602 310.02

Kit ELISA para medición de la 25-hidroxivitamina D2 y D3 en plasma y suero

INSTRUCCIONES DE USO

2

Para uso diagnóstico in vitro

Calibrador 0

Número de catálogo Calibradores 1-5

Código de lote

Controles

96 96 pruebas

Tampón de incubación

Proteger de la luz del sol

Tampón de conjugado

Fecha de caducidad

Concentrado de conjugado 25OHD

Almacenar a entre 2 y 8 °C

Concentrado de SA-HRP

No reutilizar

Concentrado de solución de lavado (x200)

Consultar las instrucciones de uso

Solución de sustrato

Liofilizado

Solución de parada

3

INSTRUCCIONES DE USO Español Nota: Otros idiomas disponibles en www.biohithealthcare.com.

Kit BIOHIT Total 25OH Vitamin D Elisa N.º Cat. 602 310.02

CONTENIDO INSTRUCCIONES DE USO Español ............................................................................... 3

1. USO PREVISTO ......................................................................................................................... 5

2. ANTECEDENTES ....................................................................................................................... 5

3. PRINCIPIOS DE LA PRUEBA .................................................................................................... 6

4. ADVERTENCIAS Y PRECAUCIONES........................................................................................ 6

5. TRAZABILIDAD DE LOS VALORES ........................................................................................... 7

6. CONTENIDO DEL KIT ................................................................................................................ 7

6.1 Microplaca ............................................................................................................................. 7

6.2 Calibrador 0 ........................................................................................................................... 7

6.3 Calibradores 1-5 .................................................................................................................... 7

6.4 Controles ............................................................................................................................... 7

6.5 Tampón de incubación .......................................................................................................... 8

6.6 Concentrado de tampón de lavado ........................................................................................ 8

6.7 Tampón de conjugado ........................................................................................................... 8

6.8 Concentrado de conjugado 25(OH)D..................................................................................... 8

6.9 Concentrado de SA-HRP....................................................................................................... 8

6.10 Solución de sustrato ............................................................................................................ 9

6.11 Solución de parada .............................................................................................................. 9

6.12 Instrucciones de uso ............................................................................................................ 9 7. MATERIALES NECESARIOS QUE NO SE SUMINISTRAN ....................................................... 9

8. ALMACENAMIENTO Y ESTABILIDAD ....................................................................................... 9

9. OBTENCIÓN DE MUESTRAS Y MANIPULACIÓN ................................................................... 10

10. MÉTODO ANALÍTICO ............................................................................................................ 11

10.1 Preparaciones preliminares ............................................................................................... 11

10.2 Protocolo del ensayo ......................................................................................................... 11

10.3 Método automatizado ........................................................................................................ 12 11. RESULTADOS ........................................................................................................................ 12

11.1 Valores del control de calidad ............................................................................................ 12

11.2 Cálculo de resultados y datos típicos ................................................................................. 12

11.3 Interpretación de los resultados e intervalos de referencia biológicos ................................ 14 12. LIMITACIONES DEL PROCEDIMIENTO ................................................................................ 14

13. CARACTERÍSTICAS DE LOS RESULTADOS ANALÍTICOS .................................................. 14

13.1 Límite de detección y límite de cuantificación .................................................................... 14

13.2 Rango de notificación ........................................................................................................ 15

4

13.3 Precisión ........................................................................................................................... 15

13.4 Especificidad analítica ....................................................................................................... 15

13.5 Interferencia ...................................................................................................................... 16

13.6 Recuperación y linealidad .................................................................................................. 16

13.7 Comparación de los métodos ............................................................................................ 17 14. BIBLIOGRAFÍA ....................................................................................................................... 18

15. FECHA DE PUBLICACIÓN ..................................................................................................... 19

16. GARANTÍA ............................................................................................................................. 19

17. INFORMACIÓN SOBRE PEDIDOS ........................................................................................ 19

18. BREVE DESCRIPCIÓN DEL PROCEDIMIENTO ................................................................... 20

5

1. USO PREVISTO El ensayo BIOHIT Total 25OH Vitamin D ELISA es un ensayo inmunoenzimático cuantitativo para la determinación in vitro de la 25-hidroxivitamina D2 y D3 (25(OH)D2 y 25(OH)D3) en suero y plasma que facilita el diagnóstico de la deficiencia, insuficiencia o intoxicación por vitamina D.

2. ANTECEDENTES Vitamina D representa el nombre que se asigna habitualmente a un grupo de prohormones esteroides liposolubles que son extremadamente importantes en numerosos aspectos de la salud humana. Las dos formas relevantes para el ser humano son la vitamina D2, o ergocalciferol, y la vitamina D3, o colecalciferol. Las vitaminas D2 y D3 están presentes de forma natural en determinados alimentos, y también se añaden a numerosos productos alimenticios. En muchos países se recomienda ingerir suplementos de vitamina D mediante complementos dietéticos, especialmente durante el embarazo, y cuando la exposición al sol se ve limitada por motivos climatológicos o culturales. (1-3) Principalmente, el organismo metaboliza la vitamina D3 como 25-hidroxilado (25(OH)D3, también conocido como calcidiol). La vitamina D3 se metaboliza en 25-hidroxivitamina D3 en el hígado, y recientemente se ha observado que la vitamina 25(OH)D3 también está disponible directamente en algunos alimentos de origen animal. La vitamina 25(OH)D3 presenta una actividad limitada por sí misma y es precursora de otros metabolitos de la vitamina D. El derivado más activo de la vitamina D3 es la 1,25-hidroxivitamina D3, o calcitriol, que es producida por el riñón a partir de la vitamina 25(OH)D3. La vitamina D2 se metaboliza fundamentalmente de forma similar a la vitamina D3, y ambas formas contribuyen al estado general de la vitamina D. Por lo tanto, para diagnosticar de forma precisa la deficiencia de vitamina D, resulta esencial medir ambas formas, D2 y D3, de la vitamina D. La alternativa más fiable para determinar el estado de la vitamina D de un individuo es medir el nivel de 25(OH)D en sangre. La vitamina 25(OH)D presenta una semivida en circulación relativamente larga, de 15 días, y el nivel de 25(OH)D en circulación sirve de indicación de la vitamina D obtenida por ingesta de alimentos y complementos dietéticos y de la vitamina D producida en la piel. (1-9) La vitamina 25(OH)D estimula la absorción intestinal tanto del calcio como del fósforo, y afecta a la reabsorción y la mineralización óseas. La deficiencia de vitamina D puede provocar el debilitamiento de los huesos: es un factor de riesgo importante de raquitismo, osteomalacia y osteoporosis senil. La medición de las vitaminas 25(OH)D2 y 25(OH)D3 también resulta necesaria para determinar la causa de concentraciones anómalas de calcio en suero. Niveles excesivamente elevados de vitamina D (intoxicación por vitamina D) pueden provocar daños en los riñones y en tejidos. Se ha observado que la vitamina D tiene otras funciones en el organismo, incluida la modulación del crecimiento celular, la función neuromuscular e inmunológica y la reducción de la inflamación. También se ha confirmado la relación entre el deterioro cognitivo, la demencia y la deficiencia de vitamina D. Literatura reciente también ha presentado nuevas pruebas de la posible intervención de la vitamina D en cáncer, diabetes y en el desenlace del embarazo. (1-6, 10-16)

6

3. PRINCIPIOS DE LA PRUEBA El ensayo BIOHIT Total 25OH Vitamin D ELISA es un ensayo competitivo de inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA) que se realiza en placas de microtitulación. En primer lugar, se añaden la muestra, los controles y los calibradores a los pocillos de la placa de microvaloración e, inmediatamente, se añade el amortiguador de incubación. Durante la fase de incubación de 2 horas a temperatura ambiente, la vitamina 25(OH)D se disocia de las proteínas séricas/plasmáticas y se fija a un anticuerpo monoclonal específico que recubre la superficie del pocillo. Se lavan los pocillos para eliminar los componentes no unidos. A continuación, se añade al pocillo una cantidad fija de derivado de vitamina 25(OH)D marcada con biotina junto con peroxidasa de rábano picante (HRP) marcada con estreptavidina. Durante la incubación posterior, la vitamina 25(OH)D marcada y la vitamina 25(OH)D sin marcar fijada al anticuerpo compiten entre sí por los sitios de fijación del anticuerpo. A continuación, se lavan los pocillos para eliminar los materiales no unidos y se añade un sustrato cromogénico (tetrametilbencidina, TMB). Después de 15 minutos de incubación, la reacción se interrumpe al añadir solución de parada y se realiza la medición de la intensidad del color desarrollada. La concentración de vitamina 25(OH)D es inversamente proporcional al color generado y puede calcularse mediante la interpolación de dosis a partir de la curva de calibración.

4. ADVERTENCIAS Y PRECAUCIONES Para uso diagnóstico in vitro. PRECAUCIÓN: Trate las muestras de plasma como material con posible riesgo biológico. Todas las muestras deben considerarse potencialmente contaminadas y tratarse como si fueran infecciosas. Consulte la publicación del Dr. Bethesda, «Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories», 1999, 4ª ed. (CDC/NIH) y nº (CDC) 88-8395, de la Agencia estadounidense de sanidad y servicios humanos; en ella se recogen informes sobre los procedimientos de seguridad del laboratorio relacionados con distintas enfermedades o sobre cualquier otra normativa local o nacional. Este kit contiene reactivos fabricados a partir de componentes de sangre humana. Los materiales de origen incluidos en el kit han sido analizados en busca de anticuerpos contra la hepatitis B y C, así como de anticuerpos contra el VIH, y se ha determinado que son negativos. No obstante, ningún método de análisis puede ofrecer una garantía absoluta de ausencia de estos patógenos; por lo tanto, deben cumplirse todas las precauciones recomendadas para la manipulación de una sustancia derivada de la sangre humana. Todos los productos y derivados animales han sido obtenidos de animales sanos. Los componentes bovinos proceden de países en los que no se han notificado casos de EEB. No obstante, los componentes que contienen sustancias animales deben tratarse como potencialmente infecciosos. Utilice siempre guantes protectores cuando manipule muestras de pacientes. Utilice un dispositivo de seguridad durante el pipeteo. No use la pipeta con la boca. Lea las instrucciones en su totalidad antes de llevar a cabo este ensayo. Los componentes que contienen ProClin pueden provocar una reacción alérgica en la piel (véase la Ficha de datos de seguridad). Las soluciones que contienen ProClin deben desecharse de conformidad con la normativa local sobre tratamiento de residuos. La solución de

7

interrupción contiene HCl (véase la Ficha de datos de seguridad). En caso de contacto, lavar con abundante agua. Amortiguador de incubación contiene PFOA, ácido perfluorooctanoico (véase la Ficha de datos de seguridad). En caso de contacto, lavar con abundante agua y jabón.

5. TRAZABILIDAD DE LOS VALORES La prueba se calibra mediante el procedimiento de medición de referencia ID-LC/MS-MS (método de Ghent) (17-18), aprobado por el programa Vitamin D Standardization Program (VDSP) de la Oficina de Complementos Dietéticos (Office of Dietary Supplement, ODS) de los Institutos Nacionales de la Salud (NIH).

6. CONTENIDO DEL KIT Los reactivos incluidos son suficientes para 96 pocillos. No deben mezclarse reactivos de lotes de kits diferentes.

6.1 Microplaca Contenido: 12 x 8 tiras (con pocillos independientes) en marco recubierto con anticuerpos monoclonales para las vitaminas 25(OH) D2 y D3. Envasado en bolsa autoadhesiva con desecante. Preparación: Listo para el uso. Las tiras de microplaca o individuales no deben retirarse de la bolsa de papel hasta que se equilibren con la temperatura ambiente (20-25 °C). Estabilidad: Estable hasta la fecha de caducidad. Deseche las tiras después de utilizarlas. Las tiras no utilizadas deberán volver a depositarse en la bolsa de papel, sellarse y guardarse a una temperatura de entre 2 y 8 °C.

6.2 Calibrador 0 Contenido: 1 vial que contiene material biológico liofilizado con gentamicina y Proclin como conservantes. Nota : El calibrador 0 debe usarse para la dilución de muestras con valores superiores a los del calibrador mayor. Preparación: Reconstituir el calibrador agregando 2 ml de agua destilada. Estabilidad: El material liofilizado es estable hasta la fecha de caducidad. Tras la reconstitución, el calibrador 0 es estable durante ocho semanas a una temperatura de 2 a 8 °C. Para períodos de almacenamiento más prolongados, deben dividirse en alícuotas y guardarse a –20 °C durante un máximo de 4 meses. Evitar ciclos de congelación y descongelación sucesivos.

6.3 Calibradores 1-5 Contenido: 5 viales que contienen calibradores liofilizados 1 a 5 (consulte los valores exactos impresos en las etiquetas de los viales) en suero de caballo con gentamicina y Proclin como preservantes. Los calibradores presentan valores de vitamina 25(OH)D específicos del lote. La concentración exacta de 25(OH)D se indica en los viales de los calibradores. Preparación: Reconstituir los calibradores agregando 1 ml de agua destilada en cada vial. Estabilidad: Estable hasta la fecha de caducidad. Tras la reconstitución, los calibradores son estables durante ocho semanas a una temperatura de 2 a 8 °C. Para períodos de almacenamiento más prolongados, deben dividirse en alícuotas y guardarse a –20 °C durante un máximo de 4 meses. Evitar ciclos de congelación y descongelación sucesivos.

6.4 Controles Contenido: 2 viales que contienen controles liofilizados (n = 2) en plasma humano con Proclin como conservante. Preparación: Reconstituir agregando 1 ml de agua destilada a cada vial.

8

Estabilidad: Estable hasta la fecha de caducidad. Tras la reconstitución, los controles son estables durante ocho semanas a una temperatura de 2 a 8 °C. Para períodos de almacenamiento más prolongados, deben dividirse en alícuotas y guardarse a –20 °C durante un máximo de 4 meses. Evitar ciclos de congelación y descongelación sucesivos.

6.5 Tampón de incubación Contenido: 1 frasco (20 ml) de tampón de incubación con caseína y Proclin como conservantes. Preparación: Listo para el uso. Estabilidad: Estable hasta la fecha de caducidad.

6.6 Concentrado de tampón de lavado Contenido: 1 frasco (10 ml) de concentrado de tampón de lavado (200x, TRIS-HCl). Preparación: Diluir de 1 a 200 con agua destilada (por ejemplo, 5 ml de concentrado de tampón de lavado + 995 ml de agua). Utilizar un agitador magnético para mezclar. Utilizar un contenedor de plástico limpio para preparar la solución de lavado. Para evitar el desarrollo de microbios, se recomienda que la solución de lavado de trabajo recién preparada se utilice en el mismo día. Estabilidad: Estable hasta la fecha de caducidad.

6.7 Tampón de conjugado Contenido: 1 frasco (30 ml) de tampón de conjugado con caseína y Proclin como conservantes. Preparación: Listo para el uso. Para preparar la solución de trabajo de conjugado, añada conjugado concentrado de 25(OH)D y concentrado de SA-HRP al tampón de conjugado, tal y como se describe a continuación en el Esquema de dilución. Estabilidad: Estable hasta la fecha de caducidad.

6.8 Concentrado de conjugado 25(OH)D Contenido: 1 vial (0,3 ml) concentrado de conjugado de vitamina 25(OH)D. Preparación: Para la preparación de solución de trabajo de conjugado, diluir 100 veces con tampón de conjugado, tal y como se describe en el Esquema de dilución siguiente. Estabilidad: El concentrado es estable hasta la fecha de caducidad.

6.9 Concentrado de SA-HRP Contenido: 1 vial (0,2 ml) de concentrado de estreptavidina-HRP. Preparación: Para la preparación de solución de trabajo de conjugado, diluir 200 veces con tampón de conjugado, tal y como se describe en el Esquema de dilución siguiente. Estabilidad: El concentrado es estable hasta la fecha de caducidad. Preparación de solución de trabajo de conjugado. La solución debe prepararse al menos 1 h y 45 minutos antes del uso. Se recomienda preparar la solución de trabajo de conjugado durante la primera fase de incubación. Para preparar un volumen adecuado de solución de trabajo de conjugado de HRP mezcle 3 reactivos en el orden siguiente: (1) tampón de conjugado, (2) concentrado de conjugado 25(OH)D, (3) vórtex, (4) concentrado de SA-HRP y (5) vórtex. El orden en que se añaden estos 3 reactivos es fundamental y debe respetarse escrupul osamente para obtener densidades ópticas reproducibles. Almacene la solución de trabajo de conjugado a temperatura ambiente hasta su uso. Evite la exposición directa a la luz del sol. La solución de trabajo no es estable durante periodos prolongados y debe desecharse si no se utiliza en la misma jornada de trabajo.

9

Esquema de dilución Tiras Tampón de

conjugado (ml)

Concentrado de conjugado 25OHD (µl)

Concentrado de SA-HRP (µl)

Volumen total* (ml)

1 3 30 15 3,045 2 5 50 25 5,075 3 6 60 30 6,090 4 8 80 40 8,120 5 9 90 45 9,135 6 10 100 50 10,150 7 12 120 60 12,180 8 14 140 70 14,210 9 16 160 80 16,240 10 18 180 90 18,270 11 20 200 100 20,300 12 22 220 110 22,330

* 200 µl por pocillo

6.10 Solución de sustrato Contenido: 1 frasco (13 ml) de tetrametilbencidina (TMB) en solución acuosa. Preparación: Listo para el uso. Estabilidad: Estable hasta la fecha de caducidad. Evitar la exposición directa a la luz.

6.11 Solución de parada Contenido: 1 frasco (13 ml) de HCl 1M. Preparación: Listo para el uso. La solución de interrupción contiene HCl (véase la Ficha de datos de seguridad). En caso de contacto, lavar con abundante agua. Estabilidad: Estable hasta la fecha de caducidad.

6.12 Instrucciones de uso En cada kit se suministran instrucciones de uso en español. Otros idiomas disponibles en www.biohithealthcare.com.

7. MATERIALES NECESARIOS QUE NO SE SUMINISTRAN Agua destilada o desionizada, micropipetas y puntas desechables para suministrar 50-1000 µl, pipetas para suministrar 1-10 ml de forma precisa, pipeta de 8 canales que suministre 100 y 200 µl, probeta graduada (por ejemplo, 1000 ml), agitador magnético, agitador vórtex, agitador de placas, limpiador de placa de microvaloración, temporizador, lector de placas mediante el principio de medición vertical con capacidad de lectura a 450 nm (frente a 630 o 650 nm, se recomienda lectura bicromática), tubo de plástico de obtención de sangre para suero o plasma con EDTA, recipiente para baño en agua helada.

8. ALMACENAMIENTO Y ESTABILIDAD Almacene el kit BIOHIT 25OH Vitamin D refrigerado (2-8 °C). Al almacenarse a estas temperaturas, el kit permanece estable hasta la fecha de caducidad impresa en la etiqueta de la caja y en la etiqueta de cada componente individual del kit. No congele el kit ni lo exponga a altas temperaturas; tampoco lo almacene a temperaturas superiores a 8 °C cuando no lo esté utilizando.

10

No utilice los reactivos después de la fecha de caducidad impresa en la etiqueta. No utilice reactivos de kits pertenecientes a números de lote diferentes ni reactivos sustitutos de kits de otros fabricantes. Utilice únicamente agua destilada o desionizada. Los componentes del kit se suministran con concentraciones precisas. La dilución adicional u otras alteraciones de los reactivos pueden dar lugar a resultados incorrectos. Véase en la sección 6 la información sobre la estabilidad de los componentes individuales una vez reconstituidos. Las alteraciones en el aspecto físico de los reactivos del kit pueden indicar inestabilidad o deterioro. La solución de sustrato debe ser inolora o de color azul claro. Cualquier otro color indica el deterioro de la solución de sustrato.

9. OBTENCIÓN DE MUESTRAS Y MANIPULACIÓN La matriz de muestras para el kit BIOHIT Total 25OH Vitamin D kit es suero o plasma con EDTA. Preparación del plasma: Una vez extraída la muestra de sangre en un tubo con EDTA sin aditivos, se realiza la mezcla inmediatamente en los tubos dándoles la vuelta 5 o 6 veces. La separación del plasma se realiza mediante centrifugado antes de que transcurran 2 horas desde la obtención de la muestra (por ejemplo, StatSpin® Express 2, centrifugado durante 2 minutos a 4440 x g; consulte las instrucciones del fabricante de la centrifugadora para la separación de plasma). Transfiera el plasma a un tubo de plástico limpio. Preparación del suero: Una vez extraída la muestra de sangre en un tubo de suero sin aditivos, permita que la muestra se coagule completamente dejándola en reposo y colocada verticalmente en un soporte para tubos a temperatura ambiente durante 30 min. Elimine el coágulo mediante centrifugado (por ejemplo, Stat Spin 180s, centrifugado durante 10 min. 2000×g, consulte las instrucciones de los fabricantes de la centrifugay el tubo para la separación del suero). El centrifugado debe realizarse antes de que transcurra una hora desde la obtención de la muestra. El suero se transfiere a un tubo de plástico limpio. Almacenamiento de la muestra: Tras separar el suero/plasma, la muestra puede almacenarse durante 4 días en un refrigerador a 2-8 °C y temporalmente (<24 horas) a temperatura ambiente (TA). Si no se prevé utilizar la muestra durante cuatro días, se recomienda almacenarla a –20 °C. El almacenamiento prolongado debe realizarse a –70 °C. Mezcle bien las muestras después de descongelarlas. Evite procesos repetitivos de congelación y descongelación de las muestras. Deben desecharse las muestras sumamente hemolizadas, lipémicas o turbias. Las muestras sospechosas de contener concentraciones superiores a las del calibrador mayor deberán diluirse en el calibrador 0 del ensayo.

11

10. MÉTODO ANALÍTICO

10.1 Preparaciones preliminares Permitir que todos los reactivos y la microplaca alcancen la temperatura ambiente (20-25 °C). Reconstituir los calibradores y controles liofilizados con agua destilada, tal y como se describe en la sección 6. Diluir el concentrado de tampón de lavado de 1 a 200 con agua destilada o desionizada (por ejemplo, 5 ml + 995 ml). Seleccionar el número necesario de tiras para el análisis. Las tiras no utilizadas deberán volver a depositarse en la bolsa autoadhesiva con un desecante y guardarse a una temperatura de entre 2 y 8 °C. Asegurar las tiras en el marco de soporte. La descongelación de las muestras congeladas debe realizarse rápidamente en un baño de agua a temperatura ambiente con agitación ocasional. Cuando estén prácticamente descongeladas, colocarlas en un baño de hielo triturado. Lea el procedimiento de ensayo completo antes de empezar. Se recomienda apl icar todos los calibradores y controles en la placa como duplicados. Esta medida resulta necesaria para utilizar calibradores y controles en cada análisis . Agitar o remover suavemente todos los reactivos y l as muestras para mezclarlos bien antes de utilizarlos . Nota: todas las incubaciones deben realizarse a 20-30 °C (=temperatura ambiente), no debe superarse la temperatura especificada.

10.2 Protocolo del ensayo PASO 1: MUESTRA Pipetear 50 µl de cada calibrador, control y muestra en los pocillos de la microplaca. Nota 1: las muestras que puedan contener una concentración de 25(OH)D superior a la del calibrador mayor deberán diluirse en el calibrador 0. Nota 2: para evitar variaciones entre los niveles de resultados debido a tiempos de pipeteado más altos, el tiempo máximo entre el pipeteado del primer calibrador y la última muestra debe limitarse a 20 minutos. PASO 2: TAMPÒN DE INCUBACIÓN Pipetear 150 µl de tampón de incubación en los pocillos. Incubar durante 2 horas a temperatura ambiente en un agitador de placas (300-700 rpm). Nota: preparar la solución de trabajo de conjugado durante la incubación y como mínimo 1 h y 45 minutos antes de su uso. PASO 3: LAVADO Lavar las tiras de la microplaca 3 veces dispensando 350 µl de solución de lavado en cada pocillo y aspirando el contenido de cada uno. PASO 4: SOLUCIÓN DE TRABAJO DE CONJUGADO. Pipetear 200 µl de solución de trabajo de conjugado en cada pocillo. Incubar la microplaca durante 30 minutos a temperatura ambiente en un agitador de placas (300-700 rpm).

12

PASO 5: LAVADO Lavar las tiras de la microplaca 3 veces dispensando 350 µl de solución de lavado en cada pocillo y aspirando el contenido de cada uno. PASO 6: SUSTRATO Pipetear 100 µl de solución de sustrato (TMB) en cada pocillo. Incubar la microplaca durante 15 minutos a temperatura ambiente en un agitador de placas (300 a 700 rpm). Evitar la exposición a la luz directa del sol. Dispensar la solución de sustrato en el plazo de 15 minutos desde el lavado de la microplaca. PASO 7: PARADA DE LA REACCIÓN Pipetear 100 µl de solución de parada con una pipeta de 8 canales en los pocillos de la microplaca. PASO 8: MEDICIÓN DE RESULTADOS MEDIANTE EL PRINCIPIO DE MEDICIÓN VERTICAL Medir la absorbancia de los pocillos de la microplaca a 450 nm (filtro de referencia de 630 nm o 650 nm) en el plazo de 1 hora y calcular los resultados tal y como se describe en la sección 11.

10.3 Método automatizado El diseño del BIOHIT Total 25OH Vitamin D ELISA ha considerado la automatización. Una vez creados y validados para el uso los protocolos específicos para el ensayo, la sencilla ejecución automatizada del ensayo BIOHIT Total 25OHD ELISA abierto permite ahorrar recursos y resulta fácil e intuitivo; por ejemplo, al evitarse trastornos inducidos por el pipeteo, tales como lesiones por esfuerzo repetitivo. 11. RESULTADOS

11.1 Valores del control de calidad Las buenas prácticas de laboratorio requieren el uso de controles adecuados para determinar si todos los reactivos y protocolos ofrecen la eficacia requerida. El kit Biohit Total 25 OH Vitamin D se suministra con dos controles específicos del lote. Deberá supervisarse el rendimiento del control con los gráficos de control de calidad. Como alternativa, pueden emplearse métodos estadísticos adecuados para analizar los valores de control interno del laboratorio, que deben cumplir los intervalos de confianza correspondientes en cada laboratorio. La aceptación de los resultados dependerá de la obtención de los resultados de control esperados. Se recomienda comprobar visualmente el ajuste de la curva seleccionado por el ordenador.

11.2 Cálculo de resultados y datos típicos DATOS TÍPICOS: Los siguientes datos representan los valores típicos obtenidos para los calibradores. Los valores únicamente tienen una finalidad ilustrativa y no deberán utilizarse nunca en lugar de los datos obtenidos en tiempo real para cada análisis.

13

25OH Vitamin D ELISA DO (450 nm)

Concentración del calibrador

0 ng/ml 2,96

6,0 ng/ml 2,56

13,0 ng/ml 2,03

33,0 ng/ml 1,29

69,0 ng/ml 0,68

138 ng/ml 0,23

Nota: 1 ng/ml = 2,5 pmol/ml

CÁLCULO DE LOS RESULTADOS Preparar una curva de calibración independiente para cada análisis. No utilizar los datos de análisis anteriores. Calcular los valores medios de DO de todas las determinaciones duplicadas. Para cada calibrador, control y muestra, calcule la señal relativa (%) dividiendo la señal (A) por la señal obtenida del calibrador 0 (A0) y multiplicando por 100.

�

�0�%� �

����� ������, ���������������

����� ������0��100

Trazar la señal relativa media (A/A0, %) de los calibradores frente a sus concentraciones respectivas (indicadas en los viales). Las lecturas de absorbancia se convierten en concentraciones de 25(OH)D mediante la interpolación de valores desconocidos a partir de la curva de ajuste óptimo de los calibradores. Se recomienda la aplicación de métodos asistidos por ordenador, realizándose el ajuste de la curva de la función logística de cuatro parámetros. En la figura 1 se muestra una curva típica de calibración.

Figura 1. Ejemplo de curva de calibración típica.

14

11.3 Interpretación de los resultados e intervalos de referencia biológicos En las directrices sobre prácticas clínicas (Clinical Practice Guideline) de Endocrine Society se define la deficiencia de vitamina D como un nivel de 25(OH)D inferior a 20 ng/ml y la insuficiencia de vitamina D como un nivel de 25(OH)D de entre 21 y 29 ng/ml (2). Las concentraciones en suero superiores a 150 o 200 ng/ml de forma constante se consideran potencialmente tóxicas (1, 10, 20), por lo que se ha sugerido un límite de seguridad más amplio de 100 ng/ml (20). No obstante, se han podido relacionar efectos secundarios adversos para la salud con concentraciones mucho menores de 25(OH)D y se ha sugerido que deberían evitarse las concentraciones superiores a 50-60 ng/ml (2). Se sabe que factores tales como la ingesta dietética, el grupo demográfico y la estación afectan a los niveles normales de vitamina 25(OH)D (1, 6, 21). Cada laboratorio debe establecer su propio intervalo en función de su población local y las posibles recomendaciones de las autoridades sanitarias nacionales. Existe aún controversia acerca de los niveles óptimos de vitamina D en suero (1-2, 4, 6, 21). Las siguientes son sugerencias para determinar los niveles de vitamina 25(OH)D en suero conforme a las directrices de la Sociedad de Endocrinología (2) y literatura reciente (21-23).

Nivel ng/ml

Deficiencia <20 ng/ml

Insuficiencia 21-29 ng/ml

Suficiencia >30 ng/l

Toxicidad potencial >100 ng/ml Nota: 1 ng/ml = 2,5 nmol/l

12. LIMITACIONES DEL PROCEDIMIENTO Como ocurre con cualquier procedimiento diagnóstico, los resultados de la prueba Biohit 25OH Vitamin D deben interpretarse junto con la presentación clínica del paciente y cualquier otra información a disposición del médico.

13. CARACTERÍSTICAS DE LOS RESULTADOS ANALÍTICOS Todas las pruebas de resultados se realizaron a temperatura ambiente (20-25 °C). Los análisis de todas las muestras se realizaron con pocillos de placa de microtitulación duplicados.

13.1 Límite de detección y límite de cuantificación Los valores de Límite de blanco (LoB), Límite de detección (LoD) y Límite de cuantificación (LoQ) se determinaron conforme a la directriz EP17-A del CLSI, con porcentajes de resultados positivos falsos (α) inferiores al 5% y de resultados negativos falsos (β) inferiores al 5% (14). El LoB calculado fue de 1,7 ng/ml. y el LoD de 2,8 ng/ml. El LoQ se calculó analizando 5 muestras de valor bajo en 14 pruebas diferentes. El LoQ calculado fue de 4,4 ng/ml con un CV% entre mediciones de ≤ 20,0.

15

Además, se realizaron análisis del LoD mediante un segundo método con veinte calibradores 0 junto con otro conjunto de calibradores. El límite de detección, definido como la concentración aparente de dos desviaciones estándar por debajo del valor de DO medio con cero unión resultó ser de 1,5 ng/ml.

13.2 Rango de notificación El rango de notificación para el ensayo Biohit 25OH Vitamin D es de 4,4-123 ng/ml.

13.3 Precisión La precisión del ensayo se calculó analizando muestras en 20 análisis (durante un mínimo de 20 días) con 3 lotes de kits diferentes. Para la precisión de la reproducibilidad (dentro del mismo análisis), el rango para los valores medios fue de 5,5 ng/ml a 81,2 ng/ml, las desviaciones estándar de 0,4 a 2 ng/ml y el CV% del 2,5 al 7,8%. Para la precisión dentro del laboratorio (dentro del mismo análisis), el rango para las desviaciones estándar fue de 1,2 a 7,8 ng/ml y el CV% del 4,7 al 9,2%.

Precisión de la reproducibilidad Precisión dentro d el laboratorio

Muestra N [X] ± DE (ng/ml) CV (%) Muestra N [X] ± DE (ng/ml) CV (%)

S1 24 5,5 ± 0,4 7,8 S4 39 17,7 ± 1,3 7,4

S2 35 27,4 ± 1,6 5,7 S5 10 26,3 ± 1,2 4,7

S3 24 81,2 ± 2,0 2,5 S6 21 85,4 ± 7,8 9,2

DE: desviación estándar, CV: coeficiente de variación

13.4 Especificidad analítica Se evaluaron las reacciones cruzadas provocadas por otras formas de la vitamina D en el ensayo 25OH Vitamin D. Para determinar la reactividad cruzada del ensayo BIOHIT Total 25OH Vitamin D ELISA se analizaron muestras de suero con reactantes cruzados enriquecidos. Los porcentajes de reacción cruzada para cada sustancia, estimados mediante la comparación de la concentración que proporciona una inhibición del 50%, se resumen en la siguiente tabla, respectivamente:

Compuesto y concentración % de reacción cruzada Vitamina 25(OH) D3 100 Vitamina 25(OH) D2 84

Vitamina D3 <0,2 Vitamina D2 <0,2

Vitamina 1,25(OH)2D3 50 Vitamina 1,25(OH)2D2 <0,2

Vitamina 24,25(OH)2D3 >100 Vitamina 25,26(OH)2D3 >100

Vitamina 3-epi-25(OH)D3 <0,2

16

13.5 Interferencia Se evaluó la interferencia del ensayo Biohit 25 OH Vitamin D con tres niveles diferentes de suero 25(OH)D (25 OHD a 6-43 ng/ml). Se identificó que el sesgo introducido por la hemoglobina, la bilirrubina no conjugada o los triglicéridos en concentraciones interferentes de 5 mg/ml, 0,5 mg/ml y 5 mg/ml era inferior al 10%. Esta interferencia se consideró como irrelevante. Deben evitarse las muestras sumamente hemolizadas, lipémicas o turbias. De forma similar, se analizó la interferencia con ácido ascórbico (vitamina C, 1 mg/ml analizado), bilirrubina conjugada (1 mg/ml analizado) y biotina (40 µg/ml analizados), y se identificó que era inferior al 10%. Se realizaron pruebas de la inhibición por Zemplar (50 ng/ml) en concentraciones de 25(OH)D de 18 ng/ml y 34 ng/ml, y también se identificó un valor <10 %, que se consideró como una interferencia irrelevante.

13.6 Recuperación y linealidad Se evaluó la recuperación agregando diferentes niveles de vitamina 25(OH) D2 y D3 a una muestra de concentración baja de 25(OH)D. Los resultados se resumen en la siguiente tabla:

PRUEBA DE RECUPERACIÓN

Se agregó vitamina 25(OH)D3 (ng/ml) Recuperación (%)

0 100

31,3 96

53,9 92

Se agregó vitamina 25(OH)D2 (ng/ml) Recuperación (%)

0 100

22,9 105

38,4 95

Para analizar la linealidad de las diluciones, se analizaron tres muestras con concentraciones distribuidas por todo el intervalo medible, en soluciones equidistantes. Los resultados se resumen en las siguientes tablas: Muestra S1

Dilución de la muestra

Concentración medida (ng/ml)

Recuperación (%)

ninguna 66,2 100 1/2 34,5 104 1/4 15,5 94 1/8 8,2 99

1/16 4,4 106

17

Muestra S2 Dilución de la

muestra Concentración medida

(ng/ml) Recuperación

(%) ninguna 99,2 100

1/2 53,9 109 1/4 24,6 99 1/8 11,8 95

1/16 6,5 105 Muestra S3

Dilución de la muestra

Concentración medida (ng/ml)

Recuperación (%)

ninguna 123 100 1/2 64,5 105 1/4 31,5 103 1/8 15,0 98 1/16 7,6 99

El análisis demuestra que la serie de diluciones es lineal de 7,6 a 123 ng/ml (16 veces la dilución). El rango de notificación, definido como LoQ hasta la concentración lineal más alta medida, se determinó de 4,4 a 123 ng/ml.

13.7 Comparación de los métodos Para determinar el rendimiento del ensayo BIOHIT Total 25OH Vitamin D ELISA, se realizó un estudio de correlación en el que se analizaron un total de 127 muestras. Las muestras se analizaron con el ensayo BIOHIT Total 25OH Vitamin D ELISA y un ensayo de vitamina 25(OH)D CLIA (inmunoanálisis quimiluminiscente) disponible en el mercado. El coeficiente de correlación entre los dos métodos fue de 0,94, con una pendiente de 0,976 y una intersección con el eje Y en 1,94. Los resultados se ilustran en la Figura 2 inferior.

Figura 2. Correlación entre el ensayo Biohit 25OH Vitamin D y el método basado en CLIA disponible comercialmente.

18

14. BIBLIOGRAFÍA 1. HOLICK MF. Vitamin D deficiency. N Engl J Med 2007; 357:266-281. 2. HOLICK MF, BINKLEY NC, BISCHOFF-FERRARI HA, GORDON CM, HANLEY DA, HEANEY RP,

MURAD MH, WEAVER CM. Evaluation, treatment, and prevention of vitamin D deficiency: an Endocrine Society clinical practice guideline. J Clin Endocrinol Metab 2011; 6(7):1911-30.

3. WHO. Guideline: Vitamin D supplementation in pregnant women. Geneva, World Health Organization, 2012.

4. ROSS AC, TAYLOR CL, YAKTINE AL, DEL VALLE HB, eds. Committee to Review Dietary Reference Intakes for Vitamin D and Calcium, Institute of Medicine, Food and Nutrition Board. Dietary Reference Intakes for Calcium and Vitamin D. Washington, DC: National Academy Press (2010).

5. HOLICK MF Vitamin D Status: Measurement, Interpretation, and Clinical Application. Ann Epidemiol 2009; 19:73-78.

6. GRÖBER U, SPITZ J, REICHRATH J, KISTERS K, HOLICK MF. Vitamin D Update 2013: From rickets prophylaxis to general preventive healthcare. Dermatoendocrinol 2013; 5(3): 331–347.

7. ZERWEKH JE. Blood biomarkers of Vitamin D status. Am J Clin Nutr 2008; 87(suppl):1087S-91S. 8. TAYLOR CL, PATTERSON KY, ROSELAND JM, WISE SA, MERKEL JM, PEHRSSON PR, YETLEY

EA. Including food 25-hydroxyvitamin D in intake estimates may reduce the discrepancy between dietary and serum measures of vitamin D status. J Nutr 2014; 144:654-9.

9. HEANEY RP, ARMAS LA, FRENCH C. All-source basal vitamin D inputs are greater than previously thought and cutaneous inputs are smaller. J Nutr 2013; 143:571–5.

10. HOLICK MF. Resurrection of Vitamin D deficiency and rickets. J Clin Invest 2006; 116:2062-2072. 11. CHRISTAKOS S, HEWISON M, GARDNER DG, WAGNER CL, SERGEEV IN, RUTTEN E, PITTAS

AG, BOLAND R, FERRUCCI L, BIKLE DD. Vitamin D: beyond bone. Ann NY Acad Sci 2013; 1287: 45–58.

12. SCHLÖGL M, HOLICK MF. Vitamin D and neurocognitive function. Clin Interv Aging 2014; 9: 559–568.

13. JACOBS ET, KOHLER LN, KUNIHIRO AG, JURUTKA PW. Vitamin D and Colorectal, Breast, and Prostate Cancers: A Review of the Epidemiological Evidence. J. Cancer 2016; 7(3):232-240.

14. NAKASHIMA A, YOKOYAMA K, YOKOO T, URASHIMA M. Role of vitamin D in diabetes mellitus and chronic kidney disease. World J Diabetes 2016; 7(5):89-100

15. ANIC GM, ALBANES D, ROHRMANN S, KANAREK N, NELSON WG, BRADWIN G, RIFAI N, MCGLYNN KA, PLATZ EA, MONDUL AM. Association between serum 25-hydroxyvitamin D and serum sex steroid hormones among men in NHANES. Clin Endocrinol (Oxf) 2016; Epub ahead of print: doi:10.1111/cen.13062.

16. DE-REGIL LM, PALACIOS C, LOMBARDO LK, PEÑA-ROSAS JP. Vitamin D supplementation for women during pregnancy. Cochrane Database Syst. Rev. 2016 14;1

17. STEPMAN HC, VANDERROOST A, VAN UYTFANGHE K, THIENPONT LM. Candidate Reference Measurement Procedures for Serum 25-Hydroxyvitamin D3 and 25-Hydroxyvita- min D2 by Using Isotope-Dilution Liquid Chromatography–Tandem Mass Spectrometry (ID-LC/ MS-MS). Clin Chem 2011; 57(3): 441 – 44.

18. THIENPONT LM, STEPMAN HCM, VESPER HW. Standardization of measurements of 25-Hydroxyvitamin D3 and D2. Scand. J Clin Lab Inves 2012; 72(Suppl. 243):41-49.

19. DANIEL W, THOLEN MS. Clinical and laboratory standards Institute (CLSI) (2004). Protocols for Determination of Limits of Detection and Limits of Quantitation; Approved Guideline. CLSI document EP17-A.

20. JONES G. Pharmacokinetics of vitamin D toxicity. Am J Clin Nutr 2008; 88:582S-6S. 21. HEANEY RP. Health is better at serum 25(OH) D above 30ng/mL. J Steroid Biochem Mol Biol 2013;

136:224-8. 22. VIETH R. Why the minimum desirable serum 25-hydroxyvitamin D level should be 75 nmol/L (30

ng/ml). Best Pract Res Clin Endocrinol Metab 2011; 25(4):681-91.

23. DAWSON-HUGHES B, HEANEY RP, HOLICK MF, LIPS P, MEUNIER PJ, VIETH R. Estimates of optimal vitamin D status. Osteoporos Int 2005; 16(7):713-6.

19

15. FECHA DE PUBLICACIÓN Prospecto del kit BIOHIT Total 25OH Vitamin D Versión 4.0, junio de 2017.

16. GARANTÍA El Fabricante remediará todos los defectos detectados en cualquier producto (el «Producto defectuoso») que se deriven de materiales no aptos o de negligencia en la elaboración, y que impidan el funcionamiento mecánico o el uso previsto de los productos, incluidas, entre otras, las funciones que se indican en las especificaciones del Fabricante para los productos. NO OBSTANTE, TODA GARANTÍA SE CONSIDERARÁ ANULADA SI SE DETERMINA QUE EL FALLO SE DEBE A TRATAMIENTO INADECUADO, USO INDEBIDO, DAÑO ACCIDENTAL, ALMACENAMIENTO INCORRECTO O USO DE LOS PRODUCTOS PARA OPERACIONES FUERA DE LAS LIMITACIONES ESPECIFICADAS O DE SUS ESPECIFICACIONES, CONTRARIAMENTE A LAS INSTRUCCIONES QUE SE OFRECEN EN EL MANUAL DE INSTRUCCIONES. El período de garantía para el Distribuidor se define en el manual de instrucciones de los productos y comenzará en la fecha en que el Fabricante suministre el producto en cuestión. En caso de conflictos sobre la interpretación del texto, se seguirá la versión en inglés. Este kit de diagnóstico Biohit se ha fabricado de acuerdo con los protocolos de gestión de calidad ISO 9001/ISO 13485 y ha superado todos los procedimientos pertinentes de garantía de calidad relacionados con este producto.

17. INFORMACIÓN SOBRE PEDIDOS Kit BIOHIT Total 25OH Vitamin D Elisa N.º Cat. 602 310.02 Sede central Biohit Oyj Laippatie 1 00880 Helsinki (Finlandia) Tel: +358-9-773 861 Fax: +358-9-773 2867 Correo electrónico: info@biohit.fi www.biohithealthcare.com

20

18. BREVE DESCRIPCIÓN DEL PROCEDIMIENTO

Permitir que todos los reactivos alcancen la temperatura ambiente

Mezclar bien todos los reactivos y muestras antes de pipetear *

Tras mezclar, pipetear 50 µl de muestras del paciente, calibradores y controles en los pocillos

*

Agregar 150 µl de tampón de incubación *

Incubar durante 2 h a temperatura ambiente agitando

Preparar la solución de trabajo de conjugado durante la incubación (mín. 1 h y 45 minutos antes del uso)

*

Lavar los pocillos 3 veces con 350 µl de solución de lavado diluida. *

Pipetear 200 µl de solución de trabajo de conjugado en los pocillos. *

Incubar durante 30 minutos a temperatura ambiente agitando. *

Lavar los pocillos 3 veces con 350 µl de solución de lavado. *

Pipetear 100 µl de solución de sustrato mezclada en los pocillos. *

Incubar durante 15 minutos a temperatura ambiente agitando. *

Pipetear 100 µl de solución de parada mezclada en los pocillos. *

Medir a 450 nm (frente a 630 o 650 nm).

4004

10E

S-4

.0