la activación del complejo nlrp3

7/24/2019 La Activacin Del Complejo NLRP3

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La activacin del complejo NLRP3 inlfamasoma no es requerido para lamuerte por estrs inducido de islotes pancreticos

AbstractoLa diabetes tipo 2 produce la perdida de las clulas beta del pncreas. El estrsER, el estrs oxidativo y las altas concentraciones de glucosa producen la

apoptosis de las clulas de los islotes, y no solo eso sino que tambin puedenactivar el infamasoma NLR! que conduce a la producci"n de interleucina #L$%beta y caspasa$% dependiente de pyroptoisis.*pyroptosis: es una estrategia antimicrobiana porque de ciertas molculas, donde unaclula husped infectada, muerte para alertar las clulas vecinas sanas a la presenciade un intruso bacteriano.&in embargo, est en duda que la activaci"n de interleucina #L$%beta y elinl'amasoma NLR!, sean 'actores intr(nsecos a la muerte de las clulas beta.)s( se examin" a un rat"n que carecen de NLR! o caspasa$%, el cual seexpuso a per"xido de *idrogeno, rotenona o t*apsigargin que lo condu+eron ala muerte tal como uno salva+e. Esto sugiere que el estrs oxidativo o estrs delER no causan la muerte celular mediad por infamasoma. el mismo modo la

carencia de los componentes de infamasoma NLR! no proporciona ningunaprotecci"n 'rente a la glucosa, ribosa o glucolipotoxicidad. -inalmente, laactivaci"n gentica de NLR!, no aumento la producci"n de #nterlucina o lamuerte celular. En resumen, el aumento de glucosa, el estrs ER y el oxidativo,no son dependeitende de la activaci"n del infamasoma.

INTR!"##I$N&egn estudios en *umanos y algunos animales, la prdida de masa de lasclulas beta del pncreas se produce debido a la diabetes tipo 2, algunasmuestras *istol"gicas, de+an en evidencia una reducci"n de la masa de lasclulas beta y el aumento de desoxinucleotidil trans'erasa terminal /tnel0, quees mtodo para detectar )N 'ragmenteado mediente el etiquetado del

extremo terminal de acidos nucleicos. La glucosa plasmtica elevada escaracter(stica de los diabticos y la exposici"n cr"nica a estas concentracionescausa la apoptosis de las clulas beta, la cual se debe a la activaci"n de la v(aintr(nseca de apoptosis. El proapopt"tico 1!, solo en prote(nas, susactivadores 1#3 y 43), +unto con sus e'ectores 1)5, son importantesmediadores de la toxicidad de la glucosa, los cuales se observaron en losislotes con diabetes de tipo 2. &e *a in'ormado que la exposici"n a altasconcentraciones de glucosa induce a la producci"n de #L$%beta, la cual es elresultado de la activaci"n del infamosoma, la cual depende de dos se6ales7$La se6al %, aumenta la concentraci"n de pro #L$%beta, en respuesta a la uni"nde ligandos a receptores tipo toll /8LR0, los cuales activan la producci"n decitoquinas. Este ligando en estudios in$vitro, pueden ser lipopolisacaridos /L&0,

mientras que el colesterol LL o acidos grasos libres pueden ser un seres vivos.$La se6al 2, permite el ensambla+e del infamosoma NLR! o o la 'ormaci"n delcomple+o NlR!$)&9$porcaspasa$%, para la activaci"n de caspasa$%, la cualpasa la pro#L$%beta a #L$%beta, que puede ser secretada por la celula.&ustancias como cristales de colesterol, nigericina, alumbre y cido urico *andemostrado que activan el infamosoma.

)lgunas sustancias como la glucosa, algunas drogas como t*apsigargin,tunicamicina o rotenona, pueden producir tanto la se6al % como la 2.


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La acumulaci"n de radicales libres /R:&0 produce la separaci"n de 8R5/tiorredoxina0 interactuando con 85N#, el cual libre se una a NLR!activndolo.)demas la activaci"n del infamosoma, puede conducir a la piroptosis, debido ala activaci"n de caspasas y liberaci"n de #L$%beta. Esta se caracteri;a por la

'ragmentaci"n del )N, *inc*a;"n celular y 'ormaci"n de poros en lamembrana.

La activaci"n de molculas #RE%$al'a y ER< en el estrs delreticuloendoplasmico, tambin pueden activar en infamosoma, a travs de laregulaci"n positiva de 85N#. &in embargo, la participaci"n de este gen escontroversial. 3ientras la anulaci"n de 85N# en la l(nea #N&$% de la celula betareduce la toxicidad de t*aspigargin, los islotes de ratones que carecen de estano estaban protegidos.Los macr"'agos expresan componentes del infamosoma, como NLR!, )&9 ycaspasa$%, y lo activan en respuesta a agentes pat"genos. &in embargo, se *ademostrado que su expresi"n en los islotes pancreticos es muc*o mas ba+o en

comparaci"n con los macrpg'acos derivados de la medula osea. )dems,aunque la expresi"n de8LR= e #L$%b se *a in'ormado anteriormente en*umanos y en islotes de rat"n y clulas beta 3#N>, la activaci"n delinfamasoma no se *a demostrado en las clulas beta convincentemente.)dems, un estudio reciente report" ausencia de 8LR= en beta de rata lasclulas, *aciendo que la comprensi"n del papel de estos 'actores en las clulasbeta sea ms complicada.

or lo tanto, decidimos directamente examinar si la supresi"n de loscomponentes de infamasoma en los islotes protege contra la muerte celular.Nuestros resultados muestran que la supresi"n de los componentes delinfamasoma no a'ecta a la apoptosis de los islotes en las clulas en respuesta

a la glucosa o productos qu(micos que inducen apoptosis oxidativa, Estrs ER,y que la activaci"n de NLR! en las clulas beta no lo *ace contribuir a laproducci"n de #L$%b y la muerte celular de los islotes.

%todosRatonesLos ratones de?cientes en caspasa$% se obtuvieron en Laboratorios @acAson en un'ondo N:BLt /N:.%2C&2 /1>0 $ 9asp%tm%&es* B L8@0 y retrocru;ados en el 'ondogentico 9D1LB> durante %F generaciones por el r. 1en 9roAer /GE#0. &e generaronratones mutantes *ypomor?cos NLR! /Nlrp!)!DFHneuR0 por el r. &usanna* 1rydgesy el r. al oIman.Estos ratones son e'ectivamente una mutacion con prdida de 'unci"n al ser criados

como *omocigotos sin 9RE recombinasa. or simplicidad de nomenclatura, estosratones *an sido llamados NLR!2B2 en este art(culo. Ratones mutantes NLR!)!DFH B)!DFH 'ueron criados con R#$9re de los Laboratorios @acAson /1>.9g$8g /#ns2$cre02D3gn B @0 para generar los ratones con el aumento de la actividad 'uncional NLR! enel pncreas clulas beta. 8odos los experimentos con animales se llevaron a cabo encumplimiento con el Jc"digo )ustraliano para el cuidado y uso de animales para ?nescient(?cos Jy 'ueron aprobadas por el &an Hicente de9omit de Ktica del ospital de )nimales /)E9 nmero de protocolo F%> B%%0.

Reactivos


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$glucosa /utili;ado en !!,! m30 y $ribosa /DF m30 'ueron adquiridos de #nvitrogen/#nvitrogen 9orporation, ran #sland, Nueva MorA0 y &igma$)ldric* /&t Louis, 3:0,respectivamente.9oncentraciones similares de L$glucosa o L$ribosa se utili;aron como *iperosmolaridadcontroles /datos no mostrados0 >O. 8apsigargina /utili;ado en D m30 se adquiri" de9albioc*em /armstadt, )lemania0 e #L$%Ra /utili;ado en D mg B mL0 se obtuvo de)mgen /8*ousand :aAs, 9)0. El per"xido de *idr"geno /2:2, &igma$ )ldric*0 se utili;"a F$=F m3, rotenona /&igma$)ldric*0 a %FF nm y lipopolisacrido /L&, &igma$)ldric*L2>!F, a partir de Esc*eric*ia coli F%%%7 1=0 a %FF n3. Estos reactivos se ensayaron atravs de una gama de concentraciones en los islotes de tipo salva+e para determinarla concentraci"n "ptima a usar para experimentos adicionales. El control decondiciones conten(a la misma concentraci"n de diluyente /3&: para rotenona yetanol para t*apsigargin0 en medio completo. almitato /&igma$)ldric*0 se utili;" a %m3 acoplados a cido graso libre %P de 1&) /Roc*e, 3ann*eim, )lemania0 y se a6adi"a %FP de suero que contiene medio para el tratamiento de los islotes.

)islamiento de islotes, cultivo y ensayo de 'ragmentaci"n de )N.&e aislaron islotes de Langer*ans tal como se describe anteriormente. Los islotes selavaron, recogidos a mano, y durante la noc*e se cultiv" a !u9 en DP de 9:2 en93RL medio$%F>> /#nvitrogen0 suplementado con %FF unidadesBml de penicilina, %FFmgBml de estreptomicina, 2 mmolBL glutamina, y %FP de -9& /@R 1iosciences, Lenexa,


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1lotting se reali;" utili;ando anti$caspasa$% /p2F0 a partir de )dipogen /9asper$%,)dipogen #nternational, &an iego, 9)0.

Lactato des*idrogenasa /L0 de ensayoLos islotes se cultivaron y se trataron como se *a descrito anteriormente para losexperimentos de Gestern 1lot. Los sobrenadantes se obtuvieron en el ?nal de loscultivos y las concentraciones de L se determinaron. 4n Ait disponiblecomercialmente de Roc*e se utili;" para el ensayo de L.

El anlisis estad(stico)nlisis estad(stico se reali;" utili;ando rap*ad rism &o'tTare /&an iego, 9)0.8odos los datos que se muestran en 'orma de gr?cos de barras son el promedio U&E3. Los datos 'ueron anali;ados por una v(a o dos )N:H) con 1on'erroni de unnett ode post test para la comparaci"n de varias columnas /segn sea apropiado0.

Resultados

Estrs oxidativo y el estrs ER no causan muerte celular de islotes mediada porel NLR! infamasoma.

3uerte celular causada por estrs oxidativo no es mediado por infamosomas.

El estrs oxidativo se *a demostrado que causa la activaci"n de lainfamasoma NLR!. En particular, existen pruebas de que R:& mitocondrial esun potente activador del comple+o NLR! en clulas no islotes. &e estudi" elpapel de la activaci"n infamasoma mitocondrial en la muerte celular mediadapor R:& en ambas l(neas celulares, beta e islotes primarios. N#8$% clulas betasensibles al estrs oxidativo 'ueron tratadas con %FF n3 rotenona para inducir

la producci"n de R:& mitocondrial. )unque la rotenona es capa; deproporcionar tanto la se6al % y 2, las clulas nunca 'ueron pre$tratadas con %FFng B ml de L& para aumentar al mximo el almacena+e celular de la pro$#L$%b.La muerte celular se cuanti?c" por la 'ragmentaci"n del )N, que es comn atodas las 'ormas conocidas de muerte celular programada. La in*ibici"n de laactividad de #L$%b con el antagonista del receptor de #L$%b /#L$%Ra, D mg B ml0no proporcion" ninguna protecci"n contra la 'ragmentaci"n del )N inducidapor rotenona. Esto demuestra que R:& mitocondrial no causa la muertedependiente de #L$%R en las clulas beta /-igura %)0. &igue siendo posible quela activaci"n infamasoma podr(a ocurrir en los macr"'agos residentes de losislotes u otras clulas no beta, dando como resultado la secreci"n de #L$%b ytoxicidad para las clulas beta. or lo tanto, islotes aislados de tipo salva+e,

Nlrp!2 B 2 y la caspasa %2B2 'ueron expuestos a rotenona durante 2 d(as. La'ragmentaci"n del )N 'ue similar en tipo salva+e y NLR! o islotes de?cientesen caspasa$% lo que sugiere que el estrs oxidativo 3itocondrial causa lamuerte de clulas de islote travs de v(as independientes de infamosomas/-igura %1 y 90. ara investigar ms a 'ondo la posible contribuci"n del estrsoxidativo, islotes de ambos, Nlrp!2 B 2 y ratones caspasa$%2B2, 'ueron expuestoa R:& sist"licos cultivndolas con per"xido de *idr"geno. La 'ragmentaci"n de)N inducida por per"xido de *idr"geno 'ue similar en islotes de tipo salva+e y


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AnocA$out, lo que indica que el NLR! infamasoma no es un mediador de lamuerte celular de islotes inducida por R:& citos"lico /-igura %0.3uerte inducida por el estrs ER no es mediada por infamasoma.ara examinar si el estrs ER podr(a causar muerte de clulas de islotemediada por infamasoma, islotes de tipo salva+e 'ueron tratados cont*apsigargin e #L$%Ra. La adici"n de #L$%Ra no protegi" los islotes de la

toxicidad t*apsigargin /-igura % 1 S E0 lo que indica que la muerte celularinducida por estrs ER en islotes no est mediada por la secreci"n de #L$%b.ara mayor con?rmaci"n, islotes Nlrp!2 B 2 y la caspasa$%2B2 'ueron incubadoscon D mm t*apsigargin durante D d(as. No *ubo di'erencia. &e observ" la'ragmentaci"n del )N entre los de tipo salva+e y Nlrp!2 B 2 o caspasa$%2B2, loque demuestra la toxicidad del estrs ER inducido en islote no implica laactivaci"n del infamasoma NLR!. /-igura %-0.

-igura =. mutaci"n en la activaci"n de NLR! no induce la escisi"n de caspasa$% en los islotes. /)0 9uatrocientos islotes aislados de tipo salva+e o 9re B URatones NLR!)!DFH B )!DFH 'ueron cultivadas en % ml de medio que conten(aglucosa !!,! m3 o DF m3 ribosa durante 2,D d(as y la concentraci"n de #L$%ben el sobrenadante se cuanti?c" por EL#&). #slotes de control se incubaron enun medio que contiene glucosa D,D m3. 3acr"'agos tratados durante la noc*econ % m3 de palmitato 'ueron utili;ados como control positivo. Los resultadosson la media V &E3 de n W !$= experimentos independientes. /109uatrocientos islotes B muestra 'ueron cultivados en medio de control que

contiene %P de 1&) y %FF L& nm o un medio que contiene %P de 1&), %FFnm L&, glucosa !!,! m3 y palmitato de % m3 durante 2,D d(as. Los lisados seprepararon en tamp"n R#) y Gestern blot para la caspasa$% /entero, -L otroceados, p2F0 se reali;". Los genotipos %7U B U NLR! U B U, 27 9re B U NLR! U B U, !7 U B U NLR!)!DFH B )!DFH y =79re B U NLR!)!DFH B )!DFH. 9omo control positivo, los macr"'agos de tiposalva+e /)0 y caspasa$%2B2 /10 'ueron tratados con L& U 1&) U glucosa Ualmitato de 2= * o L& U nigericina para % *.


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4na alta concentraci"n de glucosa no causa muerte celular mediada por NLR!infamasoma en islotes.La posibilidad de que la muerte inducida por la glucosa 'uera por la activaci"ninfamasoma en los islotes 'ue estudiada. )dems de glucosa, *emos probadola toxicidad de los islotes a la ribosa a;car reductor, similar a la glucosa,induce la muerte de clulas de islote a travs glicaci"n y la 'ormaci"n de R:&

!DO. #slotes que carecen de NLR! o caspasa$% 'uncional no 'ueron protegidosde la toxicidad de la ribosa /-igura 2 ), 1 y 90. ara descartar cualquierposibilidad de una dbil se6al$%, islotes tambin se cultivaron en la presenciade L& para aumentar la concentraci"n de la pro$#L$%b. &in embargo, la adici"nde L& no *i;o aumentar la muerte celular de los islotes inducida por la ribosaen comparaci"n con los de tipo salva+eX no vimos ningn tipo de protecci"n enislotes 9)&)&E%2 B 2 tratados con L& U ribosa /-igura 20. #slotes enterostambin 'ueron tratados con palmitato de % m3 /con+ugado a %P de 1&) enmedio que contiene %FP de suero0 en presencia o ausencia de glucosa !!,!m3 para estudiar si la presencia combinada de glucosa y palmitato/glucolipotoxicity0 se requiere para causar la secreci"n de #L$%b signi?cativo. Novimos la muerte celular sustancial en islotes enteros despus de la exposici"n

a palmitato solo, sin embargo, la exposici"n de islotes de palmitato y glucosa+untos caus" mayor muerte celular. &upresi"n de la caspasa$% a partir deislotes no le *i;o proporcionar ninguna protecci"n contra glucolipotoxicity/-igura 2E0. Estos resultados, +unto con nuestros resultados anteriores de que lade?ciencia de receptores #L$% no proteg(an islotes de la toxicidad de la glucosa>O, muestran que ni la activaci"n del comple+o$NLR! infamasoma, ni #L$roducci"n %b median la muerte de clulas de islote en respuesta a la alta lasconcentraciones de la glucosa.

3utaci"n en la activaci"n de NLR! espec(?co de clulas beta no resulta en laproducci"n de #L$%b o ampli?ca toxicidad de la glucosaara determinar si la activaci"n constitutiva de NLR! en beta clulas

exacerbar(an toxicidad de la glucosa, aislamos islotes de ratones con unamutaci"n activadora de NLR! *umana golpeado en locus NLR! delraton/NLR!)!DFH B )!DFH0 !FO. Esta mutaci"n es controlada por la en;ima9re, por lo que mediante el cruce de la NLR!)!DFH B )!DFH ratones mutantes,que expresan 9re ba+o el control de la rata promotor de insulina /R#$9re0,*emos generado ratones mutantes de NLR! en niveles end"genos pero s"loen las clulas beta del pncreas. La expresi"n con xito de NLR! mutante enlas clulas beta del rat"n 'ue con?rmado por 9R usando )N de islotespuri?cados /-igura !)0. Esta mutaci"n es claramente activa, ya que los ratonescru;ados a Lys3$9re no sobrevivieronn ms all de %= d(as, sin embargo losratones NLR!)!DFH B )!DFH B R# cre no tienen cualquier 'enotipo mani?esto/datos no mostrados0. &i las clulas beta son capaces de producir #L$%bsigni?cativa en respuesta a la glucosa o la exposici"n ribosa, a continuaci"n,islotes con NLR! constitutiva deber(an producir incluso mayores cantidades de#L$%b que resulta en la ampli?caci"n de la glucosa o la toxicidad de la ribosa.9ontrariamente a esta expectativa, se observ" que los islotes con NLR!mutante no lo *icieron, no mostraron aumento en la toxicidad de la ribosa encomparaci"n con los controles /-igura !10. &e midi" la #L$%b producidomediante el cultivo de =FF islotes en % ml medio de cultivo con DF m3 ribosa oglucosa !!,! m3 durante 2,D d(as. &e *a demostrado previamente que las


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altas concentraciones de glucosa ni inducen secreci"n de #L$%b, ni a'ectan suexpresi"n en clulas dendr(ticas cultivadas %O. or lo tanto, los macr"'agos detipo salva+e cultivados con palmitato se incluyeron como un control positivo. &erecogi" el sobrenadante y la concentraci"n de #L$%b se determin" por EL#&). )ligual que en nuestra anterior conclusi"n >O, 'uimos incapa; de detectarcualquier #L$%b en sobrenadantes de islotes de tipo salva+e tratados con ribosa

o glucosa. )dems, la concentraci"n de #L$%b mantenido por deba+o del umbralde detecci"n incluso en los sobrenadantes de islotes mutantes NLR! tratadoscon ribosa o glucosa /-igura =)0. En contraste, %%!.>=.C pg B ml de #L$%b /n W=0 'ue detectado en los sobrenadantes de macr"'agos tratados con palmitato/-igura =)0. ara probar glucolipotoxicity, islotes 'ueron tratados con !!,! m3de glucosa y % m3 de palmitato al con+ugarse con %P de 1&) en la presenciade %FF n3 L& durante 2,D d(as. #slotes de control 'ueron tratados con L& y%P de 1&). #L$%b era detectable en extremadamente ba+os niveles en lossobrenadantes de los islotes de tipo salva+e. En islotes mutantes de NLR!,esta concentraci"n #L$%b se mantuvo sin cambios/-igura &% )0. Estos resultados indican que las clulas beta carecen de lacapacidad para producir su?ciente #L$%b que podr(a *acer una notable

contribuci"n a la muerte celular mediada por palmitato +unto con glucosa.

3utaci"n en la activaci"n de NLR! espec(?co de clulas beta no causa laescisi"n de caspasa$% en los islotesor ltimo, se anali;" si la activaci"n de NLR! intr(nseca podr(a causarescisi"n de caspasa$% y, por lo tanto, resultar en pyroptosis de las clulas beta.&e detect" ro$caspasa$% en los islotes L& tratados, pero la adici"n depalmitato y glucosa al medio de cultivo no indu+o la escisi"n en cualquiera delos tipos salva+e o los que expresan mutaci"n NLR! /-igura =10. En contraste,se observ" escisi"n de caspasa$% en los macr"'agos sensibili;ados con L& yluego se trat" con glucosa y palmitato, o nigericin como control positivo /-igura=10. La 'ragmentaci"n de )N es una caracter(stica de pyroptosis y no se vio

anteriormente una reducci"n en la 'ragmentaci"n del )N en los islotesde?cientes de caspasa$% /-igura 21$E0. El tratamiento con glucosa y palmitatodurante 2,D d(as dio lugar a una mayor concentraci"n de L en elsobrenadante, pero la muerte celular 'ue similar en tipo silvestre, as( comoislotes NLR! mutantes /-igura &%10. Estos *alla;gos indican queglucolipotoxicity no induce pyroptosis de las clulas beta.

iscusi"nEn este estudio, *emos investigado si la exposici"n de los islotes al estrspodr(a causar la muerte de clulas de islote mediada por infamasoma. No seencontr" un papel signi?cativo para los infamasoma NLR! o #L$%b en ladestrucci"n de clulas de los islotes en respuesta a las altas concentracionesde glucosa o productos qu(micos que inducen el estrs ER o el estrs oxidativo.Estudios previos mostraron que la exposici"n de islotes *umanos a glucosa!!,! m3 durante D d(as dan lugar a un nivel muy ba+o de la secreci"n de #L$%bC,%2O. el mismo modo en los islotes de rat"n, las concentraciones altas deglucosa o el estrs ER inducido por la droga t*apsigargin caus" una producci"nde modesta cantidad de #L$%b /2F a =F pg B ml0 que 'ue derogada en los islotesque carecen NLR! o 85N#. Estos estudios sugirieron que todo el #L$%bproducido como resultado de la incubaci"n con glucosa o t*apsigargin 'ue


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responsable de la muerte de clulas de los islotes. &in embargo, el'undamental experimento de incubaci"n de islotes que carecen decomponentes infamasoma o #L$% receptores con el est(mulo t"xico no se *i;o.9uando nosotros reali;amos este experimento, se encontr" que la prdida de'uncionalidad en 'actores infamasoma, NLR! o caspasa$%, no in*ibieron latoxicidad de la glucosa, el estrs ER o la muerte por estrs oxidativo de clulas

de los islotes. Estos resultados estn de acuerdo con los datos previos quedemuestran que los islotes que carecen receptores #L$% no estn protegidos dela toxicidad de la glucosa. e acuerdo con nuestros resultados, otro estudiomostr" que el tratamiento de islotes *umanos aislados con alta concentraci"nde glucosa para un mximo de d(as, no induc(an la secreci"n de #L$%b nia'ectaba la expresi"n de genes #L$%b. Nuestros datos tambin estn de acuerdocon el concepto de que los islotes de ratones no son susceptibles a ladestrucci"n por #L$%b por s( solos, sino que requieren la adici"n de #L$%b U #-N9para inducir la muerte celular signi?cativa. &in embargo, con las di'erencias enla 'uente /*umana vs. rat"n0 de islotes, el nmero de islotes, condiciones decultivo, las concentraciones de 'rmaco, di'erencias entre las diversas l(neas declulas beta y ensayos usados para medir la muerte celular y la actividad

infamasoma no se puede descartar como posibles explicaciones para lasdi'erencias entre nuestros datos y los resultados de algunos de los estudiosprevios. or e+emplo, 3aedler y sus colegas cultivaron islotes *umanos durante2 d(as en placas de matri; recubierta extracelulares permitiendo que las clulasse ad*irieran y expandieran antes de tratar los islotes con glucosa que llev" ala secreci"n de #L$%b. or otro lado tenemos, entre otros, islotes cultivados enplacas de etri no revestidos y los trataban con diversos reactivos despus de2= *ora de aislamiento. El ensayo de 'ragmentaci"n del )N que se utili;" ennuestros experimentos tiene la venta+a de que anali;amos %F.FFF clulas pormuestra, lo que *ace de este un mtodo altamente sensible para recoger datossutiles. ) pesar de que clulas trypsini;ing *ace a algunos inducir la muertecelular /)N de 'ondo 'ragmentado siempre por deba+o del %FP0, la proporci"n

de clulas muertas como resultado de trypsini;ing 'ue consistente en todos losgrupos de tratamiento. &in embargo, no podemos descartar la posibilidad deque los peque6os aumentos en la muerte celular de los islotes inducida por #L$%b podr(a *aber sido enmascarada por la muerte celular inducida portripsini;aci"n. :tra advertencia es el uso de L& en nuestro estudio parainducir la se6al % en los islotes, donde es posible que otros agentes, tales comoam29&


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Estudios en animales y *umanos *an demostrado que la alta concentraci"n deglucosa induce estrs oxidativo y estrs ER en los islotes. )umento de laproducci"n mitocondrial de R:& en clulas no de islotes, tales comomacr"'agos 8% o derivados de la mdula "sea provocaron la activaci"n delinfamasoma y liberaci"n de #L$ %b. el mismo modo, la liberaci"n de #L %b delos islotes de glucosa tratada 'ue in*ibida por el tratamiento con in*ibidores de

R:& %!O. Estrs ER inducido por reactivos tales como t*apsigarin ytunicamicina tambin causa la liberaci"n de #L$%b de las clulas no islotes,l(neas de clulas beta e islotes primarias. )dems de la liberaci"n de #L$%b,

85N# 'ue regualada por estos productos qu(micos. Estos estudios concluyeronque el estrs ER y la activaci"n, inducida por infamasome , de estrs oxidativoen los islotes es mediada por 85N#,sin embargo, una relaci"n directa entre

85N# y activaci"n infamasoma no se demostr" 'ormalmente en los islotes.Laactivaci"n de infamasoma 85N#$dependiente puede no ser importante para latoxicidad de los islotes. La de?ciencia de 85N# *i;o proteger a los islotes de latoxicidad de la glucosa, pero esto puede ser debido a la mayor actividadantioxidante de tiorredoxina en la ausencia de 85N#, independiente decualquier e'ecto sobre la infamasoma. En conclusi"n, nuestros resultados

muestran claramente que la activaci"n de la infamasoma no media la muertecelular de los islotes en respuesta a la alta concentraciones de glucosa, estrsER o el estrs oxidativo. odr(a ser posible que los islotes produ;can peque6ascantidades de #L$%b en respuesta a estos est(mulos, pero por s( mismo no essu?ciente para causar la muerte sustancial in vitro. eque6as cantidades de #L%b pueden aumentar la expresi"n de quimiocinas como 959L% en las clulasbeta, 'acilitando as( la reclutamiento de clulas inmunes en los islotes. 3straba+o ser requerido para determinar si la activaci"n de infamasoma ba+o elfu+o de toxicidad de la glucosa o el estrs ER tiene e'ectos adversos sobre la'unci"n de las clulas beta, incluyendo la bios(ntesis de insulina y la liberaci"nde insulina estimulada por glucosa. En la diabetes tipo 2, *ay un aumento en laconcentraci"n de sustancias tales como glucosa, cidos grasos saturados y

cidos grasos insaturados, #), y citoquinas circulantes. Es probable que estostambin sean capaces de inducir la producci"n de #L$%b por macr"'agos en elte+ido adiposo y otros te+idos tal como islotes. &in embargo, nuestros datosmuestran que, si bien estos 'actores circulantes a'ectan la viabilidad de losislotes directamente, es menos probable que causen la muerte de clulas deislote mediante la producci"n de #L$%b de manera aut"noma en las clulasbeta.

la activación del complejo nlrp3

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