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Tesis de Posgrado

La electroforesis sobre papel deLa electroforesis sobre papel defiltro y su aplicación alfiltro y su aplicación al

fraccionamiento del suerofraccionamiento del suerosanguíneosanguíneo

Castagnino, Juan Miguel

1956

Tesis presentada para obtener el grado de Doctor en CienciasQuímicas de la Universidad de Buenos Aires

Este documento forma parte de la colección de tesis doctorales y de maestría de la BibliotecaCentral Dr. Luis Federico Leloir, disponible en digital.bl.fcen.uba.ar. Su utilización debe seracompañada por la cita bibliográfica con reconocimiento de la fuente.

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Cita tipo APA:Castagnino, Juan Miguel. (1956). La electroforesis sobre papel de filtro y su aplicación alfraccionamiento del suero sanguíneo. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad deBuenos Aires. http://digital.bl.fcen.uba.ar/Download/Tesis/Tesis_0893_Castagnino.pdf

Cita tipo Chicago:Castagnino, Juan Miguel. "La electroforesis sobre papel de filtro y su aplicación alfraccionamiento del suero sanguíneo". Tesis de Doctor. Facultad de Ciencias Exactas yNaturales. Universidad de Buenos Aires. 1956.http://digital.bl.fcen.uba.ar/Download/Tesis/Tesis_0893_Castagnino.pdf

R E S U H E N D E T E S I 3

L .‘JLA ELECTROFCRESIS SCERE PnPEL DE FIEQRC Y SU “ELICHC:’"* - w— — -- 1- v -“-. ""'"| m —r1 ' --—.ï nL anCCLOnnnIEJTO gLL sLsRC QuÜULIBJO.i ____.____________________________._____' ver Juzm Kit-“.191Cestdlï-nino

——o_.—

l ­' En el presente trabaJo se hace un nrevc resumen sobre la evoluoi n‘ o n - r . ,. q ‘ .. ':históiica de esta técnica que tiene Chau Cia más “FLICuClODCSe—I

. Se infiican luego las condiciones teóriccs cn que se basa el método1

.y lo influenc1a fic -a temperatura y del lenómenode la electroosmosls en lai migraciór de los fracciones rroteic¿s.­. L; descripción y clasificoci n de los operatos se ha efectuado te­1

‘nienúo en cuenta la ¿iCposíción de las tiPuS de papel de filtro, co”“‘

¡i

omyieton—do Verios gráficos ilustrLtivos su descripción,­

L‘d 'J. le oort (D experimental, se ¿cn los instruccion o p¿ o s

le fuen e de tensión empleanáoen su totalidod, accesorios e inplenent-“.105 utilizados corrientemente en la fabricación de ap;r;tos de radio.­

É Se detalla lo construcción de la cuba destinofia a ontener los ti­ras de papel de filtro, utilizando :ecipientes de meterisl plástico, de losdestinados comercialmente a contener huevos; cornes, etc.­

Una SOMETJdescripción del aparato E.E.L. utiïiz ¿o comocontrol'4 .—._ ._

O0.-..-)­_y las instrucciones para su manejo junto con los del densitómetro, comple­fton lo relativo al uso de los upqrotos.­

F, En un breve resumensobre los posibilidades de la electroforesis,r' - icon los diversas anlicaciones biológic.s de coto nuevo método.­

(I (I >(JH l(.) Oy

J“d q Q‘.l.l O '11 S'Ï'0 ¡.l. S}L.) OF‘if¡Jd ¡.10 cl­ {-3c|­ ¡.10

I‘I9 (AI (D LJ S(0 I'Í)"3 SO O L-u C1 L) fi) C1

JS O (-l­ ”) r.. O Cf') del suero

3 El m toño se ha aplicado a la determincción de las albúminos y¿globulinos en treinta yseis coses, efectuando la separación entre placas deEviñ=io y efecturndo la valoración después de coloreado por fotocolorimetria,o bien, realizando 1a separación con el aparato de Grassm‘1ny Hanning y

'valorición densitométricoó­‘ Los ¿reficos electroforéticos de los casos patológicos, concuer­‘don ampliamente con los gráficos de la clasificación ¿e Uurhmanny Wunder­.ly.­

En el preseite trabajo se han representedo los vclores de 1aelectroforesis sobre papel, los reacciones de floculución, la.eritrosedi­

:mentación, o bondn de üeltmonn y el nefelogrgma en un ¿ráfico que los au­'tores arriba citados, han designado con el nombrede " Constelación deEReacciones ".­

.v-­

_/ ¿La/c 717M] 893

Seoaración y valoración de glucoproteína" del suero sgnruineo:E1 métodoarriba descripto, se aplica a la valoración de glucoproteí

nas, separando las fracciones en 1a misma.formaque para les proteinaspero utilizando 0,04 mlo de suero; la coloración que se emplea es la Koi*oxidando con ácido periódico y coloreendo con el reactivo de Schiff.—

La valoración densitométrica se ha efectuado en la mismaforma que pra las proteínas y los resultados se han expresado en milímetros cuadrardos y proporción relativa %, la Veloración ha sido aplicada a diez casosnormales.­

Sep;r_ción y Vuloraci n de liponroteíne3.—

La seplrución y vulorecíón de lipOproteíduï hu ¿iio reul'zud; utili­y.

zanúo_el mismométodo que para las ¿luc0proteín¿:, pero con un voltajey milïamperaje mayor, la coloración utilizada es 1;.Shuan con.SudanKe­

gro y posterior valoración densitcmetrica.­Se distinguen bien claramente-en el lipidograma, dos zones , la be­

ta lipo-proteína y la alfL-lipoproteína.—. Los porcentuales relativos obtenidos en la.separueión de ocho sue­

ros normales, han dudo valores que concuerdan con los obtenidos por c­tros autores, al finsl del trabajo se adjuntun cuarenta y dos fotogra­fiss que corresponden a.les determinaciones de pr teines Gluco y Lipo­proteíncs; los casos más interesantes corresponden a las diversas ci­

.I'I‘CS 18 , donde se observa el típico aumento de la gammaglobulina, lasnefrosis con la típica hipoalbuminemiay aumentode la alfa globulina.y los mielomas con su gran aumento de ¿anna o beta.globu1inas.

La bibliografía,correspondiente y as conclusiones, completaneltrabajo.­

z/, v/Uí’l/w//

UNIVERSIDADDE Buxyps DIRE

FACULTADDE CIENCIAS meus Y NATURALJB

--—=o-=---r

IA ELECTROEORISIS SOBRE PAPEL DE FILTRO Y SU AEDIQQQI

AL FRACCIONAMIENTO DEL SUERO SANGUINÉO

por

JUAN MIGUEL CASTAGNDJO

WLM\

TESIS

para optar al título de

DOCTOR EN QUIMICA

1956

Agradezco al Dr. Ventura. Morera por sucooperación y ayuda durante la reali­zación del presente estudim­

A1 Dre Rodolfo Palazzo por haber­me facilitado el uso de aparatos y dro­gas en el Sanatorio Anchorena y porsus consejos-e indicaciones.'­

A la Dra.' Aída D'Agostino por suamabilidad al facilitarme los suerospatológicos-rutilizados en el presentetrabajm- .

A1 técnico fotógrafo Sra AlfredoBeovide por su valiosa y desinteresa­da colaboración.­

Al Sr." Angel Acea por su cuidadoen la impresión;­

r'-——-—————"—"'W

í INDICEPARTEQEM

La electroforesis sobre papel de filtro y su aplicación alfraccionamiento del suero BangUÍDBO¡ooooooooóoooooooooooooooooHistoria oddooooooooooooooooooooooooooooooooooooocooooióooooooo.0.....OOO-0.0.0.0...QI.....I.....O.‘O...’.........I.OO.La influencia del tiempo y de la intensidad de camposobre lamigraCÍón ElectrOfbréticaóo00-000-000-ooo-good.doooooooooooooooManifestaciones ElectrOCinéticaBooococo-oooooooioooooóo¿ooo-ao.MétOÓOay aparatos utilizadoeoolo¡0000000.000ooddooóoooóooooooo

’ PARTE MERnaENTAL

Construcciónde un aparato para realizar la electroforeSis sobrepapel de filtrOoíco0006000oocooonooooooonoocooooooooóóoooooooooo 9Manejoy descripción del aparato utilizado comocontrol¿¿¡...... 11Solucionesbuffer y métodosde coloración utilizados¡as;;....... 14Sepm‘acidnde fracciones‘proteicas del suero sanguíneo 3.-....... 19

wOOOOOOOOOOOOOOOOOI0......OO0...0...0.000.000.000000243SeparaciQn de fracciones gaucoproteicas del suero s o..... 4FotograÏIBSocooooooooooooooooooooooocooooodooooooooooo:o¡coca-24 0 24q€Separación de fracciones lipoproteicas del suero sanguíneod..... 4Fotografías 0000000000000000000000000.o...OOOOOOIQDOOOOOOOOOOOOo 24ZoCuadrosde resultados obtenidos en 1a separación'dé'fracCionesproteicae y glucoproteicaaoo00000000000ooo-cooóoocioóiooooo00024r '2480

í Cuadro de resaltaüos obtenidos en 1a separación de fracOiones

255;­

111

3

3

lipoproteicaSÓÓQOOOQO¡ccoo-ooo...o.ooooooooooooooocooodsoon-nooo 24u€

' APENDICE

La electroforesis y la variación de albúminay globulina¡....... 25La electroforesis sobre papel y los trastornos globulinicos ¡..¿ 26Fraccionamientode las proteinas del suero en distintas afec­Cionesóc’oodoooooooo-oooocooiOOOOOIoooooooooooooooooocoooooooooa 33Aplicacionesde Ia electroforesis sobrepapel¡.....¡;;::........ 35COHCIUSionesdoooooooooo¡ooo-ooooooooooooooooo¡ooo-odooodoooooooo 37

‘OODIOOOOOCOOo...OIOCOOODÓOIOOOOOOOOOOOOIOIOOOOOOI.

ui“ EIEGIROFORFSIASPSOBREPÁPEL'DE Fmó Í. s APLICÁÓIOÑ

“ " AL FRACCIONAMIENTODEL sumo smcmmao. '

LA ELECTROFORESIS SOBRE PAPEL DE FILTRO Y SU APLICACION

AL FRACCIONAMIENTO DEL.SUERO SANGUINEO

_____o-____

ELECTROFORESJE

DEFINICION:

Se llama asi a la electromigración de particulas coloidales porla acción de la corriente eléctrica, reservándose el nombrede iontofore­sis, a la migración de iones a través de un campoeléctricas­

La técnica primitiva de electromigración de particulas coloidaples a través de una solución buffer,.por acción de un campoeléctrico, sellama electroforesis libre o clásica, asignandose el nombrede electrofolresis sobre papel, a la que se realiza sobre ese medio soporte.­

H I S T O R I A

En 1907, Field y Tergue separaron utilizando la corriente eléc­trica la toxina de la antitoxina.diftérica aplicándola a través de geles deagarpe En 1926 en geles, Kendall, Jette y West intentaron separar tierrasraras.- Pero recién en 1937, Tiselius con su técnica, le dió amplio impul­so, utilizando el tubo U de Nerst en el que superponia la solución tam­pón a la mezcla proteica, aplicando luego una diferencia de potencial,es­te procedimientoes el que-se llama electroforesis libre clásica o "ances­tral"¿—-Losprocedimientos se multiplicaron utilizando agar, gelatina,algodón, fibras de amianto, seda, almidón ,gel de sílice, resinas intercam­biadores de iones, perlas de vidrio etca­' En 1939, Koening, conjuntamente con VonKlobusitzky, emplearontiras de papel embebidasen solución buffer, separando un pigmento amari­llo del venenode los ofidios.­

Se antepone este método en 5 años a la.separación cromatografí­ca sobre-papel iniciada en 1944, con los trabajos de ConsdenGordony Mar­tin seguida casi simultaneamente por los trabajos de Haugaardy Kroner,(1948) Wieland (1948) Fischer (1948) y Baserte que hicieron comunicacionessobre cromatografía bidimensional utilizando la corriente galvanica¡ En1950 se publicaron los resultados de Durrum, Turba y Enenkel, GrassmannyHanningen su mayorparte referentes a la separación de proteinas del sue­roa Desde entonces, hasta la fecha, han ido apareciendo simplificacionesy mejoras que han acertado el tiempo y mejorado la exactitud de esta téc­nica, que tiene cada dia más aplicacione3¡­

T E O R I A

La migración electroforética.sobre papel de filtro carece delfenémenode la convección y del efecto desarrollado por la pared, por locual, es posible simplificar el aparato, pero oponecierta dificultad parala electromigración, por la adsorción de 1a celulosa.- De allí lo difícil

-2.

del tratamiento teórico. Kunkely Tiselius expusieron por primera vez lasfórmulas de la intensidad del campoeléctrico en la electroforesis libre¡

n _ d 1 C = distancia recorrida.t V V = voltios;

A 1 > B l = longitud del recorrido‘ ’ n _ dogdkó tetal‘

d' 1, - t i i = intensidad de 1a Co­rriente eléctrica¿-., \\\‘V;;;=;::=::;\‘\:::;::7 q = superficie de la sec­

ción transversal deld tubo en U .

k = conductibilidadeAL = movilidad

t = tiempoEstos valores son distintos en la electroforesis sobre papel y esa discre­pancia es debida al recorrido tórtuoso de las-particulas proteicas sobreel papel de filtro; El corte longitudinal nos indica el caminoque siguela particula en el papel:­

Llamaremos 1 a la distancia recorrida rectilineamente desde Ahasta B, l'el recorrido sinuoso correSpondientea esa.distancia d y d'a una fracción de-l y l'respectivamenteó­Por lo tanto: (1)

d} ll————= d4= d 1' que es el recorrido de una

d l _ I

partícula en el interior del papeléComoel recorrido de una partícula en la electroforesis libre es:

_ ‘u = mOVilidad q sección del tubo Ud = ——-“°t°i°= t - tiempo k _q.Ek _ I - conductibilidadi - intensidad especifica.­

Para la electroforesis sobre papel resulta sustituyendo q por qa (área dela sección transversal del papel):

uetdi =qak

Sustituyendo d por el valor de d’se obtiene: —­

¿(17: u.-t.'i y por lo tanto d_u.t.i ( ll )1 qa_K _ qa. k 1

Siendo qa el área de la sección transversal del papel. El cociente 1/; esun factor de corrección que se determina para distintas clases de papel.El factor puede ser determinado para varios tipos de papel por la misma

d:

ecuacióna l’= R; qa e k.­DondeR es la resistencia de la tira de papel Que se mide con

un ohmometro,qa es el área de 1a sección transversal, que se determinapesando el papel entre placas de vidrio antes y después de sumergirlo enla solución buffer, conociendoel peso especifico del buffer, se calculael volumenque dividido por 1a longitud del papel permite calcular la sec­ción.- La conductividad k se mide de la manera usuale­

-5—

La influencia del tiempo1 de la intensidadde camsobre la mmmelectroforética.­

Grassmany.Hanning midiendo la conductibilidad de la tira de pa­pel durante 12 horast, comprobaron que.-en Ia primera media horacomo conse­cuencia de la. inhibición creciente, aumentala. conductibilidad, pero lue­go permanece constante tanto a 10° C como a 25°C; - ‘

Cuandola temperatura aumenta, la movilidad disminuye y a 25°es-nulaa La intensidad de la corriente también produceuna cantidad decalor regida porr-1a. ley de Joulei­

RIZQ=—-— ­A

VIdonde A == 4 ,1817 Joulea

Un aumento de la. intensidad produce im aumento del la temperamra, que enciertos. casos produce la. evaporación paulatina del agua,.11egando a talextremo que la. tira queda caasi seca: esa evaporación aumenta 1a concentra­ción del buffer en e-l papel y por lo tanto su fuerza iónica, que influyeen el trazado de las zonas proteicas que esemuestran al revelado bien de.­finidas y;rec-tasa­

Por lo tanto para la electroforesis en papel es favorable la es­casa concentración proteica, pero la. intensidad iónica del tampóndebe-serrelativamente elevados­

Manifestaciones.electrocinéticasaSe designan con este nombre los, fenómenos de electroforesis y

electro-osmosis."Ademásde: la. fuerza electroforética cuya acción sobre lassustancias emigrantes, produce seudesplazamiento, existe la merza electro-noamótica.prtnduci'dapor la carga. eléctrica. negativa, que e-l papel de fil­tro comosistema. capilar, adapta. trente al tampón:­

Comoel papel de filtro permanece fijo, lo que saedesplaza esI tampónque adopta carga positiva frente al papel-migrando hacia el cátodo;

Para conseguir una visión más objetiva del fenómeno,hemosrepresentado lasfibras de celulosa por rectángulos, en blanco .-¡las particulas. de bufferpor rectángulos neg‘os y las moléculas proteicas, por. circulos negros concarga negativa. en el centrar­

L @"—IL _h LI e) 1«wwwwú¿axe @*’ Me

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EF-“Tr-fi r1 J] I (a J

A1adquirir el papel carga negativa y el buffer carga positiva frente a¿“4... -*" ¡.í i-‘ ""“—‘—‘,;Ï=i’ltocontinuo del tam­

a¿gi-n “161..

.4­

La.migración de las particulas proteicas cargadas negativamente en medioalcalina pH8,6 se hace, en sentido contrario es decir hacia el_ñáted927

Por lo dicho la corriente electroosmótica se hace en sentido 6:‘“ïïïpuesto a 1a migración anódica de las proteinas.­

Esto es visible, cuandose colocan las proteinas cerca del bordedel recipiente anódico de él emigran las gammaglobulinas por acción decorriente electroosmótica a pesar de su carga negativa. Más evidente esel fenómenousando una.sustancia que no.migra en el papel por acción dela corriente eléctrica, por ej: dextran, cuya posición se marcaal ini­ciar la prueba y luego se compruebasu desplazamiento por la corrienteelectroosmóticae­

Por la causa mencionadala muestra proteica se coloca cerca delcentro del papel, pero ligeramente deeplazada hacia el ánodo¿­

METOD<B Y APARATCB UTILIZADG

Se utilizan tres tipos principales de procedimientos para conse­guir la separación de las proteinas sanguineas, cada una de ellas extensi—vamenteusada. Es dificil decidirse en los valores comparativos de estostres métodos porque ningún investigador ha conseguido ser perito en lostres

Cada.uno de ellos ha sido usado sucesivamente pero comotodos ellosdemandanatención, tiempo y considerable experiencia, 1a mayoria ha tendi­do a utilizar la técnica más simple.- Sin embargolos que más se empleanson los de cámara húmeday tira de papel libre en posición horizontal osuspendida verticalmente correspondiéndole la mayorreproductibilidad aeste últimoi­

La clasificación de los métodoses la siguiente:

ler¿ METODO.­

iira de pgpel en cámara cerrada.(no permite evaporación).

a) Saporte sólido (vidrio o plástico)b) Líquido no polar clorobenceno.

- tetracloruro de carbono¿­heptano.­

2) Tira de papel en cámara semicerrada (permite evaporación)Soporte sólido sobre un lado de la tira de papel.­

3) Tira QÉ;papel libre (permite la evaporación)A) Tipo horizontal.­B) Tipo colgante o suspendido en posición verticalC) Aparatos de separación continuas­

ler. METODOs a) Soporte sólido.­La tira de papel va colocada entre dos placas de vidrio o plástico

que hacen de puente entre.dos recipientes electródicos, que llevan elec­trodos de platin0¡ Fig¡ 1.­

La tira de papel de filtro impregnadaen solución buffer, va colo­cada sobre una placa cubierta de.grasa siliconada y se cubre con otra placa

P64

P|N1AS PLACAS DE V\DI’-2tO ÏlNZ-AS

PAPEL ELECTQC Dos pA EL

RECWIENTES ELECTRODKOS _ REKL‘D‘KENTESELECTRogn‘gos

0500 Eau-mamon Z“RECIP|ENTE ELECTRODICO

F‘G Z pAPEL ’ DIENTEELEcTeooíco'

r- T- *— A i¡ ELLC Qoivo congNrE ENFQIADCRA

L, eqúoq COQQiENTE ENFBÏHDOQH

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“' n TERMOHÉTEO

LIQUIDO N0 POLAR

ELECTQOLITO

ELELÏKd‘L‘C’ REUP‘EHTE ELELTQODICO ELECTRODOu

FIGÓ'

¡.5­

prov'ista de un orificio. circular en donde se coloca 1a muestra a anali­zar; Efectuada.la separación se interrumpe la. corriente y se cortan losextremos del papel que penden de los bordes de las placas de vidrio paraevitar que-el buffer miga hacia. el centro del papel debido a su mayor.embibicióm- ‘

otros métodosaplican el material sobre e'l papel antes de cubrircon la placa superior que no lleva orificio.-- e,

Kunkel (1954) utilizó placas gruesas de vidrio de (2,5 por 25por 25..cma) y láminas de papel del mismo tamaño, 1a presi-ón se aplica conuna prensa que permite gradnar la misma, encontrándose óptima una.presiónde I a 1,4 libras por pulgada cuadrada: Es interesante observar que lareproductibilidad del métodoes excelente, en cuanto a la determinaciónde la gammaglobuIina y albúmina cuando las condiciones. de lla presión semantienen uniformemente de una determinación a otra.'- h

Para prenszarlaa hojas de papel de filtro se utilizan tambiénláminas de plástico acrilico (plexiglas) dleespesor variable de acuerdo alas necesidad-es de métodos­b) Con liguido no- 2018.136­

Cremer (1950) fué el primero en usar un liquido nomisciblie comoel clorobJenceno-para sellar los bordes de las láminas de vidrio y permi­tir la disipación de calor; en la fig: 3 puede observarse un aparato deeste tipo¿­

Las:ventajas: de estos sellados. no polares es que impiden la eva­poración y permiten intercambiar el calor producido;­

Los inconvenientes son irrflamabilidad, cambio del pH por solw­bilidad del compuestono polar en el buffer, desnaturalización de sustan­cia que se desea separar; lípidos: o lipoproteinas y contaminaciónde lastiras con las impmrezas-del liquido no polar." En general el poder de reso­lución es pobre comparadocon el de otros aparatos;­2) METOD0:

Tira de papel en cámara semicerrada:' En la figura 2 se ha representado un aparato de este tipo don.­

de el papel apqya una de sus caras. sobre el soporte , mientras la otra,permanece libre en una cámara en oonnmicación con el medio ambienta­

3)‘I‘ira de page}. libres­A) Tipohorizontals

Descripción;­El aparato es un bloque único de plexiglas de 30 x 15 +5 cm ce­

rrado en su parte superior; con una tapa del mismomaterial pero tremsparente para poder observar el interior del recipiente: Figa 42­

La base está dividida en siete compartimentos,tres a cada lado,que representan los recipientes electródicos, siendo el mas pequeño, elque: contiene el electrodo de platino y el mas.grande el que contiene losextremos de papel.' El espacio intemedio es el de. mayores dimensiones yen él quedan tendidaa horizontalmente en el aire las tiras de papel defilhOa­

La comunicaciónentre el recipiente electrónico propiamente dicho ylos restantes, se hace por medio de orificios de 2 mm,de diámetro, sobrelas paredes divisorias de las distintas secciones¿-­Manejo:

Las tiras de papel de filtro humedecidasen la solución buffer, soncolocadas en el caballete (A) que es también de plexiglas, una vez que estánbien tensas, se deposita sobre los bordes del recipiente electrolitico enforma tal, que los extremos de la tira, queden sumergidos en el buffer delrecipiente e1ectr6dico.­

La aplicación de las tiras se hace después de haber eliminado el ex­ceso de solución buffer lo que se logra depositando las tiras húmedassobreuna placa de vidrio deslizando sobre ellas un rodillo cubierto de papel defiltro grueso.­gglgggción del suero.­

Se puede hacer trazando una linea con la pipete cargada de suero através de la tira, en dos zonas marcadas con las letras A y.B, que corres­ponden a determinada polaridad de los extremos electródicos, se conecta yse deja actuar la corriente, durante 16 horas con un miliamperaje de 2mAportira.­

EME-'­Facilidad de colocación de las tiras de papel, que se depositan hú­

medas sobre el SOporte (A) pero dejando que ellas mismas absorben la soluciónbuffers­Desventajas¿­

Comotodos los aparatos con cámara.húmeday tira horizontal, presen­ta el problema del gradiente de concentración y ademásle tendencia del pa­pel a formar la catenaria, es decir a curVarse en la zona central por el pe­so de la tira y de la solución buffer que lo embebe,esto influye en la.ni­tidez del trazado electroforético¿ Ademásen la tapa horizontal se condensangotas de agua, sobre todo cuandose usan altos voltajes que calientan la ti­ra acentuando la evaporación, dichas gotas caen sobre el papel desfigurandoel trazado electroforéticoa ­B) Tipo colgante o suspendido gp posición verticale­

Descripción: El aparato es un bloque único de Perspex de 40 x 20 x 10,con una cubierta.de material plástico de 25 cmde altura, en forma de techoa dos aguas, adaptada a la base que contiene los recipientes electródicos,Fig¿ 5.- Dichos recipientes se comunicanentre.si, con puentes de algodón olana de vidrio impregnados con solución buffer. Las tiras de papel húmedas,se colocan sobre un caballete vertical, en forma tal que sus extremos librescaen en los recipientes e1ectródicosa­Colocación del suero¿—

La colocación ne' hace sobre el punto más alto del papel, es decirdonde cae.e1 papel hacia amboslados, en forma de un trazo rectilíneo a travésdel mismoQ- 'mai..­

Tiene un mayor poder de separación pues a la acción de la corriente,se sumala.acción de la gravedad, que aumenta el distanciamiento de las distin­tas fracciones proteicaS¡Además el aparato resulta muchomas menuable que elaparato con tira horizontal. La tapa permite que les gotas se deslicen sobresus paredes y caigan en la solución buffer, manteniendola concentración,

-7...

Seigación electroforética de cuatro gotas del mismosuerg sggufilggc­por el método de las placas de vidrio

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5) METODO.­

Tira degpapel libre horizontal y colgante:Con este método se consigue un mayor poder de resolución que

con los métodos anteriormente descriptos.

Conoconsecuencia del calentamiento que se produce en la tira de papelpor el pasaje de la corriente eléctrica, (efecto Joule) se evaporaunacierta cantidad de liquido de ellas , el que debe ser repuesto por unacorriente>de buffer que debido a la capilaridad sale de ambosrecipien­tes.electr6dicos y se:dirige al centro de la tira de papel (potencial ce­ro); Las distintas fracciones de la muestra colocada en una zona próximaal punto.medio,de la.tira.migran por acción de la corriente eléctricael ánodo, pero al mismotiempo.son comprimidas por la corriente de bufferque migra en sentido «antrario, obteniéndose un trazo más rectilineo quecon los otros métodos¿­

El procedimiento que utiliza Ia tira suspendida, tiene un gradomayorde reproductibilidad que el método con tira horizontal, pués en es­te el gradiente de liquido no es igual en todos los puntos del papel de­bido al estancamiento de1.tamp6n en la zona central por la. catenaria queforma el‘mismo; En cambio, en el otro método, el pasaje del buffer es.másuniforme Io que influye en la reproductibilidad¿­Aparatos de separación continua¿ Fig; 6.­

Grassmanny Hanning en 1950 idearon un aparato para separar‘elec—troforéticamente y en forma contínua diversas sustancias¿ El dispositivoconsiste en principio en una hoja cuadrada de papel de filtrO, colosadotenso en un bastidor en posición vertical donde fluye lentamente, por laparte superior el bufferá Lateralmente se aplican los electrodos de platinoconectados a una corriente eléctrica de tensión uniforme 110 volts y 20a30mA.'—

La mezcla de sustancias que quiere separarse se-vierte desde a­"rriba.en forma de chorro fino, en consecuencia, el liquido se desliza trans­versalmente con una inclinación que es la.resu1tante de dos fuerzas, unavertical dada por la caida.del buffer, y la otra horizontal determinadapor las líneas de fuerza del campoeléctric0¡ Las resultantes presentandiversas inclinaciones que dependende su carga eléctrica;­

Sustancias “9'4 JI 4, BUffeI'o

Dlre°°1ón Campoeléctrico

5 E Di _Í rección‘+ " de caida

M____ ,.__'ww del bu- H Resultante.ffer

La parte inferior del papel se corta en picos cuyos vértices caen den­-tro de un tubito recogiendose en esa forma las diversas sustancias se­paradas.­Electrcforesis en columna:

Este aparato comoel anterior se utiliza con fines preparati­vos es decir, con el objeto de separar fracciones proteicas, que seránutilizados en cromatografía sobre papel, absorción de rayos ultraviole­tas, medida de la fluOrescencia, nefelometria, et0¿­

El diapositiva consiste en una columna de celulosa de 25 cmpor 3,2 cmde diámetro de masa de papel de filtro.- Esta se pone en co­municacióncon dos recipientes electródicos, los tres vasos se llenancon tamponm/lS de veronal sódico, hasta igualdad de niveles, en la par­te inferior de la columna se encuentra la cámara de repleeción que sellena con la muestra. Se conecta una corriente continua de 220 voltios y40 mAdurante 28 horas, después se corta la columna, en tantos trozoscomofracciones, y se eluye la sustancia de cada uno de ellosd­

PARTE EXPERIMENTAL

a) Construcción de un aparato para realizar la electroforesis sobre pa­pel de filtro.­

b) Manejoy descripción del aparato utilizado comocontrol (E¿E¿L. E­vans. Electroselenium Limitada).­

c) ¿Resumende soluciones buffers para separaciones electroforéticassu utilizacións­

d) Métodosde coloración utilizados.­n)'Separación electroforética de fracciones proteicas del suero sanguíneo

en normales y en distintas afecciones.­f) Separación electroforética de fracciones glicoproteicas del suero

sanguíneo en casos normales.­g) Separación electroforética de lipoproteinas sericas en sueros normaP

les¿­

a) Construcción de un aparato para realizar la electroforesis sgbrepapel de filtro.­

En todo aparato de separación electroforética se distinguendos partes esenciales:

-1o—

l) Fuente de tensión contínua.­2) Cámara de sepaPación.­

l) Fuente=de.tensión continua.­

Está constituida por un rectifieador de corriente alternada acontínua, cuyos elementos se detallan:

l Transformador comúnde radio de 220 volts de entraday 375 voltios de salida por ramad­

1 Lámpara 80.­1 Impedancia de 1000 ohms.­2 Condensadoreselectroliticos de 16 mfd, 450 voltios.­i Resistencias de alambre de lOsOOOohms 75 watts.­1 Resistencia variable.' 5.-ooothus, 75 watts.­l Lamparilla de 6 voltios.­l Miliamperímetro de escala 0 a 10 mAs­1 Voltimetro para corriente contínua de O a 450 voltios

con escala variable.­2 Enchufe3¿2 Interruptores.­

‘ Cables.­

El circuito que emplea los.materiales mencionadoses el que figura enla página siguiente.­2) Cámarade separación.­

Se han utilizado dos variantes para realizar la separación elec­troforética¡­| a) Láminas de vidri0¡­

b) Cámara tipo Grassmann y Hanning¿­a) Láminas de vidrio.­

Se utilizan placas de vidrio de 0,5 x 8 x 30 cmque se limpianprimero con agua corriente y después con una.gasa empapadaen alcohol,a los efectos de eliminar vestigios de grasa o residuos de las-salesdel buffera­

La tira de papel de filtro, se coloca.entre las placas de vidrioy se prensan luego con pinzas tipo bull-dog.­

Cuandose.desea aumentar el número de gotas de suero para cadaprueba se utilizan placas de vidrio de 0,5 cm. x 12 cm¿x 15 cm. entrelas que se colocan hojas-de papel de filtro de 14 amóz 23 cm.b) Cámara tipo Grassmann 1 Hanniggá­

Se han construído dos cámaras del mismo tipo que difieren solamen­te en sus dimensiones, y que designaremos cámara pequeña y cámara.gran­ded­

k“Cámara pequeña:

Fué construida utilizando un recipiente de:materia1 plástico(acrilico) de 17 cmx 13 cm x 4 cm de los destinados comercialmente a

"Lx-0

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— 10 Bis u

OTOGRAFIAS DEL APARATO CONSTRUIDO POR ¿EL AUTOR APLICLLDO A LA SEPARX­

CION EN CMA/IAB“HUMEDA Y EÏ‘JTRE PLACAS DE VIDRIO.­

Separacgón en cámara húmeda.

-11,

contener huevos, carnes, etc cerrado hermeticamente con una tapa del mis­momaterial de 2 cm de alto.­

La cubeta fué dividida en sus extremos en dos compartimentos pe­gando sobre las paredes laterales dos láminas de Perspex de 13 cm. x 4 cm.a 2 y 4 cmx?borde, dividiendo.este último compartimento en dos partescon un trozo de plástico 2 cmx 4 cmy pegado a una distancia de 5 cm. delborde lateral¿—

El compartimento más pequeño fué perforado en su base introducien­dose dos electrodos de alambre de platino de 5/10 de mm;embutidos endos tubitós de Perspox pegados con cemento especial¿—

En la base se-colocaron dos pequeños toma-corrientes de-los utilinzados en radio, que llevan sus correspondientes clavijas;­

El soporte para el papel de filtro se construyó con tres placasde Vidrio de 3 mm. x 2 cm de ancho y de v longitudes 15 cm y 12 cm ( dee“ta medida se usaron dos) pegadas con bálsamo del Canadá formando una H¿

Cámara grande: ,Fué construida utilizando un recipiente de material plásti­

co como el caso anterior de 25 cm. x 18 cm. x 7.cm. y dividido en la mis­maforma que el recipiente descripto más arriba, con la diferencia de quelos compartimentos laterales fueron ubicados a 2a5 cmdel borde.­

El soporte para el papel de filtro fué construido con dos láminasde vidrio de 5 cm. de ancho 16 cm de largo y 0,5 cm. de espesor, unidastransversalmente en su punto medio por una varilla de 24 cmde largo, 2 cm¡de ancho, y 0,3 cm de espesor, pegada con bálsamo del Canada.­

Ambascámaras han dado buenos resultados para la separación deproteinas , pero.la mas pequeña la hemosutilizado para la separaciónde lipoproteínas, pues el recorrido de la muestra es de menor longitud.­Manejo 1 descripdón del aparato utilizado comoaantrol (E¿E¿L¡Evans Elec­troselenium Limitada).­

Se ha utilizado el " EEIJ" aparato para electroforesis de la ca­sa Evans Electroselenium Limited que comprendetres unidades:

a) Fuente de poders­b) Recipiente para las tiras de papel.­c) Scanner.­

‘a) Fuente de poder.­

Es una compacta.unidad constituida por un potente transformador,una célula rectificadora de selenio de onda completa y un condensador defiltro que opera.directamente con la corriente comúnde 220 voltios 50 ci­clos, suministrando una.corriente continua, de voltaje variable, compren­dido entre O a 400 voltios y valores de miliamperaje entre 0 a lO ma e

La conexión con el recipiente que contiene las tiras de papelde filtro, se realiza por intermedio de un enchufe o toma-ccrriente polari­zado que impide la intersión de la polaridad.­

-12...

Con el objeto de mantener el buffer en buenas condiciones, por

un periodo máximose recomienda cambiar de.poíaridad frecuentemente unavez por prueba.­

En 1a mismafuente de poder, está indicado con las ietras A y Bcada una de las posiciones para una determinada polaridad, estando esasmismasletras marcadas en el soporte que contiene el papel de filtro enfcrma tal, que si se coloca el suero en la zona marcadacon la.letra.n,la.11ave de la ernte de poder debe indicar la.mismaletra.­

¿ïggipggnte para las tiras de page .­

Consta de tres partes, el baño propiamente dicho, los puenteselectroliticos y la cubierta transparente, que se usa para el tratamientodu las tiras de papel de filtro, con la solución buffer o con la solucióncolorante.­

Cada extremo del baño es dividido en tres que están intercomuni­cados por pequeños orificios perforados a través de las paredes de divi­siéno­

Los electrodos están provistos de pequeños compartimentos, la co­nexión eléctrica de los extremos de la tira de papel que quedan sumergi­dos en el último compartimento, es realizada.por medio de la soluciónbuffer, a través de pequeños orificios de intercomunicación arriba men-­cionados¡—

"Scanner".­

El "Scanner" o densitómetro es un aparato que permite medir portransparencia, la intensidad de color de cada una de las manchas, que seobtienen al realizar una separación electroforética.­

Comprendeuna caja de aluminio fUndido con un panel de-perSpexopal, colocado sobre la superficie superior que lleva también un micro­amperímetro,ealibrado con una escala de densidad ópticas Una.regla trans­parente se muevelibremente sobre el panel de perspex y marca las unidadescorrespondientes sobre una escala métrica.­

La regla está.rigidamente unida al saporte que contiene el papelde filtro montadoentre dos láminas de vidrio delgado; El soporte con elpapel se muevesolidario con la regla graduada, mientras un haz de luzde 1 mmde ancho atraviesa el papel, recogiéndose la.1uz transmitida sobreuna célula fotoeléctrica cuyos impulsos eléctricos son transmitidos a unmicro amperimetro.­

La curva generada por esta célula es obtenida directamente sinamplificación un filtro " óptico puede ser colocado delante de la foto­célula utilizándose un filtro determinadopara cada colorante.­

La fuente luminosaestá constituida por una lamparilla eléctricade 6 voltios 6 watts­

-13­

FOTOGRAFIA DEL APARATO E.E.L. UTILIZADO COMO CONTROL EN EL PRESENTE TRABAJO

F —Fuente de poder.­. C - Cámarade separación electroforética.

D - Densitómetro.—

Técnica de trabajo.­

Se coloca el baño sobre un banco nivelado, se llenan los compar»timentos extremos con solución buffer hasta niveles iguales.­

Se dibuja sobre las tiras de papel de filtro de 34 cm. x 5 cm. deancho una linea transversal situada a 13 cm. del extremo. Se humedecenlas tiras con solución buffer, absorbiendo el exceso de líquido en la re­gión dondese dibuja la linea.de lápiz. Se colocan las tiras húmedasenel soporte de tal manera que la línea de lápiz se encuentre en la posi­‘ción a o B.­

La tensión de las tiras es conseguida colocando el SOporte en po­sición vertical doblando los extremos que se adhieren al soporte y desdo­blándolos cuando se conecta la fuente de tensión. El suero es colocadodibujando un trazo rectilineo sobre el papel con una pipeta de-0,0l ml.t‘atando de que no alcance los bordes extremos de la tira.­

Por última se coloca el soporte en el baño, se aplica la cubiertay se conecta con la fuente de poder situando la ficha de polaridad en laposición A o B según el lugar donde se aplica la gota de suero.­

Se hace pasar una intensidad de corriente de 0,4 cm. A por cm de uancho,con 5 cmse requieren 2mnpor tira. Se deja actuar la corriente du­rante un período de 16 horas siendo lo más conveniente durante la noche.­

Terminadodicho lapso de tiempo, se desconecta la fuente de tensiónse sacan las tiras de papel se secan a 105 grados durante 15 minutos,luego se procede-a la coloración y posterior valoración cuantitativa.­

ggggning Densitometría.—

Se coloca la tira de papel después de sumergirla en'el líquidoclarificador alfa bromonaftalenobien plana entre dos placas de vidriodel dispositivo para la lectura densitométrica, se ajusta el cero delgalvanométrO'en la zona donde se observe menor coloración y luego se ha­ce correr lentamente desde la zona de las globulinas hasta la zona mascoloreada o de la albúmina, anotándose los valores indicados en el gal­vanfmetro sobre una hoja de papel milimetrado.­c) Resumende soluciones buffers utilizadas para separaciones electrofo­

réticasgy su utilización.­Comolas proteinas son anfolitos el pH del sistema tampon tiene

gran influencia sobre su movilidad comotambién'la fuerza ionicu del bu­ffer;— i

A continuación se indican los electrolitos mas comunesempleadosen la electroforesis-sobre papel de filtro.­

Todas las fórmulas se refieren a un litro.­Para separación de proteínas del suero.­

Buffer barbiturato pH 8,6 y u = 0,05gr. 1,84 veronal.

-15­

10,34 veronal sódico.­Buffer barbiturato. pH8,6 y u = 0,075.­

gr. 2,76 veronal15,45 veronal sódico,­

Buffer veronal acetato. pH = 8,6 y u = 0.10gr. 9,78 veronal sódico. ‘.­

6.47 acetato sódico.60 cc. de ácido clorhídrico. 0.1 Nd

Buffer verona;_ggetato. pH # 8,6 y u = 0,09 ( 9 )lO gr de veronal sódico.6.5 acetato de sodio.

68,3 cc. de ácido clorhídrico 0,1 N,

Ha sido bien comprobadoque en experimentos cortos durante 6 a 0raras y con corriente moderada, los más convenientes son los bufferesde fuerza iónica igual a 0,05 y pH= 8,6 en oposición a los bufferes defuerza iónica igual a 0,1 y del mismopH¡ Esto es debido e.que la evapo­ración, es mayorcuando el tiempo es corto pues el voltaje es elevado.­Al evaporarse el líquido de la.tira de papel si la fuerza ióníca.es ele­Vada, aumenta aún más lo que influye en la reproductibilidad del método,­

' En cambio en experimentos de tiempo largo, 16 horas, donde la e­vaporación es mínima, se recomienda el uso de tampones de u = 0,1. Ennuestro caso hemosutilizado siempre el buffer ( Q ) que no solo permiteexcelentes trazados y una nítida separación de la.fracción alfa, unoglobulina / albúmina, que no puede conseguirse en forma tan completautilizando el buffer veronal veronal sódic0¡­ggjfer degboratogpgr=8.6.­

8,80 gr. de borato de sodio.4,65 gr. de ácido bórico.—

Buffer de borato pH = 9,7 .­

7,63 gr de borato de sodio.­0,62 gr. de ácido bórico.

Buffer gg fosfato pH 2,5.­

O,6 gr de fosfato monosódico monohidratado.­2,2 gr. de fosfato disódico anhidro¿­

.Para 1a separación de fibrinógeno Berkes recomienda fosfato buffer a:L9,2."

Para separación de-amino ácidos.­Buffer d_e_ftalato ' pH. 5L9.

5,10 gr de ftalato ácido de potasio¡0,86 gr de hidróxido de sodio.­

permite la separación de ácido glutámico, de ácidos monocarboxílicos,histidina y arginina y lisina.­

r___iPara separación de azúcares.Buffer de borato.4pHAQLg¿

0,2 Mde ácido bórico.' 0,2 Mde hidróxido de sodio.

Se mezclan en partes iguales.­Este buffer permite separar mezclas de azúcares porque se forman boratoscomplejos que son más fáciles de separar que las sustancias puras.­Para separación de hemoglobinas.—Se utiliza el buffer de pH= 8,6 y fuerza inonica 0,05d) Métodosde coloración utilizados.:

Los procesos son diversos según la clase de sustancia que se de­L see colorear clasificándose en:

a) Métodospara coloración de proteinas.b) Métodospara coloración de lipoproteingg.c) Metodos para coloragién degglugoproteinags

a) Métodosgparacoloreargproteingg.­AZOCARMIN(Turba 19 50)

Solución saturada de colorante (0,25 %) es conveniente tener lasolución en reposo durante una semana; en alcohol metílico al 50 % conlO % de ácido acético¿

Se colorea durante lO minutos»Se lava con alcohol metilico durante 5 minutos y otros 5 minu­

' tos en ácido acético al 10 %.—Elución.­

Se-eluye con solución 0,1 N de hidróxido de sodio y t se leeel fotocolorimetro a los 570 m u.­NEGRODE ANILINA 10 B (Amidoschwam)

Solución saturada de negro de anilina en metanol con lO %deacido acético.

Coloración lO minutos.lgïggggzLavadocon alcohol metílico con.lO %de ácido acético re­

novadovarias veces hasta decoloración de los bordes del papel.­Elución:

Metanol al 50 % con 4 % de carbonato de sodio .­También se utiliza una solución de É a 5 % de fenol con lO %

de ácido acético en agua destilada.4Unatécnica satisfactoria es la que utiliza solución 0,1 N de

hidráxido de sodio, y lectura fotocolorimétrica a 570 mu.­AZUL DE BROMO FENOL .­

Se utiliza solución saturadu.de cloruro mercúrico en metanolcon 0,1 % de azul de bromofenol.­Coloración: 5 minutos.­

-17­

LaVado: 10 minutos en agua corriente.­Inmersión en metanol a1 l %de cloruro mercúrico..Por último en etanol con l % de cloruro mercúrico, y metanol hasta deco­loración total del papel en la zona donde no se encuentran las manchasproteicas.—Elución: El mismoprocedimiento que para la coloración con amidoschwartz.

La técnica anterior ha sido propuesta por Durrum, pero este mismo-autor ha indicado otro método que parece dar una relación más directa en­tre la cantidad de proteínas y la coloración y que por otra parte es massimple de realizar¿—

Solución al 0,1 %de azul de bromofenol.con 50 gr. de sulfato dezinc y 50 cc; de ácido acético glacial por litrOa­Coloración: 16 horas.­.Lagggg:Primer lavado con ácido acético al 2 %durante 5 minutos.­

Segundolavado igual al anterior.Tercer lavado con solución al 2.% durante 10 minutos.­Cuarto lavado 2 % de acetato de sodio con 10 % de ácido acético­

2 minutos.­.Este últimü lavado tiene por objeto producir el viraje del color

de las tiras en las-zonas donde se encuentran las.manchas proteicas quecambiansu color verde amarillento a azul intenso pH3,6, este virajese consigue también exponiendo las tiras a los vapores del amoniaco.­VERDEBRILLANTE(Lichtgruen) F.S.

Solución contiene 50 mgr. de verde claro F.S. y 50 gr. de ácidotricloroacético en un litro de agua.­Lavado: Solución a1 5 %de ácido tricloroacético, asta decoloración dela zona no coloreada.­Elución: Solución 0,1 N de hidróxido de sodio al que despúes de tres ho­TASse agrega ácido acético glacial¡ Se lee en el fotocolorímetro alos 600 mu¡­Observación:

En la tinción con azul de bromofenol 1a extinción de las tiras conglobulinas, debe multiplicarse por el factor de corrección 1,6 de estemodose toma en'cuenta la tinción más intensa de-la albúmina; Se ha com­probado que no se colorean por igual todas las fracciones y se han de­terminado así factores de corrección para cada globulinaa Se ha demostrardo también que las globolinas alfa y beta portadoras de lipoides son lasque muestran unos limites de variación más amplios.­

Factores de corrección similares deben emplearse cuando seutiliza el negro de anilina,en cambio la proporcionalidad es muchoma­yor cuando se usa el azocarmin o el verde brillante, los factores citadosse calculan determinando el nitrógeno por micro-Kjendall en cada frac­ción de la tiras­

-18­

En general puede prescindirse de esos factores de corrección de­terminando el valor normal para una serie de sueros de personas sanas ypromediándolos , determinar el porcentaje normal.­b) Métodosde coloración gara lipoproteinas.ACEITEEQQOo (Durrumil952).­

Solución alcohólica 60 %saturada de colorante durante 16 hso atemperatura ambiente y filtrada.—Coloración: durante la noche.Lavado: lavar rápidamente en agua hasta decoloración de los bordes.delpapel. Secar al aire.­ACEITEAZULN (National Aniline). .

Se usa en forma similar al anterior pero durante cuatro horaS¿­SUDANNEGRO( National Aniline) (Swan)

Solución alcohólica de colorante 0,1 g en 100 CC¡ de alcohol alCU%, calentar a ebullición y filtrar.­Coloración:

Inmersión durante tres horas.­Lavado: Sumergir las tiras tres veces durante quince minutos cada vezun alcohol etílico al 50 %y dejar secar a1 airea­Elución:

Se cortan los trazados en tiras de lO mm.de ancho y se elimina elcolorante con alcohol absoluto con 20 %de ácido acético glacial, durante30 a co minutos..­c) Métodosgara coloración de carbohidratos (Glucoproteinas) (Koiw)

Acido periodico.1,2 gr de ácido periodico disuelto en 50 ml¿ de agua destilada,

se agregan 15 ml. de solución M/5 de acetato de sodio en 100 ml de alcoholetílico. Puede usarse varios dias después de preparada manteniéndola.enla oscuridad.­

‘Solución reductora:5 gr de ioduro de potasio, 5 gr. de tiosulfato de sodio en 100 ml

de agua destilada, con agitación y agregado de 150.ml de alcohol etílicoy 2,5 ml de ácido clorhídrico. Usar inmediatamente.­Fucsinasulfito.­

2 gr. de fucsina básica se disuelven en 400 m1de agua en ebulli­ción y se enfría a 50° y después se filtra¿ A1filtrado agregar 10 ml.de ácido clorhídrico 2 N y 4 gr. de metabisulfito de potasio. Se tapael recipiente y se deja. estar durante la noche en un.lugar fresco y osacuro° Se agrega l gr de carbón deolorante y se filtra. Se agregan lO mlo más de ácido clorhídrico en pequeñas cantidades hasta desaparición deltinte rosado¿ Se guarda en el refrigerador y en un lugar oscuro.- 'Solución de sulfito para lavado.­

Se agregan a 100 ml de agua destilada 1 ml. de ácido clorhídrico

-19­

concentrado y 0,4 gr de metabisulfito de potasio.­Procedimiento.­

Fijado de la tira de papel en alcohol.­Oxidación por 5 minutos en ácido periodico.Lavado en alcohol 70 %.­5-8 minutos en solución reductora.—Lavado con aocohol al 70 %.—Coloración 25 a 45 minutos en solución de fucsina.—Tres lavados en solución de solución de sulfito para lavado.­Deshidratación en etanol.­Secado sobre placa de vidrio.­Se presentan las bandas de color violeta sobre un fondo ro­

sa pálido.— Las bandas pueden medirse por colorimetría directa pero laelución es incompleta por lo tanto debe escogerse la determinacián conel densitómetro electrónico.—

d) Segaración elggtroforética de fracciones proteicas del suero sangui—neo en normales y gp distintas afeccioneS¿­

Fundamento del método: ,El procedimiento consiste en someter una gota de suero de una

capacidad de 0,01 ml. aplicada sobre una tira de papel embebidoen solu­ción buffer pH8,6 a.la acción de una diferencia de potencial constanteo

Las moléculas proteicas se orientan en dicho campoy son obli­gadas.a desplazarse con velocidades diversas de acuerdo a su carga eléc­trica, su velocidad de migración aumenta en el orden siguiente: gammaglobulina, beta globulima, alfa dos globulina, alfa uno globulina y al­búmina disponiéndosa en el papel en orden precipitado comose indicaen el esquemaadjunto.­

Las manchascqrrespondientes a cada fracción son circulares a rectangulares¿e acuerdo a la forma de aplicación, comogota circular o trazado

-2o­

rectilineo respectivamente.­Les fracciones proteicus se hacen visibles por medio de un coloran­

te que-se fija.selectivamente sobre cada una de ellas, en relación cuanti­tativa, de esta manera puede tenerse por comparacióndel trazado electro­forético (electroforegrama) de un suero normal con el suero en estudio unaidea cualitativa de las fracciones proteicas.- a

fiDeterminacióncuantitativa:Comola cantidad de colorante es proporcional a la cantidad de pro­

teinas se-corta el electroforegrama en porciones de 5 mmsy se eluye el co­lorante con solución de hidróxido de sodio.­

La intensidad de la solución se determina por medio de un fotocolo­rímetro y se lleva a un gráfico, 1a densidad óptica leída en fuución delnúmero de la tira de papeló­Valoración planimótrica:

Para la determinación porcentual absoluta y relativa se determinael área de cada una de-las fracciones, contando el númerode cuadraditoscontenidos debajo de los picos que representan cada una de las globulinas yla,elbúmina¿­Descripción general del método:

Las etapas que conducena la obtención de la relación porcentualabsoluta y relativa de las fracciones proteicas del suero sanguíneo sonlas siguientes:

l) Impregnaciónde las tiras de papel de filtro con la solución bu­ffer.­

2) Colocación de las tiras de papel en el aparato para realizar laelectroforesiss­

3) Aplicación del suero¿­4) Aplicación del campoeléctrico.­5) Separación de las tiras de papel del aparato y secado de las mis­

mas ¡'­

6) Coloración de-las fracciones.proteicas sobre el papel de filtTOó­7) Lavadode las tiras de papel de filtro;­8) Determinación cuantitativa de la cantidad de colorante absorbi­

da por cada fracción ya sea por el métodode elución del coloranteo por densitometrfa¡­

9) Determinaciónporcentual absoluta y'relativas­

1) Impreggaciónde las tiras de papel de filtro con la solución buffgga­Las tiras de papel de filtro de 4,5 cmde ancho por 33 cmde longi­

tud se sumergen en 1a solución buffer durante 5 minutos, se sacan y secolocan sobre una placa de vidrio bien limpia y se pasa sobre ellas un

Pn rodillo cubierto con papel de filtro hasta que la superficie de la tira de

-21­

FOTOGRAFIA CON LCB DETz'LLES DE La. CARLJLL CONSTRUan POR EL AUTOR PARA

REALIZAR LA SEPARACION ELECTROFORETICA

lC Cubeta con los compartimentos electródicos.T —Tapa con ajuste hermético. «S —Soporte para las tiras de papel de filtro¿E —Enchufe que permite cambiar la polaridad;­P —Tiras de papel de filtro.“

-22­

papel quede opaca.­2) Colocaciónde las tiras de papel de filtrofign el aparatogpara realizar

la electroforesis.­Las tiras se colocan bien teneas sobre el soporte destinado a ese

fin tratando de que quedenbien adheridas a la superficies­Si se usa el método de Grassmann y Hanning que es el que se ha

utilizado convienecolocar el soporte verticalmente y adherir las tirashúmedas en esa.posici6n doblando los extremos para conseguir una mayortirantez.­3) Aplicación del suero:

Con reapecto a este punto son varios los procedimientos indicardos para aplicar el suero; indicamosa continuación los siguientes.-'

a) Aplicación sobre papel de filtro.­b) Aplicación con láminas de vidrio.-.c) Colocación con aplicador de vidrio.vd) Colocación con aplicadores de hilos;­

a) Aplicación sobre papel de filtro¿—

Algunos autores cortan sobre el papel de filtro un cuadrado de uncentímetro de lado, sobre el que colocan el suero y depositan mas tar­

de en el hueco que queda en el papel comosi fuera la pieza de un rompe­cabezas¿­

Unmétodosatisfactorio consiste en aplicar un papel de filtro so­bre el lugar dondese aplicara la gota, hacer una leve presión para ab­sorber la humedady luego colocar la pipeta en posición vertical sobre lasuperficie dibujando una línea recta en forma tal que los extremos quedena medio cm de los bordes de la tira.— El mismoefecto se consigue con unfinIsimo pincelito de pelo de martas­

b) Aplicación con láminas de vidrio.­

Sobre el borde de un trozo de vidrio de 2 cm de largo por 0,5 cmde espesor se aplica la gota de suero extendiéndola a lo largo del mismoy luego se coloca sobre el papel tratando que el suero Queda uniformemen­

/ .te distribuido sobre el._

c) Colocación con aplicadores de VidPiO¡-i

Este dispositivo puede construirse con dos portaobjetos cuyosbordes son desgastados con una piedra de afilar, después se colocan-unoencima de otro separados por un prisma de madera de 2 mmx 2mmx 20 mmconsiguiéndose su unión con una banda elástica que permite que los cantosse adhieren perfectamente; un tornillo aplicado en el otro extremoobli­ga a separar los vidrios;­

Para cargar el dispositivo se aprieta el tornillo al máximocon­siguiéndose la separación de los portaobjetos y luego se deposita en el

-23­

borde interior el suero con una micropipeta de 0,01 ml ajustando el tor­nillo se consigue que los portaobjetos se adosen y el suero forme unabanda delgada entre ellos; por fin se aplica sobre.el papel de filtroa

T (Tornillo )

P Portaobjetosbiselados.

Soporte de madera

C (cuña de madera)

d) Colocación con a licadores de hilos¿­

Los aparatos americanos vienen provistos de un aplicador consti­tuido por dos hilos de platino muydelgados que se separan paralelamen­te, entre ellos se deposita la gota de suero que se aplica por últimosobre el papel de filtrad­

4) Aplicación del campoelóctrico¡­

Después de colocado el suero se esperan 30 minutos para que elpapel se sature con el buffer y se conecta a 1a.fuente de tensión, apli­cando una tensión de 110 voltios y una intensidad de 2nú.por tira¡­

5) Separación de las tiras de gagel del aparato y secado de 1as.mismas.­

Transcurridas 16 horas se retiran las tiras una vez interrumpidala corriente y se secan en posición horizontal sobre una tela metálicabien caliente pero sin tocar la mismay evitando que se quemeel papel,también se puede secar en estufa a 105 durante 10 minutosa­

6) Coloración de las fraccionesgproteicqg sobre el papel de filtro.­La coloración utilizada en el presaite trabajo es la citada en

las técnicas de coloración que figuran más arriba y es la que utilizaNegro Amido10 B5 en solución metanol/agua v/v con 10 % de ácido acéticoy I %de colorante.udurante 15 minut08¡­

7) Lavadode.las tiras de papel de filtr0¡­El lavado se hace con solución de metanol a1 50 % con lO % de

ácido acético durante una hora cambime el baño cada 15 minutos.­

8) Determinación cuantitativa de 1a cantidad de colorante absorbida.porcada fraccións­

Para determinar la cantidad de colorante absorbida par cada frac­ción proteica se corta esta en tiras de 5 mm¡de ancho y se colocan en

C24“ ‘!

tubos calibrados para fotocolorimetria y luego se introducen 5 cc. desolución de hidróxido de sodio 0,1 N y se deja en reposo durante 60 mi­nutos agitando de vez en cuando. Pasado ese lapso , se retira la tirade papel y se lee al fotocolorímetro consignando gráficamente la inten­sidad.de coloración en función del númerode cada una de las tiras de

opapel.­9) Determinaciónporcentual l absoluta de cada una de las fracciones.­

Unavez obtenida la curva electroforética se mide la superficiede los picos que corresponden a cada fracción y se calcula la relaciónrelativa por ciento por mediode la fórmula.­

Concentración relativa % =_jí¿_ . lOO=St

Si - Superficie individual de Cadafracción.­St —Superficie total.­

La concentracion absoluta se determina multiplicando la cantidad de pro­teinas totales de la muestrapor la concentraciónrelativa por cien.­

Concentración absoluta %= Conc. rel.% a proteinas totales %/

En el cuadro número1 se encuentran tabulados los valores del fraccio'—namiento electroforético sobre papel de diez casos normales y otros tan­tos patológicos diversos.­

f) Separación electroforética de fracciones glicoproteicgg del suerosanguíneo en casos normales.

La técnica es idéntica a 1a utilizada para separar proteinas, pe­rc la cantidad de suero es cuatro veces mayor que aquella , es decir,se trabaja con 0,04 ml. y 1a técnica de tinción es la utilizada por Koiwy figura en 1a página número ¡5 del presente trabajo .-—

En el cuadro número 2 se encuentran consignados los valores delas fracciones glic0proteicas ocho casos normales.­

g) Separación elcctroforética de fracciones ligggggteicas del suerosanguíneo en casos normales¿­

La técnica es idéntica a_la utilizada para separar proteinas conla diferencia de que el voltaje utilizado es de 250voltios durante 8horas trabajando con 0,04 m1de suero;­

La técnica de coloración es 1a que figura en la página {8En el cuadro número 3 se encuentran consignados los valores de

las fracciones lipoproteicas en 8 casos normales.­Se puede observar en los lipidogramas las zonas correSpondientes

a las alfa y beta 1ipoproteinas.­

SEPÁRACIW DE FRACCIONESPROTEICASDEI}sufiáo 3g! sumo

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SEPARACION DE FRACCIONES PROTEICAS DEL SUERO SANGUINEO

METODO:Cámara húmeda

VALORACION:Densitométrica

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Separación de fraccionesgproteicgg del s

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'METODO:Placas de vidrio.

uero sannuíneo humano

VaLORaCION:Fotocolorimétrica

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SUERO _ 'G__LOE}U__LINA.S _ ¿amm4xG10bul1n[;Giobu11n'=.G10bu11. aGlobu11n. Albumina.R 95 195 Ra; a9; RE 4%. R’ï‘a—'

1 Normal 18 1,2 9,5 0,62 7,5 0,50 4,2 0,28 64,3124,2

2 Normal 17 1.171,5 0,77 7,9 0,54 2,8 0,18 61 4,24

5L Normal 14 0,99 7,8 0,55 5,8 0,44 5,2 0,22 69,2 4,94 Normal 20 1,5510,6 0,75 5,4 0,56 5. 0,19 61. 5,95 Normal 21,5 1,4814,2 1,07 8,5 0,58 4,5 0,52 51,5 5,6

6 Normal 14,1 0,99 7,8 0,52 6,5 0,44 5,8 0,25 68 4,5

_7 Inflamación Aguda 25' 1,82 15 0,96 4,5 0,52 4_ 0,28 55,5 5,82

8 Hepatitis 14,5 1,15 17 1,28 7,9 0,6 7,6 0,57 55 4

9 Hepatitis 24,8 1,68 0,46 7,4 0,49 4,8 0,55 56 5,710 Hepatitis 19 1,14 105 0,6912,5 0,75 8,5 0,51 49,5 2,9711 CirrosisHepática 25,8 1,42 258 1,42 4,8 0,28 2,4 0,14 45,2 2,7

12 Cirrosis Hepática 44‘ 2,52 8,7 0,54 6,9 0,44 6,0 0,54 54,8.2,os

15 Cirrosis Hepática 44,5 2,62 2,5 1,47 4,2 0,242 0,17 28 I1,6

14 Hepatitis 25_ 14,5 14 0,75 10 0,52 7L 0,45 49.4505415 Nefiritis 55,5 1,99 15 0,9 19 1,14 6,5 0,59 26,2 !1,574

16 01omezu1oneiritis 28,5 1,57 4,8 0,27 2,2 1,17117 0,64 55,8 51,84;17 Nefroeis 22,8 095 7,2 0,5 58 2,58 7,6 0,51 O,18¡4,4 718 Ami1oidosia Renal 41 1,6 12,8 0,6 20 0,78 6,4 0,2 18,8 '.:,72519 Nefi‘Osj-S 14. 0,63 14 0,63 46 ¡2,07 10 0,45 16 ¡0,724

20 LeucemiaLinf.-Agud.- 15,1 0,9512 0,75 5,4 0,21115 0,73 58 5,65621 Leucemiacrónica 14,8 0,9512,5 0,78 7,7 0,4815 0,85 52 5,286

22 Leucemia mie1oide. 12,4 0,8510,5 0,701.8,1 1,2 11,8 0,85 47,4 5,2 6

25 Mieiona de Gammaiom 65 5,05 1,75 0,44 2,95 0,25 2,52 0,18 5o 2,42 a

24 Mie-lona de Globulína 27 2,1 55 2,5 4,8 0,42 5,2 0,58 52 2,5 7

Fraccionggiggto de la; profeïqggfdel suero sanggíneo humanoMétodo - CámaraHúmeday Tira de ngel Horigpntal y

Valoración —Densitométnigg _

1 Normal 22 1,4814,6 0,9810,8 0,70 5,6 0,841 49 5,5 6

2 Normal 18,2 1,2 12_ 0,85119 0,82 2,9 0,2 56 5,8565 Normal 18,5 1,22 7,6 0,51 4,8 0,551,5 0,08 68 4,36 6,

S u e-r o R% A% R% A% R% A% R% A% R% 1% P1

xGlob. ¡301ob. '52 G10b.‘ "4,Glob.' Albuma Tc

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GLOBUL INAS ALBUMDÏAr fi: r<2 «a A 31:

R A R B B A 13 A T7

Normal 14,7 0,93 14,70,9310,6 0,63 _6 0,38 54 3,43 6

Normal 18,5 1,33 12,3 0,88 8,1 0,5813,1 0,21 58 4,2 7

Normal 17,2 1,2 12,9 0,9 11,2 0,76 3,7 0,28 54 3,88 7

Hepatitis 23 1,5 18 1,18 11 0,72 9 0,6 39 2,6 6

tericia Obstruct. 20 1,4 15 1,05 11 0,77 7 0,49 47 3,29 '

irrosisHepática 28 1,72 18 1,10 '8 0,49 6 0,37 40 2,42 6

eumatisqugudo 24,3 1,6 15,71,07 11 0,75 3,7 0,25 46 3,13 6

nia Hemol.Adquir. 34 2,23 13 0,9 9 0,6 7 0,47 37 2,5 6

JOLECISTITIS 32 2,15 16 1,06,8 0,52 7 0,47 37 2,5 6

c UAD R 0 N° 2

nggración y doaaje de Glicogroteínas del suero sanguíneo humang_Valoración - Densitométrica

Normal 16 012,5 261625 30 187,5 18 112,5 8 50 6

Normal 28 75 26,5 100 16,2 72,5 1o 37,5 26,5 100 5

Normal 8,5 62 26, 200 31,8 238 13,4100 18,5 138 75

Normal 7,1 25 14,8 50 50 145 0,43 50 14,3 50 3:

Normal 14 162,5 28 225 21 200 _6 62,5 31 300 "9.4

Normal 27,5 262,5 24,8 225 24,8 225 9,7 87,5 15,2 175 9:

Nor-mal D.9,8 187,5 22,4 212,5 25 237,5 7,8 75 25 237,5 95

Iormal 8,1 75 39,2 362,5 28,4 262,5 10,8 100 13,5 125 9:

Normal 22 125 25 150 18 112,5 14 87,5 21 1375+?

Normal 26 32.5 23 287,5 18 25o 13 562,5 22 275 1:

R%Amm2R‘1’,Amm2R%Amm2R%AImnR%ImmznG1obu11na. Globulina Globulifi Globul. Albúmina T<

Los valores R %y A %significan valores relativos por cien y abso­lutos por cien, respectivamente.­Las determinaciones de la proteinemia total hen sido realizados se­gún el método de Marenzi, Vilallonga y Mogliae­

S_E_E_A_B_¿Q;[0NDE FRACCIONES LEOPROTEICAS DEL sum-1g SANGUINEO

METODO: Cámara Húmeda

COLORACION : Shwan (Sudán Negro)

VALORACIONz Densitométrica.

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LE5.El;

C U A D R O No. J

DCBAJE DE LIPOPROTEDIAS SOBRE PAPEL DE FILTRO.­

METODO:Segaración en cámara húmed .

VALORACION:Dens'itométrica.

COLORACIOIÉ: ' SUDAN - NÉGRO

No. Beta Lipoproteínas Mia Lipoproteínmw

S U E R o ¿Eat-a BM Relativo 95Relativo % Relativo 96

..1 A Normal 21 57 22

1 B Normal 23 52 25

2 A Normal 26 45 50

2. B Normal 25 55 20

3 A Normal 27 52 21

3 B Normal 24 55 21

4 A Normal 33 47 20

4 B Normal 26 62 12

En 1a página siguiente se encuentran representadas las curvas de los lípi­dogramaacuya fotografía figura en la página No.'

13635“: 0:. uvapuomNAs DELSUEROSANGUlNEO*

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-25­

LA ELECTROFORESIS Y ImS VARIACIONES DE LA ALBUMINA Y GLOBULINAS

Las determinaciones comunesde albúmina y globulina por losmétodosusuales de precipitación con sales neutras se hallan sujetas amuchas causas de errors En cambio la sencillez de la técnica hace que searecomendablepara.obtener una idea en particular del aumentode las glo­bulinas¿­

Este aumentode las globulinas con disminución de la albúminaconstituye un hecho destacado que se presenta no solo en numerosas en­fermedades de tipo inflamatorio progresivo e irreversible sino tambiénen trastornos de las secreciones internas y en determinados tumores ma­ligDOSePor otra parte, puede decirse que no ha podido ser comprobado,un aumentode la fracción albúmina, en condiciones patológicasa­

Según Wurhmanny Wunderly y otros autores z el concepto enboga del cociente albúminaglobulina, no tiene especial importancia y enadelante irá desapareciendo progresivamente, porque el aumentode la frac­ción globulina en determinados sueros se acompañasiempre, de una grandisminución de la fracción albúmina por lo general directamente proporcio­nal de tal modoque el valor numérico del cociente se desvía en forma tandesproporcionada que ello motiva falsas conclusiones¿­

Esto es una prueba más en favor de 1a.eleetroforesis puesmediante determinaciones electroforéticas, hoy dia sabemosque cocientesalbuminanglobulina.numéricemente idénticas, pueden corresponder a muydistintos " capectos proteicos" y que en ciertos casos ademáscon un co­ciente normal, las proporciones de las proteinas se hallan muyaltera»das, lo cual conducea interpretaciones erróneas¿5La electroforesis x las reacciones de floculación¡­Reacción de Takata Aras­

La reacción de Takata es una reacción de floculación cuyoautor la aplicó en los primeros preliminares.­

Los resultados positivos de las reacciones son inespecífi­cos y determinados por el aumentode una fracción que falta en los suerosnormales y que en circunstancias patológicas aparece relacionada con elgrado de dispersión grosera globulínicas- El resultado positivo es inde­pendiente de la proteinemia total y de la concentración del sueroo Seha comprobadoelectroforóticamente que el resultado positivo de la reac­cidn-de Takata en pacientes febriles significa.un aumentode la ï’globu­linaj debido a una lesión hepática difusa o una afección crónica renal.­

En estados febriles cuando la función hepática está indemrne revela una reacción que afecta el sistema reticulo endotelial intra oextrahepático ( ¡'globulina con carácter de anticuerpo).­

' En sintesis la positividad dependedel aumentode la'Ïglobulina¿

-26­

.nggción de floculggión, cefalina colesterol (Hanger).­Es una reacción especifica de la labilidad del suero sanguíneo

e induce su positividad a admitir la presencia de un proceso parenquima­

toso hepático difusos El mecanismocomprende el aumento de la U-globuli­na y también de la ¡3 - globulina y en alguno u otro caso las albúminasdesarrollan una acción estabilizadora¡­

Reacción del timol (MacLaaan).­

Es una reacción cuyo mayorvalor «insiste en que resulta positiwva en numerosísimas afecciones parenquimatosas difusas del hígado, so­bre todo en las hepatitis a El fundamento de la acción comolo demostróKumkel está relacionado con las lipoproteinas que emigran con igual ve­locidad que lasj5 globulinase Por otra parte intervienen las ¡(globuli—nas así comoel contenido en albúminss que desarrollan una acción estarbilizadora sobre el suero sanguíne0¡­

¿Reacciónqa enturbialliento por el cadmio (R: Cd).­De acuerdo.con Wurhmanny Wunderly se ha comprobado que el re­

sultado positivo de-la.reacción del cadmio depende ante todo, del aumen­to de IosK 'globulinas, si bien interviene también el aumentode las )—globulina y en menorgrado el de la (3 globulina. El aumento.exclusivode B4 globulina inhibe el resultado positivo de esa-reacción.­Reacción de Weltman.—

Esta es una reacción que es independiente de la velocidad desedimentaciónglobular, de la.cifra total de proteinas séricas, del ni­vel de productos de depuración renal y de la bilirrubina da sin embargouna valiosa impresión diagnóstica acerca de los trastornos y desviacio­nes de las funciones globulínicas comose resume a continuación.vBanda de Weltmanacortada.­

Umbralde termocoagulación elevado significa inflamación aguda,proceso exudativo necrobiótico (aumentode las globulinas ci og1 ).­Banda de Weltman alargada.­

Umbralde termocoagulación descendido, representa proceso ci­rrático produce eventualmente inflamación “crónica o hemólisiS'(aumeriode 1a í globulinah­

-27­

La electroforesis sobre papel y los trastornos globulínicos.

Gammahiperglobulinemias:La onda gammaregistrada en el diagrama electroforética simula una.

entidad 1a cual se descarta debido a los resultados obtenidos con las reac­ciones inmunoserológicas, las determinaciones por ultracentrifugación, laelectroforesis asociada a la convección. La hiperglobulinemias.se encuentranen los siguientes grupos de enfermedades.­a) Inflamaciones crónicasz.

Supuraciones crónicas, procesos inmunizadores activos de las enferme­dades infecciosas (linfogranuloma inguinal, tuberculosis pulmonarcrónica,lupus eritematoso¿­b) Muchashepatopatias crónicas:

En especial las hepatitis subagudasy crónicas, cirrosis hepáticas ynecrosis parenquimatosas del hígado.­c) Ciertos tumores malignos:

Plasmacitomas.y reticulosis activa, algunas formas de macroglobuli­nemia de Waldestrom, las denominadashiperproteínemias esenciales¡­Beta hiperglobulinemia:

Se encuentran generalmente asociados a la alfa globulina y por lotanto se observa un aumentode ésta¡ Su elevación se observa en los si­guientes cuadros clinicosa­

Pasmacitoma de El y B2¿Macroglobulinemia de WaldestrómsCiertas hepatopatías en especial hepatitis incipiente.Sindrome nefrótico por lo comúnasociado a.un aumento de la alfa

globulina¿Casos raros de tuberculosis pulmonar exudativa, embarazossCirrosis xantomatOSas,xantomatosis y lipoidemias en-lasvhiperlipe—mias se observan tras de la ingestión de abundante grasaé­

Alfa hiperglobulinemia:Se observan rara vez estados con alfa hiperglobulinemias en cambio

son muyfrecuentes asociados al aumentode la beta globulina pues revelaninflamación celular genuina, las necrosis en términos generale0¡ Debenconsi­derarse los aumentosde alfa globulina comotípicos de:

Toxicosis gravidicaaTumores malignos complicad08¡

La electroforesis sobre papel presenta la ventaja de permitir diferenciarlas alfa uno y alfa dos globulinas habiéndose comprobadoque la alfa unoglobulina es la que posee mayor contenido en polisacáridos¿­

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V7

-28.

1- COhSTELnCION DE REACCIONES

Tipo : inflamacion aguda.­

'em los:Neumonía.­Enfermedades.infecciosas agudas.­Tuberculosis pulmonar exudativa.­Reumatismopoliarticular agudo.«Sepsis¿ Flemón.—Infarto de miocardio reciente y otras necrosis.­

Sedimentacióneritrocítica.-Aceleración manifiesta (valores progresi­vamentecrecientes a las una, dos y veinticuatro horas¿­Reacción de Takata.- Negativa (Rara.vez positiva)¡Reacción de la cefalina: Negativa¿ (Rara vez positiva)Reacción del timol: NegatiVa. (Rara vez positiva);­Reacción del cadmio: Positiva¡—

valor protídico global: Inmodificado; disminución de albúmina y aumen­tfi de la globulinaó- .Umbral de la coagulación térmica: El evado,.banda de Weltmannacertada,nefelograma muydesviado hacia la izquierda, de base ancha y cursobastante elevado¿—

8) Electroforesisfi Marcado aumentode las alfa-globulina a menudodividi­das en alfa- uno y alfa dos globulinas, a expensas de la albúmina yen periodos avanzados, además aumento de las gamma-globulinas.­

2p CONSTELACION DE REACCIONES

2399: procesos inflamatorios subagudos y crónicos

Ejemplos:Neumonía.en curso.­Enfermedades infecciosas en defervescenciaTuberculosis-pulmonar poco activas­

a Cistitis, pielitis, cólecistitis¿—Endocarditis.—

1) Eritrosedimentación: Poco o muyelevada, en ciertas circunstancias

' Reacción de Takata:normales ( en parte depende del fibrinógeno)a­

Negativa.Reacción de 1a cefaling¿ Negativa ( Rara vez positiva)¡Reacción del cadmio: Débilmente positiva o negativa6­Proteinas del suero: En 1a zona normal, con las albúminas un pocodisminuidas y el correspondiente aumentode las globulinas.­Reacción del timol: Negativas —Umbral de.coagulación térmica: Poco elevado o "mudo", es decir, labanda de Weltmannun poco estrecha o velada, con el nefelograma sinensanchar, pero con el curso algo descendid05—

-29­

8) electroforesis: Pequeña disminución de las albúminas y correspondien­te aumento de las gamma-globulinas, eventualmente a la vez de lasalfa-globulinas.­

5- CONSTELAC'ION DE REACCIONES

Tipo de la hepatitisEjemplos:

Hepatitis y sus secuelas.­Estasis pasiva crónica del higado¿Lesiones parenquimatosas tóxicas hepática3¡Ciertas formasde poliartritisd­Ciertas leucemias y tumores malignos de los tejidoshemopoyeticoso linfáticos.­

1) Eritrosedimentación: No acelerada o en grado moderados­¿) Reacción de Takata: Positiva en un 50 %.— '3) Reacción de la cefalina: Positiva en un 95 %de los casos.­4) Reacción del Timo}: Positiva en un 95 %de los casos¡­5) Reacción del cadmio: Positiva en un 70 % de los ca309¡­6) Proteínas del suero: Un poco disminuidas albúmina reducida, aumento

5 globs- '7) Umbral de coagulación térmic : Descendido, nefelograma desviado a la

derechag­8) Electroforesis: Aumentode las betarglobulinass Lo prepio con las

gammacon disminución de la albúmina.­

4- CONSTELACION DE REACCIONES219o de la cirrosis hepática

Cirrosis hepática de-LaenneC¡­Cirrosis por estasis pasiva.Cirrosis cclangítica.­Tuberculosis pulmonar indurativa graves­Septicemia lenta, kalapazar y otros procesos flogís­ticos crónicos.­Cierta formade poliartritiS¡­Hambre.- n

PaquipleuritiS¡—En la figura se reproduce el cuadro proteico sanguíneo típico de una ci­rrosis hepática de Laennec avanzada, de origen alcohólico¿­l) Eritrosedimentación: Muyaceleradaa Si hay insuficiencia concomitante

del miocardio. GMiocardosis)no está acelerada dicha sedimentación.­2) Reacción de Takata: Positiva en un 60 por 100 de los casos¿­3) Reacción de la cefalina: Negativa o positiva ( en un 40 por 100 de

los casos).­4) Reacción de timol: Negativa o positiva ( en un 40 por-l00 de los cas

sos)¡- '

-50.

5) Reacción de cadmiozPositiva, aproximadamente en el 90 por lOO de losCaSOS¡- ­

6) Erótidos globales del suero: Disminuido, sobre todo las albíminas conaumentorelativo de las globulina5¿­

7) Embral de la coagulación térmica; Ensanchado en más del 90 por lOO delos casos: por tanto, banda de Weltmannalargada, nefelograma desviadohacia la derecha, estrecho y de curso bajo; su rama descendente llega altubito 13 desprovisto de electrolitosá- ­

8) Electroforesis: Gran aumentode las gamma-globulinas, con la onda altay su base ancha (heterogeneidad de las gamma-globulinas; las betas glo­bulinas están a menudoaumentadas, gran disminución de las albúminas);

5 -CONSTELACION DE REACCIONES

Tipo de ictericia obstructivaEjemplo:

Ictericia obstructiva.por cáncer de las vías biliareso del páncreaaí­Ictericia por b obstrucción calculosa.Obstrucción mecánica de las vías biliares por proce­sos flogístico o cicatrizales.­

En la figura se expone un caso con cáncer de.las vias biliares (colédoco)a las cuatro semanas, sobre poco más o menos, de obstrucción del flujo bi­liar. .l) Eritrosedimentación: Moderadaa intensamente acelerada¡­2) Reacción de Takata:Negativa, rara vez positiva¿­3) Reacción de cefalina:Negativa en el 90-95 por 100 de los casos¿­4) Reacción de cadmiozPositiva en un 70 por 100 de los cas03¿­5) Reacción del timol: Negativa en el 90-95 por 100 de los casos¿­6) Proteinas totales: Normales o un poco disminuidos; albúmina claramente

disminuida¿­7) Umbral de coagulación termica: Normal (velado) o banda de Weltmann un

poco acertada; nefelograma, por lo camfii, con la base estrecha y pocoelevada.— .

8) Electroforesis: Disminución patente de la albúmina, aumentode las glo­bulinas-ML-beta-gamma (aproximadamente con uniformidad)¿

6. - CONSTELACION DE REACCIONES.

Tipo de sindrome nefrótico.¿Memoloz

Nefrosis lipoidea o genuinasNefrosis amilaidea.Nefritis o nefroesclerosis con repercusión nefróti­ca (la denominadaseudonefrosis)s

-31.

Formaexcepcionales de síndromes hepatorrenales.­Tuberculosis pulmonares gravísimas, terminales y ca­quexia.Toxicosis gravidicas¿­Hipoproteinemias eventualmente denominadas "esencia­les".­

1) Eritrosedimentación: Sumamenteacelerada, ya en la primera hora¡­2) Reacción de Takata: Resultado dispar.—3) Reacción de la cefalina: Positiva muyrara vez.­

'4) Reacción del Timol: Positiva muyrara vez¡­5) Reacción del cadmio: Casi siempre intensamente positiva.­6) Proteinas totales del suero: Muybajas sobre todo las albúminas.­7) Umbral de termocoggulación: Muyelevado Banda de Weltmann acortadas­8) Electroforesis: Aum to de alfa y beta globulina con disminución de

Álbúmina y gammaglobu inag­9) Notable lipoidemia, hipocalcemia proteinuria y 1ipoiduria.­

7 - CONSTELACION DE REACCIONES

Ti o de los tumores malivnos

E em los:Cánceres sobre todo con metástasis.­Sarcoma, exceptuando el plasmocitoma¡­Neoplasias sin gran participación hepática.­

1) Eritrosedimentación: De moderada a muy aceleradaa­2) Reacción de Takata: Negativa¡—3) Reacciónde la cefalina: Negativa, rara vez positiva.­4) Reaccióndel timol: Negativa, rara vez positiva.­5) Reacción del cadmio: Positiva en el 60-70 %de los casos¿­6) Proteínas totales: valor normal; si el proceso morbosoes inveterado,

un poco.disminuidasi la albúmina algo disminuida a costa de las glo­bulinas.—

7) Umbral de coagulación térmica: Acortado, en parte en 1a zona velada,Nefelogramamas bien desviado hacia la izquierda, bajo y con la baseestrechas­

8) Electroforesis: El_aumentode las subfracciones globulinicas alfa,beta y gammaes casi uniforme o menos marcada y a expenses de 1a al­búminaw '

8 - CONSTELaCION DE REACCIONES

Ïipo del plasmacitoma de gammaglobulina¡

Ejemplos :Gammaplasmacitomas­Macroglobulinemia de Waldenstrom.Linfogranulcmainguinal (forma genitorrectal de Ni­colas- Fabre).­

-52.

Kala-Azar.—Ciertas formas de reticulosiS¡—Formasraras de polartritiS¡­

1) Eritrosedimentación: Muyacelerada sobre todo incluso en la fase ini­cia1¿-(A menudose registra el valor máximo,transcurrido quince-vein­te minutos)¡­

2) Reacción de Takata: Positiva en un 90 % de los casos;­3) Reacción de cefalina: Positiva o negativa¡—4) Reaccióndel timol: Positiva rara vez.­5) Reacción de cadmio: Intensisimamente positiva.( en.a1gún que otro caso

con gran diSproteinemia, en ciertas circunstancias, resulta negativa aintensamente negativa, comoen el beta uno plasmocitomaé­

6) Proteinasrtotalgg;de1 suero: Muyaumentadas, rara vez hasta el doble(en muypocos casos valor normal o escaso) pero la albúmina siempre es­tá disminuida.— .

"Umbralde la termocoggulació : Iuy disminuido, banda de Weltmann muy7)ancha, nefelograma desviado hacia la derecha:­

8) Electroforesis: Marcado aumento de la gammaglobulina a expensas dealfa y beta globulinax­

9) El plasmacitoma se acompañafacultativamente de proteinuria de. .B.JoneS¡

9 *.QQHSTELACIQHLDE REACCIONES

Tipo del plasmacitoma de betaruno -globulinamEjemplos:

Plasmacitoma de beta uno-globulina¡Leucemiade células plasmáticas-beta uno.Macroglobulinemia de Waldenstrom¡Tumoresmalignos raros¡­

1) Eritrosedimentación: Sumamenteacelerada en especial en 1a fase inicial.2} Reacción de Takata: Positiva.en 1a mayoría.de los cas03¡­5) Reacción de 1a cefalina; Positiva muyrara vez¿­4) Reacción del timol: Positiva muyrara.veza­5) Reacción del cadmio: Negativa¡6) Proteinas totales del suero: Muyalmentadas, rara vez normal.-­7 umbral de termocoggu;ación: Muyelevado, banda de Weltmann acertada,

nefelograma muydesviado hacia la izquierda;­Electroforesis: Marcadoaumentode las.beta uno globulinaa a costa delas demásfraccione8¡­Proteinuria de BenceJones facultativaó­

O) x1V

V9

-33­

Fraccionamientode lagïproteínas del suero en distintas afecciongg.­De acuerdo con Wurhmanny Wunderly las alteraciones proteicas del

suero sanguíneo puedenser agrupadas con el objeto de facilitar la inter­pretación de esas alteraciones, en nueve tipos distintos de proteinogra­mas electroforéticos, que comose ha visto en párrafos anteriores son los _siguientes:

l) Tipo inflamación aguda.'d2) Tipo proceso inflamatorio subagudo y crónic0¡3) Tipo de la hepatitiSa4) Tipo de la cirrosis. hepática.­5) Tipo de la ictericia obstructivaa6) Tipo del sindrome nefrótic0¿7) Tipo de los tumores malignos¡8) Tipo del plasmacitoma.de gammaglobulinai9) Tipo del plasmacitoma de beta globulinaa

La.electroforesis sobre papel suministra por su simplicidad y ba"ratura, un método sumamenteútil por su aprovechabilidad para obtener losproteinogramas ya citados¿­

Cuandoeste método se realiza comose ha descripto anteriormen­te, no es menosexacto que el electroforético clásicoa­

A continuación se adjunta los nueve tipos de proteinogramas elec­troforeticos acompañadosesquemáticamentecon la representaciBn gráficade las reacciones de floculación cuya positividad, está directamente ovinculada.a la cantidad absoluta y relativa de cada una de las fraccionesproteicasa­

En las páginas siguientes se adjuntan varios diagramas que co­rresponden a diversos estados patológicos y que concuerdan ampliamentecon los nueve tipos de espectros proteicoss­

En los diagramas obtenidos por electroforesis sobre papel corres­pondientes a procesos diversos se manifiestan las siguientes alteraciones:Procesos inflamatorios: Se puede observar un aumento de la gammaglobulinacon descenso de la albúmina que encuadra dentro del tipo l y 2;­Ictericia obstructiva: Muestra un aumentode gammay beta alfa globulinacon descenso de la albúmina;­girrosis.hepática: Se observa un aumentode gammay beta globulina en grancantidad, a tal extremo que a veces resulta dificil de separar gammay betaglobulina con gran descenso de la albúmina;­Hepatitis: Los diversos casos de hepatitis que se adjuntann muestran unaumento de la gammabeta alfa globulina con descenso de la albúmina quecorreSpondenperfectamente a las variaciones del diagrama tipo 3;­Nefrosis: Pueden,verse varios disgramas de afecciones renales, amiloidosisrenal, glomerulonefritis y nefrosis con una ausencia de albúminavisiblepor una pequeña manchacuyo rastro no pudo dsscubrirse utilizando la pre­cipitación salinas­

—r—rí

- 34­

Tumoresmalignoa¡- Se adjunta un caso correspondiente a un mieloma múl­tiple con un aumento marcado de la gammaglobulina que se ajusta perfec­tamente al diagrama tipo 8.­

Lo dicho anteriormente y los esquemas que se adjuntan comoprue­ba no son mas que la ratificación de 1a importancia y ventajas de la elec­troforesis sobre papel, que permite obtener ademásde la curva electro“fbrética un diagramabidimensional, que es especifico para algunas enfer­medades.comoser cirrosis hepatica mielona etc, para citar los casosmás típicos y masfacilmente identificables por visión directas­

S‘NURÜMLS ÉNÏLRPRUACÉÜN

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-35—

APLICACIONES DE LA ELECTROFORESIS SOBRE EgPEL

Hasta el presente la principal aplicación de la electroforesissobre papel de filtro ha sido la separación de las fracciones del sueroSanguineo.— i

Existe un elevado númerode trabajos que se refieren a la separa­ción electroforética sobre papel de filtro de albúminasy globulinas(alfa beta y gamma)en el suero.­

Aparte de estas determinaciones se ha aplicado a la resoluciónde numerosos problemas dentro del campode_la biología experimental algunode los cuales se indican a continuación, sin embargoel método no ha al­canzadola difusión que cabía esperar dada su practicid;d.­

El métodoha resultado útil para fraccionar las proteinas de otrosliquidos biológicos comoser líquido céfalo raguiggp donde a veces se dis­pone de muypoca cantidad de material.­

Se ha aplicado también para separar las ppppginas de la orina ylcomparar el electroferograms con el obtenido con el suero sanguíneo de lamisma pers0na.—

El estudio de isotOpps radiosctivos en el suero sanguíneo puoderealizarse siguiendo la administración de aminoácidosmarcadosradioacti­vamentey comparandola radioactividad especifica de las fracciones delsuero.- '

Conrespecto a la separación de péptidos x apippácidos la electro­foresis sobre papel ha resultado ser superior a la cromatografía pués las“separaciones requieren un tiempo muchomenorutilizando_1a electroforesis"Se ha podido comprobar la homogeneidad de la ositocipg y de la hormonavasopresora, que fueron previamente purificados por distribución en con­tracorriente.­

Pueden separarse por este procedimiento diversas fracciones delpgpgno de los ofidios cuya acción biológicanse determina extrayendolos.de

las bandas separadas en el papel.­La separación de los carbohidratos ha sido obtenida ingeniosamen­

te separando-los boratos complejos de esos carbohidratosd­Aplicando la coloración de Koiwes posible identificar los ggggg—

pidratos que se localizan sobre las fracciones proteicas del suero sanguíneo.‘ La separación con papel de filtro tiene la ventaja de que el material

separado en bandas wb ' ; ¡puede ser utilizado cortando la zonadonde se ha localizado y extrayéndolo después de macerado el papel pordisolución en un solvente específico.­

Se ha citado un método para dosar el pglgstepg; combinadoa cadauna de las fracciones del suero sanguíneo, utilizando un micrométodo perola adsorción en el origen ha limitado el uso del método.­

Se han-localizado los lípidos componentesdel suero utilizandoun colorante especifico lo que ha permitido determinar las alfa l beta li:ppprotefnas que migran en la zona de la alfa y beta globulina.—

-36­

OTRCB MEDICB DE SOPORTE

Se han utilizado numerosos medios de soporte comoser papel de vidriolïcagel, esferitaa de vidrio, smtancias sintéticas, perlas de polye'ti­leno, partículas de polivynilo, arena lavada, etc; con resultados varia­bles pero.que no tienen la ventaja del poder de resolución del papelde‘filtrm­

Una modificación satisfactoria es el empleo de almidón que se hautilizado para separar alfa y beta lipOproteinas pero presenta dificul­tades en 1a preparación del medio soporte¡­

“po-.­

2:° 272%

C O N C L U S I O N E S

1°) Aparatos construidoes­

Se.construyeron dos aparatos modificados para electroforesis so­bre papel de filtro de distinto modelo, uno con cámara húmeday el otrocon placas de vidrio, introduciendo en ambos.a1gunasmodificaciones conrespecto a los modelospropuestos por otros autores.­2°) Fuente de tensión utilizada.­

Hemosconstruido la fuente de tensión correspondiente para dichosAparatos modificados utilizando en su casi totalidadnaccesorios e implementosde loa-utilizados corriéntemente en 1a fabricación de aparatos de radioa­

30‘ Comparaciónde aparatos;­Los resultados obtenidos con estos dos aparatos fueron comparados

con los resultados de los aparatos’existentes en el comercioeLas compara­ciones efectuadas como.contralor con el Evans E5E¿Lay las pruebas aisla­das con los aparatos S¡V¿A¡R¿P¿y Polymetron acusaron resultados.eatisfac­torios o'-_

E} 153.0Se 2298 41.131.99599 222952261 vayais}? 82292292136. e .192construidoslpgr nosotrosf­4°) Separación y dggaJe de globulingg y albúminas del suero sanguíneo.

.Los trazados obtenidos y gráficos que se incluyan en el presentetrabajo, correspondena la separación electroforética y valoración de lasfracciones albúminasy globulinas en treinta y seis casos que pertenecena otros-tantos pacientes afectados de diversas dolencia3¿ Los resultadosobtenidos permiten observar concordancia entre dichos diagramas electrofo­

ríSicos sobre papel y los casos clínicos referidos al diagrama de Wurhmmanny underly, que ee incluyen en el presente traba30¡­

4°) Separación x valoración de lipgproteinas del suero sanggineo¿—La separación y valoración de lipopgoteinas realizada mediante la

electroforesis sobre papel utilizando los dos aparatos antes citados enocho casos normales ha dado resultados que concuerdan en los ocho casoscon los encontrados por otros autores;­50) Se aración Valoración de uco roteínas del suero s inca.­

Se ha ensayado también en diez casos.normales la separación elec­troforética aplicada a 1a valoración de glucoproteinas utilizando la colo­ración de Koiwhabiendo obtenido resultados concordantes con los citadosen 1a literaturai­