kit de mutaciones del gen k-ras de therascreen® · pdf fileel kit de k-ras detecta siete...

de 42

Kit de mutaciones del gen K-RAS de TheraScreen® Para la detección de las 7 mutaciones del gen K-RAS Para uso con el sistema de PCR en tiempo real LightCycler® 480 de Roche (Equipo II) (Nº de catálogo: 05015278001) Y el sistema de PCR en tiempo real 7500 de Applied BioSystems (Número de referencia: 4351105) Incluye el Manual del usuario del programa LightCycler® Adapt Software v1.1 de Roche Diagnostics (Nº de catálogo 05474914001) para el Kit de mutaciones del gen K-RAS de TheraScreen® con el marcado CE-IVD. Instrucciones de uso

Códigos de producto

Tamaño del kit Código del producto DxS

Número de pedido para Roche Diagnostics

20 reacciones KR-21 05366216190 80 reacciones KR-22 05366224190

Versión de las instrucciones: DU001g Fecha de la revisión: mayo de 2009 Almacenar entre -18 °C y -25 °C

Para uso diagnóstico solamente Kit de mutaciones de K-RAS de TheraScreen

Página 2 de 42

Contenido 1. Uso previsto/Indicaciones de uso .........................................................3 2. Resumen y explicación de la prueba ....................................................3 3. Principios tecnológicos ..........................................................................4 4. Reactivos ..................................................................................................6 5. ADVERTENCIAS Y PRECAUCIONES.....................................................7 6. Condiciones de almacenamiento, estabilidad y envío ........................9 7. Equipo .......................................................................................................9 8. Muestras ...................................................................................................9 9. Protocolo de detección de mutaciones del gen K-RAS ................... 14 10. Limitaciones de la prueba ................................................................. 28 11. Características del rendimiento del ensayo .................................... 29 12. Asistencia técnica .............................................................................. 38 13. Información sobre el fabricante y el distribuidor ........................... 38 14. Fecha de publicación de la última revisión ..................................... 39 15. Referencias ......................................................................................... 40 Notas para el comprador: ........................................................................ 42


Página 3 de 42

IMPORTANTE: lea estas instrucciones detenidamente y

familiarícese con todos los componentes del Kit de K-RAS antes de empezar a utilizarlo. 1. Uso previsto/Indicaciones de uso Uso previsto El Kit de mutaciones K-RAS de DxS TheraScreen® (Kit de K-RAS) es una prueba de diagnóstico in vitro diseñada para la detección de las siete mutaciones somáticas en el oncogen K-RAS con el fin de proporcionar una validación cualitativa del estado de las mutaciones. El Kit de K-RAS está concebido para personal cualificado y para uso en en entornos profesionales de laboratorio con muestras de ADN de tejido colorrectal fijado en formalina e incluido en parafina. Indicaciones de uso Los resultados del Kit de K-RAS tienen como finalidad ayudar al personal médico a la identificación de pacientes con cáncer colorrectal que no puedan beneficiarse de las terapias antireceptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR), como Panitumumab o Cetuximab.

El Kit de K-RAS no tiene como objetivo servir de prueba diagnóstica del cáncer colorrectal. Está concebida como complemento de otros factores pronósticos importantes utilizados para la selección de los pacientes aptos para el tratamiento mediante terapias por inhibición del EGFR, según el estado de la mutación en el paciente. El médico valorará el estado de la mutación en el paciente, además de otros factores relativos a la enfermedad, para tomar una decisión sobre la terapia. Ninguna decisión relativa a la aplicación de tratamientos en pacientes con cáncer debe basarse exclusivamente en el estado de la mutación en el gen K-RAS. 2. Resumen y explicación de la prueba El Kit de K-RAS es un dispositivo de diagnóstico con marcado CE fabricado según la Directiva de productos sanitarios para diagnóstico in vitro 98/79/CE de la Unión Europea.

Los cánceres humanos(1-4) suelen presentar mutaciones en el oncogen K-RAS. La existencia de estas mutaciones se relaciona con la falta de respuesta a determinadas terapias anticancerígenas por inhibición del EGFR en pacientes con cáncer colorrectal metastásico (5-10)(14-21).

El ensayo de PCR en tiempo real basado en la tecnología Scorpions de DxS permite detectar las siete mutaciones del gen K-RAS en ADN genómico normal. Este método es altamente selectivo. Siempre que se disponga de suficientes copias de ADN, existe la posibilidad de detectar aproximadamente un 1% de mutaciones en el ADN genómico normal.

El Kit de K-RAS detecta siete mutaciones del gen K-RAS en los codones 12 y 13 del oncogen K-RAS, tal y como se muestra en la Tabla 1.


Página 4 de 42

Tabla 1: mutaciones en el gen K-RAS detectadas mediante el kit de DxS Se utilizan los identificadores (ID) COSMIC del catálogo de mutaciones somáticas del cáncer (Catalogue of Somatic Mutations in Cancer). http://www.sanger.ac.uk/genetics/CGP/cosmic/

Mutación Cambio de base ID de CosmicGly12Ala (GGT>GCT) 522 Gly12Asp (GGT>GAT) 521 Gly12Arg (GGT>CGT) 518 Gly12Cys (GGT>TGT) 516 Gly12Ser (GGT>AGT) 517 Gly12Val (GGT>GTT) 520 Gly13Asp (GGC>GAC) 532

3. Principios tecnológicos El Kit de K-RAS combina dos tecnologías, ARMS® y Scorpions® (11, 12, 13), para la detección de las mutaciones mediante ensayos realizados con la técnica de PCR en tiempo real. ARMS La ARMS permite llevar a cabo una amplificación específica de los alelos o las mutaciones. La enzima Taq ADN polimerasa resulta extremadamente eficaz para diferenciar entre una coincidencia y un error de coincidencia en el extremo 3’ de un primer o cebador de PCR. Algunas secuencias mutadas se pueden amplificar de forma selectiva, incluso en muestras cuya mayoría de secuencias no presentan la mutación, por ejemplo:

• Cuando la coincidencia con el cebador es completa, la amplificación se produce con total eficacia.

• Cuando no hay coincidencia con la base 3’, únicamente tiene lugar una amplificación complementaria de bajo nivel.

Scorpions La detección de la amplificación se realiza mediante Scorpions. Scorpions es una técnica de moléculas bifuncionales que contienen un cebador de PCR unido covalentemente a una sonda. El fluoróforo de esta sonda interactúa con un quencher o silenciador, también incorporado en la sonda, lo que reduce la fluorescencia.

Durante la reacción de la PCR, cuando la sonda se une al amplicón, se separan el fluoróforo y el silenciador. El resultado es un aumento de la fluorescencia en el tubo de reacción. Análisis de los datos: método ∆Ct Los ensayos en tiempo real de Scorpions utilizan el número de ciclos de PCR necesarios para detectar una señal de fluorescencia superior a la señal de referencia como medida de las moléculas diana presentes al comienzo de la reacción. El punto en el que se detecta una señal superior a la lectura de fluorescencia de referencia se denomina "ciclo umbral" (Ct).


Página 5 de 42

El cálculo de los valores de ∆Ct de una muestra se obtiene de la diferencia entre el valor de Ct del ensayo de mutación y el valor de Ct del ensayo de control de una misma muestra. Las muestras se clasifican como positivas para mutaciones si su valor de ∆Ct es inferior al valor de ∆Ct del 1% correspondiente a dicho ensayo.

Por encima de este valor, se considera que la muestra contiene menos de un 1% de mutaciones (por encima del límite de los ensayos) o que la muestra es negativa para la mutación.

Si se utilizan cebadores ARMS, es posible que el cebado no resulte eficaz, lo que daría lugar a un valor de Ct de referencia muy tardío para secuencias de ADN que no contengan mutaciones. Todos los valores de ∆Ct calculados a partir de la amplificación de referencia serán superiores a los valores de ∆Ct del 1% y la muestra se clasificará como negativa para la mutación.

El Kit de K-RAS tiene el marcado CE para su uso con fines de diagnóstico in vitro con el sistema de PCR en tiempo real LightCycler® 480 (Equipo II) de Roche Diagnostics (Equipo LightCycler® 480) con 96 pocillos, número de referencia de Roche: 05015278001, o el Sistema de PCR en tiempo real 7500 de Applied BioSystems, número de referencia 4351105 (ABI7500).

En el caso del equipo LightCycler® 480, el Kit de K-RAS debe utilizarse en combinación con el programa LightCycler® Adapt Software v1.1 para el Kit de mutaciones del gen K-RAS de TheraScreen® con marcado CE-IVD (LightCycler® Adapt Software). El objetivo del programa es automatizar la determinación del estado de un gráfico de amplificación y calcular un umbral adecuado con el que obtener los valores de Ct. Dichos valores se utilizan para calcular los valores de ∆Ct de las muestras, que posteriormente se comparan con los valores de corte del 1%. El programa indica si el resultado para la mutación es positivo o negativo y elimina cualquier subjetividad de los procesos de análisis e interpretación de los datos del Kit de K-RAS. Formato del Kit de K-RAS El Kit de K-RAS se suministra con ocho ensayos.

• Un ensayo de control • Siete ensayos de mutación

Todas las mezclas de reacción contienen un ensayo de control exógeno (control interno) con la etiqueta HEX (que identificará el detector JOE en el sistema ABI7500). Su objetivo es controlar la existencia de inhibidores que puedan conducir a resultados de falsos negativos. Ensayo de control El ensayo de control, con la etiqueta FAM, sirve para valorar el ADN total de una muestra. El ensayo de control amplifica una región del exón 4 del gen K-RAS.


Página 6 de 42

Los cebadores y la sonda se han diseñado para evitar cualquier polimorfismo conocido del gen K-RAS. Ensayos de mutación Cada ensayo de mutación, con la etiqueta FAM, contiene un cebador Scorpions más uno ARMS cuyo objetivo es discriminar entre el ADN normal y el ADN mutante detectado mediante los ensayos de PCR en tiempo real. 4. Reactivos El Kit de K-RAS contiene los reactivos necesarios para llevar a cabo el control de calidad de las muestras y realizar los ensayos de K-RAS para 20 ó 80 reacciones, según el tamaño del kit.

Tamaño del kit Código del producto DxS

Número de pedido para Roche Diagnostics

20 reacciones KR-21 05366216190 80 reacciones KR-22 05366224190

El número de muestras que puede analizarse depende del tamaño del lote de muestras.

Tabla 2: contenido del Kit de K-RAS

Reactivos incluidos 20

reacciones80

reacciones Tubo Volumen Volumen

Mezcla de reacción para control 1300 µl 5200 µl 1 Mezcla de reacción para 12ALA 650 µl 2600 µl 2 Mezcla de reacción para 12ASP 650 µl 2600 µl 3 Mezcla de reacción para 12ARG 650 µl 2600 µl 4 Mezcla de reacción para 12CYS 650 µl 2600 µl 5 Mezcla de reacción para 12SER 650 µl 2600 µl 6 Mezcla de reacción para 12VAL 650 µl 2600 µl 7 Mezcla de reacción para 13ASP 650 µl 2600 µl 8 Estándar mezclado 300 µl 1000 µl 9 Taq ADN polimerasa 60 µl 240 µl 10

Equipo y reactivos no suministrados con el Kit de K-RAS El usuario necesita el equipo y los consumibles que se indican a continuación:

• Equipo LightCycler® 480 o equipo para la PCR en tiempo real ABI7500, capaces de ejecutar ciclos tal como se define en el apartado 9; Protocolo de detección de mutaciones del gen K-RAS.

• Programa LightCycler® Adapt Software v1.1 de Roche Diagnostics (Nº de catálogo 05474914001).


Página 7 de 42

• Placas para PCR exentas de DNAsa de 0,2 ml (equipo LightCycler® 480 con placa de 96 pocillos, número de catálogo 04729692 001, o placa de reacción óptica con 96 pocillos ABI MicroAmp (número de referencia 4306737) con película adhesiva de calidad óptica de MicroAmp, número de referencia 4311971).

• Tubos estériles para la preparación de las mezclas maestras. • Pipetas exclusivas para la preparación de la mezcla para PCR. • Pipetas exclusivas para la dispensación de ADN plantilla. • H2O libre de nucleasa estéril

5. ADVERTENCIAS Y PRECAUCIONES

Para uso de diagnóstico in vitro.

El Kit de K-RAS no se ha diseñado para el cribado ni el diagnóstico de ningún tipo de cáncer, incluido el cáncer colorrectal. Su objetivo es servir como complemento de otros factores pronósticos utilizados actualmente para la selección de pacientes que no podrían beneficiarse de las terapias anticancerígenas por inhibición del EGFR.

Las terapias para pacientes con cáncer no deberían basarse únicamente en el estado de la mutación del gen K-RAS. Los médicos deben valorar el estado de la mutación del paciente junto con otros factores de la enfermedad.

El contenido del Kit de K-RAS se puede congelar/descongelar hasta 8 veces sin que se vea afectado el rendimiento del ensayo. NO congele/descongele los reactivos del Kit de K-RAS más de 8 veces.

Es importante tener en cuenta la posibilidad de que la información de las muestras de tumores y los datos de una muestra de tumor no coincidan con otras secciones del mismo tumor. Las muestras de tumores también pueden contener tejido no tumoral. En un principio, no se prevé que el ADN del tejido no tumoral contenga las mutaciones del gen K-RAS que detecta el Kit de K-RAS.

Todos los ensayos del Kit de K-RAS generan productos de PCR cortos. Sin embargo, el Kit de K-RAS no funciona correctamente con el ADN muy fragmentado.

La validación del ADN debería basarse en la PCR y puede diferir de la cuantificación basada en las lecturas de densidad óptica. Se suministra una mezcla de reacción para control adicional para permitir la validación de la calidad y la cantidad del ADN en las muestras antes de ejecutar el Kit de K-RAS.

Los reactivos del Kit de K-RAS presentan una dilución óptima. No se recomienda una mayor dilución, puesto que disminuiría el rendimiento. No se recomienda utilizar de volúmenes de reacción inferiores a 25 µl porque aumentan el riesgo de falsos negativos.


Página 8 de 42

Todos los reactivos del Kit de K-RAS se han formulado específicamente para su uso con las pruebas mencionadas. No deberían sustituirse los reactivos del Kit de K-RAS si se pretende mantener un rendimiento óptimo.

Para garantizar una actividad y un rendimiento óptimos, los cebadores Scorpions (así como todas las moléculas marcadas con fluorescencia) deben protegerse de la luz para evitar el blanqueamiento.

Extreme la precaución para evitar la contaminación de las reacciones de PCR con material de control sintético. Se recomienda utilizar pipetas diferentes para hacer las mezclas de reacción y añadir ADN plantilla. La preparación y dispensación de las mezclas de reacción debería realizarse en una zona separada a la de donde sea añada la plantilla. No abra los tubos después de la reacción de la PCR.

Cada ensayo incluido en el Kit de K-RAS tiene características especiales. El cálculo del resultado debe realizarse con los parámetros de ensayo correctos (consulte el apartado sobre interpretación de los informes y los datos).

Los valores de Ct de mutación de 38 o superiores se deben clasificar como negativos o como inferiores a los límites del Kit.

Los ensayos contienen una reacción de control exógeno (control interno) además de la reacción de interés (consulte el apartado Principios tecnológicos). Si ambos ensayos dan error, no deben utilizarse los datos obtenidos puesto que puede haber inhibidores que generarían falsos negativos. La dilución de la muestra puede reducir el efecto de los inhibidores, aunque se debe tener en cuenta que esto también diluiría el ADN.

Se deben aplicar las precauciones generales de laboratorio como, entre otras, las siguientes:

a) No pipetee con la boca. b) No fume, coma ni beba en áreas donde se están utilizando las

muestras o los reactivos del kit. c) Lávese las manos después de realizar la prueba.

Utilice solamente la enzima Taq polimerasa (Taq) suministrada con el kit; no la sustituya con Taq de otros kits del mismo tipo o de cualquier otro ni con Taq de otros proveedores.

Descongele solamente los reactivos necesarios para cada serie, no el kit entero cada vez, a fin de reducir al mínimo los ciclos de congelación/descongelación.

Información de seguridad Precaución: todos los materiales químicos y biológicos deben ser considerados potencialmente peligrosos. Las muestras son potencialmente infecciosas y deberían tratarse como tal.


Página 9 de 42

El Kit de K-RAS únicamente deben utilizarlo las personas que hayan recibido la formación adecuada en las técnicas de laboratorio correspondientes. Cuando trabaje con los componentes de este Kit de K-RAS, utilice siempre una bata de laboratorio adecuada, guantes desechables y gafas de seguridad. Después de su uso, los componentes del Kit de K-RAS deben desecharse como residuo clínico. 6. Condiciones de almacenamiento, estabilidad y envío Almacenamiento Todo el contenido del Kit de K-RAS debe almacenarse inmediatamente tras la recepción a una temperatura comprendida entre -18 °C y -25 °C, a oscuras y en un congelador que mantenga la temperatura constante. Evite la congelación y descongelación innecesaria del contenido del Kit de K-RAS. Estabilidad No utilice el Kit de K-RAS después de la fecha de caducidad mencionada. El contenido del Kit de K-RAS se mantiene estable hasta la fecha de caducidad si se almacena según las condiciones de almacenamiento recomendadas y se conserva en el envase original.

El contenido del Kit de K-RAS se puede congelar/descongelar hasta 8 veces sin que se vea afectado el rendimiento del ensayo. NO congele/descongele los reactivos del Kit de K-RAS más de 8 veces. Condiciones de envío El transporte del contenido del Kit de K-RAS se realiza en hielo seco y debe seguir congelado a la llegada. En caso de que el Kit de K-RAS no esté congelado al recibirlo, de que el embalaje externo se haya abierto durante el transporte o de que el envío no incluya la nota de embalaje, las instrucciones de uso o los reactivos, póngase en contacto con la oficina local de Roche Diagnostics (consulte el apartado 12, Asistencia técnica, para obtener la información de contacto). 7. Equipo Consulte el manual de usuario del equipo para conocer las instrucciones completas de instalación y uso del equipo de PCR en tiempo real. 8. Muestras El material de las muestras debe ser ADN genómico humano, obtenido de muestras de tumores colorrectales fijadas con formalina e incluidas en parafina.


Página 10 de 42

Obtención y preparación de las muestras 1. Transporte de las muestras: metodología anatomopatológica estándar

para garantizar la calidad de las muestras.

2. Proceso recomendado de extracción de muestras: extracción de ADN mediante el kit para ADN en tejidos FFPE de Qiagen QIAamp® (número de catálogo 56404).

Deben aplicarse las siguientes enmiendas al protocolo Qiagen: • Los cortes de FFPE deben colocarse en un portaobjetos de

vidrio. • El exceso de parafina localizado alrededor de los cortes

tisulares debe retirarse mediante un bisturí estéril nuevo. • El material del corte tisular debe depositarse en los tubos de

microcentrífuga utilizando un bisturí nuevo para cada muestra que se vaya a extraer.

• Debe esperarse a la compleción de la digestión de la proteinasa K. Este proceso puede tardar hasta 48 horas.

• Las muestras deben eluirse en 200 µl de tampón ATE del kit de extracción de Qiagen.

El usuario final deberá validar cualquier método alternativo para la preparación de muestras.

3. Almacenamiento del ADN extraído: debe almacenarse a -20 ˚C antes de realizar el análisis.

Protocolo de evaluación de las muestras Utilice la mezcla para ensayo de control adicional suministrada con el Kit de K-RAS para valorar el ADN total de la muestra. El ensayo de control amplifica una región del exón 4 del gen K-RAS. Las muestras deben prepararse únicamente con el ensayo de control y utilizando el estándar mezclado como control positivo y agua como control sin plantilla (negativo). Cabe mencionar que las muestras deben distribuirse en lotes para lograr un uso óptimo de los reactivos del Kit de K-RAS. Todas las series experimentales deben utilizar controles. Si las muestras se analizan por separado, se utilizarán más reactivos y será necesario disminuir el número de muestras que se pueden analizar con el Kit de K-RAS. Protocolo de evaluación de las muestras: configuración de la placa 1. Descongele la mezcla de reacción para el control y el estándar

mezclado del Kit de K-RAS a temperatura ambiente. Mezcle cada solución invirtiendo cada tubo 10 veces, después de descongelarlos, para evitar que se produzcan concentraciones localizadas de sales. Prepare suficientes mezclas para las muestras de ADN, una reacción para el estándar mezclado y una reacción para el control sin plantilla (negativo), más 2 reacciones adicionales.

2. Para crear la mezcla maestra, utilice las cantidades de reactivos por reacción que se indican en la tabla 3.


Página 11 de 42

Tabla 3: volúmenes de mezcla maestra por ensayo de control

Ensayo Mezcla maestra

Mezcla de reacción (µl)x1 Taq (µl)x1

Ensayo de control 19,8 0,2

3. NO mezcle en vórtex la enzima Taq ni ninguna mezcla de reacción que

contenga Taq, ya que se podría inactivar la enzima.

4. Asegúrese de que la enzima Taq se encuentra a temperatura ambiente antes de utilizarla. Gire el vial para asegurarse de que la totalidad de la enzima Taq se haya depositado en el fondo del vial. Después, pipetee colocando la punta de la pipeta bajo la superficie de la enzima Taq para minimizar el riesgo de que la punta quede excesivamente recubierta de Taq.

5. Mezcle la mezcla maestra pipeteando con cuidado en la zona superior e inferior.

6. Añada inmediatamente 20 µl de la mezcla maestra de control en cada pocillo de reacción.

7. Añada inmediatamente 5 µl de muestra, estándar mezclado o agua (en el caso de los controles negativos) a los pocillos de reacción.

8. Prepare la placa añadiendo el estándar mezclado al pocillo A1 y el control negativo (agua) al pocillo A2. El resto de los pocillos que se utilicen deben contener las muestras.

9. Cierre y gire brevemente la placa de PCR para que los reactivos se depositen en el fondo de los pocillos.

10. Siga los pasos de configuración del equipo correspondiente a la plataforma en uso.

Protocolo de evaluación de las muestras: configuración del equipo LightCycler® 480 1. Introduzca la placa inmediatamente en el equipo LightCycler® 480.

2. Seleccione el icono del programa LightCycler® 480 que se encuentra en el escritorio de la estación de trabajo conectada al equipo. Inicie el programa y desde la pantalla ‘Overview’ seleccione ‘New Experiment from Template’. Seleccione una de las plantillas de análisis incluidas, concretamente ‘K-RAS LC480II Run Template’. Esta plantilla presenta los siguientes parámetros:

1. El formato de detección es ‘DxS IVD Assays’.

2. El volumen de reacción es 25.


Página 12 de 42

3. Una fase de mantenimiento inicial a 95 ˚C durante 4 minutos.

4. Amplificación en dos pasos durante 45 ciclos con desnaturalización a 95 ˚C durante 30 segundos e hibridación a 60 ˚C durante 1 minuto. La adquisición de la fluorescencia es única y se produce en la fase a 60 ˚C.

3. Seleccione la pestaña ‘Sample Editor’ que aparece en ‘Step 1: Select Workflow’ y marque la casilla ‘Abs Quant’. En ‘Select Filter Combinations’, asegúrese de que se hayan seleccionado los dos filtros (465-510 nm y 533-580 nm). Establezca los nombres de la muestras en los pasos 2 y 3. El valor correspondiente a ’Quantification Sample Type’ debe definirse como ‘unknown’. La columna de réplica se debe dejar en blanco.

4. Haga clic en el botón ‘Experiment’ y luego en el botón ‘Start Run’ para guardar el experimento e iniciar los ciclos.

5. Una vez terminado el análisis, seleccione la pestaña ‘Analysis’ y elija la opción ‘Abs Quant/2nd Derivative Max’ de la ventana ‘Create New Analysis’. Acepte la configuración predeterminada de la pantalla ‘Create New Analysis’. Asegúrese de que el botón ‘Filter Comb’ tiene el valor ‘465-510’ y seleccione el botón ‘Calculate’. Los valores de Ct se muestran en la tabla ‘Samples’.

6. Seleccione el botón ‘Filter Comb’ y cambie los filtros a 533-580 nm. Seleccione el botón ‘Calculate’ y obtenga los valores de Ct del control exógeno de la tabla ‘Samples’.

Protocolo de evaluación de las muestras: configuración del equipo ABI7500 1. Introduzca la placa inmediatamente en el equipo ABI7500.

2. Seleccione el icono del programa del sistema 7500 que se encuentra en el escritorio de la estación de trabajo conectada al equipo. Abra un nuevo archivo de análisis del menú de archivos del programa 7500 Sequence Detection versión 1.4.

3. En ‘Assay’, seleccione ‘Standard Curve (Absolute Quantification)’. En ‘Run Mode’, seleccione ‘Standard 7500’.

4. Desplácese hasta la ventana de configuración de detectores con el botón ‘Next’. En la lista de detectores, añada un detector FAM y un detector JOE y defina los silenciadores con el valor ‘none’. Si estos detectores no aparecen ya en la lista, seleccione el botón ‘New Detectors’ y defina un detector FAM y un detector JOE con el silenciador definido en el valor ‘none’.

5. Establezca ‘Passive Reference’ en ‘None’ y seleccione el botón ‘Next’.


Página 13 de 42

6. Seleccione toda la placa y marque las casillas de los detectores FAM y JOE para garantizar que ambos marcadores se supervisan en cada pocillo. Seleccione el botón ‘Finish’.

7. En la pestaña ‘Instrument’, defina los ciclos tal como se indica en la tabla 4.

Tabla 4: condiciones de los ciclos en el sistema ABI7500

Temperatura Tiempo Ciclos Obtención de datos

Fase 1 95 oC 4 minutos 1 Fase 2 95 oC 30 segundos 60 oC 1 minuto 40 FAM, JOE

8. Seleccione el botón ‘Start’ para guardar el experimento e iniciar los ciclos.

9. Al terminar la serie analítica, asegúrese de que la referencia pasiva está definida en el valor ‘none’ en la pantalla de inspección de pocillos. En la pestaña 'Amplification Plot', seleccione todos los pocillos en uso y seleccione el marcador JOE del menú desplegable de detectores.

10. Compruebe la señal JOE de cada muestra y compárela con la señal JOE del pocillo con NTC. Tenga en cuenta las muestras con una curva de amplificación posterior o cuyo control exógeno no presente amplificación en comparación con el NTC.

11. En la pestaña ‘Amplification Plot’, seleccione todos los pocillos en uso y seleccione el marcador FAM del menú desplegable de detectores. Utilice la configuración de referencia automática y el Ct manual y luego defina el umbral manualmente en la mitad de la fase exponencial, utilizando la escala logarítmica para el eje Y, tal como se describe en la Guía de usuario del sistema ABI7500.

12. Seleccione el botón ‘Analyse’ para obtener los valores de Ct. Interpretación de la validación de las muestras Revise los valores de Ct del NTC para asegurarse de que no exista contaminación que dé lugar a una amplificación positiva en el canal FAM (Ct inferior a 40) o una reacción negativa del control exógeno en el canal HEX (ausencia de Ct), lo que indicaría un problema de configuración. El estándar mezclado debe dar un valor de Ct de 26-29 para el ensayo de control (canal FAM) realizado en el sistema ABI7500 y ≤ 29 en el equipo LightCycler® 480. No deben utilizarse los datos si alguno de estos 2 controles de análisis da error.


Página 14 de 42

Valor de Ct del ensayo de control comprendido entre 29-35: interprete con precaución los datos ya que es posible que no se hayan detectado las mutaciones de bajo nivel.

Valor de Ct del ensayo comprendido entre 35 y 38: En estos casos, en las muestras sólo existen algunas copias amplificables de ADN y es probable que las mutaciones sólo se detecten si la mayoría de las copias presentan mutaciones.

Valor de Ct del ensayo de control ≥ 38: en estos casos debe rechazarse la muestra porque el ADN presente es mínimo y el Kit de K-RAS no podrá detectar las mutaciones.

Tenga en cuenta que si el valor de Ct del ensayo de control genera un valor tardío, el valor de Ct del control exógeno de la muestra deberá compararse con el control exógeno del NTC. Si el control exógeno de la muestra se retrasa o es negativo, en comparación con el NTC, es posible que exista un inhibidor. El efecto del inhibidor se puede reducir diluyendo la muestra, aunque esto también diluirá el ADN.

Dilución de la muestra: un valor de Ct para el control < 24 sobrecargará los ensayos de mutación. Las muestras con un valor de Ct para el control < 24 se deben diluir. Se debe tener en cuenta que, en el equipo LightCycler® 480, los valores de Ct obtenidos mediante el método de la segunda derivada pueden ser ligeramente diferentes a los obtenidos con el programa LightCycler® Adapt Software. Se recomienda diluir las muestras concentradas para que sus resultados se encuentren en el intervalo > 24 y < 29 (valores de Ct basados en el programa 7500 Sequence Detection o en el programa LightCycler® 480 Instrument Software), partiendo de la premisa que establece que dilución del 50% producirá un incremento unitario del valor de Ct. 9. Protocolo de detección de mutaciones del gen K-RAS

Lea estas instrucciones detenidamente y familiarícese con todos los componentes del Kit de K-RAS antes de empezar a utilizarlo.

Para utilizar el Kit de K-RAS de forma eficaz, las muestras se deben distribuir en lotes de 10 (para rellenar una placa de 96 pocillos). Un tamaño de lote inferior a 10 implica que se pueden analizar menos muestras con el Kit de K-RAS. Configuración experimental del equipo LightCycler® 480

En cada muestra de ADN, los ensayos de control y la mutación deben analizarse en la misma serie analítica de PCR para evitar las variaciones entre series.

1. Descongele las mezclas de reacción y el estándar mezclado del Kit de K-RAS a temperatura ambiente. Mezcle cada solución invirtiendo cada tubo 10 veces, después de descongelarlos, para evitar concentraciones localizadas de sales.


Página 15 de 42

Prepare suficientes mezclas para las muestras de ADN, el estándar mezclado y los controles negativos, más 2 reacciones adicionales por mezcla, tal y como se indica en la tabla 5.

Tabla 5: volúmenes de mezcla maestra para K-RAS

Ensayo Mezclas maestras

Mezcla de reacción (µl)x1 Taq (µl)x1 Mezcla de reacción

(µl) por placa (x14)Taq (µl) por placa

(x14) Ensayo de

control 19,8 0,2 277,2 2,8

Ensayos de mutación 19,8 0,2 277,2 2,8

2. NO mezcle en vórtex la enzima Taq ni ninguna mezcla de reacción que contenga la enzima Taq, ya que podría quedar inactiva.

3. Asegúrese de que la enzima Taq se encuentra a temperatura ambiente antes de utilizarla. Gire el vial para asegurarse de que la totalidad de la enzima Taq se haya depositado en el fondo. Después, pipetee colocando la punta de la pipeta bajo la superficie de la enzima Taq para minimizar el riesgo de que la punta quede excesivamente recubierta de Taq.

4. Pipetee con cuidado en la zona superior e inferior para mezclar las mezclas maestras.

5. Añada inmediatamente 20 µl de las mezclas a los pocillos de reacción.

6. Añada inmediatamente 5 µl de muestra, estándar mezclado o agua (en el caso de los controles negativos) a los pocillos de reacción. Cada muestra de ADN se debe analizar tanto con el ensayo de control como con el ensayo de mutación. En la tabla 6 se ilustra la configuración de la placa.


Página 16 de 42

Tabla 6: disposición de la placa del Kit de K-RAS

Disposición de 96 pocillos

Ensayo 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A

Control Estándar mezclado NTC Muestra 1 Muestra 2 Muestra 3 Muestra 4 Muestra 5 Muestra 6 Muestra 7 Muestra 8 Muestra 9 Muestra 10

B 12ALA

Estándar mezclado NTC Muestra 1 Muestra 2 Muestra 3 Muestra 4 Muestra 5 Muestra 6 Muestra 7 Muestra 8 Muestra 9 Muestra 10

C 12ASP


D 12ARG


E 12CYS


F 12SER


G 12VAL


H 13ASP


7. Cierre y gire brevemente la placa de PCR para que los reactivos se

depositen en el fondo de los pocillos.

8. Introduzca la placa inmediatamente en el equipo LightCycler® 480. Configuración del equipo LightCycler® 480 1. Seleccione el icono del programa del equipo LightCycler® 480 que se

encuentra en el escritorio de la estación de trabajo conectada al equipo. Inicie el programa y seleccione ‘New Experiment from Template’ en la pantalla ‘Overview’.

2. En la lista ‘Run Templates’, seleccione ‘K-RAS LC480II Run Template’ (consulte el apartado sobre la validación de las muestras del equipo LightCycler® 480 para obtener más información).

3. Seleccione la pestaña ‘Sample Editor’ y luego el cuadro de selección ‘Abs Quant’ en ‘Step 1: Select Workflow’. En ‘Select Filter Combinations’, asegúrese de que se hayan seleccionado los dos filtros (465-510 nm y 533-580 nm). Establezca los nombres de las muestras en los cuadros ‘Step 2’ y ‘Step 3’. En la columna 1, el nombre de la muestra debe ser ‘Mixed Standard’. En la columna 2, el nombre de la muestra debe ser NTC. Introduzca los nombres de las muestras en las columnas 3 a 12. Los nombres deben ser idénticos en todos los pocillos de la columna 1. La opción ‘Quantification Sample Type’ debe establecerse con el valor ‘unknown’. La columna de réplicas debe permanecer vacía, ya que el programa LightCycler® Adapt Software no tiene en cuenta las réplicas.


Página 17 de 42

4. Haga clic en el botón ‘Experiment’ y luego en el botón ‘Start Run’ para guardar el experimento e iniciar los ciclos.

Análisis de las muestras en el equipo LightCycler® 480 1. Una vez finalizada la serie analítica en el equipo LightCycler® 480,

utilice la ventana de exploración para exportar el experimento (archivo .ixo) a una ubicación adecuada a la que pueda acceder mediante el programa LightCycler® Adapt Software.

2. IMPORTANTE: el programa LightCycler® Adapt Software se ha validado para su uso en sistemas de un solo ordenador definidos como unidad de control única (estación de trabajo), equipos suministrados por Roche Diagnostics para su uso con un único sistema LightCycler® 480 (Equipo II). Esta validación del programa LightCycler® Adapt Software se aplica actualmente sólo a las unidades de control que actúan como ordenadores independientes (p. ej., ordenadores que no forman parte de un red). Se prohíbe el uso de cualquier otro ordenador dado que el programa no funcionaría correctamente.

3. Abra el programa LightCycler® Adapt Software haciendo clic en el icono del programa LightCycler® Adapt Software situado en el escritorio de la estación de trabajo e introduzca el nombre de usuario en el campo ‘username’. Este nombre se utilizará para indicar el autor del informe.

4. En la ventana principal, utilice el botón para examinar y seleccione un único archivo de análisis del equipo LightCycler® 480 (para deshacer cualquier selección, cierre y vuelva a abrir el programa).

5. Seleccione un tipo de informe (pdf o csv). Si se selecciona el formato csv, se creará automáticamente una versión pdf.

6. Seleccione ‘Analyse’ para elaborar el informe de resultados. El informe se guarda automáticamente en una carpeta donde también se almacena el archivo de análisis con el mismo nombre que el archivo de análisis.

7. El informe se muestra automáticamente.

8. Los resultados del informe se muestran en la columna ‘Mutation Status’ de la tabla ‘Sample Result Table’.

Interpretación de informes en el programa LightCycler® Adapt Software 1. Los informes elaborados por el programa LightCycler® Adapt Software

contienen información general sobre el análisis. 1.1. El autor del informe es la persona que ha ejecutado el programa y

elaborado el informe. 1.2. La fecha y hora del análisis se indican en el mismo.


Página 18 de 42

2. El informe muestra un resumen del análisis, donde se detalla el nombre del archivo de análisis utilizado, así como el archivo de definiciones de algoritmos y la secuencia del algoritmo. Los detalles del algoritmo son invariables, por lo que no pueden modificarse.

3. La sección de resultados incluye el nombre completo y la ruta del archivo de análisis en el equipo LightCycler® 480, junto con la siguiente información: 3.1. Número de serie del equipo LightCycler® 480 3.2. ‘Instrument Name’: identificador asociado al equipo LightCycler®

480 en el programa del equipo LightCycler® 480 3.3. ‘Run Date’: fecha y hora del análisis en el equipo LightCycler® 480 3.4. ‘Run Operator’: nombre de la persona que ha iniciado sesión en el

programa del equipo LightCycler® 480 para la ejecución del análisis

3.5. ‘Experiment Name’: nombre del archivo de análisis 3.6. ‘Software Version’: versión del programa instalado en el equipo

LightCycler® 480 3.7. ‘Lot Number’: número procedente del campo ‘Lot No’ situado en la

pantalla de configuración del experimento, dentro del programa LightCycler® 480

4. La disposición de la placa se indica con los nombres de las muestras que aparecen en la pantalla del editor de muestras del programa del equipo LightCycler® 480.

5. En la sección ‘Run Summary Result’ se indica si el análisis se considera ‘Valid’ (válido) o ‘Invalid’ (no válido). El resultado depende de los controles de análisis expuestos en las columnas 1 y 2.

6. Controles de análisis 6.1. El programa LightCycler® Adapt Software calcula

automáticamente el valor de ∆Ct del estándar mezclado mediante la siguiente fórmula:

Ct de mutación-Ct de control=∆Ct 6.2. El programa LightCycler® Adapt Software compara los valores con

los valores previstos que se muestran en la tabla 7.

Tabla 7: valores de ∆Ct previstos del programa LightCycler® Adapt Software

Ensayo ∆Ct del estándar mezclado12ALA -0,61 12ASP -0,61 12ARG 0,34 12CYS -0,79 12SER -0,1312VAL 0,1 13ASP -0,74

6.3. En el informe se presentan los valores de Ct y ∆Ct.


Página 19 de 42

6.4. Los controles de análisis de las columnas 1 y 2 generan los siguientes indicadores/advertencias:

Tabla 8: indicadores/advertencias para controles de análisis del programa LightCycler® Adapt Software

Indicador/Advertencia SignificadoCT_OUT_OF_RANGE El Ct de FAM del ensayo de control está fuera

del intervalo EXO_FAIL Para el estándar mezclado, se obtiene un Ct < 30

para el control exógeno o bien es negativo cuando el resultado de FAM es negativo.

DELTA_CT_OUT_OF_RANGE Los valores de ∆Ct de la mutación están fuera del intervalo definido.

EXO_CONTROL_INVALID La reacción del control exógeno ha dado error en un NTC.

TARGET_CHANNEL_INVALID La reacción de FAM tiene un valor de Ct positivo en un NTC.

6.4.1. El significado de los indicadores y las advertencias se

explica detalladamente a continuación:

6.4.1.1. CT_OUT_OF_RANGE: el ensayo de control del estándar mezclado debe tener un valor de Ct igual a 26,60 ± 2. Si el ensayo se encuentra fuera del intervalo, se mostrará este indicador/esta advertencia para todos los pocillos de estándar mezclado, puesto que no se habrán calculado los valores de ∆Ct y el estándar mezclado no será válido. Esto evidencia el funcionamiento incorrecto del ensayo de control.

6.4.1.2. EXO_FAIL: este indicador/esta advertencia aparece cuando el ensayo del control exógeno en alguno de los pocillos de estándar mezclado es inferior a 30, valor que indica la existencia de contaminación de PCR en la mezcla. Si el ensayo del control exógeno da error cuando una reacción de FAM es errónea en alguno de los pocillos de estándar mezclado, el indicador/la advertencia EXO_FAIL se mostrará igualmente. Esto indica la existencia de un problema con el ensayo que podría generar falsos negativos. El estándar mezclado queda invalidado a causa del error de FAM.

6.4.1.3. DELTA_CT_OUT_OF_RANGE: si los valores de ∆Ct del estándar mezclado se encuentran en el intervalo ±2,00 de los valores indicados en la tabla 7, el programa notificará que el estado es válido. Si el valor de ∆Ct está por encima del intervalo previsto, el estado será no válido y aparecerá este mensaje/esta advertencia. Esto indica un problema con el ensayo que podría generar resultados falsos.


Página 20 de 42

6.4.1.4. EXO_CONTROL_INVALID: en los pocillos de control sin plantilla (negativo), el ensayo del control exógeno debe generar un resultado positivo en los 8 pocillos (Ct < 41). Si se obtiene un resultado negativo, se mostrará este indicador/esta advertencia y el estado será no válido. Esto indica un problema con el ensayo que podría generar resultados incorrectos.

6.4.1.5. TARGET_CHANNEL_INVALID: en los 8 pocillos del control sin plantilla, el resultado de FAM debe ser negativo (Ct > 38). Cualquier amplificación indica la existencia de contaminación. Si el resultado es positivo, se mostrará este indicador/esta advertencia y se invalidará el control sin plantilla (negativo).

6.5. En caso de que alguno de los pocillos con estándar mezclado o los pocillos con control sin plantilla (negativo) obtengan un resultado no válido, la sección ‘Run Summary Result’ mostrará el valor ‘Run Invalid’ para indicar que el análisis no es válido. La tabla ‘Sample Result Table’ incluirá los nombres de las muestras y los valores de Ct del control, aunque el estado de la mutación será ‘invalid’ (no válido). El estándar mezclado indica que todos los ensayos funcionan correctamente. Si éste no fuera el caso, el programa podría indicar que se trata de una mutación con un resultado de falso positivo o falso negativo. El control sin plantilla (negativo) indica la ausencia de contaminación en las mezclas maestras y el funcionamiento correcto del control exógeno.

6.6. En el caso improbable de que el programa LightCycler® Adapt Software genere un mensaje de error, consulte el apartado 12, Asistencia técnica.

7. Resultados de las muestras 7.1. La tabla ‘Sample Result Table’ de resultados de las muestras

contiene los nombres de las muestras procedentes del programa del equipo LightCycler® 480, además de los valores de Ct del ensayo de control.

7.2. El programa LightCycler® 480 Adapt Software calculará los valores de ∆Ct y determinará si una muestra es positiva o negativa para la mutación en función de los valores de corte del 1% indicados en la tabla 9.


Página 21 de 42

Tabla 9: valores de corte del 1% del programa LightCycler® Adapt Software

Ensayo Ct delta del 1%12ALA 6,25 12ASP 7,7212ARG 6,83 12CYS 6,95 12SER 8,95 12VAL 6,5 13ASP 9,09

7.3. Si el valor de ∆Ct de una mutación para una muestra se encuentra

por debajo del valor de corte de ∆Ct del 1% indicado, la muestra se considera positiva para la mutación. El programa LightCycler® Adapt Software informará de la mutación existente, pero sólo notificará una única mutación. Si se dan 2 valores de ∆Ct positivos, se mostrará el valor inferior. Se asume que el segundo valor se obtiene por la reactividad cruzada de un cebador de mutación que utiliza una mutación distinta para la unión y el cebado. En el caso improbable de que se produzca una mutación doble, la decisión clínica será idéntica a la de la mutación simple.

7.4. Si los valores de ∆Ct de las muestras superan los valores de ∆Ct del 1%, la muestra se considera negativa para la mutación (es posible que contenga una mutación, pero a un nivel por debajo de los límites del kit).

7.5. Indicadores/Advertencias 7.5.1. El programa LightCycler® Adapt Software genera una serie

de indicadores/advertencias para las muestras de la tabla ‘Sample Result Table’, tal y como se describe en la tabla 10.

Tabla 10: indicadores/advertencias para muestras del programa LightCycler® Adapt Software

Indicadores/Advertencias Significado

REP_DILUTION El control de Ct es inferior a 24. CONF_LEVEL El control de Ct es superior a 28,9 y no se notifica

ninguna mutación.LIMITED El control de Ct es superior a 35.

EXO_FAIL El ensayo del control exógeno no se ha realizado correctamente debido a que la reacción de FAM también

ha resultado errónea en una reacción de mutación, o bien el Ct del control exógeno es inferior a 30.

FAIL El programa no es capaz de determinar si la curva es positiva o negativa.


Página 22 de 42

7.5.2. El significado de los indicadores y las advertencias se explica detalladamente a continuación:-

7.5.2.1. REP_DILUTION: Ct de control < 24. Los ensayos se han validado con relación a un nivel de ADN con un Ct de control igual o superior a 24. Si una muestra genera un valor de Ct para el ensayo de control inferior, será necesaria su dilución para garantizar que esté dentro del intervalo de funcionamiento válido.

7.5.2.2. CONF_LEVEL: Ct de control > 28,9. Se mostrará el indicador/la advertencia CONF_LEVEL para las muestras negativas con un Ct de control > 28,9. Los valores de Ct de la mutación se consideran negativos o por encima de los límites del kit cuando son superiores o equivalentes a 38. Es necesario que el Ct de control sea igual o inferior a 28,9 para disponer de ADN suficiente y poder detectar el 1% de mutaciones, según los valores de corte del 1% y un valor de corte de Ct de 38. Si el Ct de control es superior a 28,9 y se detecta una mutación, el programa informará de una mutación positiva y no se mostrará este indicador/esta advertencia porque la muestra contiene una mutación fija. No obstante, si el Ct de control está por encima de 28,9 y todo parece indicar que la muestra es negativa para la mutación, se mostrará este indicador/esta advertencia para avisar de la posibilidad de que se hayan ignorado las mutaciones de bajo nivel. A media que el Ct de control aumenta por encima de 28,9, disminuye la sensibilidad de detección de las mutaciones.

7.5.2.3. LIMITED: Ct de control > 35. Indica la existencia de muy poco ADN amplificable, por lo que sólo se podrán detectar las mutaciones presentes en un porcentaje elevado. En el caso de las muestras pertenecientes a la categoría LIMITED, si una mutación positiva genera un Ct < 38, el programa la seguirá considerando y presentando como válida. No debe descartarse la presencia de mutaciones de bajo nivel en una muestra con un resultado negativo y el indicador/la advertencia LIMITED.

7.5.2.4. EXO_FAIL: el programa comprueba la amplificación del ensayo del control exógeno para determinar la presencia de un inhibidor, que podría dar lugar a falsos negativos. Se aplica la siguiente lógica:-


Página 23 de 42

a. La reacción del control exógeno se valorará únicamente en los pocillos de reacción de la mutación, no en el pocillo del ensayo de control, a excepción del el estándar mezclado y las columnas de NTC (consulte el punto 6) o si hay un Ct < 30 para el control exógeno.

b. Si el programa determina que existe una mutación positiva pero informa de un error en el ensayo del control exógeno en el pocillo positivo para la mutación, no se mostrará el indicador/la advertencia EXO_FAIL, ya que podría haber una posible inhibición competidora desde la reacción de FAM. El estado de la mutación es válido.

c. Si el programa determina que existe una mutación positiva para una muestra en un pocillo de mutación y un error en el ensayo del control exógeno de otro pocillo de mutación de la misma muestra, se indicará que existe una mutación en el primer pocillo y el resultado se considerará válido. No obstante, se mostrará el indicador/la advertencia EXO_FAIL. Esto indica un problema con el ensayo del pocillo donde se ha producido el error del ensayo del control exógeno y la posibilidad de que se haya ignorado una mutación en este pocillo. Es posible que la mutación indicada contenga reactividad cruzada entre los ensayos en lugar de una mutación real, que se puede haber omitido. Sin embargo, el estado de la mutación del ensayo que genera la mutación positiva sigue siendo válido, pues existe una mutación clara y la decisión clínica no se modifica, independientemente del tipo de mutación.

d. Si la muestra se considera negativa pero se ha producido un error en alguno de los ensayos de mutación de la reacción del control exógeno, se mostrará el indicador/la advertencia EXO_FAIL y el estado no será válido. Es posible que se haya omitido una mutación.

e. Si el Ct del ensayo del control exógeno es < 30 en alguno de los 8 pocillos, se mostrará el indicador/la advertencia EXO_FAIL y el estado no será válido. Es posible que exista contaminación del producto de PCR en este ensayo.

f. Existe la opción de revisar el archivo de análisis del equipo LightCycler® 480 para determinar las posibles causas de error del ensayo del control exógeno. Si todas las reacciones del control exógeno resultan erróneas en una columna, debe considerarse la presencia de algún inhibidor.


Página 24 de 42

Si el error se produce en 1 pocillo solamente, puede que el problema radique en la configuración de la placa.

7.5.2.5. FAIL: se mostrará el indicador/la advertencia FAIL cuando el programa no puede determinar si una curva de amplificación es positiva o negativa (p. ej. debido a una forma de curva anómala).

7.5.3. El programa LightCycler® Adapt Software comprueba que el nombre de la muestra de una columna sea idéntico. El objetivo es garantizar que los valores de Ct de la mutación y el ensayo de control utilizados para calcular los valores de ∆Ct proceden de la misma muestra. Los nombres de las muestras se obtienen del archivo de análisis del experimento ubicado en la pantalla del editor de muestras del equipo LightCycler® 480. Si se produce un error de coincidencia en la columna, el programa mostrará el mensaje ‘SAMPLE MISMATCH’ en la columna ‘Sample Name’ de la tabla ‘Sample Result Table’. En la disposición de la placa, el programa muestra el nombre de la muestra seguido de (MISMATCH). Si se trata de un error de escritura, se puede corregir el nombre en el archivo de análisis del equipo LightCycler® 480 y volver a analizar los datos con el programa LightCycler® Adapt Software.

Configuración experimental del sistema ABI7500

Para cada muestra de ADN, los ensayos de control y de mutación se deben analizar en la misma serie de PCR a fin de evitar variaciones entre series analíticas.

1. Descongele las mezclas de reacción y el estándar mezclado del Kit de K-RAS a temperatura ambiente. Mezcle cada solución invirtiendo cada tubo 10 veces, después de descongelarlos, para evitar concentraciones localizadas de sales. Prepare suficientes mezclas para las muestras de ADN, el estándar mezclado y los controles sin plantilla (negativos), además de 2 reacciones adicionales por mezcla, tal y como se indica en la tabla 11.

Tabla 11: volúmenes de mezcla maestra de K-RAS

Ensayo Mezclas maestras

Mezcla de reacción (µl)x1 Taq (µl)x1 Mezcla de reacción

(µl) por placa (x14)Taq (µl) por placa

(x14) Ensayo de

control 19,8 0,2 277,2 2,8

Ensayo de mutación 19,8 0,2 277,2 2,8

2. NO mezcle en vórtex la enzima Taq ni ninguna mezcla de reacción

que contenga Taq, ya que se podría inactivar la enzima.


Página 25 de 42

3. Asegúrese de que la enzima Taq se encuentra a temperatura ambiente antes de utilizarla. Gire el vial para asegurarse de que la totalidad de la enzima Taq se haya depositado en el fondo. Después, pipetee colocando la punta de la pipeta bajo la superficie de la enzima Taq para minimizar el riesgo de que la punta quede excesivamente recubierta de Taq.

4. Mezcle las mezclas maestras pipeteando con cuidado en la zona superior e inferior.

5. Añada inmediatamente 20 µl de las mezclas maestras en los pocillos de reacción.

6. Añada inmediatamente 5 µl de muestra, estándar mezclado o agua (en el caso de los controles negativos) en los pocillos de reacción. Cada muestra de ADN se debe analizar tanto con el ensayo de control como con el ensayo de mutación. En la tabla 12 se ilustra la configuración de la placa.

Tabla 12: disposición de la placa de K-RAS en el sistema ABI7500

Disposición de 96 pocillos

Ensayo 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A

Control Estándar mezclado NTC Muestra

1 Muestra 2 Muestra

3 Muestra 4 Muestra 5 Muestra


9 Muestra 10

B 12ALA

Estándar mezclado NTC Muestra

1 Muestra 2 Muestra



9 Muestra 10

C 12ASP


1 Muestra 2 Muestra



9 Muestra 10

D 12ARG


1 Muestra 2 Muestra



9 Muestra 10

E 12CYS


1 Muestra 2 Muestra



9 Muestra 10

F 12SER


1 Muestra 2 Muestra



9 Muestra 10

G 12VAL


1 Muestra 2 Muestra



9 Muestra 10

H 13ASP


1 Muestra 2 Muestra



9 Muestra 10

7. Cierre y gire brevemente la placa de PCR para que los reactivos se

depositen en el fondo de los pocillos.

8. Introduzca la placa inmediatamente en el equipo ABI7500.

Configuración del equipo ABI7500 1. Seleccione el icono del programa del sistema 7500 que se encuentra

en el escritorio de la estación de trabajo conectada al equipo. Abra un nuevo archivo de análisis del menú de archivos mediante el programa 7500 Sequence Detection Software, versión 1.4.


Página 26 de 42

2. En ‘Assay’, seleccione ‘Standard Curve (Absolute Quantification)’. En ‘Run Mode’, seleccione ‘Standard 7500’.

3. Desplácese hasta la ventana de configuración de detectores con el botón ‘Next’. En la lista de detectores, añada un detector FAM y un detector JOE y defina los silenciadores con el valor ‘none’. Si estos detectores no aparecen ya en la lista, seleccione el botón ‘New Detectors’ y defina un detector FAM y un detector JOE con el silenciador definido en el valor ‘none’.

4. Establezca ‘Passive Reference’ en ‘None’ y seleccione el botón ‘Next’.

5. Seleccione toda la placa y marque las casillas de los detectores FAM y JOE para garantizar que ambos marcadores se supervisan en cada pocillo. Seleccione el botón ‘Finish’.

6. En la pestaña ‘Instrument’, defina los ciclos tal como se indica en la tabla 13.

Tabla 13: condiciones de los ciclos en el sistema ABI7500

Temperatura Tiempo Ciclos Obtención de datos

Fase 1 95 oC 4 minutos 1 Fase 2 95 oC 30 segundos 60 oC 1 minuto 40 FAM, JOE

7. Seleccione el botón ‘Start’ para guardar el experimento e iniciar los

ciclos.

Análisis de las muestras en el sistema ABI7500 1. Asegúrese de que la referencia pasiva está definida en el valor ‘none’

en la pantalla de inspección de pocillos.

2. Compruebe que cada pocillo emite una señal JOE desde el ensayo de control exógeno. a. Si el ensayo de control exógeno arroja un resultado positivo,

prosiga con el análisis. b. Si el ensayo de control exógeno es erróneo pero la reacción de

FAM se ha amplificado suficientemente, prosiga con el análisis puesto que la reacción de FAM tiene prioridad sobre la reacción del control exógeno.

c. Si las dos reacciones, la de FAM y la del control exógeno, no se producen correctamente, descarte los datos puesto que puede haber inhibidores. Estos inhibidores podrían conducir a falsos negativos.

3. En la pestaña ‘Amplification Plot’, seleccione todos los pocillos en uso y seleccione el marcador FAM del menú desplegable de detectores.


Página 27 de 42

Use la configuración de línea de base automática y el Ct manual y, a continuación, defina el umbral manualmente en la mitad de la fase exponencial, mediante la escala logarítmica para el eje Y, tal como se describe en la Guía de usuario del sistema ABI7500.

4. Analice los datos y calcule el valor de ∆Ct de la siguiente forma: [Ct del ensayo de mutación de la muestra] – [Ct del ensayo de control de la muestra] =∆Ct

Los datos se pueden exportar a Microsoft Excel para facilitar su análisis.

Interpretación de los datos del sistema ABI7500 1. Valores de Ct de control:

1.1. El valor de Ct de control debe ser ≥ 24 para evitar una sobrecarga del ensayo.

1.2. Ct de control < 29: el Kit de K-RAS ofrece una capacidad de detección hasta un mínimo de un 1% de mutaciones en estas muestras.

1.3. En las muestras con un Ct de control ≥ 29, el kit no detectará menos del 1% de las mutaciones, aunque sí detectará mutaciones de nivel más elevado.

1.4. Con un Ct de control ≥ 35, en la muestra sólo habrá presentes algunas copias amplificables de ADN, y las mutaciones únicamente son detectables si hay numerosas copias con mutaciones.

1.5. En el caso de un Ct de control ≥ 38, el ADN será limitado y no se podrán usar los datos.

2. Valores de ∆Ct del estándar mezclado 2.1. Los valores de ∆Ct del estándar mezclado deben ser los indicados

en la tabla 14, aunque se pueden producir variaciones de ±2 debido a configuraciones de umbrales distintas en equipos diferentes.

Tabla 14: valores de ∆Ct del estándar mezclado y puntos de corte del 1% en el sistema ABI7500

Ensayos ∆Ct del

estándar mezclado

Intervalo aceptable del

estándar mezclado

∆Ct del 1% de la

muestra

12ALA -0,70 De -2,70 a 1,30 6,5 12ASP -1,04 De -3,04 a 0,96 8 12ARG -0,02 De -2,02 a 1,98 8 12CYS -0,98 De -2,98 a 1,02 7 12SER 0,02 De -1,98 a 2,02 9 12VAL -0,19 De -2,19 a 1,81 6,5 13ASP -1,12 De -3,12 a 0,88 9


Página 28 de 42

3. Valores de ∆Ct de la muestra: 3.1. Si el valor de ∆Ct de la muestra es superior al valor del 1% (como

se indica en la tabla 14), la muestra de ADN será clasificada como negativa para las mutaciones o por debajo de los límites del Kit de K-RAS.

3.2. Si el valor de ∆Ct es inferior al valor del 1%, el ADN de la muestra se clasificará como positiva para las mutaciones.

3.3. Los valores de Ct de mutación de 38 o superiores se deben clasificar como negativos o por debajo de los límites del kit.

10. Limitaciones de la prueba Es preciso tener un Ct de ensayo de control de la muestra < 29 en el sistema ABI7500 y del < 28,9 en el equipo LightCycler® 480 para garantizar la detección del 1% de mutaciones en ADN normal de referencia. Los ensayos no podrán detectar el 1% de mutaciones en muestras con valores superiores de Ct; por su parte, la sensibilidad de la detección de mutaciones disminuirá puesto que el Ct de control aumenta por encima de esos valores.

El valor del Ct de control del ADN de la muestra se basa en la concentración determinada por la PCR. Los valores basados en las lecturas de densidad óptica no se corresponden con los valores de Ct del ensayo de control en muestras fragmentadas de ADN. Para poder realizar una validación del Ct de la muestra antes de analizar el kit se suministra una mezcla de reacción de control adicional.

Si una muestra arroja un resultado positivo de mutación donde el Ct de mutación es ≥ 38, el ensayo se debe clasificar como negativo o por debajo de los límites del kit. El programa LightCycler® Adapt Software lleva a cabo esto automáticamente.

Se puede producir reactividad cruzada entre las reacciones de mutación. Por ejemplo, si se observa una mutación de 12ALA de gran nivel, algunas de las reacciones de mutación restantes también arrojarán un resultado positivo. Esto se debe a que los cebadores ARMS detectan otras mutaciones en bases cercanas. En material de control sintético, la reactividad cruzada forma un patrón legible en el sistema ABI7500 que permite que los positivos verdaderos se determinen a partir de varias señales (consulte la tabla 15).

Tabla 15: patrón de reactividad cruzada en el sistema ABI7500 a partir de material de control sintético

"Sí" indica la señal verdadera. Los números indican el número aproximado de ciclos después de la señal verdadera que pueden observarse en una señal de reactividad cruzada. No se han incluido valores superiores a 9 ciclos puesto que se encontrarían en la zona negativa.


Página 29 de 42

Muestra positiva

Señal de

12ALA

Señal de

12ASP

Señal de

12ARG

Señal de

12CYS

Señal de

12SER

Señal de

12VAL

Señal de

13ASP12ALA Sí 9 - 6 3 6 - 12ASP 9 Sí - - - - - 12ARG - - Sí - - - - 12CYS - 7 4 Sí - - - 12SER 9 6 9 - Sí - 8 12VAL 4 - - - - Sí - 13ASP - - - - - - Sí

Nota: el patrón de reactividad cruzada puede ser diferente, por ejemplo, en muestras de ADN incluidas en parafina.

El Kit de K-RAS ha sido diseñado para detectar una mutación en una muestra de ADN. Si un segundo ensayo de mutación arroja un resultado positivo, es muy probable que se trate de reactividad cruzada. Sin embargo, aunque es poco probable, se han observado dobles mutantes en contadas ocasiones. Si el patrón no se adapta al patrón de reactividad cruzada, será preciso realizar una investigación más detallada.

11. Características del rendimiento del ensayo Se ha definido el rendimiento del ensayo para el Kit de K-RAS en el sistema ABI7500 y en el equipo LightCycler® 480 (a través del programa LightCycler® Adapt Software para obtener los valores de Ct). Para ello, se ha realizado una gran variedad de pruebas en cada equipo. A continuación encontrará un resumen de los resultados de estas pruebas.

Validación del punto de corte del 1%:

Equipo LightCycler® 480: se determinó la detección del 1% de mutaciones en ADN de líneas celulares negativo para las mutaciones de K-RAS de referencia en tres concentraciones distintas de ADN de líneas celulares con objeto de asignar un valor de ∆Ct de corte para cada ensayo de mutación.

Para cada ensayo se analizaron los estándares del 1% por triplicado, en 3 series analíticas distintas, tanto para el ensayo de control como para el ensayo de mutación. Este paso se repitió con 3 usuarios distintos. Los valores de Ct se obtuvieron del programa LightCycler® Adapt Software.

Los valores de ∆Ct del 1% se calcularon a partir de todas las combinaciones de valores de Ct de mutación y control a lo largo de las réplicas de una serie analíticas.

Los valores de ∆Ct de corte se definieron como la media de todas las series analíticas y todas las concentraciones. Los resultados de estas pruebas se resumen en el apartado sobre la interpretación de los datos.


Página 30 de 42

ABI7500: para cada ensayo, las diluciones del 1% se analizaron por triplicado, en 3 lotes de kits, en 3 series analíticas independientes, tanto para el ensayo de control como para el ensayo de mutación. Se usó el estándar mezclado en cada placa para garantizar que los ensayos se realizaran de acuerdo con los criterios especificados.

Los valores de ∆Ct del 1% se calcularon a partir de los valores del Ct medio de las réplicas de una serie analítica y de un lote. Los valores de ∆Ct de corte se definieron como la media (más cercana al 0,5) de todos los lotes, las series analíticas y las concentraciones en que todas las réplicas obtuvieron un valor de Ct. Los resultados de estas pruebas se resumen a continuación en la tabla 16.

Tabla 16: resultados de validación de los valores de corte del 1% en el sistema ABI7500

Ensayo Media Valores de ∆Ct del 1%

12ALA 6,68 6,5 12ASP 8,2 8 12ARG 8,16 8 12CYS 6,94 7 12SER 8,83 9 12VAL 7,67 7,5* 13ASP 8,89 9

* El corte del 1% para 12Val se modificó al 6,5 según el estudio de progresión. A continuación encontrará más datos al respecto.

Determinación del ∆Ct del estándar mezclado:

Equipo LightCycler® 480: los valores de ∆Ct del estándar mezclado son medias obtenidas a partir de 50 series analíticas del estándar mezclado. Los valores de Ct se obtuvieron a partir del programa LightCycler® Adapt 480 Software. Los valores de ∆Ct previstos para el estándar mezclado se muestran en el apartado sobre la interpretación de datos.

ABI7500: los valores del estándar mezclado se han definido usando la media de 422 valores de ∆Ct. Éstos a su vez se calcularon a partir de numerosos lotes de kits y series analíticas distintos. Los valores de ∆Ct previstos para el estándar mezclado se muestran en el apartado sobre la interpretación de datos. Validación de la progresión: se entiende como progresión la amplificación inespecífica de los ensayos de mutación de una diana de ADN normal presente en una muestra concreta. Esto provoca un nivel medible de ruido de fondo. Se valoró la progresión de ADN normal para cada ensayo de mutación. El estudio de progresión garantizó que los valores de corte del 1% establecidos anteriormente fueron inferiores al nivel de progresión y que evitarían la comunicación de un falso positivo.


Página 31 de 42

Equipo LightCycler® 480: se analizaron por duplicado y en 5 placas 10 muestras de ADN de líneas celulares negativas para las mutaciones de K-RAS en diferentes concentraciones, 5 muestras FFPE negativas para las mutaciones de K-RAS y 5 muestras FFPE positivas para las mutaciones de K-RAS. Las muestras positivas para mutación dieron positivo para una única mutación, mientras que el resto de las mutaciones se usó para analizar la progresión. Los valores de Ct se obtuvieron con el programa LightCycler® Adapt Software y se usaron todas las combinaciones de valores de Ct para calcular el ∆Ct.

Los resultados de los ensayos negativos para las mutaciones de las muestras de ADN de líneas celulares y de FFPE arrojaron valores de ∆Ct que fueron todos superiores a los valores de corte del 1%, lo que demuestra la estabilidad de los valores de corte del 1%. En la tabla 17 se muestran los peores niveles de progresión obtenidos de las 5 series analíticas. Tabla 17: resultados de progresión

Ensayo Peores valores de ∆Ct de progresión

12ALA 12,35 12ASP 11,36 12ARG Sin progresión12CYS Sin progresión12SER 11,74 12VAL 12,29 13ASP 11,29

ABI7500: se ha valorado la progresión mediante ADN de línea celular agrupado de líneas celulares negativas para la mutación del gen K-RAS en 3 niveles diferentes de ADN. Se analizaron tres placas de PCR idénticas. Cada placa contenía 3 lotes de reactivos. Se utilizó el estándar mezclado como control positivo. Además, se analizaron por duplicado muestras de FFPE positivas. La mayoría de las muestras positivas para mutación dan un resultado positivo para una única mutación. El resto de los ensayos de mutación pueden utilizarse para valorar la progresión (aunque se prevé algún tipo de reactividad cruzada entre algunos ensayos y mutaciones positivas. Sin embargo, este proceso genera un modelo conocido). Se han obtenido los valores de Ct y los valores de ∆Ct y se han comparado con los valores de corte del 1%.

Los datos del ADN de línea celular y las muestras de FFPE arrojaron unos valores de ∆Ct superiores todos a los valores de corte del 1%, a excepción de una muestra de FFPE que obtuvo un valor de ∆Ct justo por debajo (6,84) del valor de corte de 7,5. Dado que el intervalo de datos para la determinación del valor de corte del 1% cubría el valor 6,84, se cambió el valor de ∆Ct del 1% del ensayo 12VAL de 7,5 a 6,5 para evitar la posibilidad de un resultado falso positivo.


Página 32 de 42

La tabla 18 muestra los valores de ∆Ct del 1% actuales a partir de los resultados de validación de la progresión. Tabla 18: resultados de la validación de progresión

Ensayo Valores de ∆Ct del 1%

12ALA 6,5 12ASP 8 12ARG 8 12CYS 7 12SER 9 12VAL 6,5 13ASP 9

Validación de la precisión:

Equipo LightCycler® 480: el análisis de la precisión se ha realizado mediante controles sintéticos del 1% en 3 niveles distintos de ADN de línea celular negativo para la mutación del gen K-RAS. Cada control se ha analizado por triplicado para cada ensayo correspondiente en una placa que también contenía estándar mezclado duplicado y reacciones NTC simples para garantizar que las reacciones funcionaban según las especificaciones. La misma placa se repitió 54 veces durante 6 días. A la matriz de análisis se incorporó el uso de 3 equipos, 3 lotes de reactivos y 3 usuarios.

Los valores de Ct se obtuvieron del programa LightCycler® Adapt Software y se utilizaron todas las combinaciones de los valores de Ct para calcular los valores de ∆Ct. Cualquier valor de ∆Ct que superara tres veces el intervalo intercuartil se consideró fuera del rango y se eliminó del análisis. Se calcularon las medias, los errores estándar y las desviaciones estándar y se agruparon los datos por lote de kit, equipo o usuario a fin de valorar las variaciones provocadas por dichas variables. También se valoró la repetibilidad general de los ensayos.

Los datos indican que la variabilidad general entre ensayos es baja y que 2 desviaciones estándar cercanas a la media cubren un intervalo de ±1,4 ciclos con referencia a la media para el ensayo con una desviación estándar máxima.

Para cada prueba, el ∆Ct medio de cada usuario está comprendido en 0,15 ciclos de la media general para todos los datos. Las diferencias entre usuarios no llegaron a superar en 0,2 el Ct, lo que demuestra que la variabilidad entre usuarios no es superior a la variabilidad existente entre el conjunto de los datos y que la variabilidad entre usuarios no afecta a la estabilidad de los ensayos.


Página 33 de 42

Para cada prueba, la diferencia entre las medias de cada equipo y la media general fue de ±0,097 y la diferencia entre medias de cada equipo nunca fue peor que ±0,186, lo que demuestra que la variabilidad entre equipos no fue superior a la variabilidad existente entre todos los datos y que la variabilidad entre equipos no incide en la estabilidad de los ensayos.

Para cada análisis, la diferencia máxima entre un solo lote y los promedios generales fue de ± 0,195 y las peores diferencias entre lotes fueron de ± 0,38, lo que demuestra que la variabilidad entre lotes no fue superior a la variabilidad entre el conjunto de datos y que dicha variabilidad entre lotes no incide en la estabilidad de los ensayos.

ABI7500: se han llevado a cabo experimentos para establecer el rendimiento de la precisión de cada ensayo mediante la repetición de una placa de PCR con un intervalo de muestras de elevada y reducida concentración de ADN y un nivel de mutación bajo, con 3 lotes de reactivos durante todo un día, durante varios días, entre usuarios y entre equipos.

Se ha utilizado una ANOVA unidireccional para valorar la variación entre réplicas, lotes de reactivos, análisis, día de ejecución de la serie analítica y usuario. La hipótesis nula se estableció definiendo la igualdad para los valores promedio de las diferentes categorías. También se calcularon las medias totales, la SD y el %CV para los valores de Ct. Ninguno de los ensayos mostró una desviación significativa (en el nivel p=0.05) respecto a la hipótesis nula que establece que las medias son idénticas en todas las categorías. Todo ello indica que la estabilidad de los ensayos no se ve afectada por las variaciones existentes entre equipos, usuarios, lotes, días o series analíticas. Validación de la exactitud:

Equipo LightCycler® 480: para valorar la exactitud se han utilizado 92 muestras FFPE y 28 diluciones de línea celular positivas para la mutación. Las pruebas se han realizado con el Kit de K-RAS y se ha empleado la secuenciación de Sanger. Se comparó la clasificación de las mutaciones de K-RAS con los 2 métodos y se obtuvieron 18 resultados discrepantes (5 cortes FFPE y 13 líneas celulares), en los que la secuenciación indicaba un resultado negativo aunque la muestra fuera positiva con el ensayo DxS. Para confirmar la presencia de una mutación en estas 18 muestras, se clonó la región próxima a las mutaciones de cada muestra. Se ha utilizado la presencia de un clon positivo para la mutación con el fin de resolver la discrepancia.

ABI7500: para valorar la exactitud se han utilizado controles sintéticos diluidos en 2 niveles de ADN de línea celular negativo para la mutación del gen K-RAS con objeto de obtener 3 porcentajes distintos de mutación que cubran tanto el nivel de mutación positivo como el negativo. Para cada mutación se han analizado tres placas idénticas, cada una con 3 lotes de reactivos.


Página 34 de 42

Se analizaron los niveles de mutación de 25%, 5% y 0,5%. (Las muestras del 25% y el 5% deberían dan un resultado positivo para la mutación (∆Ct inferior a los valores de corte del 1%); la muestra del 0,5% debería dar un resultado negativo para la mutación (∆Ct superior a los valores de corte del 1%)). Los resultados se resumen en la tabla 19 que figura a continuación. Tabla 19: resultados de la validación de la exactitud para ABI7500

Ensayo 25% 5% 0,5% Ensayo 100% 100% 94% 12ALA 100% 100% 100%12ASP 100% 100% 100%12ARG 100% 100% 100%12CYS 100% 100% 100%12SER 100% 100% 100%12VAL 100% 100% 100%13ASP 100% 100% 100%

La reducción de la exactitud en el ensayo 12ALA responde a la variación existente entre las réplicas en un nivel de ADN. Validación de la linealidad:

Equipo LightCycler® 480: para valorar la linealidad se han utilizado estándares sintéticos con niveles de mutación del 100%, el 1% y el 0% para cada ensayo. Se ha realizado una dilución en serie para cada porcentaje de mutación a fin de conservar el nivel de mutación y reducir la cantidad total de ADN. Se han generado curvas estándar mediante la dilución por triplicado en 3 placas de réplicas para el ensayo de control y el ensayo de mutación correspondiente. Los valores de Ct se han calculado mediante el programa LightCycler® Adapt Software. También se ha creado un gráfico para cada mutación (sin datos) donde se ha plasmado la representación de los Ct del ensayo de control y de mutación a fin de compararlos y luego se ha realizado una regresión para cada nivel de mutación. También se han representando los intervalos de confianza del 95% para cada nivel de mutación.

En el análisis de la concentración del 0% no se han obtenido valores de Ct para la mutación. Los gráficos de las concentraciones del 100% y el 1% muestran que existe una clara discriminación entre los conjuntos de datos y que las pendientes de las curvas presentaban una equivalencia sustancial, lo cual denota una eficacia de la amplificación similar para todo el intervalo de concentraciones de mutación.

ABI7500: este estudio valora la eficacia de cada ensayo de mutación en el intervalo de concentraciones de ADN con ADN normal y agua. Cada ensayo de mutación debería conseguir una eficacia comprendida entre el 90% y el 110% (100% + 10%).


Página 35 de 42

La elaboración de las curvas estándar se ha realizado utilizando una dilución en serie de 5 ciclos. Para cada ensayo se utilizó una placa de PCR con tres lotes de reactivos del kit. El análisis de los estándares de mutación del 100% se realizó con 50 ng, 10 ng, 2 ng y 0,4 ng de ADN en cada uno de los ensayos de mutación mediante su dilución en agua. También se analizaron los ensayos de mutación mediante una dilución en serie de 5 ciclos en 10 ng/µl de ADN de línea celular para valorar la eficacia de la progresión.

Las curvas estándar para cada ensayo de mutación se han elaborado a partir de los datos experimentales. La eficacia de la PCR se calculó con la siguiente ecuación:

100((10-1/Pendiente)-1)

El nivel superior de progresión en las diluciones de línea celular de 10 ng/µl obtuvo una eficacia superior al 100%.

Se calculó la eficacia general entre lotes de reactivos. Todos los valores obtenidos fueron similares y comprendidos en un intervalo del 10% con relación a la eficacia del ensayo de control. Las curvas estándar paralelas entre el ensayo de control y los ensayos de mutación indican que el método de ∆Ct es adecuado.

El nivel de linealidad obtenido es aceptable para el intervalo comprendido entre 0,4 ng de ADN y 50 ng de ADN. Validación de la reactividad cruzada:

Equipo LightCycler® 480: no se ha efectuado la validación de la reactividad cruzada puesto que el programa LightCycler® Adapt Software se limita a determinar una única mutación con el ∆Ct inferior.

ABI7500: puesto que todas las mutaciones detectadas con el Kit de K-RAS se producen en la región de pares de 5 bases, se espera algún tipo de reacción cruzada entre los cebadores. Este estudio determinó el modelo de reactividad cruzada para el Kit de K-RAS.

La evaluación se llevó a cabo mediante controles de mutación sintéticos con objeto de establecer el número de ciclos que se podían detectar tras una señal positiva real de reactividad cruzada. Se analizó cada mezcla de reacción para mutación con seis réplicas de cada uno de los siete controles de mutación al 100%. Además, se analizó cada control con la mezcla de reacción emparejada y todas las demás mezclas de reacción en la misma serie analítica.

La determinación del modelo de reactividad cruzada se llevó a cabo calculando la diferencia entre el valor de Ct de la amplificación real del casete emparejado y la señal de reactividad cruzada del resto de los cebadores.


Página 36 de 42

La tabla 20 resume el modelo de reactividad cruzada previsto. Se ha demostrado que el modelo de reactividad cruzada se mantiene estable y permite al usuario interpretar un modelo de amplificación, en el que más de un ensayo dé un resultado positivo, a fin de obtener el resultado correcto para el ensayo. Los números de cada celda indican el número aproximado de ciclos posteriores a la detección de la señal positiva real en los que puede detectarse la señal de reactividad cruzada. No se han incluido los valores superiores a 9 porque se clasifican como negativos para la mutación. Tabla 20: resultados de la validación de la reactividad cruzada para ABI7500

Muestra positiva

Señal 12ALA

Seña12ASP

Señal12ARG

Señal12CYS

Señal12SER

Señal 12Val

Señal 13ASP

12ALA Sí 9 - 6 3 6 - 12ASP 9 Sí - - - - - 12ARG - - Sí - - - - 12CYS - 7 4 Sí - - - 12SER 9 6 9 - Sí - 8 12VAL 4 - - - - Sí - 13ASP - - - - - - Sí

Validación de la tolerancia entre ciclos: Equipo LightCycler® 480: estos estudios determinaron la tolerancia de los ensayos de mutación con relación a las variaciones de temperatura entre ciclos. Dado que la temperatura de hibridación es la más importante para el rendimiento del ensayo, el parámetro de variación establecido fue la temperatura de hibridación.

La validación de la tolerancia entre ciclos se ha llevado a cabo mediante estándares sintéticos del 1% en 3 niveles distintos de ADN. Se han realizado análisis por triplicado de las muestras para cada mutación, junto con reacciones duplicadas de estándar mezclado y reacciones de NTC simples, para garantizar que el rendimiento de los ensayos está comprendido entre las especificaciones.

Cada placa se analizó a temperaturas de hibridación de 59 ˚C, 60 ˚C y 61 ˚C. 60 ˚C es la temperatura óptima para el análisis del ensayo, pero la variabilidad entre bloques de PCR (o en los bloques de PCR) indica que el ensayo debe ser estable en todo el intervalo. Cada placa se analizó por triplicado con cada una de las temperaturas. Los valores de Ct se obtuvieron del programa LightCycler® Adapt Software y se utilizaron todas las combinaciones de los valores de Ct de control y mutación de cada muestra para calcular los valores de ∆Ct.


Página 37 de 42

Los resultados de todos los ensayos se sitúan dentro de los criterios admitidos según los cuales los valores obtenidos a las temperaturas de 59 ˚C y 61 ˚C no deben ser diferentes del valor de media para 60 ˚C ± la desviación estándar para 60 ˚C. Todo ello indica que la estabilidad de los ensayos no se ve afectada por una desviación de 1 ˚C para la temperatura de hibridación.

ABI7500: se analizaron tres placas de PCR idénticas, cada una con 3 kits de lotes de reactivos, a cada una de las temperaturas de hibridación. También se analizó el estándar mezclado, puesto que estaba formado por 50 ng de ADN de línea celular agrupado negativo para la mutación. Dado que 60 °C es la temperatura de hibridación recomendada, las placas se analizaron a 58 °C, 60 °C y 62 °C. Si la validez establecida para los ensayos toleraba las temperaturas experimentales, los valores de ∆Ct del estándar mezclado deberían situarse entre +1,5 de los valores definidos para el estándar mezclado y los valores de ∆Ct de la línea celular agrupada deberían ser superiores a los puntos de corte del 1%.

La muestra 12ASP fue la que mostró una mayor susceptibilidad a la variación de temperatura; sin embargo, los resultados de todos los ensayos fueron correctos para las 3 temperaturas, lo que indica que la validez de los ensayos es buena cuando se utilizan temperaturas 2 °C superiores o inferiores a la temperatura óptima. Validación de la tolerancia de Taq:

Equipo LightCycler® 480: estos estudios determinaron la tolerancia de los ensayos de mutación a las variaciones en el nivel de la enzima Taq polimerasa, una posible fuente de variación entre usuarios puesto que son éstos quienes la añaden. La validación de la tolerancia de los ensayos a los diferentes niveles de Taq se realizó con estándares sintéticos del 1% en 3 niveles distintos de ADN. Se analizó cada muestra por triplicado para un nivel elevado, normal y reducido de Taq (nivel elevado supone un 20% de Taq adicional y nivel reducido, un 20% menos de la Taq utilizada normalmente). También se ejecutaron reacciones dobles de estándar mezclado y reacciones simples de NTC para garantizar que el rendimiento de los ensayos esté comprendido entre las especificaciones. Se realizaron series por triplicado para cada placa y se analizaron 3 lotes distintos de Taq.

Los valores de Ct se obtuvieron del programa LightCycler® Adapt Software y para calcular los valores de ∆Ct se utilizaron todas las combinaciones de los valores de Ct de las réplicas de una placa.

Los resultados de todos los ensayos están comprendidos entre los criterios según los cuales los valores promedios de la Taq elevada y la Taq reducida no difieren del valor promedio del nivel normal de Taq en más de 1 desviación estándar de los datos de Taq normales.

ABI7500: se analizaron tres placas de PCR idénticas, cada una con 3 lotes de reactivos, para cada ensayo de mutación.


Página 38 de 42

Se aplicaron cambios en el nivel de la Taq polimerasa comprendidos entre +10% y -10% con relación a la cantidad recomendada (que también se analizó). También se analizó el estándar mezclado, ya que había estándares del 1% en 2 niveles de ADN y 50 ng de ADN de línea celular negativa para la mutación. Se analizaron los datos del ensayo para obtener las medias, la desviación estándar y la variación de coeficientes.

Los resultados mostraron una variación mínima (SD equivalente entre ensayos, %CV <10%) en los resultados del ensayo cuando el nivel de Taq variaba en +10%, lo que demuestra que los ensayos pueden tolerar una variación máxima del 10% en los niveles de Taq polimerasa.

12. Asistencia técnica Para recibir asistencia técnica o información más detallada, póngase en contacto con su distribuidor de Roche. En el apartado 13 figura una lista con los detalles de contacto de los principales distribuidores de Roche. 13. Información sobre el fabricante y el distribuidor

Si ha comprado este kit en un país que no figura en la lista de oficinas de Roche Diagnostics indicadas más arriba, póngase en contacto con Roche Diagnostics GmbH (Mannheim), a través de la dirección indicada.

DxS Limited, 48 Grafton Street, Manchester M13 9XX, Reino Unido

Roche Molecular Systems, Inc., Branchburg, NJ, 08876 USA Miembro de Roche Group

REINO UNIDO

Roche Diagnostics Charles Avenue Burgess Hill, West Sussex, United Kingdom RH15 9RY

ALEMANIA Roche Diagnostics GmbH Sandhoferstr. 116 Dept. VM-G Mannheim, D-68298,

FRANCIA Roche Diagnostics S.A. 2 Avenue du Vercors BP 59, Meylan Cedex, 38240

SUIZA Roche Diagnostics (Schweiz) AG Industriestr. 7 Rotkreuz, CH-6343

ESPAÑA Roche Diagnostics S.L. Av. de la Generalitat, s/n Sant Cugat del Valles Barcelona, E-08190

ITALIA Roche Diagnostics – Italy V. le G.B. Stucchi 110 Monza (MI), I-20052

CENTRO DE DISTRIBUCIÓN PRINCIPAL

Roche Diagnostics GmbH Sandhofer Strasse 116 D-68305 Mannheim


Página 39 de 42

14. Fecha de publicación de la última revisión

Fecha de la última versión: febrero de 2009

Resumen de cambios: Cambio de valor en las tablas 5 y 11.


Página 40 de 42

15. Referencias 1. R.A. Hilger, M.E. Scheulen, D. Strumberg. (2002). The Ras-Raf-MEK-

ERK Pathway in the Treatment of Cancer. Onkologie 25: 511-518. 2. Pavan Bachireddy, Pavan K. Bendapudi, Dean W. Felsher. (2005).

Getting at MYC through RAS. Clin Cancer Res 11(12):4278-4281. 3. Sae-Won Han, Tae-You Kim, Yoon Kyung Jeon, Pil Gyu Hwang, Seock-

Ah Im, Kyung-Hun Lee, Jee Hyun Kim, Dong-Wan Kim, Dae Seog Heo, Noe Kyeong Kim, Doo Hyun Chung, Yung-Jue Bang. (2006). Optimization of Patient Selection for Gefitinib in Non-Small Cell Lung Cancer by combined analysis of Epidermal Growth Factor Receptor Mutation, K-ras Mutation, and AKT Phosphorylation. Clin Cancer Res 12(8):2538-2544.

4. William Pao, Theresa Y. Wang, Gregory J. Riely, Vincent A. Miller, Qiulu Pan, Marc Ladanyi, Maureen SF. Zakowski, Robert T. Heelan, Mark G. Kris, Harold E. Varmus. (2005). KRAS Mutations and Primary Resistance of Lung Adenocarcinomas to Gefitinib or Erlotinib. PloS Medicine 2(1):57-61.

5. Astrid Lievre, Jean-Baptiste Bachet, Delphine Le Corre, Valerie Boige, Bruno Landi, Jean-Francois Cote, Gorana Tomasic, Christophe Penna, Michel Ducreux, Philippe Rougier, Frederique Penault-Llorca, Pierre Laurent-Puig. (2006). KRAS Mutation Status is Predictive of Response to Cetuximab Therapy in Colorectal Cancer. Cancer Res 66 (8): 3992-3995.

6. Silvia Benvenuti, Andrea Sartore-Bianchi, Federica Di Nicolantonio, Carlo Zanon, Mauro Moroni, Silvio Veronese, Salvatore Siena, Alberto Bardelli. (2007). Cancer Res 67 (6): 2643-2648.

7. W. De Roock, J. De Schutter, G. De Hertogh, M. Jannsens, B. Biesmans, N. Personeni, K. Geboes, C. Verslyp, E. Van Cutsem, S. Tejpar. (2007). Journal of Clinical Oncology 25 (18S): 4132.

8. G. Finocchiaro, F. Cappuzzo, P.A. Janne, K. Bencardino, C. Carnaghi, W.A. Franklin, M. Roncalli, L. Crino, A. Santoro, M. Varella-Garcia. (2007). Journal of Clinical Oncology 25 (18S): 4021.

9. F. Di Fiore, F. Blanchard, F. Charbonnier, F. Le Pessot, A. Lamy, M.P. Galais, L. Bastit, A. Killian, R. Sesboue, J.J. Tuech, A.M. Queuniet, B. Paillot, J.C. Sabourin, F. Michot, P. Michel, T. Frebourg (2007). British Journal of Cancer 96: 1166-1169.

10. Shirin Khambata-Ford, Christopher R. Garrett, Neal J. Meropol, Mark Basik, Christopher T. Harbison, Shujian Wu, Tai W. Wong, Xin Huang, Chris H. Takimoto, Andrew K. Godwin, Benjamin R. Tan, Smitha S. Krishnamurthi, Howard A. Burris III, Elizabeth A. Poplin, Manuel Hidalgo, Jose Baselga, Edwin A. Clark, David J. Mauro. (2007). Journal of Clinical Oncology 25(22): 3230-3237.

11. Newton CR, Graham A, Heptinstall LE, Powell SJ, Summers C et al. (1989). Analysis of any point mutation in DNA. The amplification refractory mutation system (ARMS) Nucleic Acids Res. 17 (7): 2503-16.

12. Whitcombe, D., Theaker J., Guy, S.P., Brown, T., Little, S. (1999). Detection of PCR products using self-probing amplicons and fluorescence. Nature Biotech 17: 804-807.


Página 41 de 42

13. Thelwell, N., Millington, S., Solinas, A., Booth, J. and Brown, T. (2000). Mode of Action and Application of Scorpion Primers to Mutation Detection. Nucleic Acids Research 28(19): 3752-3761

14. De Roock W, Piessevaux H, De Schutter J, Janssens M, De Hertogh G, Personeni N, Biesmans B, Van Laethem JL, Peeters M, Humblet Y, Van Cutsem E, Tejpar S. KRAS wild-type state predicts survival and is associated to early radiological response in metastatic colorectal cancer treated with cetuximab. Ann Oncol. 2007, Nov. 12.

15. Lièvre A, Bachet JB, Le Corre D, Boige V, Landi B, Emile JF, Côté JF, Tomasic G, Penna C, Ducreux M, Rougier P, Penault-Llorca F, Laurent-Puig P. KRAS mutation status is predictive of response to cetuximab therapy in colorectal cancer. Cancer Res. 2006;66:3992-5.

16. Lièvre A, Bachet JB, Boige V, Cayre A, Le Corre D, Buc E, Ychou M, Bouché O, Landi B, Louvet C, André T, Bibeau F, Diebold MD, Rougier P, Ducreux M, Tomasic G, Emile JF, Penault-Llorca F, Laurent-Puig P. KRAS mutations as an independent prognostic factor in patients with advanced colorectal cancer treated with cetuximab. J Clin Oncol. 2008;26:374-9.

17. C. Bokemeyer et al., K-RAS status and efficacy of first-line treatment of patients with metastatic colorectal cancer (mCRC) with FOLFOX with or without cetuximab: The OPUS experience. J Clin Oncol 26: 2008 (May 20 suppl; abstr 4000)

18. E. Van Cutsem et al., K-RAS status and efficacy in the first-line treatment of patients with metastatic colorectal cancer (mCRC) treated with FOLFIRI with or without cetuximab: The CRYSTAL experience. J Clin Oncol 26: 2008 (May 20 suppl; abstr 2)

19. S. Tejpar et al., Relationship of efficacy with K-RAS status (wild type versus mutant) in patients with irinotecan-refractory metastatic colorectal cancer (mCRC), treated with irinotecan (q2w) and escalating doses of cetuximab (q1w): The EVEREST experience (preliminary data). J Clin Oncol 26: 2008 (May 20 suppl; abstr 4001).

20. 10th World Congress on Gastrointestinal Cancer: Abstract o-037. Presented June 27, 2008. "KRAS mutation status is a predictive biomarker for cetuximab benefit in the treatment of advanced colorectal cancer. Results from NCIC CTG CO.17: A phase III trial of cetuximab versus best supportive care". Christos Karapetis et al.

21. Rafael G. Amado, Michael Wolf, Marc Peeters, Eric Van Cutsem, Salvatore Siena, Daniel J. Freeman, Todd Juan, Robert Sikorski, Sid Suggs, Robert Radinsky, Scott D. Patterson and David D, Chang. Wild-Type KRAS Is Required for Panitumumab Efficacy in Patients with Metastatic Colorectal Cancer. J. Clin. Oncol. 2008; 26: 1626-1634.


Página 42 de 42

Notas para el comprador: Se prohíbe la reventa, la transferencia o la modificación para la venta sin el consentimiento previo por escrito de DxS Limited de este producto, el kit de mutaciones K-RAS de TheraScreen® y todos sus componentes.

TheraScreen® y Scorpions® son marcas registradas de DxS Limited. ARMS® es una marca registrada de AstraZeneca UK Limited.

LIGHTCYCLER y ROCHE son marcas registradas de Roche.

ABI7500 es una marca registrada de Applied BioSystems.

Este producto es un dispositivo de diagnóstico con marcado CE fabricado según la Directiva de productos sanitarios para diagnóstico in vitro 98/79/CE de la Unión Europea.

La compra de este producto viene acompañada de una licencia intransferible y limitada para utilizar las tecnologías ARMS® y Scorpions® únicamente con fines de diagnóstico in vitro.

ARMS® está registrado por la patente de EE.UU. 5.595.890 y EP 332435; y Scorpions®, por la patente de EE.UU 6.326.145 y EP1088102.

La información de este documento está sujeta a cambios. DxS Limited no asume ninguna responsabilidad por los errores que puedan aparecer en este documento. DxS Limited no se hará responsable en ningún caso ni de ningún modo (sea por contrato, agravio (incluida la negligencia) u otros supuestos) de ninguna reclamación derivada o relacionada con el uso de este producto. Ningún supuesto del presente documento excluye ni limita la responsabilidad de la que DxS Limited no pueda excluirse o limitarse legalmente.

© Copyright 2009. DxS Limited. Reservados todos los derechos. DxS Limited,

48 Grafton Street, Manchester,

M13 9XX Reino Unido

www.dxsdiagnostics.com

kit de mutaciones del gen k-ras de therascreen® · pdf fileel kit de k-ras detecta siete...

Documents