la hemoglobina es una proteina globular , presente en las
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ESTIMACION DE LA FRECUENCIA DE LAS HEMOGLOBINOPATIAS
PRESENTES EN NIÑOS DE UNO A DIEZ AÑOS DE EDAD DE AMBOS SEXOS QUE CONSULTAN A LOS HOSPITALES: PEDIATRICO Y
GENERAL DE BARRANQUILLA.
Jaime de Jesús Ayala Oviedo. M. D.
TRABAJO DE TESIS Presentado como requisito parcial para optar al título de Maestría en Biología
PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA FACULTAD DE CIENCIAS
PROGRAMA DE POSGRADO MAESTRIA EN BIOLOGIA ENFASIS EN BIOQUÍMICA
BOGOTÁ, D. C., COLOMBIA
Noviembre de 2002
1
ESTIMACION DE LA FRECUENCIA DE LAS HEMOGLOBINOPATIAS
PRESENTES EN NIÑOS DE UNO A DIEZ AÑOS DE EDAD DE AMBOS SEXOS QUE CONSULTAN A LOS HOSPITALES: PEDIATRICO Y
GENERAL DE BARRANQUILLA.
JAIME DE JESÚS AYALA OVIEDO. M. D.
APROBADO
______________________________ Carlos Corredor Pereira, Ph. D
Director ___________________________ ______________________ Dra. Harlem Povea, M. D. M. Sc. Dr. Leonardo Lareo, M. Sc. ________________________ Dr. Luis Fajardo, M. D. M. Sc. _______________________ __________________________ Dra. Angela Umaña, M. Phil Dr. Luis Alejandro Barrera, Ph. D. Decana Académica Director
Facultad de Ciencias Programa de Posgrado
2
A Sandra Cristina, Jaime Andrés, Gabriel José y a mis Padres,
por ser fuentes inagotables de estímulos.
3
AGRADECIMIENTOS
El autor expresa sus agradecimientos a:
Al Dr. Carlos corredor, director del trabajo de investigación por su confianza, apoyo y por enseñarme su amplia visión de la Bioquímica. A Maria del Pilar Bernal, Codirectora, por entregarme toda su experiencia sin ninguna contraprestación. A Clara Lopez de Mesa, por su invaluable colaboración en el estudio estadístico de los resultados. Al grupo de Genética del Instituto de Salud de Colombia, por su apoyo, invaluable compañía y amistad. A los Pacientes, con su concurso y colaboración fue posible este trabajo. A la UNIVERSIDAD DEL NORTE DE BARRANQUILLA, Por su soporte económico Y confianza que depositaron en mí. Al INSTITUO NACIONAL DE SALUD, Por su apoyo en materiales y soporte ideológico para el desarrollo de la investigación
4
NOTA DE ADVERTENCIA
Reglamento de la Pontificia Universidad Javeriana. Artículo 23 de la Resolución N.13 de julio de 1946: “La universidad no se hace responsable por los conceptos emitidos por los alumnos en sus trabajos de tesis.”
5
CONTENIDO
PAGINA
RESUMEN INTRODUCCIÓN 15 1. MARCO TEORICO 22 1.1 GENETICA 22 1.2 ONTOGENESIS DE LAS HEMOGLOBINAS EN EL HOMBRE 23 1.3 ALTERACIONES DE LA HEMOGLOBINA 25 1.4 PROPIEDADES DE LA HEMOGLOBINA 26 1.5 DETECCIONES DE VARIANTES DE HEMOGLOBINA 27 1.6 EFECTO DE LAS ALTERACIONES DE LA HEMOGLOBINA 29 1.7 CLASIFICACION CLINICA DE LAS HEMOGLOBINOPATIAS 31 1.7.1 Síndromes falciformes o drepanocíticos 32 1.7.1.1 Hemoglobina S 32 1.7.1.2 Cambios en el glóbulo rojo con hemoglobina S 34 1.7.1.3 Presencia de hemoglobina fetal en la vida adulta 36 1.7.1.4 Hemoglobina A2 37 1.7.1.5 Hemoglobina C 38
6
pg 1.7.1.6 Hemoglobina D 38 1.7.2 Hemoglobinas inestables 39 1.7.3 Hemoglobinas con anormalidad en la afinidad por el oxígeno 39 1.7.3.1 Alta afinidad por el oxígeno 39 1.7.3.2 Baja afinidad por el oxígeno 40 1.7.4 Hemoglobina M. Cianosis Familiar 41 1.7.5 Síndromes talasémicos 43 1.7.5.1 α – talasemias 44 1.7.5.2 β - talasemias 45 1.8 Estudios realizados en los países caribeños 47 1.9 Estudios realizados en Colombia 51 2. OBJETIVOS 53 3. MATERIALES Y METODOS 54 3.1 Selección de la muestra poblacional 54 3.2 Individuos a analizar 55 3.3 Calculo de la muestra 55 3.4 Métodos 55 3.4.1 Extracción y manejo de la muestra 55 3.4.2 Hematocrito e índices eritrocitários 56 pg
7
3.4.3 Inducción de drepanocitos o falciformía 57 3.4.4 Prueba de estabilidad al isopropanol 58 3.4.5 Preparación del bemolizado 59 3.4.6 Electroforesis en acetato de celulosa 59 3.4.7 Cuantificación de hemoglobina A2 61 3.4.8 Isoelectroenfoque en gel de agarosa 63 3.5 Reactivos 64 3.5.1 Metabisulfito de sodio al 2% 64 3.5.2 Solución salina isotónica 64 3.5.3 Buffer TEB pH 8,6 65
3.5.4 Ponceau S 65 3.5.5 Acido acético al 5% 65 3.5. 6 Ciclohexanona 66 3.5.7 Buffer de isopropanol 66 3.5.8 Buffer Tris pH 7,4 66 3.5.9 Gel de agarosa al 1% 2 mm. 66 3.5.10 Solución para electrodos 67 3.5.11. Solución fijadora 67 3.5.12 Solución colorante o-toluidina 67 pg
8
3.6 Métodos estadísticos 68 4. RESULTADOS 70 4.1 Edad y sexo 70 4.2 Distribución de grupos sanguíneos 71 4.3 Electroforesis en acetato de celulosa e isoelectroenfoque en azarosa 73 4.4 Cuadro hemático e índices eritrocitarios 75 4.5 Comparación de los valores percentilares de los índices eritrocitarios del grupo de niños sin variante hemoglobínica (Normales) y los niños con variantes ( Anormales) 77 4.6 Falciformía y estabilidad al isopropanol 78 4.7 Comparación de falciformía y estabilidad con hemoglobinopatías 79 4.8 Antecedentes clínicos 80 4.9 Comparación de antecedentes clínicos con hemoglobinopatías 81 4.10 Comparación entre el motivo de consulta con hemoglobinopatías 82 4.11 Estudio familiar 83 5. DISCUSIÓN 85 6. CONCLUSIONES 99 7. RECOMENDACIONES 100 8. BIBLIOGRAFÍA 101
LISTA DE TABLAS
PAGINA
9
Tabla 1 Frecuencia(%) de Hb S y Hb C en población negra/negroide de países del Caribe. 49 Tabla 2 Resultados de estudios realizados en diferentes poblaciones de Colombia. 51 Tabla 3 Distribución porcentual por sexo y edad de 400 niños de uno a diez años de edad de la ciudad de Barranquilla que consultan a los hospitales: Pediátrico y General de Barranquilla. 70 Tabla 4 Grupos sanguíneos de niños de Barranquílla y de dos poblaciones Estadounidenses 72 Tabla 5 Comparación de dos métodos diagnósticos Electroforesis vs Isoelectroenfoque utilizados para la detección de variantes Hemoglobínicas en 400 niños de uno a diez años de edad de la ciudad de Baranquílla que consultan a los hospitales: Pediátrico y General. 75 Tabla 6 Valores percentilares de cuadro hemáticos de los 400 niños De uno a diez años de edad de la ciudad de Barranquilla. 76 Tabla 7 Comparación de valores internacionales de referencia con Los valores obtenidos en los 400 niños de Barranquilla. 76 Tabla 8 Comparación de valores percentilares de índices eritrocitarios entre niños de la ciudad de Barranquílla que presentan en el IEF normal y los niños que presentaron hemoglobinopatías. 77 Tabla 9 Comparación de los hallazgos de hemoglobinopatías en relación Con índices eritrocitarios bajos en niños de uno a diez años de edad de la ciudad de Barranquilla. 78 Tabla 10 Resultados de las pruebas de falciformía y de estabilidad al Isopropanol en 400 niños de ambos sexos de uno a diez años de Edad de la ciudad de Barranquílla. 78 Tabla 11 Comparación de los resultados de falciformía y prueba de Estabilidad con las hemoglobinopatías identificadas en los 400 niños de la ciudad de Barranquílla 79 Tabla 12 Distribución porcentual de los niños con antecedentes clínicos De 400 niños de uno a diez años de edad de la ciudad de Barrranquílla 80 Tabla 13 Distribución de frecuencias de niños con antecedentes clínicos
10
Vs diagnósticos según resultados de hemoglobinopatías en niños 81 Tabla 14 Distribución de frecuencias de niños por motivo de consulta Vs diagnóstico según resultados de hemoglobinopatías en niños De uno a diez años de edad de la ciudad de Barranquilla 82
11
LISTA DE FIGURAS
PAGINA Figura 1 Distribución porcentual de niños según sexo 71 Figura 2 Distribución porcentual de niños por grupos de edad 71 Figura 3 Distribución porcentual de niños según clasificación por grupos Sanguíneos 72 Figura 4 Resultado de una de la EAC realizadas a un grupo de diez niños 73 Figura 5 Resultado de un IEF realizado a un grupo de diez niños 74 Figura 6 Distribución porcentual de niños según antecedentes clínicos 81 Figura 7 Esquema familiar 1 83 Figura 8 Esquema familiar 2 84 Figura 9 Esquema familiar 3 84
12
ABREVIATURAS
Hb : HEMOGLOBINA F : FETAL A : ADULTA S : FALCIFORME RGR : RECUENTO DE GLOBULOS ROJOS HCTO : HEMATOCRITO HCM : HEMOGLOBINA CORPUSCULAR MEDIA VCM : VOLUMEN CORPUSCULAR MEDIO CMHC : CONCENTRACIÓN MEDIA DE HEMOGLOBINA CORPUSCULAR RP : RECUENTO DE PLAQUETAS EAC : ELEACTROFORESIS EN ACETATO DE CELULOSA IF : ISOELECTROENFOQUE
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RESUMEN Las hemoglobinopatías son las enfermedades genéticas más frecuentes en todo el mundo. La organización Mundial de la salud (1982) calculó que alrededor del 5% de la población mundial es portadora de genes de trastornos clínicamente importantes de la hemoglobina y cada año nacen 300.000 homocigotos gravemente afectados. Estudios previos realizados en varias regiones de Colombia por Restrepo encontraron una frecuencia de 7,6% de estas enfermedades. El objetivo del presente trabajo fue el de estimar la frecuencia de hemoglobinopatías en niños de ambos sexos de uno a diez años de edad que consultan por cualquier motivo a los Hospitales: Pediátrico y General de Barranquilla. Se estudiaron 400 niños previo consentimiento informado de sus padres a los que se les realizó una historia clínica dirigida hacia la detección de las hemoglobinopatías. Además, se les practicaron los siguientes exámenes de laboratorio: falciformía y estabilidad al isopropanol, hemograma completo, cuantificación de Hb A2 y Hb Fetal, electroforesis en acetato de celulosa e isoelectroenfoque en gel de agarosa. Después de estudiar todos los resultados de las anteriores pruebas se lograron identificar un total de 22 (5,5%) niños con hemoglobinas alteradas, de los cuales 17 (4,2%)niños presentaron Hb AS, un niño (0,2%)con Hb AC, un niño (0,2%) con Hb AD, 2 niños(0,5%) portadores de alfa--talasemia y un niño(0.2%) portador de beta- talasemia. Los resultados obtenidos permiten concluir que las hemoglobinopatías representan un problema de salud pública en estas poblaciones del Caribe Colombiano. Palabras claves: Hemoglobinopatias, electroforesis en acetato de celulosa, Isoelectroefoque en gel de agarosa
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INTRODUCCION
La hemoglobina es una proteína globular, presente en las células rojas sanguíneas
de los vertebrados comprometida en el transporte de oxígeno a los tejidos. Es un
tetrámero, con peso molecular de 68.000 d. constituido por cuatro cadenas
polipeptídicas, llamadas globinas, unidas entre sí mediante enlaces no covalentes,
cada cadena de globina contiene un anillo de ferroporfirina o hemo, que es el sitio
de unión para el oxígeno (1)
Las cadenas de globina son del tipo alfa (α) o beta (β). Las cadenas globínicas α
constan de 141 aminoácidos y las β constan de 146 aminoácidos cada una. Los
genes que codifican las globinas α están localizados en bloque, en una región de 35
Kb del cromosoma 16, en el que se encuentran 3 genes, que se expresan como
globínas: zeta (Ζ) alfa1 (α1) y alfa 2 (α2). (2)
Los genes que codifican para las cadenas β también se localizan en bloque en una
región de 70 Kb del cromosoma 11, donde se encuentran 5 genes, que se expresan
como globinas: epsilon (ε), gama1 (γ1), gama (γ2), delta (δ) y beta (β). (2)
En los eritrocitos se hallan normalmente tres tipos de hemoglobinas:A, A2 y F. En los
adultos normales, al menos el 96% de la hemoglobina es hemoglobina A, que consta
15
de dos cadenas α y dos cadenas β (α2β2). La hemoglobina A2, representa entre un
2,5 a 3% y está formada por dos cadenas α y dos cadenas δ (α2δ2). La hemoglobina
fetal (Hb F), consta de dos cadena α y dos cadenas γ (α2γ2). Esta hemoglobina
predomina durante la vida fetal, pero disminuye durante el primer año de vida
postnatal. En adultos normales, menos del 1% de la hemoglobina es Hb F. Las
hemoglobinas embrionarias tienen poca importancia en el laboratorio clínico, ya que
no están presentes durante la vida postnatal.(2)
Desde que Ingram identificó la alteración estructural de la hemoglobina S, alrededor
de 600 variantes adicionales han surgido por un número de mecanismos genéticos
diferentes y en los que varios efectos clínicos han sido descritos. Las variables o
variantes de hemoglobinas que tienen repercusión clínica se les denomina
desórdenes de la hemoglobina o hemoglobinopatías en general. En aquellos
desórdenes en donde el glóbulo rojo toma forma de hoz o falciforme, se les
denomina anemia de células falciformes o drepanocíticas. (2).
Las hemoglobinopatías constituyen un grupo de enfermedades caracterizadas por
defectos en la estructura de la hemoglobina. Esto sucede porque las cadenas
polipeptídicas de la globina se sintetizan a partir de aminoácidos mediante control
genético, al igual que otras proteínas del organismo, por lo que es de esperar que
haya errores ocasionales en su formación. Por fortuna estos errores son infrecuentes
y no todos ellos producen una hemoglobina funcionalmente defectuosa. (2).
Estas enfermedades se heredan en forma autosómica recesiva y se caracterizan por
16
presentar manifestaciones clínicas solo los individuos homocigotos para el gen
mutante. Tanto los hombres como las mujeres presentan la misma probabilidad de
padecer la enfermedad. A los individuos que solo presentan un alelo mutante, se les
denomina heterocigotos o portadores y generalmente son asintomáticos. (3).
Los desordenes de la síntesis de hemoglobina se han dividido en dos grandes
grupos:
A. Síntesis de globina estructuralmente anormal (hemoglobinopatías): anemia de
células falciformes o drepanocitosis, hemoglobinas inestables.
B. Síntesis deficiente o nula de globina: Síndromes talasémicos. (4).
Atendiendo a sí estos desórdenes producen glóbulo rojo en forma de hoz o
falciformía con repercusiones clínicas se clasifican en: Síndromes falciformes o
drepanocíticos y síndromes talasémicos. (4)
Las hemoglobinopatías son enfermedades hereditarias, que prevalecen en el África,
Asia, Europa y las Américas, principalmente en el Caribe, debido a la inmigración
negra, en donde estos genes se mezclaron en diferentes extensiones, creándose en
el Caribe diferentes poblaciones híbridas.(5)
La importancia de las hemoglobinopatías en el ámbito de la salud pública ha
suscitado un acelerado desarrollo de tecnologías para su análisis en el laboratorio,
particularmente en el desarrollo de procedimientos diagnósticos rápidos y
precisos.(6)
17
Estos avances han ayudado a dilucidar patrones electroforéticos convencionales que
otrora confundían el diagnóstico clínico, así como a clasificar perfiles hereditarios
complejos y a investigar diversas poblaciones humanas desplazadas a nuevos
continentes.(7)).
Los estudios antropológicos han demostrado que los genes responsables de las
drepanocitosis provienen de los países africanos, principalmente de la costa
occidental de África. Estos países presentan un promedio del 20-25 % de personas
afectadas por Hb S y los genes talasémicos provienen principalmente de los países
Europeos, de raza caucásica, con una penetración al Caribe con la colonización
Española y mediante el mercado de esclavos de raza negra. (7)
La contribución Africana ha sido predominante desde los inicios del siglo XVI,
mediante la migración forzada de aproximadamente 20 millones de esclavos
provenientes de las diferentes regiones de África a los países caribeños y que se
fueron mezclando con los nativos en diferente grado. (8)
Los trastornos de las hemoglobinas humanas, o hemoglobinopatías, ocupan una
importante posición en la genética médica por varias razones. Son las enfermedades
genéticas más habituales en todo el mundo y generan una sustancial morbilidad. La
Organización Mundial de la Salud (1982) calculó que alrededor del 5% de la
población mundial es portadora de genes de trastornos clínicamente importantes de
la hemoglobina, y que cada año nacen alrededor de 300.000 homocigotos
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gravemente afectados. (7)
La OMS ha sugerido acciones que se deben realizar; entre ellas, la detección
temprana de heterocigotos en comunidades o grupos étnicos con prevalencia alta de
enfermedades genéticas recesivas, programa que podría ser parte del control
prenatal, con asesoramiento de pareja y diagnóstico en los recién nacidos; a través
de la detección de los casos índice, se realiza el estudio familiar y se toman acciones
encaminadas a la prevención y el manejo adecuado de los casos. El asesoramiento
genético consiste en brindar a la pareja toda la información disponible y necesaria
sobre los riesgos detectados de manera que puedan tomar decisiones reproductivas
de manera informada y autónoma. (9)
Los programas de tamizaje, orientan a la prevención de estas enfermedades, y el
diagnóstico prenatal trajo una marcada reducción en el nacimiento de niños
afectados en Grecia, Chipre e Italia. La extensión de estos programas a otras áreas
del mundo no ha sido posible en el diagnóstico prenatal recientemente se ha
obtenido del análisis directo del DNA fetal de la vellosidad coriónica, esta prueba
está asociada con un leve aumento del riesgo de perdida fetal y con un porcentaje de
error menor del 1 %. (10)
En los estudios realizados en el Caribe, las hemoglobinas S y C son las más
encontradas en poblaciones híbridas; en cambio, las poblaciones aborígenes no
muestran ningún polimorfismo en el loci de la hemoglobina, así como tampoco se
han encontrado polimorfismo para la enzima G6PDH, y genes talasémicos.(5)
19
Lo primero que llama la atención con estos estudios poblacionales es que en la
mayoría de los países caribeños no existe una distribución homogénea de las
variantes hemoglobínicas ni siquiera entre la Hb S y Hb C, posiblemente debido a
los diferentes factores étnicos que han entrado a formar parte de la población de los
distintos países y, aún dentro de ellos, en diferentes regiones. Es decir, que estos
resultados reflejan la estructura antropológica de los diferentes grupos. (5)
El hecho que los portadores de cualquier desorden de la hemoglobina no presenten
síntomas clínicos, pero que potencialmente sean capaces de tener hijos enfermos,
hace que los estudios poblacionales sean de mucha importancia, y podamos realizar
mapas epidemiológicos de estas áreas. En Cuba existe un programa Nacional de
Educación y prevención de hemoglobinopatías. En Colombia no existe un programa
nacional para la detección de portadores y enfermos de hemoglobinopatías y
tampoco hay estadísticas de morbi - mortalidad que informen cual es la prevalencia
de estas patologías en el país. (11)
Colombia como parte integrante del Caribe, tiene una población estimada en
43.000.000 habitantes, con una distribución racial aproximada de 15% blancos de
origen caucásico, 15% negros de origen Africano, 5% indígenas y el 65% son
mestizos o mulatos resultantes de la mezcla de las razas anteriormente
mencionadas. (8,12)
En los estudios realizados en diferentes grupos de población Colombiana, las
20
frecuencias en los desordenes de la hemoglobina fluctúan entre 0.6 y 21,2 %, siendo
de todos ellos el más común el rasgo AS, lo que indica que el espectro de
prevalencia es amplio y depende de factores raciales, geográficos y ambientales. Las
poblaciones estudiadas son de los departamentos del Antioquia, Boyacá, Cauca,
Cundinamarca, Chocó y San Andrés y Providencia. (13,14)
Barranquilla, es una ciudad localizada en la costa norte sobre el caribe colombiano,
con una población aproximada de 990.547 habitantes que se caracterizan por su alto
grado de mestizaje, de estos el 20% son menores de 10 años de edad. Esta
población no cuenta con un estudio acerca de las principales desordenes de la
hemoglobina. Por tal motivo, nuestro estudio tiene como finalidad analizar muestras
sanguíneas de niños entre 1 y 10 años de edad, que consulten por algún motivo a los
dos principales sitios de atención en salud en Barranquilla como son: el Hospital
Pediátrico y el hospital General que cubren las consultas del 40 % de los niños de
la población y así poder establecer un diagnóstico de la incidencia de estas
enfermedades y con esto poder sugerir programas de atención a la comunidad.(12)
21
1. MARCO TEORICO
1.1 GENETICA
La síntesis de cada una de las subunidades de la hemoglobina ( α,β ,γ, ε, ζ ) se
regula por genes distintos. Las subunidades épsilon y ζ se encuentran solo en la
hemoglobina embrionaria. Los individuos normales heredan dos genes para la
cadena β (uno de cada progenitor), cuatro genes para la cadena α y cuatro genes
para la cadena γ. Los genes para las cadenas épsilon, gamma, delta y beta ocupan
locis adyacentes en el cromosoma 11. Los genes α y ζ se localizan en el
cromosoma 16. La herencia de las hemoglobinas anormales sigue la genética
mendeliana clásica.(2)
Los polipéptidos de globina α y β son productos de genes específicos en
cromosomas separados. Así una mutación en la hemoglobina envuelve una
anormalidad estructural de una subunidad de globina en particular.(2)
Las variantes de la hemoglobina son heredadas de portadores codominantes. Un
individuo hereda un gene de la cadena beta de cada padre, si ambos padres son
heterocigotos para la hemoglobina S en la cadena beta ( portador de Hb S o AS),
hay un 50 % de probabilidad que un hijo de la pareja sea AS, un 25 % AA y un 25 %
tenga el genotipo SS. (2)
22
Si un individuo AS se une a otro AC, hay un 25 % de probabilidad que un hijo sea
doble heterocigoto (SC); en este los glóbulos rojos tendrán un 50% de Hb S y un
50% DE Hb C, pero no tiene Hb A.(2)
1.2 ONTOGENESIS DE LAS HEMOGLOBINAS EN EL HOMBRE
En las distintas etapas del desarrollo embrionario desde el embrión hasta llegar a la
edad adulta, se sintetizan en un orden fijado y rigurosamente determinado, diferentes
hemoglobinas constituidas por dos pares de cadenas polipeptídicas como se puede
apreciar en la siguiente tabla que muestra la composición de las distintas moléculas
correspondientes a los estadios embrionarios, fetal y adulto. El patrón de aparición y
desaparición de las distintas cadenas globínicas se esquematiza en la figura , en la
cual se ponen en evidencia los cambios que ocurren en la ontogenia. El primero, del
fenotipo embrionario al fenotipo fetal, ocurre en las etapas tempranas de la
diferenciación; el segundo, del fetal al del adulto, y tiene lugar en el período
perinatal.(5)
La eritropoyesis comienza en el saco vitelino durante la etapa embrionaria, se
desplaza al hígado y al bazo durante el período fetal, y finalmente a la medula ósea
en la vida adulta.(5)
Las células que se originan en el saco vitelino contienen predominantemente Hb
Gover I, Hb Gover II y Hb Pórtland en proporciones 42, 24 y 21 %. Estas
23
hemoglobinas están presentes en células nucleadas relativamente grandes, llamadas
megaloblastos, que se encuentran en circulación hasta alcanzada las seis semanas
de gestación, cuando el saco vitelino cesa su actividad eritropoyética que se
transfiere al hígado. Aparecen en la circulación células macrocíticas anucleadas más
pequeñas, la cantidad de cadenas ς disminuyen y aumentan las cadenas α, por lo
que aumenta la Hb Gover II y las cadenas γ.
Las Hb Fetal es producida en el hígado hasta las 32 semanas de gestación donde
comienza su reducción y se aumenta la síntesis de la Hb A.(5)
En los recién nacidos los niveles relativos son muy variables, y la Hb F presenta
valores entre 60 -80%, que se deben en gran medida a la presencia de células
sintetizadas en los meses anteriores al nacimiento ( la vida media de los eritrocitos
fetales es de aproximadamente 90 días). En la figura se pude observar que después
del nacimiento el porcentaje de Hb F se mantiene constante por un período de
aproximadamente 20 a 40 días, durante los cuales la hemoglobina total presenta una
caída rápida durante unos tres meses, seguidos por un período de disminución más
lenta, hasta llegar a los niveles del adulto, aproximadamente al año de vida.
Este modelo implica que el cambio de Hb F a Hb A no se debe a una disminución
paulatina, sino a un cambio brusco que produce la inactivación del gene γ y la
activación del gen β. (5)
24
En cada estadio las hemoglobinas responden a una particular situación en la cual
llevan a cabo su función y, en efecto, se ha demostrado que las propiedades
fisiológicas de las distintas hemoglobinas son diferentes. La afinidad por el oxígeno
de las hemoglobinas embrionarias y de la Hb F es mayor que la de la Hb A, de
manera que ambas son capaces de saturarse en condiciones de baja tensión de
oxígeno. Esta diferencia tiene un importante significado fisiológico, porque permite la
respiración del embrión y del feto.(5)
1.3 ALTERACIONES DE LA HEMOGLOBINA
La primera observación sobre una alteración de la hemoglobina data de principios del
siglo XX cuando en 1910, Herrick observó en los eritrocitos de un individuo negro con
anemia grave células en forma de hoz (células drepanocíticas o falciforme). Sin
embargo, fue hasta la introducción de técnicas electroforéticas, en 1949, cuando
Pauling, Itano, Singer y Wells demostraron, en los individuos portadores de
drepanocitos, una hemoglobina de movilidad electroforética diferente a lo normal y la
denominaron Hb S. En ese mismo año, Neel probó que los pacientes con anemia
grave y eritrocitos en forma de hoz eran homocigotos para un gen productor de una
anormalidad similar aunque clínicamente menos grave en ambos padres
homocigotos obligados, quedando con esto demostrado el patrón hereditario de la
anemia drepanocítica: autosómica recesiva para la enfermedad. (15)
En 1950, Harris probó que la deformidad del eritrocito se debe a la polimerización
de la Hb S en fibras alongadas. Las pruebas de la anormalidad estructural fueron
encontradas por Ingram en 1956 y 1959, quien demostró que la Hb S difería de la
25
Hb A, en la sustitución del aminoácido valina por el ácido glutámico en la posición 6
de la cadena β. Esta fué la primera demostración en el humano, de que una
mutación en un gen estructural origina un cambio en la secuencia de aminoácidos
en la proteína correspondiente y que esta proteína anormal da lugar a una patología
característica, en este caso, anemia hemolítica; por tanto, la Hb S está considerada
como el primer ejemplo de enfermedad molecular. (16 )
1. 4 PROPIEDADES DE LA HEMOGLOBINA
En 1949 Linus Pauling y sus colaboradores examinaron las propiedades físico-
químicas de la hemoglobina en individuos normales y de pacientes con rasgo
falciforme o con anemia falciforme. Su objetivo principal fue investigar las diferencias
de estas hemoglobinas mediante electroforesis. Encontraron que el pH isoélectrico
(pI) de la hemoglobina de las células falciforme es mayor que el encontrado para la
hemoglobina normal, tanto en la forma oxigenada como en la desoxigenada. (14)
Descripción del pH isoeléctrico
NORMAL ANEMIA FALCIFORME DIFERENCIA
OXIHEMOGLOBINA 6,87 7,09 0,22
DESOXIHEMOGLOBINA 6,68 6,91 0,23
Estas observaciones sugirieron que existe una diferencia en el número o la clase de
grupos ionizables en las dos hemoglobinas. Se llegó a la conclusión de que la
hemoglobina falciforme tiene por lo menos entre dos y cuatro cargas positivas netas
26
más que la hemoglobina normal. (15)
El ARNm para la cadena α esta compuesto por 625 a 650 nucleótidos de los cuales
423 son necesarios para codificar los 141 aminoácidos que componen la cadena y el
ARNm de la cadena β tiene un largo de 675 a 770 nucleótidos de los cuales 438 son
necesarios para codificar los 146 aminoácidos que componen la cadena
polipeptídica.
Por consiguiente de las 2750 bases nitrogenadas en los genes α y β pueden sufrir
una sustitución teórica y se puede calcular que aproximadamente 700 bases de estas
(25%) debidas a la degeneración del código genético no originan cambios finalmente
en la secuencia de las cadenas peptídicas. 50 bases (2%) provocan una terminación
prematura y 2000 bases originan un cambio de aminoácido. En este último grupo
solo la tercera parte de las mutaciones da lugar a un cambio de carga eléctrica, de
manera que pueden producirse por mutación puntiforme aproximadamente 600
variantes las que se pueden identificar por medio de técnicas electroforéticas. Las
otras son sustituciones eléctricamente neutras que se detectan solo cuando
conllevan a una anormalidad funcional con efectos clínicos. (16)
1.5 DETECCION DE VARIANTES DE HEMOGLOBINA
El diagnóstico de las alteraciones de la hemoglobina y en particular de las
hemoglobinopatías, se realiza por:
27
A. Examen clínico: Se busca la presencia de anemia hemolítica, palidez, ictericia,
esplenomegalia y deformaciones óseas.
B. Examen hematológico: Análisis de la biometría hemática, en particular de las cifras
de Hb, Volumen corpuscular medio y hemoglobina corpuscular media, presencia de
reticulocitos, normoblastos y de formas anormales eritrocitarias o de cuerpos de
inclusión en un frotis sanguíneo.
C. Electroforésis e isolectroenfoque de hemoglobina: Presencia de hemoglobina con
movilidad anormal
D. Cuantificación de hemoglobinas F y A2. Valores elevados son indicativos de algún
tipo de talasemia.
E. Estudios moleculares: Se realizan principalmente para analizar los genes que se
encuentran en bloques, con la técnica del southern blot y por amplificación génica
con la reacción en cadena de la polimerasa (PCR).(29)
La mayoría de las variantes de hemoglobina fueron detectadas por estudio
electroforético. Usualmente este estudio se realiza en acetato de celulosa pH 8,3 a
8,8. De las 200 variantes que no estaban asociadas a manifestaciones clínicas, el
95% tienen una sustitución de un aminoácido que envuelve un cambio de carga
identificándose en un examen de rutina al separar Hb A. (16)
28
Algunos laboratorios primero realizan una electroforesis con urea 6M seguida de otra
en agar citrato a pH (6 a 6.5) obteniendo así la identificación de una gran cantidad de
variantes. Rosa y colaboradores han mostrado lo útil que es el isoelectroenfoque en
gel de policrilamida en la separación de variantes de hemoglobina. La cromatografía
de alta presión también es utilizada para algunas variantes que se escapan de la
detección por estos métodos electroforéticos.(17)
Recientemente, técnicas inmunológicas han sido desarrolladas para la identificación
de variantes. Garver y colaboradores han preparado 40 anticuerpos monoespecíficos
para ese mismo número de variantes. Recientes avances en la cromatografía líquida
de alta presión y espectrofotometría de masas han facilitado la identificación de
estructuras anormales. (17)
1.6 EFECTO DE LAS ALTERACIONES DE LA HEMOGLOBINA
La mayoría de las variantes no están asociadas a manifestaciones clínicas. Solo el
30% de las variantes descubiertas hasta ahora las presentan. Muchas fueron
descubiertas accidentalmente o por estudios poblacionales. Un individuo de cada 800
presenta una variante que puede ser detectada por electroforesis. Las más
comúnmente encontradas de las variantes son la S, E, o C. (9)
El conocimiento de la función que tienen las distintas partes de la molécula de
hemoglobina en el mecanismo de transporte del oxígeno y el análisis del efecto que
tienen ciertas mutaciones sobre ese mecanismo, permiten demostrar que las
29
alteraciones en la función dependen en gran medida de la posición y del tipo de
mutación. Por ejemplo, aproximadamente de 151 sustituciones de un aminoácido en
la región externa de la molécula, solo 48 producen una hemoglobina funcionalmente
anormal, mientras que de 182, en los cuales la mutación ocurre en una región de
contacto con el grupo hemo o en el interior de la subunidad, 172 conlleva a la síntesis
de una hemoglobina funcionalmente anormal. (17)
Por otra parte, la importancia del tipo de mutación se puede analizar observando el
efecto de diferentes sustituciones en el mismo sitio aminoacídico. Por ejemplo, la
sustitución de la histidina 92 de la cadena beta por glutamina o prolina, (Hb Istambul
y Hb St. Etienne), produce anemia hemolítica; la sustitución del mismo aminoácido
por tirosina, ( Hb HydePark), produce cianosis y la sustitución por ácido aspártico
(Hb Algeld Garden), no tiene ningún efecto. (18)
Es evidente, entonces, que las mutaciones que afectan los residuos en la región de
contacto α1 - β1 no altera el efecto de cooperación, mientras que las mutaciones en el
área de contacto α1 - β2 tiene una elevada probabilidad de producir alteraciones en la
afinidad por el oxígeno. Igualmente alteraciones en las regiones cercanas donde se
une el hierro con el oxígeno, influyen sobre la afinidad por este. (18)
1.7 CLASIFICACION CLINICA DE LAS HEMOGLOBINOPATIAS
Las variantes o desordenes de la hemoglobina se han agrupado de acuerdo a su
30
importancia clínica en:
I. Síndromes falciformes:
A. Portadores de células falciformes
B. Enfermedad de células falciformes
1. SS
2. SC
3. SD
4. SO
5. S/β- Talasemia
II. Hemoglobinas inestables (aproximadamente 90 variantes)
III. Hemoglobinas con anormalidad en la afinidad por el oxígeno
A. Alta afinidad. Eritrocitosis familiar (aproximadamente 40 variantes)
B. Baja afinidad. Cianosis familiar
IV. Hemoglobinas M. Cianosis familiar (6 variantes)
V. Síndromes talasémicos
A. α- talasemia
B. β - talasemia (4)
1.7.1 SINDROMES FALCIFORMES O DREPANOCITICOS
31
Estos síndromes se caracterizan por presentar un glóbulo rojo en forma de hoz o
depranocítico, ante una tensión baja de oxígeno. Esta forma característica del
glóbulo rojo se presenta en todas las variantes hemoglobínicas que se polimerizan,
precipitando en su interior y deformándolo, como por ejemplo: Hb SS, SC, S- β
talasemias, etc.(2)
1.7.1.1 HEMOGLOBINA S
La Hemoglobina S es el resultado de una mutación puntual de una base nitrogenada
en el DNA: la base cambiada es A en vez de T. Esto trae como consecuencia que el
aminoácido de la posición 6 de la cadena β, el ácido glutámico, sea sustituido por
valina.
Los genes falciformes producen una entidad clínica, solo si son heredados en los
estados homocigotos como en la anemia falciforme (SS) y en los doble
heterocigotos (SC, SD, SO; S / β talasemia. En estos casos el número de glóbulos
rojos afectados es tan alto que en muchos casos es incompatible con la vida. (2)
Las manifestaciones clínicas de la anemia falciforme clásica han sido bien definidas
desde hace mucho tiempo y se han caracterizado por un conjunto de signos y
síntomas propios de una anemia hemolítica crónica grave, con incremento en la
susceptibilidad a infecciones, retraso en el crecimiento y desarrollo, crisis de dolor
por oclusión vascular, cuadro toráxico agudo, síndrome de secuestro esplénico, daño
tisular, trastornos en el sistema nervioso central, crisis aplásicas hemolíticas y
32
asplenia funcional. (13)
La falta de maduración en la enfermedad de células falciformes se refleja en una baja
tasa en el desarrollo del esqueleto y una menarquia tardía. La osteomelítis y
lesiones óseas fueron encontradas en un 10% de los casos de Hb SS en Jamaica
(Serjeant, 1970). Un 13% de los afectados perecen en los primeros 2 años de vida
comparado con un 1% de los que presentan hemoglobina normal, y la principal causa
es falla esplénica y respiratoria secundaria a una infección pneumocóccica. (18)
Para el diagnóstico del portador de hemoglobina S (AS) generalmente se realizan
las siguientes pruebas de laboratorio: electroforesis de hemoglobina, en donde
aparecen dos bandas; una de Hb S y una banda de Hb A; cuantificación de
hemoglobinas F, la cual es inferior al 1% y cuantificación de Hb A2, siendo inferior al
4%, siclemia y prueba de solubilidad al isopropanol, positivas. El portador de Hb S es
esencialmente asintomático, solo se ha demostrado con certeza la hipostenuria, la
hematuria (4%), la infección urinaria en la mujer embarazada y la bacteriurea
asintomática en la mujer. En 204 portadores AS estudiados en Cuba, la hemoglobina,
las constantes corpusculares, los reticulocitos, la Hb F y la Hb A2 fueron normales.(5)
1.7.1.2 CAMBIOS EN EL GLOBULO ROJO CON HEMOGLOBINA S
La polimerización de la Hb S en estado desoxigenado para formar un gel
extremadamente viscoso es el evento fisiopatológico primario en la enfermedad
conocida como hemoglobinopatía S; la gelificación distorsiona el glóbulo rojo y
33
disminuye su flexibilidad. Estas células rígidas pueden obstruir los pequeños
capilares en la circulación y ocasionar una oxigenación deficiente de los tejidos. La
hipoxia tisular causada por la vasoclusión en la microcirculación constituye la
principal causa de morbilidad y mortalidad de esta enfermedad. (17)
El proceso de polimerización de la desoxihemglobina S envuelve tres fases:
nucleación, crecimiento y alineamiento. Este proceso depende de la concentración
de desoxihemoglobina S, temperatura, pH y la presencia de Hb A o Hb F las cuales
inhiben la gelación. (17)
La estructura del polímero se ha estudiado detalladamente y se ha determinado que
la unidad está formada por un filamento compuesto por anillos de 14 moléculas de
Hb S superpuestos formando una estructura helicoidal. También se puede describir
como 7 dobles hélices de moléculas superpuestas y enrolladas entre sí. (17)
En cada molécula solamente uno de los residuos de valina en la posición 6 de la
cadena β está involucrado en el contacto intramolecular con su vecina de la doble
hélice. Además de este contacto, existen muchos otros entre las moléculas del
polímero, tanto con los tetrámeros adyacentes en el mismo anillo, como con los que
están situados a lo largo del eje vertical. Aunque el contacto de la valina β - 6 es el
más importante para la formación del polímero, los contactos entre otras partes de
las moléculas también se hacen necesarios para su estabilidad. (17)
34
Repetidos ciclos de desoxigenación - reoxigenación dan una pista sobre los cambios
que sufre el glóbulo rojo al deformarse y los daños que sufre la membrana como
son: la entrada de sodio y salida de potasio y un marcado incremento del calcio
intracelular. Estos cambios causan un aumento en la perdida de agua, resultando
una deshidratación del glóbulo rojo con un incremento de la concentración de
hemoglobina intracelular, lo cual aumenta la polimerización intracelular de Hb S.
Finalmente, las células deformadas aún después de una adecuada reoxigenación
permanecen así, por lo que es irreversible el proceso. (17)
Los cambios de deshidratación y el incremento de la concentración intracelular de
hemoglobina causan un aumento de la viscosidad en el interior de la célula capaz
de deformar y permitir la agrupación al pasar por la microvasculatura, trayendo como
consecuencia vaso-oclusión. (17)
Hay evidencia ahora, que otros cambios ocurren en la membrana del glóbulo rojo:
oxidación de fosfolípidos, traslocación de fosfolípidos, oxidación de grupos
sulfhidrilos de proteínas y formación de enlaces disulfuros intramoleculares. Un grupo
anormal de glicoforinas con incremento en la adhesión celular al endotelio y a otras
membranas biológicas, explicaría el tiempo de tránsito por los capilares, que puede
variar de un paciente a otro. (17)
1.7.1.3 PRESENCIA DE HEMOGLOBINA FETAL (F) EN LA VIDA ADULTA.
La hemoglobina F se encuentra en pequeñas cantidades, variables entre 0,3% -
35
1,2% en todos los individuos normales, y no está distribuida uniformemente en los
glóbulos rojos, sino que se encuentra localizada en una subpoblación celular que
representa el 0,5- 7,0 % de los eritrocitos circulantes. Estas células se denominan
células F, y su número se relaciona con el porcentaje de Hb F. Estudios de
seguimiento realizados en individuos normales han demostrado que el número de
células F y por lo tanto el porcentaje de Hb F se mantiene constante en el
tiempo.(25)
Sin embargo, existen varias condiciones adquiridas o congénitas en las cuales la Hb
F está elevada por la persistencia de su síntesis o por la reactivación de la expresión
de los genes en la vida adulta. Las condiciones familiares incluyen diversos tipos de
persistencia hereditaria de la hemoglobina fetal, beta-talasemia y anemia de células
falciformes. Los desordenes hematológicos adquiridos asociados con niveles altos de
Hb F incluyen leucemias, anemia megaloblástica anemia aplásica, anemia
sideroblástica y hemoglobinuria paroxística nocturna. También se han encontrado
niveles elevados en el embarazo y en tumores con metástasis en medula ósea.(25)
1.7.1.4 HEMOGLOBINA A2
La Hemoglobina A2 se encuentra presente en los individuos normales en un
porcentaje variable, de 1,8 – 3,0 %. La activación del gen tiene lugar poco antes del
nacimiento, de manera que los niveles de Hb A2 en recién nacidos son bajos,
alrededor de un 0,5%, y alcanza valores normales del adulto aproximadamente a los
seis meses de vida. A pesar de sus bajos niveles en sujetos normales, y por su
36
escasa importancia fisiológica, la Hb A2 ha sido muy estudiada. En parte, para
obtener datos sobre el mecanismo de expresión de los genes globínicos y en parte
porque niveles elevados de esta hemoglobina son patognomónicos de la β- talasemia
heterocigótica y su determinación es la base del diagnóstico de ese trastorno, por lo
que se han desarrollado muchas técnicas simples y confiables de cuantificación de
HB A2. (27 )
Aumentos de Hb A2 se han observado además en la anemia perniciosa, en presencia
de algunas hemoglobinopatías inestables, y después de un transplante de medula
ósea. Por el contrario, niveles disminuidos se encuentran en la alfa –talasemia, la
anemia aplástica y en el deficit de hierro.(27)
1.7.1.5 HEMOGLOBINA C
La hemoglobina C se produce por una mutación puntual similar a la que ocurre en la
Hb S: el ácido Glutámico de la posición 6 de la cadena β es sustituido por Lisina. Fué
la segunda variante identificada por electroforesis; es encontrada; exclusivamente en
raza negra. Cerca del 25% de los habitantes del oeste africano y entre el 2 y 3% de
individuos americanos de raza negra están afectados por la Hb C. Su presencia en
individuos de raza blanca es infrecuente, aunque puede presentar una incidencia
focal en determinadas zonas geográficas del litoral mediterráneo al igual en España
se encuentra localizada en Andalucía y Extremadura. En su forma heterocigoto (Hb
AC) es totalmente asintomático tanto clínica como hematológico. En su forma
37
homocigota( Hb CC) se caracteriza por una ligera anemia hemolítica de carácter
crónico y esplenomegalia y un ligero aumento de la Hb F. El diagnóstico se realiza
por las alteraciones del hemograma, la formación de cristales intraeritrocitarios y la
electroforesis de hemoglobina. Su movilidad electroforética, al igual que la Hb S es
más lenta que la Hb A, situándose aproximadamente en el lugar de la Hb A2. (29)
1.7.1.6 HEMOGLOBINA D
La hemoglobina D se origina por una mutación en la cadena β, el ácido glutámico
en la posición 121 es sustituido por glutamina. Esta variante co-migra en la misma
zona electroforética que la hemoglobina S, pero la siclemia y la solubilidad en alcohol
son negativas. Tanto los homocigotos como los heterocigotos presentan valores de
hemoglobina normales y no hay evidencia de hemólisis. (2)
1.7.2 HEMOGLOBINAS INESTABLES
Las hemoglobinas inestables son las variantes caracterizadas por una alteración
estructural que causa una disminución de la estabilidad de la molécula, por lo cual
estas hemoglobinas pueden precipitar en los hematíes formando cuerpos de
inclusión, conocidos como cuerpos de Heinz. Las causas más comunes de la
inestabilidad son los cambios estructurales de unión con el grupo hemo o en la región
de contacto entre las subunidades y las alteraciones conformacionales producidas
por la inserción de una prolina en regiones de α-hélice.La presencia de una
hemoglobina inestable se confirma por medio de pruebas de estabilidad al
38
isopropanol. Las características clínicas y hematológicas más relevantes de esos
síndromes son: anemia hemolítica de severidad variable, la excreción de dipirroles
por la orina y las frecuentes crisis hemolíticas asociadas a ingestión de drogas y a
infecciones.(31)
1.7.3 HEMOGLOBINAS CON ANORMALIDAD EN LA AFINIDAD POR EL OXIGENO
1.7.3.1 ALTA AFINIDAD POR EL OXIGENO
Las alteraciones pueden ocurrir tanto en la cadena α como en la cadena β: las
variantes de la cadena α están presentes siempre en cantidad menor que las
variantes de la cadena β y por lo tanto producen en general una menor alteración de
la afinidad por el oxígeno en los heterocigotos y una eritrocitosis más reducida. La
eritrocitosis es una característica típica de estos trastornos y se produce por un
mecanismo que induce la síntesis de eritropoyetina en condiciones de hipoxia tisular,
producto de la insuficiente liberación de oxígeno. La presencia de una variante
hemoglobínica con alta afinidad por el oxígeno se puede sospechar en todos los
casos de eritrocitosis que no tengan otros diagnósticos. Estas variantes se
transmiten de acuerdo con un patrón autosómico dominante, lo cual determina que
el estudio familiar es muy importante. En muchos casos la hemoglobina anormal en
la afinidad por el oxígeno presenta una movilidad electroforética diferente a la Hb A a
pH 8,6 y por lo tanto se puede lograr un diagnóstico, sin embargo otras variantes no
se separan de la Hb A de manera que el resultado de la electroforesis es normal.(31)
39
1.7.3.2 BAJA AFINIDAD POR EL OXIGENO
Las hemoglobinas caracterizadas por una reducción en la afinidad por el oxígeno
son raras. Todas presentan, como es de esperarse, una saturación menor de la HbA
a una determinada tensión de oxígeno en los tejidos. Debería producirse, por lo
tanto, una anemia relativa, por un mecanismo opuesto al que se origina en las
hemoglobinas con alta afinidad por el oxígeno, pues la elevada tendencia a liberar
oxígeno a los tejidos baja la producción de eritropoyetina y se reduce la cantidad de
hemoglobina sintetizada. La presencia de una hemoglobina de baja afinidad se
puede sospechar en los pacientes con cianosis sin alteraciones cardíacas o
pulmonares. Estas variantes se heredan con un patrón autonómico dominante, por lo
que el estudio familiar es importante. La presencia de este síntoma en otros
familiares es indicativo de una variante hemoglobínica. No obstante, muchas de
estas hemoglobinas anormales no producen cianosis, de esta manera que como en
los casos de variantes con alta afinidad por el oxígeno, la prueba crucial para el
diagnóstico es la determinación de la curva de afinidad, que en estos casos se
encuentra desplazada hacia la derecha.(31)
1.7.4 HEMOGLOBINA M. CIANOSIS FAMILIAR
La hemoglobina M o metahemoglobina, es el derivado de la hemoglobina en la que el
hierro del hemo se encuentra en forma férrica (Fe+++) y no en la forma ferrosa
normal (Fe++). En esta situación el hierro es incapaz de unirse reversiblemente con
el oxígeno y por lo tanto de transportar el gas. La metahemoglobina es
40
funcionalmente inútil.
Pequeñas cantidades de metahemoglobina se producen continuamente en los
glóbulos rojos de los individuos normales, pero la constante oxidación fisiológica del
hierro está balanceada por su reducción, catalizada por sistemas enzimáticos que
convierten el hierro férrico en ferroso, de manera que el porcentaje de
metahemoglobina no supera el 0,5%.(30)
Las enfermedades que se originan por aumento de la metahemoglobina se conocen
como metahemoglobinemias hereditarias y la mayoría de ellas se caracterizan por
una cianosis variable.
Las metahemoglobinemias hereditarias se pueden producir por dos causas:
1. Disminución en la reconversión de la metahemoglobina en hemoglobina
2. Alteración de una cadena globínica que impide la presencia del hierro en la forma
ferrosa.
En el primer caso se debe a una deficiencia hereditaria de la enzima responsable de
la reducción de la metahemoglobina, la NADPH-dependiente metahemoglobina
reductasa. También conocida como diaforasa, que se transmite como un gen
autosómico recesivo. En estos casos se puede identificar fácilmente porque la
metahemoglobina desaparece en presencia de sustancias reductoras como el ácido
ascórbico o azul de metileno, que se utilizan para mantener bajos los niveles de
metahemoglobina en estos pacientes.
41
En el segundo caso presentan una sustitución de un aminoácido en una posición
ubicada en la cavidad donde está situado el grupo hemo, como es el caso de la HbM
Milwaukee y la Hb Iwate. Se ha demostrado la presencia de enlaces de coordinación
entre el átomo de hierro y los aminoácidos anormales, lo que impide la unión con el
oxígeno y al mismo tiempo estabiliza la forma férrica.(5)
1.7.5 SINDROMES TALASEMICOS
El otro grupo de desordenes de la hemoglobina, conocidos como síndromes
talasémicos, constituye un grupo de trastornos hereditarios extremadamente
heterogéneos desde los puntos de vista clínico, hematológico y genético. Están
caracterizados por alteraciones cuantitativas en la síntesis de las cadenas de
globina, que producen anemias microcíticas e hipocrómicas de intensidad variable.
(19)
Las talasemias, en conjunto los trastornos monogénicos más frecuentes, en donde
la mutación reduce el nivel de síntesis de las cadenas α ,β, γ ο δ (Weatherall y col.,
1989).
En ausencia de una de las cadenas el tetrámero se forma con un solo tipo de
cadena, el exceso de la misma cadena produce corpúsculos de hemoglobina
anormales intraeritrocitarios deformando el glóbulo rojo y su membrana lo que
42
ocasiona su destrucción prematura. El daño en los glóbulos rojos de estos pacientes
causa anemia microcítica, hipocrómica. (19)
Las α talasemias son las más prevalentes y se encuentran más ampliamente
distribuidas. Existe una distribución característica de las talasemias en una franja a lo
largo del viejo mundo: Mediterráneo, Oriente Medio y partes de África, India y Asia.
El nombre deriva del término Tallaza, mar, y significa que la enfermedad se
descubrió por primera vez en personas de origen mediterráneo. (19)
1. 7 . 5. 1 α - TALASEMIAS
Este desorden está caracterizado por una reducida síntesis de las cadenas α;
normalmente cuatro genes son los responsables de la codificación para la síntesis de
las cadenas α; la severidad del síndrome clínico muestra una gran variación,
dependiendo del número de genes defectuosos. Se clasifican así: cuando se altera
un solo gene; se le conoce como portador silencioso(- α / αα, heterocigoto para
talasemia α- 2), no existen manifestaciones clínicas ni hematológicas; cuando dos
genes se encuentran implicados, se le conoce como estado portador (- / αα o -α / -α,
heterocigoto para talasemia α - 1 u homocigoto para talasemia α - 2,
respectivamente) existen manifestaciones clínicas leves idénticas a las descritas
para la β - talasemia menor, como es una discreta anemia; la alteración de tres
genes (--/ -α, heterocigoto compuesto para talasemia α - 1 y α - 2 ) causa un estado
hemolítico, que aunque está compensado, se traduce en un síndrome de anemia
43
hemolítica crónica conocido como enfermedad por Hb H; finalmente, cuando los
cuatro genes se afectan, el cuadro clínico es más grave y se manifiesta desde la vida
fetal, es incompatible con la vida y se conoce como hidropesía. (19)
En ausencia de cadenas α -globina con las cuales asociarse, las cadenas de los
conjuntos de β - globina están libres para formar una hemoglobina homotetramérica.
La hemoglobina con una composición γ4 se conoce como Hb Bart, y el tetrámero β4
se denomina Hb H. Debido a que ninguna de estas hemoglobinas pueden liberar
oxígeno a los tejidos en condiciones normales, resultan portadoras de oxígeno
completamente ineficaces. Por lo tanto, los niños con α -talasemias graves y niveles
altos de Hb Bart, presentan en sangre del cordón umbilical un 80% de Hb Bart`s
(γ4), trazas de Hb H (β4) y hasta un 20% de Hb Pórtland( ε2γ2), lo cual indica que en
presencia de grandes deleciones en las regiones de los genes alfa, los loci que
normalmente se inactivan en la vida embrionaria, permanecen activos.(2). Estos
pacientes sufren hipoxia intrauterina grave y nacen con acumulación masiva
generalizada de líquidos, una alteración denominada hidropesía fetal. En las α -
talasemias más leves desarrollan anemia, debido a la precipitación gradual de Hb H
en el eritrocito. Esto produce la formación de inclusiones en el eritrocito maduro
dañando las células, las cuales son eliminadas por el bazo, trayendo como
consecuencia la anemia.(4)
1.7.5.2 β- TALASEMIAS
44
Las β-talasemias obedecen a una disminución en la síntesis de cadenas β de
globina. La intensidad del déficit depende del grado de alteración genética y pude
variar desde una síntesis deficiente o parcial (β+ talasemia) hasta una ausencia total
de síntesis (β 0 talasemia). (19)
El exceso de cadenas α produce un tetrámero insoluble, el cual precipita, trayendo
como consecuencia mayores trastornos hematológicos, como es una mayor lisis
celular y por lo tanto una anemia más severa. Este cuadro es conocido como beta
talasemia mayor, anemia de Cooley o anemia Mediterránea, cuando el paciente es
homocigoto (βo- tal) o beta talasemia menor cuando es heterocigoto o portador
(β+tal), en la que el paciente presenta una anemia leve, no requiere tratamiento y
solo amerita consejería genética.(19)
Las β- talasemias comparten muchas características con las α - Talasemias. La
producción disminuida de la β- Globina provoca anemia microcítica, hipocrómica y el
desequilibrio en la síntesis de globina produce precipitación del exceso de cadenas
α, lo que a su vez provoca daño en la membrana eritrocítica.(2)
En contraste con la α - globina, sin embargo, la cadena β es solo importante en el
período postnatal. Por lo tanto, el inicio de la β-talasemia se hace evidente hasta
unos meses después del nacimiento, cuando la β-globina reemplaza normalmente la
γ - globina como la principal cadena no α, y solo la síntesis de la principal
hemoglobina del adulto la Hb A se reduce. (2)
45
Las cadenas α en exceso resultan insolubles y así se precipitan en precursores de
eritrocitos y se destruyen en la médula ósea. Debido a que el gen delta se halla
intacto, la producción de Hb A2 continúa y, de hecho, la elevación del nivel de Hb A2,
es propia de los heterocigotos de β-talasemia. El nivel de Hb F también se
incrementa, pero no debido a la reactivación del gen de la globina γ que se detuvo al
nacimiento, sino a causa de la supervivencia selectiva y quizá también de la
producción incrementada de la población minoritaria de eritrocitos adultos que
contienen Hb F.(2)
La patogenia molecular de la β-talasemia es más compleja y heterogénea que la de
la α - talasemia. A diferencia de la α, la deleción de genes es una causa poco
frecuente de la β-talasemia. Entre los casos reconocidos de deleción del gen β, un
padecimiento conocido como "persistencia hereditaria pancelular de Hb F" tiene
manifestaciones clínicas mínimas debido a síntesis eficiente de cadenas γ en el
cromosoma donde hay deleción de los genes β y δ. Hay varios pasos en la síntesis
de β globina que pueden alterarse y producir un genotipo talasémico, mutaciones en
uno de los segmentos interpuestos del gen de globina o cerca de él, lo que causa
errores en la elaboración del RNAm. A menudo se sintetizan cadenas β pero en
cantidad reducida (talasemia β +). Otros tienen mutaciones sin sentido en la región
de codificación, produciendo una terminación prematura de las cadenas de β -
globina: Siendo esta última la causa más frecuente de β + talasemia.(3)
46
1.8 ESTUDIOS REALIZADOS EN LOS PAISES CARIBEÑOS
En estudios realizados en poblaciones del Caribe, se observa que su constitución
hematológica refleja los rasgos genéticos heredados de los antepasados indígenas,
así como de los inmigrantes africanos, asiáticos y europeos que se establecieron. De
esta manera, las hemoglobinas anormales, presentes en la actualidad, son herencia
de otras poblaciones, como es el caso de la Hb S y C originarias de África y las
talasemias alfa y beta de África, Asia y Europa.(20)
La prevalencia de hemoglobinas anormales en el Caribe en estudios de 32 grupos
en 14 países en una muestra de 12.220 individuos, muestran que la
hemoglobinopatía más común es el rasgo heterocigoto (Hb AS) la presentaron entre:
11,6 y 13,9% de los individuos estudiados. Los homocigotos (Hb SS), que
frecuentemente producen una anemia letal (anemia de células falciforme), ha sido
reportada alrededor del 0,7%. La variante Hb AC también es frecuente entre 0.2-
4,6% de los sujetos, la cual es originaria del oeste- centro de África y documentada
en Sur América. Nos sorprendió encontrar en 12 de las poblaciones estudiadas la Hb
SC, estimando la frecuencia en Jamaica de Hb SS y de Hb SC en 3,2/1.000 y
2,0/1.000 nacidos vivos, respectivamente. (7).
La menor frecuencia encontrada en el Caribe corresponde a: Hb AD, Hb AE y Hb
AG. De estas hemoglobinopatías, incluyendo tanto la Hb AS y la Hb AC, son
relativamente más frecuentes en el Mediterráneo y Asia. La Hb D probablemente se
encontró en el Sureste Asiático y arribó más tarde al Caribe a través de migraciones
47
más que por una mutación independiente (Milner, 1963). La combinación genética Hb
AF, también llamada persistencia hereditaria de hemoglobina fetal (HPFH), fue
descubierta en Bahamas, Jamaica y Curacao.(7)
Otras hemoglobinas anormales detectadas en el Caribe: la Hb Korle - Bu y la Hb G
philadelphia, localizadas en Ghana y la costa de Marfil encontradas en Costa Rica,
Panamá, Cuba, Jamaica, Martinica y Colombia. Estos hallazgos demuestran la
región de origen de la población de raza negra. El origen de otras variantes no esta
claro (Colombo y Martínez 1981): tal es el caso de la Hb D Punjab, típicamente
asiática, la cual ha sido reiteradamente encontrada en Europa y América Tropical. (7)
La Tabla 1 muestra los resultados sobre la frecuencia relativa de la Hb S y Hb C en
muestreos realizados en diferentes países de la cuenca del Caribe, específicamente
en grupos de raza negra y / o negroide.(11)
TABLA 1. FRECUENCIA ( %) DE HB S Y HB C EN POBLACIÓN NEGRA/
NEGROIDE DE PAÍSES DEL CARIBE. (11).
48
País No. individuos AS ACBarbados - 7.5 5.0Colombia 1.184 11.2 -Costa Rica 3.830 7.1 2.3Cuba 6.996 6.1 3.0Dominica 589 16.0 -Guadalupe 10.559 8.1 2.5Guatemala 150 18.0 -Haití 807 13.2 2.6Honduras 1.671 10.0 1.2Jamaica 1.249 10.5 3.5Martinica 1.154 7.1 3.9Panamá 7.604 16.0 1.3Puerto Rico 1.921 7.1 0.4Rep. Dominicana 798 7.0 1.1St. Tomas 1.769 9.4 4.0Surinam 1.058 17.1 2.6Trinidad 547 6.8 2.9Venezuela 2.132 8.7 0.9
Los hallazgos clínicos encontrados en el Caribe son variados, en particular
alteraciones anatómicas, fisiológicas y bioquímicas. Estudios recientes han
encontrado diferencias significativas en las características anatómicas entre el
heterocigoto y el homocigoto de Hb S, al mismo tiempo disminución en el peso, un
bajo desarrollo esquelético y retardo de la menarquia se ha encontrado en niños con
Hb SS y Hb SC. Los portadores de Hb S (Hb AS), no muestran ningún daño
anatómico ni mental y su desarrollo es similar a los que presentan hemoglobina
normal. (13).
Un número de alteraciones fisiológicas se ha identificado, especialmente
cardiovasculares y renales. Las células rojas falciformes en todo caso son más
frágiles, entre un 25- 50 % de las que presentan hemoglobina normal. Esta fragilidad
49
trae como consecuencia problemas en circulación, primariamente la oclusión de
micro capilares y arteriolas por trombos, resultando crisis de dolor. (13)
La enfermedad de células falciforme aumenta la probabilidad de muerte en los
primeros años de vida. En los estudios realizados en Jamaica la probabilidad de
morir de estos niños alcanza hasta el 13% en los primeros 2 años de vida
comparado con el 1% en niños con hemoglobina normal. Aunque la mayor mortalidad
en individuos con Hb SS se presenta más frecuentemente entre los 6 y 12 años de
edad y las principales causas son la falla esplénica y las infecciones respiratorias por
pneumococo. Otras causas menos comunes de muerte en personas jóvenes
incluyen septicemia, meningitis, crisis aplástica y gastroenteritis. (20).
1.9 ESTUDIOS REALIZADOS EN COLOMBIA
La tabla 2 muestra los resultados de hallazgos de hemoglobinas anormales
encontradas en diferentes grupos de la población colombiana. (13)
Tabla 2. RESULTADOS DE ESTUDIOS REALIZADOS EN DIFERENTES
POBLACIONES DE COLOMBIA.
ESTUDIO, AÑO POBLACIÓN N PROPORCIÓN DE HEMOGLOBINOPATIAS
Restrepo, 1966-1970 Indígena (Antioquia) 776 ------ Negra (Choco) 1.422 13,5 Mixtas- pacientes (Antio) 2.817 2,2 Pacientes hospitalizados
(Med) 2.466 6,6
Engelkes, 1989 Negra (Chocó) 810 5,2
Espinel, 1991 Negra (Chocó) 1.043 3,8
Indígena (Chocó) 52 21,2
50
Fonseca, 1994 Altiplano Cundí boyacense 300 0,6
Gover, 1995 Negra (Cauca) 1.474 15
Bernal, 1995 San Andrés y Providencia 544 14,3
En general la frecuencia de hemoglobinopatías en los estudios realizados fluctúa
entre 0,6 y 21,2%, lo que indica que el espectro de la prevalecía de este tipo de
patologías es amplio y depende de los factores raciales y geográficos. (13).
El portador de S (AS) es la hemoglobinopatía reportada con mayor frecuencia en los
estudios en Colombia. Restrepo en población negra del Chocó encontró el 8,7%.
Engelkes, en seis veredas del Alto y medio Atrato reportó un promedio de 3,6%.
Espinel en población negra del Chocó encontró el 3,8% y en una población indígena
del Chocó el 21,2%; esta población indígena estudiada está separada de la población
negra por el río; en todos los estudios revisados las poblaciones indígenas
investigadas no presentan hemoglobinopatías. Gover en poblaciones del Cauca
reporta 8,2% y Bernal en las islas de San Andrés y Providencia el 6,8%. La
hemoglobina SS fue encontrada por Gover en un 0,3% y Bernal en un 0,2% en sus
respectivas poblaciones de estudio, señaladas anteriormente.(13,14)
Otras hemoglobinopatías como: Hb C en su forma homocigota (CC), Fonseca y
Gover las encontraron en un 0,06%, mientras que los heterocigotos (AC), Restrepo,
Gover y Bernal las reportaron en un 2,3%, 5,8% y 2,9% de los casos
respectivamente. Además, la Hb DD solo fué identificada en un 0,06% de los casos
51
por Gover. Un caso de persistencia hereditaria de Hb F (PHHF) es reportado por
Bernal es sus estudios.(13,14)
Acerca de las talasemias, Fonseca reporta un caso de heterocigoto para delta-
talasemia y Bernal 1,7% para alfa-talasemia y el 2% para S-β-talasemia de los
casos.(13,14)
2. OBJETIVOS
El objetivo general de este estudio es estimar la frecuencia de las hemoglobinopatías
presentes en los niños de ambos sexos entre uno y diez años de edad que consultan
a los hospitales: Pediátrico y General de Barranquílla.
OBJETIVOS ESPECIFICOS:
1. Identificar las variantes de hemoglobina mediante electroforesis e
isoelectroenfoque.
2. Correlacionar los hallazgos de hemoglobinopatías con el cuadro clínico de los
pacientes.
3. Correlacionar los resultados de las variantes de hemoglobina con la biometría
52
4. Elaborar un árbol genealógico de los pacientes afectados
5. Realizar consejería genética a la familia del afectado
53
3. MATERIALES Y METODOS.
Se realizó un estudio de tipo descriptivo en niños de uno a diez años, en la ciudad de
Barranquilla durante 1997 a 1998.
3. 1. SELECCION DE LA MUESTRA POBLACIONAL
El criterio para la selección de la muestra fue: los primeros 400 pacientes de ambos
sexos entre uno a diez años de edad que consultaran por cualquier motivo a los
servicios de emergencia y de medicina interna en los hospitales: Pediátrico y
General de Barranquílla, previo consentimiento de los padres o acompañantes para
ser incluido en el estudio.
La población de Barranquílla, según el censo de 1993 es de un total de 993.759
habitantes. De ellos, los niños con edades entre 1 y 10 años están calculados en
201.991, representando el 20% de la población total. Estos dos hospitales tienen una
cobertura de aproximadamente el 30-40% de la población total de Barranquílla,
principalmente habitantes del sur de la ciudad, con las siguientes características:
proceden de diversas regiones del litoral atlántico, alto grado de entrecruzamiento
genético y alta tasa de natalidad.(12)
54
3. 2. INDIVIDUOS A ANALIZAR.
Los pacientes que consultaron a estos centros hospitalarios, se eligieron mediante
muestreo aleatorio simple y a las muestras de sangre obtenidas se les asignó un
código para evitar el sesgo. A cada paciente se le elaboró una breve historia clínica
con ayuda de sus familiares.
3. 3 CÁLCULO DE LA MUESTRA.
Se calculó mediante la fórmula generalmente usada para determinar tamaño de
muestras, a través de la cual se obtuvo un total de 338 sujetos, sin embargo se
incluyeron 400 lo cual da una confiabilidad del 99%.
FORMULA:
Confiabilidad = 99% Error máximo aceptado = 1% α = 0,01 Z= 2,576 p= 15% q= 100 – 15 N = 338 3. 4. METODOS
3. 4. 1. EXTRACCION Y MANEJO DE LA MUESTRA
Previo consentimiento informado de los pacientes y de sus familiares se procedió a
extraer 5 c. c. de sangre por punción venosa en tubos vacutainer que contienen
EDTA como anticoagulante. Estos tubos se conservaron refrigerados en una nevera
55
portátil a 6 C aproximadamente.
En el mismo día de la toma, las muestras fueron trasladadas a un laboratorio
particular de la ciudad en donde se les realizó las pruebas biométricas. Un día
después en los laboratorios de Bioquímica de la Universidad del Norte se les
realizaron las siguientes pruebas: a) Inducción de drepanocítos, b) Estabilidad al
isopropanol, c) Cuadro hemático, d) Electroforesis en acetato de celulosa, e
isoelectroenfoque, e) Hb F y Hb A 2. Estas últimas se realizaron en el laboratorio de
genética del Instituto Nacional de Salud en Bogotá, antes de los 8 días de tomada la
muestra.
3.4.2 HEMATOCRITO E INDICES ERITROCITARIOS
El cuadro hemático se le realizó a cada una de las 400 muestras proveniente de los
niños que participaron en el estudio, por medio de un contador de células
automatizado, el cual proporcionó los siguientes índices eritrocitarios:
1. Recuento de glóbulos rojos (RGR), por mm3 de sangre.
2. Hemoglobina (Hb), gramos por 100 ml de sangre.
3. Hematocrito (HCTO), como porcentaje del volumen que ocupa los eritrocitos en un
volumen determinado de sangre.
4. Hemoglobina corpuscular media (HCM), como promedio del peso en mg/dl.
5. Volumen corpuscular medio (VCM), como volumen promedio del glóbulo rojo en fl.
6. Concentración de hemoglobina corpuscular media (CHCM), concentración media
56
de la hemoglobina en cada eritrocito en pg/dl.
7 Recuento de plaquetas (RP), cantidad de plaquetas por mm3 de sangre
8. Anchura de distribución eritrocitária (RDW), como el porcentaje de distribución
volumétrica de los eritrocitos
Los índices son calculados automáticamente por el contador tipo Coulter, a partir del
número, forma y volumen de los eritrocitos.
3.4.3. INDUCCION DE DREPANOCITOS O FALCIFORMIA
Cuando los eritrocitos se someten a una tensión de oxígeno reducido, experimentan
un cambio y adoptan una forma parecida a una hoz (falciforme), la hemoglobina es
tipo S, reflejando así el proceso de polimerización de la Hb S. Esto puede ocurrir
también en los heterocigotos SC, SD, S - β talasemias entre otras.(28 )
La técnica más utilizada en el laboratorio para su identificación es agregar un reactivo
que consuma oxígeno tal como el metabisulfito a una gota de sangre y realizar un
extendido sobre una placa de vidrio, cubrir con un portaobjeto y luego observar al
microscopio.(29 )
En un portaobjetos, se coloca una gota de sangre y una gota de metabisulfíto de
sodio, se mezclan bien. Se cubre con un cubreobjeto y se sella con vaselina, parafina
o silicona, se deja a temperatura ambiente por 30 minutos y se observa al
57
microscopio la formación de depranocítos. Se dejan a temperatura ambiente por 24
horas y se observan de nuevo. Como control se utiliza una sangre con hemoglobina
normal. (28)
Interpretación: La hemoglobina S y combinada con C, D, O, β-talasémica, ocasionan
células falciformes o drepanocíticas.
3.4.4. PRUEBA DE ESTABILIDAD AL ISOPROPANOL
La adición de alcohol isopropìlico debilita los enlaces internos de la molécula de
hemoglobina inestable o de variantes de hemoglobinas, en un tiempo aproximado de
20 minutos. A 0.5 ml de buffer de isopropanol, se le agregan 50 ul del hemolizado; se
incuban a 37 C durante 30 minutos.
En una cubeta con agua y hielo se colocan los tubos y se observa la formación de
precipitado.
Interpretación: Con la formación de precipitado la prueba es considerada como
positiva.
3.4.5. PREPARACION DEL HEMOLIZADO
58
Para poder realizar la EAC y el IEF es necesario previamente preparar un
hemolizado de la muestra de sangre obtenida de cada paciente. 2 ml de sangre
anticoagulada se centrifugan a 1500 rpm por 3 minutos, se retira el plasma y la capa
de células blancas con pipeta pasteur.
Se lavan los glóbulos rojos con solución salina isotónica, 3 veces a 2500 rpm por 3
minutos cada una. Al volumen de células rojas lavadas y empaquetadas, se adiciona
igual volumen de agua destilada y se agita en vortex por 1 minuto.
Se adicione por cada ml de células rojas empaquetadas 0.4 ml de cloroformo. Se
agita en vortex por 1 minuto. Luego se centrifuga por 15 minutos a 5000 rpm. El
hemolizado de glóbulos rojos es el sobrenadante resultante; se recupera en un nuevo
tubo y se descarta el pellet. Se adiciona al hemolizado 2 gotas de KCN al 1%. Se
almacena en congelador.
3.4.6. ELECTROFORESIS EN ACETATO DE CELULOSA
La electroforesis en acetato de celulosa es un método cualitativo y semicuantitativo
que permite la separación de moléculas cargadas eléctricamente: Se fundamenta en
la carga neta de la proteína, que depende del pH del medio en que se encuentra y en
su peso molecular, para migrar a una determinada zona del acetato de celulosa y
así separarse de proteínas que tienen otras velocidades de migración. En caso de
que la proteína posea carga neta cero no migrará del sitio donde fué aplicada.
Además se encuentran proteínas con características similares, por lo que migran a la
59
misma velocidad y no se logran separar. Se usa como tamizaje para variantes de la
hemoglobina, teniendo en cuenta que la mayoría de las hemoglobinas se cargan
negativamente a pH 8.6, de manera que migrarán desde el punto catódico hacia el
ánodo.
En Buffer TEB 8.6, se sumerge la membrana de acetato de celulosa por 20 minutos;
se retira el exceso de humedad de la membrana con papel absorbente.
El hemolizado de glóbulos rojos se diluye en agua destilada en una proporción 3:7 y
se aplica sobre la membrana en posición catódica (-).
La electroforesis se realiza a 250 Voltios, 4 mA por 60 minutos. Se retira el exceso de
humedad y se colorea la membrana con Ponseau S por 3 minutos, el exceso de
colorante se retira con ácido acético al 5% v/v, hasta aclarar la membrana.
Para retirar el resto de acetato de celulosa se sumerge en metanol absoluto por 2
minutos y en ciclohexanona al 30% en etanol por 1 minuto.
Se coloca la membrana sobre una placa de vidrio y se lleva a la estufa por 10
minutos a 100 C.(22)
Interpretación: Todas las hemoglobinas se desplazan desde el punto de aplicación
catódica hacia el ánodo. Generalmente se encuentra una banda al inicio que
corresponde a la enzima anhidrasa carbónica.( 17)
60
De acuerdo a la movilidad se pueden diferenciar 3 grupos de hemoglobina con
diferente movilidad.
1. Movilidad lenta: en las proximidades del cátodo ( Hb A2, C, E, y D).
2. Movilidad intermedia: entre la Hb A2 y Hb A ( Hb S, Lepore, D y F)
3. Movilidad mayor o más anódica que la Hb A ( Hb K, J, N, I, Bart y H)
3.4.7 CUANTIFICACION DE HEMOGLOBINA A2
La cuantificación de Hb A se realiza mediante electroforesis en acetato de celulosa,
seguida de elución y usando una relación de las absorbancias de las bandas eluídas
y leídas en el espectrofotómetro a 415 nm.
Primero, se realiza la electroforesis en acetato de celulosa, pH 8.6, con las mismas
condiciones que para la identificación de las variantes, realizando las siguientes
modificaciones: en vez de diluir la muestra, se aplicaron 5 ul de hemolizado sin diluir
en posición catódica. Se corre la electroforesis a 450 V por 90 minuto en vez de 60
minutos.
Se retira la membrana y se identifica las fracciones que luego se recortan
cuidadosamente con tijeras, colocando la fracción de Hb A2 en un tubo con 2 ml de
61
buffer TEB y la fracción de A1 junto con la fetal en otro tubo con 6 ml de buffer TEB.
Se deja que la fracción de HbA2 se eluya en el buffer por espacio de 30 minutos. De
la misma manera se deja que la fracción A y Hb F se eluya en el buffer.
Posteriormente se determina su concentración a 540 nm.
Se lee la D. O. del eluido se lee 415 nm contra blanco de agua destilada.
D. O. Hb A2 % de Hb A2 = ------------------------------------------- X 100 D. O. Hb Total X 3 + D. O. Hb A2 Los valores normales de Hb A2 oscilan entre 1.5 % - 3.7 % Interpretación: Valores aumentados o disminuidos de esta fracción son argumento
importante para la definición de talasemias. Así : en la β/+Talasemia los valores de
Hb A2 oscilan entre 3, 8 y 12 %. En la β/0 talasemia puede llegar hasta un 20 %.
Valores por encima del 20 % sugieren la presencia de Hb C, D, O, E, las cuales no
migran con la Hb A2 en acetato de celulosa a pH básico.
D. O de Hb Fetal % de Hb F = ---------------------------------------------- X 100 D. O. Hb total X 3 + D.O Hb Fetal Valores normales de Hb Fetal: menor del 1%
3.4.8 ISOELECTROENFOQUE EN GEL DE AGAROSA
62
El isolectroenfoque en capa fina (IEF) es un tipo de electroforesis modificada, que se
puede utilizar para la identificación de hemoglobinas anormales. Consiste en el
estudio de la movilidad electroforética en función del pH. El gradiente de pH es
formado en gel de agarosa por polielectrolítos sintéticos, los cuales presentan bajo
peso molecular y tienen cargas netas definidas, que al migrar con una determinada
velocidad en el gel proporcionan diversos gradientes de pH. La proteína que
presente la misma carga neta que un grupo de anfolítos, con determinado pI migrará
con la misma velocidad que ellos en el gel y podrá ser ubicada en el mismo sitio.
Tiene ventajas sobre la electroforesis convencional, en el sentido que permite una
clara resolución sobre la base del punto isoeléctrico de las cadenas protéicas con
diferencias que oscilan entre 0,01 a 0,0025 de pI. El método, además, permite
detectar pequeñas concentraciones de hemoglobinas hasta 1 %. (20)
Las hemoglobinas diluidas en K C N1% toman carga positiva y migran del ánodo al
cátodo. A lo largo de cada uno de los extremos del gel de agarosa que contiene los
anfolítos se coloca una tira de papel de filtro de 2 cm de ancho. Una de ellas está
impregnada de etanolamina 0,5 M y que servirá de cátodo. La otra, impregnada con
ácido acético 0,5M sirve de ánodo 10 ul del hemolizado al 1% en KCN, se aplican en
el ánodo.
Se Inicia el corrido del isoelectroenfoque con un voltaje de 300 voltios y con
aumentos graduales de 50 voltios cada 15 minutos hasta alcanzar 500 voltios por un
tiempo total de 90 minutos.
63
Se retira el gel de la cámara de isolentroenfoque, al igual que las tiras de papel de
filtro tanto anódica como catódica, se agrega el colorante de o- tolidina preparado
instantes antes de su uso en toda la extensión del gel. Las bandas se hacen visibles
por su color verde. Se realiza una lectura inmediatamente.(20)
3.5 REACTIVOS
3.5.1 METABISULFITO DE SODIO AL 2 %
0.2 gramos de metabisulfito de sodio en 10 ml de agua destilada
3.5.2. SOLUCION SALINA ISOTONICA
8.75 gramos de NaCl disueltos en 1000 ml de agua destilada
3.5.3 BUFFER TEB pH 8.6
10.2 gramos de Tris
0.6 gramos de EDTA
3.2 gramos de Ácido bórico
Se adicionan los anteriores compuestos a 800 ml de agua destilada, se ajusta a pH
8.6 con ácido bórico al 30 % y completa hasta un litro. Este buffer puede ser
64
reutilizado si se mantiene traslúcido, corrigiendo cada vez el pH y sí la separación
electroforética tiene buena resolución, en caso contrario se debe descartar. No
reutilizar más de 4 veces.
3.5.4 PONCEAU S
Ponceau S 0.5 gramos
Ácido tricloroacético 5 gramos
Se adiciona el colorante a 100 ml. de ácido tricloroacético al 5 % en agua destilada.
3.5.5 ACIDO ACETICO AL 5%
5 ml de ácido acético glacial en 95 ml de agua destilada.
3.5.6 CICLOHEXANONA
Ciclohexanona al 30 % en etanol.
3.5.7 BUFFER DE ISOPROPANOL
Tris- base 6,06 gramos
Tris- H Cl 7,9 gramos
Alcohol Isopropílico 100%, 70 ml
65
Se mezcla el tris con 300 ml de agua destilada, se ajusta a pH 7,4 se adicionan 70
ml de alcohol isopropílico y se completa hasta 500 ml
3.5.8 BUFFER TRIS pH 7,4
Tris 9.85 gramos
H Cl 1 N 42 ml.
Se adiciona a 400 ml de agua destilada, se ajusta a pH 7,4 y después se completa
hasta 500 ml
3.5.9 GEL DE AGAROSA AL 1%. 2mm
Agarosa IEF 0.2 gramos
Sorbitol 2.4 gramos
Agua destilada 18 ml
Anfolítos pH 3- 10 1 ml.
Se disuelve la agarosa y el sorbitol en agua destilada con agitación constante a
temperatura de 70C. Finalmente se adicionan los anfolítos y se agita.
Se sirve esta solución rápidamente y en forma uniforme en la plataforma del gel.
3.5.10. SOLUCION PARA ELECTRODOS
3.5.10.1 SOLUCIÓN ANODICA
Acido aspártico 0,04 M
66
3.5.10.2 SOLUCION CATÓDICA
Hidróxido de Sodio 1 M
3.5.11 SOLUCION FIJADORA
Ácido Tricloroacético 10 % p/v
3.5.12 SOLUCION COLORANTE: O-TOLIDINA
O- tolidina 0.5 gramos
Ácido acético 5 ml
H2O2 30%
Adicione 0.5 g de o-Tolidina a 5 ml de ácido acético, Agite vigorosamente y luego
almacene en frasco ámbar. Inmediatamente antes de usar, diluya 2 ml de esta
solución con 8 ml de agua destilada y agregue 4 gotas de H2O2 al 30 %.
3.6. METODOS ESTADÍSTICOS
La información se presenta en tablas y figuras. Se empleó el programa estadístico
SPSS V.11.0 para Windows. Para cumplir con los objetivos del presente estudio, en
primera instancia se calcularon los valores normales estadísticos de los parámetros
del cuadro hemático, ya que se incluyeron niños sanos o enfermos con cualquier
patología. Los valores obtenidos son presentados en percentiles 5, 50 y 95, teniendo
67
en cuenta que no todas las variables observadas tenían distribución normal.
Los anteriores resultados se utilizaron para hallar la frecuencia de anormalidad en los
diferentes parámetros del estudio, por cuanto no se encontró reporte de estudios que
evidenciaran los valores de referencia para la población donde se realizó el estudio.
Se hicieron transformaciones de las variables de tipo numérico a dicotómicas para
establecer la frecuencia de anormalidad de las variables. Se aplicaron pruebas
estadísticas como la U de Mann-Whitney para variables no paramétricas, pruebas z,
y chí *cuadrado, considerando significativo p<0.05. Al igual se compararon los dos
métodos diagnósticos que fueron la electroforésis en acetato de celulosa (EAC) con
el Isoelectroenfoque (IEF), siendo esta última la prueba de oro, para hallar la
sensibilidad y especificidad. Al igual, se compararon los índices eritrocitarios del
cuadro hemático, la prueba de estabilidad al isopropanol, la siclemia y los
antecedentes clínicos del paciente, aplicando las correspondientes correlaciones.
68
4. RESULTADOS
4.1 EDAD Y SEXO
Para el siguiente estudio se seleccionaron los primeros 400 niños de ambos sexos
de 1 a 10 años de edad que consultaron por cualquier motivo entre Junio del 1997 a
junio del 1998 a los servicios de Emergencia y Medicina Interna de los hospitales:
Pediátrico y General de Barranquilla. El número de niños se calculó mediante
formula de proporciones como aparece en materiales y métodos.
TABLA 3. DISTRIBUCIÓN PORCENTUAL POR SEXO Y EDAD DE 400 NIÑOS DE UNO A DIEZ AÑOS DE EDAD DE LA CIUDAD DE BARRANQUILLA QUE
CONSULTAN A LOS HOSPITALES: PEDIÁTRICO Y GENERAL Sexo N %
Femenino 191 47.8 Masculino 209 52.3
Total 400 100.0 Edad agrupada (años) N %
< 5 73 18.3 5- 10 327 81.7
Total 400 100.0
69
Como se muestra en la tabla 3 y figura 1 y 2, el porcentaje de niños que ingresaron
al estudio es muy similar al de niñas, mientras que el 81,7% de la población se
encontraba, entre 5 y 10 años de edad con un promedio de 7+/- 2 años mientras que
el resto tenía menos de 5 años.
Femenino47.8%
Masculino52.3%
n=400 (100%)
Figura 1. Distribución porcentual de niños según sexo
18.3
81.7
1-5 5- 10
Grupos de edad (años)
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
% d
e ni
ños
Figura 2. Distribución porcentual de niños por grupos de edad
4.2 DISTRIBUCION DE GRUPOS SANGUÍNEOS ABO
Clasificamos a los 400 niños que participaron en el estudio de acuerdo al tipo de
grupo sanguíneo. La distribución de frecuencia hallada se comparó con 2 grupos de
poblaciones estadounidenses, una descendiente de europeos occidentales y la otra
de afroamericanos
70
TABLA 4. GRUPOS SANGUÍNEOS DE NIÑOS DE BARRANQUILLA, Y DE DOS
POBLACIONES ESTADOUNIDENSES
Población Estadounidense
Grupos sanguíneos % niños de Barranquilla
% Descendientes de europeos Occidentales
% Descendientes de africanos
O 57.7 43.0 50.0 A 26.7 45.0 29.0 B 12.7 4.0 4.0
AB 3.0 8.0 17.0
Total 100.0 100.0
FIGURA 3. GRUPOS SANGUÍNEOS BARRANQUILLA Y AFROAMERICANOS
O A B AB
BarranquillaAfroamericanos0
10
20
30
40
50
60
BarranquillaAfroamericanos
Como se puede observar en la tabla y gráficamente en la figura 3 no hay diferencias
en la distribución de los grupos ABO en las poblaciones comparadas. Sin embargo,
se observa que la distribución en niños del estudio se aproxima al patrón de la
población afroamericana.
4.3 ELECTROFORESIS EN ACETATO DE CELULOSA (EAC) E ISOELECTROENFOQUE EN GEL DE AGAROSA.
A cada una de las 400 muestras sanguíneas de los niños participantes del estudio
71
se les realizó electroforesis en acetato de celulosa (pH= 8,6) e isoelectroenfoque
(pH= 3 - 10) para identificar la clase de hemoglobína que cada uno de ellos posee,
y determinar si existen hemoglobinopatías, para luego comparar los resultados
obtenidos en las dos pruebas.
En la Figura 4 se presenta el resultado de una de las EAC realizadas a un grupo de
diez niños. Esta electroforésis es típica de los hallazgos encontrados en todas las
pruebas y se presenta solo como un ejemplo en el que se observa en 3 de las
columnas manchas que corresponden a 3 niños con hemoglobina AS y 7 niños con
hemoglobina AA.
Figura 4. Electroforesis de hemoglobina en Acetato de celulosa.
En la Figura 5 se presenta el resultado de IEF realizado a diez niños. En el que
podemos observar lo siguiente: 3 niños con hemoglobina AS y 7 niños con
hemoglobina AA.
72
Figura 5. Isoelectroenfoque en gel de Agarosa.
A partir de un análisis de todas las muestras de EAC y IEF, se construye la siguiente
tabla (tabla 5).
73
TABLA 5. COMPARACIÓN DE DOS MÉTODOS DIAGNÓSTICOS ELECTROFORESIS VS. ISOELECTROENFOQUE UTILIZADOS PARA LA
DETECCION DE VARIANTES HEMOGLOBÍNICAS EN 400 NIÑOS DE UNO A DIEZ AÑOS DE EDAD DE LA CIUDAD DE BARRANQUILLA QUE CONSULTAN A LOS
HOSPITALES: PEDIÁTRICO Y GENERAL
Condición Fenotipos EAC IEF Portador Hb C AC 0 1 Portador Hb D + Fetal + ADF 0 1 Portador Hb S AS 22 17 Portador de Alfa talasemia BART + 0 2 Portador de Beta talasemia FETAL + 13 10 Homocigoto de Hb S SS 1 0 Sin definir BANDA ADELANTE 1 0 Homocigoto para Hb A NORMAL 363 369
TOTAL 400 400
Como se puede observar, la prueba EAC permitió identificar 37 niños(9,25%) con
hemoglobinas anormales, mientras que por IEF solo 32 niños(8%). 5 de las 22
muestras que por EAC fueron consideradas como AS, en el IEF aparentemente son
normales. Igual ocurre con 3 de las 13 muestras con Fetal +. Mediante el IEF se
logró identificar las Hb AC y ADF y Bart, que no se pudieron observar por EAC.
4.4 CUADRO HEMATICO E INDICES ERITROCITARIOS
En la tabla 6, se muestran los resultados de los valores percentilares, del cuadro
hemático realizado a los 400 niños del estudio.
TABLA 6. VALORES PERCENTILARES DE CUADRO HEMÁTICOS DE LOS 400 NIÑOS DE UNO A DIEZ AÑOS DE EDAD DE LA CIUDAD DE
BARRANQUILLA
74
Percentiles 5 50 95 Glóbulos Rojos (106 /cc) 3.8 4.4 5.1 Hemoglobina (gr/ml) 10.4 12.0 14.0 Hematocrito (%) 31.0 36.1 42.0 Volumen corpuscular medio 74.0 79.8 81.0 Hemoglobina Corpuscular media 24.3 27.3 30.1 Concentración del volumen corpuscular medio 31.3 33.1 34.8 Anchura de distribución 12.2 13.3 15.3 Plaquetas (10 3/cc) 208 327 478 MPV 6.8 8.1 9.6
Como se puede observar en la tabla 6 para los valores más importantes del cuadro
hemático que no se determinaron por pruebas específicas sino que se calcularon por
el citómetro, la hemoglobina varía entre 10,4 y 14 g/dl; el hematocrito entre 31 y 42%,
el VCM entre 74 y 91 fl.
Estas cifras no son significativamente diferentes a las encontradas en poblaciones
similares como se observa en la Tabla 7
TABLA 7. COMPARACIÓN DE VALORES INTERNACIONALES DE REFERENCIA CON LOS VALORES OBTENIDOS EN LOS 400 NIÑOS
INTERNACIONALES BARRANQUILLA 1 - 6 años 7 - 12 años 1 -10 años Hemoglobina g/ ml 10.5 - 14 11 – 16 10.4 - 14.0 Hematocrito (%) 33 - 42 34 – 40 31 – 42 Volumen corpuscular medio 70 - 74 76 – 80 74 – 91
Como se puede observar, los valores para la hemoglobina y el hematocrito no
muestran diferencias significativas entre los estándares internacionales y la población
de niños de Barranquilla, pero sí hay diferencia en el volumen corpuscular medio
75
encontrándose elevados los valores en Barranquilla.
4.5 COMPARACION DE LOS DE LOS VALORES PERCENTILARES DE LOS INDICES ERITROCITARIOS DEL GRUPO DE NIÑOS SIN VARIANTE HEMOGLOBINICA (NORMAL) Y LOS NIÑOS CON VARIANTES (ANORMALES)
En la Tabla 8, se comparan los valores percentilares obtenidos del grupo de niños
(369) que presentaron hemoglobina normal con el grupo de niños que presentó
alguna variante hemoglobínica (31) para poder establecer si hay cambios
significativos entre ellos.
TABLA 8. COMPARACIÓN DE VALORES PERCENTILARES DE ÍNDICES
ERITROCITARIOS ENTRE NIÑOS DE LA CIUDAD DE BARRANQUILLA QUE PRESENTARON EN EL IEF HEMOGLOBINA NORMAL Y LOS NIÑOS QUE
PRESENTARON HEMOGLOBINOPATÍAS
Normales Hemoglobinopatía Indices P5 P50 P95 P5 P50 P95 Hb 10.4 12.0 13.9 10.2 11.9 13.6 HCTO 31.0 36.1 42.0 30.6 36.1 40.7 VCM 74.9 82.8 90.0 72.6 82.8 91.0 HCM 24.5 27.4 30.1 23.5 27.0 29.7 CHCM 31.3 33.1 34.8 30.9 32.8 34.5 RDW 12.2 13.3 15.4 12.0 13.0 14.6
P= NS
La Tabla 8, muestra que las diferencias encontradas entre el grupo de los normales y
los que presentaban alguna hemoglobinopatía son relativamente pequeñas y no son
significativas.
En la Tabla 9, se comparan los valores de los índices eritrocitarios encontrados
por debajo de lo normal y las muestras con algún tipo de hemoglobinopatía.
76
TABLA 9. COMPARACIÓN DE LOS HALLAZGOS DE HEMOGLOBINOPATÍAS EN RELACIÓN CON ÍNDICES ERITROCITARIOS BAJOS EN NIÑOS DE UNO A DIEZ AÑOS
DE EDAD DE LA CIUDAD DE BARRANQUILLA
Pruebas sanguíneas
Isoelectroenfoque
Hb HCTO VCM HCM RDW
AC (1) 0 0 0 0 0 ADF (1) 0 0 1 0 0 AS (17) 0 1 1 1 2
BART + (2) 0 0 0 1 0 FETAL + (10) 1 1 0 0 0 Normal (369) 20 14 16 13 6
Total muestras bajas 22 16 18 15 8
Como se puede observar, de 22 niños con niveles de hemoglobina por debajo de lo
normal solo 1 presenta Hb F aumentada. De 16 niños con hematocrito por debajo
del rango normal, uno tiene una hemoglobinopatía en este caso AS y el otro tiene
fetal +. De 18 niños con VCM por debajo de lo normal 1 tiene Hb ADF y otro, Hb AS.
4.6 FALCIFORMIA Y ESTABILIDAD AL ISOPROPANOL
TABLA 10. RESULTADOS DE LAS PRUEBAS DE FACIFORMÍA Y DE
ESTABILIDAD AL ISOPROPANOL EN 400 NIÑOS DE AMBOS SEXOS DE UNO A DIEZ AÑOS DE EDAD DE LA CIUDAD DE BARRANQUILLA
FALCIFORMIA ESTABILIDAD
POSITIVOS 33 38 NEGATIVOS 367 362 TOTAL 400 400
Como se puede observar en la tabla 10, la prueba de falciformía fué positiva en 33
muestras mientras que por la prueba de estabilidad al isopropanol resultaron 38
positivos
4.7 COMPARACION DE FALCIFORMIA Y ESTABILIDAD CON HEMOGLOBINOPATIAS.
77
TABLA 11. COMPARACIÓN DE LOS RESULTADOS DE FALCIFORMÍA Y PRUEBA DE ESTABILIDAD AL ISOPROPANOL CON LAS
HEMOGLOBINOPATÍAS IDENTIFICADAS EN LOS 400 NIÑOS DE LA CIUDAD DE BARRANQUILLA.
Hemoglobina (Isoelectroenfoque) Falciformia Estabilidad
AC
ADF 1 1
AS 13 14
BART + 1 1
FETAL + 4 4
Normal 14 18
Total positivos 33 38
En la Tabla 11, se muestra que de 33 muestras falciformes positivas 19 presentaron
algún tipo de hemoglobinopatía, mientras que de 38 muestras positivas en la prueba
de estabilidad al isopropanol solo 20 la presentaron. La hemoglobinopatía AS fué la
que mayor número de pruebas positivas presentó tanto para la falciformía (13) como
para la estabilidad al isopropanol (14)
78
4.8 ANTECEDENTES CLINICOS En la Tabla 12, se resumen los principales síntomas que fueron investigados en los
niños del estudio, haciendo énfasis en los que tienen relación con la presencia de
hemoglobinopatías.
TABLA 12. DISTRIBUCIÓN PORCENTUAL DE NIÑOS CON ANTECEDENTES CLÍNICOS EN 400 NIÑOS DE UNO A DIEZ AÑOS DE EDAD DE LA CIUDAD DE
BARRANQUILLA n % Anemia 71 17.8 Dactilitis 11 2.8 Neumonía 24 6.0 Meningitis 6 1.5 Infarto 1 0.3 Hospitalización por cualquier motivo 46 11.5 Ingesta medicación antianémica 34 8.5 Antecedentes familiares de anemia 26 6.5
En la Tabla 12, se muestran los antecedentes clínicos de los pacientes al ingreso del
estudio. La mayor frecuencia encontrada fué la anemia en 71 niños (17,5%), seguido
por hospitalizaciones en 46 niños(11,5%). Los antecedentes de neumonía los
presentaron 24 niños(6%) y la dactilitis, 11 niños(2,8%). Esto se puede ver
gráficamente en la Figura 6
79
Anemia Dactilitis Neumonía Meningitis Infarto
0
5
10
15
20
% d
e pa
cien
tes
Figura 6. Distribución porcentual de niños según antecedentes clínicos
4.9. COMPARACION DE ANTECEDENTES CLINICOS CON HEMOGLO-BINOPATIAS
La Tabla 13 nos muestra la relación entre los antecedentes clínicos y los hallazgos
de hemoglobinopatías
TABLA 13. DISTRIBUCIÓN DE FRECUENCIAS DE NIÑOS CON ANTECEDENTES
CLÍNICOS VS DIAGNÓSTICO SEGÚN RESULTADOS DE HEMOGLOBINOPATÍAS EN NIÑOS DE UNO A DIEZ AÑOS DE EDAD DE LA CIUDAD DE BARRANQUILLA
Hemoglobina
(Isoelectroenfoque)
Anemia Dactilitis Neumonía Meningitis Infarto Hospitaliza-ción
Ingesta medicame
ntos
Antecedentes familiares
AC
ADF 1
AS 6 1 2 2 3 1
BART +
FETAL + 1 1 1 2 3 1
Normal 63 9 22 5 1 42 28 24
Total 71 11 24 6 1 46 34 26
Podemos observar, de 71 niños con antecedentes de anemia, 6 fueron clasificados
como AS, 1 como ADF y 1 como Fetal +; de 11 niños con antecedentes de dactilitis,
80
1 es AS y otro Fetal +; de 34 niños con antecedentes de tratamiento para la
anemia, 3 presentaron AS y 3 con Hb F+ y de 46 con antecedentes de
hospitalizaciones solo 2, presentaron AS y dos más con Hb F+
4.10. COMPARACION ENTRE EL MOTIVO DE CONSULTA CON HEMOGLO-BINOPATIAS
TABLA 14. DISTRIBUCIÓN DE FRECUENCIAS DE NIÑOS POR MOTIVO DE CONSULTA VS DIAGNÓSTICO SEGÚN RESULTADOS DE HEMOGLOBINOPATÍAS EN NIÑOS DE UNO A DIEZ AÑOS DE EDAD DE LA CIUDAD DE BARRANQUILLA
Hemoglobina (Isoelectroenfoque)
IRA EDA Anemia Trauma Otros Total
AC 1 1
ADF 1 1
AS 7 5 2 1 2 17
BART + 1 1 2
FETAL + 1 3 1 2 3 10
Normal 147 131 27 47 17 369
Total 155 140 30 51 24 400
Como podemos observar, de 155 niños que consultaron por IRA, 7 fueron
clasificados como AS y 1 como Fetal +; de 131 niños que consultaron por EDA
fueron clasificados como AS, 1 como Bart´s + y 3 como Fetal +; de 27 niños que
consultaron por anemia, 2 presentaron AS y 1 con Hb F+ ; de 47 niños que
consultaron por traumas, 1 presento AS y 2 fetal +; y de 24 niños que consultaron
por otras patologías , 1 fue clasificado como ADF, 2 como As, otro como Bart´s + y 3
como fetal+.
81
4.10 ESTUDIO FAMILIAR:
Se realizó estudio familiar a las 31 muestras que salieron positivas en el IEF, para
poder detectar cuantos integrantes de la familia presentaban la variante u otra. A
continuación se presenta 3 familias de las estudiadas con algunas características de
importancia en el estudio de hemoglobinopatías.
Figura 7. Esquema familiar 1
1
1 2
2
I
II
AF
AF
El caso corresponde a un niño de 5 años de edad quien presenta Hb Fetal
aumentada, asintomático. En el estudio familiar, encontramos que solo la mamá
presentaba también una condición similar al niño.
82
Figura 8. Familia 2
I
II
III
1 2
A F
A F
A SF A SF
En esta familia 4 niños de ambos sexos presentaron alteraciones en la hemoglobina.
2 de ellos Hb ASF y los otros dos AF aumentada. Al realizar el estudio no se
encontró más familiares que presentaran Hb anormales.
I
II
III
AS
AD
AD
AS
AS
AS
AS
Figura 9. Familia 3
Este estudio familiar muestra múltiples casos de individuos con Hb AD y Hb AS
Presentes en sexo masculino y femenino, lo que demuestra una vez más que el tipo
de herencia de estas enfermedades es autosómico recesivo.
83
5. DISCUSIÓN
Las hemoglobinopatías constituyen un problema de salud pública de grandes
proporciones en el Caribe. La importancia de un diagnóstico temprano radica en
disminuir la alta morbi - mortalidad que aparece en los primeros años de vida en los
homocigotos debido a un incremento en el riesgo de padecer anemia hemolítica,
hipofunción esplénica, septicemia y meningitis, entre otros. Además, la identificación
de los heterocigotos se hace necesaria para un buen manejo médico y por su
potencialidad de dar hijos enfermos.(6)
En este estudio investigamos la presencia de hemoglobinopatías en 400 niños de
uno a diez años de edad de ambos sexos que consultaron por cualquier motivo a los
hospitales: Pediátrico y General de Barranquílla. Para la identificación se utilizaron
las siguientes pruebas, teniendo en cuenta que son las más utilizadas según la
literatura para el diagnóstico de estas patologías y luego comparamos los resultados
de casos obtenidos en la EAC con los de IEF, tratando de obtener un diagnóstico lo
más certero posible.
Los niños que participaron en este estudio no son una muestra representativa de la
población infantil del Sur de Barranquilla, ya que el único criterio de selección fue el
que hubieran tenido que acudir a uno de los hospitales como consecuencia de
presentar una patología aguda cualquiera. En este caso, la mayoría de los pacientes
consultó por infecciones respiratorias agudas, enfermedad diarreica aguda o trauma.
84
En este sentido, el motivo de consulta de los niños del estudio sí es representativo de
las patologías agudas más frecuentes en esta población. Aceptando el sesgo que
tiene el modo de selección de pacientes para el estudio, es interesante señalar que
de esta manera se logró detectar un porcentaje importante, 5.5%, de
hemoglobinopatías. Nótese, también, que no existe ninguna relación entre el motivo
de consulta y la presencia de una hemoglobinopatía determinada, lo que descarta
que el alto porcentaje de estas alteraciones genéticas tenga que ver con el método
de selección de la muestra. Sin embargo, es claro que para validar estos datos,
sería interesante repetir el estudio con una muestra no sesgada de población infantil
en la misma región de Barranquilla.
El haber escogido al Sur de Barranquilla como el sitio en donde se estudiaría la
incidencia de hemoglobinopatías se debió a que en este sector predomina la
población mestiza, mulata y negra y que son, precisamente, estas dos últimas
poblaciones las que con mayor frecuencia presentan Hb S. La incidencia de esta
hemoglobinopatía fue del 4.2%, mostrando que se pueda hallar relacionada con el
alto porcentaje de población negra o mulata de este sector de la ciudad y llamando la
atención a que, por lo menos en esta parte de Barranquilla, se deba tener en cuenta
esta patología como posible riesgo de salud pública.
Aunque la EA y el IEF son generalmente aceptados como métodos efectivos para el
tamizaje de hemoglobinopatías en recién nacidos, el IEF es reportado como
potencialmente superior porque tiene incrementada la sensibilidad en detectar
pequeñas cantidades de Hb Bart´s. La EAC no es la ideal para el tamizaje de recién
85
nacidos, debido a que la resolución y separación de Hb F de Hb A no es la
adecuada. Además, varias hemoglobinas como la Hb E y Hb C no pueden ser
distinguidas de otras y en pequeñas cantidades no pueden ser detectadas.(17,20)
Otros exámenes tales como el cuadro hemático, siclemia o falciformía, prueba de
estabilidad al isopropanol, la cuantificación de Hb A2, de Hb F y una historia clínica
dirigida hacia estas patologías, nos ayudaron a enfocar el diagnóstico de las
hemoglobinopatías.(31)
A. IDENTIFICACIÓN DE VARIANTES
Se encontró del orden de 5,5% de hemoglobinopatías en los 400 niños estudiados.
Este porcentaje se encuentra por debajo del promedio encontrado por Restrepo en
varias regiones de Colombia, el cual es de 7,6%.(13)
La hemoglobina AS, se presentó con la mayor frecuencia en las hemoglobinopatías
identificadas, tanto por la EAC como por el IEF. Mediante la EAC se identificaron 22
(5,5%) casos, mientras que por el IEF solo 17 (4,2%) casos. Esta diferencia se
podría explicar si tenemos en cuenta que la EAC no tiene una buena resolución para
distinguir ente la HB F de la Hb A y por lo tanto 5 casos con Hb F+ se pudieron
considerar como normales en el IEF.
Si aceptamos como positivo solo lo determinado por IEF, los niños con Hb AS
representan el 4,2% del total de hemoglobinopatías identificadas en Barranquilla.
86
Este resultado es similar al encontrado por Bernal(6,8%) en poblaciones de San
Andrés y Providencia, por Espinel(3,6%) y Engelkes(5,9%) en poblaciones negras del
Chocó y por Restrepo(4,3&) en población de Medellín. Sin embargo es muy distante
del reporte de Saenz(11,2%), valor propuesto para Colombia. Nuestras cifras son
menores que las encontradas en Cuba(6,1%), Costa Rica(7,1%), Puerto Rico(7,1%),
Venezuela(8,7%), Haití(13,2%), Panamá(16%) y Guatemala(18%).
Es importante anotar que la prueba diagnóstica utilizada en los estudios citados es la
EAC. Como lo señalamos arriba, mediante esta misma prueba obtuvimos el 5,5% de
AS. Sin embargo aún se encuentra por debajo de la encontrada en la mayoría de los
países caribeños.(7,9,11,13,14)
Además de la Hb AS, identificamos un caso de Hb AC que representa el 0,2% de los
niños estudiado. Este valor se encuentra por debajo del reportado por Bernal(2,9%),
por Restrepo(1,4% y por Espinel(2,1%). Consideramos que las diferencias no son
significativas inclusive con algunos países caribeños como Puerto Rico(0,4% y
Venezuela(0,9%) aunque se aleja de lo encontrado en Barbados, país caribeño que
mayor frecuencia presenta(5%).(7,13,14)
Otra hemoglobina identificada fue la Hb AD(0,2%) en un caso. Este valor se presenta
con una frecuencia similar a la de los estudios realizados en Colombia y en los
países caribeños.(7,13,14)
El diagnóstico de alfa talasemia, es de importancia clínica y se sugiere por la
87
presencia de Hb Bart´s con una concentración mayor del 2%. La Hb Bart´s es un
tetrámero de cadenas gamma de globina que se produce por un desbalance en la
síntesis de cadena alfa. Los pacientes portadores de alfa talasemia presentan una
anemia leve microcítica, hipocrómica. En nuestro estudio se identificaron dos niños
con Hb Bart´s (0,5%), que presentaban las características anteriormente
mencionadas. Sin embargo, para asegurar el diagnóstico de esta hemoglobinopatía
es necesario confirmarla con técnicas en las que se utilicen enzimas de
restricción.(5,24)
De los 10 casos identificados por IEF como Hb F aumentada, las pruebas
complementarias sugieren que 9 de ellos presentaban adicionalmente aumento de
VCM y RDW, características de anemia por déficit de vitamina B12, ácido fólico y de
hierro, lo que descarta que se trate de pacientes con hemoglobinopatías. Solo un
caso con Hb F+ presentó las características propias de un portador de beta talasemia
como son: anemia microcítica e hipocrómica leve, Hb F mayor del 2% y electroforesis
normal.
Esto es importante debido a que el diagnóstico diferencial se realiza con anemia por
déficit de hierro, vitamina B12 y ácido fólico, entidades que presentan una alta
incidencia en nuestro medio.(32)
La siclemia o falciformía y la estabilidad al isopropanol son pruebas recomendadas
en la investigación de hemoglobinopatías, principalmente para las que presentan Hb
S tanto en forma homocigota como heterocigota. En nuestro estudio la falciformía dio
88
positiva en 12 muestras mientras que la estabilidad dio positiva en 14 de las 17
muestras con Hb AS. Esto demuestra una vez más la alta sensibilidad de estas dos
pruebas para el estudio de esta hemoglobinopatía. Teniendo en cuenta su bajo costo
y facilidad de ejecución, se convierte en una herramienta muy útil en el tamizaje de
poblaciones con riesgo.(28)
B. RELACION ENTRE LAS VARIANTES DE HEMOGLOBINA IDENTIFICADAS Y LA BIOMETRÍA.
La frecuencia de los diferentes alelos del sistema del grupo sanguíneo ABO, que se
han estudiado en muchas poblaciones del mundo, proporcionan una prueba del flujo
génico. Es decir, si se introducen nuevos alelos en una población como
consecuencia de la migración y subsiguientes uniones intergrupales, se producirá un
cambio en la frecuencia de los alelos. El ejemplo más ampliamente citado es el
gradiente observado en la incidencia del alelo B de los grupos sanguíneos a través
del mundo. Se cree que este alelo sea originario de Asia y extendido lentamente
hacia el oeste como resultado de una mezcla de carácter invasivo. Otro ejemplo
clásico de transferencia de genes entre grupos raciales es la frecuencia del alelo O
estrictamente africano en individuos negros de África y de América. Se puede
determinar el porcentaje de este alelo presente en un grupo racial y compararlo con
otros grupos, lo que nos daría el grado de entrecruzamiento de estas
poblaciones.(24)
El hematocrito, el número de glóbulos rojos y la concentración de hemoglobina son
considerados como índices eritrocitarios primarios y varían con la edad y el sexo. Los
89
índices eritrocitarios secundarios son los que relacionan al hematocrito con el número
de glóbulos rojos, y la concentración de hemoglobina y son fundamentalmente tres:
volumen corpuscular medio(VCM), hemoglobina corpuscular media(HCM) y
concentración de hemoglobina corpuscular media(CHCM). Su determinación es útil
en la valoración y orientación diagnóstica de las anemias y puede calcularse a partir
de los índices eritrocitarios primarios.
Así el VCM permite establecer una orientación etiológica de la anemia al clasificarla
en microcítica(VCM menor de 74 fl) o macrocítica(VCM mayor de 81 fl). Las anemias
microcíticas que se acompañan también de un descenso de la HCM constituyen la
alteración más frecuente en hematología y puede obedecer a dos causas principales:
a) Deficiencia de hierro, b) talasemia menor. La anemia macrocítica obedecen
generalmente a una deficiencia de vitamina B12 o de ácido fólico.
La determinación de la concentración de hemoglobina corpuscular media(CHCM)
tiene escaso valor en el diagnóstico de anemias hipocrómicas, pero es útil para
detectar aumento del contenido hemoglobínico intraeritrocitario(mayor de 36 g/dl). La
causa más frecuente de hipercromía es la esferocitosis hereditaria que es una forma
de anemia hemolítica constitucional, muy frecuente en nuestro medio.
Los valores percentilares encontrados en el grupo de niños en nuestro estudio, solo
mostraron diferencias significativas en el grupo del VCM(74-91 fl) con respecto al
valor de referencia internacional(74-80 fl): este aumento del VCM es propio de
anemias megaloblásticas por deficiencia de vitamina B12 y ácido fólico, lo que nos
90
apoyaría a pensar que estas anemias se deben a un déficit nutricional y que pueden
estar presentes junto a una hemoglobinopatía.(30,32)
Teniendo en cuenta que el estado portador de estas hemoglobinopatías
generalmente, es asintomático podría ser el motivo por el cual los niños de nuestro
estudio, que presentaron hemoglobinopatías mostraron pocas alteraciones
biométricas. Es así como, de 16 niños con hematocrito por debajo de lo
normal(menor de 31%), uno presentó Hb AS y otro, Hb ADF. El resto no presentaron
hemoglobinopatías y son compatibles con anemias por déficit de hierro, vitamina B12
y ácido fólico. Comportamientos similares se encontraron en los restantes
parámetros eritrocitarios.(32)
C. RELACION ENTRE LAS VARIENTES DE HEMOGLOBINA IDENTIFICADAS, LOS ANTECEDENTES CLINICOS Y EL MOTIVO DE CONSULTA. Los síntomas clínicos en las hemoglobinopatías varían ostensiblemente entre el
estado homocigoto o enfermo y el heterocigoto o portador. Los pacientes con Hb AS
son asintomáticos. Las crisis dolorosas drepanocíticas son, posiblemente junto con la
osteomielitis, la manifestación más característica de la anemia falciforme y muchas
su primer síntoma. Aunque puede aparecer espontáneamente, suelen ser
desencadenadas por situaciones de hipoxia y por fármacos.
De los 63 niños que refirieron antecedentes de anemia, 6 de ellos tenían Hb AS
(tabla 13). Llama la atención que estos pacientes presentan un VCM por encima de
82 fl lo hace pensar que son pacientes que adicionalmente presentan una deficiencia
crónica de vitamina B12 y /o ácido fólico.
91
Solo uno de los 11 niños que refirieron haber padecido dactilitis presentaron Hb AS
(tabla13); esto puede deberse a que el síntoma se puede presentar de una manera
muy similar por otras causas como por ejemplo, secundaria a golpes o por picaduras
de insectos.
De los 31 niños estudiados que presentan algún tipo de hemoglobinopatía, solo 3
niños consultaron por anemia, mientras que por IRA consultaron 8 niños, por EDA 9
niños, por trauma 4 niños y por motivos varios 8 niños.
En los niños estudiados la mayor causa de consulta como muestra la tabla 14 fue la
por EDA (9). Es llamativo este resultado, si tenemos en cuenta que en las
hemoglobinopatías el principal signo que se esperaría que se presente es la anemia
en estos niños. Esto demuestra que haber hecho el estudio con los primero 400
niños que consulten a estos hospitales es una buena metodología para detectar
hemoglobinopatías.
La hemoglobina C en su forma homocigota(CC) se caracteriza por una ligera anemia
hemolítica de carácter crónico y esplenomegalia. En su forma heterocigota es
totalmente asintomática, tanto desde el punto de vista clínico como hematológico.
Las moléculas de hemoglobina que contienen las subunidades betas mutantes son
normales en la capacidad para realizar su función principal de enlazar oxígeno, si no
están polimerizadas. Sin embargo, en la sangre desoxigenada se aumenta 5 veces la
92
probabilidad de forma polímeros. Esta polimerización relativa de la
desoxihemoglobina S constituye la base física del fenómeno drepanocítico (forma de
hoz). En condiciones de baja tensión de oxígeno, las moléculas de hemoglobina
drepanocíticas se agregan y forman polímeros o fibras en forma de bastones, que
distorsionan la configuración de los eritrocitos hasta darles la apariencia de hoz.
Estos eritrocitos son menos deformables que los normales y, a diferencia de estos
últimos, no pueden abrirse paso en una sola fila a través de los capilares, por lo que
bloquean el flujo sanguíneo provocando hipoxia local, edema y dolor en varias
zonas del cuerpo, en particular en las articulaciones de las manos y los pies
(dactilitis), espalda y abdomen. Los homocigotos SS pero no los heterocigotos, tienen
crisis dolorosas recurrentes y pueden aparecer en forma súbita. El 33% de los casos
de las crisis van precedidas de una infección viral o bacteriana. En algunos pacientes
se relacionan con la exposición al frío, quizás por vaso espasmo reflejo; en otros, las
crisis se vuelven más frecuentes en las épocas de calor, quizás debido a la
deshidratación que pueden sufrir.(29-33)
D. ARBOL GENEALÓGICO
El árbol genealógico es un sistema manual de registro de la información pertinente a
una familia. Comienza generalmente por la persona de la familia que atrae la
atención del investigador. Esta persona se denomina caso índice, probando o
propósito. La posición del propósito en el árbol genealógico se indica mediante una
flecha. La importancia de realizar un árbol genealógico consiste en observar cuantas
personas de la familia se encuentran afectadas y el consejo genético que se le pueda
93
realizar a los integrantes de la familia.(24)
Un carácter o trastorno hereditario que está determinado en un cromosoma
autosómico se dice que presenta una herencia autosómica, mientras que un carácter
o trastorno determinado por un gen en uno de los cromosomas sexuales se dice que
presenta una herencia ligada al sexo.(24)
Un carácter autosómico dominante es aquel que se manifiesta en estado
heterocigoto. Suele ser posible observar la enfermedad a lo largo de muchas
generaciones en una familia. La probabilidad de que una persona afectada por una
enfermedad autosómica pueda transmitir el carácter a su progenie es de uno entre
dos(50%).
Las enfermedades autosómicas recesivas se manifiestan solo cuando el alelo
mutante se expresa en doble dosis, es decir homocigoto. Los individuos
heterocigotos para un alelo mutante no muestran características de la enfermedad y
están perfectamente sanos, es decir, son portadores. El árbol genealógico para los
caracteres recesivos difiere considerablemente de los que se encuentran en los
caracteres dominantes.
Las hemoglobinopatías son enfermedades hereditarias con un comportamiento
autosómico recesivo. Se le realizó el árbol genealógico a cada uno de los 31 niños
que presentaron algún tipo de hemoglobinopatía, con la finalidad de encontrar otras
personas afectadas en la familia. Seleccionamos algunos de los árboles teniendo en
94
cuenta si servían para mostrar una característica en especial. La Figura 5, muestra
un niño que presenta AF aumentada con un diagnóstico de portador de alfa
talasemia y su mamá presentaba la misma patología. En la figura 6, mostramos un
caso índice de Hb ASF; al realizar el estudio familiar aparecieron 3 casos más con la
misma patología, aunque aún estudiando 3 generaciones más en la familia no se
pudo detectar el origen del alelo mutante. En la figura 7, se muestra dos caso índice,
uno como AS y otro como AD, en segundo grado de consanguinidad; al realizar el
estudio familiar, se encontraron 4 casos más de AS y otro más de AD, logrando
estudiar 3 generaciones más en la familia y llegando al cabeza de familia que
presumiblemente presentaba el alelo mutante. (24,33)
E. CONSEJERIA GENETICA
La asesoría genética se introdujo por primera vez hace más de 40 años. Se define
como un proceso de comunicación y educación, el cual aborda el desarrollo y o
transmisión de desordenes hereditarios. El asesoramiento incluye: 1) El diagnóstico
médico y sus implicaciones en términos de pronóstico y posible tratamiento. 2) Cómo
se hereda el desorden y el riesgo de desarrollarlo y trasmitirlo. 3) Opciones más
adecuadas para tratar los posibles riesgos. 4) Estrecha relación médico-paciente
para tomar decisiones libres de presión o estrés.
Para nuestro estudio, realizamos 2 visitas domiciliarias; en la primera visita
comunicamos a los familiares del niño el tipo de hemoglobinopatía sospechada, se
95
recogieron muestras a todos los integrantes de la familia incluyendo al caso índice y
se elaboró el árbol genealógico. Estas muestras se procesaron de la misma manera
y se les realizaron todos los exámenes indicados anteriormente como a cualquiera de
los 400 niños del estudio.(24)
En una segunda visita, después de haber hecho un estudio minucioso de los
resultados de las pruebas, se les informó a los cabeza de familia el resultado final del
estudio, tratando siempre de no crear pánico, mediante explicaciones sencilla acerca
de la patología que se identificó. Sin embargo, se presentaron dificultades propias de
este trabajo, como son por ejemplo, reproches entre los cónyuges por la transmisión
por parte de uno de ellos del alelo mutante, o la desconfianza con las esposas por
presentar la misma patología del vecino. Todas estas dificultades logramos
superarlas mediante el diálogo con todos los integrantes de las diversas familias,
dejándoles por el escrito el resultado obtenido de cada uno de ellos, con la finalidad
de que puedan tener un seguimiento a su patología.(Figuras 7-9)
96
6. CONCLUSIONES
• Las hemoglobinopatias en los niños estudiados en el sur de Barranquílla tiene
una prevalencia del 5.5%.
• La frecuencia de hemoglobina AS se encontró en el 4.2% del total de los niños,
la alfa talasemia en un 0,5%, el portador de beta talasemia 0,2%, la Hb ADF
0,2% y la Hb AC en un 0,2%.
• No se encontró relación entre las hemoglobinopatias identificadas y el motivo de
consulta ni con los síntomas clínicos aportados como antecedentes.
• No hubo correlación entre los resultados de hemoglobinopatías identificadas y
los valores del cuadro hemático de los afectados.
• La prueba de falciformía y la de estabilidad al isopropanol son válidas y baratas
para la detección de hemoglobina S pero no sirven para otras
hemoglobinopatías.
.
97
7. RECOMENDACIONES
• Confirmar los resultados obtenidos de este estudio en una muestra poblacional
con un grupo de niños con la misma edad y elegidos al azar.
98
8. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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