría a la localización de estos complejos activos de señalización en endosomas (Luttrell
et al., 2001). Resulta importante destacar que estas scaffolds incrementan la señalización
citosólica de ERK1/2, a expensas de la señalización nuclear (Tohgo et al., 2002).
Por otro lado, la proteína Paxillina parece actuar también como scaffold de esta ruta, a
nivel de los contactos focales. Paxillina regula la migración celular, actuando como proteína de
ensamblaje de los complejos proteicos presentes en los contactos focales. Se asocia de forma
constitutiva a MEK y en respuesta al factor de crecimiento de los hepatocitos (HGF) se une
también a Raf y ERK. A través de la activación de ERK, se recluta a la quinasa FAK, lo que
permite la activación de la ruta de Rac y la migración celular (Ishibe et al., 2004; Kolch, 2005).
4.1.5 Regulación espacial de la ruta de señalización de ERK1/2
Tal y como ya se ha mencionado, la localización subcelular de ERK1/2 es determinante
a la hora de controlar su actividad, sus sustratos y la respuesta celular final. Así, la retención de
ERK2 activo a nivel del citosol impide promover la extensión neuronal en células PC12. De
forma similar, cuando ERK1/2 se localiza de forma artificial en el citosol es incapaz de activar
al promotor de c-fos y de promover la progresión del ciclo celular a fase S, en respuesta a
estimulación mitogénica (Brunet et al., 1999; Ramos, 2008).
Una de las proteínas, que si bien no está claro si puede ser considerada como una
scaffold pero, que si que parece regular la activación de ERK1/2 a nivel del citosol es PEA-15.
La proteína PEA-15, al ser sobreexpresada, inhibe la transcripción dependiente de ERK1/2. Esto
es debido a que impide la traslocación nuclear de ERK1/2. En cambio, PEA-15 facilita la
activación de sustratos citosólicos como p90RSK2 (Formstecher et al., 2001; Vaidyanathan et
al., 2007; Vaidyanathan and Ramos, 2003).
Otro regulador espacial de la ruta de ERK1/2 es la proteína transmembrana Sef, que se
localiza en el aparato de Golgi. Sef es capaz de interaccionar con MEK1/2 e impedir la
disociación de MEK1/2 y ERK1/2. De esta manera, Sef impide la traslocación al núcleo de
Introducción
- 54 -
ERK1/2 y redirige y facilita la activación de las dianas citosólicas de ERK1/2, a nivel de este
compartimento celular (Figura 20) (Torii et al., 2004).
La complejidad de los mecanismos de acción de estos moduladores se ve reflejada en la
capacidad adicional de Sef para inhibir la señalización de FGF, al interaccionar e impedir la
activación del receptor de FGF, mientras que por el contrario es capaz de activar la señalización
de EGF, al disminuir el tráfico y degradación de EGFR (Kovalenko et al., 2003; Ren et al.,
2008).
4.1.6 Inhibidores de la ruta de señalización de ERK1/2
Finalmente, de entre los diferentes tipos de proteínas capaces de regular la ruta de
señalización de ERK1/2, hay que incluir otra categoría compuesta por las proteínas inhibidoras
no fosfatasas. Mencionaremos, dentro de este apartado, algunas proteínas cuyo papel como
inhibidores de la ruta de ERK1/2 es de muy reciente descubrimiento. Algunas de estas proteínas
inhibidoras serían RKIP, Sprouty, Spred, NF2, Anexina6, WNK2, VRK3, RKTG y NM23-H1,
entre otras. Se describirán brevemente estos casos, con la intención de profundizar en los
diferentes tipos de mecanismos por los cuales se puede regular negativamente la ruta de
señalización de ERK1/2. Las figuras 21 y 22 ilustran estos casos.
RKIP (Raf kinase inhibitory proteín) actúa como un regulador negativo de la ruta de
señalización de ERK1/2 al ser capaz de unirse tanto a Raf como a MEK1/2 y de esta manera
inhibir su interacción. Tras la estimulación mitogénica, RKIP se disocia de Raf permitiendo, así,
Figura 20. Control espacial de la señalización de ERK1/2. Sef inhibe la disociación de los complejos de MEK1/2/ERK1/2, reteniendo a ERK1/2 activo en las proximidades del aparato de Golgi. Esto permite que Sef inhiba la señalización nuclear de ERK1/2 (sustratos nucleares de ERK1/2 como Elk-1 no se fosforilarían). En cambio, se favorece la activación de las dianas citosólicas como p90RSK2.
Introducción
- 55 -
la activación de MEK1/2 (Figura 22) (Yeung et al., 1999). Cabe destacar que, la expresión de
RKIP se encuentra disminuida en determinados cánceres metastásicos. Dado el papel de esta
proteína en migración celular, se cree que puede actuar como un supresor de metástasis (Fu et
al., 2003).
La proteína Sprouty fue, inicialmente, identificada como un inhibidor de la señalización
por FGF en Drosophila. El mecanismo de acción por el que las diferentes proteínas Sprouty
inhiben la señalización de ERK1/2 resulta controvertido, reflejando la complejidad de los
mecanismos de modulación de estas rutas. Así, en el caso de Sprouty4 se ha descrito que inhibe
la señalización de ERK1/2 independiente de Ras. Es decir, inhibe la activación de Raf-1 por
VEGF pero no por EGF. El mecanismo de acción sería dependiente de la interacción con Raf-1
(Sasaki et al., 2003).
Los mecanismos de acción de otras proteínas de la familia, como Sprouty1 y Sprouty2,
resultan controvertidos (Figura 21). Gross y colaboradores proponen que estas proteínas
impiden la activación de Ras, sin afectar a la formación de un complejo Grb2-SOS. Tal vez,
bloqueando la activación de SOS o estimulando la desactivación de Ras a través de una proteína
GAP. De esta manera, afectan a la señalización de ERK1/2 pero no a la señalización a través de
la ruta de PI3K-AKT (Gross et al., 2001). En cambio, otros autores como Torii describen como
tras la estimulación con FGF, Sprouty1 y Sprouty2 se incorporan a la membrana, son
fosforilados e impiden el reclutamiento del complejo Grb2-SOS a los receptores (Figura 21). De
esta manera, actuarían como un mecanismo rápido de retroalimentación negativa de la ruta y
jjgrg
Figura 21. Diferentes mecanismos de acción de Sprouty como inhibidor de la señalización de ERK1/2 propuestos por diferentes autores. A) Gross y colaboradores proponen que Sprouty1/2 actuarían impidiendo la activación de Ras (Gross et al., 2001). B) Otros autores como Torii proponen que Sprouty1/2 actuarían por encima de Ras a través de la unión a Grb2 (Hanafusa et al., 2002; McKay et al., 2009).
Introducción
- 56 -
controlarían la duración de la activación de la ruta de ERK1/2 (Hanafusa et al., 2002). La
expresión de estas proteínas aparece frecuentemente disminuida en múltiples tipos tumorales
(Lo et al., 2006).
La familia de proteínas Spred (proteínas relacionadas con Sprouty que presentan
dominios EVH1) son capaces, también, de inhibir la señalización de ERK1/2. Lo harían
interaccionando constitutivamente con Ras e impidiendo la fosforilación de Raf por Ras
(Figura 22) (Wakioka et al., 2001).
La proteína NF2 (neurofibromatosis2 o Merlin) es un conocido supresor tumoral, cuya
alteración es la causa de la neurofibromatosis (propensión al desarrollo de tumores del sistema
nervioso central). NF2 inhibe la activación de la ruta de ERK1/2 y la activación transcripcional
del Elemento de Respuesta a Suero (Lim et al., 2003). El mecanismo exacto por el cual NF2
inhibe la ruta de ERK1/2 se desconoce. Sin embargo, se ha descrito como tras la estimulación
con PDGF (Platelet Derived Growth Factor), NF2 inhibe la fosforilación de ERK1/2 y AKT.
Esto es debido a que acelera la tasa de internalización y degradación del receptor de PDGF
(Figura 22) (Fraenzer et al., 2003). La complejidad de los mecanismos por los que esta proteína
inhibe estas rutas de señalización se pone de nuevo de manifiesto a través de un reciente
descubrimiento, por el cual Merlin actúa como supresor tumoral, no solo a nivel de la
membrana plasmática, sino también al traslocarse al núcleo y unirse a la E3 ubiquitín-ligasa
CRL4DCAF1 (Li and Giancotti, 2010).
Otra proteína, recientemente descrita como inhibidor de la señalización de ERK1/2, es
la Anexina 6. Anexina 6 inhibiría la señalización de Ras, al favorecer la unión de p120GAP a
Ras (Figura 22). P120GAP promueve el que Ras hidrolice GTP a GDP inactivándose.
Consecuentemente, la expresión de anexina 6 se encuentra disminuida en tumores de mama que
sobreexpresan EGFR y son receptor de estrógeno negativos (Vila de Muga et al., 2009).
La quinasa WNK2 (with no K=lysine) es también capaz de modular negativamente la
ruta de señalización de ERK1/2, en respuesta a suero o a la estimulación con EGF. Esta quinasa
inhibe la activación de ERK1/2 actuando por debajo de Raf, disminuyendo la fosforilación de
MEK1, a través de un mecanismo dependiente de su actividad quinasa que no ha sido
totalmente caracterizado (Figura 22) (Moniz et al., 2007).
Un ejemplo de inhibición espacial de la ruta de ERK1/2 sería el de la proteína, con siete
dominios transmembrana, RKTG (Raf kinase trapping to Golgi). RKTG se une a Raf y cambia
su localización al aparato de Golgi, secuestrándola en este orgánulo. Así, inhibe la activación de
MEK por Raf y la respuesta a EGF (Figura 22) (Feng et al., 2007).
Introducción
- 57 -
Tal y como ya se mencionó en el apartado 2.5 (página 37), VRK3 es capaz de regular
negativamente la ruta de ERK1/2 a través de la interacción y activación de la fosfatasa VHR
(Figuras 12 y 22) (Kang and Kim, 2006, 2008).
Finalmente, y como último ejemplo, la proteína NM23-H1 inhibe también la ruta de
ERK1/2 y parece actuar a nivel celular como un supresor de metástasis en cáncer de mama
(Hartsough et al., 2002; Hsu et al., 1995; Otsuki et al., 2001). NM23-H1 podría llevar a cabo
este efecto a través de diferentes mecanismos. Uno de estos mecanismos implica la interacción
de NM23-H1 con KSR1. NM23H1 fosforila a KSR1 y altera sus propiedades como scaffold,
disminuyendo así la señalización a través de la ruta de ERK1/2. Esto es debido a que favorece la
unión de Hsp90 a KSR1, por un mecanismo no relacionado con la fosforilación de KSR1, lo
cual induciría una mayor degradación de KSR1 (Figura 22) (Salerno et al., 2005).
Figura 22. Diferentes proteínas regulan negativamente la señalización de ERK1/2 a través de diferentes mecanismos de acción. Los mecanismos de modulación y retroalimentación negativa de la ruta de ERK1/2 son muy complejos. Numerosas proteínas están implicadas en la inhibición de esta ruta, a diferentes niveles y en contextos muy específicos. Una modulación tan precisa de la ruta de ERK1/2 permite mediar diferentes procesos biológicos en función del contexto celular (Feng et al., 2007; Fraenzer et al., 2003; Fu et al., 2003; Gross et al., 2001; Hartsough et al., 2002; Hsu et al., 1995; Kang and Kim, 2006; Li and Giancotti, 2010; Lim et al., 2006; Lim et al., 2003; Moniz et al., 2007; Otsuki et al., 2001; Salerno et al., 2005; Sasaki et al., 2003; Torii et al., 2004; Vila de Muga et al., 2009; Wakioka et al., 2001).
Introducción
- 58 -
4.1.7. Regulación de la ruta de ERK1/2 por mecanismos de retroalimentación negativa y
positiva
Las quinasas ERK1/2 son capaces de establecer mecanismos de retroalimentación
positiva y negativa, bien de forma directa o bien a través de sus sustratos (Ramos, 2008). Por
ejemplo, MEK1/2 puede ser inhibido al ser fosforilado por ERK1/2, en los residuos treonina
292 y treonina 212 (Eblen et al., 2004). ERK1/2 es capaz, como ya se mencionó, de establecer
circuitos de retroalimentación negativa a través de la hiperfosforilación de Raf (posteriormente
la desfosforilación por la fosfatasa PP2A permitirá su activación en respuesta a estímulo) y de
SOS, que inhibe su interacción con Grb2 (Ramos, 2008). Un mecanismo muy importante de
retroalimentación negativa de la ruta de ERK1/2 ocurre a través de la activación e inducción de
la expresión de las fosfatas de ERK1/2 (Figura 23).
Al contrario, existen mecanismos de retroalimentación positiva de esta ruta. Por
ejemplo, la fosforilación por ERK1/2 de la fosfatasa citosólica MKP3 (DUSP6), en los residuos
serina 159 y 197, promueve la degradación de MKP3 a nivel del proteasoma. De esta manera,
ERK1/2 es capaz de inducir la degradación de algunos de sus reguladores negativos como
MKP3 (Marchetti et al., 2005).
4.1.8 Regulación de ERK1/2 a través de fosfatasas de especificidad dual
Las MAPKs, como ERK1/2, son activadas por fosforilación dual en dos residuos
conservados de treonina y tirosina de su loop de activación. De forma similar, su inactivación se
puede producir a través de la desfosforilación de uno de estos residuos por serina/treonina
fosfatasas o por tirosina fosfatasas. Pero también y de forma más frecuente, a través de la
desfosforilación simultánea de ambos residuos de treonina y tirosina por fosfatasas de
especificad dual (DUSPs) (Figura 24). Dentro de la familia de fosfatasas de especificad dual
destacan el subgrupo conocido como MAPK fosfatasas (MKPs) (Figura 24) (Keyse, 2008).
P PT-X-YMAPK T-X-Y
Activa Inactiva
Fosfatasas
Serín-treonín fosfatasas
Tirosín fosfatasas
DUSP (fosfatasas de especif idad dual)
Figura 23. Mecanismos de activación y desactivación de MAPKs. Se representan los principales tipos de fosfatasas que pueden estar implicadas en la desfosforilación de las MAPKs como ERK1/2.
Introducción
- 59 -
Las MKPs, en base a su similitud de secuencia, especificidad de sustrato y localización
subcelular, pueden ser clasificadas en tres subgrupos. El primer subgrupo contiene las fosfatasas
DUSP1/MKP-1, DUSP2/PAC-1, DUSP4/MKP-2 y DUSP5/hVH-3. Estas fosfatasas están
codificadas por genes de inducción rápida en respuesta a mitógenos y señales de estrés. Esta
regulación ocurre a nivel transcripcional. Se trata de fosfatasas nucleares con la excepción de
DUSP5. Estas fosfatasas parecen exhibir, en general, una amplia especificidad de sustrato
pudiendo desfosforilar a ERK1/2, JNK y p38 (Figura 24). El segundo grupo de MKPs está
constituido por DUSP6/MKP3, DUSP7/MKPX y DUSP9/MKP4. Estas tres proteínas son
enzimas citoplasmáticos. MKP3 y MKPX parecen desfosforilar de forma muy específica a
ERK1/2. MKP4 desfosforila a ERK1/2 y p38 (Figura 24).
Finalmente, el último grupo de estas fosfatasas incluye a DUSP8/hVH5,
DUSP10/MKP5 y DUSP16/MKP7, que escapan a nuestro interés dado que no presentan
actividad hacia ERK1/2, sólo hacia JNK y p38 (Keyse, 2008).
La expresión de muchas de estas fosfatasas se encuentra alterada en diferentes tipos
tumorales.
Dentro de las fosfatasas de especificidad dual se incluyen, además de las MKPs, otro
subgrupo de fosfatasas, algunas de las cuales también son capaces de desfosforilar a ERK1/2,
las A-DUSPs (fosfatasas de especificidad dual atípicas). La figura 24 muestra una
representación esquemática de las principales fosfatasas capaces de desfosforilar a ERK1/2
(Keyse, 2008; Patterson et al., 2009).
5. La proteína KSR1
La proteína KSR1 fue descrita inicialmente, a través de screens genéticos en D.
melanogaster y C. elegans, como capaz de revertir el fenotipo de mutantes oncogénicos de Ras
Figura 24. Representación esquemática de los diferentes tipos de fosfatasas duales, capaces de mediar la desfosforilación de ERK1/2 en residuos tanto de treonina como de tirosina.
Fosfatasas duales
MKPs A-DUSPs
Nucleares : MKP1, MKP2,
DUSP2, DUSP5
Citosólicas:MKP-3
MKP-x, MKP-4
VHR, DUSP14DUSP22, 23, 26
Fosfatasas duales
MKPs A-DUSPs
Nucleares : MKP1, MKP2,
DUSP2, DUSP5
Citosólicas:MKP-3
MKP-x, MKP-4
VHR, DUSP14DUSP22, 23, 26
Introducción
- 60 -
(Kornfeld et al., 1995; Therrien et al., 1995). Esta proteína, que presentaba una enorme
homología con el dominio quinasa de Raf, se denominó KSR1 (Kinase Supressor of Ras).
En D. melanogaster existe un único gen de KSR. En cambio, existen dos isoformas en
mamiferos (KSR1 y KSR2) y C. elegans.
Distinguimos una serie de cinco regiones conservadas en la estructura primaria de las
diferentes proteínas KSR de distintos organismos. Estas regiones van desde la zona amino a la
carboxilo terminal y se denominan CA1-CA5 (Figura 25) (Luis G. Pérez-Rivas, 2010; Therrien
et al., 1995). La región CA1 participa en la unión a Raf, al menos en D. melanogaster y M.
musculus (McKay et al., 2009; Roy et al., 2002). La región CA4 contiene un motivo DEF
(docking site for ERK, FXFP), que media la interacción de KSR1 con ERK1/2. Tras su unión a
KSR1, ERK1/2 fosforila a KSR1 induciendo así su disociación de B-Raf (Cacace et al., 1999;
McKay et al., 2009). Por último, el dominio CA5, en la región carboxilo terminal de KSR1,
presenta una elevada homología de secuencia con el dominio quinasa de Raf. Este dominio
media la interacción con MEK1/2 (Kolch, 2005; McKay et al., 2009; Stewart et al., 1999).
Inicialmente se pensó, debido a la elevada homología del dominio CA5 con el dominio
quinasa de Raf, que KSR1 era una proteína quinasa capaz de fosforilar a Raf. Existe aún cierta
controversia sobre la posible actividad quinasa de KSR1 y sus sustratos. Sin embargo, hoy en
día se tiende a aceptar que la sustitución de un residuo de lisina clave en el sitio catalítico del
dominio CA5 hace de KSR1 una pseudoquinasa (Morrison, 2001; Stewart et al., 1999; Therrien
et al., 1995; Xing et al., 2004; Xing and Kolesnick, 2001). KSR1 interacciona de forma
constitutiva con MEK1/2 y de forma dependiente de estímulo con Raf y ERK1/2 (Cacace et al.,
1999; Stewart et al., 1999).
5.1 KSR1 en la ruta de señalización de ERK1/2
KSR1 se identificó, inicialmente, como un modulador positivo de la ruta de Ras. Hoy en
día, se considera que desempeña un papel de proteína scaffold, facilitando el ensamblaje de los
componentes de la ruta Ras/Raf/MEK/ERK. Cuando se sobreexpresa KSR1, a niveles bajos
Figura 25. Representación esquemática de la estructura de la proteína murina KSR1 (mKSR1). Se representan los principales dominios de la proteína murina que son equivalentes a los dominios presentes en la proteína humana (hKSR1). Se muestran también las zonas de interacción con las principales proteínas de la ruta de ERK1/2 (Luis G. Pérez-Rivas, 2010; Therrien et al., 1995; McKay et al., 2009)
Introducción
- 61 -
(cercanos a los fisiológicos), esta coopera con Ras para promover una mayor activación de la
ruta de ERK1/2. En cambio, su sobreexpresión a niveles elevados (14 veces superiores a los
niveles fisiológicos) inhibe la transmisión de la señal y la fosforilación de ERK1/2 (Kortum and
Lewis, 2004). Este comportamiento, como ya se ha mencionado, es característico de las
proteínas scaffold.
En concordancia con las observaciones anteriores, la eliminación de KSR1 provoca una
disminución de la tasa de proliferación celular en fibroblastos embrionarios de ratones (MEFs).
Además, estos MEFs (KSR1-/-) presentan menores niveles de activación de ERK1/2 en
respuesta a la estimulación con EGF, PDGF, 10%FBS o TPA. Estos MEFs presentan, también,
menor capacidad de transformación oncogénica por Ras (Kortum and Lewis, 2004; Lozano et
al., 2003).
La capacidad de KSR1 de interaccionar con un elevado número de proteínas apoya su
función como scaffold. KSR1 forma parte de complejos multiproteicos con proteínas como Raf-
1, MEK1/2, ERK1/2, 14-3-3 o las proteínas de choque térmico HSP90, HSP70, HSP68 y
p50CDC37 y otras proteínas sin identificar. Estos complejos multiproteicos de señalización
presentan pesos moleculares entre 250 a 1000 kDa. La presencia de MEK1/2 en estos
complejos es dependiente de KSR1, dado que un mutante de KSR1 incapaz de unir MEK1/2
desplaza a MEK1/2 a las fracciones de peso molecular monomérico (40 kDa) (Stewart et al.,
1999). Además, se han descrito otras proteínas capaces de interaccionar con KSR1 como C-
TAK1 (Muller et al., 2001), CNK (Therrien et al., 2000), las subunidades βγ de las proteínas G,
PP2A, NM23-H1 (Hartsough et al., 2002), IMP (Matheny et al., 2004) , B-Raf y CK2 (Ritt et
al., 2007). Por otro lado, KSR1 es capaz de homodimerizar (Matheny and White, 2009).
Hasta el momento, se ha descrito como KSR1 es retenido a nivel del citosol a través de
la interacción con ciertas proteínas. La interaccion con IMP (Impedes Mitogenic signal
Propagation) retiene a KSR1 en un compartimento insoluble en tritón. IMP es una ubiquitina
E3 ligasa que induce su propia degradación cuando se une a RasGTP, liberando así a KSR1
(Matheny et al., 2004; Matheny and White, 2009). La interacción con proteínas 14-3-3 retiene a
KSR1 en el citosol. Esta interacción, con proteínas de la familia 14-3-3, es dependiente de la
fosforilación de KSR1 en el residuo serina 392 (Cacace et al., 1999; Jagemann et al., 2008). La
fosforilación en serina 392 es mediada por C-TAK1 y NM23-H1 (Hartsough et al., 2002;
Muller et al., 2001; Salerno et al., 2005). La desfosforilación de este residuo por la fosfatasa
PP2A disminuye la cantidad de KSR1 unido a 14-3-3 y favorece la traslocación de KSR1 a la
membrana (Ory et al., 2003). De lo anterior, se deduce que la localización subcelular de KSR1
es dinámica. La estimulación con determinados factores de crecimiento induce la translocación
de una población de KSR1 a la membrana plasmática, donde se sabe que interacciona con Raf y
Introducción
- 62 -
contribuye a la activación de MEK1/2 (Michaud et al., 1997; Therrien et al., 1996). Por otro
lado, tanto KSR1 como MEK1/2 pueden localizarse tanto en la fracción soluble celular como en
las fracciones de membranas (Stewart et al., 1999).
KSR1 se localiza además en el núcleo celular, pero se sabe poco de su transporte
nucleocitoplasmático (Brennan et al., 2002).
Posteriormente, se han descrito otros procesos en los que parece estar interviniendo esta
proteína. Así, KSR1 parece estar implicado en procesos de estrés e inflamación mediados por
ERK1/2 (Fusello et al., 2006). De forma similar, es necesario también para la protección del
epitelio intestinal frente a la apoptosis mediada por TNF (Yan et al., 2004). Además, KSR1
parece ser imprescindible para la entrada en senescencia, dependiente del oncogen RasV12 y
para la reiniciación del ciclo celular tras el daño al ADN (Kortum et al., 2006; Razidlo et al.,
2009).
5.2 Fenotipos relacionados con el silenciamiento de KSR
En el gusano C. elegans, la eliminación individual de KSR1 o KSR2 no afecta a la
viabilidad celular. En cambio, el doble Knockout de ambos genes resulta letal (Ohmachi et al.,
2002). Mutaciones de pérdida de función de KSR1 en D. melanogaster son letales,
probablemente debido a la existencia de un único gen (Therrien et al., 1995). En cuanto a
mamíferos, el knockout de KSR1 no presenta defectos significativos que afecten a su viabilidad,
probablemente debido al efecto redundante de la isoforma KSR2. Estos ratones presentan
defectos en la proliferación de células T y folículos pilosos desorganizados. Además, estos
ratones KSR1-/- son menos susceptibles al desarrollo de tumores inducidos por oncogenes, lo
que corrobora el papel de esta proteína en la ruta de señalización de ERK1/2 (Lozano et al.,
2003; Nguyen et al., 2002). Estos ratones (KSR1-/-) son también menos susceptibles al
desarrollo de enfermedades inflamatorias, probablemente debido a una deficiente activación de
ERK1/2 durante la respuesta inflamatoria (Fusello et al., 2006).
1. Estudiar los patrones de expresión de VRK2 en tejidos normales
y tumorales de mama, así como en un panel de líneas celulares
de mama.
2. Investigar la relación entre VRK2 y la señalización dependiente
del receptor ErbB2.
3. Analizar el papel de VRK2A en la señalización a través de las
rutas mediadas por los oncogenes H-RasV12 y B-RafV600E.
OOOBBBJJJEEETTTIIIVVVOOOSSS
RRREEESSSUUULLLTTTAAADDDOOOSSS
Resultados
- 67 -
1. Características de VRK2 endógena 1.1 Localización subcelular de VRK2 en relación a VRK1
Hasta el momento, diversos trabajos han estudiado en profundidad la localización
subcelular de VRK1 tanto en líneas celulares como en tejidos. Inicialmente, VRK1 fue descrita
como una quinasa exclusivamente nuclear en líneas celulares como A549 o H1299 (Vega, et al.,
2004). Posteriormente, se ha visto que a pesar de ser una quinasa mayoritariamente nuclear, en
determinadas líneas celulares y tejidos se pueden detectar poblaciones citosólicas de VRK1, si
se emplea el anticuerpo adecuado (Valbuena, et al., 2007a). En concreto, se ha descrito la
existencia de una subpoblación de VRK1 ligada al aparato de Golgi (Lopez-Sanchez, et al.,
2009; Valbuena, et al., 2007a). Así, cuando se estudia su distribución subcelular en tejidos, se
observa una localización nuclear en tejidos como testículos y esófago y una localización tanto
nuclear como citosólica en tejidos como riñón e intestino (Valbuena, et al., 2007a).
Por otro lado, se ha descrito que la isoforma VRK2A se encuentra anclada a membranas
de retículo endoplasmático, envoltura nuclear y mitocondrias mientras que la isoforma VRK2B
se localiza libre predominantemente en el núcleo (Blanco, et al., 2006). VRK1, VRK2A y
VRK2B tienden a compartir sustratos in vitro, debido a la enorme similitud de su dominio
catalítico, en la región amino terminal. Sin embargo, debido a las diferencias en su extremo
VRK2 VRK1 DAPI MEZCLAVRK2 VRK1 DAPI MEZCLA
HeLa
MCF7
MDA-MB-231
Cal-51
HeLa
MCF7
MDA-MB-231
Cal-51
Figura 26. Comparación de la localización subcelular de VRK1 y VRK2. Inmunofluorescencias mostrando la localización subcelular de VRK2 con un anticuerpo policlonal específico para VRK2 (rojo), la localización de VRK1 con un anticuerpo monoclonal ,1F6, específico para VRK1 (verde) y el núcleo teñido con DAPI (azul), en distintas líneas celulares. La barra indica 10 μm.
Resultados
- 68 -
carboxilo terminal, responsable de su diferente localización subcelular, parece poco probable
que VRK1 y VRK2A compartan los mismos sustratos y funciones biológicas in vivo. Al
descubrirse la existencia de poblaciones citosólicas de VRK1 y en particular de la existencia de
una subpoblación a nivel del aparato de Golgi, responsable de fragmentación de este orgánulo
(Lopez-Sanchez, et al., 2009), quisimos comparar la localización subcelular de VRK1 y VRK2.
En concreto, nos planteamos si la población citosólica de VRK1 podría estar colocalizando con
las poblaciones citosólicas de VRK2. Para ello, llevamos a cabo inmunofluorescencias con un
anticuerpo monoclonal (1F6) que detecta las poblaciones citosólicas y nucleares de VRK1
endógena y un anticuerpo policlonal específico de VRK2 (anti-VRK2) (Figura 26). Se comparó,
así, la localización de VRK1 y VRK2 endógenas en un panel de líneas celulares, que incluía la
línea celular HeLa (adenocarcinoma de cérvix) y tres líneas celulares de cáncer de mama
(MCF7, MDA-MB-231 y Cal-51). En todos los casos, se detecta VRK2 tanto en el núcleo como
en el citosol, dado que el anticuerpo detecta ambas isoformas VRK2A y VRK2B,
indiscriminadamente. En cuanto a VRK1, se puede apreciar de forma muy clara en el citosol la
subpoblación del aparato de Golgi. En cambio, no se detecta ningún tipo de colocalización entre
las poblaciones citosólicas de VRK1 y VRK2. Este resultado apoyaría la hipótesis de que, a
pesar de compartir sustratos in vitro, las funciones citosólicas de VRK1 y VRK2 fuesen
diferentes debido a la diferente localizacion subcelular.
Figura 27. VRK2 no colocaliza con el aparato de Golgi ni con el sistema lisosomal. Inmunofluorescencias en la línea celular HeLa. VRK2 (rojo) se detectó mediante un anticuerpo policlonal. A) La proteína marcadora de aparato de Golgi GM130 (verde) se detectó con un anticuerpo monoclonal. B) La proteína marcadora de lisosomas LAMP2 (verde) se detectó con un anticuerpo monoclonal. El núcleo se marcó con DAPI. La barra indica 10 μm.
VRK2 DAPIGM130 MEZCLA
VRK2 DAPILAMP2 MEZCLA
A
B
VRK2 DAPIGM130 MEZCLA
VRK2 DAPILAMP2 MEZCLA
A
B
Resultados
- 69 -
Para descartar definitivamente una posible presencia de VRK2 en aquellas
localizaciones citosólicas en las que se ha descrito la presencia de VRK1, como aparato de
Golgi y lisosomas, llevamos a cabo inmunofluorescencias, en la línea celular HeLa, empleando
marcadores de estos orgánulos subcelulares. Como se puede apreciar en las
inmunofluorescencias de la figura 27, no se detecta ningún tipo de colocalización entre la
quinasa VRK2 endógena y la proteína GM130, empleada como marcador de aparato de Golgi
(Figura 27A). De forma similar, VRK2 tampoco colocaliza con la proteína LAMP2, empleada
como marcador de lisosomas (Figura 27B).
1.2 Patrones de expresión de VRK2 en tejidos de mama
Diversos trabajos han estudiado la expresión de VRK1 en tejidos. Así, en carcinomas de
cabeza y cuello se observa que VRK1 correlaciona positivamente con marcadores de
proliferación celular como Ki-67 o CDK2 (Santos, et al., 2006). En carcinomas de pulmón la
expresión de VRK1 varía en función del subtipo de carcinoma (Valbuena, et al., 2007b). En
cambio, hasta el momento, carecíamos de datos acerca de la expresión de VRK2 a nivel
histológico. Quisimos, por tanto, estudiar los patrones de expresión de VRK2 en tejidos tanto
normales como tumorales. Dada la elevada prevalencia del cáncer de mama, decidimos analizar
la expresión de VRK2 en biopsias de este tipo de tumores. Antes de analizar los tumores de
mama, estudiamos mediante inmunohistoquímica la distribución de VRK2, detectada con un
anticuerpo policlonal (anti-VRK2), en cortes de tejido de mama no tumorales. Se observa como
VRK2 (tinción color marrón) se localiza mayoritariamente en el citosol (Figura 28). Además,
VRK2 se expresa tanto en las células en posición basal, como en posición luminal dentro de la
glándula mamaria.
Al no existir datos referentes a la expresión de VRK2 en tejidos tumorales, quisimos
estudiar los patrones de expresión de VRK2 en tumores de mama en relación a marcadores
Figura 28. Localización de la proteína VRK2 humana en tejido no tumoral de mama. Se detectó VRK2 con un anticuerpo policlonal (anti-VRK2) específico, mediante inmunohistoquímica de biopsias de tejidos humanos normales. Los cortes de tejido teñidos por inmunohistoquímica se analizaron con un microscopio óptico “OLIMPUS BX51” y las fotos se tomaron con la cámara “OLYMPUS DP70” asociada al mismo.
Resultados
- 70 -
empleados de forma rutinaria en el diagnóstico del cáncer de mama, como el receptor de
membrana tirosín quinasa ErbB2. Este receptor se encuentra sobreexpresado en un 25-30% de
los tumores de mama y constituye un marcador de mal pronóstico (Slamon, et al., 1987).
Se emplearon, para preparar microarrays de tejidos (TMA), 136 muestras de tejidos
tumorales de mama, seleccionados de manera que hubiera un número equilibrado de casos
ErbB2 positivos y negativos (60 casos ErbB2 positivos y 76 casos ErbB2 negativos). De esta
manera, se pudo detectar con anticuerpos específicos la expresión de VRK2 y del receptor
ErbB2 mediante tinción inmunohistoquímica. Observamos, entonces, que existía una
correlación inversa y estadísticamente significativa (chi-square p˂0,05) entre los niveles de
expresión del receptor ErbB2 y los de VRK2 (Figuras 29 y 30). Es decir, aquellos tumores
ErbB2 VRK2 ErbB2 VRK2
Tumores ErbB2 negativos Tumores ErbB2 positivos
ErbB2 VRK2 ErbB2 VRK2ErbB2 VRK2 ErbB2 VRK2
Tumores ErbB2 negativos Tumores ErbB2 positivos
Figura 29. Inmunohistoquímicas de ErbB2 y VRK2 en tejidos tumorales de mama. Los diferentes casos se tiñeron con los correspondientes anticuerpos específicos y se clasificaron como ErbB2 negativos o ErbB2 positivos. ErbB2 se expresa a nivel de la membrana plasmática. VRK2 se expresa tanto en el núcleo como en el citosol. La barra indica 200 μm.
Resultados
- 71 -
clasificados como ErbB2 negativos expresaban niveles elevados de VRK2, mientras que los
tumores clasificados como ErbB2 positivos tendían a perder o disminuir la expresión de VRK2
(Figuras 29, 30 y 31).
Al estudiar en detalle la localización de VRK2 en estos tumores (clasificados como
ErbB2 negativos o ErbB2 positivos), observamos una localización mayoritariamente citosólica,
pero también una cierta tinción nuclear (Figura 31). Además, se aprecia un marcaje de tipo
granular acorde con una localización anclada a membranas, tal y como se ha descrito para la
isoforma VRK2A, debido a la presencia de la región hifrofóbica carboxilo terminal (Blanco, et
al., 2006).
A continuación, decidimos estudiar la expresión de VRK2 en relación a la de los
marcadores de buen pronóstico en cáncer de mama, receptor de estrógeno (ER) y receptor de
Figura 30. Análisis estadístico de la correlación inversa entre los niveles de expresión de ErbB2 y VRK2. Se analizaron 60 casos clasificados como ErbB2 positivos y 76 casos clasificados como ErbB2 negativos. En cada uno de ellos, se puntuó el nivel de intensidad de tinción de VRK2 como muy leve (1-3), moderada (4-6) y fuerte (7-9). Los tumores ErbB2 positivos expresan en su mayoría niveles muy bajos de VRK2. En cambio, los tumores ErbB2 negativos expresan mayores niveles de VRK2. El análisis estadístico se llevó a cabo con el método de Chi-square y el test de Fisher (SPSS versión 18; SPSS, Chicago, IL).
Figura 31. Distribución intracelular de VRK2 en muestras tumorales de mama clasificadas como ErbB2 negativa (izquierda) y ErbB2 positiva (derecha). En ambas inmunohistoquímicas se aprecia como la distribución de VRK2 es mayoritariamente citosólica y de aspecto granular (acorde con una localización anclada a membranas). En la muestra tumoral ErbB2 positiva (de la derecha), se aprecia una notable disminución en los niveles de expresión de VRK2. La barra indica 100 μm.
0
20
40
60
80
100
P<0.05
Porc
enta
je d
e tu
mor
es (%
)
erbB2 +N = 60
erbB2 –N = 76
7-94-61-3
Nivelesde expresión de
VRK2
0
20
40
60
80
100
P<0.05
Porc
enta
je d
e tu
mor
es (%
)
erbB2 +N = 60
erbB2 –N = 76
7-94-61-3
Nivelesde expresión de
VRK2
100 μm 100 μm
ErbB2 negativo ErbB2 positivo
100 μm 100 μm100 μm 100 μm
ErbB2 negativo ErbB2 positivo
Resultados
- 72 -
progesterona (PR). Frecuentemente, se observa una correlación inversa entre la expresión del
receptor ErbB2 y la de los receptores de estrógeno (Grunt, et al., 1995; Harari and Yarden,
2000). De esta manera, los tumores ErbB2 positivos suelen ser receptor de estrógeno negativos
y viceversa, por lo que cabría esperar que la expresión de VRK2 fuese elevada en aquellos
tumores receptor de estrógeno positivos. Efectivamente, pudimos comprobar que existía una
correlación positiva entre los niveles de expresión de VRK2 y los de los marcadores receptor de
estrógeno y progesterona (Figura 32). Es decir, los tumores de mama con niveles elevados de
receptor de estrógeno y de receptor de progesterona expresan mayores niveles de VRK2 que
aquellos tumores receptor de estrógeno y progesterona negativos (Figura 32).
Por lo tanto, VRK2 parece correlacionar positivamente con marcadores de buen
pronóstico en cáncer de mama, como los receptores de estrógeno y progesterona, y correlaciona
negativamente con marcadores de mal pronóstico, como el receptor ErbB2. Estos datos apuntan
a que VRK2 se está comportando como un marcador de buen pronóstico en cáncer de mama.
Figura 32. Inmunohistoquímicas mostrando los niveles de expresión del receptor de estrógeno o el receptor de progesterona y VRK2 en tejidos tumorales de mama. Se prepararon tissue microarrays (TMA) de tejidos tumorales de mama. En el panel de la izquierda, se muestran cortes representativos de tejidos tumorales de mama, con niveles de expresión decrecientes del receptor de estrógeno (ER), en los que se observa una correlación positiva con la expresión de VRK2. En el panel de la derecha, se muestran cortes representativos de tejidos tumorales de mama, con niveles de expresión decrecientes del receptor de progesterona (PR), en los que se observa una correlación positiva con la expresión de VRK2. A medida que decrece la expresión de ambos receptores, también, lo hace la expresión de la quinasa VRK2. Los niveles de receptor de estrógeno y progesterona se analizaron en las mismas series de casos. La barra indica 200 μm.
ER VRK2 PR VRK2 ER VRK2 PR VRK2
Resultados
- 73 -
1.3 Estudio de los patrones de expresión de VRK2 en un panel de líneas celulares de
mama
Los trabajos de Neve y colaboradores, realizados en diferentes líneas celulares
tumorales de mama, indicaban que a diferencia de los tumores primarios, en estas líneas
celulares no es posible identificar un subgrupo ErbB2 positivo asociado a un patrón
transcripcional específico (Neve, et al., 2006). A pesar de ello, la observación de que los
tumores primarios de mama ErbB2 positivos tendían a disminuir o perder la expresión de VRK2
nos llevó a plantearnos si esta correlación se mantendría también en un panel de líneas
hjhjkkjjjhjjh
Figura 33. Localización subcelular de VRK2 en un panel de líneas celulares de mama. VRK2 (rojo) se detectó con un anticuerpo policlonal específico (anti-VRK2) en las líneas de cáncer de mama AU565, T47D, MDA-MB-435 y HCC1187. En el caso de la línea celular AU565, se muestra una imagen adicional tomada a mayor aumento para apreciar con más detalle la localización subcelular de VRK2. El núcleo se marca con DAPI (azul). La barra indica 10 μm.
Líneas celulares basales
HC
C11
87M
DA
-MB
-435
Líneas celulares luminales
VRK2MEZCLA DAPI FASEDETALLE
T47D
AU
565
Líneas celulares basales
HC
C11
87M
DA
-MB
-435
Líneas celulares luminales
VRK2MEZCLA DAPI FASEDETALLE
T47D
AU
565
Resultados
- 74 -
celulares tumorales de mama. Para evaluar esta hipótesis decidimos estudiar la expresión de
VRK2 en un panel de líneas celulares tanto luminales como basales y ErbB2 positivas o
negativas. Comenzamos llevando a cabo inmunofluorescencias, en cuatro líneas celulares, para
comparar la localización subcelular de VRK2 en función del subtipo de línea celular (Figura
33). Empleamos las líneas celulares luminales AU565 y T47D y las líneas MDA-MB-435 de
tipo basal B y HCC1187 de tipo basal A. De todas ellas, sólo la línea AU565 es ErbB2 positiva.
Se puede apreciar como en todas las líneas celulares la localización subcelular de VRK2 es
mayoritariamente citosólica y tan solo levemente nuclear. Además, tal y como se muestra en los
detalles de la figura 33, VRK2 no solapa con la membrana plasmática. No existen diferencias
relevantes en cuanto a la localización, en función del subtipo de línea celular, pero si en cuanto
a los niveles de expresión de VRK2. Las imágenes se tomaron con intensidades constantes de
excitación del fluorocromo rojo, de manera que los niveles de marcaje de VRK2 fueran
comparables entre diferentes muestras. Podemos observar que las líneas celulares de tipo
luminal (AU565 y T47D) expresan mayores niveles de VRK2 (mayor intensidad de marcaje
rojo), que las líneas de tipo basal (MDA-MB-435 y HCC-1187).
Para comprobar si existía alguna correlación entre el tipo de línea celular de mama y los
niveles de expresión de ErbB2 y VRK2, se analizó por western blot la expresión de estas
klfkeñkfoe
Figura 34. Expresión de VRK2 en un panel de líneas celulares de mama de tipo Luminal. El anticuerpo policlonal (anti-VRK2) detecta dos bandas. La banda superior corresponde a VRK2A y la banda inferior a la isoforma VRK2B de menor peso molecular. A) Western blot mostrando la detección de las proteínas endógenas con anticuerpos específicos. B) Cuantificación de los niveles de expresión de VRK2A y VRK2B respecto a la β-actina.
MDA-MB-3
61
ErbB2p53
p-ERK1/2ERK 1/2
VRK2
VRK1β-actina
β-actina
Líneas celulares de mama luminales
ZR75
30AU56
5
600M
PE
ZR75
B
MCF7T47
D
HCC1428
HCC2185A
0
0,2
0,4
0,6
600M
PE
ZR7530
AU565
MDA-MB-36
1
ZR75B
HCC2185
HCC1428MCF7
T47D
VRK
2A /
β-a
ctin
a
0
0,5
1
1,5
2
2,5
600M
PE
ZR7530
AU565
MDA-MB-36
1
ZR75B
HCC2185
HCC1428MCF7
T47D
VRK
2B /
β-a
ctin
a
B
AB
MDA-MB-3
61
ErbB2p53
p-ERK1/2ERK 1/2
VRK2
VRK1β-actina
β-actina
Líneas celulares de mama luminales
ZR75
30AU56
5
600M
PE
ZR75
B
MCF7T47
D
HCC1428
HCC2185A
0
0,2
0,4
0,6
600M
PE
ZR7530
AU565
MDA-MB-36
1
ZR75B
HCC2185
HCC1428MCF7
T47D
VRK
2A /
β-a
ctin
a
0
0,5
1
1,5
2
2,5
600M
PE
ZR7530
AU565
MDA-MB-36
1
ZR75B
HCC2185
HCC1428MCF7
T47D
VRK
2B /
β-a
ctin
a
B
AB
Resultados
- 75 -
proteínas junto con otros marcadores, en dos paneles de líneas celulares de mama. El primer
panel contiene nueve líneas celulares de tipo luminal. Se cuantificaron los niveles de expresión
relativa de VRK2A y VRK2B respecto a la β-actina (Figura 34B). Ambas isoformas, VRK2A
(banda superior) y VRK2B (banda inferior), se expresaban en todas las líneas celulares de tipo
luminal, siendo en muchos casos la expresión relativa de VRK2B superior a la de VRK2A
(Figura 34A). Los niveles de expresión de VRK2A y VRK1 resultaban bastante constantes a lo
largo de las diferentes líneas celulares. Los niveles de expresión de VRK2B resultaban bastante
variables, siendo especialmente elevados en la línea celular de adenocarcinoma de mama
MCF7. No parecía existir ninguna correlación entre los niveles proteicos de VRK2A, VRK2B y
los de p53 o los niveles de fosforilación de ERK1/2 (Figura 34A).
A continuación, se analizó la expresión de VRK2A y VRK2B en un panel comparativo
de líneas celulares de tipo luminal respecto a líneas celulares de tipo basal. Además, se
jjkjkmkmcd
Figura 35. Comparación del patrón de expresión de VRK2 en líneas celulares de mama clasificadas como luminales o basales y ErbB2 positivas o negativas. La clasificación de las líneas celulares en los subtipos luminal, basal A y basal B se ha hecho en base a los datos publicados por Neve y colaboradores (Neve, et al., 2006). Las líneas HCC1569, HCC1937, HCC3153 pertenecen al subtipo basal A, mientras que las líneas BT549 y MDA-MB-435 son de tipo basal B. A,B) Western blot mostrando la detección de las proteínas endógenas con anticuerpos específicos. C) Cuantificación de los niveles de expresión de VRK2A y VRK2B respecto a la β-actina.
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
ZR7530
AU656
MDA-MB-36
1
HCC1569
HCC1937
HCC3153BT54
9
MDA-MB-43
5
Expr
esió
n re
lativ
a de
VR
K2B luminales basales
ErbB2 + ErbB2 -
HCC1937
HCC3153
β-actina
β-actinaVRK1
ERK 1/2
p-ERK 1/2p53
ErbB2
luminales basales
ZR75
30AU56
5
HCC1569
BT549
MDA-MB-4
35
MDA-MB-3
61
A
0
0,2
0,4
0,6
0,8
ZR7530
AU656
MDA-MB-36
1
HCC1569
HCC1937
HCC3153
BT549
MDA-MB-43
5
Expr
esió
n re
lativ
a de
VR
K2A luminales basales
ErbB2 + ErbB2 -
C
Ciclina D1Ciclina A
PCNAβ-actina
luminales basales
HCC1937
HCC3153
ZR75
30AU56
5
HCC169
BT549
MDA-MB-4
35
MDA-MB-36
1
B
VRK2 AB
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
ZR7530
AU656
MDA-MB-36
1
HCC1569
HCC1937
HCC3153BT54
9
MDA-MB-43
5
Expr
esió
n re
lativ
a de
VR
K2B luminales basales
ErbB2 + ErbB2 -
HCC1937
HCC3153
β-actina
β-actinaVRK1
ERK 1/2
p-ERK 1/2p53
ErbB2
luminales basales
ZR75
30AU56
5
HCC1569
BT549
MDA-MB-4
35
MDA-MB-3
61
A
0
0,2
0,4
0,6
0,8
ZR7530
AU656
MDA-MB-36
1
HCC1569
HCC1937
HCC3153
BT549
MDA-MB-43
5
Expr
esió
n re
lativ
a de
VR
K2A luminales basales
ErbB2 + ErbB2 -
C
Ciclina D1Ciclina A
PCNAβ-actina
luminales basales
HCC1937
HCC3153
ZR75
30AU56
5
HCC169
BT549
MDA-MB-4
35
MDA-MB-36
1
B
VRK2 ABVRK2 AB
Resultados
- 76 -
agruparon las líneas celulares ErbB2 positivas para compararlas con líneas celulares ErbB2
negativas (Figura 35A). La expresión de la isoforma VRK2A apenas varía en función del
subtipo de línea de mama. Además, a diferencia de los resultados obtenidos en las
inmunohistoquímicas de tumores primarios, no se observa una menor expresión de VRK2 en
aquellas líneas celulares de mama ErbB2 positivas. En cambio, salvo por la excepción de la
línea celular de tipo basal HCC1937, observamos que las líneas celulares de tipo basal tienden a
expresar niveles muy bajos de VRK2B en contraposición a las líneas de tipo luminal (Figura
35A y C). Este resultado concuerda con el observado a nivel de inmunofluorescencia (Figura
33) donde las líneas de tipo basal MDA-MB-435 y HCC1187 expresaban menores niveles de
VRK2, probablemente debido a que estarían expresando niveles muy bajos de la isoforma
VRK2B.
Hasta el momento, se ha relacionado a la quinasa VRK1 con la correcta progresión del
ciclo celular (Klerkx, et al., 2009; Marta Sanz-García, 2010). Además, su expresión correlaciona
con la de marcadores de proliferación celular (Santos, et al., 2006; Valbuena, et al., 2008). En
cambio, se cree que la expresión de VRK3 no se relaciona de forma directa con la capacidad
proliferativa de las células (Kang and Kim, 2008). Sin embargo, no existen estudios de este tipo
en el caso en VRK2. Por este motivo, nos plantearnos si los patrones de expresión de VRK2A y
VRK2B en las líneas celulares de mama podrían estar relacionados con la capacidad
proliferativa de estas células. Para evaluar esta hipótesis, decidimos estudiar la expresión de
marcadores de ciclo celular, en el panel comparativo de líneas celulares luminales frente a
basales. Llevamos a cabo western blot, a partir de extractos celulares totales de cultivos
asincrónicos y detectamos la expresión de los marcadores de ciclo Ciclina D1, Ciclina A y el
antígeno nuclear de proliferación celular (PCNA) (Figura 35B). Los niveles de expresión de
Ciclina A y PCNA eran relativamente constantes en todas las líneas celulares, probablemente
por tratarse de líneas de mama tumorales con un elevado potencial proliferativo. Sin embargo,
los niveles de expresión de Ciclina D1 variaban enormemente. De hecho, se observa como los
niveles de Ciclina D1 son casi indetectables en aquellas líneas celulares que no expresan apenas
VRK2B (Figura 35A y B). Es decir, hay una correlación positiva entre la expresión proteica de
VRK2B y la de la Ciclina D1 en el panel de líneas de mama. Además, esta correlación se
observaría a lo largo de nuestro trabajo en otras líneas celulares no mamarias. Hay que
considerar que, se ha descrito como VRK2B y VRK1 pueden tener funciones redundantes.
Ambas tienen una localización nuclear y tienden a compartir sustratos de fosforilación in vitro
(Blanco, et al., 2006). Por este motivo, el resultado anterior nos lleva a hipotetizar que VRK2B
pudiera estar controlando la expresión de Ciclina D1 a través de la fosforilación de CREB, tal y
como se ha descrito para VRK1 (Kang, et al., 2008).
Resultados
- 77 -
2. Estudio de la relación entre VRK2 y la señalización dependiente de ErbB2
La pérdida de expresión proteica, durante el desarrollo tumoral, suele ser característica
de aquellas proteínas que actúan a modo de supresores de tumores (Hanahan and Weinberg,
2000; Lo, et al., 2004). Por este motivo, la observación de que los tumores ErbB2 positivos (de
peor pronóstico) perdían la expresión de VRK2 resultaba especialmente llamativa. Este
resultado nos llevó a plantearnos cuál era la relación entre el receptor ErbB2 y la quinasa VRK2
y a considerar la posibilidad de que VRK2 estuviera afectando a la señalización mediada por
ErbB2.
El receptor de membrana tirosín quinasa ErbB2 activa múltiples cascadas de
señalización, a nivel de la membrana plasmática (Citri and Yarden, 2006). Para evaluar la
posibilidad de que VRK2 pudiera estar afectando a alguna de las cascadas de señalización
activadas por ErbB2, decidimos llevar a cabo una primera aproximación experimental basada en
el empleo de un reportero de luciferasa bajo el control de un Elemento de Respuesta a Suero
gggg gggggggg
(SRE). El Elemento de Respuesta a Suero es una secuencia génica presente en los promotores
de numerosos genes de respuesta rápida. El receptor ErbB2 puede activar la transcripción del
SRE a través de la activación de diversas rutas de señalización celular, principalmente las de las
pequeñas GTPasas Ras, Rac, CDC-42 y Rho-A (Figura 36) (Gille, et al., 1995; Treisman, 1992).
En primer lugar, llevamos a cabo un ensayo de luciferasa transfectando células HEK-
293T con el reportero de luciferasa SRE.Luc y cantidades crecientes del plásmido pCDNA3-
ErbB2, que codifica el receptor de membrana ErbB2 (Figura 37A). Tal y como cabría esperar, el
receptor ErbB2 es capaz de activar la transcripción del reportero SRE.Luc de forma dosis
dependiente. A continuación, seleccionamos una cantidad del receptor ErbB2 (500 ng) capaz de
activar de forma significativa la transcripción del reportero SRE.Luc. Cotransfectamos el
plásmido reportero SRE.Luc, junto con el plásmido pCDNA3-ErbB2 y dosis crecientes del
Figura 36. Representación esquemática del Elemento de Respuesta a Suero (SRE). La activación transcripcional del SRE se produce a través de la unión de un complejo ternario de factores de transcripción denominados TCFs (ternary complex factors) y un dímero del factor de transcripción SRF (serum response factor). Todos estos factores de transcripción pueden ser activados a través de múltiples rutas de señalización, siendo las principales las que se esquematizan en esta figura (Gille, et al., 1995; Treisman, 1992).
AGGA CCATATTAGG
TCFsSRF SRF
ERK1/ERK2
Ras
Raf
MEK1/MEK2
JNK/SPK
GCK
MEKK1
Rac/CDC- 42
Elemento de Respuesta a Suero (SRE)
Rho-A Ca++
AGGA CCATATTAGGSRF SRF
ERK1/ERK2
Raf
MEK1/MEK2
JNK/SPK
GCK
MEKK1
-
AGGA CCATATTAGG
TCFsSRF SRF
ERK1/ERK2
Ras
Raf
MEK1/MEK2
JNK/SPK
GCK
MEKK1
Rac/CDC- 42
Elemento de Respuesta a Suero (SRE)
Rho-A Ca++
AGGA CCATATTAGGSRF SRF
ERK1/ERK2
Raf
MEK1/MEK2
JNK/SPK
GCK
MEKK1
-
Resultados
- 78 -
plásmido pCEFL-HA-VRK2A (que codifica la quinasa humana VRK2A) (Figura 37B). De este
modo, podemos concluir que la sobreexpresión de VRK2A es capaz de inhibir la activación
transcripcional del Elemento de Respuesta a Suero por ErbB2, de forma dosis dependiente.
jfefie
Por otro lado, observamos en el western blot como la sobreexpresión de HA-VRK2A no afecta
a los niveles proteicos de ErbB2 (Figura 37B). Es decir, VRK2A no está promoviendo la
degradación de ErbB2 y, por lo tanto, podemos concluir que VRK2A ha de estar afectando a la
señalización mediada por el receptor ErbB2.
Puesto que la sobreexpresión de VRK2A era capaz de inhibir la activación
transcripcional del SRE por ErbB2, quisimos evaluar qué rutas de señalización relacionadas con
ErbB2 estaban siendo moduladas por VRK2A. Por este motivo, llevamos a cabo ensayos de
luciferasa transfectando células HEK293T con el reportero SRE.Luc y dosis crecientes de un
mutante constitutivamente activo de la pequeña GTPasa, H-Ras. Este mutante, H-RasG12V, es
capaz de activar la transcripción del SRE, de forma dosis dependiente (Figura 38A). A
continuación, seleccionamos una cantidad (200 ng) del vector pCEFL-H-RasG12V, capaz de
activar la transcripción del SRE de forma significativa y cotransfectamos dosis crecientes del
plásmido pCEFL-HA-VRK2A, junto con 1 μg del reportero de luciferasa SRE.Luc. La
sobreexpresión de VRK2A reprime la activación transcripcional del SRE por H-RasG12V, de
A
0
4
8
12
16
100 200 500 1000
ErbB2 (ng)
Act
ivac
ión
rela
tiva
ErbB2β-actina
0 0 50 250 500 25000
4
8
12
VRK2A (ng)
HA (VRK2A)ErbB2
β-actina
500 ng ErbB20 ng
Act
ivac
ión
rela
tiva
B
SRE.Luc
A
0
4
8
12
16
100 200 500 1000
ErbB2 (ng)
Act
ivac
ión
rela
tiva
ErbB2β-actina
A
0
4
8
12
16
100 200 500 1000
ErbB2 (ng)
Act
ivac
ión
rela
tiva
ErbB2β-actina
0
4
8
12
16
100 200 500 1000
ErbB2 (ng)
Act
ivac
ión
rela
tiva
ErbB2β-actina
0 0 50 250 500 25000
4
8
12
VRK2A (ng)
HA (VRK2A)ErbB2
β-actina
500 ng ErbB20 ng
Act
ivac
ión
rela
tiva
B
0 0 50 250 500 25000
4
8
12
VRK2A (ng)
HA (VRK2A)ErbB2
β-actina
500 ng ErbB20 ng
Act
ivac
ión
rela
tiva
B
SRE.Luc
Figura 37. VRK2A inhibe la activación transcripcional del Elemento de Respuesta a Suero por ErbB2. A) Curva de dosis mostrando la activación transcripcional del reportero de luciferasa Elemento de Respuesta a Suero (SRE.Luc), al sobreexpresar dosis crecientes del plásmido pCDNA3-ErbB2 que codifica el receptor de membrana ErbB2, en células HEK293T. B) Células HEK293T se transfectaron con 1 μg del reportero de luciferasa SRE.Luc y las dosis indicadas de los plásmidos pCDNA3-ErbB2 y pCEFL-HA-VRK2A o el vector vacío correspondiente. Tras 48 horas, los extractos se recogieron y se procesaron para medir la actividad luciferasa. Los Western blot representativos permiten verificar la correcta expresión de las proteínas transfectadas. Todos los experimentos de luciferasa se han realizado al menos 3 veces, de forma independiente y por triplicado.
Resultados
- 79 -
forma dosis dependiente (Figura 38B). Es decir, dado que VRK2A no está afectando a los
niveles de expresión proteica de H-Ras G12V, ha de estar inhibiendo la señalización a través de
esta ruta.
A continuación, nos planteamos si VRK2A podría estar afectando exclusivamente a la
señalización a través de la ruta de H-Ras o si, por el contrario, sería también capaz de modular
otras de las rutas de señalización activadas por ErbB2, que llevan a la transactivación del SRE.
kjgj
Rasβ-actina
A
Act
ivac
ión
rela
tiva
H-RasG12V (ng)
0
10
20
30
40
50
60
5 10 20 50 100 200 3000
HA (VRK2A)
β-actinaRas
Act
ivac
ión
rela
tiiva
0 0 250 500 1000 2500
VRK2A ( ng)
0
10
20
30
40
50
60 H-RasG12V (200 ng)
B
SRE.Luc
Rasβ-actina
A
Act
ivac
ión
rela
tiva
H-RasG12V (ng)
0
10
20
30
40
50
60
5 10 20 50 100 200 3000
Rasβ-actina
A
Act
ivac
ión
rela
tiva
H-RasG12V (ng)
0
10
20
30
40
50
60
5 10 20 50 100 200 3000 5 10 20 50 100 200 3000
HA (VRK2A)
β-actinaRas
Act
ivac
ión
rela
tiiva
0 0 250 500 1000 2500
VRK2A ( ng)
0
10
20
30
40
50
60 H-RasG12V (200 ng)
B
HA (VRK2A)
β-actinaRas
Act
ivac
ión
rela
tiiva
0 0 250 500 1000 2500
VRK2A ( ng)
0
10
20
30
40
50
60
0
10
20
30
40
50
60
0
10
20
30
40
50
60 H-RasG12V (200 ng)
B
SRE.Luc
Figura 38. En la línea celular HEK293T, VRK2A inhibe la activación transcripcional del Elemento de Respuesta a Suero provocada por el mutante H-RasG12V. A) Curva de dosis mostrando la activación transcripcional de 1 μg del reportero SRE.Luc, por cantidades crecientes del plásmido pCEFL-H-RasG12V que codifica el oncogén H-RasG12V. B) VRK2A reprime la activación transcripcional del Elemento de Respuesta a Suero provocada por el mutante H-RasG12V, de forma dosis dependiente.
Figura 39. VRK2A no afecta la activación transcripcional del Elemento de Respuesta a Suero por los mutantes constitutivamente activos de las pequeñas GTPasas Rho-A, CDC-42 y Rac. A) Se transfectaron células HEK293T con 1 μg del reportero SRE.Luc y de los plásmidos pCEFL-AU5-Rho-A-QL, pCEFL-AU5-CDC42-QL o pCEFL-AU5-Rac-QL, en combinación con 2,5 μg de pCEFL-HA-VRK2A, pCEFL-HA-VRK1 o el vector vacío correspondiente. Tras 48 horas, se prepararon los extractos celulares y se midió la actividad luciferasa. Western blot representativos, mostrando la expresión de las diferentes proteínas transfectadas.
HA-VRK2A 2,5 μgHA-VRK1 2,5 μg
Rho-A-QL 1μg
HA (VRK)β-actina
0Act
ivac
ión
rela
tiva
10
20
30
40
0
10
18
CDC42-QL 1µg
Act
ivac
ión
rela
tiva
Rac-QL 1µg
SRE.Luc
AU5 (GTPasa)
HA-VRK2A 2,5 μgHA-VRK1 2,5 μg
Rho-A-QL 1μg
HA (VRK)β-actina
0Act
ivac
ión
rela
tiva
10
20
30
40
0
10
18
CDC42-QL 1µgCDC42-QL 1µg
Act
ivac
ión
rela
tiva
Rac-QL 1µgRac-QL 1µg
SRE.Luc
AU5 (GTPasa)
Resultados
- 80 -
Para evaluar esta hipótesis, llevamos a cabo ensayos de luciferasa empleando el reportero
SRE.Luc y mutantes constitutivamente activos de las pequeñas GTPasas Rho-A, CDC-42 y Rac
(Figura 39). Los mutantes constitutivamente activos Rho-A-QL, CDC-42-QL y Rac-QL son
capaces de activar de forma significativa la transcripción del SRE (tal y como se exponía en la
figura 36). En cambio, la cotransfección de VRK2A o de VRK1 no afecta de forma relevante a
la activación transcripcional del SRE a través de estas rutas de señalización (Figura 39). Sin
embargo, se ha descrito que VRK2A es capaz de modular negativamente la señalización a
través de la ruta de JIP1/TAK1/MKK7/JNK, en respuesta a determinados estímulos de estrés
(Blanco, et al., 2007). Teniendo en cuenta que tanto Rac como CDC-42 median la activación
del SRE a través de la ruta de JNK, el hecho de que VRK2A no sea capaz de inhibir la
activación transcripcional del SRE por estas GTPasas probablemente sea debido a que activan la
ruta de JNK independientemente de TAK1. Quisimos, por tanto, verificar si el complejo
TAK1/TAB1 era capaz, al ser sobreexpresado, de activar la transcripción del SRE (al igual que
hlljljklj
ocurre con los sitios AP1). Para ello, transfectamos células HEK293T con el reportero SRE.Luc
en combinación con 50 ng de pCMV-HA-TAK1 y pFlag-TAB1. Podemos concluir que la
MAP3K TAK1, en combinación con su cofactor TAB1, no media la activación transcripcional
del SRE (Figura 40). Es decir, que la inhibición transcripcional del SRE por VRK2A no está
relacionada con la regulación de la ruta de JIP1/TAK1/TAB1/JNK.
Por último, para confirmar la regulación negativa de la señalización de H-Ras por la
quinasa VRK2A, quisimos ver si VRK2A podía modular esta ruta en respuesta a la estimulación
con acetato de forbol miristato (PMA). El PMA actúa como un mimético del diacilglicerol
(DAG) y en la línea celular HEK293T, es capaz de activar a la proteína quinasa PKC, quien a su
vez activará a Ras (Figura 41B). Llevamos a cabo ensayos de luciferasa, en la línea celular
HEK293T, transfectando el reportero SRE.Luc en combinación con el plásmido pCEFL-HA-
VRK2A o el vector vacío correspondiente. Tras 48 horas, se estimularon las células durante 30
Figura 40. La MAP3K TAK1 y su cofactor TAB1 no median la activación transcripcional del Elemento de Respuesta a Suero (SRE). Se transfectaron células HEK293T con 1μg del vector reportero SRE.Luc en combinación con 50 ng de los vectores pCMV-HA-TAK1 y pFlag-TAB1. Tras 48 horas, se procesaron los extractos para medir la actividad luciferasa. Se verificó la expresión de TAK1 y TAB1 a nivel de western blot.
2
0
1
Vector TAK1+TAB1
SRE.LucAct
ivac
ión
rela
tiva
Flag (TAB1)β- actina
HA (TAK1)
2
0
1
Vector TAK1+TAB1
SRE.LucAct
ivac
ión
rela
tiva
Flag (TAB1)β- actina
HA (TAK1)
Resultados
- 81 -
minutos con una concentración de 20 ng/ml de PMA y 4 horas después se prepararon los
extractos celulares y se determinó la actividad luciferasa (Figura 41A). De esta manera, se
corroboró que la sobreexpresión de VRK2A era capaz de inhibir la activación del SRE por
PMA.
2.1 Modulación negativa de la ruta de señalización de ERK1/2 por VRK2A
2.1.1 VRK2A inhibe la señalización de H-Ras de forma independiente de su actividad
quinasa
Hasta el momento, hemos determinado que VRK2A está inhibiendo la ruta de
señalización de H-Ras, empleando como modelo la línea celular HEK293T. Teniendo en cuenta
que los tumores de mama ErbB2 positivos tendían a perder la expresión de VRK2A, quisimos
verificar si VRK2A también era capaz de modular negativamente la ruta de señalización de
ERK1/2 en un modelo celular tumoral de mama. Decidimos, entonces, llevar a cabo nuestros
experimentos en la línea celular de adenocarcinoma de mama de tipo luminal, MCF7. Se
realizaron ensayos de luciferasa en esta línea celular, transfectando el reportero SRE.Luc, en
combinación con el vector que codifica el receptor ErbB2 y dosis crecientes de la quinasa
humana VRK2A. Tal y como cabría esperar, VRK2A también es capaz de inhibir la activación
transcripcional del SRE por ErbB2 en MCF7 (Figura 42A). Mediante inmunofluorescencia
podemos observar como, en esta línea celular, el receptor ErbB2, sobreexpresado, se distribuye
Figura 41. VRK2A inhibe la activación de la ruta de señalización de ERK1/2 por PMA. A) Células HEK293T fueron transfectadas con el vector reportero SRE.Luc, en combinación con el plásmido pCEFL-HA-VRK2A o el vector vacío correspondiente. Tras 48 horas, se estimularon las células con 20 ng/ml de PMA durante 30 minutos y 4 horas después se procesaron los extractos para medir la actividad luciferasa. B) Esquema del mecanismo de acción del PMA. El acetato de forbol miristato (PMA) actúa como un agente mimético del diacilglicerol (DAG), activando a la proteína quinasa PKC. PKC, a su vez, es capaz de activar la ruta de señalización de ERK1/2 actuando a nivel de Ras o bien de Raf, en función de la línea celular.
BEstimulación con PMA 20ng/ml 30 min.
0
2
4
6
8
10
HA-VRK2A (2µg)
Act
ivac
ión
rela
tiva
A
Vector
SRE.Luc
HA (VRK2A)β-actina
MPBEstimulación con PMA 20ng/ml 30 min.
0
2
4
6
8
10
HA-VRK2A (2µg)
Act
ivac
ión
rela
tiva
A
Vector
SRE.Luc
HA (VRK2A)β-actina
MP
Resultados
- 82 -
a nivel de la membrana plasmática pero también en la región citosólica próxima a la membrana,
debido a la internalización del mismo (Figura 42B). VRK2 no colocaliza con el receptor ErbB2
a nivel de la membrana plasmática (Figura 42B). Además, estas inmunofluorescencias nos
permiten descartar que, en estas condiciones, la sobreexpresión de ErbB2 pudiera regular
negativamente los niveles de expresión de VRK2 endógena (Figura 42B). Posteriormente y con
el objetivo de determinar si VRK2A podría estar regulando la ruta de H-Ras por un mecanismo
dependiente de su actividad quinasa, llevamos a cabo ensayos de luciferasa con el vector
cojofjfrfkdjfkjf
Figura 42. Modulación negativa de la ruta de señalización de ERK1/2, por parte de VRK2A, de forma independiente de actividad quinasa. A) Células MCF7 se transfectaron con 1μg del reportero SRE.Luc, 1,5 μg de pCDNA3-ErbB2 y las dosis indicadas de pCEFL-HA-VRK2A. B) Inmunofluorescencias mostrando la distribución intracelular del receptor ErbB2, sobreexpresado, detectado con un anticuerpo monoclonal específico y de la quinasa endógena VRK2A detectada con un anticuerpo policlonal específico, en MCF7. C) Se tranfectó 1μg del reportero SRE.Luc, 200 ng del plásmido pCEFL-H-RasG12V, junto con las dosis indicadas de pCEFL-HA-VRK2A o la quinasa inactiva pCEFL-HA-VRK2AK169E y el vector vacío correspondiente. Se representa la media de tres experimentos independientes, realizados por triplicado, analizados mediante la t de Student con respecto a la actividad del reportero activado por ErbB2 o H-RasG12V. *p<0,05; **p<0,005; ***p<0,0005.
Act
ivac
ión
rela
tiva
0100200300400500
* * *
VRK2AK169E (μg)
* *
* *
H-RasG12V (200 ng)
0 0,5 1,5 2,50
β-actinaRas
C
HA (VRK2A)
β-actinaRas
0100200300400500600
H-RasG12V (200 ng)
0,5 1 1,5
VRK2A (μg)
0
**
***
Act
ivac
ión
rela
tiva
0
AA
VRK2A (μg)
0
1
2
3
4
0 0 0,25 0,5 1,5 2,5
ErbB2 (1500 ng)
Act
ivac
ión
rela
tiva
***
**
HA (VRK2A)
β-actinaErbB2
B
HA (VRK2A)
SRE.Luc
SRE.Luc
MEZCLA VRK2 ErbB2
Act
ivac
ión
rela
tiva
0100200300400500
* * *
VRK2AK169E (μg)
* *
* *
H-RasG12V (200 ng)
0 0,5 1,5 2,50
β-actinaRas
C
HA (VRK2A)
β-actinaRas
0100200300400500600
H-RasG12V (200 ng)
0,5 1 1,5
VRK2A (μg)
0
**
***
Act
ivac
ión
rela
tiva
0
AA
VRK2A (μg)
0
1
2
3
4
0 0 0,25 0,5 1,5 2,5
ErbB2 (1500 ng)
Act
ivac
ión
rela
tiva
***
**
HA (VRK2A)
β-actinaErbB2
B
HA (VRK2A)
SRE.Luc
SRE.Luc
MEZCLA VRK2 ErbB2
Resultados
- 83 -
reportero SRE.Luc y sobreexpresando el mutante constitutivamente activo H-RasG12V, en
combinación con cantidades crecientes de la construcción pCEFL-HA-VRK2A (que codifica la
quinasa humana VRK2A silvestre) o bien de la construcción pCEFL-HA-VRK2AK169E (que
codifica el mutante quinasa inactivo de VRK2A) (Figura 42C). Tanto VRK2A silvestre como el
mutante quinasa inactivo son capaces de inhibir la activación transcripcional del SRE por H-
RasG12V, en similar medida. Es decir, en la línea celular MCF7, VRK2A es capaz de regular
negativamente la ruta de señalización de H-Ras, de forma independiente de su actividad quinasa
y por lo tanto a través de un mecanismo de acción que ha de estar basado en una interacción
proteína-proteína.
2.1.2 VRK2A modula negativamente la ruta de señalización de ERK1/2 actuando por
debajo de MEK1
Una vez confirmado que, en la línea celular MCF7, VRK2A sobreexpresada inhibe la
señalización de H-Ras, quisimos determinar a que nivel de la ruta de señalización mediada por
H-Ras estaba actuando. Para ello, llevamos a cabo ensayos de luciferasa con el reportero
kdjnke
SRE.Luc y cotransfectando los plásmidos pG12B-RafV600E o pFCMEK1, que codifican los
mutantes constitutivamente activos B-rafV600E y MEK1(CA) respectivamente, en combinación
con cantidades crecientes de pCEFL-HA-VRK2A (Figura 43). En ambos casos, VRK2A
Figura 43. VRK2A modula negativamente la ruta de señalización de ERK1/2, actuando por debajo de B-Raf y MEK1. Células MCF7, se transfectaron con 1 μg del reportero SRE.Luc, 200 ng del plásmido pG12B-RafV600E, que codifica el mutante constitutivamente activo B-RafV600E (A), o bien del plásmido pFC-MEK1 que codifica la construcción del mutante constitutivamente activo MEK1(S218/222E, Δ32-51) (B) y las dosis indicadas de pCEFL-HA-VRK2A o el vector vacío correspondiente. Se representa la media de tres experimentos independientes, realizados por triplicado, y analizados mediante la t de Student con respecto a la actividad del reportero activado por B-RafV600E o MEK1(CA). *p<0,05; **p<0,005; ***p<0,0005.
A
05
101520253035
B-RafV600E (200 ng)
*****
***
00 0,5 1,5 2,5
VRK2A (μg)
Act
ivac
ión
rela
tiva
HA (VRK2A)B-RafV600E
β-actina
B
010203040506070
0 0,5 1,5 2,5
* * *
* * ** * *
0
MEK1(CA) (50 ng)
VRK2A (μg)
Act
ivac
ión
rela
tiva
MEK1HA (VRK2A)
β-actina
SRE.Luc
A
05
101520253035
B-RafV600E (200 ng)
*****
***
00 0,5 1,5 2,5
VRK2A (μg)
Act
ivac
ión
rela
tiva
HA (VRK2A)B-RafV600E
β-actina
B
010203040506070
0 0,5 1,5 2,5
* * *
* * ** * *
0
MEK1(CA) (50 ng)
VRK2A (μg)
Act
ivac
ión
rela
tiva
MEK1HA (VRK2A)
β-actina
SRE.Luc
Resultados
- 84 -
sobreexpresada es capaz de inhibir la activación transcripcional del SRE. Es decir, VRK2A
inhibe la ruta de señalización de ERK1/2 actuando por debajo de B-Raf y de MEK1.
A la vista de los resultados anteriores, quisimos determinar si tal y como cabría esperar
la sobreexpresión de VRK2A se traducía en menores niveles de fosforilación de ERK1/2.
Transfectamos células MCF7 con los vectores pCDNA3-ErbB2 o pCEFL-H-RasG12V, en
combinación con 2,5 μg de la construcción pCEFL-HA-VRK2A o el correspondiente vector
vacío. A continuación, analizamos los niveles de expresión o fosforilación de un conjunto de
proteínas relacionadas con las rutas de señalización de ERK1/2 y AKT, mediante electroforesis
jdhjeff
con SDS en geles de poliacrilamida y western blot (Figura 44). Podemos observar como la
sobreexpresión de VRK2A se traduce en una disminución de los niveles de fosforilación de
ERK1/2, así como del sustrato de ERK1/2, p90RSK. En cambio, los niveles de fosforilación de
AKT y MEK1/2 no se ven afectados por la sobreexpresión de VRK2A. Por otro lado, los
niveles de expresión de algunas proteínas, relacionadas con el ciclo celular, como c-myc y
Ciclina D1 no se ven afectados por la sobreexpresión de ErbB2, H-RasG12V o VRK2A.
Posteriormente, quisimos verificar si, en la línea celular HEK293T, la sobreexpresión de
VRK2A también daba lugar a una disminución de los niveles de fosforilación de ERK1/2
Figura 44. Efecto de la sobreexpresión de VRK2A sobre los niveles de fosforilación de diversas proteínas de la ruta de señalización de ERK1/2 y AKT, en la línea celular MCF7. A) Western blot representativos mostrando los niveles de proteínas totales y fosforiladas en los residuos específicos que se indican en la figura, tras la sobreexpesión de 1,5 μg de ErbB2 y 2,5 μg de HA-VRK2A o vector vacío. B) Western blot representativos mostrando los niveles de proteínas totales y fosforiladas en los residuos específicos que se indican en la figura, tras la sobreexpesión de 200 ng de H-RasG12V y 2,5 μg de HA-VRK2A o el correspondiente vector vacío.
p-MEK 1/2 (S217/221)
HA (VRK2)
MEK 1/2
p-ERK1/2 (Y204)
ERK 1/2
p-AKT (S473)
AKT
ErbB2
c-myc
p-RSK (S380)
RSK
Ciclina D1
AErbB2
HA-V
RK2A
Vect
orVe
ctor
p-MEK 1/2 (S217/221)
B
HA-V
RK2A
H-RasG12V
Vect
orVe
ctor
HA (VRK2)
MEK 1/2
p-ERK1/2 (Y204)
ERK 1/2
p-AKT (S473)
AKT
c-myc
p-RSK (S380)
RSK
Ciclina D1
H-RasG12V
p-MEK 1/2 (S217/221)
HA (VRK2)
MEK 1/2
p-ERK1/2 (Y204)
ERK 1/2
p-AKT (S473)
AKT
ErbB2
c-myc
p-RSK (S380)
RSK
Ciclina D1
AErbB2
HA-V
RK2A
Vect
orVe
ctor
p-MEK 1/2 (S217/221)
B
HA-V
RK2A
H-RasG12V
Vect
orVe
ctor
HA (VRK2)
MEK 1/2
p-ERK1/2 (Y204)
ERK 1/2
p-AKT (S473)
AKT
c-myc
p-RSK (S380)
RSK
Ciclina D1
H-RasG12V
Resultados
- 85 -
(Figura 45). En paralelo, quisimos también evaluar si otras quinasas de la familia VRK ejercían
también este efecto, al ser sobreexpresadas. Tal y como se puede observar en la Figura 45, la
sobreexpresión de VRK2A, pero no de VRK1 o VRK2B, se traduce en una disminución de los
niveles de fosforilación de ERK1/2, sin afectar a los niveles de fosforilación de MEK1/2 y
AKT.
2.1.3 Modulación negativa de la respuesta a EGF por VRK2A El factor de crecimiento epidérmico (EGF) es uno de los ligandos capaces de unirse a
los receptores de la familia ErbB y activar, así, la ruta de señalización de ERK1/2 (Citri and
Yarden, 2006; Cohen, 1965; Cohen, et al., 1980; Cooper, et al., 1984; Massague and Pandiella,
1993). Para determinar si VRK2A podía participar en la modulación de la señalización por
ioopbfb
Figura 45. VRK2A, a diferencia de VRK1 y VRK2B, disminuye los niveles de fosforilación de ERK1/2, inducidos por ErbB2. Se transfectaron células HEK293T con 500 ng de pCDNA3-ErbB2 junto con 2,5 μg de los plámidos pCEFL-HA-VRK2A, pCEFL-HA-VRK1 o pCEFL-HA-VRK2B y, 48 horas después, los lisados se procesaron para western blot. Las proteínas totales o fosforiladas en los residuos indicados se detectaron con anticuerpos específicos.
Figura 46. Modulación por la quinasa VRK2A de la señalización inducida por el factor de crecimiento epidérmico (EGF). Se transfectaron células MCF7 con 1 μg del reportero SRE.Luc y las dosis indicadas de los vectores pCEFL-HA-VRK2A, pCEFL-HA-VRK1 o el vector vacío correspondiente. Tras 48 horas, se estimularon las células durante 30 minutos con una dosis 10nM de EGF en presencia de medio completo (10% FBS). Tras retirar el factor de crecimiento del medio, se mantuvieron las células durante 4 horas en medio completo para permitir la expresión de la proteína luciferasa, antes de procesar los extractos y medir la actividad luciferasa. La correcta expresión de las proteínas transfectadas se corroboró mediante western blot. Los experimentos se realizaron al menos tres veces por triplicado y se analizaron mediante la t de Student con respecto a la actividad del reportero activado por EGF, ***( P˂0,0005).
β-actina
Vector
Vector
VRK2A (0
,5 μg
)
VRK2A (1
μg)
VRK2A (2
,5 μg
)
VRK1 (2,5
μg)
0
1
2
3
4
5
6
7
Act
ivac
ión
rela
tiva
EGF 10 nM (30 min)
******
***
HA (VRK)
SRE.Luc
β-actina
Vector
Vector
VRK2A (0
,5 μg
)
VRK2A (1
μg)
VRK2A (2
,5 μg
)
VRK1 (2,5
μg)
0
1
2
3
4
5
6
7
Act
ivac
ión
rela
tiva
EGF 10 nM (30 min)
******
***
HA (VRK)
SRE.Luc
ErbB2
VRK2
AVR
K1VR
K2B
HA ( VRKs)
p-ERK1/2 (Y204)
ERK 1/2
p-AKT(S473)
AKT
ErbB2
p-MEK 1/2 (S217/221)
MEK 1/2
Vecto
rVe
ctor
ErbB2
VRK2
AVR
K1VR
K2B
HA ( VRKs)
p-ERK1/2 (Y204)
ERK 1/2
p-AKT(S473)
AKT
ErbB2
p-MEK 1/2 (S217/221)
MEK 1/2
Vecto
rVe
ctor
Resultados
- 86 -
EGF, llevamos a cabo ensayos de luciferasa en células MCF7. Cotransfectamos el plásmido
reportero SRE.Luc, en combinación con dosis crecientes del plásmido pCEFL-HA-VRK2A o
una cantidad máxima de pCEFL-HA-VRK1 (Figura 46). Tras 48 horas, estimulamos las células
con una concentración 10 nM del factor de crecimiento epidérmico (EGF), durante 30 minutos.
Esperamos 4 horas y procesamos los extractos para medir la actividad luciferasa. Corroboramos,
de esta manera, que VRK2A es capaz de inhibir la activación transcripcional del SRE por EGF.
En cambio, la sobreexpresión de VRK1 no afecta a la señalización por EGF (Figura 46).
A continuación, nos planteamos si VRK2A podría estar afectando a la expresión de la
Ciclina D1, una de las dianas transcripcionales clásicas de EGF. Para confirmar si, a través de la
modulación negativa de la respuesta a EGF, VRK2A podría estar inhibiendo la transcripción del
gen de la Ciclina D1, llevamos a cabo ensayos de luciferasa empleando un reportero de
luciferasa bajo el control del promotor de la Ciclina D1. Transfectamos las células con el
reportero pACiclinaD1(-1720).Luc en combinación con los plásmidos pCEFL-HA-VRK2A o
bien pCEFL-GST-VRK1 o el correspondiente vector vacío. Tras 36 horas, deprivamos a las
células de suero durante 12 horas y posteriormente las estimulamos durante 6 horas con EGF.
La estimulación con EGF activa la transcripción del promotor de la Ciclina D1 (Figura 47). A
su vez, la sobreexpresión de VRK2A inhibe la activación transcripcional del promotor de la
Ciclina D1 por EGF. Por el contrario, la sobreexpresión de VRK1 se traduce en una mayor
activación transcripcional del promotor de la Ciclina D1, en respuesta a EGF. Este resultado
concuerda con la capacidad de VRK1 de inducir la expresión de la Ciclina D1, a través de la
fosforilación del factor de transcripción CREB (Kang, et al., 2008).
Por lo tanto, hasta el momento, hemos determinado que VRK2A sobreexpresada, a
través de la inhibición de la ruta de señalización de ERK1/2, es capaz de reprimir la respuesta a
la estimulación con PMA y EGF.
Figura 47. VRK2A inhibe la activación transcripcional del promotor de la Ciclina D1 por el factor de crecimiento epidérmico (EGF). Células MCF7 fueron transfectadas con 1 μg del vector pACiclinaD1(-1720)-Luc, en combinación con 2,5 μg del vector pCEFL-HA-VRK2A o bien pCEFL-GST-VRK1 o del correspondiente vector vacío. Tras 36 horas, los cultivos fueron deprivados de suero durante 12 horas y posteriormente estimulados con una concentración de EGF 10 nM durante 6 horas. **(P˂0,001). ***( P˂0,0005).
0
1
2
3
4
5
6
7
8
Act
ivac
ión
rela
tiva
GST-V
RK1
**
EGF 10 nM (6 h)
Vecto
r
Vecto
r
***
0
1
2
3
4
5
6
7
8
Act
ivac
ión
rela
tiva
HA-V
RK2A
CiclinaD.Luc
Vecto
r
Vecto
r
***
0
1
2
3
4
5
6
7
8
Act
ivac
ión
rela
tiva
GST-V
RK1
**
EGF 10 nM (6 h)
Vecto
r
Vecto
r
***
0
1
2
3
4
5
6
7
8
Act
ivac
ión
rela
tiva
HA-V
RK2A
CiclinaD.Luc
Vecto
r
Vecto
r
***
Resultados
- 87 -
2.2 Efecto del silenciamiento de la expresión de VRK2 en la ruta de señalización de ERK1/2 2.2.1 Estudios en la línea celular HeLa
Hasta ahora, hemos demostrado que VRK2A sobreexpresaba modula negativamente la
ruta de señalización de ERK1/2, actuando por debajo de MEK1. Quisimos, a continuación,
complementar estos resultados con experimentos de silenciamiento de la expresión de VRK2.
En primer lugar, intentamos silenciar la expresión de VRK2 en la línea celular de
adenocarcinoma de mama MCF7, mediante la introducción de oligonucleótidos de ARN de
interferencia de forma transitoria. Las quinasas VRK2 son proteínas muy estables, de larga vida
media. Probablemente por este motivo, nos fue imposible silenciar la expresión de VRK2 en
Figura 48. Efecto de la supresión de VRK2, mediante ARNi específico, en la respuesta a EGF. A) Representación gráfica de los niveles de ARN mensajero de VRK2 en células MCF7 tratadas durante 48 horas con un ARN de interferencia control (si-Control) o un ARN de interferencia específico para VRK2 (si-VRK2-06). Los niveles de ARN mensajero se detectaron mediante RT-PCR cuantitativa con oligonucleótidos específicos para VRK2 y se normalizaron respecto a los obtenidos para la proteína GAPDH. B) Western blot mostrando como los niveles de proteína de VRK2A y VRK2B no varían tras 96 horas de tratamiento en MCF7 con los ARN de interferencia específicos para VRK2 (si-VRK2-06) respecto al tratamiento con si-Control, a pesar de la caída en el ARN mensajero que se observa en el apartado A. En cambio, en la línea celular HeLa hay una drástica reducción de los niveles de VRK2 tras el mismo tratamiento. Ambas líneas celulares, MCF7 y HeLa, se transfectaron con los ARN si-Control o si-VRK2-06 y, 48 horas después, se retransfectaron con 1 μg del reportero SRE.Luc. Tras 44 horas más, se estimularon las células en medio completo con una dosis 10nM de EGF, durante 10 min en HeLa y 30 min en MCF7 y se esperaron 4 horas antes de procesar los extractos para medir la actividad luciferasa. Se representa la media de tres experimentos independientes, por triplicado, analizados mediante la t de Student con respecto a la actividad del reportero no activado por EGF. *p<0,05; **p<0,005; ***p<0,0005.
si-Control si-VRK2-06
0
0,2
0,40,6
0,8
1
1,2
ARNm VRK2
MCF7
Niv
eles
rela
tivos
de
AR
Nm
de
VRK
2
A
si-V
RK
2-06
β-actina
VRK2A
si-C
ontro
l
VRK2B
MCF7
si-C
ontro
l
si-V
RK
2-06
HeLa
0
20
40
60
80
100
120
si-Control
EGFMCF7
si-VRK2-06
*
*EGFHeLa
Act
ivac
ión
rela
tiva
B
SRE.Luc
si-Control si-VRK2-06
0
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1,2
ARNm VRK2
MCF7
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VRK
2
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si-Control si-VRK2-06
0
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1,2
ARNm VRK2
MCF7
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VRK
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β-actina
VRK2A
si-C
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l
VRK2B
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2-06
HeLa
0
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120
si-Control
EGFMCF7
si-VRK2-06
*
*EGFHeLa
Act
ivac
ión
rela
tiva
B
SRE.Luc
Resultados
- 88 -
MCF7. En esta línea celular, el tratamiento con el oligonucleótido si-VRK2-06 es capaz de
reducir la expresión del ARNm de VRK2 (ambas isoformas) en aproximadamente un 80%
(Figura 48A). Sin embargo, los niveles de expresión proteica de VRK2A y VRK2B permanecen
constantes incluso tras 96 horas de tratamiento con el ARN de interferencia (Figura 48B). Por
este motivo, finalmente llevamos a cabo el silenciamiento de VRK2 en la línea celular HeLa. En
esta línea celular, el tratamiento con el oligonucleótido si-VRK2-06 silencia la expresión de
VRK2, a nivel de proteína, de forma muy eficiente (Figura 48B). A continuación, una vez
tratadas ambas líneas celulares con los oligonucleótidos si-VRK2-06 o si-Control (que carece de
dianas en eucariotas), llevamos a cabo ensayos de luciferasa transfectando el reportero
SRE.Luc, para intentar determinar si la respuesta a EGF se ve afectada en ausencia de VRK2.
En la línea celular MCF7, en la que el tratamiento con el ARN si-VRK2-06 no es capaz de
silenciar la expresión de VRK2, la activación transcripcional del SRE por EGF no se ve afectada
por el tratamiento con este oligonucleótido (Figura 48B). En cambio, en la línea celular Hela,
donde el ARN de interferencia silencia la expresión de VRK2 de forma muy eficiente, el
tratamiento con el oligonucleótido si-VRK2-06 se traduce en una mayor activación
transcripcional del SRE tanto en condiciones basales como en respuesta a EGF (Figura 48B).
Hay que tener en cuenta que, en la línea celular HeLa, los oligonucleótidos de ARN de
interferencia empleados silencian la expresión de ambas isoformas VRK2A y VRK2B
simultáneamente. Por lo tanto, los efectos observados tras el silenciamiento, pueden deberse a la
falta de cualquiera de las dos isoformas o a la combinación de la carencia de ambas. Sin
embargo, los resultados observados en los experimentos de sobreexpresión, tanto en HEK293T
como en MCF7, sugieren que la existencia de una repuesta anómala a EGF ha de estar
relacionada con del silenciamiento de la isoforma VRK2A. Aún así, quisimos verificar que en la
línea celular HeLa la sobreexpresión de VRK2A también estaba inhibiendo la ruta de
señalización de ERK1/2 y la respuesta a EGF.
Por este motivo, llevamos a cabo ensayos de luciferasa, en la línea celular HeLa,
transfectando el reportero SRE.Luc, en combinación con 200 ng del plásmido pCEFL-H-
RasG12V y dos cantidades diferentes del plásmido pCEFL-HA-VRK2A o pCEFL-HA-VRK1
(Figura 49A). Además, quisimos silenciar la expresión de la quinasa sobreexpresada (HA-
VRK2A) mediante el empleo, en este caso, de una combinación de dos vectores small hairpins,
pSUPERIOR-VRK2-230 y pSUPERIOR-VRK2-1335 (sh-pool). Ambos vectores codifican
ARNs de interferencia para VRK2A y VRK2B. Tal y como esperabamos, la sobreexpresión de
VRK2A inhibe la activación transcripcional del SRE por H-RasG12V. El silenciamiento de la
quinasa sobreexpresada permite recuperar los niveles iniciales de acividad luciferasa (Figura
Resultados
- 89 -
49A). Por otro lado, la sobreexpresión de VRK1 no tiene ningún efecto. Además, a nivel de
nkjklk
western blot, podemos observar como si bien la sobreexpresión de H-RasG12V incrementa los
niveles de fosforilación de ERK1/2, la cotransfección de HA-VRK2A se traduce en una
disminución de la fosforilación de ERK1/2. Así mismo, cuando silenciamos la expresión de
HA-VRK2A transfectada mediante la combinación de los vectores small hairpins,
pSUPERIOR-VRK2-230 y pSUPERIOR-VRK2-1335 (sh pool), se recuperan los niveles de
fosforilación de ERK1/2 casi totalmente (Figura 49B).
Dado que la ruta de señalización de ERK1/2 se activa en respuesta a estímulos como
suero (FBS) o EGF (Cooper, et al., 1984; Chambard, et al., 2007; Gille, et al., 1995; Prins, et al.,
1982), quisimos evaluar si VRK2A era capaz de inhibir la respuesta a la estimulación con suero
o EGF. Así, transfectamos células HeLa con el vector reportero SRE.Luc en combinación con
las cantidades indicadas de pCEFL-HA-VRK2A o pCEFL-HA-VRK1 (Figura 50A).
Transcurridas 4 horas después de la transfección, se mantuvieron las células control durante 48
horas en medio con 0% FBS (sin suero) y el resto de las células se cultivaron en medio con 10%
FBS. En estas condiciones, podemos apreciar como la sobreexpresión de VRK2A inhibe la
activación del SRE por los factores de crecimiento presentes en el suero, en aproximadamente
un 60%. En cambio, la sobreexpresión de VRK1 no tiene un efecto significativo sobre la
Figura 49. La sobreexpresión de VRK2A inhibe la ruta de señalización de ERK1/2 por debajo de H-Ras, en la línea celular HeLa. A) Se transfectaron células HeLa con las cantidades indicadas de los plásmidos pCEFL-H-RasG12V , pCEFL-HA-VRK1 y pCEFL-HA-VRK2A junto con las cantidades correspondientes de vector vacío o una combinación (sh-pool) de los plásmidos pSUPERIOR-VRK2-230 y 1335, que interfieren con la expresión de la quinasa VRK2A sobreexpresada. 48 horas después de la transfección, se recogieron los extractos y se midió la actividad luciferasa. B) Western blot representativos mostrando los niveles de expresión de HA-VRK2A en cada caso y los niveles de fosforilación de ERK y ERK total como control de carga.
B
0
10
20H-RasG12V (200 ng)
HA-VRK2A (1 μg)
HA-VRK2A (2 μg)
HA-VRK1 (2 μg
)
HA-VRK2A
HA-VRK2A + sh-pool
HA-VRK1A
Act
ivac
ión
rela
tiva
Vector
HA-VRK2A
H-RASGV12 ( 200ng )
HA (VRK2)p-ERK 1/2
ERK 1/2
Sh-pool +
H-RasG12V
+ ++++
SRE.Luc
B
0
10
20H-RasG12V (200 ng)
HA-VRK2A (1 μg)
HA-VRK2A (2 μg)
HA-VRK1 (2 μg
)
HA-VRK2A
HA-VRK2A + sh-pool
HA-VRK1A
Act
ivac
ión
rela
tiva
Vector
HA-VRK2A
H-RASGV12 ( 200ng )
HA (VRK2)p-ERK 1/2
ERK 1/2
Sh-pool +
H-RasG12V
+ ++++
SRE.Luc
Resultados
- 90 -
activación del SRE por suero (Figura 50A). Además, como se observa en la Figura 50A, cuando
silenciamos la expresión de VRK2A sobreexpresada, mediante el empleo de la combinación de
vectores pSUPERIOR-VRK2-230 y pSUPERIOR-VRK2-1335, (sh-pool), la actividad
luciferasa se recupera hasta niveles similares a los de las células, transfectadas con vector vacío,
en medio con 10%FBS (Figura 50A).
Finalmente, tras observar que, en la línea celular HeLa, el silenciamiento de VRK2
incrementa la respuesta a EGF, quisimos verificar que la sobreexpresión de VRK2A y no de
VRK2B era la responsable de la modulación de la respuesta a EGF. Para ello, llevamos a cabo
nuevos ensayos de luciferasa con el reportero SRE.Luc, sobreexpresando las cantidades
indicadas de pCEFL-HA-VRK2A, pCEFL-HA-VRK1 o pCEFL-HA-VRK2B y estimulando las
células con una dosis 10 nM de EFG durante 10 minutos (Figura 50B). Podemos observar que la
sobreexpresión de VRK2A inhibe la activación del SRE por EGF, de forma dosis dependiente.
En cambio, la sobreexpresión de VRK2B no afecta a la respuesta a EGF. Observamos también
que la sobreexpresión de 2 μg de VRK1 parece, en este caso, tener un discreto efecto
inhibitorio, probablemente artefactual o indirecto, dado que no se observaba, por ejemplo, en la
línea celular MCF7 (Figura 46). Por lo tanto, tanto los resultados de sobreexpresión de la
quinasa humana VRK2A como los experimentos de silenciamiento de VRK2 indican de forma
consistente que esta quinasa modula la respuesta a EGF.
Figura 50. En la línea celular HeLa, VRK2A modula la respuesta a EGF y a los factores de crecimiento presentes en el suero. A) Se transfectaron 2 μg de HA-VRK2A y HA-VRK1 junto con el vector vacío correspondiente o 2 μg de los sh-pool que interfieren con la expresión de HA-VRK2A. Las células se mantuvieron durante 48 horas en 0% o 10% FBS según lo indicado, tras lo cual se lisaron los extractos y se midió la actividad luciferasa. B) Se transfectaron las cantidades indicadas de las quinasas, junto con 1 μg del reportero de luciferasa SRE.Luc. Tras 48 horas, se estimularon las células 10 min con EGF 10nM y 4 horas después, se recogieron los extractos y se midió la actividad luciferasa. Western blot representativos mostrando la expresión de las proteínas transfectadas. p˂0,05.
VRK2A (µg)
0
1
2
3
4
Vector - 1 1,5 2 VRK1(2 μg)
VRK2B(2 μg)
EGF 10nM (10 min)
Act
ivac
ión
rela
tiva
BA
0
50
100
150
200
25010 % FBS 48h
Act
ivac
ión
rela
tiva
HA-VRK2A (2μg)
HA-VRK2A (2 μg +sh-pool 2 μg)
HA-VRK1 (2μg)
0% FBS 48
h
Vector
α-HA (VRK)
β-actina
**
*
SRE.Luc
VRK2A (µg)
0
1
2
3
4
Vector - 1 1,5 2 VRK1(2 μg)
VRK2B(2 μg)
EGF 10nM (10 min)
Act
ivac
ión
rela
tiva
BA
0
50
100
150
200
25010 % FBS 48h
Act
ivac
ión
rela
tiva
HA-VRK2A (2μg)
HA-VRK2A (2 μg +sh-pool 2 μg)
HA-VRK1 (2μg)
0% FBS 48
h
Vector
α-HA (VRK)
β-actina
**
*
SRE.Luc
Resultados
- 91 -
Dado que VRK2A está inhibiendo la ruta de señalización de ERK1/2, cabría esperar que
su silenciamiento se tradujera en mayores niveles de fosforilación de ERK1/2. Para evaluar esta
posibilidad, silenciamos la expresión de VRK2 en la línea celular HeLa. Empleamos, en este
caso, dos ARNs de interferencia diferentes, si-VRK2-05 y si-VRK2-06, tanto por separado
como en combinación (Figura 51). Tras tiempos prolongados (96 horas) de tratamiento con los
ARN de interferencia, procesamos los extractos celulares para llevar a cabo western blot.
Pudimos comprobar que tan sólo el oligonucleótido si-VRK2-06 es capaz de silenciar la
expresión de VRK2A y VRK2B y, por ende, también la combinación de ambos ARNs. Tal y
como vemos en la Figura 51A, el silenciamiento de la expresión de VRK2 (dos últimos carriles)
se traduce en significativos incrementos en los niveles de fosforilación de ERK1/2, en el residuo
tirosina 204. Si cuantificamos la intensidad de las bandas y calculamos la media de tres
experimentos, vemos como el tratamiento con el oligonucleótido si-VRK2-06 silencia la
expresión de VRK2 en torno a un 60% y esto supone un incremento, de aproximadamente, unas
seis veces de los niveles basales de fosforilación de ERK1/2 (Figura 51B).
A continuación, quisimos corroborar el resultado anterior a través de
inmunofluorescencia. Para ello, transfectamos células HeLa con los oligonucleótidos de ARN
de interferencia si-Control y si-VRK2-06. Tras 96 horas, procesamos las células para
inmunofluorescencia marcando la proteína VRK2 en rojo y ERK1/2 fosforilado en verde.
Cuando disminuimos los niveles de expresión de VRK2 (rojo), observamos mayores niveles de
marcaje verde, correspondiente a la fosforilación de ERK1/2 en la tirosina 204 (Figura 52). En
ambos casos, ERK1/2 fosforilado se localiza tanto en el núcleo como en el citosol.
Figura 51. El silenciamiento de VRK2, en la línea celular HeLa, se traduce en un significativo incremento de los niveles de fosforilación de ERK1/2 en el residuo Tyr 204. A) Western blot tras el tratamiento de células HeLa durante 96 horas con los ARN de interferencia indicados. B) En la gráfica se muestra la cuantificación y normalización respecto a la β-actina de la expresión de VRK2 y p-ERK1/2 tras el tratamiento con si-Control y si-VRK2-06. La cuantificación de los niveles relativos de proteína se llevó a cabo mediante el programa Quantity One (BIO-RAD). Se representaron gráficamente los valores medios de tres experimentos independientes.
si-Controlsi-VRK2- 06
01234567
VRK2 p-ERK1/2
Niv
eles
de
expr
esió
n re
lativ
os
VRK2β-actina
p-ERK1/2
ERK1/2
si-C
ontro
l
si-V
RK2
-05
si-V
RK2
-06
si-V
RK2
-(05+
06) HeLa
A B
si-Controlsi-VRK2- 06
01234567
01234567
VRK2 p-ERK1/2
Niv
eles
de
expr
esió
n re
lativ
os
VRK2β-actina
p-ERK1/2
ERK1/2
si-C
ontro
l
si-V
RK2
-05
si-V
RK2
-06
si-V
RK2
-(05+
06) HeLa
A B
Resultados
- 92 -
Por último, quisimos evaluar si en estas células, en las que silenciábamos la expresión
de VRK2, los niveles de activación de MEK1/2 y AKT se veían afectados. Los experimentos de
sobreexpresión nos indicaban que VRK2A estaba afectando a la activación de ERK1/2, por
hjkjhjkn
si-C
ontro
l
si-V
RK2-
06
VRK2
p-ERK(Y204)
ERK1/2
p-MEK(S217/221)
β-actina
p-AKT(S473)MEK
AKT
c-myc
si-C
ontro
l
si-V
RK2-
06
VRK2
p-ERK(Y204)
ERK1/2
p-MEK(S217/221)
β-actina
p-AKT(S473)MEK
AKT
c-myc
Figura 53. El silenciamiento de VRK2 se traduce en un incremento de los niveles de p-ERK1/2 sin afectar a la activación de MEK1/2 ni a la ruta de AKT. Células HeLa se transfectaron con los correspondientes oligonucleótidos de ARN de interferencia y, 96 horas después, se recogieron los extractos y se analizaron por Western blot con anticuerpos específicos que detectan las proteínas totales o fosforiladas en los residuos indicados.
Figura 52. Inmunofluorescencias mostrando los niveles de expresión de VRK2 y de la fosforilación de ERK1/2, en células HeLa tratadas con ARN de interferencia control (si-Control) o ARN para VRK2 (si-VRK2-06), durante 96 horas. VRK2 se detectó con un anticuerpo policlonal (rojo) y la fosforilación de ERK 1/2, en Tyr 204, con un anticuerpo monoclonal (verde). Los núcleos se marcan con DAPI (azul). La barra indica 50 μm.
si-Control si-VRK2
VRK2 VRK2p-ERK p-ERK
50 µm 50 µm50 µm
50 µm 50 µm
50 µm
50 µm 50 µm
si-Control si-VRK2
VRK2 VRK2p-ERK p-ERK
50 µm50 µm 50 µm50 µm50 µm50 µm
50 µm50 µm 50 µm50 µm
50 µm50 µm
50 µm50 µm 50 µm50 µm
Resultados
- 93 -
debajo de MEK1/2 y sin afectar a AKT. En concordancia con estos resultados, el silenciamiento
de VRK2 se traduce, a nivel de western blot, en un incremento en los niveles de fosforilación de
ERK1/2 sin afectar a la activación de MEK1/2 y AKT (Figura 53). Por lo tanto, VRK2 parece
estar regulando la ruta de señalización de ERK1/2 de forma muy específica, actuando por
debajo de MEK1/2 y no afectando a la activación de otras rutas controladas por ErbB2 como la
de AKT. Por otro lado, los niveles de la proteína c-myc, relacionada con proliferación, no se
ven alterados tras el silenciamiento de la expresión de VRK2.
2.2.2 Estudios en la línea celular MDA-MB-231
Para confirmar la regulación negativa de la ruta de señalización de ERK1/2 como
posible mecanismo que explique la disminución de la expresión de VRK2 en tumores ErbB2
positivos, quisimos llevar a cabo experimentos silenciando la expresión de VRK2 en líneas
celulares de mama. Como ya se ha comentado previamente, nos resultó imposible silenciar la
expresión de VRK2 en la línea celular de mama de tipo luminal MCF7 (Figura 48B). Pasamos
entonces a evaluar la eficacia del ARN de interferencia si-VRK2-06, en las líneas celulares de
mama MDA-MB-435, SKBR3 y MDA-MB-231. Transfectamos las tres líneas celulares con los
respectivos oligonucleótidos de ARN de interferencia y, 48 horas después, llevamos a cabo una
RT-PCR cuantitativa para determinar los niveles de ARNm de VRK2 (Figura 54A). En la
Figura 51A, representamos gráficamente los niveles de ARNm de VRK2, normalizados, para
cada línea celular tras el tratamiento con si-Control o si-VRK2-06, respectivamente. En los tres
casos, el oligonucleótido es capaz de disminuir los niveles de ARNm de VRK2 de forma
bastante eficiente. Sin embargo, cuando comprobamos los niveles de expresión de la proteína a
nivel de western blot observamos que en las líneas celulares MDA-MB-435 y SKBR3 los
niveles de proteína se mantienen constantes tras el tratamiento con el oligonucleótido de ARN
de interferencia si-VRK2-06. Es decir que, si bien el ARN de interferencia específico para
VRK2 es eficaz disminuyendo la expresión del ARN mensajero, la proteína VRK2 es muy
estable en estas líneas celulares. En cambio, en la línea celular MDA-MB-231, el tratamiento
con el oligonucleótido si-VRK2-06 sí que es capaz de silenciar la expresión de VRK2, a nivel
proteico (Figura 54B). Estos resultados nos indican que la estabilidad de VRK2A y VRK2B
varía enormemente en función del tipo celular.
El silenciamiento de la expresión de VRK2, en la línea celular MDA-MB-231, se
traduce en un incremento moderado en los niveles de fosforilación de ERK1/2 (Figura 54B). El
hecho de que, en esta línea celular, el incremento en la activación de ERK1/2 al disminuir la
jkkl
Resultados
- 94 -
Figura 54. Diferente estabilidad de la proteína VRK2 humana, en función de la línea celular. Silenciamiento de VRK2 en la línea de mama MDA-MB-231 y sus implicaciones en la ruta de señalización de ERK 1/2. A) Representación gráfica de los niveles de ARN mensajero de VRK2 en células MDA-MB-435, SKBR3 y MDA-MB-231, tratadas durante 48 h con un ARN de interferencia control (si-Control) o un ARN de interferencia específico para VRK2 (si-VRK2-06). Western blot empleando anticuerpos específicos en las líneas celulares MDA-MB-435 y SKBR3, tras el tratamiento con si-Control y si-VRK2-06. B) Western blot con anticuerpos específicos mostrando la detección de las proteínas totales y fosforiladas y cuantificación de los niveles de expresión de VRK2 y ERK fosforilado en Tyr 204 respecto a la β-actina. C) Western blot comparando los niveles de expresión de VRK2 y ERK total y fosforilado en varias líneas celulares. D) Células MDA-MB-231 con producción autocrina de EGF, se trataron durante 96 h con si-Control o si-VRK2-06, tras lo cual se procesaron los extractos y se midió la actividad luciferasa.
si-VR
K2-0
6
VRK2
β-actina
si-Co
ntro
l
MDA-MB-435
p-ERK1/2ERK1/2
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
Niv
eles
rela
tivos
de
AR
Nm
de V
RK
2
MDA-MB-435 MDA-MB-231
si-Control
si-VRK2-06
0
1
2
si-Controlsi-VRK2-06
0
1
2
VRK2 p-ERK1/2
MDA-MB-231
Niv
eles
de
expr
esió
n re
lativ
os
VRK2β-actina
p-ERK 1/2
ERK 1/2
HeL
aC
al51
MD
A-M
B-23
1M
CF7
VRK2
β-actina
p-ERK 1/2
ERK 1/2
si-Co
ntro
lsi-
VRK2
-06
MDA-MB-231
p-MEK1/2
MEK1
si-Control si-VRK2-06
2
4
6
MDA-MB-231
Act
ivac
ión
rela
tiva (EGF autocrino) si
-Con
trol
si-V
RK
2-06
β-actinaVRK2
MDA-MB-231
A
B C
D
si-VR
K2-0
6
si-Co
ntro
l
SKBR3
SKBR3
si-VR
K2-0
6
VRK2
β-actina
si-Co
ntro
l
MDA-MB-435
p-ERK1/2ERK1/2
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
Niv
eles
rela
tivos
de
AR
Nm
de V
RK
2
MDA-MB-435 MDA-MB-231
si-Control
si-VRK2-06
0
1
2
si-Controlsi-VRK2-06
0
1
2
VRK2 p-ERK1/2
MDA-MB-231
Niv
eles
de
expr
esió
n re
lativ
os
VRK2β-actina
p-ERK 1/2
ERK 1/2
HeL
aC
al51
MD
A-M
B-23
1M
CF7
VRK2
β-actina
p-ERK 1/2
ERK 1/2
si-Co
ntro
lsi-
VRK2
-06
MDA-MB-231
p-MEK1/2
MEK1
si-Control si-VRK2-06
2
4
6
MDA-MB-231
Act
ivac
ión
rela
tiva (EGF autocrino) si
-Con
trol
si-V
RK
2-06
β-actinaVRK2
MDA-MB-231
A
B C
D
si-VR
K2-0
6
si-Co
ntro
l
SKBR3
SKBR3
Resultados
- 95 -
expresión de VRK2 sea mucho menor del observado en HeLa, probablemente sea debido a los
elevados niveles basales de fosforilación de ERK1/2 en MDA-MB-231 respecto a otras líneas
celulares (Figura 54C).
Posteriormente quisimos evaluar si, en la línea celular MDA-MB-231, VRK2A es capaz
de modular también la respuesta a EGF. En esta línea celular, la estimulación con EGF no es
capaz de activar la transcripción del SRE ni la fosforilación de ERK1/2 debido a que presenta
secreción autocrina de EGF (Martinez-Carpio, et al., 1999). Cuando silenciamos la expresión de
VRK2, en esta línea celular, se observa un incremento de en torno a unas cuatro veces en la
activación transcripcional del SRE, en condiciones de secreción autocrina de EGF (Figura 54D).
3. Valoración de proteínas de la ruta de señalización de ERK1/2 candidatas a
interaccionar con VRK2
Hasta el momento, hemos demostrado que VRK2A inhibe la ruta de señalización de
ERK1/2 por un mecanismo independiente de su actividad quinasa y que, por lo tanto, ha de
estar basado en una interacción proteína-proteína. Por este motivo, nos planteamos evaluar la
posible interacción de VRK2A con proteínas de la ruta de señalización de ERK1/2.
3.1 VRK2A no interacciona con las principales fosfatasas de la ruta de señalización de
ERK1/2
Al poco tiempo de iniciar este trabajo, una publicación describía como la quinasa VRK3
interaccionaba con la fosfatasa VHR. A través de la activación de la actividad de esta fosfatasa,
VRK3 era capaz de inhibir la ruta de señalización de ERK1/2 (Kang and Kim, 2006). Si bien
VRK2A y VRK3 presentan sólo un 23% de identidad de secuencia, VRK3 presenta una región
altamente conservada que se cree que participa en el establecimiento de interacciones clave
(Nichols and Traktman, 2004; Scheeff, et al., 2009). Por otro lado, VHR presenta una
localización tanto nuclear como citosólica (Bayón, 2010). Teniendo en cuenta estos datos, VHR
kñk
Figura 55. La quinasa humana VRK2A no interacciona con la fosfatasa VHR. Se transfectaron células HEK293T con las construcciones pCEFL-GST, pCEFL-GST-VRK3, pCEFL-GST-VRK2A, pCEFL-GST-VRK1 o pCEFL-GST-VRK2B, en combinación con el plásmido que codifica la construcción HA-VHR y los correspondientes vectores vacíos. Se llevaron a cabo experimentos de Pull-Down (PD), precipitando las proteínas de fusión con GST con la resina Glutatión Sefarosa. A continuación, se analizó a través de western blot el contenido de los precipitados y de los extractos totales empleando anticuerpos específicos. Lisado total Pull-Down
GST-VRKs
HA-VHR
GST
GST
-VR
K3
GST
-VR
K2A
GST
-VR
K1
GST
-VR
K2B
GST
GST
-VR
K3
GST
-VR
K2A
GST
-VR
K1
GST
-VR
K2B
PD
Lisado total Pull-Down
GST-VRKs
HA-VHR
GST
GST
-VR
K3
GST
-VR
K2A
GST
-VR
K1
GST
-VR
K2B
GST
GST
-VR
K3
GST
-VR
K2A
GST
-VR
K1
GST
-VR
K2B
PD
Resultados
- 96 -
nos parecía una candidata idónea a estar interaccionando con VRK2A y explicar así el
mecanismo de modulación negativa de la ruta de señalización de ERK1/2.
Pasamos entonces a evaluar la posible interacción de VRK2A con VHR. Para ello,
llevamos a cabo experimentos de Pull-Down empleando construcciones de las diferentes
quinasas de la familia VRK, unidas al epítopo GST, o bien el vector vacío pCEFL-GST, en
combinación con una construcción de la fosfatasa VHR, unida al epítopo HA. Pudimos
comprobar que, a diferencia de VRK3 y VRK1, VRK2A no interaccionaba con la fosfatasa
VHR (Figura 55).
Con la intención de descartar definitivamente una posible interacción entre VHR y
VRK2, llevamos a cabo inmunoprecipitaciones de HA-VHR en las líneas celulares HEK293T y
MCF7. En ninguno de los casos pudimos detectar la presencia de VRK2 endógena en el
inmunoprecipitado de HA-VHR (Figura 56). Por lo tanto, descartamos totalmente la posibilidad
de que VRK2A pudiera estar modulando la ruta de señalización de ERK1/2 a través de la
interacción con la fosfatasa VHR.
A continuación, consideramos la posibilidad de que VRK2A pudiera estar
interaccionando y regulando a otras fosfatasas de ERK1/2, diferentes a VHR. Quisimos evaluar
la posible interacción de VRK2A con MKP1, MKP2 y muy en especial con la fosfatasa
citosólica MKP3. Llevamos a cabo experimentos de Pull-Down en la línea celular HEK293T
transfectando, en primer lugar, tanto una construcción que codifica la fosfatasa MKP2 ligada al
epítopo Myc, como las construcciones pCEFL-GST, pCEFL-GST-VRK2A, o bien pCEFL-
GST-VRK2AKD (Figura 57). Precipitamos las proteínas de fusión con GST, empleando la
resina Glutatión Sefarosa, pero no pudimos detectar la presencia de Myc-MKP2 en el
precipitado de GST-VRK2A ni GST-VRK2AKD. De forma similar, evaluamos la posible
Figura 56. VRK2 endógena no interacciona con la fosfatasa VHR. Se transfectaron células HEK293T (A) y MCF7 (B) con la construcción pCEFL-HA-VHR Tras 48 horas, se prepararon los extractos celulares y se llevaron a cabo inmunoprecipitaciones (IP). Se empleó un anticuerpo anti-Myc (α-Myc) monoclonal como inmunoprecipitación inespecífica. La proteína HA-VHR se inmunoprecipitó empleando un anticuerpo monoclonal para el epítopo HA. Se detectó la presencia de las proteínas de interés mediante western blot, tanto en los lisados totales como en los inmunoprecipitados. En ninguno de los casos se detectó la presencia de VRK2 endógena en el inmunoprecipitado de VHR.
VRK2
HA-VHR
Lisado total IP α
-HA
-VH
R
IP α
-Myc
Lisado total IP α
-HA
-VH
R
IP α
-Myc
HEK293T MCF7
VRK2
HA-VHR
A B
VRK2
HA-VHR
Lisado total IP α
-HA
-VH
R
IP α
-Myc
Lisado total IP α
-HA
-VH
R
IP α
-Myc
HEK293T MCF7
VRK2
HA-VHR
VRK2
HA-VHR
Lisado total IP α
-HA
-VH
R
IP α
-Myc
Lisado total IP α
-HA
-VH
R
IP α
-Myc
HEK293T MCF7
VRK2
HA-VHR
A B
Resultados
- 97 -
interacción de VRK2A con las fosfatasas MKP1 y MKP3. Se llevaron a cabo experimentos de
Pull-Down, transfectando las construcciones del vector vacío pCEFL-GST o bien pCEFFL-
GST-VRK2A en combinación con el vector pRK5-HA-MKP3 en un caso y el vector pRK5-
HA-MKP1 en el otro (Figura 58). No se pudo detectar la presencia de las fosfatasas HA-MKP1
ni HA-MKP3 en el precipitado de GST-VRK2A (Figura 58).
Los resultados anteriores nos permiten concluir que VRK2A no interacciona con las
fosfatasas VHR, MKP1, MKP2 ni MKP3. La modulación negativa de la ruta de ERK1/2 por
VRK2A no se produce, por tanto, a través de una de estas fosfatasas, sino a través de la
interacción con otra proteína.
Lisado total Pull-Down
GST
HA-MKP
GS
T
GS
T-V
RK2
A
GS
T
GS
T-V
RK2
A
MKP1MKP3
GS
T
GS
T-V
RK2
A
GS
T
GS
T-V
RK2
A
MKP1MKP3
PD
Lisado total Pull-Down
GST
HA-MKP
GS
T
GS
T-V
RK2
A
GS
T
GS
T-V
RK2
A
MKP1MKP3
GS
T
GS
T-V
RK2
A
GS
T
GS
T-V
RK2
A
MKP1MKP3
PD
Figura 57. VRK2A no interacciona con la fosfatasa MKP2. Transfectamos células HEK293T con los plásmidos pCEFL-GST, pCEFL-GST-VRK2A o pCEFL-GST-VRK2AKD, en combinación con la construcción pCMV-Myc-MKP2 que codifica la fosfatasa MKP2. Tras 48 horas, se prepararon los extractos celulares y se precipitaron las proteínas fusionadas con GST. Se detectaron, a través de western blot, las proteínas presentes tanto en los lisados totales como en los precipitados. (PD) Pull Down.
Figura 58. VRK2A no interacciona con las fosfatasas MKP1 ni MKP3. Transfectamos células HEK293T con los plásmidos pCEFL-GST o bien pCEFL-GST-VRK2A, en combinación con las construcciones pRK5-HA-MKP3 o bien pRK5-HA-MKP1, que codifican las fosfatasas MKP3 y MKP1, respectivamente. Tras 48 horas, se prepararon los extractos celulares y se precipitaron las proteínas fusionadas con GST mediante Pull Down (PD). Se detectaron, a través de western blot, las proteínas presentes tanto en los lisados totales como en los precipitados.
Myc-MKP2
GST
GST
GST
-VR
K2A
GST
-VR
K2A
KD
GST
GST
-VR
K2A
GST
-VR
K2A
KD
Lisado total Pull-Down
PDMyc-MKP2
GST
GST
GST
-VR
K2A
GST
-VR
K2A
KD
GST
GST
-VR
K2A
GST
-VR
K2A
KD
Lisado total Pull-Down
PD
Resultados
- 98 -
3.2 VRK2A no interacciona con las quinasas B-Raf ni ERK1/2
Teniendo en cuenta que hemos demostrado con anterioridad que VRK2A inhibe la
señalización de ERK1/2 por un mecanismo independiente de su actividad quinasa y que, por
tanto, ha de depender de una interacción proteína-proteína, quisimos evaluar la posible
interacción de VRK2A con proteínas de la ruta de señalización de ERK1/2. Una vez descartadas
algunas de las principales fosfatasas de ERK1/2, pasamos a evaluar la posible interacción con
las quinasas B-Raf y ERK1/2. La interacción con B-Raf no explicaría de por sí el mecanismo de
acción, dado que VRK2A no afecta a la activación de MEK1/2 por B-Raf. Es decir, VRK2A
actúa en la ruta de señalización de ERK1/2 a nivel de MEK1/2 o por debajo. Por lo tanto,
parecía poco probable que dicha interacción tuviera lugar si bien, en el contexto de complejos
multiproteicos de señalización ensamblados por una scaffold, podemos hipotetizar que VRK2A
interaccione con varias proteínas de la ruta simultáneamente.
Para ello, se transfectaron células HEK293T con las construcciones pCEFL-GST o
pCEFL-GST-VRK2A, en combinación con el plásmido pG12B-RafV600E en un caso (Figura
59A) o pCEFL-HA-ERK1 en el otro (Figura 59B). Se llevaron a cabo sendos experimentos de
Pull-Down, tal y como se específica en la Figura 59, con la intención de determinar si B-Raf o
ERK1 estaban interaccionando con GST-VRK2A. De esta manera, comprobamos que VRK2A
no estaba interaccionando con B-RafV600E ni con ERK1, dado que no se detectaba la presencia de
ninguna de estas proteínas sobreexpresadas en el precipitado de GST-VRK2A (Figura 59).
Figura 59. VRK2A no interacciona con las quinasas B-Raf ni ERK1. A) Se transfectaron células HEK293T con las construcciones pCEFL-GST o pCEFL-GST-VRK2A en combinación con el vector pG12B-RafV600E. Tras 48 horas, se precipitaron las proteínas unidas a GST mediante la resina Glutatión Sefarosa. A continuación, se detectó mediante western blot la presencia de las proteínas de interés tanto a nivel de los lisados totales como en los precipitados. B) De forma similar, se transfectaron células HEK293T con los vectores pCEFL-GST o bien pCEFL-GST-VRK2A junto con la construcción pCEFL-HA-ERK1. Al igual que en el caso anterior, se llevaron a cabo experimentos de Pull-Down (PD), para intentar detectar la presencia de HA-ERK1 en el precipitado de GST-VRK2A.
A
B-Raf V600E
GST
GS
T
VR
K2A
-GS
T
VR
K2A
-GS
T
PD
GS
T
Lisado total
B
HA-(ERK1)
GST PD
GS
T
VR
K2A
-GS
T
GS
T
VR
K2A
-GS
T
Lisado total
A
-
GS
T
VR
K2A
-GS
T
VR
K2A
-GS
T
GS
T
B
GS
T
VR
K2A
-GS
T
GS
T
VR
K2A
-GS
T
Pull-Down Pull-Down
A
B-Raf V600E
GST
GS
T
VR
K2A
-GS
T
VR
K2A
-GS
T
PD
GS
T
Lisado total
B
HA-(ERK1)
GST PD
GS
T
VR
K2A
-GS
T
GS
T
VR
K2A
-GS
T
Lisado total
A
-
GS
T
VR
K2A
-GS
T
VR
K2A
-GS
T
GS
T
B
GS
T
VR
K2A
-GS
T
GS
T
VR
K2A
-GS
T
Pull-Down Pull-Down
Resultados
- 99 -
3.3 VRK2A interacciona con la quinasa MEK1, a través de su extremo amino terminal
A continuación, pasamos a evaluar la posible interacción de VRK2A con la quinasa
MEK1. Para ello, llevamos a cabo experimentos de Pull-Down, en células HEK293T. Se llevó a
cabo el ensayo de interacción transfectando el plásmido pCEFL-HA-MEK1, junto con
construcciones que codifican la proteína VRK2A completa (ligada al epítopo GST) o distintos
fragmentos de VRK2A: región amino terminal (aa 1-320) de VRK2A y región carboxilo
terminal (aa 364-508) de VRK2A (Figura 60A y B). Tanto la construcción de VRK2A
completa, como el fragmento correspondiente a la región amino terminal (aa 1-320) de VRK2A
interaccionan con HA-MEK1, no así, el fragmento carboxilo terminal (aa 364-508) de VRK2A
(Figura 60B). Teniendo en cuenta que VRK2A y VRK2B son idénticas hasta el aminoácido 394
(Figura 60A), parecía lógico pensar que si MEK1 estaba interaccionando con VRK2A por la
región amino terminal de esta fuese capaz, también, de interaccionar con VRK2B. Quisimos
verificar esta hipótesis llevando a cabo un nuevo experimento de Pull-Down en el que
incluíamos la construcción de GST-VRK2B (Figura 60C). Tal y como hipotetizabamos, tanto
dfrvrklk
Figura 60. VRK2A y VRK2B interaccionan con las quinasa MEK1 a través de su extremo amino terminal. A) Representación esquemática de las proteínas VRK2A, VRK2B y los mutantes de deleción de VRK2A. B) Células HEK293T se transfectaron con los plásmidos pCEFL-HA-MEK1 en combinación con pCEFL-GST, pCEFL-GST-VRK2A, pCEFL-GST-VRK2A(1-320) o bien pCEFL-GST-VRK2A(364-508) y ,48 horas después, los extractos se emplearon para precipitar las proteínas de fusión con GST, con la resina Glutation sefarosa. Se analizó la proteína precipitada por western blot con anticuerpos específicos. C) Células HEK293T se transfectaron con los vectores pCEFL-HA-MEK1 y pCEFL-GST, pCEFL-GST-VRK2A o bien pCEFL-GST-VRK2B. Las proteínas de fusión se precipitaron y procesaron al igual que en experimentos anteriores.
A
Pull-DownLisado Total
HA-MEK1
GST
GST
GST
-VR
K2A
GST
-VR
K2A
(1-3
20)
GST
GST
-VR
K2A
GST
-VR
K2A
(1-3
20)
GST
-VR
K2A
(364
-508
)
GST
VR
K2A
(364
-508
)
Pull-DownLisado Total
HA-MEK1GST
GST
GST
-VR
K2A
GST
-VR
K2B
GST
GST
-VR
K2A
GST
-VR
K2B
B C
N- ATP - CRT
N- ATP - CVRK2B
VRK2A508
397N- ATP - CVR2A(1-320)
320
N- - CVRK2A(364-508)508
RT
Dominio quinasa
Región hidrofóbicaligada a membranas
PD PD
A
Pull-DownLisado Total
HA-MEK1
GST
GST
GST
-VR
K2A
GST
-VR
K2A
(1-3
20)
GST
GST
-VR
K2A
GST
-VR
K2A
(1-3
20)
GST
-VR
K2A
(364
-508
)
GST
VR
K2A
(364
-508
)
Pull-DownLisado Total
HA-MEK1GST
GST
GST
-VR
K2A
GST
-VR
K2B
GST
GST
-VR
K2A
GST
-VR
K2B
B C
N- ATP - CRT
N- ATP - CVRK2B
VRK2A508
397N- ATP - CVR2A(1-320)
320
N- - CVRK2A(364-508)508
RT
Dominio quinasa
Región hidrofóbicaligada a membranas
PD PD
Resultados
- 100 -
VRK2A como VRK2B son capaces de interaccionar con HA-MEK1, a través de su región
amino terminal (aa 1-320) común (Figura 60C).
Con la intención de confirmar la interacción entre VRK2A y MEK1, decidimos evaluar
si esta se producía también entre las proteínas endógenas. Para ello, inmunoprecipitamos la
proteína MEK1 endógena con un anticuerpo monoclonal, en la línea celular HEK293T (Figura
61). Detectamos, así, la presencia de VRK2A endógena unida a MEK1, lo que confirma el
resultado anterior.
3.4 VRK2A y la proteína scaffold KSR1
Hasta el momento, hemos demostrado como la quinasa humana VRK2A es capaz de
interaccionar con la proteína quinasa MEK1. Podríamos hipotetizar que, a través de esta
interacción, VRK2A sería tal vez capaz de secuestrar a MEK1 en una determinada localización
o bien de impedir la interacción de MEK1 con ERK1/2. Sin embargo, dado que la isoforma
VRK2B (incapaz de inhibir la señalización a través de la ruta de ERK1/2) también parece capaz
de interaccionar con MEK1 a través de su extremo amino terminal, la interacción de VRK2A
con MEK1 no es suficiente para explicar el mecanismo por el cual solamente la isoforma
VRK2A inhibe la señalización de la ruta de ERK1/2. Es decir, VRK2A interacciona, al menos,
con un componente de la ruta de señalización de ERK1/2, pero esta interacción por sí sola no es
suficiente para explicar por qué la isoforma VRK2A (pero no VRK2B) modula la señalización
de ERK1/2. Estos datos sugieren que VRK2A, probablemente debido a su diferente localización
subcelular (mediada por su extremo carboxilo terminal), es capaz de interaccionar con otras
proteínas que participan en el balance final de activación de esta ruta: proteínas scaffold o
proteínas inhibidoras, entre otras.
Se han descrito numerosas proteínas capaces de afectar al balance final de activación de
la ruta de señalización de ERK1/2. De entre todas ellas, juegan un papel muy importante las
proteínas scaffold que sirven como plataforma sobre la que se ensamblan los diferentes
Figura 61. VRK2A endógena se detecta en el inmunoprecipitado de MEK1 endógena. Se cultivaron células HEK293T, durante 48 horas, en medio con 10% de FBS. En esta línea celular, la isoforma VRK2A se expresa abundantemente, en cambio la isoforma VRK2B se expresa a niveles muy bajos. Se prepararon los lisados totales y se realizó un paso de lavado de estos con la resina GammaBind Plus Sepharose, para eliminar todas aquellas proteínas que se unan de forma inespecífica a la resina. A continuación, se retiró la resina y se incubó el extracto total durante toda la noche a 4ºC, en agitación orbital, con un anticuerpo monoclonal para MEK1. Al día siguiente, se añadió de nuevo la resina permitiéndonos precipitar la proteína MEK1 junto con todas aquellas proteínas capaces de interaccionar con ésta. Se analizó, mediante electroforesis SDS-PAGE y western blot, la presencia de las proteínas de interés tanto a nivel del lisado total como del precipitado. Se empleó un anticuerpo anti-Myc monoclonal como inmunoprecipitación inespecífica.
VRK2
MEK1
IP in
espe
cífic
a
IP M
EK
1
Lisa
doto
tal
VRK2
MEK1
IP in
espe
cífic
a
IP M
EK
1
Lisa
doto
tal
Resultados
- 101 -
componentes de la ruta de ERK1/2, facilitando la transmisión de la señal a nivel local (Kolch,
2005; Shaul and Seger, 2007). La posibilidad de que VRK2A pudiera estar interaccionando con
una proteína scaffold de la ruta de ERK1/2 resultaba bastante atractiva, dado que ya con
anterioridad había sido descrito como VRK2A era capaz de interaccionar con otra scaffold (la
proteína JIP1) y modular así la señalización de JNK (Blanco, et al., 2008). Decidimos, entonces,
continuar nuestro trabajo considerando como hipótesis una posible interacción de VRK2A con
la proteína scaffold KSR1. Esta se postulaba como la candidata idónea por ser la encargada de
facilitar el ensamblaje del módulo Raf/MEK/ERK a nivel citosólico, y mediar así la respuesta a
EGF (Kortum and Lewis, 2004; Lozano, et al., 2003).
3.4.1 KSR1 es necesaria para una correcta respuesta a EGF
Figura 62. La proteína scaffold KSR1 se expresa en líneas celulares de mama y es necesaria para una correcta respuesta a EGF. Por el contrario, JIP1, scaffold de la ruta de JNK, no afecta de forma significativa a la respuesta a EGF. A) Se transfectaron células HeLa con los correspondientes si-ARNs y, 48 horas después, se retransfectó el plásmido de luciferasa SRE.Luc. Tras 44 horas, se estimularon las células con EGF (10 nM) durante 10 min y, 4 horas después, se procesaron los extractos para medir la actividad luciferasa. Se representa la media de tres experimentos realizados por triplicado y analizados mediante la t de Student, respecto al reportero estimulado con EGF *** (p<0,0005). B) Western blot mostrando los niveles de expresión y fosforilación de las proteínas indicadas en un panel de cuatro líneas celulares de mama.
si-Controlsi-JIP1
EGF 0 nM 10nM
0
5
10
15
20
25
30
35A
ctiv
ació
n re
lativ
a
si-Controlsi-KSR1
***
***
0
5
10
15
20
25
30
35
Act
ivac
ión
rela
tiva
EGF 0 nM 10nM
A
HER2
VRK2
p-ERK1/2
ERK1/2
p-AKT
AKT
β-actina
BT474
SKBR3
MCF7MDA-M
B-231
KSR1
B
SRE.Luc SRE.Lucsi-Controlsi-JIP1
EGF 0 nM 10nM
0
5
10
15
20
25
30
35A
ctiv
ació
n re
lativ
a
si-Controlsi-KSR1
***
***
0
5
10
15
20
25
30
35
Act
ivac
ión
rela
tiva
EGF 0 nM 10nM
A
HER2
VRK2
p-ERK1/2
ERK1/2
p-AKT
AKT
β-actina
BT474
SKBR3
MCF7MDA-M
B-231
KSR1
B
si-Controlsi-JIP1
EGF 0 nM 10nM
0
5
10
15
20
25
30
35A
ctiv
ació
n re
lativ
a
si-Controlsi-KSR1
***
***
0
5
10
15
20
25
30
35
Act
ivac
ión
rela
tiva
EGF 0 nM 10nM
A
HER2
VRK2
p-ERK1/2
ERK1/2
p-AKT
AKT
β-actina
BT474
SKBR3
MCF7MDA-M
B-231
KSR1
B
HER2
VRK2
p-ERK1/2
ERK1/2
p-AKT
AKT
β-actina
BT474
SKBR3
MCF7MDA-M
B-231
KSR1
HER2
VRK2
p-ERK1/2
ERK1/2
p-AKT
AKT
β-actina
BT474
SKBR3
MCF7MDA-M
B-231
KSR1
B
SRE.Luc SRE.Luc
Resultados
- 102 -
Antes de evaluar si la proteína KSR1 podía interaccionar con VRK2A, quisimos
estudiar su expresión en un panel de líneas celulares de mama y ver si en nuestro modelo, en la
línea celular HeLa, KSR1 es capaz de mediar la respuesta a EGF.
Algunos autores han descrito cómo la proteína KSR1 se expresa a niveles muy bajos en
algunos tejidos, debido a la necesidad de que sus niveles estén estrictamente balanceados a nivel
estequiométrico, lo que puede derivar en una dificultad para detectarla con los anticuerpos
disponibles (Kortum and Lewis, 2004). Por este motivo, nos planteamos si esta proteína se
expresaba en tejidos de mama (en caso contrario, carecería de interés evaluar su posible
interacción con VRK2A) y si podíamos detectarla con los anticuerpos disponibles. Estudiamos
la expresión de KSR1 a nivel de western blot en cuatro líneas celulares de mama diferentes
(Figura 62B). En todos los casos, pudimos detectar cómo KSR1 se expresaba de forma
homogénea en las diferentes líneas celulares de mama. Los niveles de expresión de KSR1 eran
similares independientemente de que dicha línea celular sobreexpresase ErbB2 o no. Tampoco
se detectaba ningún tipo de relación entre la expresión de KSR1 y los niveles de VRK2 o los
niveles basales de fosforilación de ERK1/2 o AKT.
Por otro lado, quisimos confirmar que KSR1 era capaz, en nuestro modelo celular, de
mediar la respuesta a EGF. Para ello, silenciamos la expresión tanto de KSR1 como de la
proteína scaffold JIP1 (a modo de control negativo), en la línea celular HeLa, mediante el uso de
ARN de interferencia específicos. A continuación, llevamos a cabo ensayos de luciferasa
empleando el reportero SRE.Luc y estimulando las células con una concentración 10 nM de
EGF durante 10 minutos, cuatro horas antes de determinar la actividad luciferasa. Tal y como
esperabamos, pudimos observar cómo el silenciamiento de JIP1 no afecta de forma significativa
a la respuesta a EGF (Figura 62A, gráfica de la derecha), si bien la activación transcripcional del
SRE resulta ligeramente inferior probablemente debido a un efecto indirecto. En cambio, el
silenciamiento de KSR1 se traduce en una considerable disminución de los niveles de activación
del SRE en respuesta a EGF (Figura 62A, gráfica de la izquierda).
3.4.2 VRK2A y KSR1 colocalizan a nivel del retículo endoplasmático
La localización de KSR1 es dinámica. Cuando se llevan a cabo fraccionamientos de
membranas celulares, esta proteína se detecta tanto en la fracción soluble (citosólica) como en la
fracción de membranas (Stewart, et al., 1999). Además, se ha descrito como determinadas
proteínas retienen a KSR1 en el citosol, en compartimentos membranosos (Cacace, et al., 1999;
Matheny, et al., 2004). Con el objetivo de estudiar con mayor detalle la localización subcelular
de VRK2A respecto a la de KSR1, llevamos a cabo inmunofluorescencias, en la línea celular
HeLa. Inicialmente, se transfectó la construcción pCMV-Flag-KSR1 y, 36 horas después, se
Resultados
- 103 -
llevó a cabo la inmunofluorescencia empleando los anticuerpos adecuados para detectar las
fjjiiji
proteínas endógenas, de interés (rojo) y el epítopo Flag (verde). En el panel superior,
observamos como VRK2 endógena (rojo) y Flag-KSR1 (verde) colocalizan a nivel del citosol
(Figura 63). Con la intención de determinar a qué nivel del citosol estaban colocalizando KSR1
y VRK2, decidimos estudiar la localización de KSR1 respecto a proteínas endógenas que se
pueden considerar marcadores de orgánulos subcelulares, como Calnexina y Giantina (Figura
63). En el panel intermedio, observamos como Flag-KSR1 (verde) colocaliza totalmente con la
proteína marcadora de retículo endoplasmático Calnexina (rojo). En cambio, en el panel inferior
(Figura 63) no se detecta ningún tipo de colocalización entre Flag-KSR1 (verde) y la proteína
KSRVRK2Mezcla
CalnexinaMezcla KSR
GiantinaMezcla KSR
Detalle
Detalle
Detalle
KSRVRK2Mezcla
CalnexinaMezcla KSR
GiantinaMezcla KSR
Detalle
Detalle
Detalle
Figura 63. VRK2 y Flag-KSR1 colocalizan a nivel del retículo endoplasmático. Se transfectaron células HeLa con la construcción pCMV-Flag-KSR1 y, 36 horas después, se fijaron y procesaron los cubreobjetos para inmunofluorescencia. Flag-KSR1 (verde) se detectó con un anticuerpo monoclonal para el epítopo Flag. VRK2 endógena (rojo), con un anticuerpo policlonal específico. El marcador de retículo endoplasmático (Calnexina) y el de aparato de Golgi (Giantina), ambos en rojo, se detectaron con anticuepos específicos para las proteínas endógenas. La barra indica 10 μm.
Resultados
- 104 -
marcadora de aparato de Golgi, Giantina (rojo). Por lo tanto, concluimos que KSR1
sobreexpresada colocaliza con VRK2 en las proximidades del retículo endoplasmático.
Teniendo en cuenta los resultados anteriores, nos preguntamos si KSR1 endógeno
colocaliza con el retículo endoplasmático. Para responder a esta pregunta, llevamos a cabo
inmunofluorescencias en la línea celular HeLa y en varias líneas celulares de mama. Pudimos
observar que en todas las líneas celulares estudiadas existe colocalización entre KSR1 endógeno
(rojo) y la proteína endógena Calnexina (verde), empleada como marcador de retículo
endoplasmático (Figura 64A). El grado de colocalización de KSR1 con el retículo
endoplasmático varía en función de la línea celular. Además, tal y como ha sido descrito, KSR1
endógeno se localiza también en otras regiones del citosol y en la membrana plasmática,
pudiéndose detectar también poblaciones nucleares, en función de la línea celular (Brennan, et
al., 2002; Matheny, et al., 2004; Ory, et al., 2003). Por lo tanto, una subpoblación de KSR1 se
localiza en las proximidades del retículo endoplasmático, al igual que ocurre con la quinasa
VRK2 (Figura 64B).
Figura 64. KSR1 se localiza en las proximidades del retículo endoplasmático en HeLa y líneas celulares de mama. A) Inmunofluorescencias mostrando la localización subcelular de KSR1 (rojo) con un anticuerpo policlonal específico para KSR1 y la proteína marcadora de retículo endoplasmático Calnexina (verde) con un anticuerpo monoclonal. El núcleo se marca con DAPI (azul). B) VRK2 (rojo) detectado con un anticuerpo policlonal específico colocaliza con el retículo endoplasmático, también, en líneas celulares de mama, como SKBR3. La barra indica 10 μm.
Mezcla CalnexinaKSR1 DAPI
VRK2
MCF7
MDA-MB-231
SKBR3
SKBR3
HeLa
Mezcla Calnexina DAPI
A
B
Detalle Mezcla CalnexinaKSR1 DAPI
VRK2
MCF7
MDA-MB-231
SKBR3
SKBR3
HeLa
Mezcla Calnexina DAPI
A
B
Detalle
Resultados
- 105 -
Tal y como ya hemos mencionado, la localización subcelular de KSR1 es dinámica. La
estimulación con determinados factores de crecimiento (como el EGF) induce la translocación
de una población de KSR1 a la membrana plasmática (Michaud, et al., 1997; Ory, et al., 2003;
Therrien, et al., 1996). Por este motivo, quisimos evaluar si la población de KSR1 y VRK2 que
se localiza en el retículo endoplasmático colocaliza aún tras la estimulación con el factor de
crecimiento EGF. Llevamos a cabo inmunofluorescencias, en la línea celular HeLa, en
condiciones de crecimiento con 10% FBS o bien en células que tras 48 horas en medio sin suero
(0% FBS), son estimuladas con EGF durante tres minutos. En estas condiciones, no se aprecian
diferencias en la localización de KSR1 en la mayoría de las células (Figura 65). En alguna
célula aislada si que se detectan, tras la estimulación con el factor de crecimiento epidérmico,
dos poblaciones diferenciadas de KSR1 (tal y como se observa en el panel inferior de la figura
65). Una de estas poblaciones permanece en el retículo endoplasmático, mientras que una
pequeñísima fracción de KSR1 se concentra en la membrana plasmática. De esta manera, tal y
como suponíamos, tras la estimulación con EGF aún se detecta colocalización entre KSR1 y
VRK2 en las proximidades del retículo endoplasmático.
3.4.3 VRK2A y KSR1 interaccionan
La quinasa humana VRK2A interacciona con MEK1 a través de su extremo amino
terminal. Además, colocaliza con la proteína scaffold de la ruta de ERK1/2, KSR1. Para
profundizar en el mecanismo por el cual VRK2A inhibe la señalización a través de la ruta de
ERK1/2, quisimos evaluar la posible interacción de VRK2A con la proteína KSR1. En primer
lugar, transfectamos el plásmido pCMV-Flag-KSR1 en combinación con pCEFL-GST o
Figura 65. KSR1 y VRK2 endógenos colocalizan a nivel del retículo endoplasmático, tanto en células creciendo en 10% de FBS como en células mantenidas en 0% FBS y estimuladas con EGF. Se llevaron a cabo inmunofluorescencias en células HeLa creciendo en medio con 10% FBS o bien mantenidas en medio con 0% FBS, durante 48 horas, y luego estimuladas con una concentración 10 nM de EGF durante 3 minutos. VRK2 (rojo) se detectó con un anticuerpo policlonal y KSR1 (verde) con un anticuerpo monoclonal. La barra indica 10 μm.
10% FBS
0% FBSEGF 3 min
VRK2 KSR1 DAPIMezclaDetalle
10% FBS
0% FBSEGF 3 min
VRK2 KSR1 DAPIMezclaDetalle
Resultados
- 106 -
pCEFL-GST-VRK2A y llevamos a cabo la inmunoprecipitación de Flag-KSR1, en células
HEK293T. Se pudo detectar la presencia de GST-VRK2A en el inmunoprecipitado de
jlfjlfjhjhkh
Flag-KSR1 (Figura 66A). A continuación, llevamos a cabo el experimento recíproco mediante
un ensayo tipo Pull-Down, transfectando células HEK293T con las construcciones pCEFL-GST
o pCEFL-GST-VRK2A. De esta manera, se detectó la presencia de KSR1 endógeno en el
precipitado de GST-VRK2A, pero no en el precipitado de GST (Figura 66B).
Tras constatar que VRK2A es capaz de inhibir la señalización a través de la ruta de
ERK1/2 (al contrario que VRK1 y VRK2B), quisimos evaluar si también es la única capaz de
interaccionar con KSR1. Para ello, llevamos a cabo un ensayo de Pull-Down, en la línea celular
HEK293T. Transfectamos las construcciones pCEFL-GST, pCEFL-GST-VRK2A, pCEFL-
GST-VRK2B o pCEFL-GST-VRK1 en combinación con el plásmido pCMV-Flag-KSR1
(Figura 67A). Tal y como observamos en la figura 67A, se puede detectar la presencia de Flag-
KSR1 en el precipitado de GST-VRK2A pero no en los precipitados de GST-VRK2B o GST-
VRK1. Por la tanto, la interacción con KSR1 es exclusiva de VRK2A (Figura 67B). No
consideramos la posibilidad de que la quinasa VRK3 pudiese interaccionar con KSR1, dada la
localización exclusivamente nuclear de VRK3.
Figura 66. Interacciones recíprocas entre KSR1 y VRK2A. A) Células HEK293T se transfectaron con pCMV-Flag-KSR1 en combinación con pCEFL-GST o pCEFL-GST-VRK2A y, 48 horas después, los lisados se emplearon para inmunoprecipitar (IP) Flag-KSR1 con un anticuerpo monoclonal anti-Flag. Se detectó la presencia de GST-VRK2A en el inmunoprecipitado con un anticuerpo policlonal para el epítopo GST y se confirmó con el anticuerpo policlonal anti-VRK2. B) Se transfectaron las construcciones pCEFL-GST y pCEFL-GST-VRK2A en células HEK293T y se llevó a cabo un experimento de Pull-Down (PD) en el que las proteínas unidas a GST se precipitan mediante la resina Glutation Sefarosa, para luego detectar la presencia de KSR1 endógeno en el precipitado de GST-VRK2A mediante Western blot.
Lisado total Pull-Down
KSR1
GST
GST
GST
GST
-VR
K2A
GST
-VR
K2A
IP α-Flag
GST-VRK2A
Flag-KSR1
Lisado total
Flag-KSR1
GST-VRK2A
β-actina
GST
A B
KSR1
GST
GST-VRK2A GST-VRK2A
PD
Lisado total Pull-Down
KSR1
GST
GST
GST
GST
-VR
K2A
GST
-VR
K2A
IP α-FlagIP α-Flag
GST-VRK2A
Flag-KSR1
Lisado total
Flag-KSR1
GST-VRK2A
β-actina
GST
A B
KSR1
GST
GST-VRK2A GST-VRK2A
PD
Resultados
- 107 -
A continuación, nos preguntamos qué regiones de la proteína VRK2A estarían
implicadas en su interacción específica con KSR1. Dado que la interacción con KSR1 es
exclusiva de VRK2A, cabría esperar que en dicha interacción estuviese implicada al menos la
región carboxilo terminal de VRK2A, no común con VRK2B. Con la intención de responder a
esta pregunta, transfectamos células HEK293T con las construcciones pCEFL-GST, pCEFL-
GST-VRK2A, pCEFL-GST-VRK2A(1-320), pCEFL-GST-VRK2A(256-397) o pCEFL-GST-
VRK2A(364-508) en combinación con una el plásmido pCMV-Flag-KSR1 y llevamos a cabo
un ensayo de tipo Pull-Down. Podemos observar como Flag-KSR1 interacciona con la proteína
VRK2A completa, pero también con la construcción correspondiente al extremo amino terminal
de VRK2A (aminoácidos 1-320), así como con la construcción correspondiente al extremo
Figura 67. VRK2A, pero no VRK2B ni VRK1, interacciona con KSR1. A) Se llevaron a cabo experimentos de Pull-Down en células HEK293T, en las que se transfectaron las construcciones pCMV-Flag-KSR1 en combinación con una de las siguientes: pCEFL-GST, pCEFL-GST-VRK2A, pCEFL-GST-VRK1 o pCEFL-GST-VRK2B. B) Representación esquemática de la estructura de las quinasas VRK1, VRK2A y VRK2B, resaltando en gris la región carboxilo terminal de VRK2A, no común a VRK2B y que sería, por tanto, la principal región candidata a mediar la interacción con KSR1.
Flag-KSR1
GST
Pull-DownLisado Total
GST
GST
GST
-VR
K2A
VR
K2A
VR
K2B
GS
T
GST
-VR
K2B
GST
-VR
K1
VR
K1G
ST
Flag-KSR1
GST
PD
A
1
397 508
396
397
508
VRK1
VRK2A
VRK2B
Dominio quinasa
Región hidrofóbica anclada a membranas
Región candidata a ser la responsable de la interacción
1
397 508
396
397
508
VRK1
VRK2A
VRK2B
Dominio quinasa
Región hidrofóbica anclada a membranas
Región candidata a ser la responsable de la interacción
B
GST-VRKs GST-VRKs
Flag-KSR1
GST
Pull-DownLisado Total
GST
GST
GST
-VR
K2A
VR
K2A
VR
K2B
GS
T
GST
-VR
K2B
GST
-VR
K1
VR
K1G
ST
Flag-KSR1
GST
PD
A
1
397 508
396
397
508
VRK1
VRK2A
VRK2B
Dominio quinasa
Región hidrofóbica anclada a membranas
Región candidata a ser la responsable de la interacción
1
397 508
396
397
508
VRK1
VRK2A
VRK2B
Dominio quinasa
Región hidrofóbica anclada a membranas
Región candidata a ser la responsable de la interacción
B
GST-VRKs GST-VRKs
Resultados
- 108 -
carboxilo terminal (aminoácidos 364-508) (Figura 68A). En cambio, no se detecta interacción
dfdsfvgrgvr
entre Flag-KSR1 y el fragmento de VRK2A correspondiente a la región intermedia de VRK2A
(aminoácidos 256-397) (Figura 68A). Es decir, VRK2A está interaccionando con KSR1 a través
de un dominio compuesto por aminoácidos presentes tanto en su región amino como carboxilo
Figura 68. VRK2A interacciona con KSR1, a través de un dominio compuesto por aminoácidos presentes en la región amino terminal y en la región carboxilo terminal. A) Se transfectaron células HEK293T con pCMV-Flag-KSR1 en combinación con pCEFL-GST o una de las construcciones de VRK2A: pCEFL-GST-VRK2A, pCEFL-GST-VRK2A(1-320), pCEFL-GST-VRK2A(256-397) o pCEFL-GST-VRK2A(362-508). Tras 48 horas, las proteínas de fusión con GST se precipitaron mediante la resina Glutatión sefarosa y tanto los lisados totales como los precipitados se sometieron a Western blot con anticuerpos específicos. B) Representación esquemática de las construcciones utilizadas para mapear la interacción de VRK2A con KSR1. Esta interacción se produce tanto por el extremo amino como por el extremo carboxilo de VRK2A. Las regiones de VRK2A que participan en la interacción se resaltan con un recuadro gris. En cambio el fragmento correspondiente a la región central (256-397) de VRK2A no interacciona con KSR1. Esta región se resalta en amarillo.
GST
-VR
K2A
(364
-508
)
Flag-KSR1
GST
GST
-VR
K2A
(1-3
20)
GST
-VR
K2A
(364
-508
)
GST
-VR
K2A
GST
-VR
K2A
(256
-397
)
Pull-downLisado total
GST
-VR
K2A
(1-3
20)
GST
-VR
K2A
GST
-VR
K2A
(256
-397
)
GST
GST
PD
GST
Flag-KSR1
A
1
256 397
508
320
364
1 256 397 508
Regiones de VRK2A que participan en la interacción
con KSR1
Regiones de VRK2A que participan en la interacción
con KSR1
B
GST-VRKs GST-VRKs
GST
-VR
K2A
(364
-508
)
Flag-KSR1
GST
GST
-VR
K2A
(1-3
20)
GST
-VR
K2A
(364
-508
)
GST
-VR
K2A
GST
-VR
K2A
(256
-397
)
Pull-downLisado total
GST
-VR
K2A
(1-3
20)
GST
-VR
K2A
GST
-VR
K2A
(256
-397
)
GST
GST
PD
GST
Flag-KSR1
A
1
256 397
508
320
364
1 256 397 508
Regiones de VRK2A que participan en la interacción
con KSR1
Regiones de VRK2A que participan en la interacción
con KSR1
B
GST-VRKs GST-VRKs
Resultados
- 109 -
terminal, probablemente debido a la estructura terciaria de la proteína (Figura 68B). Este
dominio, empleado en la interacción con KSR1, al comprender residuos de la región carboxilo
terminal no está presente en las quinasas VRK2B y VRK1, lo cual confirma el que la
interacción con KSR1 sea exclusiva de VRK2A (Figura 67).
3.4.4 VRK2A no fosforila a KSR1 ni a MEK1
KSR1 es fosforilada en, al menos, doce residuos de serina y treonina por diversas
quinasas y desfosforilada, después, en respuesta al tratamiento con factores de crecimiento.
Algunos de estos residuos son fosforilados por quinasas desconocidas (Luis G. Pérez-Rivas,
2010). Por este motivo, si bien VRK2A está inhibiendo la ruta de señalización de ERK1/2 por
un mecanismo independiente de su actividad quinasa, quisimos descartar la posibilidad de que
VRK2A estuviese fosforilando a KSR1 o a MEK1. Esta posibilidad debía de ser evaluada dado
que, en el caso de la ruta de JIP1/JNK, VRK2A inhibe la señalización, también, de forma
independiente de actividad quinasa y, sin embargo, fosforila a la proteína scaffold JIP1 (Blanco,
et al., 2008).
Por este motivo, llevamos a cabo un ensayo quinasa in vitro, empleando las proteínas
purificadas MEK1-His6 y GST-VRK2A y la proteína Flag-KSR1 transfectada y purificada de
células eucariotas (Figura 69). Podemos observar en la autorradiografía una fuerte
autofosforilación de GST-VRK2A, que nos sirve como control positivo del experimento. En
cambio, no se detecta fosforilación de MEK1 ni de KSR1 por VRK2A. Tampoco se detecta
autofosforilación de KSR1 (es una pseudoquinasa), ni de MEK1 (probablemente debido a que
klñ
Figura 69. VRK2A no fosforila in vitro a KSR1 ni a MEK1. La autorradiografía muestra la autofosforilación de VRK2A, tras el ensayo quinasa in vitro. No se detecta fosforilación de KSR1 ni MEK1 por GST-VRK2A. El Western blot muestra los niveles de expresión de las tres proteínas empleadas en el ensayo quinasa. Se emplearon las proteínas de fusión GST-VRK2A y MEK-His6 purificadas. La proteína Flag-KSR1, transfectada en células eucariotas, se precipitó empleando la resina ANTI-Flag M2 Agarosa (monoclonal) y se eluyó de la resina mediante un proceso de elución ácida (0,1 M glicina, HCl pH 3,5). Las tres proteínas se sometieron a un ensayo quinasa in vitro con (32ɣ-P) ATP.
(Flag-KSR1) 110 -140 kDa
GST-VRK2A-32P
(MEK1) 50 kDa
KSR1
MEKGST-VRK2A
Western blot
32-p
KSR1 - + +
MEK - + +GST-VRK2A - + +
(Flag-KSR1) 110 -140 kDa
GST-VRK2A-32P
(MEK1) 50 kDa
KSR1
MEKGST-VRK2A
Western blot
32-p
KSR1 - + +
MEK - + +GST-VRK2A - + +
Resultados
- 110 -
se emplean en el ensayo quinasa condiciones óptimas para la fosforilación por la quinasa
VRK2). En principio, este resultado sugiere que VRK2A no es capaz de fosforilar (al menos in
vitro) a las proteínas KSR1 y MEK1, con las que, en cambio, interacciona.
3.4.5 VRK2A, KSR1 y MEK1 forman un complejo
KSR1 se encuentra unido a MEK1 de forma constitutiva, independientemente de
estímulo (Therrien, et al., 1996; Xing, et al., 2004). Por este motivo, parecía lógico que las tres
proteínas: VRK2A, KSR1 y MEK1, formasen parte, simultáneamente, de un mismo complejo
multiproteico. Por otro lado, existía la posibilidad de que la interacción con MEK1 fuese
indirecta, a través de KSR1.
Para comprobar si la interacción entre MEK1 y VRK2A es directa o indirecta, mediada
en este caso por KSR1, decidimos llevar a cabo un ensayo de interacción in vitro. Se emplearon
en este ensayo las proteínas purificadas, GST-VRK2A y MEK1-His6. Así, se pudo detectar la
presencia de MEK1-His6 en el precipitado de GST-VRK2A (Figura 70). Esto es indicativo de
la existencia de una interacción directa entre VRK2A y MEK1, que no depende de otras
proteínas no presentes en el ensayo in vitro.
Dado que VRK2A interacciona tanto con KSR1 como con MEK1, quisimos evaluar la
posibilidad de que las tres proteínas formasen parte de un complejo ternario. Para determinar la
existencia de este complejo, una vez descartada la posibilidad de realizar una co-
inmunoprecipitación de las tres proteínas endógenas debido a problemas técnicos con los
anticuerpos, decidimos llevar a cabo un ensayo de interacción in vitro. Para ello, incubamos la
Figura 70. La interacción entre MEK1 y VRK2A es directa. Se llevó a cabo un ensayo de interacción in vitro, para el cual se emplearon las proteínas recombinantes GST, GST-VRK2A y MEK1-His6, que se incubaron durante 1 hora con la resina Glutatión sefarosa para posteriormente llevar a cabo un ensayo tipo Pull-Down (PD). Las proteínas precipitadas y totales se detectaron por Western blot con anticuerpos específicos.
MEK-His6
GST
MEK-His6
GST
GST
GST
-VR
K2A
GST
GST
-VR
K2A
Pull-DownLisado total
PD
MEK-His6
GST
MEK-His6
GST
GST
GST
-VR
K2A
GST
GST
-VR
K2A
Pull-DownLisado total
PD
Resultados
- 111 -
proteína purificada GST-VRK2A con extractos celulares totales, procedentes de la línea celular
MCF7, y llevamos a cabo un ensayo tipo Pull-Down (Figura 71). Se detecta, así, la presencia de
KSR1 endógeno y MEK1 endógenos en el precipitado de GST-VRK2A. Por lo tanto, podemos
concluir que las tres proteínas, VRK2A, KSR1 y MEK1 forman parte, simultáneamente, de los
mismos complejos de señalización.
3.5 VRK2A modula negativamente la ruta de señalización de ERK1/2 por un mecanismo
dependiente de KSR1
Hasta el momento, hemos demostrado que VRK2A inhibe la señalización de ERK1/2 en
respuesta a EGF, actuando por debajo de MEK1/2. Además, el mecanismo de acción no
depende de la actividad quinasa de VRK2A. Es decir, VRK2A está modulando la ruta de
ERK1/2 por un mecanismo dependiente de una interacción proteína-proteína. Igualmente, en el
caso de la modulación de la señalización de JNK por VRK2A, el mecanismo de acción resultaba
ser independiente de la actividad quinasa (Blanco, et al., 2008). Con la intención de ahondar en
el mecanismo por el cual VRK2A inhibe la señalización de ERK1/2, decidimos evaluar la
posible interacción de esta quinasa con aquellas proteínas que, por su situación en la ruta de
señalización de ERK1/2, fuesen candidatas a explicar el mecanismo de acción de VRK2A. De
esta manera, hemos determinado que VRK2A es capaz de formar un complejo con KSR1 y
MEK1. Además, la interacción con KSR1 es específica de VRK2A, lo que sugiere que puede
ser clave para explicar el mecanismo por el cual VRK2A modularía esta ruta de señalización.
Por lo tanto, decidimos desarrollar una serie de experimentos destinados a determinar si KSR1
Figura 71. VRK2A, KSR1 y MEK1 forman parte de un mismo complejo. Se prepararon extractos celulares totales a partir de la línea celular MCF7 y se incubaron con las proteínas recombinantes GST y GST-VRK2A y la resina Glutatión sefarosa. Se analizó la proteína precipitada y los lisados totales, por western blot, con anticuerpos específicos. En el precipitado de GST-VRK2A, detectamos la presencia de KSR1 y MEK1 endógenas.
KSR1
MEK1
GST
GST
GST
-VR
K2A
GST
GST
-VR
K2A
KSR1
MEK1
GST
Lisado total Pull-Down
PD
KSR1
MEK1
GST
GST
GST
-VR
K2A
GST
GST
-VR
K2A
KSR1
MEK1
GST
Lisado total Pull-Down
PD
Resultados
- 112 -
es necesaria para la modulación de la ruta de señalización de ERK1/2, por VRK2A. Estos
experimentos se basan en el silenciamiento de la expresión de KSR1. Esta herramienta
experimental nos permitirá determinar si, en ausencia de KSR1, VRK2A sigue ejerciendo su
papel modulador sobre la ruta de ERK1/2 (tanto en experimentos de silenciamiento como de
sobreexpresión de VRK2A). Si bien, esta aproximación experimental debe ser interpretada
cuidadosamente, dado el papel fundamental de KSR1 en la ruta de ERK1/2, por otro lado, nos
permitirá evaluar nuestra hipótesis y concluir si KSR1 es necesaria para la modulación negativa
de la ruta de señalización de ERK1/2 por VRK2A.
3.5.1 KSR1 es necesario para la modulación negativa de la ruta de señalización de ERK1/2
por VRK2A
Tal y como hemos mencionado, nos planteamos como hipótesis de trabajo la posibilidad
de que VRK2A inhiba la ruta de señalización de ERK1/2, a través de su interacción con KSR1.
Para confirmar o descartar esta hipótesis, llevamos a cabo una primera aproximación
experimental basada en el silenciamiento de la expresión de KSR1. Bajo estas condiciones, si
KSR1 es necesario para la modulación de la ruta de ERK1/2, por VRK2A, observaríamos una
disminución del efecto de VRK2A sobre la ruta de ERK1/2.
Decidimos, por tanto, silenciar la expresión de VRK2A tanto individualmente como en
combinación con el silenciamiento de la expresión de KSR1, en la línea celular HeLa (Figura
72A). Tras el tratamiento con los ARNs de interferencia, se procesaron los extractos totales para
analizar los niveles de expresión y fosforilación de las proteínas de interés. Podemos observar
como el silenciamiento de la expresión de VRK2 se traduce en un incremento de los niveles de
fosforilación de ERK1/2, el cual se pierde al silenciar simultáneamente la expresión de KSR1
(Figura 72A). Este resultado confirma nuestra hipótesis inicial. A continuación, decidimos
llevar a cabo un experimento similar en la línea celular MDA-MB-231 (que presenta secreción
autocrina de EGF). Tratamos las células durante 96 horas con los correspondientes ARN de
interferencia, si-control, si-VRK2-06, si-KSR1 y una combinación equimolar del ARN de
interferencia si-VRK2-06 junto con el ARN si-KSR1. Además, dos días antes de lisar los
extractos, se transfectó el plásmido reportero SRE.Luc. A continuación, se procesaron los
extractos para medir la actividad luciferasa. Además, en paralelo, se analizaron a través de
western blot los niveles de expresión y activación de las proteínas de interés (Figura 72B). Tal y
como esperábamos, en ausencia de VRK2 se produce una mayor activación transcripcional del
SRE, ligada a modestos incrementos en los niveles de fosforilación ERK1/2. En cambio, en la
ausencia combinada de VRK2 y KSR1, se recuperan los niveles basales de activación
transcripcional del SRE y de fosforilación de ERK1/2 (Figura 72B). Los resultados obtenidos,
Resultados
- 113 -
tanto en la línea celular HeLa como en MDA-MB-231, indican que KSR1 es necesario para la
modulación negativa de la ruta de señalización de ERK1/2, por VRK2A. Por lo tanto, podemos
posicionar a VRK2A y KSR1 en la misma ruta de señalización, que regula la activación de
ERK1/2.
El siguiente paso, para analizar el papel de KSR1 en la modulación de la ruta de
ERK1/2 por VRK2A, consistió en determinar si KSR1 era necesario para la modulación de la
respuesta a EGF, por VRK2A. Para ello, decidimos realizar ensayos de luciferasa, en la línea
celular MCF7, sobreexpresando la quinasa humana VRK2A. En estas condiciones, tal y como
Figura 72. KSR1 es la proteína scaffold que participa en la vía de señalización de ERK1/2 modulada por VRK2A. A) Se trató la línea celular HeLa, durante 3,5 días, con los ARNs de interferencia si-control, si-VRK2-06 o un pool de ARN para silenciar KSR1 (si-KSR1), por separado o en combinación. Los extractos se procesaron por western blot para detectar los niveles de expresión y fosforilación de las proteínas indicadas. B) Se transfectó la línea celular MDA-MB-231, durante 3,5 días, con los ARNs de interferencia si-control, si-VRK2-06 o si-KSR1, por separado y en combinación. Además, 48 horas antes de lisar y medir la actividad luciferasa, se transfectó 1μg del reportero de luciferasa SRE.Luc. En paralelo, se analizaron por western blot los niveles de expresión y fosforilación de las proteínas de interés. Los resultados indican que la falta de KSR1 contrarresta la falta de VRK2, en cuanto a los niveles de p-ERK1/2 y a la activación transcripcional del Elemento de Respuesta a Suero.
VRK2
MDA-MB-231si
-con
trol
si-K
SR
1
si-V
RK
2-06
si-V
RK
2-06
+
si-K
SR
1
p-ERK 1/2 ERK1/2
KSR1
A
B
si-K
SR1
si-V
RK
2-06
si-V
RK
2-06
+ s
i-KSR
1
si-C
ontr
ol
MDA-MB-231
0
1
2
3
Act
ivid
ad re
lativ
a
EGF autocrino
si-c
ontro
l
si-V
RK
2-06
si-c
ontro
l
si-V
RK
2-06
+
si-K
SR
1
HeLap-ERK 1/2
ERK 1/2
KSR1VRK2AVRK2B
VRK2
MDA-MB-231si
-con
trol
si-K
SR
1
si-V
RK
2-06
si-V
RK
2-06
+
si-K
SR
1
p-ERK 1/2 ERK1/2
KSR1
A
B
si-K
SR1
si-V
RK
2-06
si-V
RK
2-06
+ s
i-KSR
1
si-C
ontr
ol
MDA-MB-231
0
1
2
3
Act
ivid
ad re
lativ
a
EGF autocrino
si-c
ontro
l
si-V
RK
2-06
si-c
ontro
l
si-V
RK
2-06
+
si-K
SR
1
HeLap-ERK 1/2
ERK 1/2
KSR1VRK2AVRK2B
Resultados
- 114 -
ya hemos demostrado, VRK2A sobreexpresada inhibe la activación transcripcional del SRE por
EGF (Figura 73). En cambio, cuando realizamos este mismo experimento en células MCF7 en
las que hemos silenciado la expresión de KSR1, observamos que la sobreexpresión de VRK2A
no es capaz de inhibir la activación residual del SRE por EGF (Figura 73). Es cierto
jnnkj
que tras el silenciamiento de KSR1 la activación del SRE por EGF es mínima. Sin embargo, esa
activación residual (en torno a tres veces) de la ruta de ERK1/2 por EGF, que presumiblemente
no transcurre vía KSR1, no se ve afectada por la sobreexpresión de VRK2A. Es decir, VRK2A
modula la respuesta a EGF cuando esta ruta está mediada por la proteína scaffold, KSR1.
Finalmente, quisimos confirmar el resultado anterior mediante experimentos de
silenciamiento simultáneo de la expresión de VRK2 y KSR1. Para ello, llevamos a cabo
ensayos de luciferasa, en la línea celular HeLa, silenciando la expresión de VRK2 o KSR1, o
bien silenciando la expresión de ambas simultáneamente. Además, tal y como se indica en la
figura 73, las células fueron estimuladas o no, durante 10 minutos con una concentración 10 nM
de EGF, cuatro horas antes de lisar los extractos para determinar la actividad luciferasa. Tal y
como ya habíamos demostrado (Figura 48), en ausencia de VRK2, se observa una mayor
activación transcripcional del SRE, tanto en condiciones basales como en respuesta a EGF. En
cambio, al igual que ocurría en la línea celular MDA-MB-231 (Figura 72B), el silenciamiento
simultáneo de KSR1 y VRK2 se traduce en menores niveles de activación transcripcional del
reportero, en comparación con el silenciamiento aislado de VRK2 (Figura 74). Esto ocurre tanto
en condiciones basales de señalización de la ruta de ERK1/2, como en respuesta a EGF. Es
decir, en concordancia con los experimentos anteriores, KSR1 resulta imprescindible para la
modulación negativa de la ruta de señalización de ERK1/2 por VRK2A. Por lo tanto, podemos
Figura 73. VRK2A modula negativamente la respuesta a EGF en presencia de KSR1, pero no tras el silenciamiento de esta proteína scaffold. Células MCF7 fueron transfectadas, inicialmente, con los ARNs de interferencia si-control o si-KSR1 y, 48 horas después, con 2,5 μg de los plásmidos pCEFL-HA o pCEFL-HA-VRK2A y 1 μg del reportero de luciferasa SRE.Luc. Tras 30 horas, las células fueron estimuladas durante 30 min con EGF 10nM y 4 horas después se procesaron los extractos para medir la actividad luciferasa. Se representa la media de tres experimentos independientes, por triplicado, analizados mediante la t de Student con respecto a la actividad del reportero activado por EGF. *p<0,05.
0
2
4
6
8
*
EGF 10 nM EGF 10 nM
HA-VRK2A(2,5 μg)
vector HA-VRK2A(2,5 μg)
vector
si-Control 96h
si-KSR1 96h
vector
Act
ivac
ión
rela
tiva
0
2
4
6
8
*
EGF 10 nM EGF 10 nM
HA-VRK2A(2,5 μg)
vector HA-VRK2A(2,5 μg)
vector
si-Control 96h
si-KSR1 96h
vector
Act
ivac
ión
rela
tiva
Resultados
- 115 -
concluir que VRK2A modula la señalización a través de la ruta KSR1-Raf-MEK1/2-ERK1/2,
por un mecanismo relacionado con su interacción con KSR1.
3.5.2 VRK2A contribuye a retener a una subpoblación de KSR1 en complejos de elevado
peso molecular
La proteína KSR1 es capaz de homodimerizar y de formar heterodímeros con la quinasa
Raf (Matheny and White, 2009; Rajakulendran, et al., 2009). Además, dado su papel de proteína
scaffold, forma parte de complejos multiproteicos con numerosas proteínas. De esta manera,
KSR1 se puede detectar en complejos multiproteicos de 150-1000 kDa de peso molecular. Así
mismo, KSR1 retiene a MEK1/2 en complejos multiproteicos de aproximadamente 700 kDa de
peso molecular (Stewart, et al., 1999). Por otro lado, VRK2A se localiza igualmente en
complejos multiproteicos de elevado peso molecular (Blanco, et al., 2008). Por este motivo,
Figura 74. KSR1 es necesario para la modulación de la respuesta a EGF por VRK2A. Se transfectaron células HeLa con los ARNs de interferencia si-Control, si-VRK2-06, si-KSR1 o la combinación de si-VRK2 y si-KSR1. Tras 48 horas, se transfectó el reportero de luciferasa SRE.Luc y se esperaron 44 horas más antes de estimular las células con una concentración de EGF 10 nM, durante 10 minutos. A las 4 horas de la estimulación, se procesaron los extractos para determinar la actividad luciferasa. Se representa la media de tres experimentos independientes, por triplicado, analizados mediante la t de Student con respecto a la actividad del reportero activado por EGF. *p<0,05.
0
20
40
60
80
100
120EGF 10 nM (10 min)
si-C
ontr
ol
si-V
RK
2-06
si-K
SR1
si-V
RK
2-06
+si-K
SR1
si-C
ontr
ol
si-V
RK
2-06
si-K
SR1
si-V
RK
2-06
+si-K
SR1
* *
HeLa
SRE.Luc
Act
ivac
ión
rela
tiva
0
20
40
60
80
100
120EGF 10 nM (10 min)
si-C
ontr
ol
si-V
RK
2-06
si-K
SR1
si-V
RK
2-06
+si-K
SR1
si-C
ontr
ol
si-V
RK
2-06
si-K
SR1
si-V
RK
2-06
+si-K
SR1
* *
HeLa
SRE.Luc
Act
ivac
ión
rela
tiva
Resultados
- 116 -
quisimos evaluar a través de FPLC (Fast protein liquid chromatography) si VRK2A se
localizaba en las mismas fracciones de elevado peso molecular que KSR1 y MEK1/2 y si de
alguna manera podía estar afectando a los complejos formados por estas proteínas. Para
responder a esta pregunta, decidimos llevar a cabo cromatografía líquida tipo FPLC (Fast
protein liquid chromatography) en condiciones nativas. Esta técnica, combinada con el
posterior análisis de las fracciones recogidas mediante electroforesis SDS-PAGE seguida de l
western-blot, nos permite separar proteínas que forman parte de complejos multiproteicos en
función del peso molecular de estos complejos.
Figura 75. VRK2A contribuye a retener a una subpoblación de KSR1 y MEK1/2 en complejos multiproteicos de 600-1000 kDa. La figura se organiza en tres paneles: panel superior (si-Control), panel intermedio (si-VRK2-06) y panel inferior (si-KSR), en función del ARN de interferencia con el que se trataron las células en cada caso. Células HeLa se transfectaron con los respectivos ARN de interferencia y, 96 horas después, se prepararon los extractos proteicos. Una vez cuantificados los extractos, se separaron cantidades iguales de proteína en cada caso mediante cromatografía líquida tipo FPLC. Se recogieron fracciones de 200 μl, cuyo peso molecular se estableció en relación a marcadores estándar de peso molecular, separados en las mismas condiciones. Las fracciones impares se precipitaron y se sometieron a una separación mediante electroforesis SDS-PAGE. Posteriormente, se llevaron a cabo western blots empleando anticuerpos específicos para detectar las proteínas de interés en cada caso.
si-Control
si-VRK2-06
29 31 33 35 37 39 41 43 45 4749 5153 55 57 59 61 63 65 67697173 75
Marcadores (kDa) 670
158
44 17
KSR1VRK2
MEK 1/2ERK 1/2
B-Raf
KSR1VRK2
MEK 1/2ERK 1/2
B-Raf
KSR1VRK2
MEK 1/2ERK 1/2
B-Raf
si-KSR1
β-actina
VRK2β-actina
KSR1Lisado Total
si-C
ontro
l
si-C
ontro
l
si-V
RK
2-06
si-K
SR
1
si-Control
si-VRK2-06
29 31 33 35 37 39 41 43 45 4749 5153 55 57 59 61 63 65 67697173 75
Marcadores (kDa) 670
158
44 17
KSR1VRK2
MEK 1/2ERK 1/2
B-Raf
KSR1VRK2
MEK 1/2ERK 1/2
B-Raf
KSR1VRK2
MEK 1/2ERK 1/2
B-Raf
si-KSR1
si-Control
si-VRK2-06
29 31 33 35 37 39 41 43 45 4749 5153 55 57 59 61 63 65 67697173 75
Marcadores (kDa) 670
158
44 17
KSR1VRK2
MEK 1/2ERK 1/2
B-Raf
KSR1VRK2
MEK 1/2ERK 1/2
B-Raf
KSR1VRK2
MEK 1/2ERK 1/2
B-Raf
si-KSR1
β-actina
VRK2β-actina
KSR1Lisado Total
si-C
ontro
l
si-C
ontro
l
si-V
RK
2-06
si-K
SR
1
Resultados
- 117 -
En primer lugar, tratamos células HeLa con ARN de interferencia control (si-Control),
así como con ARN de interferencia para VRK2 (si-VRK2-06) y ARN de interferencia para
KSR1 (si-KSR1). De esta manera, además de estudiar la distribución de KSR1, MEK1/2 y
VRK2 en complejos de diferente peso molecular, podemos evaluar si la ausencia de KSR1 o
VRK2 es capaz de alterar la distribución de estos complejos. Comenzamos analizando la
distribución de las proteínas de interés en la población de células control, tratadas con el ARN
de interferencia si-Control, que carece de diana en eucariotas. Tal y como esperábamos, tanto
KSR1 (recuadrada en gris) como VRK2A se localizan, además de como monómeros, en
complejos de peso molecular intermedio (120-300 kDa) y de elevado peso molecular (600-1000
kDa) (Figura 75, panel superior, si-Control). Igualmente, B-Raf se detecta en fracciones
correspondientes a complejos de peso molecular intermedio y elevado. No se detecta esta
proteína en las fracciones correspondientes a su peso molecular como monómero,
probablemente debido a que se encuentra mayoritariamente formando homodímeros y
heterodímeros o en complejos multiproteicos (Farrar, et al., 1996; Karreth, et al., 2009; Weber,
et al., 2001; Wellbrock, et al., 2004). La localización de MEK1/2 (recuadrada en naranja) es
Figura 76. Representación comparativa del porcentaje de KSR1 presente en las fracciones de interés, tras el tratamiento con el ARN de interferencia si-Control o el ARN de interferencia para VRK2 (si-VRK2-06). Se cuantificó el porcentaje de la proteína KSR1 presente en las fracciones de interés, tras llevar a cabo la separación del contenido proteico de las muestras mediante cromatografía FPLC y posterior electroforesis (SDS-PAGE) y western blot. La cuantificación de los niveles relativos de proteína se llevó a cabo mediante el programa Quantity One (BIO-RAD).
0
5
10
31 33 35 37 39 41 43 45 47 49 51 53 55 57 59Fracción
si-Control
Dis
tribu
ción
de
KS
R1
por
fracc
ione
s
Complejos de(1000-600 kDa)
Complejos(300-100 kDa)
0
5
10
31 33 35 37 39 41 43 45 47 49 51 53 55 57 59Fracción
si-VRK2-06
Dis
tribu
ción
de
KS
R1
por f
racc
ione
s
Complejos de(1000-600 kDa)
Complejos(300-100 kDa)
1,4%
6,7%7,5%
6,1%7,5%
7,5%
6%
0,3%1,4%
2,1%
7,9%
11,9%12,6%
10,9%9%
1,7%4,3%
5,8%3,2%
4%3,2%
2,1% 1,1%
11%
16,5%15,6%
17,3%14,1%
0
5
10
31 33 35 37 39 41 43 45 47 49 51 53 55 57 59Fracción
si-Control
Dis
tribu
ción
de
KS
R1
por
fracc
ione
s
Complejos de(1000-600 kDa)
Complejos(300-100 kDa)
0
5
10
31 33 35 37 39 41 43 45 47 49 51 53 55 57 59Fracción
si-VRK2-06
Dis
tribu
ción
de
KS
R1
por f
racc
ione
s
Complejos de(1000-600 kDa)
Complejos(300-100 kDa)
1,4%
6,7%7,5%
6,1%7,5%
7,5%
6%
0,3%1,4%
2,1%
7,9%
11,9%12,6%
10,9%9%
1,7%4,3%
5,8%3,2%
4%3,2%
2,1% 1,1%
11%
16,5%15,6%
17,3%14,1%
Resultados
- 118 -
más restringida, pero se detecta tanto como monómero y dímero como en complejos de elevado
peso molecular (700-1000 kDa) (Figura 75, panel superior, si-Control). Además, KSR1,
MEK1/2 y VRK2 se localizan en las mismas fracciones correspondientes a complejos de
elevado peso molecular (700-1000 kDa), lo que apoya la hipótesis de que estén formando
complejos in vivo (Figura 75, panel superior, si-Control). Por otro lado, cuando comparamos la
distribución de KSR1, MEK1/2 y VRK2 tras silenciar la expresión de VRK2, mediante el
tratamiento durante 96 horas con el ARN de interferencia específico, observamos una
redistribución de KSR1 (recuadrado en azul) y de MEK1/2 (recuadrado en amarillo), cuya
presencia disminuye en las fracciones de elevado peso molecular (Figura 75, panel intermedio,
si-VRK2-06). Es decir, VRK2 parece estar contribuyendo a retener a una subpoblación de
KSR1 y MEK1/2 en complejos multiproteicos de 700-1000 kDa. En la figura 76, la
cuantificación de los niveles relativos de KSR1 en cada fracción tras el tratamiento con si-
Control o si-VRK2-06 refleja el desplazamiento de KSR1 desde los complejos multiproteicos
de elevado peso molecular a los de peso molecular intermedio tras el silenciamiento de VRK2
(Figura 76).
Finalmente, el silenciamiento de la expresión de KSR1 se traduce en una disminución
de la presencia de las proteínas MEK1/2 y B-Raf en los complejos de elevado peso molecular
(700-1000 kDa) (Figura 75, panel inferior, si-KSR1). En concordancia con estos resultados,
Stewart y colaboradores habían descrito como la presencia de MEK1/2 en este tipo de
complejos dependía de su interacción con KSR1 (Stewart, et al., 1999). Sin embargo, la
presencia de VRK2 en los complejos de elevado peso molecular no se ve afectada por el
silenciamiento de la proteína KSR1 (Figura 75, panel inferior, si-KSR1).
De esta manera, podemos concluir que existen complejos multiproteicos de
señalización, compuestos por las proteínas KSR1-Raf-MEK1/2, de diferentes rangos de peso
molecular. VRK2A contribuye a retener a una subpoblación de KSR1 y MEK1/2 en complejos
multiproteicos de elevado peso molecular (700-1000 kDa) y modula la señalización de ERK1/2
a través de estos complejos.
DDDIIISSSCCCUUUSSSIIIÓÓÓNNN
Discusión
- 121 -
1 La quinasa VRK2 endógena 1.1 Expresión y localización subcelular Nezu y colaboradores describieron, inicialmente, a la quinasa humana VRK2 como una
proteína de expresión ubicua (Nezu et al., 1997). Posteriormente, se diferenció la existencia de
dos isoformas VRK2A (de expresión ubicua) y VRK2B (de expresión restringida a
determinados tipos celulares) (Blanco et al., 2006). La isoforma VRK2A contiene una región
hidrofóbica, carboxilo terminal, que la ancla a membranas de retículo endoplasmático,
mitocondrias y envoltura nuclear. En cambio, la isoforma VRK2B se localiza libre tanto en el
núcleo como en el citosol (Blanco et al., 2006; Nichols and Traktman, 2004). Las quinasas de la
familia VRK presentan grandes dominios extracatalíticos que, además, se encuentran muy
conservados entre los ortólogos humanos y murinos (Nichols and Traktman, 2004). Esto sugiere
que estas regiones extracatalíticas, localizadas en el extremo carboxilo terminal de VRK1 y
VRK2 y en el extremo amino terminal de VRK3, desempeñan importantes funciones en estas
proteínas. Estas funciones probablemente se relacionen con la localización subcelular, su
regulación y la interacción con otras proteínas. Nosotros quisimos comparar la localización
subcelular de las quinasas VRK2 respecto a la quinasa VRK1, dado que esta diferente
localización subcelular parece ser clave a la hora de explicar las diferentes funciones biológicas
desempeñadas por estas quinasas. De hecho, si bien VRK1, VRK2A y VRK2B tienden a
compartir sustratos de fosforilación in vitro, debido a la enorme similitud de su dominio
catalítico amino terminal, las diferencias en su extremo carboxilo responsable de su diferente
localización subcelular sugieren que probablemente difieran en sus sustratos fisiológicos in
vivo. Así, si bien las tres quinasas fosforilan al factor de transcripción p53 in vitro, tan solo las
quinasas nucleares VRK1 y VRK2B son capaces de mediar su estabilización y activación
transcripcional (Blanco et al., 2006).
Al conocerse la existencia de poblaciones citosólicas de VRK1 (Valbuena et al., 2007a),
llevamos a cabo inmunofluorescencias mediante las cuales hemos constatado que no se detecta
ningún tipo de colocalización entre las poblaciones citosólicas de VRK1 y VRK2. Además,
quisimos descartar la presencia de VRK2 en aquellas localizaciones subcelulares citosólicas en
las que se ha descrito la existencia de subpoblaciones de VRK1, como el aparato de Golgi o el
sistema lisosomal (Lopez-Sanchez et al., 2009; Valbuena et al., 2008a; Valbuena et al., 2007a).
A través de inmunofluorescencia, pudimos concluir que VRK2 no colocaliza con la proteína
GM130, proteína estructural del aparato de Golgi, empleada como marcador de este orgánulo.
De igual manera, tampoco se detecta ningún tipo de colocalización entre VRK2 y la proteína
LAMP2, marcador lisosomal. Estos resultados apoyan la hipótesis de que si bien VRK1 y la
isoforma VRK2A tienden a compartir sustratos in vitro, su diferente localización subcelular
Discusión
- 122 -
probablemente impida que muchos de estos sustratos, restringidos a regiones celulares
específicas, estén accesibles para ambas quinasas. De hecho, los datos de que disponemos hasta
el momento apuntan a que VRK1 y VRK2A participan en diferentes procesos a nivel celular.
Así, por ejemplo, si bien la población de VRK1 presente en el aparato de Golgi participa en la
fragmentación de este orgánulo, esta función no sería desempeñada por la quinasa VRK2A
(Lopez-Sanchez et al., 2009). Por el contrario, la isoforma nuclear VRK2B podría desempeñar a
nivel celular funciones muy similares a las de VRK1, incluso reemplazándola funcionalmente
en los casos en los que la expresión de VRK1 se vea disminuida (Blanco et al., 2006).
1.2. Expresión de VRK2 en tumores de mama
Hasta el momento, numerosos trabajos han estudiado la expresión de la quinasa humana
VRK1, tanto en tejidos normales como tumorales. De esta manera, a nivel histológico, VRK1
correlaciona con marcadores de proliferación celular (como por ejemplo Ki67) (Santos et al.,
2006; Valbuena et al., 2008b; Valbuena et al., 2007b). Además, recientemente han comenzado a
surgir evidencias de que la quinasa VRK1 pueda comportarse como un marcador de mal
pronóstico en cáncer de mama (Finetti et al., 2008; Fournier et al., 2006).
Dado que carecíamos de datos acerca de los patrones de expresión de la quinasa humana
VRK2 a nivel histológico, quisimos estudiar su expresión en tejidos de mama tanto normales
como tumorales. El único anticuerpo disponible (anti-VRK2, de producción propia en el
laboratorio) detecta, simultáneamente, la expresión de ambas isoformas VRK2A y VRK2B.
VRK2 muestra una distribución ubicua pero predominantemente citosólica en los tejidos de
mama no tumorales, expresándose en las células situadas tanto en posición basal como luminal,
dentro del epitelio de la glándula mamaria. Además, se observa una tinción de tipo granular en
el citosol, acorde con una localización anclada a membranas. Estos datos nos indican que en los
tejidos de mama se expresa, al menos, la isoforma VRK2A.
Posteriormente, decidimos estudiar la expresión de VRK2 en relación a marcadores
moleculares empleados de forma rutinaria en el diagnóstico del cáncer de mama. Los
marcadores moleculares pueden tener valor pronóstico, cuando correlacionan con las tasas de
supervivencia, o valor predictivo, cuando permiten seleccionar a los pacientes por su adecuada
respuesta a una determinada terapia. Así, los marcadores moleculares de uso más frecuente en
cáncer de mama, el receptor ErbB2 y el receptor de estrógeno, tienen valor tanto pronóstico
como predictivo (Esteva and Hortobagyi, 2004). Debido a la gran heterogeneidad que presentan
los tumores de mama, especialmente en lo que respecta a la respuesta a los tratamientos, sigue
siendo necesario identificar nuevos marcadores moleculares que, en combinación con los ya
existentes, nos permitan seleccionar mejor a los pacientes más apropiados para cada terapia o
Discusión
- 123 -
incluso diseñar estrategias terapéuticas nuevas. Por este motivo, estudiamos la expresión de
VRK2 en una serie de biopsias de cáncer de mama, clasificadas como ErbB2 positivas o
negativas. Este receptor se encuentra sobreexpresado en un 25-30% de los tumores de mama y
constituye un marcador de mal pronóstico (Slamon et al., 1987). Inicialmente, observamos que
existía una correlación inversa entre los niveles de expresión de VRK2 y los del receptor de
membrana tirosín quinasa ErbB2. Es decir, los tumores ErbB2 positivos tienden a disminuir o
perder la expresión de VRK2. La down-regulación de la expresión de una proteína puede
ocurrir a varios niveles. Así, a nivel transcripcional, ErbB2 podría estar regulando determinados
factores de transcripción y de esta manera inducir una menor transcripción del gen de VRK2 o
bien, en los tumores ErbB2 positivos, la acumulación de alteraciones epigenéticas puede dar
lugar al silenciamiento del gen de VRK2. Otra posibilidad es la perdida de heterocigosidad
(LOH) en la región del gen de VRK2, en este tipo de tumores. A nivel post-traduccional, ErbB2
podría estar induciendo la degradación proteica de VRK2. La observación a través de
inmunofluorescencia, en células MCF7 (ErbB2 negativas), de que la sobreexpresión del
receptor ErbB2 no induce una menor expresión de VRK2 endógena respecto a las células
circundantes que no sobreexpresan el receptor, nos hace pensar que probablemente ErbB2 no
esté induciendo la degradación de VRK2 (Figura 42B). Por otro lado, por ensayos de estabilidad
proteica con cicloheximida, sabemos que VRK2 es una proteína de larga vida media. Por este
motivo, serían tal vez necesarios tiempos largos de sobreexpresión del receptor ErbB2 para
determinar con certeza si ErbB2 puede disminuir la transcripción del gen de VRK2. Sin
embargo, tal y como se discutirá más adelante, no existe disminución de la expresión de VRK2
en aquellas líneas celulares tumorales de mama ErbB2 positivas frente a las líneas celulares
ErbB2 negativas. Este hecho nos lleva a hipotetizar que el mecanismo más probable, para
explicar la pérdida de expresión de VRK2 en los tumores ErbB2 positivos, sea el silenciamiento
del gen de VRK2, derivado de la acumulación progresiva de alteraciones epigenéticas en los
tumores primarios o bien la perdida de heterocigosidad asociada a los mismos.
A continuación, decidimos estudiar la expresión de VRK2 en relación a otros
marcadores de uso rutinario en cáncer de mama, como los receptores de estrógeno y
progesterona. Estos receptores se consideran marcadores de buen pronóstico en cáncer de
mama. Existe una correlación inversa entre la expresión del receptor de estrógeno y la del
receptor ErbB2, de manera que los tumores receptor de estrógeno negativos tienden a
sobreexpresar ErbB2 y ser más agresivos (Harari and Yarden, 2000). Esto es debido a que
ambos receptores reprimen la expresión del otro (Grunt et al., 1995; Mueller et al., 1995). Por
este motivo, cabía esperar que los tumores receptor de estrógeno negativos (que por lo general
son ErbB2 positivos) expresasen bajos niveles de VRK2. En concordancia con los resultados
Discusión
- 124 -
anteriores, pudimos determinar que, efectivamente, existía una correlación positiva entre la
expresión tanto del receptor de estrógeno como del de progesterona con la expresión de VRK2.
Por lo tanto, podemos concluir que en tumores de mama VRK2 correlaciona
negativamente con marcadores de mal pronóstico, como el receptor ErbB2 y correlaciona
positivamente con marcadores de buen pronóstico, como los receptores de estrógeno y
progesterona. Es decir, VRK2 parece estar comportándose en los tumores de mama como un
marcador de buen pronóstico. Por el contrario, varios trabajos independientes han sugerido que
la quinasa humana VRK1 podría tener valor predictivo, junto con otros genes, como marcador
de mal pronóstico en pacientes de cáncer de mama (Finetti et al., 2008; Fournier et al., 2006).
Estos resultados son consistentes con las diferentes funciones que desempeña VRK1, que la
sitúan como una quinasa esencial para la correcta progresión del ciclo celular (Marta Sanz-
García, 2010; Valbuena et al., 2008b). A tenor de nuestros resultados, VRK1 y VRK2 parecen
comportarse de forma opuesta en los tumores de mama, lo que indica que probablemente
desempeñen funciones muy diferentes a nivel celular.
1.3 Expresión de VRK2 en un panel de líneas celulares de mama
Las líneas celulares de mama constituyen modelos de trabajo muy útiles en los
laboratorios de biología molecular y celular. Por este motivo, nos planteamos estudiar la
expresión de las quinasas VRK, con especial interés en VRK2A y VRK2B, en un panel de estas
líneas celulares.
A diferencia de lo que observábamos en las inmunohistoquímicas, al comparar los
niveles de expresión de VRK2A y VRK2B entre líneas celulares tumorales de mama ErbB2
positivas y ErbB2 negativas, no pudimos detectar menores niveles de expresión de una o ambas
isoformas de VRK2 en las líneas celulares ErbB2 positivas. Por un lado, esto no es sorprendente
si tenemos en cuenta las grandes diferencias existentes entre los tumores primarios y las líneas
celulares tumorales. En los tumores primarios de mama se puede detectar un subgrupo tumoral
con un patrón de expresión de genes asociado a la sobreexpresión del receptor ErbB2 (Neve et
al., 2006). En cambio, en las líneas celulares tumorales de mama no existe un subgrupo ErbB2
positivo asociado a un patrón transcripcional de genes, sino que las líneas celulares ErbB2
positivas se distribuyen entre los subgrupos luminal y basal A (Neve et al., 2006). Así, estas
discrepancias, entre los resultados que observamos a nivel de tumores primarios y líneas
celulares, pueden deberse a varios factores. Por un lado, las líneas celulares tumorales han sido
obtenidas por lo general de tumores en estadios tardíos y han sufrido un proceso de selección
por su cultivo in vitro. Por otro lado, no se puede descartar la enorme influencia del
Discusión
- 125 -
microambiente tumoral en el desarrollo del tumor. Las líneas celulares tumorales, al ser
cultivadas de forma aislada en placa, no resultan reguladas por el microambiente tumoral.
La tres quinasas (VRK1, VRK2A y VRK2B) se expresan en un panel de líneas
celulares tumorales de mama de tipo luminal. Los niveles de expresión de VRK1 y VRK2A son
relativamente constantes en las líneas celulares de tipo luminal y basal. En cambio, cuando
estudiamos un panel comparativo de líneas celulares luminales frente a líneas celulares basales,
observamos que, salvo por la excepción de la línea celular de tipo basal A, HCC1937, las líneas
celulares de tipo basal expresan niveles extremadamente bajos de la isoforma VRK2B en
contraposición a las líneas celulares de tipo luminal. Esta correlación se ha observado también
en otras líneas celulares, empleadas a lo largo de nuestro estudio, pero que no estaban
representadas en los paneles de líneas celulares. Así, las líneas celulares luminales SKBR3 y
BT474 expresan niveles elevados de VRK2B. Por el contrario, las líneas celulares MDA-MB-
231 y Cal51, ambas de tipo basal B, expresan niveles de VRK2B casi indetectables. Por el
momento, desconocemos el significado de esta asociación entre el subtipo de línea celular de
mama y los niveles de expresión de VRK2B. Cabe la posibilidad de que la expresión de
VRK2B se relacione con el origen histológico de cada tipo celular. Así, las células luminales y
basales se diferencian por su posición en el epitelio de la glándula mamaria y por el tipo de
moléculas de adhesión de tipo queratina que expresan (Petersen and Polyak, 2010; Taylor-
Papadimitriou et al., 1989). Por otro lado, los bajos niveles de expresión de VRK2B, en líneas
celulares tumorales de tipo basal, podrían asociarse a las características específicas de estas
líneas celulares tumorales. Las líneas celulares tumorales basales y en especial las basales tipo
B, presentan aspecto más indiferenciado, uniones intercelulares más débiles y un mayor
potencial invasivo (Neve et al., 2006). La pérdida o disminución de la expresión de VRK2B
podría asociarse a la adquisición de alguna de estas características.
Quisimos, además, estudiar la expresión de marcadores de ciclo o proliferación celular
en este panel de líneas celulares de mama. La expresión del marcador de proliferación PCNA
(antígeno nuclear de proliferación celular) era muy homogénea y elevada, por lo que no nos
permite clasificar estas células en función de su potencial proliferativo. Sin embargo, al estudiar
la expresión de ciclina D1, observamos que existía una correlación positiva entre los niveles de
expresión de esta proteína y los de la quinasa VRK2B. Esta ciclina es la primera que se induce
cuando las células que están en fase G0 son estimuladas para reiniciar un nuevo ciclo celular.
Además, la sobreexpresión de ciclina D1 es bastante frecuente en tumores y líneas celulares
tumorales de mama (Sherr, 1994; Weinstat-Saslow et al., 1995; Worsley et al., 1997). Se ha
demostrado que el silenciamiento de VRK1 disminuye los niveles de proteína de algunos
reguladores del ciclo celular como la ciclina D1 y que, además, VRK1 induce la expresión de
Discusión
- 126 -
esta ciclina a través de la fosforilación del factor de transcripción CREB (Kang et al., 2008;
Valbuena et al., 2008b). Teniendo en cuenta que se ha descrito como la isoforma VRK2B
puede, en ocasiones, desempeñar funciones similares a las de VRK1, a nivel nuclear (Blanco et
al., 2006), cabe la posibilidad de que VRK2B esté regulando también la expresión de la ciclina
D1. Esto explicaría la correlación positiva entre la expresión de ambas proteínas. Sin embargo,
esta hipótesis aún no ha sido corroborada.
2. VRK2 como modulador de la ruta de ERK1/2
2.1 Modulación negativa de la ruta de señalización de ERK1/2 por la quinasa humana
VRK2A
La pérdida de la expresión de una proteína durante el desarrollo tumoral está
frecuentemente asociada a un papel como supresor tumoral. Así, por ejemplo, la expresión de la
proteína Sprouty 2 (inhibidora de la señalización por FGF) está frecuentemente disminuida en
tumores de mama y próstata (Lo et al., 2006; Lo et al., 2004). Por este motivo, el hecho de que
los tumores ErbB2 positivos mostrasen una expresión reducida de VRK2 resultaba
especialmente llamativo. Esta observación nos llevó a plantearnos la posibilidad de que
VRK2A, VRK2B o ambas, estuviesen regulando alguna de las rutas de señalización activadas
por el receptor ErbB2. Este receptor se localiza a nivel de la membrana plasmática, desde donde
activa múltiples cascadas de señalización (Citri and Yarden, 2006). Así, la sobreexpresión de
ErbB2 es capaz de activar la transcripción de un reportero de luciferasa bajo el control de un
Elemento de Respuesta a Suero (SRE). Este Elemento de Respuesta a Suero es una secuencia
génica presente en los promotores de numerosos genes cuya transcripción se activa de forma
rápida tras la estimulación con factores de crecimiento o mitógenos (Treisman, 1992). En este
trabajo, hemos demostrado que la sobreexpresión de la quinasa humana VRK2A es capaz de
inhibir la activación transcripcional del Elemento de Respuesta a Suero por ErbB2. Dado que
VRK2A no está afectando a los niveles de expresión proteica de ErbB2, podemos concluir que
no está promoviendo la degradación de este receptor y, por lo tanto, ha de estar afectando a la
señalización a través de alguna de las rutas activadas por ErbB2. De hecho, VRK2A es capaz de
inhibir la activación transcripcional del Elemento de Respuesta a Suero actuando por debajo de
los mutantes constitutivamente activos H-RasG12V, B-RafV600E y MEK1(CA). Además, la
sobreexpresión de VRK2A se traduce en una disminución de los niveles de fosforilación de
ERK1/2 en el residuo tirosina 204. Este residuo, situado en el loop de activación de ERK1/2, es
fosforilado exclusivamente por las quinasas MEK1/2. Esta disminución en los niveles de
Discusión
- 127 -
activación de ERK1/2 va acompañada de una disminución de los niveles de fosforilación de uno
de los sustratos directos de ERK1/2, la proteína p90RSK. Esta quinasa se encarga de fosforilar a
sustratos tanto nucleares como citosólicos, regulando diferentes procesos como la transcripción,
traducción, migración, apoptosis y progresión de ciclo celular (Anjum and Blenis, 2008). Estos
resultados nos permiten concluir que VRK2A, al disminuir los niveles totales de activación de
ERK1/2 y p90RSK, está afectando tanto a la señalización citosólica como nuclear de ERK1/2.
Por otro lado, los niveles de activación de las quinasas MEK1/2 no se ven afectados por la
sobreexpresión de VRK2A o el silenciamiento de VRK2. Estos resultados nos permiten situar a
VRK2A por debajo de MEK1/2, en la ruta de señalización de ERK1/2. Además, el hecho de que
VRK2A se sitúe al final de la cascada de señalización de ERK1/2 es consistente con la
observación de que otra de las rutas de señalización activada por el receptor ErbB2, tal como la
ruta de PI3K/AKT (responsable principalmente del balance final entre la supervivencia o
apoptosis celular) no se vea afectada por la sobreexpresión de VRK2A o el silenciamiento de
VRK2.
Por lo tanto, hemos demostrado que VRK2A es capaz de disminuir la activación de la
ruta de ERK1/2, en varios modelos celulares. En cambio, la sobreexpresión de VRK2A no
afecta a la activación transcripcional del Elemento de Respuesta a Suero por las rutas de
señalización de las pequeñas GTPasas Rho-A, Rac o CDC-42 (Figura 39). Concretamente, las
pequeñas GTPasas Rac y CDC-42 activan la transcripción del Elemento de Respuesta a Suero a
través de la ruta de señalización de JIP/MEKK1-4/MKK4,7/JNK (Johnson, 1999; Johnson and
Lapadat, 2002; Treisman, 1992). Por su parte, VRK2A y VRK2B son capaces de regular
negativamente la señalización de la vía JIP1/TAK1/MKK7/JNK, en respuesta a la estimulación
con interleuquina 1β e hipoxia (Blanco et al., 2007; Blanco et al., 2008). Sin embargo, en este
estudio, hemos observado que la quinasa TAK1 y su cofactor TAB1, si bien son responsables de
la activación transcripcional de sitios AP1 (Blanco et al., 2007), no participan en la activación
transcripcional del Elemento de Respuesta a Suero (Figura 40). Esto nos lleva a concluir que
VRK2A no regula negativamente la activación transcripcional del Elemento de Respuesta a
Suero por Rac y CDC-42, probablemente debido a que la quinasa TAK1 no está implicada en la
activación de JNK por estas GTPasas. Es decir, que VRK2A estaría implicada en la modulación
de la señalización de JIP1/JNK, cuando la activación de JNK depende de la quinasa TAK1, pero
probablemente no cuando JNK es activada vía otras MAPKKKs diferentes a TAK1.
Además, hemos demostrado que otras quinasas de la familia VRK como VRK1 o
VRK2B no están implicadas en la modulación negativa de la ruta de señalización de ERK1/2.
En cambio, tanto VRK2A como VRK3, participan en una regulación negativa de la señalización
Discusión
- 128 -
de ERK1/2, si bien, llevan a cabo esta función a través de diferentes mecanismos de acción, tal
y como se discutirá más adelante.
Nuestros resultados contribuyen a situar a la quinasa humana VRK2A en una nueva ruta
de señalización de MAPKs (Figura 77). De esta manera, ampliamos el escaso conocimiento
existente acerca del papel de esta quinasa, que hasta el momento sólo había sido implicada en la
modulación negativa de la ruta de señalización de JIP1/TAK1/MKK7/JNK en repuesta a
estímulos como IL-1β e hipoxia (Blanco et al., 2007; Blanco et al., 2008).
Las proteínas quinasas activadas por mitógenos (MAPKs) se encargan de transmitir
señales generadas en la superficie de la membrana a través de cascadas de fosforilaciones.
Diferentes estímulos como estrés, mitógenos, citoquinas, entre otros, son responsables de la
activación de cada una de las cascadas para generar respuestas variables, dependiendo del
contexto fisiológico (Johnson and Lapadat, 2002; Karin and Hunter, 1995). Así, resulta
importante identificar en respuesta a qué estímulos concretos participa una quinasa, dentro de
cada ruta de señalización. Uno de los primeros factores identificados por su capacidad para
inducir la fosforilación de ERK1/2 y la proliferación celular fue la proteína denominada factor
de crecimiento epidérmico (EGF) (Cohen, 1965). Hemos determinado como la quinasa VRK2A
Figura 77. Esquema de las rutas de señalización en las que participa la quinasa humana VRK2A. VRK2A es capaz de modular negativamente la ruta de señalización de ERK1/2, en respuesta a estímulos como el factor de crecimiento epidérmico (EGF) o los mitógenos y factores presentes en el suero. Tanto VRK2A como VRK2B inhiben la señalización a través de la ruta de JIP1/TAK1/MKK7/JNK, en respuesta a estímulos como la interleuquina 1 o las señales de hipoxia. Esto se traduce en una disminución de la transcripción dependiente del Elemento de Respuesta a suero (SRE) y de los sitios AP1, respectivamente.
Discusión
- 129 -
modula negativamente la ruta de señalización de ERK1/2 en respuesta a la activación por el
factor de crecimiento epidérmico, pero también en respuesta a los mitógenos y factores
presentes en el suero. Sin embargo, al actuar al final de la ruta de señalización, cabe la
posibilidad de que VRK2A regule la señalización de ERK1/2 en respuesta a otros estímulos que
no han sido estudiados o incluso que contribuya, aún en células quiescentes, a mantener unos
niveles basales de ERK1/2 inactivo. Esto no sería de extrañar si tenemos en cuenta la
importancia del control preciso y que ocurre a muy diferentes niveles, de las vías de
señalización de ERK1/2 (English et al., 1999; Inder et al., 2008; Kolch, 2005; Murphy and
Blenis, 2006). Una de las dianas transcripcionales clásicas del factor de crecimiento epidérmico
(EGF) es la ciclina D1. El factor de crecimiento epidérmico (EGF) activa la señalización de
ERK1/2, lo cual conduce a la activación transcripcional del sitio AP1 presente en el promotor de
la ciclina D1 y consecuentemente a la expresión de esta proteína. En concordancia con los
resultados anteriores, hemos determinado que la quinasa humana VRK2A inhibe la activación
transcripcional del promotor de la ciclina D1 por EGF. Por el contrario, la sobreexpresión de la
quinasa humana VRK1 se traduce en una mayor activación transcripcional del promotor de la
ciclina D1 en respuesta a EGF. Esta observación se puede atribuir a la capacidad de VRK1 de
inducir la expresión de la ciclina D1 a través de la fosforilación del factor de transcripción
CREB (Kang et al., 2008). Se ponen así de manifiesto, de nuevo, los papeles opuestos
desempeñados por las quinasas VRK1 y VRK2A a nivel celular.
Por otro lado, el silenciamiento de la expresión de VRK2 se traduce en un incremento
de los niveles basales de fosforilación de ERK1/2, sin afectar a los niveles de activación de
MEK1/2 y AKT. Así mismo, también da lugar a una mayor respuesta a EGF. El tratamiento con
los ARN de interferencia para VRK2 permite disminuir entre un 60-80% los niveles de ARN
mensajero de VRK2A y VRK2B en todas las líneas celulares estudiadas. Sin embargo, la
disminución en los niveles de expresión proteica de estas quinasas requiere tiempos largos de
tratamiento con los ARN de interferencia. Esta observación guarda relación con la gran
estabilidad de estas proteínas, de manera que, aún tras el cese de su transcripción, tardan varios
días en degradarse debido a su larga vida media. Además, el hecho de que nos resultase
imposible silenciar la expresión de VRK2 en líneas celulares como MCF7, MDA-MB-435 o
SKBR3 pero no en otras como MDA-MB-231 o HeLa, sugiere que la estabilidad de las
proteínas VRK2A y VRK2B varía mucho en función de la línea celular, lo que podría tal vez
ser indicativo de la existencia de algún tipo de mecanismo de regulación de su estabilidad.
Discusión
- 130 -
2.2 Estudio del mecanismo de acción por el que VRK2A inhibe la ruta de señalización de
ERK1/2
VRK2A modula negativamente la cascada de señalización de ERK1/2, actuando por
debajo de MEK1/2. Dado que el mutante quinasa inactivo VRK2AK169E también lleva a acabo
este efecto, deducimos que el mecanismo de acción es independiente de la actividad quinasa de
VRK2A. Por lo tanto, VRK2A ha de estar regulando la señalización de la ruta de ERK1/2 por
un mecanismo dependiente de una interacción proteína-proteína. Esto no es extraño, si tenemos
en cuenta que la modulación de la ruta de señalización de JNK por VRK2A y VRK2B se lleva a
cabo también por un mecanismo independiente de actividad quinasa (Blanco et al., 2007;
Blanco et al., 2008). También en el caso de la pseudoquinasa VRK3, la modulación negativa de
la ruta de señalización de ERK1/2 transcurre por un mecanismo dependiente de una interacción
proteína-proteína (Kang and Kim, 2006). De hecho, hasta el momento no se conoce ningún
sustrato de fosforilación in vivo para VRK2A. Diversos trabajos han demostrado cómo VRK2A
y VRK2B fosforilan in vitro a sustratos como la proteína de la envuelta nuclear BAF o la
histona H3 (Nichols et al., 2006; Sanz-Garcia et al., 2008). Sin embargo, aún no ha sido
demostrado el que estas fosforilaciones tengan lugar in vivo y cual sería su relevancia. Tan sólo
en el caso de la quinasa VRK2B se ha demostrado que la fosforilación de p53 en el residuo
treonina 18 tiene un efecto sobre la estabilidad y actividad transcripcional de este sustrato
(Blanco et al., 2006; Valbuena et al., 2008a).
La capacidad de la ruta de ERK1/2 para transmitir señales que pueden dar lugar a
efectos biológicos opuestos y la importancia, a nivel celular, de una estricta regulación espacial
y temporal de esta ruta de señalización, se ha ido perfilando con los continuos descubrimientos
de proteínas que modulan o inhiben la señalización de ERK1/2. De la misma manera que resulta
vital una rápida transmisión de la señal que permita a la célula responder a las señales externas,
la atenuación de la señal es indispensable para garantizar una adecuada respuesta celular. No es
infrecuente que algunos de los moduladores negativos de la ruta de ERK1/2 ejerzan su acción
por mecanismos dependientes de interacciones proteína-proteína. Así, la proteína RKIP actúa
como inhibidor competitivo que impide la unión de Raf-1 a MEK (Yeung et al., 1999). Otros
ejemplos serían las proteínas Anexina 6, Sprouty 1/2/4, Spred, NF2 (Merlin), RKTG, NOREIA
o VRK3 (Feng et al., 2007; Gross et al., 2001; Hanafusa et al., 2002; Kang and Kim, 2006,
2008; Sasaki et al., 2003; Vila de Muga et al., 2009). De esta manera, la mayor parte de las
proteínas que modulan la ruta de ERK1/2 interaccionan con, al menos, un componente de la
cascada de señalización y en ocasiones establecen complejas redes de interacciones. Por este
motivo, quisimos analizar la posible interacción de VRK2 con aquellas proteínas de la ruta de
Discusión
- 131 -
señalización de ERK1/2, que por su posición en la cascada, pudiesen ser susceptibles de
interaccionar con VRK2A.
Al poco tiempo de iniciar muestro estudio, se publicó un trabajo en el que se describía
como la pseudoquinasa VRK3 regulaba negativamente la señalización de ERK1/2, a través de la
interacción y activación de la fosfatasa VHR (Kang and Kim, 2006, 2008). Esta fosfatasa de
expresión ubicua y localización tanto nuclear como citosólica, es capaz de desfosforilar a
ERK1/2 y JNK. De esta manera, parece que desempeña un papel en el mantenimiento de los
niveles adecuados de actividad de ERK1/2, tanto en células en reposo como estimuladas
(Bayón, 2010; Rahmouni et al., 2006). Si bien VRK3 y VRK2A presentan tan solo un 23% de
homología de secuencia, la reciente cristalización del dominio quinasa de ambas proteínas ha
permitido determinar que son estructuralmente similares. A pesar de ser catalíticamente
inactiva, el plegamiento del dominio quinasa de VRK3 está muy conservado respecto al de
VRK2. Además, VRK3 presenta una región altamente conservada (respecto al resto de las
proteínas de la familia VRK) en la cara opuesta al sitio activo, de manera que se especula que
esta región se haya mantenido para retener sus motivos de interacción con determinadas
proteínas (Scheeff et al., 2009). Por todo ello, VHR nos parecía una candidata idónea a
interaccionar con VRK2A y explicar así el mecanismo por el cual esta quinasa disminuye los
niveles de activación de ERK1/2. Comprobamos que VHR parecía interaccionar tanto con
VRK3 como con VRK1. En cambio, no detectamos interacción de VHR con la quinasa VRK2A
sobreexpresada ni endógena. De igual manera, descartamos también la posibilidad de que
VRK2A interaccionase con algunas de las principales fosfatasas de ERK1/2 como son MKP-1,
MKP-2 o MKP-3. Sin embargo, debido al elevado número de fosfatasas de ERK1/2, no
podemos descartar totalmente la posible interacción de VRK2A con alguna otra fosfatasa de
esta ruta.
Decidimos, a continuación, evaluar la posible interacción de VRK2A con aquellas
quinasas que constituyen el módulo de señalización de ERK1/2. Ensayos de tipo Pull-down nos
permitieron descartar la existencia de una interacción entre VRK2A y las quinasas B-Raf y
ERK1/2. Es frecuente que aquellas proteínas inhibidoras de la señalización de ERK1/2, que
actúan por encima de MEK1/2 en la cascada, interaccionen con la quinasa Raf. Este es el caso
de la proteína RKIP que se une a Raf y MEK1/2 impidiendo su interacción o de la proteína
RKTG que secuestra a Raf en el aparato de Golgi (Feng et al., 2007; Yeung et al., 1999). Sin
embargo, VRK2A modula la ruta de ERK1/2 sin afectar a la activación de MEK1/2 por Raf, por
lo que no es de extrañar que no interaccione con Raf. Por otro lado, la ausencia de interacción
con ERK1/2, nos permite descartar la posibilidad de que VRK2A pudiese secuestrar a ERK1/2
en una determinada localización subcelular que lo hiciese inaccesible para MEK1/2.
Discusión
- 132 -
A continuación, quisimos evaluar la posible interacción de VRK2A con MEK1/2.
Ensayos de Pull-Down con las proteínas sobreexpresadas nos permitieron determinar que
VRK2A interacciona con MEK1/2 a través de su extremo amino terminal (aminoácidos 1-320
de VRK2A). Además, pudimos confirmar esta interacción a través de la co-inmunoprecipitación
de ambas proteínas endógenas. Dado que VRK2A y VRK2B son idénticas en su secuencia hasta
el aminoácido 394, parecía probable, tal y como pudimos demostrar, que VRK2B interaccionase
también con MEK1 a través de su extremo amino terminal (Figura 78). El hecho de que ambas
isoformas sean capaces de interaccionar con MEK1 pero, sin embargo, solamente VRK2A
inhiba la ruta de señalización de ERK1/2, nos indica que la interacción con MEK1 por sí sola no
es suficiente para explicar el mecanismo por el cual VRK2A regula la señalización de ERK1/2.
Estos datos sugieren que VRK2A, probablemente debido a su diferente localización subcelular
(mediada por su extremo carboxilo terminal), es capaz de interaccionar con otras proteínas que
participan en el balance final de activación de esta ruta: proteínas scaffold o proteínas
inhibidoras, entre otras.
Las proteínas de ensamblaje o scaffold actúan a modo de plataformas que reúnen a los
distintos componentes de una ruta de señalización, facilitando la transmisión de la señal a nivel
local y contribuyendo a la especificidad de la respuesta. La posibilidad de que VRK2A
estuviese interaccionando con una proteína scaffold de la ruta de señalización de ERK1/2
resultaba muy interesante, dado que sabemos que es capaz de interaccionar con otra scaffold, la
proteína JIP1 y modular así la señalización de JNK (Blanco et al., 2008).
La proteína KSR1 fue identificada inicialmente por su papel como modulador de la
señalización de Ras (Therrien et al., 1995). Hoy en día, se sabe que actúa a modo de proteína
scaffold de la ruta de señalización de ERK1/2. Además, parece ser la principal proteína de
ensamblaje responsable de la activación de ERK1/2 en respuesta a EGF y suero, en el citosol
(Kortum and Lewis, 2004; Lozano et al., 2003). Hemos comprobado que KSR1 endógeno se
expresa en un panel de cuatro líneas celulares de mama. Además, en la línea celular Hela, KSR1
es necesario para una correcta respuesta a EGF, dado que su silenciamiento disminuye
notablemente la activación transcripcional del Elemento de Respuesta a Suero por EGF.
Por otro lado, antes de evaluar una posible interacción de KSR1 con VRK2A quisimos
estudiar la localización de KSR1 respecto a la de VRK2A. La localización subcelular de KSR1
es dinámica y se encuentra regulada por su estado de fosforilación. Así, hasta el momento, se ha
descrito cómo KSR1 se encuentra presente tanto en las fracciones solubles como asociado a
membranas (Stewart et al., 1999) y cómo es retenido en el citosol a través de la interacción con
determinadas proteínas como, por ejemplo, la proteína 14-3-3γ (Cacace et al., 1999; Jagemann
et al., 2008; Matheny et al., 2004). La estimulación con factores de crecimiento promueve la
Discusión
- 133 -
translocación de una subpoblación de KSR1 a membranas. En concreto, los trabajos de Ory,
Michaud y Jagemann muestran como KSR1 sobreexpresada presenta una localización difusa
por el citosol e incluso en el núcleo, y como el tratamiento con PDGF, la sobreexpresión de H-
RasV12 o el silenciamiento de la isoforma 14-3-3γ, promueven la acumulación de una
subpoblación de KSR1 en la membrana plasmática, mientras que el resto permanece en una
localización principalmente perinuclear (Jagemann et al., 2008; Matheny et al., 2004; Michaud
et al., 1997; Ory et al., 2003). Nosotros comenzamos analizando la localización subcelular de
KSR1 sobreexpresado mediante inmunofluorescencia en células HeLa. En los experimentos de
sobreexpresión, hemos trabajado siempre con la isoforma KSR1 murina (mKSR1), por ser la
más estudiada. KSR1 sobreexpresada colocaliza con la quinasa VRK2A endógena en la región
perinuclear. Además, existe un elevado grado de colocalización entre KSR1 y la proteína
Calnexina endógena, empleada como marcador de retículo endoplasmático. En cambio, existe
una ausencia total de colocalización entre KSR1 y la proteína endógena Giantina, empleada
como marcador del aparato de Golgi. Teniendo en cuenta que se ha descrito cómo VRK2A se
ancla a membranas del retículo endoplasmático, podemos concluir que KSR1 y VRK2A
colocalizan en las proximidades del retículo endoplasmático. No nos atrevemos, sin embargo, a
afirmar de forma contundente que KSR1 esté asociado a las membranas de este orgánulo ya que
para confirmar este hecho deberíamos de llevar a cabo experimentos de fraccionamiento de
membranas. A continuación, determinamos cómo la proteína KSR1 endógena colocaliza con el
retículo endoplasmático en un panel de líneas celulares como HeLa, MCF7, MDA-MB-231 y
SKBR3. Es decir, la proteína KSR1 endógena mantiene esta localización perinuclear en
múltiples líneas celulares. Por último, cuando analizamos la localización subcelular de VRK2 y
KSR1 endógenas vemos que, nuevamente, colocalizan en las proximidades del retículo
endoplasmático. Estas subpoblaciones de VRK2A y KSR1 que colocalizan en la región
perinuclear lo hacen tanto en células creciendo en medio completo, como tras una breve
estimulación con el factor de crecimiento epidérmico (EGF).
Teniendo en cuenta que KSR1 y VRK2A colocalizan en las proximidades del retículo
endoplasmático y que ambas proteínas interaccionan con MEK1, cabía la posibilidad de que
tuviese lugar una interacción entre ambas. Efectivamente, pudimos comprobar mediante
inmunoprecipitaciones y ensayos tipo Pull-Down que VRK2A y KSR1 interaccionan. Además,
a diferencia de lo que ocurría con MEK1, la interacción con KSR1 es exclusiva de la quinasa
VRK2A. Esto es debido a que dicha interacción ocurre a través de un dominio compuesto por
aminoácidos presentes tanto en la región amino terminal como en la región carboxilo terminal
(exclusiva de VRK2A), probablemente como consecuencia de la estructura terciaria de la
proteína VRK2A (Figura 78). Por lo tanto, creemos que esta interacción entre KSR1 y VRK2A
Discusión
- 134 -
podría estar relacionada con el mecanismo de acción, ya que permite explicar el que tan sólo la
isoforma VRK2A regule negativamente la ruta de señalización de ERK1/2. Por otro lado, dado
que KSR1 y MEK1 interaccionan de forma constitutiva, surge la cuestión de si la interacción
con MEK1 es directa o si se produce de forma indirecta a través de KSR1. La realización de un
ensayo de interacción in vitro, en presencia exclusivamente de las dos proteínas purificadas, nos
permitió confirmar que la interacción entre VRK2A y MEK1 es directa. Además, las tres
proteínas KSR1, MEK1 y VRK2A se pueden detectar simultáneamente formando parte de un
mismo complejo. A continuación, se resumen todas las proteínas que hasta el momento han sido
descritas como capaces de interaccionar con VRK2A y VRK2B, especificando las regiones de
ambas isoformas implicadas en las interacciones (Figura 78).
El hecho de que KSR1, MEK1 y VRK2A formen parte simultáneamente de los mismos
complejos y de que la interacción con KSR1 sea específica de VRK2A, debido a su localización
en las proximidades del retículo endoplasmático, nos hace pensar que esta interacción juega un
papel clave en el mecanismo de acción por el cual VRK2A inhibe la señalización de ERK1/2.
Además, la observación de que en ausencia de KSR1, VRK2A no es capaz de ejercer una
regulación negativa de la ruta de señalización de ERK1/2 nos permite situar a ambas proteínas
en la misma vía de señalización y reafirma la hipótesis de que la interacción con KSR1 juega un
papel clave en el mecanismo de acción. De esta manera, podríamos proponer diferentes
mecanismos de acción a nivel molecular, si bien ninguno de ellos ha sido confirmado por el
momento. Así, cabe la posibilidad de que VRK2A este limitando o compitiendo por la
incorporación de ERK1/2 a los complejos de señalización de KSR1/MEK1/2. Otra posibilidad
ATP35 61 162
BAB397174
Sitio Catalítico
VRK2B
Ran256 320
JIP1
1MEK1
320
VRK2A
ATP35 61 162
BAB RT492 508174
TAK1397 508
JIP1
1 320
Ran256 320
MEK1
KSR1
Sitio Catalítico
KSR11 364 508
BHRF401 508
ATP35 61 162
BAB397174
Sitio Catalítico
VRK2B
Ran256 320
JIP1
1MEK1
320
ATP35 61 162
BAB397174
Sitio Catalítico
VRK2B
Ran256 320
JIP1
1MEK1
320
VRK2A
ATP35 61 162
BAB RT492 508174
TAK1397 508
JIP1
1 320
Ran256 320
MEK1
KSR1
Sitio Catalítico
KSR11 364 508
BHRF401 508
Figura 78. Representación esquemática de las diferentes proteínas que interaccionan con VRK2A y VRK2B, indicando las regiones implicadas en la interacción. Aquellas proteínas que se unen a través de la región amino terminal (MEK1, JIP1) o a través de la región medial (Ran), interaccionan con ambas isoformas. En cambio, aquellas proteínas que interaccionan a través de la región carboxilo terminal (BHRF, TAK1) o por un dominio que incluye aminoácidos de la región carboxilo terminal (KSR1) van a establecer una interacción específica con la isoforma VRK2A.
Discusión
- 135 -
sería que VRK2A estuviese disminuyendo la estabilidad de la proteína scaffold KSR1, de forma
similar a como hace la proteína NM23-H1(Salerno et al., 2005). Sería también posible que
VRK2A estuviese facilitando el reclutamiento o incorporación de alguna fosfatasa de ERK1/2 al
complejo multiproteico ensamblado sobre KSR1, aún sin necesidad de una interacción directa
entre VRK2A y dicha fosfatasa.
Si bien sabemos que VRK2A inhibe la señalización de ERK1/2 por un mecanismo
independiente de su actividad quinasa, dada su capacidad para interaccionar con KSR1,
quisimos evaluar la posibilidad de que VRK2A estuviese fosforilando a esta proteína. KSR1 es
fosforilado en diversos residuos de serina y treonina por varias quinasas como C-TAK1, CK2,
ERK1/2 y NM23-H1. Sin embargo, adicionalmente, otros residuos son fosforilados por
quinasas desconocidas. Además, el estado de fosforilación de KSR1 regula su localización
subcelular y su estabilidad (Cacace et al., 1999; McKay et al., 2009; Muller et al., 2001; Razidlo
et al., 2004; Salerno et al., 2005). Por estos motivos, llevamos a cabo ensayos quinasa in vitro,
en los que no pudimos detectar fosforilación de KSR1 por VRK2A.
La proteína KSR1 es capaz de homodimerizar y de formar heterodímeros con Raf
(Matheny and White, 2009; Rajakulendran et al., 2009). Adicionalmente, interacciona con
numerosas proteínas, formando complejos multiproteicos de muy diversos pesos moleculares
(150-1000 kDa). De esta manera, retiene a MEK1/2 en complejos muliproteicos de unos 700
kDa de peso molecular (Stewart et al., 1999). De forma similar, también se ha descrito la
presencia de VRK2 en complejos multiproteicos de elevado peso molecular (Blanco et al.,
2008). A través de experimentos de cromatografía líquida tipo FPLC (Fast protein liquid
chromatography) en condiciones nativas, hemos determinado que VRK2A, KSR1 y MEK1/2 se
localizan en las mismas fracciones de peso molecular intermedio (100-300 kDa) y de elevado
peso molecular (700-1000 kDa), lo que es consistente con la presencia de estas tres proteínas
formando parte de los mismos complejos multiproteicos. El silenciamiento de la expresión de
VRK2 se traduce en una redistribución de KSR1 y MEK1/2 desde los complejos de elevado
peso molecular (700-1000 kDa) a los complejos de peso molecular intermedio (100-300 kDa).
Es decir, parece que VRK2 está contribuyendo a retener a una subpoblación de KSR1 y
MEK1/2 en complejos multiproteicos de elevado peso molecular.
De esta manera, podemos hipotetizar que en aquellos tejidos de mama ErbB2 negativos,
VRK2A contribuye a retener, en las proximidades del retículo endoplasmático, a una
subpoblación de KSR1 y MEK1/2 en complejos multiproteicos de elevado peso molecular (700-
1000 kDa), en los que probablemente la señalización a través de la ruta de ERK1/2 se vea
limitada respecto a otro tipo de complejos. En cambio, en los tumores ErbB2 positivos la
sobreexpresión de ErbB2 se asocia a menores niveles de expresión de VRK2. Esto daría lugar a
Discusión
- 136 -
una redistribución de los complejos de señalización, formándose preferentemente complejos de
señalización de peso molecular intermedio (100-300 kDa), en los cuales la señalización a través
de la ruta de ERK1/2 se ve incrementada. Esta hipótesis queda reflejada en el modelo de la
figura 79.
ErbB1
Sobreexpresión de ErbB2
ErbB1 ErbB2
Cromatina
Downregulación de VRK2
AKT Ras
RafMEK
KSR1
ERKVRK2
Ras
RafMEK
KSR1
ERK
Incremento señalización de ERK1/2
Tejido de mama ErbB2 negativo Tumor mamario ErbB2 positivo
Proteínasdesconocidas
P P
Disminución de la señalización de ERK1/2
?
La señalización desde orgánulos subcelulares se ha relacionado a menudo con la
intensidad y duración de la señal. De manera que se suele hablar de una primera oleada de
señalización que se inicia en la membrana y que luego, en parte a través de la internalización de
los receptores, se amplifica a nivel de otras localizaciones intracelulares. En concreto se ha
demostrado que H-Ras se activa de forma eficiente a nivel del retículo endoplasmático, en un
proceso independiente de la internalización de los receptores, y desde esta localización es capaz
de mediar la activación de Raf y ERK1/2 en respuesta a la estimulación con EGF (Chiu et al.,
2002; Caloca et al., 2003). Esta activación de la ruta de ERK1/2 a nivel de los orgánulos
intracelulares es temporalmente posterior a la que ocurre a nivel de la membrana plasmática.
Nuestros resultados nos permiten hipotetizar que una subpoblación de KSR1 esté participando
en el ensamblaje de complejos activos del módulo de señalización de ERK1/2 en las
proximidades del retículo endoplasmático, lo que explicaría que una mayoría de la población de
Figura 79. Modelo propuesto para explicar la modulación negativa de la ruta de señalización de ERK1/2 en el contexto de los tumores de mama. La sobreexpresión de ErbB2, en tumores de mama, se asocia a bajos niveles de expresión de la quinasa VRK2. Esto favorecería la redistribución de los complejos multiproteicos de señalización de KSR1 y MEK1, formándose preferentemente complejos multiproteicos en los que la señalización a través de la ruta de ERK1/2 se vería incrementada, contribuyendo a facilitar la progresión tumoral.
Discusión
- 137 -
KSR1 permanezca en esta localización tras la estimulación con EGF (Figura 65). VRK2A
contribuiría a retener a una subpoblación de KSR1 y MEK1 en esta localización y modularía
negativamente la transmisión de la señal a través de estos complejos. Este tipo de
compartimentalizaciones de la ruta de ERK1/2 contribuyen a determinar el tipo de sustratos y
efectores con los que va a interaccionar ERK1/2 influyendo en la respuesta celular final.
2.3 Relevancia, a nivel fisiológico, del papel de VRK2A como modulador negativo de la
ruta de señalización de ERK1/2
La activación de la ruta de señalización de ERK1/2 regula un amplio espectro de
procesos a nivel celular tales como proliferación, apoptosis, supervivencia, senescencia,
motilidad, transcripción, metabolismo o diferenciación. Así, la activación de una misma cascada
de señalización puede mediar procesos celulares opuestos, por lo que el balance final va a
depender del contexto celular, del tejido y del estímulo concreto, así como de la regulación
espacial y temporal de la ruta.
La relevancia a nivel fisiológico de la modulación negativa de la ruta de señalización de
ERK1/2 por VRK2A, aún no ha sido examinada en profundidad, salvo en el contexto de los
tumores de mama. Tal y como ocurre con otros reguladores negativos de la señalización de
ERK1/2, como Sprouty o Spred (Lo et al., 2006), la expresión de VRK2A tiende a perderse en
los tumores ErbB2 positivos dado que en este contexto una menor activación de la ruta de
señalización de ERK1/2 contribuye a facilitar la progresión tumoral.
En cuanto a la relevancia de la existencia de mecanismos de modulación negativa y
retroalimentación de la ruta de ERK1/2, hemos de destacar que estos procesos permiten la
atenuación de la señal de manera que la célula pueda responder con posterioridad a una nueva
estimulación, previenen la activación de la ruta por señales inespecíficas (ruido) y cuando
actúan al final de la cascada, como es el caso de VRK2A, alteran el balance final de activación
de diferentes rutas. Así, VRK2A inhibe la activación de ERK1/2 por ErbB2, pero no de la ruta
de AKT.
Como ya hemos mencionado, es necesario que la cascada de señalización de ERK1/2
permanezca insensible al ruido de fondo (señales inespecíficas) y se active sólo por encima de
determinados umbrales. Hemos observado que el silenciamiento de la expresión de VRK2, en la
línea celular HeLa, se traduce en un incremento en los niveles basales de activación de ERK1/2
de magnitud similar al producido por la estimulación con EGF. Es decir, en ausencia de VRK2,
se eleva el ruido o activación inespecífica de la ruta. Cabe la posibilidad, por tanto, de que
VRK2 esté actuando a modo de sensor, que suprima el ruido de fondo de manera que la
transcripción dependiente de ERK1/2 se active sólo cuando el estímulo supere cierto umbral.
1. La expresión de VRK2 correlaciona inversamente con la del receptor ErbB2 y
positivamente con la de los receptores de estrógenos y progesterona en tumores
primarios de mama.
2. VRK2A actúa como modulador negativo de la ruta de señalización de ERK1/2 y de la
respuesta a EGF.
3. VRK2A actúa en la ruta de señalización de ERK1/2, por debajo de MEK1/2.
4. VRK2A modula la ruta de ERK1/2 a través de una interacción proteína-proteína.
5. VRK2A interacciona con la quinasa MEK1 y con la proteína scaffold KSR1 en las
proximidades del retículo endoplasmático.
6. VRK2A, KSR1 y MEK1 se localizan en complejos multiproteicos de medio y elevado
peso molecular. VRK2A contribuye a retener a una subpoblación de KSR1 y MEK1 en
complejos multiproteicos de elevado peso molecular (700-1000 kDa).
CCCOOONNNCCCLLLUUUSSSIIIOOONNNEEESSS
MMMAAATTTEEERRRIIIAAALLLEEESSS YYY MMMÉÉÉTTTOOODDDOOOSSS
Materiales y métodos
- 143 -
1.Técnicas de manipulación de ácidos nucleicos
1.1 Extracción de ADN plasmídico de E. Coli El aislamiento de ADN plasmídico , a partir de E. Coli, (minipreparaciones) se llevó a
cabo mediante el método de la lisis alcalina (Birnboim and Doly 1979). La obtención de ADN
plasmídico de mayor pureza, a pequeña escala, empleado principalmente para secuenciación, se
llevó a cabo utilizando el sistema comercial High Pure Plasmid Isolation Kit (Roche Mannheim
Germany). Para la obtención de ADN a gran escala se empleó el sistema comercial Jetstar de
(GENOMED). En todos los casos se siguieron las especificaciones del fabricante.
1.2 Cuantificación de ácidos nucleicos
La determinación de las concentraciones de ADN, se llevo a cabo en un
espectrofotómetro Gene Quant (Amersham, Pharmacia Biotech), mediante la medición de la
absorbancia de la muestra a 260 nm, longitud de onda a la que tienen su máximo de absorción
los ácidos nucleicos. Además se analizó la relación de absorbancias A260/A280 que debe estar
siempre comprendida entre 1,8 y 2,0 si se trata de una preparación homogénea de ADN no
contaminada con ningún otro cromóforo. Las concentraciones de ADN se confirmaron
posteriormente sometiendo la muestra a electroforesis en geles de agarosa al 1% y analizando la
fluorescencia emitida.
1.3 Electroforesis de fragmentos de ADN
La separación de fragmentos de ADN se llevó a cabo en función de su movilidad
electroforética en geles de agarosa al 1%. Esta movilidad va a depender tanto del tamaño del
fragmento de ADN como de su forma. Para la separación de fragmentos de ADN de tamaños
excepcionalmente mayores o menores, se ajusto la proporción de agarosa en el gel para una
mayor resolución en la separación. La electroforesis se llevo a cabo en tampón TAE 1x (0,04M
Tris,1 mM EDTA) con un pH de 8, al cual la carga de los ácidos nucleicos es negativa por lo
cual migrarán hacia el polo positivo al ser sometidos a una diferencia de potencial. Para la
visualización de las bandas se empleó el bromuro de etidio, agente que al intercalarse entre las
bases del DNA emite fluorescencia al ser estimulado mediante una lámpara de luz ultravioleta.
Para la determinación del tamaño exacto se comparó la migración con la de marcadores de peso
molecular.
Materiales y métodos
- 144 -
2. Generación de vectores recombinantes de ADN
Las construcciones diseñadas en el laboratorio se generaron insertando secuencias de
ADNc en los correspondientes vectores mediante reacciones de digestión de fragmentos de
ADN con enzimas de restricción (Promega o Fermentas) y posterior ligación con la enzima T4
ADN-ligasa (Promega). Posteriormente, estas construcciones se transforman en la cepa
bacteriana adecuada (generalmente DH5α) para luego proceder a la selección de las colonias
transformadas por su resistencia específica al antibiótico ampicilina o Kanamicina, en función
del gen de resistencia contenido en el plásmido transformante. Las construcciones se
confirmaron después tanto por análisis de restricción como por posterior secuenciación y
verificación de la exactitud de la secuencia mediante su alineamiento en los programas Chromas
y DS-GENE.
3. Transformación
Los plásmidos de ADN recombinantes se transformaron en las cepas competentes de E.
Coli, DH5α o BL21DE, con la intención de expresar ADN o proteína respectivamente, mediante
la técnica de choque térmico. Para ello las bacterias preservadas a -80º tras su descongelación
se mezclan con una pequeña cantidad del DNA a transformar y se incuban durante 30 minutos
en hielo (4º), 30 segundos a 42º y rápidamente otros 5-10 minutos a 4º. Tras este proceso las
bacterias que hayan captado el plásmido aún no han tenido tiempo de expresar los genes de
resistencia al antibiótico de selección, por lo que se incuban durante 1 hora a 37º en agitación en
medio LB sin antibiótico, tiempo tras el cual se pueden ya sembrar en placas Petri de LB-agar
con el antibiótico de selección adecuado (generalmente ampicilina 50 µg/ml). Las placas se
incuban durante la noche a 37º, para al día siguiente pinchar colonias individuales en las cuales
es necesario verificar la presencia del plásmido correcto por secuenciación antes de proceder a
almacenarlas mediante “stocks en glicerol” ( 70% de cultivo + 30% glicerol estéril al 80%) a
-80º.
4. Purificación de proteínas de fusión
4.1 Purificación de proteínas de fusión con GST
Esta técnica permite la expresión a gran escala de proteínas sobreexpresadas en E. Coli,
previa transformación en la cepa BL21DE3 de un vector pGEX-GST recombinante en el que se
ha clonado la proteína deseada. Dichos vectores presentan un promotor tac para poder ser
inducidos químicamente con lactosa o un análogo como es el isopropil β-D- tiogalactosido
Materiales y métodos
- 145 -
(IPTG) y un sitio de corte reconocido por la Trombina para poder separar la proteína clonada
del producto de fusión.
Se crece el clon bacteriano correspondiente en medio LB con el antibiótico de selección
ampicilina (50µg/ml) durante toda la noche, a 37º y en agitación. Al día siguiente se hace una
dilución 1:10 de ese cultivo pasándolo a un volumen de unos 200 ml en el caso de proteínas que
se expresan bien ó unos 2 l en el caso de proteínas que se expresan mal (como VRK2). Se crece
ese cultivo en agitación a 37º durante unos 45 minutos aproximadamente, hasta que alcance una
densidad óptica, a 600 nm, de 0.6-0.8. En este punto, el cultivo se encuentra en fase de
crecimiento exponencial por lo que ya se puede inducir la expresión de la proteína mediante la
adición al medio de IPTG (Boehringer Mannheim) 0,1mM. Se continúa creciendo el cultivo a
37º en agitación durante 2-4 horas, tras las cuales se centrifuga el cultivo a 8000 rpm durante 10
minutos y se resuspende el pellet bacteriano en buffer de lisis (PBS frío + 1% Triton X-100,
0.2μg/ml Lisozima, 1mM PMSF, 5mM DTT, 10μg/ml aprotinina y 10μg/ml leupeptina). A
continuación para permitir la correcta separación de las proteínas poco solubles de las
membranas, es necesario sonicar dando a intervalos de 10 segundos, 5 pulsos de 10 segundos
cada uno a 4º, mediante un sonicador “Misonic XL2010”. La lisis de la pared bacteriana se
efectuará durante 30 minutos a 4º, para luego centrifugar a 150000 rpm durante 30 minutos. En
este punto, es recomendable recoger una alícuota tanto del pellet como de la fracción soluble,
para verificar en un gel que nuestra proteína permanece en la fracción soluble. Posteriormente la
fracción soluble se incubó con 100-200 µl de la resina Glutathion Sepharose 4B beads
(Amersham Biosciences, Uppsala, Sweden) durante 2-12 h a 4ºC en agitación suave. Esta resina
tiene elevada afinidad por el GST (Glutatión-S-Transferasa) que se encuentra fusionado a la
proteína de interés. Transcurrido el tiempo necesario para la unión de la proteína de fusión a la
resina, se hacen 5 lavados de las bolas con PBS 1x con inhibidores de proteasas a 1700 rpm
durante 2-3 minutos. En el último lavado se deja la misma cantidad de PBS que de bolas (50%)
y si queremos guardar la proteína a -20º se le añade glicerol al 10-20%, lo que ayuda a
mantener la estructura de la proteína. La elución de la proteína de las bolas se llevó a cabo en
una solución 10mM de glutatión reducido en 50mM Tris-Cl pH 8.0 a 4ºC, durante 1 hora, en
agitación orbital. Luego una breve centrifugación de 2 minutos a 2000 rpm permitirá recoger el
sobrenadante con la proteína eluída. La presencia de la proteína se verifica en cada caso
mediante electroforesis SDS-PAGE seguida de Tinción con Azul de Coomassie o Western Blot..
En algunos casos las proteínas unidas a la resina Sefarosa-glutation se separaron de su epítopo
GST por digestión con trombina (10 unidades/mg proteína de fusión), durante 16 horas a
temperatura ambiente y posterior centrifugación, durante 5 minutos a 1500 x g, para guardar el
sobrenadante correspondiente a la proteína purificada.
Materiales y métodos
- 146 -
4.2 Purificación de proteínas de fusión con el epítopo 6x His
El protocolo seguido fue el mismo que para la expresión y purificación de proteínas
fusionadas a GST exceptuando que en el tampón de lisis así como en los lavados se eliminó el
DTT y se añadió 10-15 mM de Imidazol (Merck, Darmstadt, Alemania). Además la inducción
de la proteína con IPTG 0,1 mM, se efectuó a una temperatura de 30ºC. La resina empleada para
la purificación fue “TALON Metal Affinity Resin” (BD Biosciences, Palo Alto, CA, USA) y la
elución de la proteína de la resina se efectuó mediante la incubación a 4ºC o/n con Imidazol
diluido en PBS 200mM.
5. Tinción de Coomassie
La visualización de la banda de interés tras expresión a gran escala de una proteína de
fusión, se llevo a cabo mediante electroforesis vertical (SDS-PAGE) en geles de poliacrilamida
que después se tiñeron en solución de Coomassie (0,5 % Coomassie brilliant blue R250, 50%
metanol, 10% ácido acético glacial) durante 5 minutos en agitación. A continuación se
destiñeron los geles con solución de destinción (50% metanol, 10% ácido acético glacial) en
agitación hasta la correcta visualización de las bandas de interés. Este proceso permite estimar
además la concentración de la proteína por comparación de bandas con varias cantidades
diferentes de la proteína BSA cargadas en el gel en paralelo. Finalmente se transfirió a papel
Whatman 3M y se secó en un secador de geles (Biorad) durante 2h a 80ºC.
6. Cuantificación de proteína
El procedimiento empleado para la cuantificación proteica es el método de Bradford.
Este se basa en el uso del colorante azul brillante G-250 Coomassie, que en presencia de
proteínas se torrna de color rojo a azulado cambiando su máximo de absorción de 465 a595 nm.
El cambio en la absorción del colorante es proporcional a la cantidad de proteína en la muestra.
El reactivo comercial usado fue “BIO-RAD protein assay” (Biorad), junto con la proteína BSA
para la elaboración de una recta patrón.
7. Precipitación de proteína
La concentración de la proteína presente en un extracto se efectuó mediante la
precipitación y posterior resuspensión en un volumen menor del de partida. En primer lugar se
añade al volumen inicial de extracto proteico, tricloroacético frío al 100% en agua, de manera
que quede presente en la disolución final al 10%. Se centrifuga 15 minutos a 150000 rpm a 4ºC
Materiales y métodos
- 147 -
y se descarta el sobrenadante. A continuación, se hace un lavado del pellet con 100 μl de
acetona muy fría y se centrifuga de nuevo a 150000 rpm y 4ºC durante 15 minutos. Finalmente,
se descarta la acetona y se deja secar el pellet, para luego resuspenderlo en 30- 50 μl de tampón
de carga 1x.
8. Purificación de anticuerpos policlonales frente a la proteína VRK2 mediante columna
de afinidad
Los anticuerpos frente a VRK2 se generaron inmunizando un conejo con la proteína de
fusión GST-VRK2A humana, previamente purificada. Los sueros inmunes de dicho conejo se
incubaron varios días con la proteína GST expresada en E. Coli, para eliminar del suero inmune
aquellos anticuerpos capaces de reconocer activamente a la proteína GST. Para la purificación
del anticuerpo frente a VRK2A se emplearon 20 mg de antígeno GST-VRK2A (10 mg por cada
ml de resina). Se empleó la resina NSH-activated separose 4B Fast Flow (Amershan Pharmacia
Biotech). Se concentró la proteína de fusión mediante el uso de un centricón y se resuspendió a
una concentración 0,5 M en la disolución COUPLING SOLUTION (Na2PO4, pH 7.5). La
resina y la disolución conteniendo el antígeno se incuban toda la noche a 4º, tras lo cual se
verifica que el sobrenadante no contiene aun proteína GST-VRK2 y que, por lo tanto, esta se ha
unido a la resina. A continuación, para eliminar los restos de antígeno no unido, la resina se lavó
con 10 volúmenes de etanolamina 100mM a pH 7.5 durante 4 horas y 2 veces con PBS. Luego
se pasa la resina a una columna y se hacen una serie de lavados con distintos tampones 100mM
Tris a diferentes pH, hasta que el pH de los lavados fue de 7.5. El suero se diluyó 1:10 en 10mM
Tris pH 7.5 y se dejó pasar por la columna a flujo lento. Posteriormente, se lavó la columna con
el tampón 10mM Tris pH 7.5 y luego con 500mM de NaCl + 10nM Tris pH 7.5. Finalmente, el
proceso de elución se llevó a cabo en 2 pasos, de manera que aquellos anticuerpos con cargas
positivas se eluyeron con 100mM Glicina pH 2,5, mientras que los anticuerpos cargados
negativamente se eluyeron con 100nM Trietanolamina pH 11.5. Finalmente, los anticuerpos
fueron dializados y concentrados en un centricón Amicon Ultra (Millipore , Carrihtwohill, Co.
Cork, Irland) frente a PBS con 0,02% de azida sódica. Una vez purificados se titularon para su
uso en Western blot, inmunofluorescencias e inmunoprecipitaciones.
9. Electroforesis en geles SDS-PAGE y Western Blot de extractos proteicos
Las separaciones electroforéticas se llevaron a cabo siempre en condiciones
desnaturalizantes, mediante el empleo del detergente SDS (dodecilsulfato sódico), el cual aporta
a las proteínas una carga uniforme negativa enmascarando la carga propia de estas. Este
detergente desnaturaliza las proteínas de manera que si además se tratan con un agente reductor
Materiales y métodos
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como el β-mercaptoetanol sólo quedarán presentes las cadenas polipeptídicas individuales que
van a migrar hacia el ánodo en función de su peso molecular y no de su carga ó su estructura
terciaria ó cuaternaria. La migración de las proteínas será aproximadamente inversa al logaritmo
de su peso molecular y se compara en el gel con la migración de marcadores de peso molecular.
La obtención de extractos proteicos totales a partir de células en cultivo, se llevó a cabo
lisando las placas en frío con tampón de lisis RIPA (150mM NaCl, , 1,5mM MgCl2, 10mM
NaF, 4mM EDTA, 50mM Hepes pH 7,4, 1% Tritón X-100, 0,1% SDS, 10% glicerol) al que
previamente se le han añadido inhibidores de proteasas y fosfatasas ( 1mM PMSF, 10 µg/ml de
aprotinina, 10 µg/ml de leupeptina, 2 mM DTT, 1mM de ortovanadato de sodio), salvo en
determinadas excepciones en las que se indica que se emplearon otros tampones de lisis de
diferentes características ó se omitió la presencia de DTT. Tras una incubación de 20 minutos en
hielo se centrifugaron los extractos 20 minutos a 16000 x g a 4º. Se recuperó la fracción soluble
y se midió la cantidad de proteína total por el método de Bradford.
Se resolvió una cantidad total de extracto proteico igual para todos los puntos a
comparar (25-50 µg) mediante electroforesis vertical en gel SDS-PAGE (sodium-
dodecylsulfate-polyacrlamide gel electrophoresis) con un porcentaje de acrilamida adecuado al
tamaño de la proteína a analizar. Así, para resolver proteínas con pesos moleculares
comprendidos entre 30-100 K-Da se emplearon preferentemente geles del 10% de acrilamida,
para proteínas de entre 30-15 K-Da geles del 12,5% y para proteínas mayores de 120 K-Da
geles del 7,5%. Para ello las muestras se procesaron con tampón de carga (62.5mM Tris-HCl
pH6.8, 10% glicerol, 2.3% SDS, 0.1% azul de bromofenol, 5% β-mercaptoetanol) y se hirvieron
durante 5 minutos. El agente reductor β-mercaptoetanol no se empleó en el caso de extractos
procesados para llevar a cabo inmunoprecipitaciones, además no se añade en el tampón de
preparación del gel dado que interfiere en la polimerización de la acrilamida. El gel se corrió en
condiciones desnaturalizantes en tampón de carrera adecuado (25mM Tris, 192mM glicina y
1.7mM SDS) según (Laemmli 1970). Como marcadores de peso molecular se utilizaron
marcadores preteñidos Precision Plus Protein™ Standards Dual Color (Biorad).
Las proteínas se transfirieron después a una membrana PVDF (Millipore) mediante
transferencia húmeda en el tampón de transferencia según (Towbin, Staehelin et al. 1979) (25
mM Tris, 0,192M glicina y 10% metanol). El porcentaje de metanol varió según el peso
molecular de las proteínas objeto de estudio (10% metanol para proteínas 50-70 kDa, 15-20%
metanol para proteínas de en torno a 15 kDa y 7,5% metanol para proteínas de en torno a 200
kDa). La transferencia se realizó durante 1-1,5 horas a 90-100 V para proteínas hasta 100 kDa y
a 40 V durante toda la noche para proteínas de tamaño superior a 100 kDa .
Materiales y métodos
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Para llevar a cabo el Western blot, la membrana se bloqueó durante 1h a temperatura
ambiente o toda la noche a 4ºC en agitación en 5% de leche en polvo desnatada en el tampón
TBS-T (25mM Tris, 50mM NaCl, 2.5mM KCl y 0.1% Tween-20). A continuación, la
membrana fue incubada con el anticuerpo primario en TBS-T a la dilución adecuada que se
indica en la Tabla I, durante 1-2 h a temperatura ambiente o durante toda la noche a 4º en el
caso de determinados anticuerpos. Los anticuerpos de cell-signaling se incubaron en TBS-T con
5% BSA siguiendo las especificaciones de la casa comercial. Luego se efectuaron 3 lavados
durante 30 minutos con TBS-T en agitación. El anticuerpo secundario correspondiente
conjugado con peroxidasa se incubó con la membrana a la dilución adecuada (1: 10000 en el
caso de los anti-Mouse y anti-rabbit o bien 1:40000 en el caso del anti-goat), durante 30
minutos a temperatura ambiente. La membrana se lavó varias veces en agitación durante 30
minutos antes de detectar la luminiscencia tras incubación con el reactivo ECL Western Blotting
Detection Reagents (Ammersham Biosciences). La luminiscencia emitida se detectó exponiendo
las membranas con películas de rayos X.
10. Cultivo de líneas celulares
Las líneas celulares con las que se trabajó se especifican en la Tabla III, así como el
correspondiente medio de cultivo que varía en función de la línea celular. Estas líneas se
crecieron en Flasks o placas Petri en un incubador a 37º, 5% de CO2 y 98% de humedad
relativa. Todos los medios se suplementaron con 10% FBS (Fetal Bovine Serum), 2mM de
Glutamina y los antibióticos penicilina 50 unidades/ml y estreptomicina 50 µg/ml. Para la
realización de determinados experimentos el porcentaje de FBS varió entre 0-10% FBS,
especificándose en cada caso. Los pases se realizaron levantando las células con tripsina-EDTA.
Todos los medios, sueros y suplementos fueron obtenidos de GIBCO-Life Technologies.
Las líneas celulares se siguieron mediante un microscopio óptico invertido “Zeiss
Axiovert 25”. Las fotos de las distintas líneas celulares se tomaron con un microscopio invertido
“Zeiss Axiovert 135” con una cámara digital HAMAMATSU asociada al mismo.
11. Transfecciones transitorias de ADN en células eucariotas en cultivo
La sobreexpresión, siempre transitoria, de proteínas en células eucariotas se consiguió
previa transfección de las mismas con los plásmidos de ADN codificante de expresión
eucariota. Inicialmente, se sembraron las células a la densidad adecuada, de manera que 24
horas después, en el momento de la transfección la confluencia rondase el 50-70% y tratando de
evitar que durante la consecución del experimento se alcanzase el 100% de confluencia. Las
Materiales y métodos
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cantidades concretas de ADN transfectado se especifican para cada experimento. El método de
tranfección empleado varió en cada caso entre los que se especifican a continuación.
11.1 Transfección con fosfato calcico
El método de transfección con fosfato cálcico se adaptó de (Wigler, Pellicer et al. 1979;
Wigler, Sweet et al. 1979) y se empleó en las línea celular HEK293T . El medio de cultivo se
cambió 4 horas antes de la transfección de manera que estuviera fresco. Se preparó una
disolución (561µl) con el ADN a transfectar ADN/CaCl2 con 3-10 µg/ml de ADN y 250mM de
CaCl2. A continuación se añade la disolución de ADN/CaCl2 sobre un volumen de 2X HBS
(280mM NaCl, 50 mM Hepes y 1,5 mM fosfato sódico ajustado a pH 7,1) al tiempo que se
vortexea la mezcla . Durante 15-30 minutos se permitió que se forrmase el precitado de fosfato
cálcico/ADN. Luego la anterior solución se añade gota a gota sobre las células mientras que se
agita las placas.
En el caso de los ensayos de focos en células NIH3T3 se llevaron a cabo las
transfecciones con fosfato cálcico, empleando ADN de esperma de salmón como adyuvante.
Para ello cada placa p100 se transfecta con el ADN necesario para el ensayo junto con 20µg de
ADN de salmón en un volumen de 0,5 ml. A continuación se adiciona al ADN un volumen de
CaCl2 0,5 M, se vortexea y se espera 1 hora. Finalmente a 1ml /placa de tampón HNP ( 280
mM NaCl, 50mM HEPES, NaH2PO4.H2O 1,57 mM ) se le adiciona lentamente la mezcla
ADN/ CaCl2, al tiempo que se vortexea y se incuba 1 hora para esperar a que se formen los
precipitados de ADN antes de adicionar dicho volumen a las células.
11.2 Transfección con el reactivo comercial JetPEI
La mayor parte de las tranfeciones se efectuaron con el polímero catiónico comercial
JetPEI (Polytransfection Illkirch France) siguiendo las instrucciones del fabricante. Este
polímero catiónico compacta el ADN en el interior de partículas cargadas positivamente que se
adhieren a los proteoglicanos cargados negativamente de la superficie celular y son introducidos
en la célula por endocitosis.
El ADN se resuspende en un volumen de NaCl y a este se le adiciona 1 volumen de
NaCl en el que se ha resuspendido el JetPEI (2 µl de reactivo por µg de ADN a transfectar) de
manera que el volumen final de la mezcla es aproximadamente 1/10 del volumen de medio de
cultivo de la placa a transfectar. Tras 20 minutos, se puede adicionar la mezcla a las células.
Materiales y métodos
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11.3 Transfección con el reactivo comercial Lipofectamine
Para los experimentos de supresión de la expresión de una proteína mediante RNA de
interferencia se empleó el reactivo Lipofectamine TM 2000 (Invitrogen), para conseguir mayores
eficiencias de tranfección de los oligonucleótidos. Se diluyó la lipofectamine en un volumen de
Opti-MEM (GIBCO, Invitrogen) (medio sin suero) y tras 10 minutos se adiciona a un volumen
de Opti-MEM en el que previamente se había resuspendido los oligonucleótidos. Tras 20
minutos de espera se vierte y reparte la mezcla de transfección sobre las células que hemos
cultivado en medio de cultivo sin antibiótico. 12 horas después de la transfección se puede
remplazar el medio de cultivo por medio con antibiótico, tras realizar varios lavados para
eliminar todos los restos de Lipofectamine.
12. RT-PCR cuantitativa en tiempo real
Esta técnica permite la amplificación y cuantificación con gran exactitud y fiabilidad de
una molécula concreta de ARN, para la cual se han diseñado primers específicos, mediante la
monitorización de la PCR usando técnicas de fluorescencia. Para ello, la molécula de ARN se
transforma primero en su molécula de ADN correspondiente mediante el enzima transcriptasa
reversa y luego dicha molécula de ADN se amplifica mediante PCR (reacción en cadena de la
polimerasa). Para el análisis cuantitativo del producto, se analiza la curva de amplificación. El
número de copias del oligonucleótido diana al inicio de la reacción se puede cuantificar con
gran precisión a través del ciclo umbral (Ct). El Ct es el número de ciclos necesarios para que se
produzca un aumento de fluorescencia asociada al ADN amplificado, significativo con respecto
a la señal de base, y es inversamente proporcional a la cantidad inicial de moléculas molde.
Inicialmente se lavaron las células en cultivo varias veces con PBS frío y se extrajo el ARN
total de cada muestra mediante el kit RNeasy Mini Kit (Quiagen), que basa su método de
extracción y purificación de ARN total celular en el uso de columnas con membranas de silica-
gel, diferentes tampones de estabilización, lisis, homogeneización y lavado, y centrifugaciones
rápidas. A continuación, el ARN purificado se cuantifico y analizó mediante el sístema
Bioanalyzer 2100 nano-lab chip (Agilent Technologies). Se emplearon 100 ng de este ARN
total diluído a 50 ng/µl para cada reacción de RT-PCR cuantitativa a tiempo real, usando el kit
QuantiTect SYBR Green RT-PCR kit (Quiagen) y un termociclador iCycler (BIO-RAD) y los
oligonucleótidos sonda específicos en cada caso (Tabla IV). La fluorescencia emitida por el
fluorocromo SYBR Green, asociada al ADN amplificado, es cuantificada y analizada
posteriormente mediante el software de iCycler. En cada caso, los niveles de ARN específico se
normalizaron respecto a los niveles de ARN de la GAPDH determinados para cada muestra,
como control interno para corregir la variabilidad asociada a cada experimento.
Materiales y métodos
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13. Determinación de la actividad transcripcional de promotores génicos ligados a un gen
reportero de luciferasa
El sistema de valoración de la actividad transcripcional mediante el gen reportero de la
luciferasa, se basa en la transfección en células de un vector que contiene un gen de la luciferasa
bajo el control de un promotor concreto. La unión de los factores de transcripción adecuados a
sus sitios de unión en el promotor permitirá la transactivación del gen reportero de luciferasa
con la consiguiente síntesis de la proteína luciferasa. En todos los casos se empleó el reportero
de luciferasa SRE.Luc, en el que la luciferasa se encuentra bajo el control de un Elemento de
Respuesta a Suero, SRE. 48 horas después de la transfección, se lisan los extractos en tampón de
lisis de luciferasa y se procede a medir la actividad luciferasa mediante el kit Dual-luciferase
reporter assay system de Promega. El mecanismo de reacción se basa en la adición de un
reactivo capaz de oxidar a la luciferasa con la consiguiente producción de luz a 556 nm, la cual
se cuantifica en un luminómetro.
Estos experimentos se realizaron siempre al menos 3 veces de forma independiente y
cada punto por triplicado, para luego analizar estadísticamente los resultados mediante el test t-
de student.
14. Ensayos de interacción entre proteínas
14.1 Ensayos de coinmunoprecipitación
Las inmunoprecipitaciones se llevaron a cabo a partir de 1,5 mg de extracto proteico
total, lisado en tampón de lisis RIPA (NaCl 150mM, MgCl2 1,5mM, NaF 10mM, EDTA 4mM,
Hepes 50mM, Tritón 1%, SDS 0,1%, Glicerol 10%), o bien en tampón de lisis Suave (50mM
Tris-HCl pH 7,5, 150 mM NaCl, 1% Igepal, 1mM EDTA) junto con inhibidores de proteasas y
fosfatasas (1mM PMSF, 10 µg/ml de aprotinina, 10 µg/ml de leupeptina, 2 mM DTT, 1mM de
ortovanadato de sodio). Estos extractos, en un volumen de 1ml, se incubaron de forma previa a
la inmunoprecipitación con 20 μl de la resina “GammaBind Plus Sepharose” (Ammersham
Biosciences), durante al menos 1 hora en rotación a 4ºC, para eliminar del extracto todo lo que
se pueda unir a la resina de forma inespecífica. A continuación, se incubaron estos extractos con
el anticuerpo concreto a la concentración adecuada en cada caso (esta concentración
generalmente varió entre 1:50 a 1:500), durante toda la noche, en rotación y a 4ºC. Al mismo
tiempo, 25µl/ por punto de las bolas de la resina “GammaBind Plus Sepharose” al 100%, tras
ser equilibradas mediante 3 lavados con tampón de lisis a 4ºC y 2400 rpm, se llevan a un
volumen de 1 ml con tampón de lisis con inhibidores de proteasas y BSA (seroalbúmina bovina)
Materiales y métodos
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al 1% y se incuban también durante toda la noche, a 4ºC, en rotación. De esta manera, se
pretende bloquear los sitios de unión inespecíficos en la resina con la BSA. Al día siguiente, a
los extractos que ya han sido incubados con el anticuerpo se les adicionan los 25 µl de la resina
resuspendida en tampón de lisis y esta mezcla se incuba durante 1-2 horas de manera que el
anticuerpo empleado en la inmunoprecipitación se una a la resina. Posteriormente tras realizar al
menos 6 lavados de la resina, con tampón de lisis con inhibidores de proteasas a 2400 rpm y
4ºC, se procesan con tampón de carga para ser analizadas por electroforesis SDS-PAGE y
Western-Blot. En todos los experimentos de coinmunoprecipitación se incluye al menos un
punto en el que se ha realizado una inmunoprecipitación con un anticuerpo inespecífico como
control negativo.
14.2 Ensayos de interacción por precipitación de proteínas de fusión con GST (“Ensayos
de Pull-Down”)
El objetivo de estos experimentos es precipitar proteínas fusionadas a GST expresadas
exógenamente en células eucariotas y analizar la presencia ó ausencia de determinadas proteínas
que pudieran o no interaccionar, o incluso formar un complejo estable con la proteína
precipitada. Para ello se parte de 1,5 mg de extracto proteico total, que se lisa en tampón de lisis
RIPA (NaCl 150mM, MgCl2 1,5mM, NaF 10mM, EDTA 4mM, Hepes 50mM, Tritón 1%, SDS
0,1%, Glicerol 10%), o bien en tampón de lisis Suave (50mM Tris-HCl pH 7,5, 150 mM NaCl,
1% Igepal, 1mM EDTA) o tampón de lisis NP-40 (20mM Tris-HCl, 137mM NaCl, 105 glicerol,
1% NP-40) en función del experimento, siempre en presencia de inhibidores de proteasas y
fosfatasas (1mM PMSF, 10 µg/ml de aprotinina, 10 µg/ml de leupeptina, 2 mM DTT, 1mM de
ortovanadato de sodio). El extracto necesario se llevó a un volumen de 1 ml con tampón de lisis
y se incubó durante 1 hora en rotación y a 4ºC con la resina “GammaBind Plus Sepharose”
(Ammersham Biosciences), con la intención de eliminar, de los extractos, moléculas con
tendencia a unirse de forma inespecífica a las resinas. A continuación, se recupera el extracto y
se incubará durante toda la noche con 20-25 µl de la resina “Glutathion Sepharose 4B beads”
(Amersham Biosciences, Uppsala, Sweden) al 100%, habiendo sido esta equilibrada
previamente mediante 3 lavados con tampón de lisis a 2400 rpm y 4ºC. Al día siguiente, se
recuperan las bolas por centrifugación a 2400 rpm y 4ºC y se hacen 6-8 lavados con tampón de
lisis con inhibidores de proteasas y fosfatasas en estas mismas condiciones. Finalmente, tras el
último lavado se procesan las muestras con tampón de carga para ser analizadas por
electroforesis SDS-PAGE y Western-Blot. En todos los experimentos de “Pull-Down” se
incluye siempre un punto de control negativo en el que se precipita la proteína GST, para
descartar interacciones inespecíficas con dicha proteína o con las bolas.
Materiales y métodos
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14.3 Ensayos de interacción in Vitro
Para el ensayo de interacción in Vitro se purificaron las proteínas GST, GSTVRK2A y
MEKHis, tal y como se indica en el apartado 4 de esta sección. Se eluyeron las proteínas de la
resina de Glutathion Sepharose 4B beads” mediante 10 mM de Glutatión y se cuantificaron tras
separarse por SDS-PAGE en un gel de acrilamida y teñirse en solución de Coomassie junto con
diferentes cantidades de la proteína BSA. Finalmente, se incuban durante 2 horas, a 4ºC en
agitación, las 2 proteínas expresadas junto con 20-25 μl de resina “Glutathion Sepharose 4B
beads” al 100% en un volumen final de 300 μl en tampón de lisis Suave (50mM Tris-HCl pH
7,5, 150 mM NaCl, 1% Igepal, 1mM EDTA). Tras el periodo de incubación, se recupera la
resina por centrifugación a 2400 rpm a 4ºC, y se hacen unos 8 lavados en estas condiciones.
Finalmente, tras el último lavado se procesan las muestras con tampón de carga para ser
analizadas por electroforesis SDS-PAGE y Western-Blot.
15. Cromatografía líquida de exclusión molecular FPLC “Fast proteín liquid
chromatography”
Esta técnica se caracteriza por su elevada eficiencia dentro de las distintas técnicas
cromatográficas conseguida mediante el empleo de un flujo controlado y constante. En la
cromatografía de exclusión molecular se emplean por lo general soportes basados en polímeros
altamente hidrofílicos que al entrar en contacto con el agua adquieren el aspecto de un gel. Las
micropartículas en que están divididos estos soportes son esferas formadas por enrejados de
fibras del polímero correspondiente cuyo tamaño de poro viene determinado por la
concentración de fibras.
Esta cromatografía permite, en definitiva, separar la moléculas en función no sólo del
tamaño sino también de la forma molecular, mediante un parámetro denominado diámetro
hidrodinámico. La máxima utilidad de esta técnica se obtiene al combinarla con el SDS-PAGE,
lo que permite comparar la masa molecular de la proteína nativa y la proteína desnaturalizada y
obtener conclusiones sobre su estructura cuaternaria y sobre la formación de complejos
multiproteicos. En este tipo de separaciones, las moléculas de menor tamaño son las últimas en
filtrarse dado que penetran en todos los poros recorriendo un camino mayor.
Para la determinación de complejos proteicos por cromatografía de filtración en gel o
exclusión molecular, se lisaron las células en buffer de lisis ( 20mM Tris-Hcl pH 7,4, 137 mM
NaCl, 2mM EDTA, 25m mM β-glicerofosfato, 10% glicerol, 1% Tritón-X-100) con inhibidores
de proteasas y fosfatasas. El material insoluble se eliminó por centrifugación a 13.200 rpm
durante 20 minutos y posterior filtración con aguja. Se cuantificaron las muestras de manera que
Materiales y métodos
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para cada muestra se filtraron 3 mg de proteína total, contenidos en un mismo volumen. Estos
extractos se fraccionaron por FPLC de filtración en gel en una columna “Superose 12 /10/300
GL” (GE Healthcare). El buffer de equilibrado y elución de la columna empleado fue ( 50 mM
Tris-HCl pH 7,5, 1mM EDTA, 100 mM KCl y azida sódica 0,025% ) , el cual fue previamente
filtrado ( filtro 0,42μm) y desgasificado mediante sonicación y se empleó a un flujo de 0,3
ml/min. Se recogieron fracciones de 200 μl, de las cuales las fracciones impares se precipitaron
y resuspendieron en un volumen menor para ser separadas mediante cromatografía SDS-PAGE
en geles del 10% y analizadas mediante Western-Blot. Para calibrar la columna y estimar los
pesos moleculares de las fracciones obtenidas se emplearon los siguientes marcadores de peso
molecular de (Biorad): tiroglobulina bovina 670 kDa, ɣ-globulina bovina 158 kDa,
Ovoalbúmina de pollo 44 kDa, mioglobina de caballo 17 kDa y vitamina B12 1,35 kDa.
16. Reactivos y estimulaciones
En la estimulación de cultivos celulares con el factor de crecimiento epidérmico EGF
(Sigma), se usó este a una concentración 10 nM, durante los tiempos indicados en cada caso ya
sean 10 minutos o 30 minutos. El PMA (Sigma), se empleó a una concentración de 20 ng/ml
durante 30 minutos. Cuando la intención era analizar los extractos por Western-Blot se lisaron
los cultivos inmediatamente después de la estimulación correspondiente, en cambio para los
ensayos de luciferasa se retiró el estímulo pasando las células de nuevo a medio con 10% FBS y
se esperó 4 horas para después preparar los extractos, para que el estímulo correspondiente se
pueda traducir en variaciones en la transcripción y traducción de la proteína luciferasa.
17. Supresión de la expresión de proteínas mediante ARNi
En el caso del silenciamiento de VRK2 se empleó el duplex si-genome D-004684-06 de
la casa comercial Dharmacon RNA Technologies, en paralelo se empleó siempre como control
negativo un duplex de ARN carente de diana en el células humanas ON_TARGETplus
siCONTROL Nontargeting siRNA de la misma casa comercial. En el caso de KSR1 se empleó
un pool de siARN de la casa comercial Santa Cruz Biotechnology. Para silenciar JIP1 se
adquirieron siARN duplex de la casa comercial Quiagen (Valencia, CA). La transfección se
llevó a cabo mediante el reactivo lipofectamine 2000 reagent.
18. Inmunofluorescencias
Con el objetivo de estudiar los niveles de expresión y la localización subcelular de
proteínas tanto sobreexpresadas como endógenas en células en cultivo, mediante microscopía
confocal, se llevaron a cabo ensayos de inmunofluorescencia. Se sembraron las células sobre
Materiales y métodos
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cubreobjetos de vidrio estériles y en el caso de la detección de proteínas sobre-expresadas se
transfectaron tal y como se indica en el apartado 10. Transcurridas de 24 a 48 horas
dependiendo del tipo de ensayo, las células se lavaron 3 veces con tampón PBS 1X frío y luego
se fijaron con paraformaldehido al 3% en PBS durante 30 minutos a temperatura ambiente. Tras
la fijación se efectuó un tratamiento de 10 minutos con Glicina 200mM a temperatura ambiente,
con la intención de reducir los sitios aldehído libres. A continuación, se permeabilizan las
células con Tritón X-100 al 0,2% en PBS frío durante 30 minutos y posteriormente se
bloquearon con 1% de BSA en PBS y azida 2X, durante 30 minutos a temperatura ambiente o
durante toda la noche a 4ºC. Una vez fijadas las células, se incubaron con el anticuerpo primario
en 1% BSA en PBS durante 30 minutos a 37ºC o 1 hora a Tª ambiente. Se realizan 3 lavados
con PBS, siempre tras la incubación con los diferentes anticuerpos, para eliminar los restos de
anticuerpo libre. En algunos casos se incuban las células con un segundo anticuerpo primario de
diferente origen al primero. La incubación con los anticuerpos secundarios a una dilución 1:500,
se efectúa en PBS, 1% BSA durante 30 minutos a 37ºC y siempre en oscuridad. En el caso de
emplear 2 anticuerpos secundarios de diferente origen, estos se incuban simultáneamente. El
resto del proceso se realiza evitando al máximo la exposición de las muestras a fuentes de luz
para preservar los fluoróforos. Tras los correspondientes lavados, se tiñen los núcleos celulares
con DAPI (4’,6’-diamidino-2-fenilindol) durante 10 minutos en PBS a temperatura ambiente.
Tras 3 últimos lavados con PBS los cubreobjetos se montaron sobre portaobjetos con Gelvatol
(Monsanto) y la localización subcelular de los antígenos se analizó mediante microscopía
confocal en un microscopio confocal Zeiss LSM510. Las imágenes así adquiridas se analizaron
con el programa LSM Image Examiner de Zeiss.
19. Inmunohistoquímicas
Las biopsias de tumores de mama se obtuvieron del Banco Nacional de Tumores en el
Centro de Investigación del Cáncer-Hospital Universitario de Salamanca. Estas biopsias
tumorales se diagnosticaron antes de iniciar su tratamiento para inmunohistoquímica: fueron
revisadas por patólogos y clasificadas histológicamente mediante examinación visual al
microscopio óptico.
Estas biopsias se fijaron en formalina y se embebieron en parafina para luego se empleadas en la
elaboración de tissue arrays (TMA).
20. Ensayos de actividad quinasa.
La actividad serina-treonina quinasa se analizó mediante un ensayo de fosforilación in
vitro. Para ello se mezclaron aproximadamente 2-5 μg de la quinasa purificada, 10 μg de otra
Materiales y métodos
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proteína empleada como sustrato o bien un sustrato precipitado mediante inmunoprecipitación
con la resina ANTI-FLAG M2 agarosa. Para analizar la actividad quinasa de VRK2A se empleó
un tampón específico para caseín quinasas que consiste en 50mM Tris-HCl pH7.5, 5mM MgCl2,
0.5mM DTT, 150mM KCl, 5μM ATP-Mg2+ y 5μM (5 μCi) [γ32P] ATP en un volumen final de
25-50 μl. La mezcla se incubó durante 30 minutos, a 30ºC en agitación, en un agitador
“Thermomixer Compact” de Eppendorf. Posteriormente, las muestras fueron procesadas y
fraccionadas en un gel de poliacrilamida al 10%/0.1% SDS. La expresión de las proteínas se
verificó mediante western blot con anticuerpos específicos. Finalmente, para detectar las
bandas radiactivas los geles fueron expuestos en películas de rayos X (Fujifilm) durante varios
minutos u horas, según cada caso. Tras revelar las películas se interpretaron las señales de
fosforilación utilizando como referencia el western blot.
21. Abreviaturas
aa: aminoácidos ADN: ácido desoxiribonucleico ARN: ácido ribonucleico ARNm: ARN mensajero ADNc: ADN codificante ARNi: ARN de interferencia ATP: del inglés “Adenosine TriPhosphate” BSA: del inglés “bovine serum albumin”. Sero-albúmina bovina CKI: del inglés “casein kinase I” CKII: del inglés “casein kinase II” DAPI: del inglés “4’,6’-DiAmidino-2-Phenil Indol” DMEM: del inglés “Dubelco’s modified- Minimum Essential Medium” DTT: DiTioTreitol EDTA: del inglés “EthyleneDiamine-Tetraacetic Acid” EGF: del inglés “Epidermal Growth Factor” EST: del inglés “expressed sequence tags” FBS: del inglés “Fetal Bovine Serum”. Suero fetal bovino FPLC: del inglés “Fast liquid protein chromatography” GFP: del inglés “Green Fluorescent Protein” GST: Glutation-S-Transferasa IB: inmunoblot o western blot IF: inmunofluorescencia IPTG: IsoPropil-β-D-TioGalactopiranósido KD: del inglés “kinase dead”, quinasa inactiva kDa: kilodalton LB: medio “Luria bertani” mg: miligramo min: minuto ml: mililitro mm: milímetro mM: milimolar nm: nanómetro
Materiales y métodos
- 158 -
ng: nanogramo NLS: del inglés “nuclear localization signal” aa: aminoácidos un: nucleótidos ºC: grado centígrado PBS: del inglés “Phosphate Buffer Salinum” PCR: del inglés “Polimerase Chain Reaction” PMSF: del inglés “Phenyl Methyl Sulfonyl Phuoride”. Fluoruro de fenilmetilsulfonilo PVDF: del inglés “PolyVinyliDene Fluoride” S: segundo SDS: del inglés “Sodium Dodecyl Sulfate” SDS-PAGE: del inglés “SDS-Polyacrilamide Gel Electrophoresis” si-ARN: del inglés “small-interference RNA” sh-RNA: del inglés “small hairping RNA” SRE: del inglés “serum response element” TMA: del ingles “tissue microarrays” PMA: acetato de forbol miristato v/v: relación volumen/volumen w/v: relación peso volumen WT: del inglés “wild type”, silvestre x g: veces la fuerza de la gravedad μg : microgramo μl: microlitro μM: micromolar Aminoácidos A Ala alanina C Cys cisteína D Asp aspartato E Glu glutámico F Phe fenilalanina G Gly glicina H His histidina I Ile isoleucina K Lys lisina L Leu leucina M Met metionina N Asn asparagina P Pro prolina Q Gln glutamina R Arg arginina S Ser serina T Thr treonina V Val valina W Trp triptófano Y Tyr tirosina Bases Nitrogenadas A adenina C citosina U uracilo G guanina T timidina
Materiales y métodos
- 159 -
TABLA I Anticuerpos primarios
Anticuerpo Antígeno Tipo Dilución de uso Procedencia
Anti-VRK2 VRK2 humana Policlonal conejo 1:1000,
IF 1:500 Producción propia
1F6 VRK1 humana Monoclonal ratón 1:500,
IF 1:2000
Producción propia
β-actina β-actina Monoclonal ratón 1:5000 Sigma
HA.11 Epítopo HA Monoclonal ratón 1:1000
IF 1:100
Covance
Anti-Flag Epítopo Flag Monoclonal ratón 1:1000
IF 1:100
Sigma
Anti-AU5 Epítopo AU5 Monoclonal ratón 1:1000 Covance
Anti-GST Epítopo GST Monoclonal ratón 1:1000 Santa Cruz
Anti-Myc(9E10) Epítopo Myc Monoclonal ratón 1:1000
IF 1:500
p-ERK p-Tyr 204 ERK Monoclonal ratón 1:5000
IF 1:200
Santa cruz
ERK2 ERK2 (extremo
C-terminal)
Policlonal conejo 1:10000 Santa Cruz
pMEK1/2 (Ser217/221) p-Ser217/221 Policlonal conejo 1:1000 Cell signaling
MEK-1(C18) MEK-1 (extremo
N-terminal)
Policlonal conejo 1:1000 Santa Cruz
MEK1/2(9G3) MEK (loop de
activación)
Monoclonal ratón 1:1000 Santa Cruz
pAKT(Ser473) p-Ser473 (AKT) Policlonal conejo 1:2000 Cell signaling
Akt-1/2/3(H-136) AKT1/2
(aa 345-480)
Policlonal conejo 1:1000 Cell signaling
p-p90RSK p-Ser380
(p90RSK)
Policlonal conejo 1:500 Cell signaling
RSK1/2/3 p90RSK Policlonal conejo 1:1000 Cell signaling
HER2 ErbB2 (extremo
C-terminal)
Monoclonal ratón 1:1000 Cell signaling
Ras H/K/N-Ras
(extremo amino-
terminal)
Policlonal conejo 1:500 Cell signaling
Raf-B(F-3) Raf-B
(aa 12-156)
Monoclonal ratón 1:1000 Santa Cruz
LAMP-2(H4B4) LAMP2 Monoclonal ratón 1:1000 Santa Cruz
Materiales y métodos
- 160 -
Calnexina(AF18) Calnexina Monoclonal ratón IF: 1:100 Santa Cruz
PRB-114C Giantina
(aa 1-469) Policlonal conejo IF 1:1000 Covance
Anti-GM130 GM130
(aa 869-982)
Monoclonal ratón IF: 1:100 BD Transduction
LaboratoriesTM
PC10 PCNA Monoclonal ratón 1:1000 Santa Cruz
Ciclina A(C19) Ciclina A Policlonal conejo 1:1000 Santa Cruz
Ciclina D1(M-20) Ciclina D1 Policlonal conejo 1:1000 Santa Cruz
Anti-KSR-1(C19) KSR1 (extremo
C-terminal)
Policlonal cabra 1:1000 Santa Cruz
Anti-KSR-1 KSR1
(aa 90-203)
Monoclonal ratón IF 1:100 BD Transduction
LaboratoriesTM
Tabla I. Se detallan los anticuerpos primarios empleados y su dilución de uso para western blot o inmunofluorescencia (IF).
Materiales y métodos
- 161 -
TABLA II Construcciones de ADN recombinante
Construcción
Vector Inserto Uso
pGEX-VRK2A
pGEX-4T1 VRK2A humana
Expresión como proteína de fusión con GST
en bacterias
pGEX-VRK2B
pGEX-4T1 VRK2B humana Expresión como proteína
de fusión con GST en bacterias
pGEX-VRK2AKD
pGEX-4T1 VRK2A mutante
quinasa inactivo
Expresión como proteína de fusión con GST
en bacterias
pGEX-VRK2BKD
pGEX-4T1 VRK2B mutante quinasa inactivo
Expresión como proteína de fusión con GST
en bacterias
HA-VRK2A
pCEFL-HA VRK2A humana Expresión en eucariotas
HA-VRK2B
pCEFL-HA VRK2B humana Expresión en eucariotas
HA-VRK1 pCEFL-HA VRK1 humana Expresión en eucariotas
HA-VRK2AKD
pCEFL-HA VRK2A mutante
quinasa inactivo Expresión en eucariotas
HA-VRK2BKD
pCEFL-HA VRK2B mutante
quinasa inactivo Expresión en eucariotas
GST-VRK2A
pCEFL-GST VRK2A humana Expresión en eucariotas
GST-VRK2B pCEFL-GST VRK2B humana Expresión en eucariotas
GST-VRK2AKD
pCEFL-GST VRK2A mutante
quinasa inactivo
Expresión en eucariotas
GST-VRK2BKD
pCEFL-GST VRK2B mutante
quinasa inactivo
Expresión en eucariotas
GST-VRK2(1-320)
pCEFL-GST VRK2A, dominio
N-terminal (aa 1-320)
Expresión en eucariotas
GST-VRK2B(256-
397)
pCEFL-GST VRK2B, dominio
C-terminal (aa 256-397)
Expresión en eucariotas
GST-VRK2A(256-
508)
pCEFL-GST VRK2A, dominio
C-terminal (aa 256-508)
Expresión en eucariotas
GST-VRK2A(364-
508)
pCEFL-GST
VRK2A, dominio C-terminal (aa 364-
508)
Expresión en eucariotas
GST-VRK1
pCEFL-GST VRK1 humana
Expresión en eucariotas
Materiales y métodos
- 162 -
GST-VRK3 pCEFL-GST VRK3 humana Expresión en eucariotas
pSUPERIOR-VRK2-
230
pSUPERIOR ARN de interferencia posición 230
Supresión de la expresión de VRK2 sobreexpresada
pSUPERIOR-VRK2-
1335
pSUPERIOR ARN de interferencia posición 1335
Supresión de la expresión de VRK2 sobreexpresada
ErbB2 pCDNA3 ErbB2 Expresión en eucariotas H-RasG12V pCEFL-HA RasG12V Expresión en eucariotas B-rafV600E pG12B RafV600E Expresión en eucariotas
MEK1.His6 pGEX MEK1.His6 Expresión como proteína
de fusión con His6 en bacterias
HA-MEK1 pCEFL-HA MEK1 Expresión en eucariotas MEK1CA pFC-CMV MEK1CA Expresión en eucariotas RAC-QL pCEFL-AU5 RAC-QL Expresión en eucariotas
CDC-42-QL pCEFL-AU5 CDC-42-QL Expresión en eucariotas Rho-A-QL pCEFL-AU5 Rho-A-QL Expresión en eucariotas HA-ERK1 pCEFL-HA ERK1 Expresión en eucariotas
FLAG-KSR1m pCMV KSR1m Expresión en eucariotas HA-VHR pEF-HA VHR Expresión en eucariotas
HA-MKP1 pRK5-HA MKP1 Expresión en eucariotas HA-MKP3 pRK5-HA MKP3 Expresión en eucariotas Myc-MKP2 pCMV-Myc MKP2 Expresión en eucariotas
SRE.Luc p.SRE.Luc SRE Expresión en eucariotas
CiclinaD1(-1745)Luc pA3-Luc (-1745) promotor CiclinaD1 Expresión en eucariotas
HA-TAK1 pCMV-HA TAK1 Expresión en eucariotas Flag-TAB1 pCMV-Flag TAB1 Expresión en eucariotas
Materiales y métodos
- 163 -
TABLA III Líneas celulares
Línea celular Organismo Procedencia Características Medio Cultivo
HEK293T Humano Embrionarias de riñón - DMEM, 10%FBS
HeLa Humano Adenocarcinoma de cervix Transformadas por papillomavirus HPV-18 DMEM, 10%FBS
MDA-MB-231 Humano Carcinoma de mama BaB DMEM, 10%FBS
MCF7
Humano
Carcinoma de mama
Lu
RPMI, 10%FBS
SKBR3
Humano
Carcinoma de mama
Lu
McCoys, 10%FBS
Cal-51
Humano
Carcinoma de mama
BaB
DMEM, 10%FBS
ZR7530
Humano
Carcinoma de mama
Lu
RPMI, 10%FBS
AU565
Humano
Carcinoma de mama
Lu
RPMI, 10%FBS
MDA-MB-361
Humano
Carcinoma de mama
Lu
DMEM, 10%FBS
HCC1569
Humano
Carcinoma de mama
BaA
RPMI, 10%FBS
HCC3153
Humano
Carcinoma de mama
BaA
RPMI, 10%FBS
HCC1937
Humano
Carcinoma de mama
BaA
RPMI, 10%FBS
BT549
Humano
Carcinoma de mama
BaB
RPMI, 10%FBS
MDA-MB-435
Humano
Carcinoma de mama
BaA
DMEM, 10%FBS
600MPE
Humano
Carcinoma de mama
Lu
DMEM, 10%FBS
ZR75B
Humano
Carcinoma de mama
Lu
RPMI, 10%FBS
HCC2185
Humano
Carcinoma de mama
Lu
RPMI, 10%FBS
HCC1428
Humano
Carcinoma de mama
Lu
RPMI, 10%FBS
T47D
Humano
Carcinoma de mama
Lu
RPMI, 10%FBS
HCC1187
Humano
Carcinoma de mama
BaA
RPMI, 10%FBS
BT474
Humano
Carcinoma de mama
Lu
RPMI, 10%FBS
Materiales y métodos
- 164 -
TABLA IV Oligonucleótidos
Oligonucleótido Secuencia (5´-3´) Uso
VRK-2A
CCCGGATCCATGCCACCAAAAAGAAATGAAAAATACAAACTTCC
Clonación de VRK2A
Y VRK2B
VRK-2S GGGGTCGACGGAATTTTGGTATCATCTTCAGAG
Clonación de VRK2A
Sin codón de terminación
VRK2(K169E)S GTTCATGGTGATATAGAAGCAGCAAATCTACTTTTGGG
Mutagénesis de VRK2A/B en
K169E (616-654)
VRK2(K169E)A CCCAAAAGTAGATTTGCTGCTTCTATATCACCATGAAC
Mutagénesis de VRK2A/B en
K169E (616-654)
VRK2i-230-fwd
GATCCCCGAAGATTGGCTCTGGAGGATTCAAGAGATCCTCCAG
AGCC AATCTTCTTTTTGGAAA
Clonación de ARN de
interferencia de VRK2
VRK2i-230-rev
AGCTTTTCCAAAAAGAAGATTGGCTCTGGAGGATCTCTTGAATC
CTCC AGAGCCAATCTTCGGG
Clonación de ARN de
interferencia de VRK2
VRK2i-1335-fwd
GATCCCCATACACTTCCACAGTCAGCTTCAAGAGAGCTGACTGT
GGAA GTGTATTTTTTGGAAA
Clonación de ARN de
interferencia de VRK2
VRK2i-1335-rev
AGCTTTTCCAAAAAATACACTTCCACAGTCAGCTCTCTTGAAGCT
GACT GTGGAAGTGTATGGG
Clonación de ARN de
interferencia de VRK2
VRK2TA
AGTGAGGAAGCGCTGAGTCCT
Detección de distintos
mensajeros por PCR
VRK2TB
CAAGAGTCTCAAGAACCTTTG
Detección de distintos
mensajeros por PCR
VRK2TC
GCAGCTCAGGTAGAAGCTTAGG
Detección de distintos
mensajeros por PCR
VRK2TD
CGTGCTGACTGTGGAAGTGT
Detección de distintos
mensajeros por PCR
GAPDH5´
GGTCTTACTCCTTGGAGGCCATGTG
Amplificación de GAPDH
GAPDH3´
ACCTAACTACATGGTTTACATGTT
Amplificación de GAPDH
BBBIIIBBBLLLIIIOOOGGGRRRAAAFFFÍÍÍAAA
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AAAGGGRRRAAADDDEEECCCIIIMMMIIIEEENNNTTTOOOSSS
Finalmente, quisiera agradecer a todas aquellas personas que han hecho posible este
trabajo: mi director de tesis Pedro A. Lazo, mis compañeros de laboratorio y profesión, mi
familia, así como a tantos amigos y personas especiales que se han cruzado en mi camino. Este
trabajo no hubiera visto la luz sin la ayuda de gente tan excepcional.
Parte del trabajo defendido en esta Tesis Doctoral ha sido publicado en el siguiente
artículo científico:
Fernandez, I.F., Blanco, S., Lozano, J., and Lazo, P.A. (2010). VRK2 inhibits mitogen-
activated protein kinase signaling and inversely correlates with ErbB2 in human breast cancer.
Molecular and cellular biology 30, 4687-4697.
