Departamento de Química Facultad de Agronomía

Universidad Agraria de la Habana

La interacción Planta-Metal Pesado.

Estudios en la familia Solanaceae

Autores: Ing. Liane Portuondo Farías Lic. Andrés Calderín García DrC. Fernando Guridi Izquierdo

La Habana, 2008

Índice Página

1. Introducción………………..……………………………………….…….. 1

2. Efecto y acumulación de metales pesados en plantas…..….……. 3

3. Mecanismos de adaptación……………………………………....……. 8

3.1 Inmovilización……………………………………………………….…… 9

3.2 Exclusión………………………………………………………………..… 10

3.3 Quelación…………………………………………………………….…… 10

4. Compuestos involucrados en los mecanismos de defensa…..…. 13

4.1 Metalotioneinas (Metallothioneins-MTs)………………………….….… 13

4.2 Fitoquelatinas (Phytochelatins-PCs)…………………………………... 14

5. Estudios relacionados con adición de metales pesados a

medios de cultivo …………………………..…………………………...….. 17

5.1 Perspectivas y aplicaciones de los métodos de propagación in

vitro…………………………………………………………………………..… 21

1. Introducción Los avances en la ciencia y la tecnología desde la revolución industrial, han

aumentado la capacidad del ser humano para explotar los recursos naturales. Sin

embargo, esto ha generado perturbaciones en los ciclos biogeoquímicos

elementales (Liu y Suflita, 1993). La introducción repentina de compuestos

químicos xenobióticos o la reubicación masiva de estos materiales en diferentes

compartimientos ambientales, con frecuencia provoca la acumulación de

contaminantes a niveles perjudiciales para todos los organismos vivos (Cañizares-

Villanueva, 2000).

La contaminación del ambiente con metales tóxicos y radionúcleos surge como

resultado de las actividades humanas, principalmente industriales que junto a

otras fuentes como la agricultura y la eliminación de residuos, contribuyen a

agravar esta problemática a nivel mundial (Atkinson y Kassan, 1998).

Estos contaminantes son descargados en la atmósfera y en los ambientes

acuáticos y terrestres, principalmente como solutos o partículas que pueden

alcanzar concentraciones elevadas, especialmente cerca del sitio de descarga

(Brierley, 1990).

Entre los mecanismos moleculares que determinan la toxicidad de los metales

pesados se encuentran: el desplazamiento de iones metálicos esenciales de

biomoléculas y bloqueo de sus grupos funcionales; modificación de la

conformación activa de biomoléculas, especialmente enzimas y polinucleótidos;

ruptura de la integridad de biomoléculas y la modificación de otros agentes

biológicamente activos (Ochiai, 1987).

Un aumento en las concentraciones de metales como Ni, Cu, Cd, Pb y Zn pueden

producir cambios fisiológicos y bioquímicos en las plantas, tales como daños a la

membrana celular, modificación o inactivación de la actividad de las enzimas e

inhibición del crecimiento de las raíces, que influyen en su posterior desarrollo

(Barcelo et al., 1997).

La acumulación de metales en la plantas depende de procesos de movilización y

captación del suelo, compartimentación y secuestro desde la raíz y la eficacia del

xilema como tejido de transporte hacia las partes aéreas para su almacenamiento

11

a nivel de las hojas. Para que estos procesos sean eficaces, se hace necesaria la

presencia en la planta de ligandos que posean alta afinidad con los cationes de los

metales pesados, para la posterior formación de complejos ligando-metal. Los

ligandos potenciales incluyen aminoácidos, ácidos orgánicos y péptidos como las

fitoquelatinas y las metalotioneinas, principales encargadas de inmovilizar y

atrapar metales pesados para su posterior almacenamiento dentro de la vacuola;

siendo este un mecanismo de defensa ante elevados niveles de toxicidad (Lobo,

2000).

Una de las principales familias botánicas estudiadas mundialmente es la

Solanaceae, dentro de la cual se incluyen importantes especies con fines

alimentarios como es el caso del tomate (Lycopersicon esculentum Mill.) y la papa

(Solanum tuberosum L.). Además se encuentran otras con fines comerciales como

el tabaco (Nicotiana tabacum L.), la cual constituye una fuente importante de

ingresos al país, que se utiliza como base para el estudio de la estructura y

funciones del genoma, debido a la buena caracterización genética que existe de

esta especie. También es un cultivo que permite estudios in vitro aplicados a la

micropropagación y a la ingeniería genética que pueden ser extrapolados a otras

especies vegetales (Grimmer et al., 2000).

La caracterización genética de especies como el tabaco, permiten el empleo de

técnicas de ingeniería genética para estudios más profundos acerca de los

mecanismos de adaptación de las plantas ante metales pesados. Dado que

muchas de las especies consideradas como acumuladoras se encuentran en la

familia Solanaceae, es por lo que este trabajo se propone como objetivo presentar

a esta familia botánica como modelo en la interpretación de los efectos

relacionados con metales tóxicos en las plantas, así como la utilización de la

micropropagación para futuras investigaciones en este sentido.

Para ello, se presentan en este material las principales investigaciones realizadas

en este tema en los últimos diez años. Relacionados principalmente con especies

pertenecientes a las solanaceas y la interacción de estas plantas con los metales

pesados, sus mecanismos de defensa ante este estrés y la utilización práctica de

las técnicas de micropropagación para estos fines.

22

2. Efecto y acumulación de metales pesados en plantas

En los ecosistemas agrícolas la mayoría de los metales pesados se encuentran

incluidos en un ciclo biogeoquímico en el cual los dos componentes

fundamentales son el suelo y la planta. Estos elementos pueden llegar al suelo

de forma aérea o terrestre, principalmente por la acción del hombre y son

absorbidos por las plantas, por lixiviación o erosión. A su vez, existe un equilibrio

entre las fracciones disponibles y no disponibles de estos elementos en el suelo,

capaces de modificar su ciclo, que dan lugar a que se encuentren en proporciones

deficientes o tóxicas (Ghosh y Singh, 2005; Llugany et al., 2007).

La capacidad de las plantas para acumular metales o presentar signos de

fitotoxicidad ante éstos u otros posibles contaminantes, varía según la especie

vegetal y la naturaleza del contaminante. Estas diferencias en la absorción de

metales pueden ser atribuidas a la capacidad de retención del metal por el suelo y

a la interacción del complejo planta-raíz-metal.

Los efectos negativos o daños en la fisiología de las plantas han sido motivo de

innumerables investigaciones en los últimos años (Harter y Naidu, 1995). Se

plantea que una toxicidad por metales pesados, pueden causar anomalías

citogenéticas en las plantas como el decrecimiento o la inhibición de la división por

mitosis y anomalías en los cromosomas (Ünceer et al., 2000). Además de la

reducción del crecimiento radicular y la frecuencia de células mitóticas,

incrementando la frecuencia de células aberrantes en especies del género Allysum

(Lerda, 1992).

Sin embargo, a pesar de ser considerada como acumuladora, la familia

Solanaceae no se encuentra exenta de este comportamiento y en condiciones

altamente tóxicas se ha comprobado que elementos como el Cd, Fe, Pb, Zn, Cu y

Hg, pueden inhibir la germinación del polen, el crecimiento del tubo polínico y la

germinación de semillas en plantas de tabaco (Nicotiana tabacum L.). Esto afectó

negativamente el crecimiento de la plúmula, la radícula y provocó cambios

morfogenéticos. Esa información se obtuvo a partir de la adición de disoluciones

de Ni Cl2, Fe Cl2, Cu SO4 y CO Cl2 y Pb NO3 a medios de germinación donde las

33

plántulas se encontraban bajo condiciones controladas de temperatura, humedad,

fotoperíodo y asepsia total (Tuna et al., 2001).

Además, se han reportado estudios donde en condiciones controladas se logró

demostrar anomalías citogenéticas en plantas de la familia Solanaceae, tales

como el decrecimiento o la inhibición de la división por mitosis, encontrando al

catión Pb2+ como el principal causante de la reducción del crecimiento y la

frecuencia de mutaciones (Lupino et al., 2005).

Iguales resultados se han encontrado en especies de la misma familia pero en

condiciones de campo, donde concentraciones elevadas de Cd fueron

responsables de daños en la estructura del ADN extraído de las hojas y raíces de

Nicotiana tabacum L var. Nicotiana xanthi, las que provocaron cambios

morfogenéticos y recombinaciones en la estructura de los ácidos nucleicos,

(Gichner et al., 2004) así como el incremento en la frecuencia de mutaciones

somáticas en plantas de Solanum tuberosum L. que no sólo retardaron el

crecimiento de éstas, sino que repercutieron en una reducción del área foliar

(Gichner et al., 2007).

Estudios equivalentes a estos en condiciones naturales tienen una mayor

complejidad ya que deben considerarse otros factores actuantes. En el suelo se

establece además una interacción entre la planta, el suelo y los microorganismos,

que de alguna manera puede modificar los procesos encontrados en condiciones

de laboratorio.

Las investigaciones que recoge la literatura consultada, a pesar de desarrollarse

en diferentes condiciones, demostraron una conclusión coincidente y es que los

denominados metales pesados, cuando se encuentran en elevadas

concentraciones, provocan efectos negativos en las plantas que obstaculizan el

buen funcionamiento de todos los procesos necesarios para un adecuado

desarrollo.

La acción directa de los metales pesados sobre los seres vivos ocurre a través del

bloqueo de las actividades biológicas, es decir, la inactivación enzimática por la

formación de enlaces entre el metal y los grupos sulfhidrilos (SH) de las proteínas,

causando daños irreversibles en los diferentes organismos (Hernández, 2002).

44

En los últimos años se logró identificar, en estado natural, plantas que tienen la

capacidad potencial de acumular metales pesados (Ghosh y Singh, 2005),

pertenecientes por lo menos a 45 familias: entre ellas Solanaceae, Brassicaceae,

Fabaceae, Euphorbiaceae, Asteraceae, Lamiaceae, y Scrophulariaceae como

especies hiperacumuladoras. De estas últimas, las especies más conocidas son

Thlaspi caerulescens L., que sin mostrar lesiones ha logrado acumular hasta

26,000 mg kg-1 de Zinc y Brassica juncea L., que posee la habilidad de transportar

metales desde las raíces a los retoños y algunos cálculos indican que ha sido

capaz de extraer 1,1550 mg kg-1de Pb por hectárea. En el tabaco, Nicotiana

tabacum L., se ha encontrado que tiende a acumular elevados niveles de metales

como Cd y Pb, reportándose concentraciones en tejidos foliares de este último de

más de 500 mg kg-1 en condiciones de campo (Rodríguez et al., 2006) (Tabla 1).

Ciertas plantas denominadas hiperacumuladoras muestran resistencia a los

metales pesados y son capaces de acumular y extraer grandes volúmenes de

estas sustancias en suelos con una alta contaminación. Las plantas

hiperacumuladoras son aquellas que acumulan, altas concentraciones de metales

en sus tejidos y poseen dos características principales (Bruneton, 2001):

Cuando los metales pesados penetran en una célula vegetal, son inmovilizados o

atrapados por péptidos, específicamente fitoquelatinas, pasándolos al interior de la

vacuola. De este modo la célula posee dos mecanismos de protección: la unión

del metal con la fitoquelatina y su deposición en la vacuola. Algunas plantas

pueden tener una capacidad masiva para acumular niveles elevados de materiales

tóxicos siempre que se mantengan almacenados en la vacuola ya que de esta

manera las células no sufren los efectos tóxicos de los mismos.

• Son especies que contienen en sus tejidos una concentración mayor al

0.1% de Ni, Pb, Cu, Co.

• La habilidad de crecer y desarrollarse en suelos con niveles de metales,

tóxicos para casi todas las especies de plantas.

55

Tabla 1 (Resultados recientes de las principales especies acumuladoras de la familia Solanaceae)

Especies Metal que

acumula

Contenido

(mg kg-1) Efectos que ocasiona Referencias

Nicotiana tabacum L. Cd, Fe, Pb,

Zn, Cu, Hg

Inhibición de la germinación del

polen, crecimiento del tubo

polínico y germinación de las

semillas.

Afectaciones del crecimiento de la

plúmula y radícula.

Cambios morfogenéticos.

Tuna et al., 2001

Nicotiana tabacum L. Pb Inhibición de la división por

mitosis.

Anomalías en los cromosomas.

Ünceer et al., 2000

Nicotiana tabacum L.

Cd

Pb

500.0

Cambios morfogenéticos.

Recombinaciones en la estructura

de los ácidos nucleicos.

Gichner et al., 2004

Rodríguez et al., 2006

Nicotiana tabacum L.

Solanum tuberosum L.

Cd Reducción del área foliar. Gichner et al., 2007

66

Especies Metal que

acumula

Contenido

(mg kg-1) Efectos que ocasiona Referencias

Nicotiana tabacum L. var.

- Burley

- Virginia

- Oriental

Zn

Cu

Cd

Pb

Zn

Cu

Cd

Pb

Zn

Cu

Cd

Pb

161.0

54.5

3.7

9.1

135.6

42.8

3.0

10.2

114.4

37.8

2.6

14.4

Sin mostrar lesiones. Golia et al., 2007

77

3. Mecanismos de adaptación

Las plantas han desarrollado mecanismos altamente específicos para absorber,

traslocar y acumular nutrientes incluyendo metales tóxicos, lo que constituye

generalmente el primer eslabón de entrada de éstos en la cadena alimentaria.

La absorción y posterior acumulación dependen, en primera instancia, del

movimiento de los metales desde la disolución del suelo hacia las raíces de la

planta; el paso por las membranas de las células corticales de la raíz; el transporte

desde las células corticales hasta el xilema donde la disolución con los metales se

transporta de la raíz hacia el tallo y la posible movilización a través del floema de

las hojas hacia tejidos de almacenamiento utilizados por el hombre como alimento.

Otro mecanismo de ingreso puede ser a partir de la absorción foliar, debido a

fuentes aéreas de contaminación que provoquen la acumulación de elementos

trazas en la superficie o haz de las hojas. Otra vía puede ser la aplicación continua

de fertilizantes químicos que activan una fase de penetración cuticular. Se ha

considerado la existencia de un mecanismo de carácter metabólico que justifique

la acumulación de los elementos contra un gradiente de concentración, cuando la

deposición se realice en tejidos que ya almacenan una determinada cantidad del

elemento tóxico (Harter y Naidu, 1995).

Algunas especies de plantas pueden acumular metales pesados dentro o fuera de

sus tejidos, otras pueden ser receptoras pasivas y unas pocas pueden controlar la

traslocación de elementos tóxicos debido a reacciones fisiológicas y bioquímicas

específicas. Las plantas pueden presentar distintos mecanismos de tolerancia o

respuesta al exceso de metales pesados que incluyen la exclusión, la formación

de péptidos ricos en grupos tiólicos, la quelación por ácidos orgánicos y

aminoácidos, la compartimentación del metal en estructuras subcelulares y la

reducción del transporte a través de la membrana (Hall y Williams, 2003).

Los componentes de la célula que en forma selectiva se pueden convertir en

blanco de metales tóxicos son la membrana plasmática y el citoesqueleto. Es por

esta razón que la célula, para un correcto funcionamiento, debe tener en buen

estado los siguientes caminos metabólicos: la producción de ATP mitocondrial, el

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metabolismo del calcio, la síntesis de proteínas, la regulación del ADN, la glicólisis

y el ciclo del ácido cítrico o ciclo de Krebs. Los dos últimos proporcionan los

precursores para la síntesis de aminoácidos y los equivalentes reducidos, cuya

oxidación genera la mayoría del ATP requerido. Los daños a la membrana

plasmática, a la producción de ATP mitocondrial y al control de los niveles de

calcio intracelular, son las causas para la destrucción final de la célula (Peña et al.,

2004).

La membrana plasmática es uno de los componentes que primero responde al

daño y sobre ella se producen efectos específicos según el metal. Sin embargo

también puede estar involucrada en la tolerancia a metales, reduciendo la

captación o estimulando las bombas de flujo de metales que promueven la entrada

al citosol. Se sabe que las plantas tolerantes protegen la membrana mediante

mecanismos de reparación que mantienen su integridad, mecanismos de

protección (como proteínas de choque térmico y metalotioneinas), mejorando los

mecanismos de homeostasis de metal, promoviendo un influjo reducido a través

de la membrana plasmática o un eflujo selectivo (Montes, 2001).

3.1 Inmovilización

La primera barrera contra la entrada de metales pesados se expresa

principalmente a nivel radicular. La inmovilización de éstos desde la pared celular

por carbohidratos extracelulares, identificados como sustancias mucilaginosas,

evitan la presencia de iones libres de elementos tóxicos y su posterior traslocación

hacia la parte aérea, reduciendo al máximo la fitotoxicidad (Zhao et al., 2001).

La raíz constituye el tejido de entrada principal de metales tóxicos en la planta.

Estos pudieran llegar fundamentalmente por un proceso de difusión en el medio

mediante un flujo masivo e intercambio catiónico. En el caso de la inmovilización,

los metales quedan retenidos en las paredes celulares debido a la celulosa,

hemicelulosa, lignina y carbohidratos extracelulares, que no permiten el paso de

estos elementos tóxicos hacia la parte aérea de las plantas (Junk y George, 2002).

99

3.2 Exclusión

Prevenir la entrada de metales pesados al citosol a través de la exudación de

compuestos, puede representar otra estrategia de defensa. Algunas plantas

conocidas como excluyentes poseen mecanismos especializados para la

reducción de la entrada de metales tóxicos a las raíces, que toleran su presencia,

pero no los absorben en grandes cantidades (Peris, 2006).

El malato, el citrato y el oxalato han sido identificados como importantes quelantes

secretados por las raíces, que brindan resistencia a las plantas frente a metales

tóxicos y su actuación, en dependencia de las características del suelo, puede

lograr una mayor disponibilidad de ellos para su posterior extracción (Dobermann

y Fairhurst, 2000).

3.3 Quelación

Uno de los aspectos más importantes de la acumulación de metales es el que se

refiere al proceso de formación de complejos metálicos. Un complejo o compuesto

de coordinación es el resultado de la interacción de un átomo central; esto es, un

ion metálico con orbitales de valencia vacíos, que puede actuar como ácido de

Lewis (aceptor de electrones) y una o varias bases de Lewis (dador de electrones)

con pares de electrones libres. Estas bases se conocen como agentes

acomplejantes o ligandos (Rieuwerts et al., 1998).

El metal se rodea de los ligandos formando un complejo. Los ligandos simples,

como el agua, sólo forman un enlace con el átomo central y se llaman

monodentados o monocoordinados. Algunos ligandos son capaces de formar

múltiples enlaces de coordinación, lo cual va incrementando la estabilidad de los

complejos.

La planta utiliza este mecanismo de formación de complejos en el interior de la

célula para detoxificar o amortiguar la presencia de metales tóxicos. De esta

manera, el metal queda inmerso en una interacción química que le mantiene en

equilibrio electrónico o acomplejado, pero que no lo deja fuera del metabolismo; o

1100

sea, no se ha eliminado del citoplasma de la célula y por ello, sigue siendo

potencialmente tóxico.

Ciertos agentes quelatantes sintéticos, facilitan la disponibilidad de iones metálicos

en disolución, disminuyendo procesos de insolubilización o de oxidación

reducción, por lo cual se han utilizado en disoluciones nutritivas para las plantas.

En la Figura 1 se muestra al ácido etilendiamintetracético (EDTA), uno de los

ligandos más utilizados, formador de quelatos estables y solubles en agua al

interactuar con un gran número de cationes metálicos de diversas cargas.

Figura 1 (A) (Fórmula desarrollada de la molécula de ácido

etilendiamintetracético) (EDTA). (B) (Representación tridimensional según

Williams y Xing, 2006)

Los quelatantes tienen la capacidad de formar complejos con los metales pesados

que se encuentran en la disolución del suelo y hacerlos biodisponibles a las

plantas que poseen mecanismos de defensa contra estos elementos tóxicos. Los

principales agentes quelatantes que se utilizan en la agricultura pertenecen a los

siguientes grupos químicos (Tabla 2).

1111

Tabla 2 (Nombres químicos y fórmulas de los principales agentes

quelatantes). (Modificado de Evangelou et al., 2007)

Los quelatos formados para estos fines deben tener una estabilidad suficiente

para impedir la formación de sales insolubles del ión metal, pero han de ser

suficientemente inestables para liberar lentamente los metales y que las plantas

puedan asimilarlos. Sólo unos pocos agentes quelatantes tienen suficiente

afinidad con metales para formar complejos solubles estables. La estabilidad de

los quelatos está indicada por su constante de estabilidad. Mientras más alto es el

valor de esta constante más elevada es la estabilidad del complejo (Tabla 3).

1122

Tabla 3 (Constantes de estabilidad (Kest) de los distintos quelatos).

(Modificado de Evangelou et al., 2007)

Agente

quelatante

Log Kest

Fe3+ Fe2+ Zn2+ Cu2+ Mn2+ Ca2+

EDTA 25.0 14.27 14.87 18.70 13.81 11.0

EDDHA 33.9 14.3 16.8 23.94 ___ 7.20

HEEDTA 19.6 12.2 14.5 17.4 10.7 8.0

Citrato 11.2 4.8 4.86 5.90 3.70 4.68

Gluconato (GL) 37.2 1.0 1.70 36.6 ___ 1.21

4. Compuestos involucrados en los mecanismos de defensa

Los efectos tóxicos por metales pesados en las plantas pueden causar daños

oxidativos de forma directa, por la producción de especies reactivas de oxígeno

(ERO) o indirectamente, inactivando los sistemas antioxidantes de la célula. No

obstante, las plantas pueden presentar diferentes mecanismos de tolerancia que

incluyen compartimentación del metal en estructuras subcelulares y la formación

de péptidos ricos en cisteína como metalotioneinas y fitoquelatinas. Otra

alternativa es la producción de un sistema antioxidante de defensa que incluye

sistemas enzimáticos y no enzimáticos (Soares, 2005).

4.1 Metalotioneinas (Metallothioneins-MTs)

Las MTs están presentes en todos los organismos, incluyendo microorganismos

procariotas y eucariotas, algas, plantas superiores, invertebrados, peces y

mamíferos (Roesijadi, 1996).

El término fue introducido para designar proteínas ricas en azufre que contenían

Cd, Zn, Cu, y provenían del córtex renal del caballo. Estas proteínas fueron

caracterizadas por poseer bajo peso molecular (6 - 12 KD), alto contenido

metálico, composición característica de aminoácidos con una elevada proporción

de cisteína y ausencia de histidina y de aminoácidos aromáticos. Se encontró una

1133

secuencia única de aminoácidos, con una distribución característica de los

residuos de cisteína en la forma Cys - X - Cys; y características espectroscópicas

propias de uniones mercarptilo (azufre - metal) (Pavlíková et al., 2004).

Existen cuatro isoformas diferentes; las MTs-I y MTs-II se expresan prácticamente

en todos los tejidos de los organismos vivos y son inducibles por metales pesados,

agentes oxidantes, hormonas, inflamación y el estrés. Por el contrario, la MTs-III y

la MTs-IV tienen una distribución mucho más restringida, localizándose

fundamentalmente en el sistema nervioso central (SNC) y el epitelio escamoso

estratificado del cuerpo humano. No se conocen con certeza las funciones de las

MTs, aunque se supone que intervienen en la homeostasis del Zn y del Cu y en la

detoxificación de los mismos cuando alcanzan concentraciones elevadas

(Trancoso, 2000).

Las MTs actúan en las plantas como proteínas transportadoras de metales y

juegan un papel importante en su detoxificación. Además del zinc, su expresión y

biosíntesis parece estar regulada por otros metales, como el Cd y el Cu, así como

por factores endógenos, tales como citoquininas y hormonas esteroideas

(Tohyama et al., 2000).

4.2 Fitoquelatinas (Phytochelatins-PCs)

Las PCs son ligandos de alta afinidad que acomplejan metales pesados. Se

identificaron después que las metalotioneinas y se piensa que pueden

desempeñar en las plantas el papel equivalente al que éstas últimas desempeñan

en bacterias y mamíferos.

Consisten en pequeños péptidos ricos en azufre a partir de unidades repetitivas de

glutamilcisteína (entre 2 y 8 unidades) con una glicina terminal y son sintetizadas

por degradación de glutatión mediada por una carboxipeptidasa. Son capaces de

enlazarse con cationes de metales pesados vía coordinación de tiol y en

consecuencia provocar detoxificación (Goldsbrough, 2000). En la Figura 2 se

muestra la síntesis de este péptido.

1144

Figura 2 (Esquema donde se demuestra la síntesis de PCs producida por la

unión de Glutatión sintasa (GSH), con residuos de Glutamato (Glu) y Cisteína

(Cys) ligados a través de repeticiones de (γ-Glu-Cys)n-Gly donde n= 2-

5…..11. según Cobbett, 2000) Las PCs se inducen rápidamente en las plantas por tratamiento con metales

tóxicos. Su disminución provoca una mayor sensibilidad a los metales pesados y

por tanto, su papel en la tolerancia y acumulación de éstos es crítico. Su síntesis

en las raíces es más efectiva cuando es estimulada por Cd, en menor proporción

por Zn y Cu y prácticamente no existe en presencia de Ni (Howden et al., 1995).

Se sintetizan en el citosol, donde se unen a compuestos metálicos formando

complejos. Sin embargo, técnicas de Cromatografía Líquida de Alta Resolución

(High performance liquid chromatography-HPLC) y rayos X detectan mayores

concentraciones de metal y PCs en el interior de la vacuola, por lo que se deduce

que el transporte y acumulación en su interior están implicados en tolerancia y

detoxificación (Rea et al., 1998).

Además del bien documentado proceso de acumulación de los complejos PCs-Cd

en vacuola, hay evidencias de acumulación de otros metales, involucrando

diferentes sistemas de transporte desde el tonoplasto con metales como el Zn y el

Ni, entre otros. (Figura 3).

1155

Figura 3 (Algunos mecanismos que actúan en la acumulación de metales

pesados en plantas según Clemens et al., 2002)

A pesar de esos resultados aún quedan muchas interrogantes que no logran

discernir los verdaderos mecanismos que intervienen en el proceso descrito

anteriormente. Es por esto que todavía se realizan investigaciones que buscan

dilucidar a ciencia cierta cuáles son en su totalidad las interacciones que tienen

lugar en estos sistemas.

1166

5. Estudios relacionados con adición de metales pesados a medios de

cultivo

En la actualidad aun son escasos los trabajos relacionados con adición de metales

tóxicos a medios de cultivo, para conocer con claridad los mecanismos fisiológicos

que se desarrollan en plantas resistentes a concentraciones elevadas de estos

metales.

Sin lugar a dudas, el medio de cultivo más ampliamente difundido, dada su

facilidad de preparación, así como sus excelentes resultados y fácil adaptación a

cualquier fase de micropropagación, es el propuesto por Murashige & Skoog

desde 1962. Este es un medio al cual se le pueden adicionar cationes de metales

pesados en concentraciones elevadas, para estudios de comportamientos

fisiológicos en plantas estresadas con esas condiciones.

Para el empleo de esta técnica se precisa suplementar el medio de cultivo con

hormonas reguladoras del crecimiento vegetal, como 6-bencilaminopurina (6-BAP)

o giberelinas (GA3), lo que propicia que los explantes se encuentren ante un medio

favorablemente balanceado en hormonas, aumentando la inducción de tejidos,

fundamentalmente de nuevos brotes, formación de raíces y multiplicación celular

acelerada (Gómez et al., 2006).

El éxito del cultivo de tejidos está muy influenciado por la composición química del

medio basal; este contiene macronutrientes (sales de nitrógeno, potasio, calcio,

fósforo, azufre y magnesio); micronutrientes (manganeso, boro, hierro, níquel,

cobalto y otros); carbohidratos (usualmente sacarosa), destinados a reemplazar el

carbono que la planta normalmente fija de la atmósfera por medio de la

fotosíntesis; vitaminas (las cuales son necesarias para llevar a cabo una serie de

reacciones catalíticas en el metabolismo y son requeridas en pequeñas

cantidades) y por último el agua, representando alrededor del 95% (López-

Acevedo, 1999).

La ausencia de alguno de estos componentes, normalmente conlleva a que no se

produzca crecimiento y desarrollo y el tejido u órgano aislado muera. De aquí la

importancia de una preparación adecuada del mismo, ya que un explante no

1177

podría sobrevivir en un medio desbalanceado y además, con la adición de otra

sustancia ajena, como podría ser, un metal tóxico para las plantas.

La presencia de metales en los medios de cultivos se puede realizar mediante la

preparación de diluciones partiendo de una solución más concentrada, que se

adiciona al medio mediante alícuotas en concentraciones que se encuentren

totalmente biodisponibles para las futuras semillas o plántulas (Portuondo et al.,

2008).

En la actualidad se han desarrollado trabajos donde ha sido posible la preparación

de medios de cultivo suplementados con CdCl2, para la determinación del estrés

en el crecimiento de raíces de Turfgass (Jen-Kuo et al., 2005). También se ha

estudiado, mediante técnicas de cultivo de tejido, la tolerancia ante

concentraciones de los metales pesados Zn, Cu y Mn en la especie Ailanthus

altissima Swingle, suplementando los medios de cultivos con sales de estos

metales (Predieri y Gatti, 2003). De igual forma, en investigaciones para

determinar el contenido de metales pesados en los tejidos de las plantas de Typha

latifolia, éstas se pusieron directamente en contacto con disoluciones acuosas de

una sal de plomo (Carranza et al, 2004).

Muchos son los estudios en la determinación de las modificaciones moleculares

de las plantas cuando son sometidas a estrés por metales pesados. La

generalidad de estos estudios se concentra, en la evaluación de la expresión de

alguna sustancia o grupos de compuestos, relacionados con el efecto producido

por la exposición al metal. Un ejemplo de ello resulta la determinación de niveles

de fitoquelatinas, que en la familia Solanaceae se ha relacionado con el metal Cd.

Sin embargo, los efectos morfológicos externos de las plantas, modificados

cuando son sometidas a elevadas dosis de otros cationes de metales pesados,

especialmente Pb2+, aún no han sido suficientemente estudiados, a pesar de que

se reporta que la familia es acumuladora de ese catión.

Un acercamiento a estos estudios sobre los efectos fisiológicos se pueden

encontrar en trabajos realizados por Portuondo et al., (2008) en plantas de dos

variedades de tabaco San Luis 21(SL.21) y Burley Habana 13 (BH.13), obtenidas

a partir de callos sin diferenciar, donde fueron adicionados al medio de cultivo

1188

concentraciones de 100, 500 y 1000 mg kg-1 respectivamente de una sal de

plomo.

Las diferentes concentraciones del metal utilizadas afectaron los indicadores

morfológicos evaluados (altura de las plántulas, número de hojas totales y número

de hojas verdes), teniendo una repercusión directa sobre la formación de nuevos

brotes en los explantes (Figura 4). Esto se atribuyó a un efecto de genotoxicidad,

presumiblemente por una interacción del catión plomo con el ADN, formando

enlaces con bases nitrogenadas como la Adenina, Guanina y Timina, además de

una disminución considerable en la célula de grupos tiólicos antioxidantes, lo que

traería consigo un aumento de especies reactivas de oxígeno. Esto último

finalmente causaría un estrés oxidativo a nivel celular que repercutiría en la

infuncionalidad de los lípidos, proteínas y el ADN en sí mismo.

Figura 4 (Medias del número de brotes para el factor concentración) (análisis

bifactorial)

Una última evidencia de este efecto negativo sobre la fisiología de las plantas se

evidenció en la escasa formación de hojas a partir de los brotes (Figura 5); lo cual

resulta lógico si se tiene en cuenta que sus células son las encargadas de la

formación de tejidos foliares, división y especialización celular, sugiriéndose que

estos daños tan marcados están dados fundamentalmente por la acción del Pb2+

sobre las bases nitrogenadas en los ácidos nucleicos, lo que indudablemente trae

1199

consecuencias en la variabilidad y formación de nuevos tejidos, así como en los

niveles de especialización celular.

Figura 5 (Cantidad de hojas totales por explante en el tiempo)

En todos los indicadores, los mayores efectos se ejercieron en los tratamientos

más concentrados de 500 y 1000 mg kg-1. La posibilidad de contar con un rango

de concentraciones de Pb2+ que estimule efectos visibles en las plantas de tabaco,

tiene como principal ventaja, la de contar con una planta que actúe como

indicadora de concentraciones biodisponibles de estos metales. Esto se debe a

que en los indicadores evaluados, los efectos más importantes y visibles

estuvieron en concentraciones superiores a 100 mg kg-1, indicando que cuando la

planta se somete a tales niveles, se desatan una serie de trastornos morfológicos

visibles y medibles.

2200

5.1 Perspectivas y aplicaciones de los métodos de propagación in vitro

La utilización de los métodos de propagación in vitro es numerosa, dependiendo

del objetivo que se persiga. Se puede destacar la micropropagación acelerada de

material vegetal seleccionado o transformado; el mantenimiento de bancos de

germoplasma; la evaluación de plantas resistentes o tolerantes a estrés abiótico

como alta salinidad, estrés hídrico, bajas temperaturas, etc.; la resistencia a

herbicidas, plagas; la producción de metabolitos secundarios y la germinación in

vitro.

Las aplicaciones más importantes de los métodos de cultivo de tejidos in vitro en

la agricultura se orientan a la propagación, al saneamiento y a la mejora genética. La propagación vegetativa in vitro o clonación puede ser una alternativa económicamente rentable, frente a los métodos de multiplicación clásicos; el

sexual (germinación de semillas) y el vegetativo o asexual (esqueje, injerto,

acodo, entre otros). La micropropagación masiva de clones puede obtenerse vía

organogénesis directa; es decir, a partir de un meristemo o yema (apical y/o axilar)

aislada de un vástago. Esta vía aporta estabilidad genética o ausencia de

mutaciones y también plantas libres de virus, bacterias u hongos, mediante el

cultivo de ápices meristemáticos de vástagos (Mederos-Molina, 2007). El enorme potencial que posee esta técnica ha propiciado que en los últimos años

se haya producido un incremento en el número de laboratorios de cultivos de

tejidos, lo que ha motivado que algunos especialistas la utilicen como una

alternativa viable en sus programas de producción. De igual manera en estudios

recientes a nivel mundial, la micropropagación ha servido de pauta para las

investigaciones a nivel molecular de efectos y mecanismos que desatan las

plantas resistentes a metales pesados, así como la creación de híbridos o clones

resistentes a estos metales tóxicos con el fin de ser utilizados como plantas

saneadoras de terrenos contaminados.

2211

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