Desarrollo del inoculo y cultivo celular por lote de Pichia stipitis NRRL Y-7124, utilizando xilosa y glucosa como fuente de carbono

NDICEPg.OBJETIVOS 2Objetivo general2Objetivos especficos2

METODOLOGA EXPERIMENTAL3Diseo de medios de cultivo3Preparacin de medios, programa de muestreos6Montaje de equipo experimental, cultivo del microorganismo, etc12

MATERIALES, INSTRUMENTOS Y REACTIVOS18

CRONOGRAMA DE ACTIVIDADES Y/O TAREAS28Acopio de materiales, instrumentos y reactivos29Preparacin de reactivos29Preparacin y esterilizacin de medios30Tiempo, imprevistos, etc30

REFERENCIAS BIBILIOGRFICAS31

ANEXOS32

1. OBJETIVOS:1.1 OBJETIVOS GENERALES: Disear y realizar una experiencia de cultivo celular por lotes en matraces, empleando una cepa de Pichia stipitis NRRL Y-7124, evalundose el efecto de la fuente de carbono y la velocidad de agitacin en la cintica de crecimiento y la produccin de etanol. 1.2 OBJETIVOS ESPECFICOS: Disear y preparar el medio liquido de cultivo. Lograr la activacin celular y desarrollo del inoculo Determinar la cintica de crecimiento de la biomasa Determinar la cintica de consumo de la fuente de carbono Determinar la cintica de generacin de etanol Determinacin del M, qs y los rendimientos del nutriente limitante en clulas y en etanol, adems de las respectivas productividades en clulas y etanol. Evaluar el valor del pH al inicio y al final de la cintica.

1. METODOLOGA EXPERIMENTAL:

DISEO DE MEDIOS DE CULTIVOEl diseo de un medio de fermentacin tiene como finalidad la eleccin de los componentes necesarios para lograr el crecimiento y la formacin de productos correspondientes al proceso a desarrollar. Con tal objeto se debe tener en cuenta todos aquellos aspectos relacionados con el microorganismo, el proceso y los sustratos a ser empleados como son los requerimientos nutricionales del microorganismo y algunos especficos del proceso.Para la formulacin del diseo de cultivo se tiene en cuenta los siguientes requerimientos nutricionales para el cultivo Pichia stipitis NRRL Y-7124.

Para el Diseo del medio de cultivo:

MacronutrientesC, N, Mg, K y P

Micronutrientes:Zn, Ca, Fe, Cu, Co y Mn

EstadoMedio lquido

Requerimientos nutricionales: Para ello utilizamos un Medio de cultivo mnimo.

Fuente de carbono y energa-45%: xilosa y glucosa Fuente de N- 9%: Sulfato de amonio Fuente de Mg 0.4% y S 0,25% : Sulfato de magnesio heptahidratado Fuente de K 0.5%: Fosfato dicido de Potasio Fuente de P 2.0%: Fosfato dicido de Potasio

=

Condiciones de cultivo:

Temperatura: 30C Velocidad de agitacin(Shaker): 120 rpm

1.1.1. Medio Slido De Mantencin (Pgy- Agar)NutrienteConcentracin (g/L)Peso (g)

Extracto de levadura30.15

Peptona de casena50.25

K2HPO430.15

Agar201

Glucosa0.20.01

TABLA 01: Concentracin de Nutrientes para el medio de mantencin (50 mL)

1.1.2. Medio Activacin:

TABLA 02: Concentracin de Nutrientes para el medio de activacin (30 mL)

NutrienteConcentracin (g/l)Peso (g)

Glucosa100.3

xilosa100.3

Extracto de levadura30.09

Extracto de malta50.15

Solucin de sales5 ml/L0.15 ml

T: 30C, N: 120 rpm

1.1.3. Medio De Fermentacin

Para un volumen de medio: 30% - 40% del volumen del matraz. Para una concentracin final: 2 g/l.

TABLA 03: Concentracin de Nutrientes para el medio de fermentacin (300 mL)

NutrienteConcentracin (g/L)Peso (g)

Glucosa103

Xilosa103

(NH4)2SO430.9

KH2PO420.6

MgSO4-7H2O1.10.33

FeSO4.7H200.50.15

Solucin de sales5 ml/L1.5ml

Ajustar pH 4.5T 30C, N 120 rpm

1.1.4. Nutrientes Para El Medio De Fermentacin:

Nutriente Limitante: Tabla: Debido a que las concentraciones de trabajo para el carbono y nitrgeno fueron: C: 3(g/l) y N: 1.2 (g/l), determinamos que para nuestra experiencia el carbono es el nutriente limitante, debido a que se aproxima ms a la concentracin terica dada. El factor 1.5 no ser multiplicado en este caso para el carbono.

1. Sales Para El Medio De Fermentacin

ElementoFuente% Clula% CompuestoYx/sS0 (g/L)S0 (g/L)

CaCaCl2. 2H2O0.5627.2148.592.784.167

FeFeSO4. 7H2O0.1120.09182.600.741.109

CuCuCl2. 2H2O0.5637.2666.532.033.044

MnMnCl2. 4H2O0.5627.7749.592.724.084

CoCoCl2. 6H2O0.5624.7644.213.054.580

ZnZnSO4. 7H2O0.5622.7640.643.324.983

2.2 PREPARACIN DE MEDIOS:La preparacin de medios para el desarrollo de procesos de fermentacin es una etapa fundamental para asegurar la productividad de los mismos.Los componentes de los medios constituyen los efectores externos de naturaleza qumica que desempean un rol esencial en los procesos ya que deben cumplir con los requerimientos del crecimiento y de formacin de productos y adems suministrar energa para la sntesis de metabolitos y para el mantenimiento celular.

Condiciones de AsepsiaCuando se trabaja con cultivos microbianos, la tcnica asptica se utiliza para prevenir la introduccin de organismos adicionales al cultivo. Diagrama 01.1. Preparacin del medio de mantencin, segn la TABLA 01 para el cultivo de Pichia stipitis NRRL Y-7124.Se inicia teniendo en cuenta la referencia de composicin de medios de cultivo de mantencin para Pichia stipitis NRRL Y-7124. Diagrama 02

Diagrama 01

Matraz -Nombre de cepa. -Fecha. Nombre del grupo.ROTULARMatraz -Nombre de cepa. -Fecha. Nombre del grupo.ROTULAR

Previamente desinfectado el rea de trabajo con alcohol de 96

Mechero bunsenENCENDERPreviamente desinfectado el rea de trabajo con alcohol de 96

Mechero bunsenENCENDER

Los Matraces

Si los matraces tienen un tapn de algodn, aflojar un poco de manera que no est muy apretadoSOSTENER

La boca de ambos matraces para matar cualquier microorganismo presente en el aire y que pueda contaminar en la prctica.FLAMEAR

Tapar con el meiqueRETIRAR

La Boca de ambos matracesFLAMEAR

Posicin inclinada (riesgo de contaminacin sea mnimo)MANTENER

Matraz estrilInculoSEMBRAR

Boca de los matraces taparlos de nuevoFLAMEAR

Matraces en el caldo sembradoInculoMEZCLAR

Los tapones antes que los coloques en los matraces.FLAMEAR

En una matraz de 250 ml.Agua destiladaDiagrama 02

MEDIR

Cantidades de cada compuesto.PESAR

Agua destilada

Hasta llegar a los 50 ml que se requiere.MEDIR

En un Mechero Bunsen (lograr una coloracin celeste), CALENTAR

Constantemente con un varilla por un minuto (aparicin de la primera burbuja).AGITAR

5 tubos de ensayo con tapa.PREPARAR

6-7 ml de la mezcla en caliente a cada tubo de ensayo, con pipeta de 10 ml.AGREGAR

Una vez tapados los tubos de ensayos, por 1 hora.ENFRIAR

COLOCARCALENTAR

COLOCAR

En un vaso precipitado, y llevarlos a la olla a presin (auto clave).

121 C / 20 min

A posicin inclinada a Temp. Ambiente.

1. Preparacin del medio de activacin, segn la TABLA 02 para el cultivo de Pichia stipitis NRRL Y-7124.

Por separado los componentes.MEZCLAR

121C 15 min.ESTERELIZAREL pH a 7 de la solucin que contiene glucosa y xilosa.AJUSTARSales mineralesAl matraz que contiene el extracto de levadura, con la ayuda de la micro pipeta.

AGREGAREl volumen de las sales minerales.ALISTARDISOLVERPor separado.Extracto de levadura en una matraz.Glucosa en un matraz de 125 ml.Las sales en un tubo de ensayo.

ESTERELIZARComponentes para el medio de la tabla N02PESAR

1. Preparacin del medio de fermentacin, segn la TABLA 03 para el cultivo de Pichia stipitis NRRL Y-7124Componentes para el medio de la tabla N03

PESAR

Cada compuesto en agua destilada:Glucosa en un matraz de 1 L con agua destilada.(NH4)2SO4 en un matraz con agua destiladaSolucin de sales, KH2 PO4, (MgSO4).7H2O en un matraz con agua destilada.

DISOLVER

ESTERELIZARLas disoluciones por separado.

ENFRIAR

MATERIALES, INSTRUMENTOS Y REACTIVOS:PREPARACIN DE MEDIO SLIDO DE MANTENCINa. Materiales y Equipos:Balanza analtica: Las balanzas analticas modernas, que pueden ofrecer valores de precisin de lectura de 0,1 micras a 0,1 mg, estn bastante desarrolladas de manera que no es necesaria la utilizacin de cuartos especiales para la medida del peso.

Lo utilizaremos: En este caso pesaremos todos los compuestos para el medio as que tiene que ser con mucho cuidado.

Matraz Erlenmeyer: Es ms seguro que un vaso de precipitado, ya que la estructura del matraz evita perdidas de la sustancia o solucin contenida (agitacin o evaporacin).Es ideal para agitar soluciones. Se puede tapar fcilmente utilizando algodn o tapa.Lo utilizaremos: Este se llena primeramente con agua para diluir todos los componentes pesados.

Mechero Bunsen: Se utiliza para calentar, fundir o evaporar sustancias. La llama del mechero que arde correctamente es transparente y tiene un matiz azulado.

Lo utilizamos: Aqu se calienta la mezcla del matraz agitando con la varilla de vidrio y hasta la aparicin de la primera burbuja.

Esptula, pipeta: Objetos de ayuda al pesar y medir volmenes respectivamente.

Tubo de ensayo: Es un pequeo tubo de vidrio con una abertura en la zona superior, y en la zona inferior es cerrado y cncavo. Esta hecho de un vidrio especial que resiste las temperaturas muy altas, sin embargo los cambios de temperatura muy radicales pueden provocar el rompimiento de tubo (Pyrex)Lo utilizaremos: A estos tubos se le adiciona 6-7 ml de la mezcla e inmediatamente se tapa.

Varilla de vidrio: Son unas varillas de unos 20 cm de longitud que se utilizan para agitar las disoluciones ayudando a que los slidos se disuelvan en los disolventes ms rpidamente.Lo utilizaremos: nos ayuda al calentar la mezcla en el mechero.

Agua destiladaGlucosa

Olla a presin: Se introducen los tubos y se afloja las tapas para el intercambio de gases Algodn, gasa y capachitos de aluminio

b. Reactivos y nutrientes:Cepa de Pichia stipitis NRRL Y-7124: es una levadura fermentadora de hexosas y pentosas que presenta un rendimiento de etanol de 0.4 gg-1, sin produccin de xilitol.Este cultivo a trabajar nos da referencia para el medio cultivo.

Extracto de levadura: Es un excelenteestimulador del crecimiento de bacterias, esutilizadoen la preparacin demedios de cultivo microbiolgicos. Extracto de Levaduraes la partesoluble en agua deautolisislevadura quees cuidadosamente controladapara preservar laforma naturaldel complejo B.

Extracto de maltaPeptona

PREPARACIN DE MEDIO DE ACTIVACIN:a. Materiales y Equipos:

2 matracesBalanza analtica

Mechero BunsenUna probeta de 100 ml

Varilla de vidrio, pipeta y esptula

Estufa: La estufa de secado es un equipo que se utiliza para secar y esterilizar recipientes de vidrio y metal en el laboratorio. Se identifica tambin con el nombre Horno de secado.

PH metro: es un sensor utilizado en el mtodo electroqumico para medir elpHde una disolucin. La determinacin de pH consiste en medir el potencial que se desarrolla a travs de una fina membranadevidrioque separa dossolucionescon diferente concentracin deprotones.

Agitador orbital- Shaker: Unagitador, a veces llamadomezclador, es un dispositivo que se utiliza en los laboratorios de qumica y biologa para mezclar lquidos o preparardisolucionesysuspensiones

Reactivos y nutrientes:

Extracto de levadura: Es un excelenteestimulador del crecimiento de bacterias, esutilizadoen la preparacin demedios de cultivo microbiolgicos. Extracto de Levaduraes la partesoluble en agua deautolisislevadura quees cuidadosamente controladapara preservar laforma naturaldel complejo B.

Glucosa: es un azcar que est presente de manera natural en elementos tales como las frutas o la miel. Las frutas tambin poseen otro tipo de azcar natural que se conoce como fructosa.

Solucin de sales

Extracto de malta: Debido a su especial sabor, color y agradable aroma, el extracto de malta se usa ampliamente en la industria alimentaria con el fin de mejorar las propiedades organolpticas, valor nutricional, textura y vida til de los productos.

Alcohol

Agua destilada

PREPARACIN DE MEDIO DE FERMENTACIN:a. Materiales y Equipos:

2 matraces de 125 ml Matraz 1L.

Balanza analticaVarilla de vidrio

Gasa, capachitos y algodn. pH metro

b. Reactivos y nutrientes:Sacarosa: es el trmino apropiado para describir el azcar comn. Dos azcares simples, glucosa y fructosa, se combinan para formar el hidrato de carbono complejo conocido como sacarosa. La sacarosa es fina, incolora, inodora y tiene un sabor dulce. La sacarosa da un impulso de energa rpida para el cuerpo. Es fermentable y absorbe humedad.

Agua destiladaExtracto de levadura

(NH4)2SO4 = sulfato de amonio: En bioqumica, la precipitacin del sulfato de amonio es un mtodo comn para purificar las protenas al lado de precipitacin selectiva; El sulfato de amonio es extremadamente soluble en agua y as que puede hacer las soluciones muy concentradas que pueden salar hacia fuera las protenas, causando su precipitacin en las concentraciones particulares.

AlcoholKH2PO4 = fosfato de potasio:

Solucin de salesMgSO4.7H2O

CUADRO DE RESUMEN: MATERIALES A UTILIZARMANTENCIONACTIVACIONFERMENTACION

Asa bacteriolgicax

Matracesxxx

Tubos de ensayoxx

Mecheroxx

Rejilla de asbestox

Trpodexx

Pipetax

Shakerxx

Refrigeradora

Estufa elctricax

Incubadora elctricax

Olla a presin (autoclave)xx

Algodnx

gasaxx

Balanza analticaxx

pH-metroxx

Papel aluminiox

CUADRO DE RESUMEN: REACTIVOS QUE UTILIZAREMOS

MEDIONUTRIENTE

Solido de mantencin(PGY- Agar)Extracto de levadura

Peptona de casena

K2HPO4

Agar

Glucosa

Ajustar pH 7.0

ActivacinExtracto de peptona

Peptona de casena

K2HPO4

Glucosa

Ajustar pH 7.0

T 28C, N 200 rpm

FermentacinGlucosa

(NH4)2SO4

KH2PO4

EDTA

MgSO4-7H2O

FeSO4.7H20

Solucin de sales

Ajustar pH 7.0

T 28C, N 200 rpm

Desarrollo del inoculo y cultivo celular por lote de Pichia stipitis NRRL Y-7124, utilizando xilosa y glucosa como fuente de carbono

Actividades

FECHA

ABRILMAYO

SEMANA 02SEMANA 03SEMANA 04SEMANA 05SEMANA 06

202122232427282930010203040506091011 12131617

Presentacin del preinformeX

Preparacin de medio de mantencin agar nutriente y esterilizacin.X

Colocar la cepa una hora antes de inoculacin en estufa

X

Resembrado de clulas en el medio de mantencin agar slido y observacin del crecimientoXXX

Preparacin de reactivo DNS.Obtencin de la curva de calibrado de azcares reductores DNS (glucosa y xilosa).X

Esterilizacin de materiales de vidrio necesario Preparacin y esterilizacin del medio rico lquido para inoculo o medio de activacinX

Inoculacin con asa bacteriolgica a medio rico

X

Preparacin de los medios de fermentacin y esterilizacin del medio lquido para cintica de crecimiento microbiano.

XXX

Inoculacin de medios y seguimiento de la cintica de crecimiento microbiano. Determinacin de la curva de calibrado de Biomasa Evaluacin y supervisin del medio.Determinacin de las cinticas de crecimiento, consumo.XXXXX

Presentacin del informe final. Sustentacin del informe.X