La adsorción de alfa-lactoalbúmina del suero de la leche hidroxiapatita: Efecto del pH y de la temperatura y el análisis termodinámicode adsorción de alfa-lactoalbúmina de la leche de suero de leche en hidroxiapatita: Efecto del pH y de la temperatura y el análisis termodinámicoRita Superbi de Sousa I, *; Jane Selia dos Reis Coimbra II; Liliana de Luca Augusto Xavier I; Leomir Samuel Tormen Reyes I

I Departamento de Química de la Universidad Federal de Viçosa, 36570-000 Viçosa - MG, Brasil II Departamento de Tecnología de los Alimentos de la Universidad Federal de Viçosa, 36570-000 Viçosa - MG, BrasilRecibido el 07/25/2013 Aceptado el 02/21/2014 Publicado en la web en 05/06/2014Dirección postal* E-mail: rita.sousa@ufv.brRESUMENLos beneficios nutricionales y funcionales ofrecidas por proteína de suero α-lactoalbúmina justifican el gran interés en su fabricación en grandes cantidades en un nivel de alta pureza. La hidroxiapatita es un material de fosfato de calcio capaz de adsorber las proteínas y puede ser sintetizado a bajo costo de producción. Por lo tanto, este trabajo evaluó la adsorción de α-lactoalbúmina de hidroxiapatita usando datos de equilibrio fase sólido-líquido reportados la adsorción isotermas. Análisis de la termodinámica de Van't Hoff Mostró Que el proceso de adsorción es impulsado entrópicamente.Palabras clave: Bioseparation; Energía libre de Gibbs; Modelo de Langmuir.

INTRODUCCIÓNEl suero de leche es la más abundante subproducto de la industria láctea. Es rico en proteínas que tienen diferentes propiedades de interés académico e industrial, tanto en términos de funcionalidad técnica o funcionalidad biológica. De hecho, una de las proteínas de suero presentes en, la α-lactalbúmina (α-LA) se puede manipular tanto como aditivo alimentario o como un nutracéutico.La alfa es un polipéptido de cadena única con residuos de ácido 123 aminoácidos, 67 de los cuales son aminoácidos esenciales.Dispone de una secuencia de aminoácidos homóloga a la lisozima. El alpha se estabiliza por cuatro puentes disulfuro. Cuenta con un grupo tiol libre (que podría servir como punto de partida para una reacción de agregación covalente) y por lo tanto no forman geles siguientes desnaturalización y la acidificación. Muestra la capacidad de unirse a los iones de calcio y otros metales como el zinc. La molécula nativa tiene dominios a-helicoidales y las hojas beta. 1.2

Según Eigel et al., 3 a alpha que existe en dos formas de genes (A y B) que difieren de residuo en la décima posición en la que la forma de realización tiene una glutamina (Gln) está sustituido por arginina (Arg ) en la variante B. Y, según Fox, 4 hay un medio adicional (C). La a es un pequeño peso molecular de proteína globular de 14.178 Da. El punto de entre 4,2 y 4,5 isoeléctrico. La α-La es de aproximadamente 20% de la proteína total de suero de leche y aproximadamente 3,5% de la proteína total de la leche.Debido a su contenido en aminoácidos esenciales, los fabricantes de alimentos, suplementos alimenticios y de nutrición deportiva tratar de incorporarlo en productos con diferentes características. El uso de a como un aditivo alimentario se debe a su capacidad de comprobar o cambiar las propiedades técnicas y funcionales en alimentos, sobre la solubilidad y la capacidad para formar emulsiones y espumas. En el campo biológico el uso de alfa que está relacionado con el desarrollo de formulaciones, tanto para la nutrición clínica, debido a su alto contenido de triptófano, y

para la prevención de la enfermedad debido a la presencia de péptidos bioactivos en su estructura. La literatura indica que los péptidos de alfa puede exhibir actividad bactericida, antitumoral y. Antihipertensivo 5-7 Además, bovino α que tiene una alta similitud con el humano α que 5 por lo que es un componente clave para la preparación formulaciones para los recién nacidos en el período neonatal, terapia prematuro y nutricional en lactantes.Eugene y Berliner 7 indican que la humana α-la, bajo condiciones específicas de pH y en presencia de ácido oleico, polimeriza y adquiere propiedad apoptosis (capaz de destruir las células cancerosas de diversos linajes y no diferenciado células jóvenes), ¿no es no tomar ninguna acción sobre células adultas normales. Sin embargo, para la producción a gran escala de α es necesario buscar técnicas de bajo costo para separar y purificar las fracciones de suero rico en a ella y proporcionar sus datos científicos. 8

En este contexto, el empleo se hizo hincapié en las operaciones de adsorción en diversos procesos industriales, incluyendo el fraccionamiento de mezclas complejas de proteínas. Para soluciones diluidas de proteínas, tales como suero bovino, grandes volúmenes de líquido que debe ser procesado para recuperar una masa fija de proteína. Adsorción selectiva de operaciones son los más afectados por la cantidad y la concentración de proteína adsorbida que el volumen del líquido procesado porque la capacidad adsorbente es la más afectada por la masa adsorbida que el volumen procesado. Adsorción selectiva o procesos selectivos incluyen cromatografía de intercambio iónico, la cromatografía de afinidad y una clase más general referido simplemente como cromatografía de adsorción, para el mecanismo de adsorción aún no está totalmente entendido. 9 Ejemplos de esta última clase incluyen el uso de hidroxiapatita, cuya adsorción debido a las interacciones hidrófilas. Por lo tanto, se puede considerar que el fosfato cálcico en forma de hidroxiapatita (Ca 5 (PO 4) 3 OH) es un material que tiene las características físicas de un adsorbente.10 Hidroxiapatita es un constituyente mineral usado en el área biomédica hueso reparar el y en la fabricación de los implantes dentales debido a su excelente biocompatibilidad, la biodegradación lenta, osteoconductividad y propiedades mecánicas. 11Además, debido a su afinidad por las proteínas, la hidroxiapatita se ha utilizado como un adsorbente selectivo para la separación y purificación de estos biomoléculas.Por lo tanto, en vista de los datos experimentales necesidad de analizar la viabilidad de la utilización de la hidroxiapatita para la eliminación de suero de leche α-la, en este trabajo se obtuvieron información sobre el comportamiento de adsorción del sistema por medio de los datos de equilibrio de sólido neta reportada en forma de adsorción y la evaluación de las isotermas de parámetros termodinámicos de la operación de la unidad de adsorción.Modelado de las isotermas de adsorciónLa distribución de soluto entre la fase fluida y la fase adsorbida implica un equilibrio de fase, que se rige por los principios de la termodinámica. Datos de equilibrio son reportados generalmente en la forma de las isotermas de 12 son diagramas que muestran la variación de la concentración de equilibrio del adsorbente sólido con la concentración de la fase fluida, a una temperatura específica. La determinación experimental de las isotermas es el primer paso en el estudio de un nuevo sistema de soluto / sorbente. La información así retirada es importante en la estimación de la cantidad total de adsorbente necesaria para un determinado proceso y por lo tanto el dimensionamiento del equipo para ser utilizado en un proceso de este tipo de adsorción. 13Los estudios de equilibrio proporcionan información fundamental para determinar la cantidad máxima de soluto adsorbido por masa adsorbente, así como el adsorbente afinidad por el soluto. 14

El modelo de la isoterma de Langmuir (Ecuación 1) ha sido ampliamente utilizado para describir las isotermas de adsorción de proteínas en intercambiadores de iones. 9,15,16

 

 

en donde q es la concentración de proteína adsorbida sobre la fase sólida (mg g -1), k d es la constante de disociación (kg ml -1) y Q m es la capacidad máxima de adsorción (mg g -1) y C ( mg ml -1) es la concentración de proteínas en la fase líquida después de que se alcance el equilibrio.El modelo de isoterma de Langmuir tiene algunas simplificaciones, tal como la superficie sólida contiene un número definido de sitios para la adsorción; cada sitio sólo puede adsorber una molécula; todos los sitios son energéticamente equivalente; las moléculas adsorbidas no interfieren con la adsorción de los sitios vecinos; en equilibrio, la tasa de adsorción es igual a la tasa de desorción; la superficie es completamente uniforme desde el punto de vista energético; corresponde a la monocapa de saturación máxima adsorción de moléculas de adsorbato en la superficie de la adsorbente. Sin embargo, a pesar de las simplificaciones, el modelo de Langmuir ha sido utilizado con éxito para describir la adsorción de diversas proteínas en diversos adsorbentes, debido a su simplicidad. 13.17

Proceso de adsorción TermodinámicaUna revisión de los parámetros termodinámicos, tales como el cambio de entalpía estándar de adsorción, entropía estándar de adsorción y Gibbs patrón de energía libre de adsorción puede llevarse a cabo utilizando una relación entre la temperatura y el factor de capacidad, k ', por el modelo conocido como ecuación de Van't Hoff. 18

 

 

donde la capacidad del factor k ', DH 0 anuncio y Ds 0 anuncio, respectivamente, los cambios de entalpía y entropía

de adsorción norma, R es la constante universal de los gases, T la temperatura y Φ constante de sistema depende de la relación entre fases y es

constante con la temperatura. 19

Los valores de k 'se calculan a partir de la siguiente relación:

 

 

en la que q m k d son parámetros del modelo de Langmuir.

La curva de LNK 'frente a 1 / T proporciona entonces una relación lineal que la inclinación se puede utilizar para determinar el valor DH 0 d. Aunque simple uso, sin embargo, este método ha limitado, ya que los valores son el promedio de los valores reales en el estudio de las temperaturas, que genera una pequeña cantidad de información sobre DH 0 

ad a temperaturas específicas. 18Sin embargo, Boysen et al . 20 muestran que cuando la entalpía y la entropía son dependientes de la temperatura, la curva LNK'frente a 1 / T proporciona una relación no lineal puede aproximarse por un polinomio de segundo grado, según la expresión:

 

 

donde a, byc son parámetros empíricos.Por lo tanto, la ecuación derivada 2 comparó a 1 / T, se obtiene:

 

 

y derivar la ecuación 4, en relación a 1 / T, que tiene:

 

 

Así, se puede equiparar las expresiones (5) y (6) para dar la ecuación 7:

 

 

Por lo tanto, de la ecuación 7 puede determinar la entalpía estándar de adsorción, como una función de la temperatura.Según Levine 21 la variación de la energía libre de Gibbs estándar (? G 0) puede ser determinada por la Ecuación 8:

 

 

donde K es la constante de equilibrio para una reacción. En el proceso de adsorción de acuerdo Boysen et al., 20 K puede ser reemplazado por k '/ Φ para obtener Delta G 0 

d utilizando la ecuación 7.Entonces, la entropía estándar de adsorción, Ds 0 Ad, puede calcularse a partir de la relación de Gibbs-Helmholtz:

 

 

Material y métodosLa hidroxiapatita, tipo I, se adquirió de Sigma Aldrich. La α-lactoalbúmina era cortesía de Ingredientes Davisco Comida Internacional (Eden Praire, USA).Experimentos de adsorción en tanque agitadoLa adsorción α-it en experimentos de hidroxiapatita se llevaron a cabo en tanques agitados a diferentes valores de temperatura (5, 15, 25 y 35 ° C) y pH (4.0, 6.0 y 8.0). Los tampones utilizados fueron: i) fosfato de sodio monobásico + fosfato sódico dibásico, en proporciones apropiadas para el pH 6,0 y 8,0 ajustes; y ii) el ácido cítrico + fosfato de sodio dibásico para ajustar el pH 4,0.Cada lote se llevó a cabo como se describe por Souza, 22 en un tubo Eppendorf de 2 ml contiene 50 mg de hidroxiapatita. Para todos los tubos se añadió 500 uL trabajo pH. La misma se dejó en agitación durante 12 h, debe garantizarse para alcanzar el equilibrio con el tapón de resina. El ensayo de la cinética de adsorción por lotes se realizó previamente de una manera similar a la determinación de las isotermas se diferencian sólo en la concentración inicial de la muestra (10 mg l -1) y el tiempo de colección, que varió de 1 min a 12 h. La prueba reveló que se alcanzó el equilibrio dinámico en 120 min. Sin embargo, la orientación una comparación con los datos de la literatura para el comportamiento de adsorción de proteínas de suero en resinas comerciales adoptó el intervalo de 12 horas con el fin de garantizar el tiempo suficiente para que el sistema alcance el equilibrio. 23-25 de

Después de este tiempo, se añadió a los tubos de varios volúmenes de solución de proteína, preparado en tampón de solución de trabajo, de modo que cada tubo tenía una concentración inicial de diferente proteína resultante en un gradiente de concentración de proteína a lo largo de los tubos, un volumen total finales de 1800 uL. A continuación, los tubos que contenían solución de hidroxiapatita y la proteína se dejó bajo agitación suave durante aproximadamente 12 h.Después de este período, la fase sólida se separó de la fase fluida por centrifugación a 7000 g durante 15 minutos. Una alícuota del sobrenadante (que contiene la proteína no adsorbida) fue tomada de cada tubo para la cuantificación de proteína en la fase fluida utilizando el método espectrofotométrico de la absorbancia a 280 nm de lectura directa (espectrofotómetro Hitachi U-2000, American Laboratory Trading EE.UU.). La concentración de proteína adsorbida por masa de adsorbente (q) se ha calculado utilizando la ecuación 10:

 

y c 0 la concentración inicial de proteína (mg ml -1), c la concentración de proteína en la fase fluida (mg ml -1), V el volumen de la solución de (U) y m la masa de adsorbente (g). El modelo matemático Langmuir se ajustó a partir de datos obtenidos experimentalmente de equilibrio (SigmaPlot 11, SystatSoftware Inc., 2008).Análisis termodinámicoCon base en los datos de equilibrio de adsorción obtenidos por el modelo de Langmuir, se utilizó el método de van't Hoff no lineal para describir el comportamiento adsorbente de la hidroxiapatita α-LA. Por lo tanto, los parámetros termodinámicos DH 0 anuncio, Ds 

0 anuncio y? G 0 

anuncio se determinaron 18 utilizando las ecuaciones 7-9.RESULTADOS Y DISCUSIÓNLas isotermas de adsorción de a en HALa Figura 1 muestra las isotermas de adsorción de α-la en pH 4.0 (a) 6,0 (b) y 8.0 (c).

 

Figura 1. isotermas para la adsorción de HA-α la: a) pH 4,0 b) pH 6,0 c) pH 8,0

Y en la Tabla 1 tiene equilibrios de adsorción de α-la hidroxiapatita analizadas las condiciones de temperatura: 5, 15, 25 y 35 ° C.El modelo de Langmuir cuyos parámetros se muestra en la Tabla 1, se ajustó a los datos experimentales. Los coeficientes de correlación fueron superiores a 0,90 en todos los casos.

 

 

La dependencia de los parámetros Q m k d en función del pH y la temperatura se determinó mediante el análisis de regresión (Ecuación 11 y la ecuación 12, respectivamente). Los resultados mostraron un buen ajuste y todos los parámetros de la ecuación fueron significativas al 5% de probabilidad. Los superficies de respuesta para los parámetros q m k d, el modelo de Langmuir se puede observar en las figuras 2 y 3.

 

 

 

Figura 2. Variación q m como una función del pH y de la temperatura

 

 

Figura 3. Variación k d en función del pH y de la temperatura

 

De acuerdo con las figuras 2 y 3 se observa que hay una mayor adsorción de α-la HA alrededor de pH 6,0 y 25 ° C.Varios parámetros experimentales pueden cambiar el comportamiento de la adsorción de proteínas en los intercambiadores de iones. Entre ellos, es el tipo de tampón usado,

la naturaleza de la co- y contra-iones en solución, temperatura, pH, fuerza iónica y la velocidad de flujo del eluyente. 13

Fontan, 18 estudiar el equilibrio de adsorción α en un intercambiador de iones, Streamline ® Q XL, encontrado valores de q m que van desde 426 hasta 355 mg g -

1 para el rango de temperatura de 10 a 40 ° C. Según él, el proceso de adsorción de α que esta resina de intercambio de aniones es exotérmica.Conrad et al. 15 estudió la adsorción de columna de lecho-α LA expandido de la resina con Streamline Fenil a temperatura ambiente y obtiene un valor de q m 19,28 mg g -1. Tercinier et al. 26 reportaron un valor de q m de aproximadamente 81 mg g -1a 25 ° C para la adsorción de proteína de suero (WPI) en hidroxiapatita.Según Tercinier et al. 26 proteínas de la leche de adsorción en partículas de hidroxiapatita no ha sido reportado en la literatura.Hay algunos estudios sobre las interacciones entre las proteínas de la leche y de HA para biomateriales como el hueso o compuestos para la odontología. 27 Ritzoulis et al. 28 utilizaron la unión característica en hidroxiapatita a una cerámica porosa compuesta de proteína de la caseína caseinato de sodio y de hidroxiapatita. Devold et al., 29 de estudiar la adsorción in vitro de proteínas en el esmalte de los dientes de leche, mostraron que a pH neutro, preferiblemente caseínas se han relacionado con el esmalte dental, de formación de película proteínas.Análisis termodinámicoLos parámetros termodinámicos DH 0 anuncio,? G 0 

ad y Ds 0 anuncio se determinaron

como una función de la temperatura para la adsorción de operación α en hidroxiapatita mediante análisis no lineal van't Hoff trama. El pH de 6.0 fue elegido para el análisis termodinámico de los más altos valores de q m se observaron en este pH. El segundo ajuste polinómico orden del lnk de datos'frente a 1 / T se muestra en la Figura 4.

Figura 4. Van't Hoff Gráfico - lnk "frente a 1 / T

 

La ecuación de la polinomio de segundo grado ajustado a los datos experimentales mostrados en la Figura 4 es:

 

 

Por lo tanto, los valores de DH 0 d,? G 0 ad y Ds 0 

d se calcularon usando las ecuaciones 7 a 9. Las figuras 5 a 7 muestran el comportamiento de cada uno de estos parámetros termodinámicos dependiendo de la temperatura, con sus valores en cada temperatura de trabajo se muestran en la Tabla 2.

 

Figura 5. Variación de DH 0 anuncio con la temperatura

 

 

Figura 6. La variación de Ds 0 anuncio con la temperatura

 

 

Figura 7. Variación de? G 0 anuncio con la temperatura

 

 

Se ha encontrado que al aumentar la temperatura, hubo una disminución en la entalpía de adsorción, la entropía de la adsorción y la energía libre de Gibbs de la adsorción, y esta relación es lineal.Así se puede decir que las condiciones estudiadas, el proceso de α-it adsorción sobre hidroxiapatita es endotérmica, ya que todos los valores de DH 0 

anuncio fue positivo y la dependencia del valor DH 0 

anuncio con la temperatura es pequeña, si bien se observa una disminución de la entalpía de adsorción con el aumento en la temperatura. Fontan 18 señaló también el mismo comportamiento tendencia para DH 0 

anuncio en la evaluación de los termodinámica de la adsorción de a en resina de intercambio de aniones (Streamline ® Q XL). Los valores observados fueron similares a los obtenidos para la hidroxiapatita.Además, se encontró que el proceso es conducido entrópicamente, debido al hecho de que el término T · Ds 0 

anuncio en un valor más alto que el DH 0 ad para todas las

temperaturas estudiadas, que asegura una contribución entropía más alta de adsorción que la entalpía de adsorción, incluso si la diferencia entre estos valores es relativamente pequeño.Fontan, 18 estudiar el equilibrio de adsorción α en un intercambiador de iones, Streamline ® Q XL, encontró valores de DH 0

anuncio que van desde 25 hasta 0,5 kJ mol -

1 en el rango de temperatura de 10-40 ° C. Los valores Ds 0 d varió de 70 a 150 J mol-

1 K -1 y Delta G valora 0 d varió de -20 a -16.5 kJ mol -1. Como se observa en el

presente artículo, los parámetros termodinámicos analizados por Fontan 18 disminuyeron al aumentar la temperatura y ambos procesos eran endotérmica, dirigida entrópicamente y ocurrieron espontáneamente.El alpha se considera una proteína suave 30 que puede explicar la facilidad con la que sus cambios de conformación, sin soltar o absorber grandes cantidades de energía, es decir sin variar significativamente la entalpía del sistema. Por el mismo motivo, los cambios de conformación con o sin grupos de liberación, tales como moléculas de agua, también no alteró significativamente la entropía del sistema. Sin embargo, la contribución de estos cambios conformacionales en la entropía es ligeramente mayor que la contribución entálpico, haciendo el proceso entrópicamente conducido, ya que pueden haber cambios en la conformación de la α-la cuando se adsorbe en la superficie de la hidroxiapatita.Figura 7 permite afirmar que la energía libre de Gibbs de adsorción,? G 0 

d es negativo y disminuye al aumentar la temperatura, lo que indica que el proceso de adsorción es espontánea en las condiciones estudiadas y tiende espontáneamente a ser más pronunciada a temperaturas más alto.

 

CONCLUSIÓNEn este trabajo el comportamiento de adsorción de α-lactoalbúmina en hidroxiapatita mediante la obtención de las isotermas de adsorción con posterior análisis de los

parámetros termodinámicos del proceso de adsorción. Se observó una tendencia de aumento de los valores q m al aumentar la temperatura. La adsorción se produjo con mayor intensidad a pH 6,0 y 25 ° C. El análisis termodinámico permitió la determinación de los datos de los cambios en la entalpía (DH 0 

ad), entropía (Ds 0 anuncio) y

energía libre de Gibbs(? G 0 d) la adsorción, la observación de una reducción de la misma al aumentar la temperatura. El estudiado la adsorción de a que en HA es un proceso impulsado endotérmica y la entropía. La variación de la energía libre de Gibbs adsorción fue negativo, lo que indica que el fenómeno de adsorción es espontánea en las condiciones estudiadas.

 

AgradecimientosEn la Fundación del Estado de Minas Gerais Investigación (FAPEMIG) y el Consejo Nacional de Desarrollo Científico y Tecnológico (CNPq) de apoyo financiero.

 

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