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Universidad de Chile Facultad de Ciencias Químicas y Farmacéuticas

EFECTO DEL ANTIDEPRESIVO DESIPRAMINA SOBRE MARCADORES

HIPOCAMPALES ASOCIADOS A LA RESILIENCIA CELULAR.

Tesis presentada a la Universidad de Chile para optar al Grado Académico de Doctor en Bioquímica

Por:

Javier Andrés Bravo Vivallo

Directores de Tesis

Dra. Jenny Lucy Fiedler Temer Dr. Hernán Lara Peñaloza

Santiago, Chile

2007

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Financiamiento: Esta tesis de doctorado se realizó en el Laboratorio de Neurobioquímica, Departamento de Bioquímica y Biología Molecular, Facultad de Ciencias Químicas y Farmacéuticas, Universidad de Chile y contó con el financiamiento de los siguientes proyectos y becas: Proyecto FONDECYT Nº 1040937 Investigador responsable: Dra. Jenny L. Fiedler T. Proyecto FONDECYT-Cooperación Internacional Nº 7040157 Investigador responsable: Dra. Jenny L. Fiedler T. Beca de ayuda para la realización de tesis del Departamento Postgrado y Postítulo de la Universidad de Chile: Beca PG/86/2004 y PG/65/2005 Investigador responsable: Javier A. Bravo V. Beca CONICYT Nº 102240 (2002-2006) Beca CONICYT de asistencia a congresos en el extranjero Otorgada a Javier A. Bravo V. para la asistencia a la Society for Neuroscience, 35th Annual Meeting, 12 al 16 de Noviembre de 2005, Washington, DC. EE UU. Beca AECI para asistencia a congresos en el extranjero Otorgada a Javier A. Bravo V. para la asistencia a las Jornadas Iberoamericanas sobre Investigación y Evaluación de Nuevos Medicamentos con Propiedades Ansiolíticas, Antidepresivas y Neuroprotectoras, 30 de Agosto al 3 de Septiembre de 2004, Centro de Formación de la Cooperación Española, Cartagena de Indias. Colombia. Beca PABMB para asistencia a congresos en el extranjero Otorgada a Javier A. Bravo V. para la asistencia a la Panamerican Association for Biochemistry and Molecular Biology (PABMB), 10th Congress, 3 al 6 de Diciembre de 2005, Pinamar, Provincia de Buenos Aires. Argentina.

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Publicaciones y presentaciones a congresos: Manuscrito enviado a publicación:

Bravo JA, Díaz-Veliz G, Mora S, Arancibia S, Ulloa JL; Castañeda P; Lara HE, Fiedler JL “Differential effects of chronic restraint stress and desipramine on proteins involved in hippocampal neuroprotection”. Neuropsychopharmacology.

Presentaciones a congresos nacionales:

Bravo JA, Díaz-Veliz G, Mora S, Arancibia S, Lara HE, Fiedler JL. “Desipramine but not Haloperidol prevents the stress induced depression-like behaviours in rats, and a reduction in hippocampal TGF-β1 mRNA expression” 2do Congreso de la Sociedad Chilena de Neurociencia, 27 al 29 de Septiembre de 2006, Hotel Villa el Descanso, Curicó, VII Región. Chile.

Bravo JA, Andrés S, Mora S, Díaz-Véliz G, Arancibia S, Lara HE, Fiedler J. “Los Niveles

de ERK1/2-P, CREB-P y BCL-2 se Encuentran Aumentados en Hipocampo de Animales Sometidos a un Modelo de Depresión”. 1er Congreso de la Sociedad Chilena de Neurociencia, 1 al 2 de Diciembre de 2005, Club de Campo del Colegio Médico, Lo Barnechea, Santiago. Chile

Bravo JA, Andrés S, Araneda K, Araya D, Rojas P, Sapag A, Castañeda P, Ulloa JL, Parra

C, Rojas R, Arancibia S, Araya V, Díaz-Veliz G, Mora S, Herrera L, Silva H, Fritsch R, Rojas G, Lara HE, Fiedler JL. “Estrés, Glucocorticoides y Depresión”. XVI Reunión Anual de la Sociedad Chilena de Reproducción y Desarrollo, 12 al 14 de Agosto de 2005, Conferenece Town, Reñaca, V Región. Chile.

Fiedler JF, Andrés S, Araya D, Araneda K, Rojas P, Castañeda P, Bravo JA, Cárdenas SP,

Parra C, Greiner M, Morales P, Sapag A, Lara HE. “Glucocorticoides y Plasticidad Neuronal: Implicancia en Depresión Mayor”. XXVI Reunión Anual de la Sociedad de Farmacología de Chile, 3 al 5 de Octubre de 2004, Hotel Termas de Quinamávida, Colbún, VII región. Chile.

Bravo JA, Díaz-Veliz G, Mora S, Lara HE, Fiedler JF. “Cambios en la Expresión

Hipocampal de tgf-β1 Inducida por Desipramina en un Modelo Animal de Depresión”. XXVI Reunión Anual de la Sociedad de Farmacología de Chile, 3 al 5 de Octubre de 2004, Hotel Termas de Quinamávida, Colbún, VII región. Chile.

Presentaciones a congresos internacionales:

Bravo JA, Mora S, Díaz-Veliz G, Arancibia S, Lara HE, Fiedler JL. “Hippocampal Changes in TGF-b1 mRNA do not Correlate with Levels of ERK1/2 and CREB in an Animal Model of Depression” Panamerican Association for Biochemistry and Molecular Biology (PABMB), 10th Congress, 3 al 6 de Diciembre de 2005, Pinamar, Provincia de Buenos Aires. Argentina.

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Bravo JA, Díaz-Veliz G, Mora S, Arancibia S, Lara HE, Fiedler JL. “Expression of tgf-β1 Related to Changes in CREB-P and BDNF mRNA Levels in the CA3 Hippocampal Layer of Rats Subjected to a Model of Depression”. Society for Neuroscience, 35th Annual Meeting, 12 al 16 de Noviembre de 2005, Washington, DC. EE UU.

Bravo JA, Díaz-Veliz, Mora S, Dorfman M, Lara HE, Fiedler JL. “Changes in TGF-β1

mRNA expresión in the hippocampus of rats subjected to an animal model of depresion”. Jornadas Iberoamericanas sobre Investigación y Evaluación de Nuevos Medicamentos con Propiedades Ansiolíticas, Antidepresivas y Neuroprotectoras, 30 de Agosto al 3 de Septiembre de 2004, Centro de Formación de la Cooperación Española, Cartagena de Indias. Colombia.

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Agradecimientos: A mis directores, Dra. Jenny Fiedler por haberme guiado, apoyado y ayudado a

crecer profesionalmente durante todo este tiempo. A ella un ¡Muchas Gracias! de todo corazón. También al Dr. Hernán Lara por su ayuda y apoyo. A ambos ¡Gracias por su paciencia!, y por permitir quedarme en el laboratorio todos estos años. La verdad ha sido un segundo hogar para mi.

A Marcelita, mi amiga, compañera y esposa. Su cariño y amor han sido un pilar fundamental para poder realizar esta tesis. Además, ella hizo un gran aporte a este trabajo: estar a mi lado durante todo este tiempo. ¡Muchísimas Gracias!

A mi Familia, el apoyo y cariño de mis Padres, Hermanos, Sobrinos y Abuelos ha sido muy importantes para poder seguir adelante. Gracias por todo.

A los profesores Sergio Mora y Gabriela Díaz-Veliz, quienes no solo me ayudaron, y además me enseñaron el poder del estudio del comportamiento animal, si no que también han sido muy grandes amigos.

A Ximena Campos por su apoyo y amistad durante todo este tiempo. A Patricia Castañeda, no solo por su ayuda en esos fines de semana en que había que

venir a trabajar, si no que también por su compañía y su amistad. A todos los otros miembros del laboratorio de Neurobioquímica: Sergio, Paulina,

Patricia, Romina, Coto, Karina, Claudio, Mauricio, Pablo, Ramón, Alfonso, Monika. A todos ellos, ¡Muchas Gracias! por su apoyo.

A Gabriel, por su capacidad de aguantar todo lo que le ensuciamos y hacemos rabiar, disgustos que quedan atrás al momento de compartir en los paseos, donde realmente muestra el aprecio hacia la gente con quien trabaja.

A Miguel Copaja, Raul Vivar y Francisca Mateluna del laboratorio de Farmacoquímica, por toda su ayuda.

A mis profesores, por haberme entregado una visión del mundo desde la perspectiva de la ciencia, y por aguantarme todos estos años.

A mis amigos y compañeros de curso post grado Paola Rocco y Abel Vázquez. A todos quienes trabajan en el Quinto Piso. Y a todo el mundo que ha hecho de mí una mejor persona.

¡Gracias A Todos!

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Tabla de contenidos: PáginaPortada iFinanciamiento iiPublicaciones y presentaciones a congresos iiiAgradecimientos vTabla de contenidos viÍndice de figuras xÍndice de tablas xiiAbreviaturas xiiiResumen xvSummary xixI. Introducción 1

1. Trastornos del ánimo 11.1. La depresión mayor 11.2. Vías neuronales involucradas en la etiología de la depresión 2

1.2.1. Antidepresivos y sus probables mecanismos de acción 41.3. Otras perspectivas en el estudio de la depresión 6

1.3.1. Estrés y adaptabilidad del individuo 61.3.2. Glucocorticoides y el eje Hipotalamo-Hipofisis-Suprarrenal (HHS) 71.3.3. Efectos de los glucocorticoides en otras estructuras del sistema nervioso central 91.3.4. Acción de los glucocorticoides sobre el hipocampo 10

1.4. Mecanismos que mantienen la resiliencia celular en el hipocampo 131.4.1. Participación de la proteína de unión al elemento de respuesta de AMPc (CREB) 141.4.2. Participación de factores neurotróficos en la acción de antidepresivos 151.4.3. Participación de proteínas asociadas a neuroprotección en la acción de antidepresivos 161.4.4. Participación de otros factores de crecimiento asociados a la neuroprotección 17

II. Hipótesis 22III. Objetivo general 23IV. Materiales y métodos 25

1. Animales y Tratamientos 251.1. Estrés crónico por restricción de movimiento 251.2. Tratamientos farmacológicos 25

2. Pruebas conductuales 272.1. Prueba de preferencia a una solución de sacarosa al 1% como agua de bebida 272.2. Adquisición de respuestas condicionadas y fallas en la respuesta a nuevos paradigmas de estrés 282.3. Prueba de natación forzada 29

3. Preparación de tejidos 294. Determinación de los niveles séricos de corticosterona 305. Determinación del contenido de catecolaminas de la médula suprarrenal 31

5.1. Adsorción de catecolaminas en alúmina 315.2. Fase movil 32

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5.3. Detección 326. Hibridación in situ 32

6.1 Marcaje de oligonucleótidos para la hibridación in situ BDNF y TGF-β1 336.2. Marcaje del ARN complementario usado para la hibridación in situ de Bcl-2 346.3. Protocolo de hibridación in situ 346.4. Análisis de la hibridación in situ 35

7. Determinaciones inmunohistoquímicas 367.1. Análisis de la detección inmunohistoquímica 37

8. Análisis por inmunowestern blot 378.1. Inmunowestern Blot 38

9. Liberación de 3H desde cortes de hipocampo recientemente cargados con 3H-NA 409.1. Estudio de la sensibilidad del receptor α2 en cortes de hipocampo 42

9.1.1. Evaluación de la bioactividad de TGF-β1 429.1.2. Desdiferenciación de fibroblastos a miofibroblastos 439.1.3. Tinción con cristal violeta 43

10. Análisis estadístico 43V. Resultados 44

1. Determinar si el estrés crónico por restricción de movimiento induce características similares a la depresión, y si este efecto es prevenido por la administración crónica de DMI 44

1.1. Determinación de parámetros fisiológicos luego del estrés crónico por restricción de movimiento 44

1.1.1. Variaciones en el peso corporal 441.1.2. Tamaño de las glándulas suprarrenales y contenido de catecolaminas 471.1.3. Niveles de corticosterona 48

1.2. Cambios conductuales inducidos por estrés crónico y su modificación por la administración de DMI 49

1.2.1. Adquisición de respuestas condicionadas y capacidad de responder a nuevos estímulos nocivos 491.2.2. Prueba de natación forzada 521.2.3. Preferencia por una solución de sacarosa al 1% como agua de bebida 54

2. Analizar en un modelo animal de depresión, cambios en los niveles de marcadores asociados a la resiliencia celular en hipocampo de rata 56

2.1. Determinar los efectos del estrés crónico y el tratamiento con DMI sobre ERK1/2, CREB, BCL-2, BDNF y TGF-β1, como marcadores asociados a la resiliencia celular 56

2.1.1. Determinación por inmunowestern blot de ERK1/2 572.1.2. Determinación por inmunowestern blot de CREB 592.1.3. Determinación por inmunohistoquímica de P-CREB 612.1.4. Determinación de cambios en el ARNm de BCL-2 por hibridación in situ 652.1.5. Determinación por inmunowestern blot de BCL-2 692.1.6. Determinación por inmunohistoquímica de BCL-2 712.1.7. Determinación de cambios en el ARNm de BDNF por hibridación in situ 742.1.8. Determinación de cambios en el ARNm de TGF-β1 por hibridación in 78

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situ 3. Cambios en la sensibilidad del receptor α2 adrenérgico inducidos por estrés crónico 83

3.1. Efecto de la depolarización con K+ 25mM y dependencia de Ca2+ en la liberación 3H desde cortes de hipocampo recientemente cargados con 3H-NA 833.2. Efecto de la depolarización con K+ 25mM y en la liberación de 3H desde cortes de hipocampo recientemente cargados con 3H-NA en presencia de Yohimbina y Clonidina 863.3. Relación entre las áreas bajo la curva de la liberación fraccional de cada condición experimental 883.4 Efecto de Yohimbina, Clonidina y TGF-β1 en la liberación 3H desde cortes de hipocampo recientemente cargados con 3H-NA 90

3.4.1. Liberación de 3H desde cortes de hipocampo de ratas control sin estresar recientemente cargados con 3H-NA, y efecto de Yohimbina, Clonidina y TGF-β1 903.4.2. Liberación de 3H desde cortes de hipocampo cargados recientemente con 3H-NA, de ratas control sin estresar tratadas crónicamente con Desipramina. Efecto de Yohimbina, Clonidina y TGF-β1 923.4.3. Liberación de 3H desde cortes de hipocampo cargados recientemente con 3H-NA, de ratas estresadas crónicamente, y efecto de Yohimbina, Clonidina y TGF-β1 943.4.4. Liberación de 3H desde cortes de hipocampo cargados recientemente con 3H-NA, de ratas estresadas crónicamente tratadas con Desipramina, y efecto de Yohimbina, Clonidina y TGF-β1 96

3.5. Bioactividad de TGF-β1. Desdiferenciación de fibroblastos a miofibroblastos 100

VI. Conclusiones 101VII. Discusión 104

1. Respuestas fisiológicas asociadas al estrés crónico 1042. Efecto del estrés crónico por restricción de movimiento en conductas similares a la depresión y efectos de la Desipramina 105

2.1. El tratamiento con DMI mejora la adquisición de respuestas condicionadas en animales estresados 1062.2. El estrés crónico genera una condición de desesperanza aprendida: prueba de natación forzada 1082.3. Los animales estresados tienen una reducida preferencia por una solución azucarada como agua de bebida 109

3. La Desipramina indujo cambios en marcadores asociados a la resiliencia celular y neuroplasticidad en el hipocampo 110

3.1. El estrés crónico aumenta el grado de fosforilación de las ERK1/2 1113.2. CREB es modulado de manera diferente a la activación de ERK1/2 en las condiciones de estrés crónico y tratamiento con DMI 112 3.3. BCL-2 cambia su expresión en condiciones donde la resiliencia celular se ve mas afectada 1133.4. El ARNm total de BDNF se reduce por efecto del estrés crónico y la Desipramina previene este efecto solo en la región CA3 del hipocampo 115

ix

3.5. Participación de otros factores de crecimiento en la resiliencia celular: participación del TGF-β 1163.6. El tratamiento con HAL no previene los efectos del estrés crónico 118

4. Estrés crónico, actividad del receptor α2 presináptico y efecto de la DMI 1214.1. El tratamiento crónico con DMI a animales sin estresar cambia la sensibilidad del receptor α2 presináptico 1224.2. El TGF-β1 es capaz de afectar el eflujo de 3H de cortes de hipocampo recientemente cargados con 3H-NA 124

VIII. Proyecciones 126IX. Referencias 128

x

Índice de figuras:

PáginaFigura 1. El hipocampo de rata. Anatomía del hipocampo 12Figura 2. Esquema de mecanismos relacionados con la resiliencia celular 14Figura 3. Estructura de la Desipramina 26Figura 4. Esquema del protocolo de liberación de 3H desde cortes de hipocampo recientemente cargados con 3H-NA 41Figura 5. El estrés crónico reduce la ganancia de peso corporal 46Figura 6. El estrés crónico y el tratamiento con DMI alteran la adquisición de respuestas condicionadas, y los problemas en evitar estímulos nocivos 51Figura 7. El estrés aumenta la inmovilidad en la prueba de natación forzada 53Figura 8. El estrés crónico reduce la preferencia por una solución de sacarosa al 1% 55Figura 9. El estrés crónico y el tratamiento con DMI inducen cambios hipocampales en ERK1/2 total y su grado de fosforilación 58Figura 10. El estrés crónico aumenta los niveles hipocampales de CREB y P-CREB 60Figura 11. Microfotografías representativas de la inmuohistoquímica de P-CREB en diferentes regiones hipocampales 62Figura 12. Análisis la inmunoreactividad relativa de P-CREB en las diferentes áreas hipocampales 64Figura 13. Hibridación in situ para BCL-2 en hipocampo de rata 66Figura 14. El estrés reduce los niveles hipocampales del ARNm de BCL-2, efecto que no es prevenido por la DMI 68Figura 15. El estrés induce un aumento en los niveles hipocampales de BCL-2 70Figura 16. Microfotografías representativas de la inmunohistoquímica de BCL-2 en diferentes regiones del hipocampo 72Figura 17. Efecto del estrés crónico y del tratamiento con DMI en la inmunoreactividad relativa de BCL-2 en el hipocampo de rata 73Figura 18. Hibridación in situ para BDNF en hipocampo de rata 76Figura 19. El estrés crónico reduce los niveles hipocampales del ARNm de BDNF, efecto que solo es prevenido por DMI en la región CA3 77Figura 20. Hibridación in situ para TGF-β1 en hipocampo de rata 80Figura 21. El estrés crónico reduce los niveles del ARNm de TGF-β1 en todo el hipocampo, efecto que se previene por la DMI 81Figura 22. Liberación de 3H desde cortez de hipocampo recientemente cargados con 3H-NA, estimulada por depolarización con K+ 25mM en presencia y ausencia de Ca2+. 85Figura 23. Efectos de la Yoh 5µM y Clo 5µM en la liberación de 3H desde cortes de hipocampo recientemente cargados con 3H-NA por depolarización con K+ 25mM 87Figura 24. La liberación de 3H desde cortes de hipocampo recientemente cargados con 3H-NA depende de Ca2+, y es sensible a agonistas y antagonistas del receptor α2 89Figura 25. Liberación de 3H desde hipocampo de animales control sin estresar, recientemente cargados con 3H-NA 91Figura 26. Liberación de 3H desde cortes de hipocampo cargados con 3H-NA, de animales control tratados crónicamente con DMI 93Figura 27. Liberación de 3H desde cortes de hipocampo cargados con 3H-NA, de animales estresados crónicamente 95Figura 28. Liberación de 3H desde cortes de hipocampo cargados con 3H-NA, de animales estresados crónicamente tratados con DMI 97 Figura 29. Razones E2/E1 de ensayos de liberación de 3H en animales control sin estresar, control tratados con DMI, estresados crónicamente, y estresados tratados con DMI 99

xi

Figura 30. Efecto de TGF-β1 en un cultivo de fibroblastos neonatales cardiacos 100

xii

Índice de tablas:

PáginaTabla 1. Secuencias de oligonucleótidos de ADN de hebra simple y de ARN complementario para las hibridaciones in situ de BDNF, BCL-2 y TGF-β1 33Tabla 2. Anticuerpos utilizados en inmunohistoquímica 36Tabla 3. Resumen de las condiciones de determinación para las distintas proteínas por la técnica de Inmunowestern Blot. 39Tabla 4. Tamaño de la glándula suprarrenal y contenido de noradrenalina (NA) y adrenalina (A) en la medula de la glándula 47Tabla 5. Niveles séricos de corticosterona (CORT) 48

xiii

Abreviaturas:

3H: Tritio

3H-NA: Noradrenalina Tritiada 5-HT: Serotnina ACTH: Hormona Adrenocorticotrofina APA: Asociación Norteamericana de Psiquiatría AVP: Argininavasopresina Anti-digoxigenina-AP: Anticuerpo Antidigoxigenina conjugado con fosfatasa alcalina ARC: Adquisición de respuestas condicionadas ARNc: Ácido Ribonucléico complementario ARNm: Ácido Ribonucléico mensajero B: Basal BCIP: 5-Bromo-4-Cloro-3-Indolil Fosfato BDNF: Neurotrofina derivada de cerebro bFGF: Factor básico de crecimiento de fibroblastos BSA: Albúmina sérica de bovino CA: Cuerno de Amon CAs: Catecolaminas Clo: Clonidina COMT: Catecol-O-Metil Transferasa CONTROL+DMI: Animal Control sin estresar tratado con DMI 10mg/kg ip. CONTROL+HAL: Animal Control sin estresar tratado con HAL 50µg/kg sc. CONTROL+SAL: Animal Control sin estresar inyectado con NaCl 0,9% ip. CORT: Corticosterona CPM: Cuentas por minuto CRE: Elemento de respuesta a proteína CREB CREB: Proteína de unión a elementos de respuesta a AMPc CRH: Hormona liberadora de corticotrofina CRHR1: Receptor 1 de la hormona liberadora de corticotrofina DEX: Dexametasona DHBA: Dihidrobencil-amina DM: Depresión Mayor DMI: Desipramina DSM-IV: Manual estadístico y diagnóstico 4ta edición, de la Asociación

Norteamericana de Psiquiatría DTT: Ditiotreitol E: Estímulo EDTA: Ácido di-etilentetraacético FBS: Suero bovino fetal FCN: Fibroblastos cardiacos de neonato FE: Falla en el Escape GABA: Ácido gamaaminobutírico GABAB: Receptor B del ácido gamaaminobutírico GAP-43: Proteína asociada al crecimiento de 43kDa GCs: Glucocorticoides GD: Giro Dentado

xiv

GR: Receptor a Glucocorticoides HAL: Haloperidol HHS: Eje hipotálamo-hipófisis-suprarrenal HIS: Hibridación in situ HPLC: Cromatografía líquida de alta resolución i.p.: Intraperitoneal IHQ: Inmunohistoquímica IL-1: Interleuquina tipo 1 IL-10: Interleuquina tipo 10 IL-6: Interleuquina tipo 6 InfGD: Capa infrapiramidal del giro dentado Kir: Canal de K+ de rectificación de corriente hacia dentro de la célula KRBH: Solución de Krebs-Ringer tamponada con bicarbonato y HEPES L: Lavado MAO: Monoamino oxidasa MKPs: Fosfatasa de proteínas MAPK NA: Noradrenalina NBT: Azul de nitrotetrazolio NET: Transportador de noradrenalina NF-κB: Factor nuclear κB NGS: Suero normal de cabra NMDA: Ácido N-metil-D-aspártico PCA: Ácido perclórico P-CREB: Proteína de unión a elementos de respuesta a AMPc fosforilada PE: Postestímulo PKA: Proteína quinasa activada por AMPc PKC: Proteína quinasa dependiente de Ca2+ PVN: Núcleo paraventricular del hipotalamo RESTRICCIÓN+DMI: Animal estresado crónicamente tratado con DMI 10mg/kg ip. RESTRICCIÓN+HAL: Animal estresado crónicamente tratado con HAL 50µg/kg sc. RESTRICCIÓN+SAL: Animal estresado crónicamente inyectado con NaCl 0,9% ip. RT-PCR: Reacción en cadena de la polimerasa asociada a transcripción reversa Ser 133: Serina en la posición 133 de la proteína CREB SERT: Transportador de serotonina SNC: Sistema nervioso central SSC: Solución tamponada de citrato sódico y cloruro sódico SupGD: Capa suprapiramidal del giro dentado TBS: Solución tamponada de Tris y NaCl TE: Solución tamponada de Tris y EDTA TGF-β1: Factor de crecimiento transformante tipo β1 TNFα: Factor de necrosis tumoral tipo α TrkB: Receptor a BDNF V3: Receptor a Argininavasopresina tipo 3 Yoh: Yohimbina ERK: Quinasa regulada extracelularmente

xv

Resumen:

La depresión mayor es uno de los desórdenes del ánimo más comunes. Aunque no se conoce la

etiología de la depresión, se ha establecido que esta condición podría producirse como

consecuencia de la interacción de los genes y el ambiente. Además, se ha propuesto que en

episodios depresivos existe una deficiencia de la neurotransmisión serotoninérgica y/o

noradrenérgica en el sistema nervioso central (SNC). De acuerdo con esto, los tratamientos

farmacológicos para esta patología aumentan la biodisponibilidad de serotonina (5-HT) o

noradrenalina (NA), a través del bloqueo de su recaptura por los terminales nerviosos en

distintas estructuras del SNC. El aumento en 5-HT o NA ocurre rápidamente, sin embargo, los

pacientes que se encuentran bajo tratamiento con antidepresivos perciben una mejoría sólo tras

varias semanas. Por otra parte, los eventos estresantes a lo largo de la vida inician una serie de

respuestas fisiológicas que subsecuentemente pueden transformarse en patológicas. Esta última

evidencia sugiere la participación de los mecanismos de respuesta al estrés en los desórdenes

depresivos.

La respuesta al estrés se encuentra bajo el control del eje Hipotálamo-Hipófisis-Suprarrenal

(HHS), el cual regula la secreción de Glucocorticoides (GCs). Alrededor del 50% de los

pacientes depresivos poseen niveles elevados de GCs. La depresión afecta ciertas regiones del

SNC, como el hipocampo, una estructura que posee receptores a GCs (GRs) y que está

relacionada con procesos de memoria y aprendizaje. Se ha demostrado que la activación

persistente de los GRs reduce la neuroplasticidad hipocampal, y además afecta la capacidad

celular para sobrellevar condiciones adversas (reducción en la resiliencia celular). Por el

contrario, los antidepresivos son capaces de incrementar la expresión hipocampal de genes

neuroprotectores, que se sabe modulan la resiliencia celular y la neuroplasticidad. Además, los

antidepresivos mejoran la capacidad de regulación por retroalimentación que ejercen los GCs

sobre el eje HHS, disminuyendo de esta forma los niveles de GCs. De acuerdo con esto, si el

estrés crónico afecta la función del eje HHS, aumentando los niveles de GCs, afectando de esta

manera la función hipocampal a través de una disminución en la resiliencia celular, y si estos

efectos inducen características similares a la depresión, es posible postular la siguientes

hipótesis: i) En animales de experimentación, el estrés crónico por restricción de movimiento

xvi

induce conductas similares a la depresión, efecto que es prevenido por el antidepresivo

Desipramina; y ii) El antidepresivo promueve cambios en marcadores de resiliencia celular al

interior del hipocampo, como ERK1/2, CREB y BCL-2, y además induce cambios en factores

tróficos como BDNF y TGF-β1.

Para estudiar esta hipótesis, ratas macho Sprague- Dawley fueron sometidas a 2,5h diarias de

estrés por restricción de movimiento durante 14 días. Estos animales fueron inyectados

crónicamente con una solución salina, Desipramina (DMI) 10mg/kg, i.p., o Haloperidol (HAL)

50µg/kg s.c. Este último fármaco corresponde a un antipsicótico que se utilizó para evaluar si los

efectos de DMI sobre la conducta correspondían a aquellos reportados para antidepresivos y no a

acciones diferentes.

El estrés crónico por restricción de movimiento redujo la ganancia de peso, efecto que no fue

prevenido por el tratamiento con DMI ni con HAL. De igual forma, el estrés crónico indujo

mayores niveles de GCs, efecto que fue parcialmente prevenido por el tratamiento con DMI pero

no por el HAL. Con respecto a los efectos del estrés sobre la conducta, los animales estresados

crónicamente mostraron conductas similares a la depresión, incluyendo 1) reducción de la

preferencia por una solución de sacarosa al 1% como agua de bebida, lo cual asemeja una

conducta de anhedonia; 2) reducción en la adquisición de respuestas condicionadas, lo cual se

relaciona con deficiencias en las capacidades cognitivas; 3) falla en el escape en la prueba de

evitación activa y 4) aumento en la inmovilidad en la prueba de natación forzada,

comportamientos que son indicativos de desesperanza aprendida. Estas conductas fueron

prevenidas de manera específica por el tratamiento crónico con DMI pero no con HAL. Estos

cambios sugieren que el estrés crónico afecta el SNC, y por lo tanto se estudiaron a continuación

cambios en marcadores de resiliencia celular en el hipocampo.

Estudios de inmunoblot en extractos de proteínas hipocampales revelaron que el estrés

incrementó los niveles de P-ERK1/2 y P-CREB. La administración de DMI previno el

incremento en P-ERK1/2 inducido por el estrés, pero no el de P-CREB. La evaluación por

inmunohistoquímica mostró que, mientras el estrés no modificó los niveles de P-CREB en el

área CA y el giro dentado (GD) del hipocampo, estos niveles sí se encontraron aumentados

luego del tratamiento sólo con DMI a animales estresados. El HAL redujo la inmunoreactividad

xvii

relativa de P-CREB en cada subárea del hipocampo, independiente de la condición de estrés.

Además, la DMI no previno la reducción de los niveles de ARNm de BCL-2 asociada al estrés

en el hipocampo. Sin embargo, los análisis de inmunoblot mostró un aumento en los niveles de

proteína de BCL-2 sólo en los animales estresados, efecto que fue prevenido por DMI. Con

respecto al ARNm de BDNF, hubo una reducción del transcrito total de BDNF por efecto del

estrés, efecto que fue prevenido por DMI, pero no por HAL, solamente en el área CA3. El estrés

también disminuyó los niveles de ARNm de TGF-β1 en todas las subáreas hipocampales, efecto

que fue completamente prevenido por el tratamiento con DMI, pero no con HAL.

Estos resultados sugieren una compleja relación entre el comportamiento, fosforilación de

ERK1/2 y CREB, la expresión de BCL-2 y BDNF. Además, esta es la primera vez que se

demuestra que la expresión del ARNm de TGF-β1 se disminuye por el estrés, y que este efecto

es prevenido por DMI. Estos datos sugieren que dentro de las acciones de DMI se podría incluir

la inducción de TGF-β1, para promover cambios que favorezcan la resiliencia celular, o para

mejorar la neurotransmisión de NA en el hipocampo. Se ha descrito que algunas citoquinas

modulan la liberación de NA en el hipocampo, probablemente a través de efectos sobre el

receptor inhibitorio presináptico α2. Por lo tanto, se evaluaron los efectos del estrés y el

tratamiento con DMI sobre la actividad inhibitoria de α2, así como el efecto de TGF-β1 sobre el

eflujo de 3H desde cortes de hipocampo recientemente cargados con 3H-NA.

El tratamiento crónico con DMI a los animales sin estresar redujo el efecto del antagonista

α2Yohimbina (Yoh), y produjo que el eflujo de 3H desde cortes de hipocampo se volviera

insensible al agonista α2 Clonidina (Clo), cuando fueron estimuladas con K+ 25mM. Además, el

estrés crónico redujo el efecto de Yoh, sin embargo, se observó un aumento en el efecto de Clo

sobre la liberación hipocampal de 3H. Un patrón similar se observó en animales sometidos a

restricción de movimiento y tratados con DMI. Estos datos sugieren que el estrés crónico y el

tratamiento crónico con DMI inducen cambios diferenciales en la sensibilidad presináptica de

α2, probablemente como resultado de una interacción compleja entre más de un sistema de

neurotransmisores (por ejemplo, glutamato y GABA), sobre el eflujo de 3H desde cortes de

hipocampo cargados con 3H-NA. Más aún, TGF-β1 afecta este eflujo de 3H. En animales control

sin estresar, TGF-β1 disminuyó la el eflujo de 3H, pero en ratas control tratadas con DMI, y en

xviii

animales estresados con o sin tratamiento con DMI, el TGF-β1 aumentó el eflujo de 3H. Estos

efectos no pueden ser relacionados directamente con una modulación de la actividad α2

presináptica, como se ha sugerido para otras citoquinas, más aún, es probable que TGF-β1

module sus efectos modificando la conductancia de iones como Ca2+ y/o K+.

Los resultados presentados sugieren que la DMI modula la expresión de ciertos marcadores

relacionados con la resiliencia celular, tal como TGF-β1, y también afecta la excitabilidad de las

células al interior del hipocampo, siendo el ultimo efecto un importante mediador en la acción

antidepresiva de DMI.

xix

Summary:

EFFECT OF THE ANTIDEPRESSANT DESIPRAMINE ON HIPPOCAMPAL MARKERS

RELATED TO CELLULAR RESILIENCE.

Major depression is one of the most common forms of mood disorders. Although there is no

specific aetiology underlying depression, it has been established that this condition could be a

consequence of genes and environment interactions. Also, it has been proposed that in a

depressive episode there is impairment of serotoninergic and/or noradrenergic neurotransmission

within the central nervous system (CNS). Accordingly, pharmacological treatments for this

disorder improve serotonin (5-HT) or noradrenaline (NA) bioavailability through a blockade in

their reuptake from neuron terminals in CNS structures. The increase in 5-HT or NA occurs

rapidly, but patients under antidepressant treatment perceive improvements only after several

weeks. On the other hand, stressful events throughout life trigger a series of physiological

responses that can become pathologic afterwards. The latter evidence suggest the participation

the stress response mechanisms in depressive disorders.

Stress response is under control of the Hypothalamus-Hypophysis-Adrenal gland (HHA) axis,

which regulates Glucocorticoid (GC) secretion. About 50% of depressed patients show increased

levels of GCs. These hormones affect certain regions of the CNS, such as the hippocampus, a

structure which has GCs receptors (GR) and is related with processes of memory and learning. It

has been shown that persistent activation of hippocampal GRs reduces hippocampal

neuroplasticity, and also affects cellular ability to withstand aversive conditions (reduced cellular

resilience). Conversely, antidepressants are able to increase the expression of hippocampal

neuroprotective genes, also known to modulate neuroplasticity. In addition, antidepressants

improve the feedback regulation of the HHA axis by GCs, thus reducing GCs levels.

Accordingly, if chronic stress affects HHA axis function, increasing GCs levels, thus affecting

hippocampal function through a reduction in cellular resilience, and these effects induce

depression-like characteristics, the following hypothesis can be stated: In experimental animals,

chronic motion restraint stress induces depression-like behaviours, an effect prevented by the

xx

antidepressant Desipramine. The antidepressant promotes changes in cellular resilience

markers within the hippocampus, such as ERK1/2, CREB and BCL-2, and also induces changes

in trophic factors such as BDNF and TGF-β1.

To study this hypothesis, male Sprague-Dawley rats were subjected to 2.5h of daily restraint

stress during 14 days. These animals were chronically injected with either saline, 10 mg/kg

Desipramine (DMI), i.p, and 50µg/kg Haloperidol (HAL) sc. This latter antipsychotic was

introduced to evaluate if the effects of DMI on behaviour match those of an antidepressant and

not to a different action.

Chronic restraint stress reduced the weight gain, an effect that was not prevented by DMI or

HAL treatment. As well, chronic stress induced higher GCs levels, an effect also not prevented

by DMI or HAL treatment. As for the effects of stress on behaviour, chronically restrained

animals showed depression-like behaviours including 1) reduction in the preference for a 1%

sucrose solution as drinking water, which resembles anhedonic behaviour; 2) reduced acquisition

of conditioned responses, which relates to impairments in cognitive abilities; 3) escape deficit in

the active avoidance test and 4) increased immobility in the forced swim test, behaviours

indicating learned helplessness. These behaviours were specifically prevented by chronic DMI

but not by HAL treatment. These changes suggest that chronic stress affects the CNS, therefore

changes in cellular resilience markers were studied within the hippocampus.

Immunoblot from hippocampal protein extracts revealed that stress increased P-ERK1/2 and

P-CREB levels. DMI administration prevented the restraint-induced increase in P-ERK1/2 but

not in P-CREB levels. Whereas P-CREB, evaluated by immunohistochemistry, was not modified

by restraint in the hippocampal CA and dentate gyrus (DG), it was increased in after DMI

treatment on stressed animals. HAL reduced P-CREB relative immunoreactivity in every

hippocampal subfield, in each experimental condition. Also, DMI did not prevent the restraint

associated reduction in BCL 2 mRNA in hippocampus. However, immunoblot analysis showed

an increase in BCL-2 protein levels only in restrained animals, an effect prevented by DMI

treatment but not by HAL. As to BDNF mRNA, it was reduced by restraint, an effect only

prevented by DMI in the CA3 area, but not by HAL. Stress also reduced the mRNA levels of

xxi

TGF-β1 in every hippocampal subfield, an effect completely prevented by DMI treatment and

not by HAL.

These results suggest a complex relationship between behaviour, ERK1/2, CREB activation, and

expression of BCL 2 and BDNF. Also, this is the first demonstration that TGF-β1 mRNA

expression is reduced by stress and prevented by DMI treatment. These data suggest that DMI

action could include the induction of TGF-β1, to promote changes towards an improvement in

cellular resilience within the hippocampus, or to improve NA neurotransmission within the

hippocampus. It has been described that cytokines modulate NA release from the hippocampus,

probably affecting the presynaptic α2 inhibitory receptor. Therefore the effects of stress and DMI

treatment on α2 inhibitory activity were evaluated, as well as the effect of TGF-β1 on NA

release.

Chronic DMI treatment in unstressed animals reduced the effect of α2 antagonist Yohimibine

(Yoh), and made the 3H efflux from hipocampal slices recently loaded with 3H-NA insensitive to

α2 agonist Clonidine (Clo) when stimulated by depolarization with K+ 25mM. Also, chronic

stress reduced the effect of Yoh, however an increase in the effect of Clo on 3H efflux was

observed. A similar pattern was seen in restrained animals treated with DMI. This data suggests

that chronic stress and chronic DMI treatment induce differential changes in presynaptic α2

sensitivity, probably as a result of a complex interaction of more than one neurotransmitter

system (for instance, glutamate and GABA), on 3H release from hippocampal slices loaded with 3H-NA. Furthermore, TGF-β1 affects 3H efflux. In control unstressed animals TGF-β1 reduced 3H efflux, but in control rats treated with DMI, and stressed animals with or without DMI

treatment, TGF-β1 increased 3H effluxes. These effects cannot be related directly to a

modulation on presynaptic α2 activity, as suggested for other cytokines, moreover, it is likely

that TGF-β1 modulates this effect by affecting ion conductance, probably Ca2+ and/or K+.

These data suggest that DMI modulates the expression of certain markers related to cellular

resilience, such as TGF-β1, and also affects cells excitability within the hippocampus, being the

latter effect an important mediator in the antidepressant action of DMI.

1

I. Introducción:

Según la organización mundial de la salud, la definición de salud corresponde a un estado de

completo bienestar físico, mental y social, y no meramente la ausencia de enfermedad (WHO,

2006). Con respecto a la salud mental, esta misma organización estima que cerca de 450

millones de personas sufren actualmente de alguna patología neurológica, mental o del

comportamiento, haciendo de este tipo de enfermedades un problema común a nivel mundial

(WHO, 2006).

1. Trastornos del ánimo:

Los trastornos del ánimo, son enfermedades mentales que involucran varios aspectos

psicológicos como también físicos del individuo. No son lo mismo que los sentimientos

pasajeros de tristeza, si no que son una condición patológica de la cual el paciente no se puede

despojar o eliminar en forma voluntaria (NIMH, 2002). Este tipo de patologías interfieren con la

calidad de vida del individuo, y también afecta a quienes le rodean (NIMH, 2002).

1.1. La depresión mayor:

Existen varios tipos de trastornos del ánimo, siendo la depresión mayor (DM) uno de los

desordenes más comunes. Su característica principal es una alteración en el humor de quien

sufre este trastorno (APA, 1999). La DM es una psicopatología que afecta la manera de sentirse,

pensar y actuar del individuo (APA, 1999), pudiendo ser a menudo una amenaza para la vida de

quienes la sufren, principalmente por el riesgo al suicidio (Nestler, E.J., y cols., 2002). Es tal el

impacto que puede tener la depresión, que se estima que para el año 2020, la DM será una de las

mayores causas de discapacidad a nivel mundial (Lecrubier, Y., 2001, Murray, C.J.L., y cols.,

1996, Nestler, E.J., y cols., 2002). Para el diagnóstico de la depresión el psicoterapeuta busca

signos como ánimo deprimido, irritabilidad, baja autoestima, sentimientos de desamparo y

culpabilidad, capacidad disminuida de concentrarse y pensar, apetito disminuido o aumentado,

que trae como consecuencia pérdida o ganancia de peso, insomnio o hipersomnia, fatiga o

agitación aumentada, perdida de interés por estímulos placenteros (sexo, comida, interacciones

sociales, etc.), pensamientos recurrentes sobre la muerte y el suicidio. El diagnostico de la DM,

2

de acuerdo al Manual Diagnóstico y Estadístico de los Trastornos Mentales 4ta edición

(DSM-IV) (APA, 1999) se efectúa cuando el paciente presenta 5 o más criterios diagnósticos

(incluyendo el estado de ánimo depresivo y la perdida de interés o capacidad para el placer,

también llamada anhedonia) y cuando éstos persisten por un período de más de 2 semanas,

alterando la interacción social y ocupacional del individuo (APA, 1999)

Hasta la fecha no se ha identificado una etiología específica para explicar el origen de la

depresión (Fava, M., y cols., 2000, Nestler, E.J., y cols., 2002); sin embargo se han logrado

establecer algunos posibles factores de riesgos que se asocian esta psicopatología como:

i) genético, determinado a través de estudios en familias y en gemelos (Shih, R.A., y cols.,

2004); ii) eventos estresantes a lo largo de la vida, que pueden desencadenar una serie de

respuestas fisiológicas, que a lo largo del tiempo se vuelven patológicas, permitiendo explicar

ciertos fenómenos clínicos observados en pacientes (Fava, M., y cols., 2000, Nestler, E.J., y

cols., 2002). De esta forma, se puede decir que el origen de la depresión en un individuo ocurre

por una interacción entre genes y ambiente, siendo esto último en función de la perspectiva del

entorno donde éste se desarrolle.

1.2. Vías neuronales involucradas en la etiología de la depresión:

Existe diversa evidencia farmacológica y neuroquímica que ha permitido establecer algunas

hipótesis con respecto al tipo de disfunción que ocurre a nivel del sistema nervioso central

(SNC). La administración de reserpina, fármaco que interfiere con el almacenamiento vesicular

de neurotransmisores como serotonina (5-HT) y noradrenalina (NA) (Hoffman, B., y cols., 2001,

Sachar, E.J., 1991), disminuyendo el almacenamiento de estos neurotransmisores y promoviendo

la degradación de estos por enzimas como la monoaminooxidasa (MAO), genera depresión en

pacientes (Pletscher, A., y cols., 1956, Sachar, E.J., 1991). Este hallazgo tiene su paralelo en

estudios en animales, en que la administración de reserpina produce algunas caracteristicas

similares a la depresión (Rojas-Corrales, M.O., y cols., 2004, Sachar, E.J., 1991). En este mismo

sentido, la administración de inhibidores de la MAO a animales tratados con reserpina previene

los efectos de este último fármaco en el comportamiento (Sachar, E.J., 1991). Otro hallazgo en

relación a lo observado con los inhibidores de la MAO en el comportamiento de animales y su

acción en pacientes, se descubrió gracias a compuestos tricíclicos capaces de aumentar la

3

biodisponibilidad de estos neurotransmisores bloqueando su recaptura desde el espacio sináptico

(Baldessarini, R., 2001, Sachar, E.J., 1991, Warsh, J., y cols., 1998) lo que sugiere la

participación de la 5-HT y la NA en los trastornos del ánimo. En apoyo a estas observaciones, la

administración de precursores de la síntesis de estos neurotransmisores, mejoran los efectos

terapéuticos de los inhibidores de la MAO. Además, existe evidencia basada en estudios sobre

los metabolitos de la 5-HT y la NA en el líquido encéfalo-raquideo, donde se han observado una

reducción importante de estos en pacientes depresivos (Sachar, E.J., 1991). Es así que se ha

sugerido que la depresión se debe a una reducción en el disponibilidad de 5-HT y NA

(Baldessarini, R., y cols., 2001, Warsh, J., y cols., 1998). Las neuronas serotoninérgicas tienen

sus cuerpos celulares en los núcleos del Rafe, ubicados en la línea media del tallo cerebral, y se

proyectan profusamente hacia el hipotálamo, corteza y sistema límibico, incluyendo al

hipocampo (Ganong, W., 1996a). Entre algunas de las acciones relacionadas a la 5-HT, se le

atribuyen la generación de algunas de las respuestas a estrés a través de sus proyecciones hacia

la amígdala, que le permite al individuo evaluar el entorno adverso al que se ve expuesto

(Graeff, F.G., y cols., 1996). Las proyecciones serotoninérgicas que llegan a la región

periventricular y materia gris periacueductal, están involucradas en la respuesta de flight or fight

(escape o pelea), que se refiere al tipo de respuesta frente una situación de estrés, es decir, huir

de la situación estrés (o estresor), o enfrentar directamente a esta situación (Graeff, F.G., y cols.,

1996). En cambio en el hipocampo, la liberación de 5-HT promueve la desconexión entre

eventos aversivos y procesos psicológicos, haciendo que el individuo pueda llevar una vida

normal a pesar de estar en un entorno adverso (Graeff, F.G., y cols., 1996), es decir, se ha

asociado a una resistencia al estrés. En este sentido, la depresión aparece cuando hay una

alteración en la neurotransmisión serotoninérgica, lo que disminuye la capacidad del individuo

para enfrentar un entorno desfavorable (Graeff, F.G., y cols., 1996). Por otro lado, las neuronas

noradrenérgicas tienen sus cuerpos celulares ubicados en el Locus Ceruleus, ubicados en la

protuberancia y el bulbo raquideo, desde donde proyectan sus axones (eferencias) hacia el

hipotálamo, el tálamo, el sistema límbico y la corteza (Kiernan, J., 2000). Las proyecciones

noradrenérgicas provenientes del Locus Ceruleus, se han relacionado con el estado de alerta del

animal, puesto que estas neurona solo están activas en el animal despierto y de hecho participan

en el despertar (arousal) del animal (Berridge, C.W., y cols., 2003, Kiernan, J., 2000). Además

es importante para el ingreso y el procesamiento de la información sensorial (Berridge, C.W., y

cols., 2003), lo que le permite evaluar su entorno o su situación para generar la respuesta

4

adecuada. Además, existe una interacción entre NA y 5-HT. Es así que la liberación de NA

afecta la de la 5-HT, debido a que las neuronas serotoninérgicas presentan receptores α2

presinápticos en sus terminales, cuya activación inhibe la liberación de 5-HT en los terminales

neuronales proyectados desde el Rafe (Graeff, F.G., y cols., 1996, Vizi, E.S., y cols., 1998). Esta

condición sugiere un nivel de regulación muy importante en lo que se refiere a conductas

relacionadas a aprendizaje, respuestas a estrés y la relación con el entorno. Es decir, conductas

que en el humano pueden entenderse como la interacción social del individuo y con su ambiente.

Estas conductas están alteradas en la DM, y por lo tanto las estrategias farmacológicas se han

enfocado a aumentar la disponibilidad de estos neurotransmisores.

1.2.1. Antidepresivos y sus probables mecanismos de acción:

Una de las estrategias para aumentar la disponibilidad de NA y/o 5-HT, se relaciona con la

inhibición de las enzimas que degradan a los neurotransmisores (inhibidores de la MAO), sin

embargo este tipo de fármacos son usados cada vez con menos frecuencia (Sachar, E.J., 1991),

principalmente por la amplia gama de efectos secundarios que producen este tipo de fármacos

(Baldessarini, R., 2001, Warsh, J., y cols., 1998). Otra estrategia implica la inhibición de los

transportadores de NA y 5-HT al terminal presináptico, lo que permite aumentar la

disponibilidad de neurotransmisores en el espacio sináptico (Baldessarini, R., y cols., 2001,

Sachar, E.J., 1991, Warsh, J., y cols., 1998). El bloqueo de los transportadores de NA (NET) y

de 5-HT (SERT) por antidepresivos, puede ser específica para cada neurotransmisor, o bien con

acción dual (actuando sobre NET y SERT en forma simultánea). Este efecto a nivel de los

transportadores ocurre rápidamente (Warsh, J., y cols., 1998), sin embargo el paciente observa

mejorías después de semanas o incluso meses con el tratamiento antidepresivo (Baldessarini, R.,

y cols., 2001, Warsh, J., y cols., 1998), lo que sugiere que estos fármacos en un inicio son

capaces de aumentar la disponibilidad de neurotransmisores, sin embargo este mecanismo no es

capaz por sí solo de revertir las características asociadas a la depresión. Es probable que estos

cambios en la disponibilidad de NA y/o 5-HT permitan iniciar una serie de eventos, que a largo

plazo son capaces de otorgar un efecto beneficioso al paciente con depresión (Baldessarini, R., y

cols., 2001, Warsh, J., y cols., 1998), y que no necesariamente impliquen cambios en los niveles

de NA y/o 5-HT en el SNC. Es así que se han planteado algunas nuevas hipótesis acerca del

mecanismo de acción de los antidepresivos, en las que se incluyen cambios en la sensibilidad o

5

cantidad de los autorreceptores relacionados a las vías específicas de NA y 5-HT (Warsh, J., y

cols., 1998). Por ejemplo, un aumento en la disponibilidad de 5-HT en el espacio sináptico, por

un bloqueo del SERT, puede actuar sobre los autoreceptores somato-dendríticos del tipo 5-HT1A,

capaces de disminuir la frecuencia de descarga, y lo por lo tanto disminuir la liberación de 5-HT

(Baldessarini, R., y cols., 2001). La activación persistente de la 5-HT sobre el receptor 5-HT1A,

debida al bloqueo del mecanismo de recaptura, puede desensibilizar al autoreceptor inhibitorio,

disminuyendo el efecto inhibitorio de este en la liberación de 5-HT, mejorando así la

neurotransmisión serotoninérgica (Baldessarini, R., y cols., 2001, Warsh, J., y cols., 1998). En el

caso de los inhibidores de la recaptación de NA, se ha sugerido un efecto similar a lo descrito

para la 5-HT. Un aumento en la disponibilidad de NA por efecto del bloqueo del NET, puede en

el tiempo desensibilizar al autoreceptor presinaptico α2, cuya activación inhibe la liberación de

NA desde el terminal presináptico, lo que favorece un aumento en la liberación de NA,

mejorando los efectos que promueven un aumento en la disponibilidad de NA (Baldessarini, R.,

y cols., 2001, Warsh, J., y cols., 1998). Además, y como ya se mencionó anteriormente, las

neuronas serotoninérgicas también presentan al receptor α2 inhibitorio en sus terminales, por lo

que el tratamiento crónico con un antidepresivo inhibidor de la recaptación de NA aumenta la

disponibilidad de NA, el cual promueve así una disminución del tono inhibitorio del receptor α2

en las mismas neuronas noradrenérgicas como también en las serotoninérgicas (Baldessarini, R.,

2001, Glavin, G.B., 1985, Graeff, F.G., y cols., 1996, Warsh, J., y cols., 1998). Sin embargo, esta

hipótesis implica que el tratamiento crónico con antidepresivos, que aumenta la disponibilidad

de NA y/o 5-HT en el espacio sináptico por bloqueo de sus transportadores presinápticos, y la

concomitante desensibilización de los mecanismos inhibitorios (receptores, 5-HT1A y/o α2)

(Warsh, J., y cols., 1998), también pueden desensibilizar o regular hacia abajo a los otros

receptores noradrenérgicos y/o serotoninérgicos, postsinápticos y presinápticos, por lo que a

través de esta hipótesis es difícil explicar cómo es que los antidepresivos ejercen su efecto

(Warsh, J., y cols., 1998). Es por esto que se han planteado otras hipótesis, en que los

antidepresivos, además de modular la disponibilidad de monoaminas, van a favorecer cambios

en cascadas de señalización intracelular (D'Sa, C., y cols., 2002, Duman, R.S., 2002, Duman,

R.S., y cols., 1989, Stone, E.A., y cols., 1986), principalmente para compensar la internalización

de receptores postsinapticos (D'Sa, C., y cols., 2002), y que en el largo plazo generarían cambios

en la expresión génica, lo que tendría efectos a nivel de la neuroplasticidad y/o neuroprotección

(factores asociados a la resiliencia celular), explicando en parte largo periodo de tiempo que

6

tardan estos agentes farmacológicos para ejercer efecto (Duman, R.S., 2002, Nestler, E.J., y

cols., 2002, Vaidya, V.A., y cols., 2001).

1.3. Otras perspectivas en el estudio de la depresión:

Recientemente se ha observado que en pacientes con DM hay una reducción en el volumen de

ciertas regiones discretas del cerebro como corteza y amígdala, debido a un menor número y/o

tamaño de glias y neuronas (Rajkowska, G., 2000a, b, Rajkowska, G., y cols., 1999). También se

ha planteado que estos déficit corresponden a alteraciones del desarrollo que puedan otorgar

vulnerabilidad a episodios anormales del estado de ánimo, o bien que corresponden a cambios

compensatorios a otros estados patológicos o quizas son producto episodios depresivos

recurrentes (Manji, H.K., y cols., 2001a). La reducción en el número de glias en estas áreas

llama la atención por el papel fundamental que ellas juegan en regular los niveles de otros

neurotransmisores en el espacio sináptico, como el glutamato, y en la liberación de factores

tróficos que participan en el desarrollo y mantención de redes formadas por neuronas y glias

(Coyle, J.T., y cols., 2000). Toda esta evidencia ha llevado a postular que la depresión esta

asociada a cambios en la viabilidad y mecanismos que permiten la citoprotección celular

(resiliencia celular) (Manji, H.K., y cols., 2001a).

1.3.1. Estrés y adaptabilidad del individuo:

En relación a los cambios de la resiliencia celular a nivel del SNC, el efecto que puede tener el

entorno del individuo sobre estos factores resulta de mucho interés. Las respuestas fisiológicas

generadas por situaciones externas, que el individuo no puede controlar o que resultan ser una

amenaza para la sobrevida (situaciones de estrés) (Tsigos, C., y cols., 2002), permiten la

adaptabilidad al medio, pudiendo incluso favorecer mecanismos de memoria y aprendizaje, por

lo que se puede afirmar que la exposición al estrés en cortos periodos puede ser incluso

beneficioso para el individuo (McEwen, B.S., y cols., 1995). Por el contrario, si estos

mecanismos fisiológicos son sostenidos en el tiempo, como resultado de una prolongada

exposición a la situación de estrés (estrés crónico), los efectos en el individuo dejan de ser

beneficiosos y se tornan patológicos (McEwen, B.S., y cols., 1995). Es así que dentro de los

efectores de la respuesta fisiológica al estrés, como los corticosteroides, hormonas producidas en

7

la corteza de las glándulas suprarrenales, juegan un papel muy importante en el desarrollo de los

efectos patológicos del estrés (McEwen, B.S., y cols., 1995). Uno de los factores de riesgo para

el desarrollo de la depresión es el estrés crónico, y éste, a su vez, puede causar cambios

importantes en la fisiología del individuo, alterando la resiliencia celular a nivel del SNC, es

decir la capacidad que tienen las células de adaptarse a condiciones adversas, y por lo tanto

explicar en parte una posible causa de la depresión.

1.3.2. Glucocorticoides y el eje Hipotalamo-Hipofisis-Suprarrenal (HHS):

Las respuestas de estrés de un individuo son moduladas por la actividad del eje Hipotalamo-

Hipofisis-Suprarrenal (HHS), que permite la regulación de la secreción de los glucocorticoides

(GCs). Los GCs son hormonas esteroidales que se secretan desde la corteza adrenal, proceso que

es regulado por una secuencia de eventos que se inician con la secreción de la hormona

liberadora de corticotrofina (CRH) a nivel hipotalámico. La secreción de CRH está regulada por

diversas vías neuronales que se originan en centros superiores del cerebro y que proyectan al

hipotálamo (Rhoades, R., y cols., 1996). La CRH llega a la hipófisis por vía portal induciendo la

liberación de la hormona adrenocorticotrófica (ACTH). A su vez la ACTH, liberada al torrente

sanguíneo, estimula la secreción de los GCs desde la corteza adrenal. La ACTH es el principal

regulador de la secreción de estos esteroides (Ganong, W., 1996b). A su vez, los GCs ejercen un

control inhibitorio del ACTH a nivel hipofisiario disminuyendo tanto la síntesis como la

liberación (Nestler, E.J., y cols., 2002), efecto que es proporcional a la concentración de GCs

(Ganong, W., 1996b). También, otra forma que tienen los GCs de inhibir la liberación de ACTH

hipofisiario es disminuyendo la síntesis y liberación de CRH a nivel hipotalámico (Ganong, W.,

1996b, Nestler, E.J., y cols., 2002, Rhoades, R., y cols., 1996). Los GCs realizan múltiples

funciones, como: mantener la glicemia, modular respuestas inmunes e inflamatorias y participar

en los mecanismos de adaptación a situaciones de emergencia o en estados de alerta, entre otras

(Scully, J.L., y cols., 1995). A su vez los corticoides que se liberan a la circulación pueden

atravesar la barrera hematoencefálica y actuar sobre el SNC, siendo un blanco importante el

hipocampo el cual se vincula a procesos de memoria espacial y aprendizaje (McEwen, B.S.,

1999).

8

La secreción de GCs por la glándula adrenal ocurre en forma circadiana o episódica. La primera

involucra cambios periódicos durante las 24 h; mientras que la segunda involucra un aumento de

la secreción en respuesta a estímulos específicos denominados estados de alerta. Lo anterior,

indica que la liberación de los corticoides durante el ciclo circadiano a su vez es afectada por

impulsos desde centros del SNC que regulan la liberación hipotalámica de CRH (McEwen, B.S.,

1987, 1994, 1999, McEwen, B.S., y cols., 1995, Nestler, E.J., y cols., 2002, Sapolsky, R.M.,

1996a).

Se ha observado que el 50% de los individuos con enfermedad de Cushing, y que por lo tanto

tienen niveles séricos muy elevados de GCs, sufren de depresión, sugiriendo un papel importante

de los GCs en etiología de la depresión (Sonino, N., y cols., 1998). Además, aproximadamente el

50% de los pacientes con DM presentan una secreción aumentada de cortisol (Parker, K.J., y

cols., 2003), lo que sugiere la participación del eje HHS en los trastornos depresivos mayores

(Gold, P.W., y cols., 2002, Holsboer, F., 2001, Manji, H.K., y cols., 2001a, McQuade, R., y cols.,

2000, Nestler, E.J., y cols., 2002). Esta falla en la regulación puede ocurrir por una regulación

hacia abajo de los receptores a glucocorticoides (GR), ya que se ha descrito que la función de

GR está disminuida en células periféricas de individuos depresivos mayores (Pariante, C.M.,

2004). Pero también esta alteración en la regulación del eje HHS puede ser una consecuencia de

una falla en los receptores a CRH (Budziszewska, B., y cols., 2002, Holsboer, F., 1999). Esta

última situación se podría deber a que ante niveles sostenidos de GCs, como los que se presentan

en respuesta a episodios de estrés crónico, se generaría esta regulación hacia abajo de los GR,

haciendo que se pierda la señalización inhibitoria de los GCs sobre la producción de CRH, por lo

tanto, habría un aumento en la producción de CRH que no es regulado por la retroalimentación

negativa que normalmente ejercen los GCs (Holsboer, F., 1999, 2000, 2001, Holsboer, F., y

cols., 1986). Este aumento en los niveles de CRH puede tener efecto en los receptores a este

neuropéptido. Se ha observado que el receptor a CRH tipo 1 (CRHR1) es susceptible a

desensibilización por una prolongada exposición a CRH en neuronas corticotrofas (Holsboer, F.,

1999), condición que también afecta el correcto funcionamiento del eje HHS. Estas fallas en la

actividad de este eje neuroendocrino han permitido plantear ciertas pruebas de funcionalidad,

que permiten determinar la actividad de este eje, pruebas que además han entregado más

evidencia sobre la participación del eje HHS en el desarrollo de la depresión. Esta prueba clínica

determina de qué manera cambian los niveles de ACTH y cortisol en presencia dexametasona

9

(DEX), un agonista para el receptor a GCs (GR) y también como cambian los mismos

parámetros por efecto de la CRH (Holsboer, F., y cols., 1986, Holsboer, F., y cols., 1984,

Holsboer, F., y cols., 1987, Ising, M., y cols., 2005, von Bardeleben, U., y cols., 1985). La

prueba combinada de supresión de la secreción de GCs con DEX y CRH (DEX/CRH), evalúa de

qué manera está afectada la secreción de ACTH a nivel hipofisiario, ya que la DEX no es capaz

de atravesar la barrera hemato-encefálica (Uhr, M., y cols., 2002). En segundo lugar evalúa la

secreción de ACTH por efecto del CRH, ya que hay pacientes depresivos con mayores niveles

de GCs plasmáticos que no son capaces de secretar ACTH en presencia de CRH, probablemente

debido a la desensibilización del receptor a CRH como causa de una exposición crónica al factor

liberador (Holsboer, F., y cols., 1984, Ising, M., y cols., 2005, Nestler, E.J., y cols., 2002, von

Bardeleben, U., y cols., 1985). En pacientes con DM, se observa una resistencia a la supresión de

la secreción de cortisol por DEX indicando una alteración del eje HHS a nivel hipofisiario

(Holsboer, F., 2001), y una disminuida secreción de ACTH en presencia de CRH (Holsboer, F.,

y cols., 1984, Ising, M., y cols., 2005, von Bardeleben, U., y cols., 1985). Más aún, este ensayo

ha demostrado ser de utilidad para el seguimiento del tratamiento antidepresivo, ya que después

de la terapia estos pacientes presentan una normalización de la actividad del eje HHS y además

logran mantener niveles de cortisol normales. Asimismo, pacientes que una vez terminado el

tratamiento no logran normalizar su secreción de cortisol, tendrían una mayor probabilidad de

recaer (Holsboer, F., 2001, Ising, M., y cols., 2005).

1.3.3. Efectos de los glucocorticoides en otras estructuras del sistema nervioso central:

Los GCs tienen una serie de blancos fisiológicos en el SNC, incluyendo las vías serotoninérgicas

y noradrenérgicas. Entre los efectos de los GCs sobre la neurotransmisión de 5-HT, destaca la

capacidad de modular la actividad inhibitoria del receptor somato-dendrítico 5-HT1A (Bellido, I.,

y cols., 2004, Czyrak, A., y cols., 2002, Laaris, N., y cols., 1995, Martire, M., y cols., 1989). Los

GCs aumentan la afinidad de receptor 5-HT1A por agonistas (Bellido, I., y cols., 2004). De esta

forma, aumenta la actividad inhibitoria de 5-HT1A sobre las neuronas del Rafe, disminuyendo la

liberación de 5-HT, alterando así la correcta neurotransmisión serotoninérgica, que en parte

explicarían los cambios conductuales observados en la DM (Bellido, I., y cols., 2004, Czyrak,

A., y cols., 2002, Laaris, N., y cols., 1995, Martire, M., y cols., 1989). También, los GCs son

capaces de afectar la neurotransmisión noradrenérgica (Duman, R.S., y cols., 1989, McEwen,

10

B.S., 1987, Stone, E.A., y cols., 1986), aumentando la actividad de este sistema de

neurotransmisión (McEwen, B.S., 1987), favoreciendo los estados de alerta del individuo, y

favoreciendo cambios en el establecimiento o consolidación de la memoria a largo plazo

(Roozendaal, B., y cols., 2004). El aumento en la actividad del sistema noradrenérgico, como

consecuencia de niveles elevados de GCs por estrés crónico, también tiene consecuencias a nivel

del autoreceptor inhibitorio presináptico α2 (Tjurmina, O.A., y cols., 1999), ya que a mayor

disponibilidad de NA, este autorreceptor se desensibiliza o regula hacia abajo, aumentando así la

liberación de NA (Corrodi, H., y cols., 1968, Tjurmina, O.A., y cols., 1999). Este aumento en la

liberación de NA, causado por aumento en los niveles de GCs y la consecuente desensibilización

del autorreceptor α2, sugiere que también se podrían desensibilizar los otros receptores a NA (α

y β), afectando así la funcionalidad de la neurotransmisión noradrenérgica (Meyer, H., y cols.,

2000). Este efecto, generaría una reducción en la capacidad de estar alerta en el individuo,

similar a una condición de desesperanza (incapacidad de responder a nuevos estímulos adversos

(Glavin, G.B., 1985)), y una disminución de consolidación de memoria que también se vería

afectada (Roozendaal, B., y cols., 2004). Estas condiciones ocurren en pacientes depresivos, y

están descritas como signos de depresión por los manuales diagnósticos (APA, 1999).

1.3.4. Acción de los glucocorticoides sobre el hipocampo:

El hipocampo está formado por un grupo de estructuras cerebrales localizadas en la parte más

profunda del cerebro. Esta comprende cuatro áreas (Fig. 1): i) el giro dentado (GD) formada

fundamentalmente por neuronas granulares que se disponen en forma de V, encerrando una zona

polimórfica denominada Hilus que se caracteriza por la presencia de interneuronas, glias y

células troncales indiferenciadas, ii) el hipocampo propiamente tal (Cuerno de Ammon) el cual

se divide en cuatro subáreas formadas por neuronas piramidales CA1, CA2, CA3 y una capa más

difusa CA4, iii) el complejo subicular y iv) la corteza entorrina la cual recibe información de un

gran espectro de modalidades sensoriales y de áreas de asociación multimodal. La información

fluye desde la corteza entorrina hacia el GD a través de la vía perforante (Amaral, D., y cols.,

1995). Las neuronas granulares del GD proyectan a través de sus fibras musgosas hacia las

dendritas del área CA3 del hipocampo. Las neuronas piramidales de CA3 envían colaterales

hacia el área CA1 generando la principal fuente de ingreso de información en esta región. El

subículo recibe información de CA1 y la proyecta nuevamente hacia la corteza entorrina antes de

11

regresar a las mismas áreas sensoriales que se activaron por el estimulo inicial. El circuito

establecido en el hipocampo es principalmente excitatorio asociado a neurotransmisión

glutamatérgica (Kandel, E.R., y cols., 1991). El hipocampo al formar parte del sistema límbico,

controla las respuestas emocionales frente a perturbaciones del medio ambiente, es también una

estructura involucrada en procesos de memoria y aprendizaje, que se ve afectada por variaciones

en los niveles de GCs (Kandel, E.R., y cols., 1991). Además, el hipocampo se caracteriza por su

plasticidad sináptica asociada tanto a cambios bioquímicos como morfológicos que le permiten

un remodelamiento de la función sináptica, permitiendo los procesos de memoria espacial y

aprendizaje. Aunque en esta estructura el principal sistema de neurotransmisión es

glutamatérgico, también hay participación de sistemas colinérgicos, serotoninérgicos y

noradrenérgicos que permiten regular la funcionalidad de esta estructura (Vizi, E.S., y cols.,

1998).

Los esteroides adrenales, actúan modulando la fisiología del hipocampo y provee además de un

modelo para estudiar las consecuencias neurobiológicas de estas hormonas. Los corticoides

normalmente controlan la neurogénesis, arborización dendrítica y la expresión de diferentes

receptores a neurotransmisores (McEwen, B.S., 1994, 1996, 1999). Es así que en la depresión

mayor asociada a hipercortisolemia, probablemente se verán afectadas tanto la resiliencia celular

del hipocampo, y algunas de las funciones reguladas por esta estructura (Holsboer, F., 2001,

Manji, H.K., y cols., 2001a, McQuade, R., y cols., 2000, Nestler, E.J., y cols., 2002, Sapolsky,

R.M., 2001).

12

Figura 1. El hipocampo de rata. Anatomía del hipocampo. A) Corte coronal de hipocampo de rata. Destacan las áreas como el GD, giro dentado con sus porciones, suprapiramidal (SupGD) e infrapiramidal (InfGD) y la región del, Cuerno de Ammon (CA1-4) formada por el stratum piramidalis (sp). Sobre la capa piramidal del CA se encuentra el stratum oriens (so) y bajo el sp se encuentra el stratum radiatum (sr). El stratum lucidum (sl)se encuentra próxima a CA3 y el stratum lacunosum moleculare (sml) esta dispuesto sobre SupGD (Amaral, D., y cols., 1995). B) Esquema de vías aferentes del hipocampo. (Las flechas indican la dirección de los potenciales de acción. La vía perforante proviene de la corteza entorrinal y establece conexiones excitadoras con las células granulares del GD. Las células granulares envían axones denominados fibras musgosas que conectan con las células piramidales del área CA3 del hipocampo. Las células piramidales de CA3 se proyectan a las células piramidales de CA1 por medio de la vía colateral de Schaffer (Kandel, E.R., y cols., 1991)

Diversos estudios en humanos y animales han demostrado que el alza sostenida de corticoides

logradas por estrés, induce una pérdida de las habilidades cognitivas, atrofia de las neuronas

piramidales del hipocampo (McEwen, B.S., 1999, Sapolsky, R.M., 1996b, Yehuda, R., 1997) y

una reducción en el número de neuronas y glias en regiones discretas del cerebro (Sapolsky,

R.M., 2000). Más aún, el estrés recurrente y presumiblemente episodios repetidos de depresión

asociados a niveles más elevados de cortisol, podrían disminuir el umbral para producir muerte o

atrofia celular en respuesta a una variedad de eventos fisiológicos (envejecimiento) o patológicos

(Sapolsky, R.M., 2000). Toda esta evidencia sugiere que en la depresión mayor hay un deterioro

en la plasticidad neuronal y resiliencia celular que estaría asociada al aumento en los niveles

circulantes de GCs.

A B

13

1.4. Mecanismos que mantienen la resiliencia celular en el hipocampo:

De las hipótesis propuestas para el mecanismo de acción de los antidepresivos, se puede inferir

que durante el tratamiento, estos fármacos inducirían modificaciones en algunas proteínas

encargadas de la señalización intracelular, lo que a largo plazo conduciría a cambios en la

expresión génica, y de esta forma se explicaría el período de tiempo que debe transcurrir antes

de observar los efectos de los fármacos en pacientes con depresión (Fig. 2). Con esta propuesta,

se ha sugerido que la depresión es una condición patológica en la que hay una reducción en la

resiliencia celular (Castren, E., 2005), y que los antidepresivos son capaces de prevenir y/o

revertir esta última, favoreciendo procesos de neuroprotección y/o neuroplasticidad a nivel del

SNC, y en particular dentro del hipocampo (Fig. 2).

14

Figura 2. Esquema de mecanismos relacionados con la resiliencia celular. En este esquema se muestra que el estrés es capaz de promover cambios que reducen la resiliencia celular (aumentar los GCs, aumento en los niveles de Glutamato y disminución en BDNF). Los antidepresivos pueden prevenir los efectos del estrés, ya sea disminuyendo los niveles de GCs y promoviendo un aumento en la expresión de BDNF. Esta figura está adaptada de Castren y cols 2005 (Castren, E., 2005).

1.4.1. Participación de la proteína de unión al elemento de respuesta de AMPc (CREB):

Se ha demostrado que el tratamiento crónico con antidepresivos aumenta la proliferación celular

en el hipocampo de animales de experimentación (Malberg, J.E., y cols., 2003, Santarelli, L., y

cols., 2003). Otros estudios han señalado que el tratamiento crónico con antidepresivos también

causa un aumento en la actividad de ciertos factores de transcripción (Nibuya, M., y cols., 1996),

lo que sugiere que dentro de los mecanismos de acción de estos fármacos se pueden incluir

cambios en la expresión de genes relacionados con la plasticidad sináptica (Duman, R.S., 2002).

15

De hecho, los antidepresivos tales como Sertralina y Fluoxetina (inhibidores específicos de la

recaptación de 5-HT), y Desipramina y Mianserina (inhibidores de la recaptación de NA)

aumentan la expresión y la actividad de la proteína de unión al elemento de respuesta de AMPc

(CREB) (Czeh, B., y cols., 2001, Nakagawa, S., y cols., 2002, Nibuya, M., y cols., 1996, Tardito,

D., y cols., 2006, Thome, J., y cols., 2000, Vaidya, V.A., y cols., 2001). Este factor de

transcripción, presente principalmente en el núcleo, se activa luego de ser fosforilado en el

residuo de Ser133 de su estructura primaria (Tardito, D., y cols., 2006). Consistente con esta

idea, la sobre-expresión de CREB en el hipocampo de rata ejerce acciones antidepresivas desde

el punto de vista conductual (Chen, A.C., y cols., 2001). Hay que destacar que la actividad de

CREB es regulada fundamentalmente por tres vías de señalización intracelular, que incluyen la

vía dependiente de proteína quinasa A (PKA) activada por aumentos en el AMPc, la vía

dependiente de Ca+2 y la vía dependiente de la proteína Ras (Curtis, J., y cols., 1999), las cuales

están presentes en la neuronas. Además, se ha demostrado en linfocitos una relación directa entre

individuos que responden a la terapia con antidepresivos con un aumento en los niveles de

CREB-activo (fosforilado) (Koch, J.M., y cols., 2002).

1.4.2. Participación de factores neurotróficos en la acción de antidepresivos:

Es posible entonces que el aumento en la actividad de CREB contribuya a la acción de los

antidepresivos al actuar sobre diversos genes blanco. Uno de estos genes controlados por CREB

en las neuronas corresponde a la neurotrofina derivada de cerebro (BDNF) (Finkbeiner, S., y

cols., 1997, Nibuya, M., y cols., 1995, Russo-Neustadt, A., y cols., 1999). Este factor trófico

pertenece a la familia de las neurotrofinas, y participa en el desarrollo del SNC, sobrevida

neuronal y plasticidad sináptica en el sistema nervioso adulto (Bayas, A., y cols., 2002, Vaidya,

V.A., y cols., 2001, Xu, H., y cols., 2003). Además se ha demostrado que el BDNF participa en

la inducción de la potenciación a largo plazo y además facilita la liberación de varios

neurotransmisores (Ying, S.W., y cols., 2002).

El BDNF es un gen complejo que presenta cinco exones, donde el exón V codifica para la

proteína y posee dos sitios de poliadenilación alternativos. Cada uno de los primeros cuatro

exones tiene una región promotora hacia el extremo 5’, y una región dadora de splicing hacia el

extremo 3’, que permiten unirse al exon V contiene la región aceptora de splicing en su extremo

16

5’. Así, a través de estas características se pueden generar diferentes transcritos mediante

splicings alternativos, siendo el transcrito que contiene al exon III el de mayor expresión en el

hipocampo (Shieh, P.B., y cols., 1998). Esto último es importante, considerando que es en este

exon donde se encuentra el elemento de respuesta a AMPc (CRE), el cual es regulado por el

factor transcripcional CREB (Aliaga, E., y cols., 1999). El BDNF promueve la activación de la

vía ERK1/2-MAPK a través de su receptor TrkB. Esta activación tiene por consecuencia la

activación de la quinasa Rsk, que puede fosforilar y activar a CREB. Esto último permite que el

BDNF a través de ERK1/2-MAPK promueva su propia activación.

En animales de experimentación, el estrés por inmovilización induce una reducción en el BDNF

hippocampal (Smith, M.A., y cols., 1995, Tapia-Arancibia, L., y cols., 2004), efecto que es

remedado por los GCs (Schaaf, M.J., y cols., 1998). Esta disminución afectaría de manera

importante la plasticidad estructural del hipocampo. Por el contrario, los antidepresivos son

capaces de aumentar la expresión de BDNF a nivel hipocampal, (Nibuya, M., y cols., 1995,

Nibuya, M., y cols., 1996), sugiriendo la participación de este factor trófico en el mecanismo de

acción de los antidepresivos. Además, la inyección aguda e intrahipocampal de BDNF tiene

efectos antidepresivos a nivel conductual (Shirayama, Y., y cols., 2002), posiblemente activando

a CREB a través de la vía ERK1/2-MAPK asociada al receptor TrkB, y de esta forma

reduciendo la atrofia o daño neuronal causada por estrés.

1.4.3: Participación de proteínas asociadas a neuroprotección en la acción de antidepresivos:

La inducción de BDNF por antidepresivos puede tener consecuencias en la expresión de otros

factores de crecimiento o proteínas involucradas con la resiliencia celular a nivel del hipocampo.

Una de estas proteínas es BCL-2, una proteína antiapoptótica cuya expresión también puede ser

modulada por CREB fosforilado (P-CREB) (Finkbeiner, S., 2000). Además la expresión de

BCL-2 puede ser modulada por Amitriptilina y Venlafaxina (Xu, H., y cols., 2003), como

también por cambios en los niveles de GCs. En relación a esto último, la remoción quirurgica de

las glándulas suprarrenales (adrenalectomía) causa un aumento en la expresión de BCL-2, lo que

sugiere que los GCs ejercen un tono represor en la expresión hipocampal de esta proteína

(Andres, S., y cols., 2006, Cardenas, S.P., y cols., 2002, Greiner, M., y cols., 2001)

17

De esta manera, un aumento en los niveles de GCs por efecto de una exposición prolongada a un

evento causante de estrés, sería de capaz de generar cambios a nivel de la resiliencia celular en el

hipocampo, disminuyendo los niveles de BDNF y BCL-2, reduciendo la capacidad de

adaptabilidad a condiciones adversas, y finalmente generando los cambios conductuales

observados en pacientes con depresión. En resumen los antidepresivos inducen la activación de

vías transduccionales, que activan a factores transcripcionales asociados con la resiliencia celular

en el hipocampo.

1.4.4. Participación de otros factores de crecimiento asociados a la neuroprotección:

Los efectos de los antidepresivos sobre los niveles de CREB, BDNF y BCL-2 sugieren que estos

fármacos modulan la expresión de genes en el SNC para ejercer su efecto y así mejorar la

condición del paciente. Considerando esto, no se puede descartar la posibilidad de que otros

factores de crecimiento puedan estar involucrados en la acción de los antidepresivos.

Se ha demostrado que el estrés agudo por restricción de movimiento o la administración aguda

de GCs, reducen la expresión del ARNm de factor básico de crecimiento de fibroblastos (bFGF)

en el hipocampo de rata (Molteni, R., y cols., 2001), y también la expresión de bFGF se puede

inducir por la acción de los antidepresivos Desipramina y Fluoxetina, tanto en corteza como en

el hipocampo (Mallei, A., y cols., 2002). El bFGF está involucrado en procesos de plasticidad

neuronal en el hippocampo (Mallei, A., y cols., 2002, Molteni, R., y cols., 2001), como por

ejemplo entregando soporte trófico a neuronas maduras y estimular la neurogénesis (Molteni, R.,

y cols., 2001). Otro tipo de factores que también se pueden relacionar a cambios en la resiliencia

celular son la citoquinas inmunomoduladoras (Rothwell, N.J., 1999). Estos péptidos han sido

implicados en la depresión (Dantzer, R., y cols., 2002, Myint, A.M., y cols., 2005, O'Brien, S.M.,

y cols., 2004), principalmente porque su expresión puede ser regulada por variaciones en los

niveles de GCs; también algunas de las citoquinas proinflamatorias, como TNF-α, IL-1 y IL-6,

modulan la actividad del eje HHS, aumentado los niveles de CRH; y los antidepresivos son

capaces de inducir la expresión de citoquinas antinflamatorias tales como IL-10 (Myint, A.M., y

cols., 2005, O'Brien, S.M., y cols., 2004).

18

Además el tratamiento crónico con el antidepresivo Desipramina disminuye la expresión de

TNF-α en el Locus Ceruleus, cambio que afecta la actividad del receptor α2 noradrenérgico

(Ignatowski, T.A., y cols., 1997, Reynolds, J.L., y cols., 2004b, 2005b). Se ha observado que el

TNF-α actúa como un inhibidor de la liberación de NA en el hipocampo de animales control,

mientras que el tratamiento crónico con Desipramina cambia el efecto del TNF-α de inhibidor a

potenciador de la liberación de NA (Ignatowski, T.A., y cols., 1997, Nickola, T.J., y cols., 2001,

Reynolds, J.L., y cols., 2004a, Reynolds, J.L., y cols., 2005a, Reynolds, J.L., y cols., 2004b,

2005b, Schmidt, P., y cols., 2001). Este fenómeno permitiría a un antidepresivo inhibidor de la

recaptura de NA, como la Desipramina, promover una desensibilización del receptor α2 o bien

cambiar su capacidad inhibitoria a potenciadota (Reynolds, J.L., y cols., 2005a), aumentando la

liberación de NA y ejerciendo así su efecto antidepresivo. Además, dado que el tratamiento

crónico con Desipramina disminuye los niveles de TNF-α, y la presencia de esta citoquina

potencia la liberación de NA desde el hipocampo, sugiere que la Desipramina promueve

cambios en la liberación de NA no sólo a nivel de aumentar la disponibilidad de NA, si no que

también a través de cambios en la expresión de factores que puedan afectar al correcto

funcionamiento del sistema de neurotransmisión noradrenérgcio (Reynolds, J.L., y cols., 2005a,

Reynolds, J.L., y cols., 2005b).

Las citoquinas son expresadas en el SNC (Myint, A.M., y cols., 2005) y dentro de estos factores

expresados aquí encontramos al Factor de Crecimiento Transformante β1 (TGF-β1), que además

de tener propiedades antiinflamatorias al antagonizatr los efectos de TNF-α, también se le

atribuyen una serie de propiedades neuroprotectoras en el hipocampo (Bezchlibnyk, Y.B., y

cols., 2001, Bottner, M., y cols., 2000, Bravo, J.A., y cols., 2006, Henrich-Noack, P., y cols.,

1996, Kim, E.S., y cols., 1998, Lehrmann, E., y cols., 1995, Myint, A.M., y cols., 2005, Nichols,

N.R., y cols., 2005, Nichols, N.R., y cols., 1991, Prehn, J.H., y cols., 1994, Ren, R.F., y cols.,

1997, Unsicker, K., y cols., 1991, Zhu, Y., y cols., 2001b, Zhu, Y., y cols., 2002). Los TGF-βs

son factores de crecimiento multifuncionales, que permiten la migración de algunos tipos

celulares durante el desarrollo temprano del SNC y periférico, regulan la respuesta mediada por

células gliales, y dan cuenta de la diferenciación neuronal, entre otras funciones (Bottner, M., y

cols., 2000)

19

En modelos animales donde se observan situaciones de muerte neuronal inducida por

deaferentación, hipoxia, isquemia y adrenalectomia, existe un aumento en la expresión del

TGF-β1 (Bravo, J.A., y cols., 2006, Bye, N., y cols., 1998, Lehrmann, E., y cols., 1995, Nichols,

N.R., y cols., 2005, Nichols, N.R., y cols., 1991, Prehn, J.H., y cols., 1994). Incluso, animales

knock out para TGF-β1, aunque resulta ser un genotipo letal, presentan un mayor número de

células con morfología apoptótica en la corteza, caudado putamen y cerebelo (Brionne, T.C., y

cols., 2003), lo que sugiere que esta citoquina además de ser importante para el desarrollo del

animal, tiene efectos neuroprotectores importantes en el SNC. En particular en el hipocampo,

esta citoquina ejerce neuroprotección en respuesta a una amplia variedad de estímulos nocivos

como por ejemplo en respuesta a lesiones, como trauma, infecciones y presencia del péptido β-

amielioide (Hopkins, S.J., y cols., 1995, Zhao, B., y cols., 1998). Se ha descrito que TGF-β1

puede activar la cascada de transducción mediada por ERK1/2-MAPK y Rsk1 (proteína quinasa

activada por MAPK) en el SNC (Zhu, Y., y cols., 2002), lo que corresponde a una ruta

alternativa a la clásica vía de transducción mediada por las proteínas SMADS (Visser, J.A., y

cols., 1998). Además, TGF-β1 es capaz de inducir BCL-2 en cultivo primario de neuronas

hipocampales (Prehn, J.H., y cols., 1994), efecto que quizás también es mediado por la

activación de CREB. Además, la sobre-expresión de TGF-β1 se relaciona con la fosforilación de

la proteína pro-apoptotica Bad en SNC (Zhu, Y., y cols., 2002). Esta proteína al fosforilarse es

secuestrada en el citosol por la chaperona 14-3-3 impidiendo su acción apoptótica (Tzivion, G., y

cols., 2002). Más aún, TGF-β1 inhibe la apoptosis en cultivo de neuronas hipocampales quizás

impidiendo la activación de la caspasa-3 (Zhu, Y., y cols., 2001a).

Estos antecedentes indican que el TGF-β1 tiene un papel importante en la protección neuronal, y

por lo tanto en la resiliencia celular en el hipocampo, condición que aparece afectada en la

depresión. Sin embargo, existe muy poca evidencia que indique la participación de TGF-β1 en la

depresión. Un estudio reciente ha encontrado que en pacientes depresivos los niveles séricos de

TGF-β1 son menores a los observados en individuos sanos (Myint, A.M., y cols., 2005). Además

encontraron que después de 8 semanas de tratamiento con distintos tipos de antidepresivos, los

niveles de séricos de TGF-β1 aumentaron en estos pacientes depresivos (Myint, A.M., y cols.,

2005). Por otro lado, y en otra psicopatología que también está clasificada dentro de los

trastornos del ánimo, como la depresión bipolar, se ha encontrado evidencia que sugiere la

20

participación de este factor de crecimiento. En un estudio postmortem de pacientes con

depresión bipolar, se encontró una reducción del ARNm de TGF-β1 en muestras de la corteza

prefrontal (Bezchlibnyk, Y.B., y cols., 2001), estructura cuyo volumen además está reducido en

pacientes con esta psicopatología (Rajkowska, G., 2002). Este antecedente nuevamente sugiere

la relación entre nivel de TGF-β1 y daño celular. Además, y en apoyo a la posible función de

esta citoquina en la resiliencia celular a nivel hipocampal se ha demostrado que la aplicación

intracerebroventricular de un oligonucleótido de antisentido para el ARNm de TGF-β1 causa un

aumento en la morfología nuclear asociada a apoptosis en la región CA3 de neuronas

piramidales (Bravo, J.A., y cols., 2006). Curiosamente esta región presenta atrofia neuronal

inducido por estrés y en donde se observa además una reducción en los niveles de BDNF

(Schaaf, M.J., y cols., 1998, Smith, M.A., y cols., 1995).

21

En resumen:

i) En la depresión mayor existe una reducción en la resiliencia celular (Manji, H.K., y

cols., 2001b, Nestler, E.J., y cols., 2002, Sapolsky, R.M., 2001)

ii) Esta disminución en la resiliencia celular puede ocurrir por una exposición sostenida a

altos niveles de GCs, como por efecto del estrés crónico (McEwen, B.S., 2005, McEwen, B.S., y

cols., 1995, Nestler, E.J., y cols., 2002, Sapolsky, R.M., 1996a, b, 2000, Yehuda, R., 1997)

iii) Niveles elevados de GCs pueden afectar los sistemas de neurotransmisión

serotoninérgicos y noradrenérgicos (Glavin, G.B., 1985, Graeff, F.G., y cols., 1996), dando

cuenta de los cambios conductuales observados en la depresión

iv) El estrés crónico, a través de los GCs, y los antidepresivos afectan la neurotransmisión

de NA y 5-HT (Reynolds, J.L., y cols., 2005a, Reynolds, J.L., y cols., 2005b)

v) Las alteraciones en la neurotransmisión de NA y 5-HT causadas por el estrés crónico,

inducen cambios en la sensibilidad de autoreceptores inhibitorios, como ocurre con el

autorreceptor α2 presináptico (Reynolds, J.L., y cols., 2005a, Reynolds, J.L., y cols., 2005b)

vi) Los antidepresivos pueden normalizar la actividad del eje HHS (Ising, M., y cols., 2005,

von Bardeleben, U., y cols., 1985), lo que favorecería una mejor funcionalidad de los sistemas

noradrenérgicos y serotoninérgicos

vii) Los antidepresivos, permiten aumentar la resiliencia celular en estructuras como el

hipocampo (D'Sa, C., y cols., 2002, Nestler, E.J., y cols., 2002), lo que se asocia con una mejora

de la funcionalidad de esta estructura y la conducta del individuo.

22

Estos antecedentes permiten proponer las siguientes hipótesis:

II. Hipótesis:

1. En animales de experimentación, el estrés crónico por restricción de movimiento

induce conductas similares a la depresión, efecto que se previene por la acción del

antidepresivo Desipramina.

2. La Desipramina, promueve cambios en marcadores asociados a la resiliencia celular y

plasticidad neuronal en el hipocampo como ERK1/2, CREB, y BCL-2, y también de

factores tróficos como BDNF y TGF-β1.

23

III. Objetivo general:

Evaluar si el estrés crónico por restricción de movimiento genera conductas similares a la

depresión en animales de experimentación, y si estas conductas pueden ser prevenidas por

acción del tratamiento crónico con el antidepresivo Desipramina.

Determinar si la administración crónica de Desipramina en animales sometidos a estrés crónico

media cambios en la expresión a nivel hipocampal de ERK1/2, CREB, BCL-2, BDNF y

TGF-β1.

Objetivos específicos:

1. Establecer un modelo animal con características similares a la depresión, y evaluar el efecto

del antidepresivo Desipramina en este modelo

1.1. Establecer los efectos del estrés crónico por restricción de movimiento sobre

parámetros fisiológicos asociados a la respuesta a estrés

1.2. Estudiar los efectos del estrés crónico por restricción de movimiento en conductas

similares a la depresión y comparar los efectos de la administración crónica de

Desipramina en animales estresados y sin estresar afecta las respuestas fisiológicas y

la conducta

2. Analizar en un modelo animal de depresión, el grado de expresión de marcadores asociados

a la resiliencia celular en hipocampo de rata

2.1. Determinar los efectos del estrés crónico sobre ERK1/2, CREB, BCL-2, BDNF y

TGF-β1, como marcadores asociados a la resiliencia celular y determinar los efectos

de la Desipramina sobre los niveles de estos

24

3. Determinar si el estrés crónico y el tratamiento crónico con Desipramina modifican la

liberación de noradrenalina en el hipocampo

3.1. Evaluar los efectos de Yohimbina y Clonidina en la liberación de noradrenalina en el

hipocampo de animales estresados y tratados con Desipramina

3.2. Evaluar los efectos de TGF-β1 en la liberación de noradrenalina en el hipocampo de

animales estresados y tratados con Desipramina

25

IV. Materiales y métodos:

1. Animales y Tratamientos:

En todos los experimentos se emplearon ratas macho de la cepa Sprague-Dawley (200 –240 g),

criadas en el bioterio de la Facultad de Ciencias Químicas y Farmacéuticas de la Universidad de

Chile, en condiciones estandarizadas de ciclo luz–oscuridad de 12 horas, a una temperatura de

22° C y con una humedad de 45 %. Los animales tuvieron alimento estéril y agua filtrada ad

libitum. En este estudio no se consideró la utilización de ratas hembras puesto que éstas

presentan ciclo estral (4 días) donde varían hormonas como el estradiol y la progesterona; las

cuales pueden influir sobre los parámetros que se evaluaron.

Se usó el número mínimo de animales, y todos los procedimientos fueron aprobados por el

Comité de Ética de la Facultad de Ciencias Químicas y Farmacéuticas de la Universidad de

Chile.

1.1. Estrés crónico por restricción de movimiento:

Para este modelo de estrés, los animales fueron colocados en cilindros de acrílico transparente

(de 80mm de diámetro) durante 2,5h diarias por 14 días continuados. Este aparato limita la

movilidad del animal, pero no lo inmoviliza completamente. Durante este periodo los animales

no tenían acceso a alimento o agua (Magarinos, A.M., y cols., 1995). Cada sesión de estrés se

realizó entre las 9:00am y 12:00pm con el fin de evitar efectos no específicos debido a cambios

circadianos.

1.2. Tratamientos farmacológicos:

Se utilizó el antidepresivo inhibidor de la recaptación de NA Desipramina (DMI) (Sigma, St.

Louis, MO, EE UU) (Fig. 3) a una dosis de 10mg/kg de peso corporal del animal (Frechilla, D.,

y cols., 1998), el cual se inyectó intraperitonealmente (ip). Este fármaco fue disuelto en una

solución de NaCl 0,9%.

26

Figura 3. Estructura de la Desipramina. Este compuesto tricíclico es el metabolito activo de la imipramina. Este fármaco antidepresivo inhíbe la recaptura de NA, siendo este el mecanismo de acción propuesto para este antidepresivo (Baldessarini, R., 2001, Sachar, E.J., 1991, Warsh, J., y cols., 1998).

Los animales se clasificaron en los siguientes grupos: (i) animales control sin estresar que fueron

inyectados diariamente con una solución vehículo de NaCl 0,9% (Control+SAL); (ii) animales

estresados crónicamente por 14 días a los que también se inyectó la misma solución salina antes

de cada sesión de restricción de movimiento (Restricción+SAL); (iii) animales no estresados a

los que se les inyectó la DMI 10mg/kg por los 14 días de tratamientos (Control+DMI) y (iv)

animales estresados por restricción de movimiento a los que se les administró el antidepresivo

durante los 14 días (Restricción+DMI).

Además se incluyeron otros dos grupos de animales a los que se les administró el fármaco

antipsicótico Haloperidol (HAL) (Laboratorio Sorenson, Santiago, Chile) en una dosis de

50µg/kg de peso por vía subcutánea (sc) (Díaz-Véliz, G., 1988). Este fármaco actúa a nivel del

SNC como antagonista de los receptores D2 de dopamina (Baldessarini, R., y cols., 2001) y no

tiene efectos antidepresivos descritos. El uso de HAL permite determinar si los efectos del estrés

por restricción de movimiento sólo se previenen por un antidepresivo como la DMI y no por otro

fármaco no relacionado, que en este caso es un antipsicótico. Esta aproximación entrega mayor

validez predictiva al modelo. Los grupos que se incluyeron corresponden a: (i) animales no

estresados inyectados diariamente con HAL 50µg/kg por 14 días (Control+HAL) y (ii) animales

sometidos a restricción de movimiento por 14 días a los que se les inyectó HAL todos los días

(Restricción+HAL).

27

Además de todos los tratamientos y aplicaciones de estrés, los animales fueron manipulados

diariamente para ser pesados. Terminado los tratamientos, los animales fueron evaluados

conductualmente y posteriormente eutanasiados por decapitación.

2. Pruebas conductuales:

Para evaluar si el estrés crónico por restricción de movimiento generó características similares a

la depresión, fue necesario evaluar la conducta de los animales finalizado los 14 días de

tratamientos y/o estrés crónico. Estas conductas incluyen anhedonia, alteraciones en la

adquisición de respuestas condicionadas, que se relaciona con fallas en la capacidad cognitiva, y

desesperanza aprendida.

2.1. Prueba de preferencia a una solución de sacarosa al 1% como agua de bebida:

Esta prueba permite evaluar el grado de preferencia por una situación placentera para el animal,

como lo es el agua de bebida endulzada con sacarosa al 1%.

Para esta prueba, todos los animales fueron entrenados en un paradigma donde cada individuo

podía elegir una solución de sacarosa al 1% como agua de bebida. Esto se realizó durante la

semana anterior a los diferentes procedimientos de estrés y tratamientos farmacológicos. En este

período todos los animales se manipularon de la misma forma. El entrenamiento consistió en

colocar diariamente y por 3h a cada animal en una jaula individual, donde se colocaron 2 tubos

con agua de bebida: uno con agua sola y el otro con la solución de sacarosa. Los tubos eran

alternados diariamente y en forma aleatoria, con la finalidad de evitar efectos de habituación por

posición de los tubos (Zurita, A., y cols., 2000). Finalizada la semana de entrenamiento, se

evaluó el porcentaje de preferencia por el agua endulzada en función del volumen total de

líquido consumido.

Una vez iniciado el protocolo de restricción de movimiento y los tratamientos, se evaluó la

preferencia por la bebida endulzada a los 7 y 14 días. Esto se realizó colocando a los animales en

las jaulas individuales y enfrentándolos al mismo paradigma de los tubos de agua de bebida

descrita para la semana de entrenamiento, pero por sólo durante 1h. Terminada la prueba, se

28

evaluó el porcentaje de preferencia por el agua endulzada en función del volumen total de

líquido consumido.

Los cambios en la preferencia por la solución de sacarosa al 1% permitieron evaluar la

predilección de los animales por una actividad placentera, o conducta hedónica. La falta de

preferencia por el agua endulzada refleja una condición de anhedonia, condición que también se

observa en pacientes con depresión mayor (APA, 1999).

2.2. Adquisición de respuestas condicionadas y fallas en la respuesta a nuevos paradigmas de

estrés:

En esta prueba, cada animal fue colocado individualmente en una caja compuesta por dos

unidades modulares de acero inoxidable, entre las cuales hay una compuerta abierta para que el

animal pase de un lado al otro (Two-way shuttle box [Lafayette Instrument Co., Lafayette, IN,

EE UU]). Cada unidad esté equipada con una rejilla de 18 barras en el piso, a través de la cual se

puede aplicar un shock eléctrico de intensidad variable; dos ampolletas de 28V DC y un

generador de tonos audibles (Mallory Sonalert 2.800 Hz, Lafayette Instrument Co., Lafayette,

IN, EE UU). Los shocks eléctricos se administraron con una fuente de poder (Lafayette

Instrument Co., Lafayette, IN, EE UU).

Cada ensayo se inició aplicando un estimulo condicionante (tono) durante 5s seguido de un

descarga eléctrica de 0,2-0,5mA en el piso como estímulo aversivo. La descarga eléctrica se

mantuvo hasta que el animal escapó hacia la otra caja que no está electrificada. Cada animal se

puso a prueba durante 10min, aplicando el sonido seguido del shock cada 30seg, con una

duración máxima del shock de 10s. Luego, el ensayo se realizó durante 30min. Una respuesta de

condicionamiento se define cuando el animal escapó de la caja electrificada a la otra dentro de

los primeros 5seg del sonido (adquisición de respuesta condicionada, ARC). En cambio, si la

rata no escapa a la otra caja durante la aplicación del shock eléctrico, se considera como falla en

el escape (FE) (Mora, S., y cols., 1993).

Esta prueba permitió evaluar de qué manera el estrés por restricción de movimiento es capaz de

modificar la capacidad del animal por adquirir una respuesta condicionada, y en cierta medida

29

evaluar algo de la capacidad de aprendizaje de éste, ya que en pacientes con depresión mayor

hay una disminución en las capacidades cognitivas y de memoria del individuo (APA, 1999)

2.3. Prueba de natación forzada:

Esta prueba se realizó en 2 días: en el primer día (día 13 de cada tratamiento) los animales

fueron colocados durante 15min en un cilindro de acrílico de 20cm de diámetro por 50cm de

alto, que se llena con agua (24ºC-25ºC) hasta 30cm de altura. En el segundo día (día 14 de cada

tratamiento), se evaluaron las conductas de escape que el animal intenta realizar. En esta

determinación, y durante 5min se evaluó la conducta de escape en tres parámetros:

i) escalamiento: el animal trata de subir por las paredes del tubo, ii) natación: el animal nada en

busca de la salida, y por último, la diferencia del tiempo en que el animal no realiza ninguna de

las conductas anteriores se considera como: iii) inmovilidad, donde la rata no hace ningún

esfuerzo por buscar una salida, sólo intenta mantenerse a flote. Para la determinación de la

conducta de inmovilidad, se resta el tiempo en que el animal realizó las otras dos conductas de

escape. Un animal con desesperanza, es decir con incapacidad de responder adecuadamente a

una nueva condición adversa, va a tener menos conductas de escape y va a permanecer más

tiempo inmóvil durante la prueba (Cryan, J.F., y cols., 2002, Cryan, J.F., y cols., 2005). Esta

condición de desesperanza aprendida también puede ser observada en pacientes con depresión

mayor (APA, 1999).

3. Preparación de tejidos:

Luego de 14 días de estrés y tratamientos farmacológicos, y luego de pruebas conductuales, los

animales fueron eutanasiados mediante decapitación. Se disecó el cerebro y fue congelado

rápidamente en isopentano (Riedel-de Haën, Hanover, Alemania) enfriado en nitrógeno líquido

y posteriormente los tejidos fueron almacenados a -80°C (Greiner, M., y cols., 2001). Se

realizaron cortes coronales en crióstato (Microm HM5000, Microm, Walldorf, Alemania) de 10

µm de grosor (Bregma -2,8 a -3,8) (Paxinos, G., y cols., 1982) y colocados alternadamente sobre

porta objetos silanizados y posteriormente almacenados a -80°C hasta ser utilizados en los

experimentos de hibridación in situ (HIS) e inmunohistoquímica (IHQ). También se colectaron

las glándulas suprarrenales las cuales fueron colocadas en tubos plásticos de 1,5mL (Eppendorf,

30

Foster City, CA, EE UU), cuya masa fue determinada previamente. Luego, cada tubo

debidamente identificado, fue pesado con la glándula en su interior para determinar el peso de

cada suprarrenal. A continuación, los tubos se almacenaron a -80ºC para posteriormente

determinar el contenido de catecolaminas de la médula de cada glándula.

4. Determinación de los niveles séricos de corticosterona:

En el momento de la eutanasia se recolectó la sangre en tubos de vidrio sin anticoagulante la

cual fue centrifugada a 4.000 x g durante 15 min y el suero obtenido se almacenó a -20°C hasta

el momento de la determinación de corticosterona.

Los niveles séricos de corticosterona fueron determinados cuantitativamente mediante un ensayo

inmunoenzimático para corticosterona (Correlate-EIATM, Enzyme Immunoassay Kit, Assay

Designs, Inc., Ann Arbor, MI, EE UU). Se procedió a realizar la dilución de los estándares de

hormona (32, 160, 800, 4000, 20000 pg/mL) y de las muestras (1:40) en el tampón

proporcionado por el fabricante. Se colocaron 100 µL de las diluciones en una placa de 96

pocillos la cual estaba previamente recubierta con un anticuerpo (anti cabra Ig G), que reconoce

al anticuerpo que se une específicamente a la corticosterona (preparado en cabra). Sobre ella se

agregó 50 µL de corticosterona conjugada a fosfatasa alcalina que compite con la hormona

presente tanto en las muestras como estándares por la unión al anticuerpo anticorticosterona

presente en la placa. Posteriormente se adicionó a todos los pocillos excepto al que se dejó como

blanco y otro para determinar la unión no específica, 50 µL de un anticuerpo policlonal contra la

corticosterona que reacciona con la hormona libre (conjugada y no conjugada). Luego se incubó

durante 2 h a temperatura ambiente con agitación suave y posterior a 3 lavados con 400 µL del

tampón provisto en el fabricante, se agregó el sustrato de la fosfatasa alcalina

(p-nitrofenilfosfato) el cual genera un producto de color amarillo (p-nitrofenol). Luego de 1 h se

detuvo la reacción mediante la adición de una solución ácida provista por el fabricante. Se

determinó la absorvancia del producto coloreado a 405 nm en un lector de placa (Expert 96,

Asys Hitech, Augendorf, Austria). La lectura de la absorvancia de la curva estándar se usó para

calcular la concentración de corticosterona (CORT) presente en los sueros de los animales.

31

5. Determinación del contenido de catecolaminas de la médula suprarrenal:

La determinación de catecolaminas se realizó en homogenizados de médula suprarrenal de rata.

La médula suprarrenal se extrajo haciendo un pequeño corte por un lado de la glándula, y luego

presionando por el lado contrario a donde se hizo el corte, lo que permite la salida de la médula

por el lado donde se hizo el corte. Este tejido se homogenizó en 1 mL de ácido perclórico (PCA)

0,2 N en un homogenizador vidrio-vidrio. Después se centrifugó por 15 min a 15.000 x g y se

recolectaron 100 µL del sobrenadante para las mediciones de catecolaminas por cromatografía

líquida de alto rendimiento (HPLC).

5.1. Adsorción de catecolaminas en alúmina:

Este procedimiento se realizó antes de pasar las muestras por el cromatógrafo de HPLC.

Corresponde a un procedimiento de concentración de las catecolaminas (CAs). Este tratamiento

se aplica tanto para las muestras como también para las soluciones estándares de CAs con las

que se construye una curva de calibración, donde se interpola el valor obtenido de cada muestra.

Se colocaron 200 µL de cada estándar o 100 µL de muestra en tubos cónicos de 15 mL. Además

a las muestras se les agregó 100 µL de PCA 0,2 N y 20 µl de dihidrobencil-amina (DHBA)

5 mg/mL (Sigma, St. Louis, MO, EE UU) como estándar interno. También, a cada tubo se

agregaron 100 µL de ácido etilendiaminotetraácetico (EDTA) 0,1 M pH 7; 1 mL de H2O

nanopura filtrada; 50 mg de alúmina activada; 1 mL de Tris-HCl 1,5 M-EDTA 2% pH 8,5.

Luego, esta solución se ajustó el pH entre 8,5 y 8,6 con NaOH 5 N (5µL aproximadamente) para

permitir la adsorción de las catecolaminas a la alúmina. Posteriormente se agitó por 15 min,

luego se centrifugó por 5 min a 1.000 x g para sedimentar la alúmina. El liquido se sacó por

aspiración y se lavó la alúmina resuspendiéndola en 5 mL de H2O nanopura fría. Esta operación

se repitió 3 veces. Para los lavados cada tubo se agitó por 10 min. Finalmente la alúmina se secó

introduciendo una tira de papel filtro terminado en punta. Luego de unos minutos, se retiró el

papel. Posteriormente se eluyeron las CAs con 100 µL de PCA 0,2 N. Se agitó vigorosamente

por 1 min y se dejaron reposar las muestras en hielo por otros 5 min. Cada tubo se agitó y luego

se centrifugó por 5 min. Se colectaron los sobrenadantes en tubos rotulados. Esta elusión se

repitió con 100 µL más de PCA 0,2 N.

32

5.2. Fase movil:

Como fase móvil para la cromatografía se usó: NaH2PO4 100 mM, EDTA 1 mM, octil-sulfato

1,7 mM y acetonitrilo (CH3CN) 3,5% v/v ajustado a pH 2,3, con ácido ortofosfórico

concentrado.

5.3. Detección:

Las muestras se analizaron usando cromatografía de HPLC (Waters 600-E Multisolvent, Waters,

Millipore Corporation, Milford, MA, EE UU) acoplado a detección amperométrica (Waters 464

Pulsed ElectrochemicalDetector, Waters, Millipore Corporation, Milford, MA, EE UU)

mantenida a una diferencia de potencial de +650 mV, potencial al cual las CAs se oxidan. Las

catecolaminas se separaron con una columna BAS 250 x 4,6mm MF-6017, Biophase ODS 5µm

(BAS, West Lafayette, IN, EE UU). La sensibilidad del detector amperométrico se varió entre 1,

2 y 5 nA, dependiendo de la cantidad de CAs que tenía cada muestra. Cada cromatograma fue

analizado en un computador el cual está conectado por una interfase al detector del equipo, y que

está equipado con un software que permite la integración del área bajo la curva. Los tiempos de

retención fueron los siguientes: noradrenalina fue 5 min, adrenalina 8 min y DHBA 10 min.

La determinación de CAs se realiza mediante la construcción de una curva de calibración, en que

cada punto de la curva corresponde al valor de área integrada de adrenalina y noradrenalina de

cada estándar, en razón con el valor del área integrada del estándar interno (razones A/DHBA y

NA/DHBA). Luego, y dado que a cada muestra se le agregó una cantidad conocida de DHBA, se

establecen valores de razones de A/DHBA y NA/DHBA de cada muestra, que se interpolan en la

curva de calibración construida (Dorfman, M., y cols., 2003).

6. Hibridación in situ:

Se utilizó la técnica de hibridación in situ (HIS) para determinar niveles relativos de ARNm para

Bcl-2, BDNF y TGF-β1 en las diferentes regiones que componen el hipocampo de forma de

visualizar posibles cambios regionales que se produzcan en los diferentes grupos de

experimentación.

33

6.1 Marcaje de oligonucleótidos para la hibridación in situ BDNF y TGF-β1:

Para detectar los ARNm de BDNF y TGF-β1 se utilizaron oligonucleótidos de ADN de hebra

simple de aproximadamente 40 bases, y cuya secuencia es complementaria a cada transcrito

(Tabla 1). Los oligonucleótidos se marcaron en su extremo 3´-OH mediante la incorporación de

un nucleótido modificado con digoxigenina. Para ello, se procedió a tomar 100 pmol del

oligonucleótido y se mezcló a 4ºC en presencia de 1 µL de Digoxigenina-11-dUTP 25 nM

(Roche Diagnostics GMBH, Mannheim, Alemania), 0,9 µL de dATP 10 mM, 27,2 U de

Transferasa Terminal, 5 µL del tampón de la enzima (Roche Diagnostics GMBH, Mannheim,

Alemania) y en presencia de CoCl2 20 mM (Roche Diagnostics GMBH, Mannheim, Alemania)

en un volumen final de 25 µL. La reacción se llevó a cabo a 37ºC durante 30 min y

posteriormente se agregó, en hielo, 1 µL de una solución de detención, que contiene Glicógeno

20 mg/mL (Merck, Darmstadt, Alemania) y EDTA a una concentración final de 8,8 mM a pH 7.

Posteriormente el oligonucleótido se precipitó con 2,5 µL de LiCl 4M y 75 µL de etanol

absoluto frío, durante al menos 1 h a -80ºC. Luego de una centrifugación durante 30 min a

10.000 x g a 4ºC, el precipitado seco se resuspendió en 100 µL de agua destilada, quedando de

esta manera listo para ser empleado en el protocolo de hibridación.

Tabla 1. Secuencias de oligonucleótidos de ADN de hebra simple y de ARN complementario

para las hibridaciones in situ de BDNF, BCL-2 y TGF-β1

Secuencia Secuencia de

ARNm a la que es complementaria

Cantidad utilizada

durante la hibridación

BDNF 5’-TATCCTTATGAATCGCCAGCCAATTCTCTTTTTGCTATCCAT-3’ 651-705 (Genbank Acc. nº AY176065) 50pmol/mL

BCL-2 254-792 (Genbank Acc. nº L14680) 50ng/mL

TGF-β1 5’-CACGGATGGCTTCGATGCGCTTCCGTTTCACCAGCTCCAT-3’ 524-563 (Genbank

Acc. nº NM021578) 100pmol/mL

34

6.2. Marcaje del ARN complementario usado para la hibridación in situ de Bcl-2:

Para el caso de la detección de ARNm de BCL-2 se utilizó ARN complementario (ARNc) que se

obtiene a partir de un plasmidio pGEM-T Easy Vector (Promega, Madison, WI, EE UU) que fue

generado anteriormente en el laboratorio (Cardenas, S.P., y cols., 2002). Este vector contiene un

fragmento de ADNc de BCL-2 (254-792 pb) generado por RT-PCR, el cuál se cortó con la

enzima de restricción ApaI (Promega, Madison, WI, EE UU). El ARNc se obtuvo incubando

durante 2 h a 37° C el fragmento cortado con la polimerasa Sp6 y el kit de marcaje de

digoxigenina ARN que incorpora un ribonucleótido de UTP modificado con digoxigenina

(Roche, Molecular Biochemicals, Mannhein, Alemania).

6.3. Protocolo de hibridación in situ:

Los cortes de tejido se fijaron durante 45 minutos a 4ºC en p-formaldehído al 4% disuelto en

solución tamponada de NaCl y fosfato (PBS, NaCl 0,14 M; Na2HPO4 10 mM; NH2PO4 1,8 mM;

pH 7,4). Luego de permeabilizar el tejido con proteinasa K 2 µg/mL (Merck, Darmstadt,

Alemania) durante 10 min, los portaobjetos con los tejidos se postfijaron nuevamente en

p-formaldehído al 4% disuelto en PBS, para luego ser deshidratados en una batería de alcoholes

(75%, 90% y 100% etanol en H2O destilada libre de ARNasas) y delipidados con cloroformo

(Merck, Darmstadt, Alemania) por 5 min. Luego los tejidos fueron rehidratados en otra batería

de alcoholes, para realizar la incubación con el oligonucleótido marcado correspondiente a 37ºC

toda la noche. La solución de hibridación que contiene a cada oligonucleótido se preparó con:

solución tamponada de citrato de sodio 0,3 M y NaCl 3 M pH 7,4 concentrada 4 veces (SSC 4x),

solución de Denhart 50x (Ficoll 0,02% [Sigma, St. Louis, MO, EE UU], albúmina sérica bovina

0,02% [Calbiochem Darmstadt, Alemania], polivinilpirrolidona 0,02% [Sigma, St. Louis, MO,

EE UU] en agua libre de ARNasa), formamida 50% (Sigma, St. Louis, MO, EE UU), ADN de

espermio de salmón 18 µg/mL (Sigma, St. Louis, MO, EE UU), t-RNA 10 mg/mL (Sigma, St.

Louis, MO, EE UU) y agua libre de ARNasa. Luego de la hibridación, se realizaron una serie de

lavados con la solución tampón de SSC en diluciones consecutivas: para BCL-2 se lava con SSC

4x, SSC 2x, SSC 1x y SSC 0,5x; para BDNF y TGF-β1 SSC 4x, SSC 2x y SSC 0,5x. Todos

estos lavados se realizan durante 10 min a temperatura ambiente cada uno y sólo el último

lavado se hizo a 40ºC. En el caso de BCL-2, por tratarse de una determinación que usa un ARN

35

complementario al ARNm blanco, se realizó una incubación con ARNasa 20 µg/mL en solución

tampón de Tris HCl 10 mM y EDTA 1 mM en pH 7,4 (solución TE), por 10 min, después del

primer lavado con SSC 4x. Luego, se realizó bloqueo de proteínas en los tejidos, usando un

reactivo de bloqueó al 1 % (Roche Diagnostics GMBH, Mannheim, Alemania) en solución

tampón de ácido maleíco pH 7,5 durante 30 min. Luego se adicionó el anticuerpo

anti-digoxigenina conjugado con fosfatasa alcalina (Roche Diagnostics GMBH, Mannheim,

Alemania) diluido 1:500 en tampón ácido maleíco pH 7,5, reactivo de bloqueo 1%, suero fetal

bovino 1%, Triton X-100 0,1% (Merck, Darmstadt, Alemania) a temperatura ambiente durante

2 h. Para el desarrollo de color y visualización de la hibridación, se utilizó como sustrato de la

enzima NBT 330 µg/mL y BCIP 33 µg/mL (Sigma, Saint Louis, Missouri, USA) ambos

disueltos en solución tamponada de revelado (Tris HCl 130mM y MgCl2 50mM, pH 9,5). Los

cortes se dejaron secar al aire y se montaron utilizando Entellan (Merck, Darmstadt, Alemania),

medio de montaje hidrófobo, que permite una adecuada visualización al microscopio.

Para asegurar que la unión de los oligonucleótidos o el ARN complementario fueron específicas,

y para descartar errores en la realización de la técnica, se utilizaron los siguientes controles: un

control negativo que consiste en el reemplazo del oligonucleótido por agua libre de ARNasa o

bien se incubó con el oligonucleótido marcado en presencia de un exceso de 100 veces del

oligonucleótido no marcado.

6.4. Análisis de la hibridación in situ:

Para el análisis semicuantitativo de la señal obtenida en la HIS, se utilizó el software

computacional de análisis de imagen UN-SCAN-IT versión 4.1 para Windows (Silk Scientific

Inc, Orem, UT, EE UU). Se realizaron mediciones de intensidad de coloración capturadas como

píxeles en un área determinada, sustrayendo el ruido de fondo específico para cada área. Esto se

realizó en cada región de interés del hipocampo (CA1, CA3 y ambas capas del Giro Dentado),

por cada uno de los ARNm analizados. Los resultados se expresan como intensidad de pixeles de

la marca especifica. Para cada animal se evaluaron a lo menos cuatro cortes coronales, y los

hipocampos de ambos lados de cada corte. Se obtuvo un valor promedio por animal para y para

cada región del hipocampo. Los resultados corresponden al promedio de 4 animales en las

diferentes condiciones experimentales usadas.

36

7. Determinaciones inmunohistoquímicas:

A través de inmunohistoquímica (IHQ), se realizó la determinación de P-CREB y BCL-2, en las

distintas regiones del hipocampo para poder visualizar posibles cambios entre los diferentes

grupos de experimentales. Los cortes coronales fueron fijados durante 50 min a 4°C en

p-formaldehído 4% disuelto en PBS. Luego el tejido se permeabilizó con Triton X-100 1% en

PBS durante 10 min. Posteriormente se bloquearon las peroxidas endógenas con H2O2 al 1% por

30 min. Además los sitios de unión inespecífica del anticuerpo se bloquearon utilizando suero

normal de cabra (NGS) al 3% en PBS para evitar la unión inespecífica del anticuerpo primario

en el tejido. Luego se procedió a la incubación con los anticuerpos primarios para las diferentes

proteínas de interés en NGS 1% en PBS pH 7,4 durante toda la noche a 4°C. Los tejidos se

lavaron y se llevo a cabo la detección con un método indirecto utilizando el anticuerpo

secundario anti IgG de conejo conjugado con biotina fue incubado a una dilución de 1:200 en

NGS 1% en PBS durante toda la noche a 4°C. Al día siguiente se incubó durante 1 hr con el

complejo peroxidasa estreptavidina a 37°C. Finalmente para el desarrollo de color se utilizó

como sustrato diaminobenzidina (DAB), el cual se caracteriza por dar color marrón (Elite Rabbit

Ig G ABC Vectastain,Vector Laboratories, Burlingame, CA, EE UU). Las diluciones de los

anticuerpos utilizados se indican en la Tabla 2.

Tabla 2. Anticuerpos utilizados en inmunohistoquímica

Anticuerpo primario

Dilución de trabajo (anticuerpo primario) Tipo de anticuerpo Dilución del anticuerpo

secundario

Anti P-CREB (Upstate, Charlottesville,

VA EE UU) 1:300 Policlonal 1:200

Anti-BCL-2 (BD Pharmingen, San Diego, CA, EE UU)

1:160 Policlonal 1:200

Para la validación de los resultados de la coloración inmunohistoquímica se procedió a la

realización de un control negativo. Para este efecto la muestra se procesó remplazando el

anticuerpo primario por NGS 1% en PBS pH 7.4.

37

7.1. Análisis de la detección inmunohistoquímica:

La intensidad de la marca se cuantificó en cada área del hipocampo con la ayuda del programa

computacional de análisis de imagen Image J (Image Processing and Analysis in Java ver. 1.32j,

Nacional Institutes of Health, EE UU), el cual permite analizar diferencias en la intensidad

visual de color de las células inmunopositivas. Por cada hipocampo se consideraron 50 células

para CA1 y CA3, y 100 células para las capas suprapiramidal e infrapiramidal del Giro Dentado.

De todos los valores así obtenidos, se determinaron los valores maximos y minimos, con los que

se construyeron 4 rangos de frecuencia que permitieron clasificadar células como no teñidas,

levemente teñidas, moderadamente teñidas y fuertemente teñidas. Finalmente se aplicó el

método de H-score que se basa en la sumatoria de la proporción de células que muestran

diferentes grados de reactividad: 0 x porcentaje de células muy débilmente teñidas + 1 x

porcentaje de células levemente teñidas + 2 x porcentaje de células moderadamente marcadas +

3 x porcentaje de células fuertemente teñidas (Douglas-Jones, A.G., y cols., 2001). Este método

entrega un valor en un rango de 0 a 300, donde 0 corresponde a que todas la células estaban muy

débilmente teñidas o no tenían tinción, y 300 corresponde a que todas las células tienen el

máximo grado de tinción (Douglas-Jones, A.G., y cols., 2001).

8. Análisis por inmunowestern blot:

De una serie experimental se obtuvieron los hipocampos, los que fueron homogeneizados en un

homogenizador vidrio-vidrio a 4 ºC en cinco volúmenes de solución tamponada para lisis

(HEPES 10 mM pH 7.9, KCl 10 mM, EGTA 0,1 mM, EDTA 0,1 mM, DTT 0,5 mM, Na3VO4

0,1 mM, PMSF 0,1 mM, aprotinina 2 µg/ml, leupeptina 2 µg/ml, NaF 0,02 mM,

NaPPi 0,025 mM y Tritón X-100 0,06 %). Luego se centrifugaron a 18.000 x g por 30 min a

4ºC, desechando el precipitado. En el sobrenadante se cuantificaron las proteínas mediante el

método de del ácido Bicinconínico (Sapan, C.V., y cols., 1999), usando BSA (Sigma, St. Louis,

MO, EE UU) como estándar para la curva de calibración. Una vez conocida la concentración de

proteínas, las muestras fueron desnaturadas con una solución de carga tamponada

(Tris HCl 250 mM pH 6,8; SDS 5 %; glicerol 6,7 %v/v; DTT 0,512 mg/mL; azul de bromofenol

13,33 mg/mL). Finalmente, las muestras fueron hervidas por 10 minutos y luego se almacenaron

a -80ºC para su posterior utilización en inmunowestern blot.

38

8.1. Inmunowestern Blot:

Se resolvieron 75 µg de proteínas en un gel de poliacrilamida con SDS (PAGE-SDS al 12%) a

una diferencia de potencial de 80 V en una solución tamponada de Tris 2,5 mM, SDS 0,01%, y

Glicina 19 mM. La electroforesis se realizó hasta que el frente de azul de bromofenol no se

visualizará. Luego se realizó la electrotransferencia de las proteínas a una membrana de

nitrocelulosa de poro 0,2 µm (BioRad, Richmond, CA, EE UU), durante 1 hora 30 minutos a

100 V a 4ºC, en una solución tampomada de glicina 19 mM, y Tris 2.5 mM. Como control de

transferencia se tiñó la membrana con Rojo Ponceau para verificar la carga de proteínas.

Posteriormente se decoloró la membrana con una solución de tamponada de Tris HCl 25 mM,

NaCl 140 mM y KCl 2m M a pH 7,4 (TBS), con Tween-20 al 0,1% (Merck, Darmstadt,

Alemania) (TBS-T 0.1%) o PBS con Tween-20 al 0.1%, dependiendo de la composición de la

solución de bloqueo a utilizar para la determinación de las distintas proteínas (Tabla 3).

Para bloquear las uniones no específicas del anticuerpo, se incubó la membrana con leche

descremada al 3%-5%, disuelta en la solución adecuada para la proteína que se deseaba

determinar. Un vez realizado esto, se incubó con el anticuerpo primario respectivo a la dilución

adecuada, toda lo noche a 4 ºC (Tabla 3).

Al día siguiente se realizaron dos lavados por 5 minutos con una solución de TBS, PBS, o H2O

destilada, de acuerdo al anticuerpo utilizado (Tabla 3), con agitación a temperatura ambiente.

Posteriormente se incubó la membrana con el anticuerpo secundario acoplado a peroxidasa

(Tabla 3), durante dos horas con agitación a temperatura ambiente. Nuevamente la membrana

fue sometida a dos lavados con una solución de PBS o TBS (Tabla 3) por 5 minutos cada uno,

luego se incubó con el substrato de quimioluminiscencia para peroxidasa por 1 minuto

(Perkin-Elmer, Boston, MA, EE UU) posteriormente la membrana fue expuesta a distintos

tiempos (30 s-30-min) en un film fotográfico (Kodak, Rochester, NY, EE UU).

39

Tabla 3. Resumen de las condiciones de determinación para las distintas proteínas por la

técnica de Inmunowestern Blot.

Anticuerpo primario

Dilución de trabajo

(anticuerpo primario)

Tipo de anticuerpo

Solución de bloqueo

Solución de lavado

Dilución del anticuerpo secundario

Anti-P-ERK1/2 (Cell Signaling,

Beverly, MA, EEUU) 1:3.000 Policlonal Leche 3% TBS-

T 0.1% TBS-T 0.1% 1 :5.000

Anti-ERK1/2 total

(Santa Cruz, Santa Cruz, EE UU)

1:3.000 Policlonal Leche 3% PBS-T 0.1% TBS-T 0.1% 1 :5.000

Anti-BCL-2 (Santa Cruz, Santa

Cruz, EE UU) 1:100 Monoclonal Leche 1% TBS

1X TBS 1X 1 :3.000

Anti P-CREB (Upstate,

Charlottesville, VA EE UU)

1:1.000 Policlonal Leche 3%PBS H2O destilada 1:3.000

Anti β-Actina (Sigma, St. Louis, MO,

EE UU) 1 :3.000 Policlonal Leche 3%PBS-T

0.1% PBS-T 0.1% 1 :5.000

Se indica para cada anticuerpo: dilución adecuada, solución tamponada en la que se hizo el bloqueo, y solución con la que se hicieron los lavados. Los anticuerpos primarios y secundarios respectivos para cada proteína fueron disueltos en la solución de bloqueo respectiva.

40

9. Liberación de 3H desde cortes de hipocampo recientemente cargados con 3H-NA:

De una serie experimental, se extrajeron los hipocampos sobre una placa de petri enfirada con

hielo. Inmediatamente, estos tejidos fueron cortados en secciones de 350 µm en su eje

antero-posterior en un cortador de tejido (The Mickle Laboratory Engineering Co., Gomshall,

Surrey, Inglaterra). Luego, el tejido cortado se traspaso a 5mL de Krebs Ringer tamponado con

bicarbonato y HEPES frio (KRBH: NaCl 110 mM; KCl 5 mM; MgSO4 2 mM; KH2PO4 2 mM;

NaHCO3 15 mM; CaCl2 2,5 mM; glucosa 10mM; HEPES 5 mM; ácido ascórbico 1%; saturada

con una mezcla de CO2 y O2, a pH 7,4.) sacudiendo el vial para separar los tejidos. Luego se

dejó decantar por algunos segundos. Esta solución se cambió repitiendo la operación 3 veces

más. El objetivo fue eliminar todo lo que es proteasas que quedan libres por efecto de los cortes.

De aquí se eligieron 3 a 4cortes de los más íntegros.

Los cortes seleccionados se colocaron en canastillos y se incubaron a 37ºC con 3H-NA 0,01µM

(Actividad especíica: 74,9 Ci/mmol. NEN Research Products, Boston, MA, EE UU) por 30min,

en KRBH. Posteriormente se procedió a lavar el exceso no incorporado por el tejido en 10 mL

de KRBH por 10 min. Se realizaron 4 de estos lavados. Después de los lavados, el canastillo con

los tejidos se pusieron en pocillos con 1mL de KRHB por 0,5min. Esta operación se repitió 3

veces, y corresponde a las tres mediciones de liberación basal del tejido (3 basales de 0,5min). El

pocillo a continuación de los basales correspondió al del estimulo (también de una duración de

0,5min), el cual se hizo aumentando el contenido de mEq de K+ en la solución de KRBH (KCl

25 mM, KRBH+K+). Para esta solución fue necesario hacer un reemplazo isoosmótico, donde se

retiró el mismo numero de mEq de Na+ de la solución, para agregar los mEq de K+ necesarios

para la concentración final de 25mM, y así mantener la osmolaridad (NaCl 90 mM). Terminado

el estimulo, el canastillo con los tejidos se trasladó a pocillos con KRBH normal durante 0,5

min, lo que se repitió 3 veces, con el fin de registrar lo que ocurre posterior al estímulo

(post-estimulo) (Fig. 4).

Terminado el último post-estimulo, los tejidos se lavaron en 10mL de KRBH de manera similar

a como se hizo al inicio después de la incubación con 3H-NA. Esta operación se repitió 3 veces,

para poder realizar un segundo estimulo, con características similares a como se describe mas

arriba (en términos de volúmenes de solución, cantidad de registros, y tiempos). Es en el

41

segundo estímulo donde se cambian las condiciones del medio, agregando fármacos (por

ejemplo: agonistas o antagonistas de receptores que participan en mecanismos de término de la

liberación, o mecanismos de recaptura), o bien, retirando componentes de la solución KRBH,

como el CaCl2, con el fin de determinar si la liberación que se está observando corresponde a

mecanismos dependientes de Ca2+ (De Langen, C.D., y cols., 1980). Finalmente, los tejidos se

homogeneizaron en PCA 0,1 N, para determinar el contenido de 3H, que quedó tras los

estímulos.

De las muestras correspondientes a basales, estímulos, post-estímulos, lavados y

homogeneizados, se tomaron 0,6 mL y se llevaron a viales de centelleo, para medir la cantidad

de tritio presente en cada pocillo, por un contador de centelleo (Liquid scintillation analyzer

1600 TR, Packard instrument company, Downers Grove, IL, EE UU). Además se midieron las

cuentas totales, para lo cual se tomaron 50µL de la solución 0,01µM de 3H-NA y se llevan a un

vial de centelleo antes de incubar el tejido y posterior a la incubación, para calcular los valores

de liberación fraccional de 3H.

Figura 4. Esquema del protocolo de liberación de 3H desde cortes de hipocampo recientemente cargados con 3H-NA. En este esquema se indica como se realizó cada ensayo de liberación. Inicialmente, los cortes de hipocampo se colocaron a incubar con 3H-NA 0,01µM durante 30 min. Posterior a esa incubación se realizaron 4 lavados de 10 min cada uno (L1, L2, L3 y L4). A continuación se determinó la liberación basal de 3H (B1, B2, B3), previa al estimulo con K+ 25mM (E), para posteriormente determinar lo que ocurre con la liberación en un tiempo posterior al estímulo (PE1, PE2 y PE3). Cada una de estas determinaciones se realizó por 30s. Un segundo estímulo se aplicó a continuación del PE3, pero previo a eso, los tejidos se lavaron nuevamente 3 veces por 10min cada uno, para luego repetir el esquema descrito anteriormente. En este segundo estímulo se pueden variar las condiciones de la liberación, ya sea quitando componentes a la solución tampón (como Ca2+), o bien agregando sustancias que modifiquen el eflujo de 3H (Yohimbina, Clonidina, TGF-β1, etc).

42

9.1. Estudio de la sensibilidad del receptor α2 en cortes de hipocampo:

Para evaluar como el estrés crónico y el tratamiento con DMI pudieron haber afectado la

actividad del autoreceptor α2, se incluyeron dos agentes farmacológicos durante los estudios de

liberación: i) Yohimbina, un antagonista α2 adrenérgico y ii) Clonidina, un agonista para este

receptor. Ambos fármacos se utilizaron a una concentración de 5µM, y estuvieron presentes en

la solución KRBH de trabajo, desde los lavados previos al segundo estímulo, durante los basales

y el estímulo con K+ 25 mM, y también en los postestímulos.

También se evaluó el efecto que tiene TGF-β1 en el eflujo de de 3H de cortes de hipocampo

recientemente cargados con 3H-NA. Para esto, se agregó TGF-β1 0,4nM (10ng/mL) (Promega,

Madison, WI, EE UU) al medio de incubación desde los basales del segundo estímulo hasta los

postestímulos.

9.1.1. Evaluación de la bioactividad de TGF-β1:

La actividad del TGF-β1 utilizado en los ensayos de liberación se determinó a través de un

bioensayo. Los fibroblastos cardiacos neonatos (FCN) son capaces de transformarse a

miofibroblastos en presencia de TGF-β1 (Soto, C., 2006). Se utilizó el procedimiento descrito

por Soto y cols (Soto, C., 2006). Las ratas se eutanasiaron por decapitación e inmediatamente se

les removió el corazón bajo condiciones de asepsia. De este órgano, se retiraron las aurículas y

los ventrículos se cortaron en pequeños pedazos para facilitar las sucesivas digestiones

posteriores con pancreatina y colagenasa II (Gibco BRL, Carlsbad, CA EE UU). El producto de

las digestiones se sometió a un pre-plaqueo por 2 h a 37ºC en medio de cultivo conteniendo 15%

suero fetal bobino (FBS) (Gibco BRL, Carlsbad, CA EE UU) en frascos para cultivo de plástico.

Por adhesión diferencial al plástico se separaron fibroblastos de cardiomiocitos. Luego de las

2 h, se cambió el medio por DMEM-F12 (Sigma, St. Louis, MO, EE UU) suplementado con

10% FBS. Los fibroblastos se dejaron proliferar hasta confluencia y los cambios de pasaje se

realizaron mediante tripsinización (hasta pasaje 2 como máximo).

43

9.1.2. Desdiferenciación de fibroblastos a miofibroblastos:

Se utilizaron fibroblastos cardiacos neonatos en pasaje 2, los cuales se cultivaron por 84 h. en

medio DMEM-F12 suplementado con TGF-β1 0,2nM (Soto, C., 2006).

9.1.3. Tinción con cristal violeta:

Las células se fijaron sobre la placa de cultivo en frío (4°C) durante 30 min, con

paraformaldehído al 4% en PBS. Transcurrido el tiempo de fijado, las células, se lavaron con

PBS frío, al menos tres veces y teñidas en frío (4°C) durante 30 min, con una solución de cristal

violeta 5 mg/mL preparada en metanol al 20%. Al finalizar el tiempo de tinción se retiró la

solución de cristal violeta y las células se lavaron con agua destilada tres veces. Se dejó secar

para ser observada al microscopio (Soto, C., 2006).

10. Análisis estadístico:

Los análisis estadísticos se realizaron con GraphPad v. 4.0 (GraphPad software Inc., San Diego,

CA, EE UU). Los datos corresponden a valores de media ± error estándar medio (EEM). Cada

comparación se hizo con un test de ANOVA no paramétrico (test de Kurskal-Wallis). Se

consideró una significancia estadística cuando al menos p<0,05.

44

V. Resultados:

1. Determinar si el estrés crónico por restricción de movimiento induce características similares

a la depresión, y si este efecto es prevenido por la administración crónica de DMI:

El estrés agudo es un evento fisiológico frente a los cambios en el entorno que permite el

desarrollo de respuestas adaptativas (McEwen, B.S., y cols., 1995), pudiendo ser estos cambios

favorables para el individuo (McEwen, B.S., y cols., 1995). Sin embargo, el estrés crónico puede

resultar perjudicial, haciendo que esta respuesta se torne patológica (McEwen, B.S., y cols.,

1995, Sapolsky, R.M., 1996b, Yehuda, R., 1997). Estos efectos patológicos del estrés, pueden

ser explicados por los cambios a nivel de la activación del eje HHS, principalmente por un

aumento en los niveles de GCs (McEwen, B.S., y cols., 1995, Sapolsky, R.M., 1996b, Yehuda,

R., 1997). En esta parte de los resultados, se muestra el efecto de 2,5 h de restricción de

movimiento por 14 días continuados y de los tratamientos farmacológicos en distintos

marcadores fisiológicos relacionados a los efectos del estrés.

1.1. Determinación de parámetros fisiológicos luego del estrés crónico por restricción de

movimiento:

1.1.1. Variaciones en el peso corporal: En la semana anterior al inicio de la restricción de movimiento y de los tratamientos

farmacológicos, los animales ganaron peso en forma similar (barra achurada en Fig. 5 A y B).

Durante este periodo se realizó el entrenamiento para evaluar la condición de anhedonia (ver

más adelante). En esa semana, todos los animales fueron manipulados de la misma manera. Una

vez iniciada la restricción de movimiento por 2,5h/día durante 14 días (barra negra en Fig. 5 A y

B), se observó que los animales estresados tuvieron una disminución en la ganancia de peso en

comparación con el grupo control (Fig. 5 A y B). Esta diferencia empezó a ser significativa

desde el 4 día de tratamiento (p<0,05 Control+SAL vs Restricción+SAL) (Fig. 5 A). Hacia el

final de los 14 días de estrés, los animales sometidos a restricción mostraron una menor ganancia

en el peso corporal de aproximadamente 20% en comparación con los animales no estresados

(p<0,005). El tratamiento antidepresivo, redujo la ganancia de peso corporal tanto en los

animales sometidos a restricción de movimiento tratados con DMI, como los no estresados que

45

también recibieron el antidepresivo, que incluso hacia el final del tratamiento, es inferior a la de

los animales que solamente fueron sometidos a restricción de movimiento (p<0,005

Restricción+SAL vs. Control+DMI y Restricción+DMI) (Fig. 5 A).

Para poder evaluar si la DMI es capaz de prevenir en animales, cambios conductuales similares a

la depresión, se compara el efecto de este antidepresivo con el de otro fármaco, el HAL capaz de

actuar en el SNC pero como antagonista de los receptores D2 (Baldessarini, R., y cols., 2001).

A pesar de que la utilización del HAL es más bien para determinar si los efectos del estrés

crónico son prevenidos por DMI y no por otro fármaco, cuyo mecanismo de acción no se

relaciona con el de un antidepresivo, se observó que el tratamiento crónico con HAL también

produjo un efecto en las ganancias de peso. En esta otra serie experimental, hay una diferencia

entre controles no estresados y animales estresados inyectados con vehículo, desde el día 5 de

tratamientos (Fig 5 B, barra negra) (p<0,05). Hacia el final de los 14 días, los animales

estresados tuvieron una pérdida de peso que también fue de alrededor de un 20% (p<0,005). En

el caso de los animales que recibieron HAL (controles no estresados y animales con restricción

de movimiento), se observó una ganancia de peso menor respecto de los grupos de animales

inyectados sólo con salino (p<0,001 Control+SAL vs. Control+HAL y Restricción+HAL;

p<0,05 Restricción+SAL vs. Control+HAL y Restricción+HAL; diferencias observadas a los 14

días de tratamientos).

46

Figura 5. El estrés crónico reduce la ganancia de peso corporal. (A) Serie experimental en que se incluye ( ) Control+SAL ip ( ) Control+DMI ip. (▼) Restricción+SAL ip ( ) Restricción+DMI ip. (B) Serie experimental en que se incluye ( ) Control+SAL ip ( ) Control+HAL sc. (▼) Restricción+SAL ip (○) Restricción+DMI ip. Los datos están expresados como promedio del % del de peso inicial del animal ± EEM. Una semana antes de iniciarse el protocolo de restricción de movimiento y los tratamientos farmacológicos (barra achurada) todos los animales se manipularon de forma similar. La barra negra indica el periodo del protocolo de estrés crónico y los tratamientos farmacológicos. En el día 14 de, hay diferencias significativas entre Control+SAL y Restricción+SAL para ambas gráficas: (A) p<0,005, Control+SAL vs. Restricción+SAL; (B) p<0,001, Control+SAL vs. Restricción+SAL (Control+SAL n=4 en cada serie experimental; Control+DMI n=8; Control+HAL n=4; Restricción+SAL n=4 en cada serie experimental; Restricción+DMI. n=8; Restricción+ HAL. n=4)

0 7 14

0

25

50

75

100

Control+SAL ip.Control+HAL 50µg/kg ip.Restricción+SAL ip.Restricción+HAL 50µg/kg ip.

Días

% d

e ga

nanc

ia d

epe

so c

orpo

ral

A

B0 7 14

0

25

50

75

100

Control+SAL ip.Control+DMI 10mg/kg ip.Restricción+SAL ip.Restricción+DMI 10mg/kg ip.

Días

% d

e ga

nanc

ia d

epe

so c

orpo

ral

47

1.1.2. Tamaño de las glándulas suprarrenales y contenido de catecolaminas:

El modelo de estrés crónico puede generar cambios en el tamaño de las glándulas suprarrenales

(Magarinos, A.M., y cols., 1995), ya que éstas participan en la respuesta a estrés secretando GCs

que se producen en la corteza de la glándula suprarrenal, como también liberando adrenalina (A)

y NA al torrente sanguíneo (Ganong, W., 1996b, Nussey, S., y cols., 2001, Rhoades, R., y cols.,

1996). De esta manera se evaluó el efecto del estrés crónico por restricción de movimiento en el

tamaño de las glándulas suprarrenales y también el contenido de A y NA. Como se observa en la

Tabla 4, no se encontraron variaciones en el tamaño de las glándulas adrenales, y tampoco se

encontraron diferencias en el contenido de A y NA en las médulas de las glándulas suprarrenales

de animales sometidos a diferentes condiciones experimentales.

Tabla 4. Tamaño de la glándula suprarrenal y contenido de noradrenalina (NA) y adrenalina (A) en la medula de la glándula

mg glándula suprarrenal

mg glándula/100g

de peso corporal

µg NA/mg glándula

µg A/mg glándula

Control+SAL ip. n=4 32,31±1,27 9,20±0,34 0,280±0,041 0,569±0,089

Control+DMI ip. n=4 28,85±1,07 8,89±0,46 0,281±0,032 0,949±0,059

Restricción+SAL ipn=4. 31,04±1,08 10,56±0,44 0,331±0,068 0,793±0,081

Restricción+DMI ipn=4 26,41±1,24 9,54±0,97 0,195±0,022 0,968±0,083

Los valores de las masas de las glándulas suprarrenales corresponden al valor de la glándula completa. Los valores de NA y A están normalizados con respecto al valor de la glándula suprarrenal completa.

Tampoco se encontraron diferencia entre los tamaños de las glándulas adrenales de los animales

tratados con HAL (resultados no mostrados). No se determinaron los contenidos de

catecolaminas de las glándulas de estos animales.

48

1.1.3. Niveles de corticosterona:

El estrés crónico por restricción de movimiento aumentó los niveles de CORT en comparación a

los animales control no estresados (p<0,05) (Tabla 5). El tratamiento crónico con DMI a

animales estresados crónicamente, previene parcialmente el aumento en la CORT sérica,

alcanzando niveles similares a los de animales control. Este efecto no es significativo cuando se

compara con los niveles de hormona de los animales estresados (Tabla 5). Por el contrario, el

tratamiento por 14 días con DMI a animales sin estresar no logró alterar los niveles séricos de

corticosterona (CORT).

El HAL tampoco es capaz de afectar los niveles de CORT en los animales sin estresar, ni

tampoco los de los animales sometidos a estrés crónico, donde se observan valores de hormona

similares a los de las ratas estresadas que solo recibieron una inyección diaria de solución salina

(Tabla 5).

Tabla 5. Niveles séricos de corticosterona (CORT)

CORT µg/dL

Control+SAL ip. 6,36±3,03

Control+DMI ip. 4,34±1,73

Control+HAL sc 4,85±0,86

Restricción+SAL ip 15,30±3,41*

Restricción+DMI ip 8,42±3,99

Restricción+HAL sc 17,63±4,87

Los valores corresponden a media ± EEM. * p<0,05 Control+SAL vs. Restricción+SAL. Control+SAL ip. n=8; Control+DMI 10mg/kg ip. n=4; Restricción+SAL ip. n=8; Restricción+DMI 10mg/kg ip. n=4.

Estas determinaciones se realizaron en muestras de suero obtenidas tras la eutanasia, la que se

realizó entre las 17:30 y las 18:30.

49

Estas determinaciones sugieren que el estrés crónico por restricción de movimiento es capaz de

reducir la ganancia de peso (Fig. 5 A y B), que pueden ser consecuencia de cambios en los

niveles de CORT (Tabla 5). Estos cambios reflejan los efectos que tiene el estrés crónico sobre

algunas de las respuestas fisiológicas del animal. Sin embargo, la DMI no fue capaz de prevenir

esta reducción en la ganancia de peso corporal, generando incluso una mayor disminución de

éste. Además, la DMI tampoco logra reducir significativamente los niveles de CORT sérica a

valores similares al control.

1.2. Cambios conductuales inducidos por estrés crónico y su modificación por la administración

de DMI:

Para determinar la acción antidepresiva de la DMI se determinó si el estrés crónico es capaz de

modificar la conducta de los animales, y si estos cambios son prevenidos específicamente por la

DMI, y no por un fármaco antipsicótico como el HAL cuyo mecanismo de acción es diferente al

del antidepresivo.

1.2.1. Adquisición de respuestas condicionadas y capacidad de responder a nuevos estímulos

nocivos:

En la Fig. 6 (A y C) se observa que los animales sometidos a restricción de movimiento no

adquirieron respuestas condicionadas, es decir, no fueron capaces de asociar que después de un

tono audible (estímulo condicionante) viene un shock eléctrico (estímulo no condicionado) del

cual pueden escapar. Esta situación se refleja en que estos animales presentaron un porcentaje

mayor de fallas en el escape que el grupo control sin estresar (Fig. 6 B y D). Esta situación se

previene por la administración de DMI en animales estresados crónicamente (Fig. 6 A y B). Para

determinar si este efecto es específico para la DMI como antidepresivo, en otro grupo de

animales se usó el HAL, antagonista para el receptor D2 de dopamina (Baldessarini, R., y cols.,

2001). Se puede observar que sólo el tratamiento con HAL en los animales sin estresar

(Control+HAL), causa una disminución en la adquisición de respuestas condicionadas (Fig. 6

C), sin embargo su porcentaje de fallas en el escape no es diferente del control con salino (Fig. 6

D), es decir, animales no estresados inyectados con HAL realizan intentos de escape, aunque no

asociados a la señal audible que les sirve de guía para evitar la descarga eléctrica. Este es un

50

efecto descrito para este tipo de fármacos, que en pequeñas dosis pueden deteriorar la capacidad

de evitar activamente un estímulo nocivo a pesar de la señal asociada, pero que de todas maneras

intentan escapar una vez que se aplica la descarga eléctrica (Baldessarini, R., y cols., 2001).

Además se puede observar que el HAL no previene la falla de escape ni la reducción en la

adquisición de respuestas condicionadas en animales sometidos a restricción de movimiento

(Fig. 6 C y D). Los resultados de esta prueba sugieren que la restricción crónica de movimiento

genera una disminución en facultades cognitivas del animal, similar a lo que ocurre en pacientes

depresivos, y que son prevenidas específicamente por la acción del antidepresivo DMI, y no por

el antipsicótico HAL.

51

Control+S

AL ip.

Control+D

MI 10m

g/kg ip

.

Restri

cción+S

AL ip.

Restri

cción+D

MI 10m

g/kg ip

.0

10

20

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***

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cción+S

AL ip.

g/kg sc

.

µ

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cción+H

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10

20

30

40

*

**

% F

alla

s en

el E

scap

e

A B

C D

Figura 6. El estrés crónico y el tratamiento con DMI alteran la adquisición de respuestas condicionadas, y los problemas en evitar estímulos nocivos. En esta gráfica se muestra que animales estresados por 14 días tienen problemas para adquirir respuestas condicionadas en la prueba de Falla de Escape. (A) Efecto del estrés y del tratamiento con DMI en adquisición de respuestas condicionadas y (B) Fallas en el escape, para prevenir un estímulo aversivo. (C) Efecto del estrés y del tratamiento con HAL en adquisición de respuestas condicionadas y (D) Fallas en el escape, para prevenir un estímulo aversivo. (*p< 0,05 Control+SAL vs. Restricción+SAL; **p<0,01 Control+SAL vs. Restricción+SAL; ***= p<0,005 Control+SAL vs. Restricción+SAL; ##= p<0,01 Restricción+SAL vs. Restricción+DMI; ###= p<0,005 Restricción+SAL vs. Restricción+DMI; análisis realizado por ANOVA no paramétrico [Kurskal-Wallis]. Control+SAL n=4 para cada serie experimental; Control+DMI n=8; Control+HAL n=4; Restricción+SAL n=4 para cada serie experimental; Restricción+DMI. n=8; Restricción+ HAL n=4)

52

1.2.2. Prueba de natación forzada:

En la Fig. 7 A y B, los animales control sin estresar presentaron las dos conductas de escape

(escalamiento y natación), sin predominio de una sobre la otra. En cambio en los animales a los

que sólo se les administró DMI (Fig. 7 A), se puede observar que la conducta de escalamiento es

la que predominó, aunque no alcanzó a ser significativamente mayor si se compara con el grupo

control.

Los animales sometidos a restricción de movimiento presentaron menos tiempo asociado a

conductas de escape (Fig. 7 A y B), aumentando significativamente la conducta de inmovilidad

en relación a los animales control (p<0,05 Restricción+SAL vs. Control+SAL en Fig. 7 A y B),

lo que indica una condición de desesperanza aprendida (estado psicológico que se produce

cuando los acontecimientos son percibidos como incontrolables y que no se puede hacer nada

para cambiarlos (Vinaccia, S., y cols., 2005), condición que se presenta en individuos con DM

(APA, 1999)). Esta condición se previno por la administración crónica de DMI a animales

estresados, lo que se refleja en una disminución en la conducta de inmovilidad (p<0,05

Restricción+SAL vs. Restricción+DMI en Fig. 7 A), y en aumento en la conducta de

escalamiento (p<0,01 Restricción+SAL vs. Restricción+DMI en Fig. 7 A). Esta prevención no

ocurre con los animales sometidos a restricción de movimiento inyectados crónicamente con

HAL, observándose un predominio de la conducta de inmovilidad. Esto también ocurre en los

animales control sin estresar que reciben este mismo fármaco (Fig. 7 A).

Este resultado sugiere que los animales estresados crónicamente presentan una condición de

desesperanza aprendida, efecto que se previno por la administración de crónica de DMI, pero no

por la acción del HAL.

53

Escalamiento Natación Inmovilidad0

100

200

300 Control+SAL ip.

Restricción+SAL ip.Control+HAL 50µg/kg sc

Restricción+HAL 50µg/kg sc

**

*

Segu

ndos

Escalamiento Natación Inmovilidad0

100

200

300Control+SAL ip.Control+DMI 10mg/kg ipRestricción+SAL ip.Restricción+DMI 10mg/kg ip*

## *

#Segu

ndos

A

B

Figura 7. El estrés aumenta la inmovilidad en la prueba de natación forzada. (A) En esta gráfica se muestra que en los animales estresados por 14 días, hubo una disminución en las conductas de escape, aumentando la conducta de inmovilidad durante los 300seg (5min) de la prueba. Esta situación no ocurre en los animales sometidos a restricción de movimiento que reciben el tratamiento con DMI 10mg/kg ip. Los animales no estresados que reciben DMI, la conducta de escape que predomina es la de escalamiento, lo que está de acuerdo con lo descrito para este tipo de antidepresivos, sin embargo este efecto no es significativo. (B) En esta gráfica se muestra nuevamente una disminución en las conductas de escape, aumentando la conducta de inmovilidad durante los 300seg (5min) de la prueba. El tratamiento con HAL animales estresados y no estresados causa un aumento en la inmovilidad. El tratamiento con HAL no previene la conducta de desesperanza aprendida asociada a la restricción de movimiento. (*= p<0,05 Control+SAL vs. Restricción+SAL; + + p<0,01 Control+SAL vs. Control+DMI; # p<0,05 Restricción+SAL vs. Restricción+DMI; ## p<0,01 Restricción+SAL vs. Restricción+DMI; análisis realizado con el test de ANOVA no paramétrico (Kurskal-Wallis). Control+SAL n=8; Control+DMI n=8; Control+HAL n=4; Restricción+SAL n=8; Restricción+DMI n=8; Restricción+HAL n=4)

54

1.2.3. Preferencia por una solución de sacarosa al 1% como agua de bebida:

Se evaluó la pérdida de interés por un estimulo placentero o anhedonia, mediante la variación en

el consumo de una solución de sacarosa al 1% como agua de bebida. En la Fig. 8 A y B se puede

observar que la restricción de movimiento causa una reducción en la preferencia por la solución

de sacarosa 1% a los 7 días (p<0,01 Control+SAL vs. Restricción+SAL en Fig. 8 A y B),

condición que persiste a los 14 días (p<0,005 Control+SAL vs. Restricción+SAL en Fig. 8 A y

B). Esta condición se reconoce como anhedonia, y es una característica importante que se

presenta en pacientes con DM. Esta conducta se previene por la administración crónica de DMI

a animales estresados, tanto a los 7 días (p<0,05 Restricción+SAL vs. Restricción+DMI) como a

los 14 días de tratamiento (p<0,01 Restricción+SAL vs. Restricción+DMI). Por el contrario, el

HAL no es capaz de prevenir la anhedonia en animales estresados (Fig. 8 B), siendo los valores

de preferencia por la sacarosa 1% similares a los de los animales estresados que recibieron

salino.

Estos resultados sugieren que la restricción crónica de movimiento hace que los animales

pierdan la preferencia por algún estímulo placentero, similar a una conducta anhedónica, y que

esta conducta se previene específicamente por la acción específica del antidepresivo, y no por el

antipsicótico.

55

0 7 140

25

50

75

100Control+SAL ip.Control+HAL 50µg/kg scRestricción+SAL ip.Restricción+HAL 50µg/kg sc.

**

***

**

***

Días

Porc

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1%

0 7 140

25

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100

125Control+SAL ip.Control+DMI 10mg/kg ipRestricción+SAL ip.Restricción+DMI 10mg/kg ip.

**

***

###

Días

Porc

enta

je d

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enci

a po

r s

acar

osa

1%

A

B

Figura 8. El estrés crónico reduce la preferencia por una solución de sacarosa al 1%. (A) En esta gráfica se señala la condición inicial previa al paradigma de estrés (día 0 de tratamientos y estrés crónico). Se puede observar que, tanto a los 7 y 14 días de restricción de movimiento, los animales estresados crónicamente disminuyeron la preferencia por la bebida endulzada, o que indica una condición de anhedonia. Esto no ocurre en los animales sometidos a restricción de movimiento que reciben el tratamiento con DMI. (B) En esta gráfica se señala la condición inicial previa al paradigma de estrés (día 0 de tratamientos y estrés crónico). Se puede observar que, tanto a los 7 y 14 días de restricción de movimiento, los animales estresados crónicamente disminuyeron la preferencia por la bebida endulzada, o que indica una condición de anhedonia, mientras que los animales a los que se les administró HAL, tanto controles como estresados crónicamente se comportan como los animales que reciben una inyección de solución salina. (**= p<0,01 Control+SAL vs. Restricción+SAL; ***= p<0,005 Control+SAL vs. Restricción+SAL; #= p<0,05 Restricción+SAL vs. Restricción+DMI; ##= p<0,01 Restricción+SAL vs. Restricción+DMI; análisis realizado con el test de ANOVA no paramétrico (Kurskal-Wallis). Control+SAL n=8; Control+DMI n=8; Control+HAL n=4; Restricción+SAL n=8; Restricción+DMI n=8; Restricción+HAL n=4)

56

De esta forma, y de acuerdo a lo que sugieren los resultados de las pruebas conductuales, el

someter a ratas macho de 200 a 240g a 2,5h diarias de restricción de movimiento, durante 14

días continuados, induce la aparición de conductas similares a la depresión, que son prevenidas

específicamente por un antidepresivo como la DMI y no por un antipsicótico como el HAL.

2. Analizar en un modelo animal de depresión, cambios en los niveles de marcadores asociados a

la resiliencia celular en hipocampo de rata:

El estrés crónico causa una serie de alteraciones a nivel conductual, que incluyen alteraciones

cognitivas (fallas en el escape y disminución en la adquisición de respuestas condicionadas),

incapacidad de responder ante nuevas situaciones incontrolables (desesperanza aprendida), y

también anhedonia. Todas estas conductas son prevenidas por el tratamiento con DMI. Estos

cambios y los efectos del antidepresivo sugieren que la restricción de movimiento induce

cambios a nivel del SNC, y que estas alteraciones pueden ser prevenidas por la DMI. Además, la

restricción de movimiento aumenta los niveles de CORT en animales estresados, por lo que es

posible plantear que estos niveles más altos de esta hormona puedan tener efectos nocivos a

nivel de estructuras del SNC, como el hipocampo, que tienen una alta densidad de receptores

para GCs (McEwen, B.S., 1987, 1999, 2005, McEwen, B.S., y cols., 1995, Sapolsky, R.M.,

2000, 2001).

2.1. Determinar los efectos del estrés crónico y el tratamiento con DMI sobre ERK1/2, CREB,

BCL-2, BDNF y TGF-β1, como marcadores asociados a la resiliencia celular:

Dentro de los efectos nocivos que pueden tener el aumento en los niveles de corticosterona, está

la disminución de la resiliencia neuronal a nivel hipocampal (McEwen, B.S., 1999, Sapolsky,

R.M., 1996b, Yehuda, R., 1997). Por lo tanto resulta importante evaluar cómo cambian algunos

marcadores asociados a la neuroprotección en la condición de estrés crónico por restricción de

movimiento, y cómo la DMI tiene efectos a nivel de estos marcadores.

57

2.1.1. Determinación por inmunowestern blot de ERK1/2:

La vía de transducción regulada por las ERK1/2 es activada en el SNC por neurotrofinas y otros

moduladores neuroquímicos, que relacionan a estas proteínas con procesos de sobrevivencia y

plasticidad neuronal (D'Sa, C., y cols., 2002, Einat, H., y cols., 2003, Weeber, E.J., y cols.,

2002). Por este motivo se evaluó de qué manera el estrés crónico afecta los niveles y el grado de

fosforilación de ERK1/2. En la Fig. 9 A, se muestra un immunoblot representativo de estas

proteínas. El análisis densitométrico (Fig. 9 B), indicado como razón de la intensidad de ERK1 o

ERK2 con β-actina, muestra que el estrés induce un aumento en ERK1/β-actina y

ERK2/β-actina respecto a animales controles sin estresar (p<0,05) (Fig. 9 B). Sin embargo, la

administración crónica de DMI no produce cambios en la razones ERK1/β-actina y

ERK2/β-actina en animales estresados. En contraste, se observa que la DMI administrada

crónicamente a animales sin estresar induce un aumento significativo de ERK1/β-actina y

ERK2/β-actina (p<0,05). Este análisis refleja cambios en la cantidad de proteína total para las

diferentes condiciones experimentales, pero no entrega información con respecto a cambios en el

grado de fosforilación de éstas. Por este motivo, se analizaron los niveles de P-ERK1 y P-ERK2.

La Fig. 9 C se muestra que el estrés crónico induce un aumento en P-ERK1/ERK1 y produce una

tendencia similar en P-ERK2/ERK2. Este efecto es prevenido por el tratamiento crónico con

DMI en animales estresados, donde se produjo una disminución significativa en las razones de

P-ERK1/ERK1 y P-ERK2/ERK2 (p<0,05) al compararlas con las razones de animales estresados

(Fig. 9 C). También, este análisis densitométrico muestra una reducción no significativa en la

razón P-ERK1/ERK1, y una disminución significativa de P-ERK2/ERK2 (p<0,05) en animales

control tratados con DMI en comparación con animales controles (Fig. 9 C). No se determinaron

los niveles de ERK1/2 totales o fosforiladas de animales tratados con HAL.

58

Control+SAL ip

.

Control+D

MI 10m

g/kg ip

.

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cción+S

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MI 10m

g/kg ip

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1

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Control+SAL ip

.

Control+D

MI 10m

g/kg ip

.

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cción+S

AL ip.

Restri

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g/kg ip

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Control+SAL ip

.

Control+D

MI 10m

g/kg ip

.

Restri

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MI 10m

g/kg ip

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1

2

*#

Raz

ón P

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ERK

2

Control+SAL ip

.

Control+D

MI 10m

g/kg ip

.

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1

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3

4

**

Raz

ón E

RK

2/β-

Act

ina

P-ERK1/ERK1ERK1/β-ACTINA

P-ERK2/ERK2ERK2/β-ACTINA

A

B C

Figura 9. El estrés crónico y el tratamiento con DMI inducen cambios hipocampales en ERK1/2 total y su grado de fosforilación. Tras 14 días de restricción de movimiento hay un aumento en la fosforilación de ERK1/2, efecto que es prevenido por DMI. También hay un aumento en la cantidad de proteínas totales en relación con la β-actina. (A) Inmunoblots representativos de las proteínas estudiadas. (B) Análisis densitométrico de los inmunoblots de las proteínas totales expresadas como razón con β-actina; (C) Análisis densitométrico de los inmunoblots de las proteínas fosforiladas expresadas como razón con sus proteínas totales; (* p<0,05 Control+SAL vs. Restricción+SAL o vs. Control+DMI; # p<0,05 Restricción+SAL vs. Restricción+DMI; análisis realizado con el test de ANOVA no paramétrico (Kurskal-Wallis). Control+SAL n=4; Control+DMI n=4; Restricción+SAL n=4; Restricción+DMI n=4)

59

2.1.2. Determinación por inmunowestern blot de CREB:

La activación de las ERK1/2, puede llevar a la activación por fosforilación de la proteína CREB

(D'Sa, C., y cols., 2002), es por esto que se estudiaron los niveles de CREB total y fosforilado

(P-CREB). En la Fig. 10 A se observa un inmunoblot representativo de las diferentes

condiciones experimentales. El análisis densitométrico reveló que las razones de CREB/β-actina

de los animales control y la de los estresados crónicamente son significativamente diferentes

(p<0,05) (Fig. 10 B). Mientras que CREB/β-actina de animales control tratados con DMI no es

diferente de la de los controles (Fig. 10 B). Nuevamente este análisis solo refleja cambios en las

cantidades totales de CREB en cada condición experimental, y no entrega información sobre el

grado de fosforilación de CREB. El análisis de P-CREB/CREB, reveló que este valor fue

significativamente mayor en animales estresados crónicamente en comparación con animales

control. Este efecto no fue prevenido por los 14 días de tratamiento con DMI a animales

estresados (Fig. 10 C) siendo el valor de la razón de este grupo experimental significativamente

mayor que los animales control (p<0,05). Por el contrario, la razón P-CREB/CREB de animales

no estresados y tratados crónicamente con DMI es similar al de los animales control (Fig. 10 B).

No se determinaron los niveles de CREB total o fosforilado en animales tratados con HAL.

60

Control+S

AL ip.

Control+D

MI 10m

g/kg ip

.

Restri

cción+S

AL ip.

Restri

cción+D

MI 10m

g/kg ip

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Control+S

AL ip.

Control+D

MI 10m

g/kg ip

.

Restri

cción+S

AL ip.

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MI 10m

g/kg ip

.0

1

2

3

*

Raz

ón C

REB

/ β-A

ctin

a

P-CREB/CREBCREB/β-ACTINA

A

B C

Figura 10. El estrés crónico aumenta los niveles hipocampales de CREB y P-CREB. Tras 14 días de restricción de movimiento hay un aumento en la fosforilación de CREB, efecto que no es prevenido por DMI. También hay un aumento en la cantidad de proteína total en relación a la β-actina. (A) Análisis densitométrico de los inmunoblots de la proteína total expresada como razón con β-actina; (B) análisis densitométrico de los inmunoblots de la proteína fosforilada expresada como razón con su proteína total; (C) inmunoblots representativos de CREB, P-CREB, y β-actina (* = p<0,05 Control+SAL vs. Restricción+SAL o vs. Control+DMI; análisis realizado con el test de ANOVA no paramétrico (Kurskal-Wallis). Control+SAL n=4; Control+DMI n=4; Restricción+SAL n=4; Restricción+DMI n=4;)

61

2.1.3. Determinación por inmunohistoquímica de P-CREB:

Con la finalidad de obtener información mas detallada de las variaciones de P-CREB, se

evaluaron los cambios regionales de esta proteína fosforilada en el hipocampo, a través de

inmunohistoquímica para P-CREB. Para este análisis los resultados se expresaron como una

sumatoria de ponderaciones de las frecuencias relativas de los diferentes grados de intensidad de

la marca de P-CREB (H-score). Este tipo de análisis ha sido empleado por otros autores en el

estudio de otro tipo de marcas histoquímicas dentro del SNC (Forger, N.G., y cols., 1998,

Gonzalez, S.L., y cols., 2004, Thome, J., y cols., 2000). Este análisis se llevó a cabo con una

magnificación de 20x y con la asistencia de un software apropiado (ImageJ, NIH, EE UU).

En la Fig. 11 se muestran microfotografías representativas de las distintas áreas evaluadas: CA1,

CA3, Suprapiramidal e Infrapiramidal del GD (SupGD e InfGD, respectivamente). Se puede

observar que tanto animales control sin estresar, controles tratados con DMI, estresados

inyectados con salino y estresados que recibieron DMI durante los 14 días presentan

inmunoreactividad para P-CREB en todas las áreas evaluadas. Por otra parte los grupos de

animales control sin estresar y estresados que recibieron HAL casi no se observa

inmunoreactividad para P-CREB en el hipocampo, pero se observa inmunoreactividad en otras

áreas del cerebro (resultados no mostrados).

62

Figu

ra 1

1. M

icro

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graf

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os e

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ultá

nea.

63

Del análisis por H-score (Fig. 12 A y B) se puede inferir que no existe diferencia en la

inmunoreactividad relativa de P-CREB en las diferentes áreas hipocampales de los animales

control sin estresar (Fig. 12 A y B). El estrés crónico no indujo cambios en la inmunoreactividad

relativa de P-CREB. En cambio, el tratamiento crónico con DMI a animales sin estresar aumentó

la señal de P-CREB solo en la región CA3 (p<0,05), y no en otras áreas (Fig. 12 A). Con

respecto al tratamiento con DMI a animales estresados, se observó un aumento significativo de

la inmunoreactividad relativa de P-CREB en todas las capas neuronales analizadas (p<0,05 para

CA1, SupGD e InfGD, y p,0,01 para CA3), al compararlas con las de animales estresados que

fueron inyectados con una solución salina (Fig. 12 A).

La administración de HAL a animales control sin estresar y al grupo de ratas sometidas a

restricción de movimiento, disminuyó significativamente la inmunoreactividad relativa de

P-CREB en todas las áreas analizadas en ambos grupos experimentales (Fig. 11 y Fig 12 B).

64

CA1 CA3 SupGD InfGD0

50

100

150

200

250

300Control+SAL ip.Control+DMI 10mg/kg ip.Restricción+SAL ip.Restricción+DMI 10mg/kg ip.

##

# # #*

H-s

core

CA1 CA3 SupGD InfGD0

50

100

150

200

250

300Control+SAL ip.Control+HAL 50µg/kg sc.Restricción+SAL ip.Restricción+HAL 50µg/kg sc.

*+++

+++

### +

+ ++

+++

+++

###

+ ++

##H

-sco

re

A

B

Figura 12. Análisis la inmunoreactividad relativa de P-CREB en las diferentes áreas hipocampales. El H-score se determinó al sumar las ponderaciones de las frecuencias relativas: 0 x porcentaje de células muy débilmente teñidas + 1 x porcentaje de células levemente teñidas + 2 x porcentaje de células moderadamente marcadas + 3 x porcentaje de células intensamente marcadas. El valor de este puntaje va de un rango de 0 a 300, donde el valor 0 corresponde a que la muestra tiene principalmente células muy débilmente teñidas o sin marca y 300 corresponde a que la muestra tiene todas sus células intensamente teñidas. (A) Muestra el análisis de H-score para una serie de animales en que se incluyó el tratamiento con DMI. La DMI por 14 días solo incrementó la señal relativa de P-CREB en CA3 de animales controles, y en todas las regiones de animales estresados (*p<0,05 Control+SAL vs. Restricción+SAL; ≠ p<0,05 Control+SAL vs. Control+DMI). (B) Muestra el análisis de H-score para una serie de animales en que se incluyó el tratamiento con HAL. En este grupo de animales, el estrés disminuyó la expresión de P-CREB solo en CA1, y el HAL disminuyó la inmunoreactividad de este tanto en animales controles como en estresados. (+ p<0,05, ++ p<0,01 y +++ p<0,005 Control+SAL vs. Control+HAL; # p<0,05 y ## p<0,01 Restricción+SAL vs. Restricción+DMI; && p<0,01 y &&& p<0,005 Restricción+SAL vs. Restricción+HAL). Análisis realizado con el test de ANOVA no paramétrico (Kurskal-Wallis). (Control+SAL n=4 para cada serie exprimental; Control+DMI n=4; Control+HAL n=4; Restricción+SAL n=4 para cada serie experimental; Restricción+DMI n=4; Restricción+HAL n=4).

65

2.1.4. Determinación de cambios en el ARNm de BCL-2 por hibridación in situ:

La proteína P-CREB ejerce su acción citoprotectora al regulando la expresión de algunas

proteínas involucradas con favorecer la resiliencia celular. Una de los blancos regulados por

P-CREB es la proteína antiapoptótica es BCL-2 (D'Sa, C., y cols., 2002), y que además es una

proteína capaz de ser regulada por GCs (Cardenas, S.P., y cols., 2002). Es por esto que se

analizaron los cambios regionales del mRNA esta proteína a través de la técnica de hibridación

in situ (HIS).

En la Fig. 13 corresponde a microfotografías representativas de la HIS de BCL-2, donde se

puede observar que la señal de HIS se encuentra sobre las capas neuronales del hipocampo (CA1

a CA3 y ambas capas del GD). Además se puede observar que la señal del ARNm de BCL-2 en

animales con tratamiento crónico con DMI no es muy diferente a la de animales control.

También hay una aparente reducción de la señal del ARNm de BCL-2 en animales estresados si

se compara con los controles sin estresar, y lo mismo se observa la misma señal en animales

estresados tratados con DMI. También se puede observar que el tratamiento crónico con HAL

tanto a animales controles sin estresar y estresados, reduce de manera importante la señal del

ARNm de BCL-2 en todo el hipocampo.

66

Figura 13. Hibridación in situ para BCL-2 en hipocampo de rata. Se muestran microfotografías representativas de cada condición experimental, tomadas con una magnificación de 2,5x. La barra negra representa 500µm. En la primera microfotografía hay un recuadro con un detalle de la señal de hibridación in situ correspondiente a una zona de la capa SupGD (40x). De cada animal se evaluaron los hipocampos de ambos hemisferios en 3 a 4 cortes para el análisis densitométrico. Todos los ensayos fueron realizados en forma simultánea.

67

El análisis densitométrico de estas microfotografías muestra que en animales controles sin

estresar, la intensidad de marca del ARNm de BCL-2 es mayor en ambas capas de GD que en las

regiones CA1 y CA3 (Fig 14 A y B), y entre ambas regiones del Cuerno de Amon, la marca del

ARNm de BCL-2 es levemente mayor en CA3 que en CA1. Este patrón no es alterado cuando

los animales control reciben DMI por 14 días (Fig. 14 A). Sin embargo, el estrés crónico por

restricción de movimiento reduce en todo el hipocampo la señal de HIS para el transcrito de

BCL-2, efecto que no es prevenido por el tratamiento con DMI (Fig. 14 A). El tratamiento con

HAL a animales control sin estresar y ratas estresadas crónicamente, reduce la señal del ARNm

de BCL-2 en todas las regiones del hipocampo.

68

CA1 CA3 SupGD InfGD0

5000

10000

15000

20000

25000Control+SAL ip.Control+DMI 10mg/kg ip.Restricción+SAL ip.Restricción+DMI 10mg/kg ip.

*

**

**

**

**

**

**

**

Pixe

ls

CA1 CA3 SupGD InfGD0

5000

10000

15000

20000

25000Control+SAL ip.Control+HAL 50µg/kg sc.Restricción+SAL ip.Restricción+HAL 50µg/kg sc.

***

+++

+++

***

+++ +

++

***

+++

+++

**

+++

+++

Pixe

ls

A

B

Figura 14. El estrés reduce los niveles hipocampales del ARNm de BCL-2, efecto que no es prevenido por la DMI. En estas gráficas se muestra el patrón de expresión del transcrito de BCL-2 en distintas regiones del hipocampo, obtenido por densitometría. A) Resultados de una serie experimental en que se incluyó el tratamiento crónico con DMI en animales controles sin estresar y estresados por 14 días. B) Resultados de una serie experimental en que se incluyó el tratamiento crónico con HAL en animales controles sin estresar y estresados por 14 días. Los resultados corresponde al valor de la media de pixels±EEM de un análisis de 3 a 4 cortes por animal (* p<0,05, ** p<0,01 y *** p<0,005 Control+SAL vs. Restricción+SAL y Control+SAL vs. Restricción+DMI en gráfica A; +++ p<0,005 Control+SAL vs. Control+HAL y Control+SAL vs. Restricción+HAL. Análisis realizado con el test de ANOVA no paramétrico (Kurskal-Wallis). Control+SAL n=4 para cada serie exprimental; Control+DMI n=4; Control+HAL n=4; Restricción+SAL n=4 para cada serie experimental; Restricción+DMI n=4; Restricción+HAL n=4)

69

2.1.5. Determinación por inmunowestern blot de BCL-2:

Determinados los niveles de ARNm de BCL-2, se evaluó de qué manera la proteína generada

por este transcrito también cambiaba. Como primera aproximación se evaluó por inmunowestern

blot los cambios generados en el hipocampo por el tratamiento con DMI. La Fig. 15 A

corresponde a un inmunoblot representativo de BCL-2. El análisis densitométrico (Fig 15 B)

muestra que en los animales estresados crónicamente hay un aumento significativo en los niveles

de BCL-2 (p<0,05) al compararlo con los niveles de esta proteína en animales control sin

estresar. Este aumento en BCL-2, es prevenido por el tratamiento crónico con DMI en animales

sometidos a restricción de movimiento por 14 días, observándose valores significativamente más

bajos (p<0,05) que los determinados para animales estresados crónicamente y que fueron

inyectados con vehículo. Los niveles de BCL-2 de animales no estresados tratados crónicamente

con DMI no son diferentes de los niveles de los animales control. No se evaluaron los niveles de

BCL-2 en animales tratados con HAL.

70

Control+S

AL ip.

Control+D

MI 10m

g/kg ip

.

Restri

cción+S

AL ip.

Restri

cción+D

MI 10m

g/kg ip

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1

2

3

4

5

6

7*

#

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ónB

CL-

2/β-

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A

B

Figura 15. El estrés induce un aumento en los niveles hipocampales de BCL-2. Tras 14 días de restricción de movimiento hay un aumento en BCL-2, efecto que no es prevenido por DMI. A) Inmunoblots representativos de BCL-2 y β-actina; B) Análisis densitométrico de los inmunoblots de la proteína total expresada como razón con β-actina (* = p<0,05 Control+SAL vs. Restricción+SAL; # = p<0,05 Restricción+SAL vs. Restricción+DMI; análisis realizado con el test de ANOVA no paramétrico (Kurskal-Wallis). Control+SAL n=4; Control+DMI n=4; Restricción+SAL n=4; Restricción+DMI n=4;)

71

2.1.6. Determinación por inmunohistoquímica de BCL-2:

Para determinar cambios regionales en el hipocampo se realizó una inmunohistoquímica para

BCL-2. Para realizar una evaluación de la variación en la intensidad de la marca se utilizó el

método de H-score, ya que la tinción que se observó en los cuerpos neuronales en el hipocampo,

y fue perinuclear, presentando diferentes niveles de intensidad que permiten realizar este tipo de

análisis. Esta evaluación también se llevó a cabo con una magnificación de 20x y con la

asistencia de un software apropiado (ImageJ, NIH, EE UU).

En la Fig. 16 se muestran microfotografías de la inmunohistoquímica de BCL-2 en diferentes

areas del hipocampo, y de cada condición experimental. En la Fig. 17 se puede observar que no

hay diferencias en la inmunoreactividad relativa entre las diferentes áreas estudiadas. El estrés

crónico por restricción de movimiento, no es capaz de disminuir la inmunoreactividad relativa de

BCL-2 en ninguna de las áreas estudiadas, al compararlas con la señal observada para los

controles sin estresar (Fig. 17 A). Por el contrario, el tratamiento con DMI a animales estresados

disminuye significativamente la inmunoreactividad de BCL-2 en todas las áreas del hipocampo,

efecto similar a lo que observado en animales control sin estresar tratados con DMI. La

administración de HAL a animales control sin estresar y los sometidos a restricción de

movimiento (Fig. 17 B), produjo una reducción significativa de la inmunoreactividad relativa de

BCL-2 en todas las áreas hipocampales estudiadas.

72

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ra 1

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73

CA1 CA3 SupGD InfGD0

50

100

150

200

250

300

+++

Control+SAL ip.Control+DMI 10mg/kg ip.Restricción+SAL ip.Restricción+DMI 10mg/kg ip.+

++ +

+++

+ +++

++ +

++

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###

###

H-s

core

CA1 CA3 SupGD InfGD0

50

100

150

200

250

300

+++

Control+SAL ip.Control+HAL 50µg/kg sc.Restricción+SAL ip.Restricción+HAL 50µg/kg sc.+

++

###

++

++

##

##+ ++

+ ++

##

H-s

core

A

B

Figura 17. Efecto del estrés crónico y del tratamiento con DMI en la inmunoreactividad relativa de BCL-2 en el hipocampo de rata. El H-score se determinó al sumar las ponderaciones de las frecuencias relativas: 0 x porcentaje de células muy débilmente teñidas + 1 x porcentaje de células levemente teñidas + 2 x porcentaje de células moderadamente marcadas + 3 x porcentaje de células intensamente teñidas. El valor de este puntaje va de un rango de 0 a 300, donde 0 corresponde a que la muestra tiene principalmente células muy débilmente teñidas o bien sin teñir, y 300 corresponde a que la muestra tiene todas sus células intensamente teñidas. A) Análisis de H-score para una serie de animales en que se incluyó el tratamiento con DMI (+ p<0,05, ++ p<0,01 y +++ p<0,005 Control+SAL vs. Control+DMI y Control+SAL vs. Restricción+DMI; ## p<0,01 y ### p<0,005 Restricción+SAL vs. Restricción+DMI) Los valores corresponden a la media±EEM del análisis de H-score realizado en 3 a 4 cortes por animal.. (B) Análisis de H-score para una serie de animales en que se incluyó el tratamiento HAL (+ p<0,05, ++ p<0,01 y +++ p<0,005 Control+SAL vs. Control+HAL y vs Restricción+HAL; ## p<0,01 y ### p<0,005 Restricción+SAL vs. Restricción+HAL). Los valores corresponden a la media±EEM del análisis de H-score realizado en 3 a 4 cortes por animal. En A y en B se comparan los efectos de los fármacos con los mismos animales Control+SAL y Restricción+SAL. Análisis realizado con el test de ANOVA no paramétrico (Kurskal-Wallis). Control+SAL n=4; Control+DMI n=4; Control+HAL n=4; Restricción+SAL n=4; Restricción+DMI n=4; Restricción+HAL n=4)

74

2.1.7. Determinación de cambios en el ARNm de BDNF por hibridación in situ:

El BDNF es un factor neurotrófico que participa en procesos asociados a la resiliencia celular,

dado que esta neurotrofina es capaz de regular la expresión de otras proteínas que promueven la

sobrevida celular (D'Sa, C., y cols., 2002). Además, si la sobrevida neuronal depende de la

actividad de la célula, un aumento en el número de contactos sinápticos favorece a la resiliencia

celular (D'Sa, C., y cols., 2002, Nestler, E.J., y cols., 2002). Este proceso es favorecido por el

BDNF ya que es una neurotrofina asociada a procesos de neuroplasticidad, como por ejemplo

favorecer la arborización dendrítica (D'Sa, C., y cols., 2002, Manji, H.K., y cols., 2001b, Nestler,

E.J., y cols., 2002, Schaaf, M.J., y cols., 1998, Tapia-Arancibia, L., y cols., 2004). También, la

expresión de BDNF puede ser inhibida por GCs (Schaaf, M.J., y cols., 1998, Smith, M.A., y

cols., 1995, Tapia-Arancibia, L., y cols., 2004), y estimulada por antidepresivos (Nibuya, M., y

cols., 1995, Nibuya, M., y cols., 1996), y por CREB (Finkbeiner, S., y cols., 1997, Nibuya, M., y

cols., 1995, Russo-Neustadt, A., y cols., 1999); por lo que se analizaron los efectos de las

distintas condiciones experimentales en la expresión del ARNm de BDNF las diferentes áreas

del hipocampo.

En la Fig. 18, se muestran microfotografías representativas de cada condición experimental, en

donde so observa que la marca de HIS de BDNF se detectó principalmente en las capas

neuronales del hipocampo de rata (CA1, CA3, SupGD e InfGD). Luego de un análisis

densitométrico (Fig. 19 A y B), se puede observar que el estrés crónico por restricción de

movimiento redujo significativamente la señal del ARNm de BDNF en todas las capas

estudiadas del hipocampo (Fig. 19 A y B), observando una reducción significativamente mayor

en la serie de animales en que se incluyó el tratamiento con HAL (Fig. 19 B). Esta reducción

sólo fue prevenida por el tratamiento con DMI en la región CA3 de animales estresados

crónicamente (Fig. 19 A), donde se observa un aumento significativo en la señal de HIS para

BDNF, en comparación con la misma área de animales estresados que fueron inyectados con

salino. En los animales control tratados crónicamente con DMI no se observaron diferencias en

comparación con los animales control inyectados diariamente con vehículo.

En el caso de los animales tratados con HAL, este tratamiento redujo significativamente la señal

del transcrito de BDNF en todo el hipocampo, tanto en animales controles sin estresar como en

75

animales sometidos a estrés crónico por 14 días (Fig. 19 B). No se realizó análisis por

inmunohistoquímica de la proteína BDNF.

76

Figura 18. Hibridación in situ para BDNF en hipocampo de rata. Se muestran microfotografías representativas de cada condición experimental, tomadas con una magnificación de 2,5x. La barra negra representa 500µm. En la primera microfotografía hay un recuadro con un detalle de la señal de hibridación in situ correspondiente a una zona de la capa SupGD (40x). De cada animal se evaluaron los hipocampos de ambos hemisferios en 3 a 4 cortes para el análisis densitométrico. Todos los ensayos fueron realizados en forma simultánea.

77

CA1 CA3 SupGD InfGD0

10000

20000

30000Control+SAL ip.Control+DMI 10mg/kg ip.Restricción+SAL ip.Restricción+DMI 10mg/kg ip.

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**

#

Pixe

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CA1 CA3 SupGD InfGD0

10000

20000

30000Control+SAL ip.Control+HAL 50µg/kg sc.Restricción+SAL ip.Restricción+HAL 50µg/kg sc.

+++

+++

**

###

+++

#++

**

+++

+++

** #

##

+++

+++

*###

Pixe

lsA

B

Figura 19. El estrés crónico reduce los niveles hipocampales del ARNm de BDNF, efecto que solo es prevenido por DMI en la región CA3. En estas gráficas se muestra el patrón de expresión del transcrito de BDNF en distintas regiones del hipocampo, obtenido por densitometría. A) Resultados de una serie experimental en que se incluyó el tratamiento crónico con DMI en animales controles sin estresar y estresados por 14 días (* p<0,05 Control+SAL vs. Restricción+SAL; # p<0,05 Restricción+SAL vs. Restricción+DMI) Los resultados corresponde al valor de la media de pixels ±EEM de un análisis de 3 a 4 cortes por animal. B) Resultados de una serie experimental en que se incluyó el tratamiento crónico con HAL en animales controles sin estresar y estresados por 14 días. (* p<0,05 y ** p<0,01 Control+SAL vs. Restricción+SAL; ++ p<0,01 y +++ p<0,005 Control+SAL vs. Control+HAL y Control+SAL vs. Restricción+HAL; # p<0,05 y ### p<0,005 Restricción+SAL vs. Restricción+HAL) Los resultados corresponde al valor de la media de pixels ±EEM de un análisis de 3 a 4 cortes por animal. Análisis realizado con el test de ANOVA no paramétrico (Kruskal-Wallis). Control+SAL n=4 para cada serie exprimental; Control+DMI n=4; Control+HAL n=4; Restricción+SAL n=4 para cada serie experimental; Restricción+DMI n=4; Restricción+HAL n=4)

78

Los análisis realizados por inmunowestern blot y por técnicas histoquímicas indican que tanto el

estrés crónico por restricción de movimiento y el tratamiento crónico con DMI producen

cambios diferentes en la expresión hipocampal de marcadores asociados a la resiliencia celular.

La activación de ERK1/2 ocurre solo por efecto del estrés crónico, y este efecto fue prevenido

por la administración del antidepresivo. Por el contrario, no se observaron los mismos cambios

en P-CREB, donde por inmunowestern blot se observó que el estrés crónico por restricción de

movimiento aumenta los niveles de P-CREB, efecto que no es prevenido por la administración

de DMI. Algo similar ocurre con el análisis histoquímico para P-CREB, en donde el aumento

más significativo se observó en aquellos animales sometidos a restricción de movimiento que

recibieron DMI. También se evaluó el efecto del estrés y de la DMI sobre la expresión de

marcadores asociados a la resiliencia celular, cuya regulación puede ser modulada por P-CREB

y GCs como lo son BCL-2 y BDNF. Se observó que el ARNm de BCL-2 disminuye por estrés

crónico, efecto que no es prevenido por la administración de DMI, sin embargo, en la condición

de estrés los niveles de la proteína BCL-2 son altos a pesar de la reducción de su transcrito. Este

último efecto es prevenido por DMI, lo que sugiere una compleja interacción entre el estrés, la

acción de la DMI y la regulación de la proteína de BCL-2 en el hipocampo de rata. También, el

ARNm de BDNF se reduce en todo el hipocampo por efecto del estrés, disminución que sólo es

prevenida por la DMI en la región CA3 del hipocampo. Todos estos cambios en BCL-2 y BDNF

no son concordantes con los cambios en P-CREB. Además, el tratamiento con HAL pareciera

indicar que a través de la modulación de otro sistema neurotransmisor si existiese una relación

entre los niveles de P-CREB, BCL-2 y BDNF, sin embargo este efecto es observado tanto en

animales controles sin estresar como en ratas sometidas a restricción de movimiento.

2.1.8. Determinación de cambios en el ARNm de TGF-β1 por hibridación in situ:

Se evaluó de qué manera el estrés crónico por restricción de movimiento y el tratamiento con

DMI pueden afectar la expresión del ARNm de TGF-β1 en el hipocampo de rata. En la Fig. 20

se aprecian microfotografías representativas de la HIS para el transcrito de TGF-β1 para las

distintas condiciones experimentales evaluadas. El análisis densitométrico correspondiente

(Fig. 21 A y B), se puede destacar que el ARNm de TGF-β1 disminuye significativamente en

todas las áreas del hipocampo por efecto del estrés crónico (Fig. 21 A y B), comparado con los

respectivos controles sin estresar. Este efecto es completamente prevenido por el tratamiento

79

crónico con DMI a animales sometidos a restricción de movimiento durante 14 días continuados

(Fig. 21 A), donde se puede observar que la señal de HIS para TGF-β1, es similar a la de

animales controles sin estresar y que es significativamente mayor a la de los animales estresados

inyectados sólo con la solución salina (Fig. 21 A). El tratamiento con DMI a animales sin

estresar no produjo cambios en la expresión del transcrito de TGF-β1. Por otra parte, el

tratamiento con HAL a animales estresados crónicamente y a controles sin estresar reduce

significativamente la señal del transcrito de TGF-β1 en todo el hipocampo (Fig. 21 B), no

pudiendo observar algún efecto de prevención de la reducción de esta marca como se observó

para el tratamiento crónico con DMI a animales estresados crónicamente.

80

Figura 20. Hibridación in situ para TGF-β1 en hipocampo de rata. Se muestran microfotografías representativas de cada condición experimental, tomadas con una magnificación de 2,5x. La barra negra representa 500µm. En la primera microfotografía hay un recuadro con un detalle de la señal de hibridación in situ correspondiente a una zona de la capa SupGD (40x). De cada animal se evaluaron los hipocampos de ambos hemisferios en 3 a 4 cortes para el análisis densitométrico. Todos los ensayos fueron realizados en forma simultánea.

81

CA1 CA3 SupGD InfGD0

15000

30000

45000Control+SAL ip.Control+DMI 10mg/kg ip.Restricción+SAL ip.Restricción+DMI 10mg/kg ip.

*

#

**

*

### #

##

Pixe

ls

CA1 CA3 SupGD InfGD0

15000

30000

45000Control+SAL ip.Control+HAL 50µg/kg sc.Restricción+SAL ip.Restricción+HAL 50µg/kg sc.

***

****

***

+++

+++

+ ++

+++

+++

+++

+++Pi

xels

Figura 21. El estrés crónico reduce los niveles del ARNm de TGF-β1 en todo el hipocampo, efecto que se previene por la DMI. En estas gráficas se muestra el patrón de expresión del transcrito de TGF-β1 en distintas regiones del hipocampo, obtenido por densitometría. (A) Resultados de una serie experimental en que se incluyó el tratamiento crónico con DMI en animales controles sin estresar y estresados por 14 días (* p<0,05 Control+SAL vs. Restricción+SAL; # p<0,05, ## p<0,01 y ### p<0,005 Restricción+SAL vs. Restricción+DMI) Los resultados corresponde al valor de la media de pixels ±EEM de un análisis de 3 a 4 cortes por animal. (B) Resultados de una serie experimental en que se incluyó el tratamiento crónico con HAL en animales controles sin estresar y estresados por 14 días. (** p<0,01 y *** p<0,005 Control+SAL vs. Restricción+SAL; + p<0,05, ++ p<0,01 y +++ p<0,005 Control+SAL vs. Control+HAL y vs. Restricción+HAL) Los resultados corresponde al valor de la media de pixels±EEM de un análisis de 3 a 4 cortes por animal. Análisis realizado con el test de ANOVA no paramétrico (Kurskal-Wallis). Control+SAL n=4 para cada serie exprimental; Control+DMI n=4; Control+HAL n=4; Restricción+SAL n=4 para cada serie experimental; Restricción+DMI n=4; Restricción+HAL n=4)

82

A pesar de la buena correlación entre los cambios conductuales observados y los cambios en la

expresión del ARNm de TGF-β1 en el hipocampo, por efecto del estrés y el tratamiento crónico

con DMI, no fue posible realizar un análisis inmunohistoquímico de este factor de crecimiento,

principalmente por que los anticuerpos disponibles (Santa Cruz, Santa Cruz, CA, EE UU y

Chemicon, Temecula, CA, EE UU) no fueron capaces de detectar la señal de la proteína de

TGF-β1.

Resulta interesante como los cambios en el ARNm de TGF-β1 se correlacionan con los cambios

conductuales en los diferentes grupos experimentales: en animales estresados donde el ARNm

de este factor de crecimiento presentó niveles significativamente menores que animales

controles sin estresar, hay una reducción en la capacidad de adquirir respuestas condicionadas,

fallan en escapar de estímulos nocivos, presentan desesperanza aprendida, y tienen una

reducción significativa en la preferencia a una solución endulzada como agua de bebida. Estos

efectos son prevenidos por el tratamiento crónico con DMI, incluyendo la reducción

significativa del transcrito de TGF-β1 a nivel hipocampal, sugiriendo que para el efecto de la

DMI es necesario niveles adecuados de TGF-β1.

Se ha descrito que la DMI es capaz de modular la expresión del ARNm de otras citoquinas como

TNF-α, cuya expresión en el Locus Ceruleus y el hipocampo disminuye por efecto del

tratamiento con DMI por 14 días (Ignatowski, T.A., y cols., 1997, Nickola, T.J., y cols., 2001,

Reynolds, J.L., y cols., 2004a, Reynolds, J.L., y cols., 2005a, Reynolds, J.L., y cols., 2004b,

2005b). También, el TNF-α puede alterar la liberación de NA desde el hipocampo. En animales

control inhibe la liberación de NA desde cortes de hipocampo, mientras que en animales no

estresados tratados crónicamente con DMI la liberación de NA en presencia de TNF-α es

potenciada, estos cambios ocurren probablemente modificando la actividad o la sensibilidad del

autoreceptor inhibitorio α2 (Ignatowski, T.A., y cols., 1997, Nickola, T.J., y cols., 2001,

Reynolds, J.L., y cols., 2004a, Reynolds, J.L., y cols., 2005a, Reynolds, J.L., y cols., 2004b,

2005b). En contraste, TGF-β1, es una citoquina clásicamente descrita como antiinflamatoria en

el sistema inmune (Cerwenka, A., y cols., 1999, Janeway, C., y cols., 2001), y que por lo tanto

antagoniza los procesos inflamatorios mediados por TNF-α (Janeway, C., y cols., 2001).

También el ARNm de TGF-β1 cambia su expresión hipocampal por efecto del estrés y por el

83

tratamiento crónico con DMI a animales estresados. Es por esto que se buscó establecer de qué

manera el estrés crónico y el tratamiento con DMI afectan la liberación de NA desde el

hipocampo, cómo las diferentes condiciones experimentales afectan la sensibilidad del receptor

α2, y si la presencia de TGF-β1 modifica la liberación de NA así como se ha descrito para

TNF-α.

3. Cambios en la sensibilidad del receptor α2 adrenérgico inducidos por estrés crónico:

Para evaluar la actividad del receptor α2 presináptico se estableció un ensayo de liberación de 3H

en estanco desde cortes de hipocampo recientemente cargados con 3H-NA. Para esto, fue

necesario establecer las condiciones para estimular la liberación de 3H al medio de incubación,

evaluar la dependencia de Ca2+ de esta liberación y la concentración de agentes farmacológicos

para evaluar la actividad del autoreceptor α2.

3.1. Efecto de la depolarización con K+ 25mM y dependencia de Ca2+ en la liberación 3H desde

cortes de hipocampo recientemente cargados con 3H-NA:

En la Fig. 22, se muestra el porcentaje de liberación fraccional de 3H de un ensayo de liberación

hipocampal con dos estímulos sucesivos de depolarización con K+ 25mM (Fig. 22 A), y un

ensayo de liberación en que en el segundo estímulo (E2) no se agregó Ca2+ al medio de

incubación y mas aun se agregó EGTA 1mM (Fig. 22 B). Esta última determinación se realizó

con el fin establecer si la liberación observada corresponde a mecanismos dependientes de Ca2+,

ya que el mecanismo de liberación de neurotransmisores presente en neuronas es dependiente de

éste catión bivalente (De Langen, C.D., y cols., 1980). Como se observa en la Fig. 22 A, el

hipocampo es capaz de liberar 3H en dos estímulos depolarizantes sucesivos. La concentración

de K+ 25mM se determinó en ensayos previos donde se evaluaron concentraciones de 12,5, 25 y

50 mM de K+ en cortes de hipocampo y de corteza, observándose que con la concentración más

baja de K+ no hubo liberación de 3H, mientras que con 50 mM de K+ la liberación fue muy alta,

que probablemente no permitirían observar los efectos de agonistas o antagonistas del receptor

α2 presináptico, por lo que se estableció que 25 mM sería la concentración de trabajo (resultados

no mostrados). En la Fig. 22 B se observa que el Ca2+ es importante para la liberación de 3H, ya

84

que la ausencia de este ion en el medio en conjunto con la presencia de EGTA 1mM como

agente quelador de Ca2+, reducen significativamente la liberación de 3H, lo que sugiere la

participación de mecanismos de liberación dependientes de Ca2+.

85

Figura 22. Liberación de 3H desde cortez de hipocampo recientemente cargados con 3H-NA, estimulada por depolarización con K+ 25mM en presencia y ausencia de Ca2+. En las gráficas se señala con una flecha el inicio de cada estímulo, y la barra negra señala el tiempo en que los tejidos estuvieron en presencia de un exceso de K+ (30s). También se destaca el área bajo la curva de cada estímulo menos el valor del promedio de las determinaciones basales A) % de liberación fraccional de 3H con dos estímulos sucesivos (E1 y E2) de K+ 25mM . B) % de liberación fraccional de 3H donde en el segundo estímulo (E2) no se agregó Ca2+ y además se agregó EGTA 1mM. La barra gris indica el período de tiempo en que se realizó el estímulo en ausencia de Ca2+. Todos los ensayos de liberación se realizaron en presencia de ácido ascórbico al 1% (Animales control sin manipular n=3).

86

3.2. Efecto de la depolarización con K+ 25mM y en la liberación de 3H desde cortes de

hipocampo recientemente cargados con 3H-NA en presencia de Yohimbina y Clonidina:

El utilizar dos estímulos con K+ 25mM permite estudiar el efecto de alguna sustancia o algún

fármaco en la liberación del neurotransmisor. La introducción de estos compuestos se puede

hacer en el segundo estímulo (E2), lo que deja al primer estímulo (E1) como referente de la

liberación de 3H frente a una depolarización con K+. De esta forma se procedió a evaluar el

efecto de agentes farmacológicos capaces de modular la actividad del receptor α2: Yohimbina

(Yoh) que actúa como antagonista del receptor α2, y Clonidina (Clo) que es un agonista de este

mismo receptor.

En la Fig. 23, se puede observar el efecto de Yoh 5µM (Fig. 23 A), y de la Clo 5µM (Fig. 23 B)

en la liberación fraccional de 3H desde cortes de hipocampo de animales controles sin manipular.

Estos fármacos se incluyeron en el medio de incubación desde los 3 lavados de 10min previos a

la liberación en el E2, y se mantuvieron presentes durante los 3,5min que dura el ensayo de

liberación (barra gris Figs. 23 A y B). En la Fig. 23 A, se puede apreciar que la presencia de la

Yoh 5µM, aumenta la liberación de 3H, cuando se compara el E2 con el E1, ya que al estar

bloqueada la señalización del autoreceptor α2, no hay inhibición de la liberación presináptica, y

por lo tanto es posible detectar una mayor cantidad de 3H liberada al medio. Por el contrario, la

presencia de Clo 5µM (Fig. 23 B) disminuye la liberación de 3H, al comparar el E2 con el E1, ya

que al estimular el receptor α2 presináptico, hay una disminución en la liberación de 3H al

medio.

87

Figura 23. Efectos de la Yoh 5µM y Clo 5µM en la liberación de 3H desde cortes de hipocampo recientemente cargados con 3H-NA por depolarización con K+ 25mM. En las gráficas se señala con una flecha el inicio de cada estímulo, y la barra negra señala el tiempo en que los tejidos estuvieron en presencia de un estímulo depolarizante con K+ (30s). También se destaca el área bajo la curva de cada estímulo menos el valor del promedio de las determinaciones basales A) % de liberación fraccional de 3H donde en el segundo estímulo (E2) se agregó Yoh 5µM. La barra gris indica el periodo de tiempo en que se realizó el estímulo en presencia de Yoh . B) % de liberación fraccional de 3H donde en el segundo estímulo (E2) se agregó Clo 5µM. La barra gris indica el periodo de tiempo en que se realizó el estímulo en presencia de Clo. Todos los ensayos de liberación se realizaron en presencia de ácido ascórbico al 1% (Animales control sin manipular n=3).

88

3.3. Relación entre las áreas bajo la curva de la liberación fraccional de cada condición

experimental:

Los valores de las áreas bajo la curva de cada estímulo (E1 y E2), calculados como el área

comprendida por el estímulo y sus correspondientes post-estímulos, menos el valor promedio de

las determinaciones basales, permiten establecer una comparación entre los distintos agentes

farmacológicos y las modificaciones realizadas en el E2. Para esto se calculó una razón entre los

valores de área bajo la curva de E2 y la de E1 (E2/E1). En la Fig. 24 se puede observar que

aunque los dos estímulos de K+ 25mM debieran haber entregado valores similares de áreas bajo

la curva, la razón E2/E1 de estos ensayos es un poco mayor a la unidad, por que en el E2 la

liberación fue levemente mayor que en el E1. La aplicación de Yoh 5µM en el segundo estímulo

produjo un aumento en la liberación de 3H, reflejado en un mayor valor en la razón E2/E1 para

esta condición experimental, lo que es concordante con el efecto de un antagonista del receptor

α2 presináptico. Por el contrario, al utilizar un agonista del receptor α2, como la Clo, se observó

una reducción en la liberación de 3H, que tiene su reflejo en un menor valor en la razón E2/E1

(Fig. 24) en comparación con la de la razón de dos estímulos de K+ 25mM. Finalmente la razón

de E2/E1 del ensayo en el que se removió el Ca2+ en E2, entrega un valor bastante más bajo, que

la razón E2/E1 donde se utilizó Clo 5µM. Este último resultado permite establecer que la

liberación de 3H es dependiente de Ca2+, como en los mecanismos de liberación presentes en

neuronas (De Langen, C.D., y cols., 1980, Forray, M.I., y cols., 1995).

89

25mM

+

25mM/K

+ K

Mµ

+Yohm 5

25mM

+

25mM/K

+K

Mµ

25mM+C

lon 5

+

25mM/K

+K

2+

Cas/

25mM

+

25mM/K

+ K

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5*

**

Raz

ón E

2/E1

Figura 24. La liberación de 3H desde cortes de hipocampo recientemente cargados con 3H-NA depende de Ca2+, y es sensible a agonistas y antagonistas del receptor α2. Se muestra el valor de la razón entre el área bajo curva de E2 y la de E1, en diferentes ensayos de liberación en que se incluyeron Yoh 5µM, Clo 5 µM y un ensayo en el que se removió el Ca2+ del medio de incubación. Los valores representan media de las razones E2/E1±EEM. Esta determinación se realizó con 3 animales controles sin manipulación previa, y para cada animal se realizaron cada una de las determinaciones indicadas en la gráfica. (*=p<0,05 al compararlos con K+ 25mM/K+ 25mM)

Establecidas las condiciones de la liberación de 3H desde cortes de hipocampo cargados con 3H-NA, tal como la dependencia de Ca2+, y las concentraciones de Yoh y Clo adecuadas para

observar los efectos descritos para estos fármacos, se evaluó si por efecto del estrés crónico por

restricción de movimiento y del tratamiento crónico con DMI hay cambios en la actividad del

receptor α2 presináptico. Además se estudió si el TGF-β1 agregado al medio de incubación es

capaz de ejercer algún efecto en la liberación de 3H.

90

3.4 Efecto de Yohimbina, Clonidina y TGF-β1 en la liberación 3H desde cortes de hipocampo

recientemente cargados con 3H-NA:

3.4.1. Liberación de 3H desde cortes de hipocampo de ratas control sin estresar recientemente

cargados con 3H-NA, y efecto de Yohimbina, Clonidina y TGF-β1:

Con el fin de establecer de qué manera el estrés crónico y el tratamiento con DMI afectan la

liberación de NA desde el hipocampo, la sensibilidad del receptor α2, y si la presencia de

TGF-β1 modifica la liberación de NA así como se ha descrito para otras citoquinas, es que se

realizó el ensayo de liberación de 3H en animales control sin estresar, a los que se les manipuló

diariamente, y se les inyectó una solución de salino ip. durante 14 días. En la Fig. 25, se puede

observar el patrón de liberación cuando se aplican dos estímulos con K+ 25mM (Fig. 25 A),

cuando en el E2 se agregó Yoh 5µM (Fig. 25 B), con Clo 5µM en el E2 (Fig. 25 C) y con

TGF-β1 en el medio de incubación del segundo estímulo (Fig. 25 D).

91

Figura 25. Liberación de 3H desde hipocampo de animales control sin estresar, recientemente cargados con 3H-NA. En cada gráfica se señala con una flecha el inicio de cada estímulo, y la barra negra señala el tiempo en que los tejidos estuvieron en presencia de un exceso de K+ (30s). También se destaca el área bajo la curva de cada estímulo menos el valor del promedio de las determinaciones basales, y además se indica el valor de esta área. (A) Ensayo de liberación con 2 estímulos de K+ 25mM. (B) Ensayo de liberación con Yoh 5µM en E2, la barra gris indica el periodo de tiempo en que los cortes estuvieron en presencia de la Yoh. (C) Ensayo de liberación con Clo 5µM en E2, la barra gris indica el periodo de tiempo en que los cortes estuvieron en presencia de la Clo. (D) Ensayo de liberación con TGF-β1 10ng/mL en E2, la barra gris indica el periodo de tiempo en que los cortes estuvieron en presencia de TGF-β1. (n=4 animales, y por cada animal se realizaron las 4 condiciones diferentes en forma simultanea)

El análisis de las razones de las áreas bajo la curva (Fig. 29 A) mostró que, los dos estímulos de

K+ 25mM son muy similares, entregando un valor de E2/E1 muy cercano a la unidad. También

se observa el efecto significativo de la Yoh y la Clo en la liberación de 3H, siendo el efecto de la

Yoh bastante mayor que el de la Clo para este grupo de animales. El TGF-β1 en el medio de

cultivo, disminuye la liberación de 3H (Fig. 29 A), disminución que es significativa al comparar

el valor de esta razón de este ensayo de liberación con la de los dos estímulos de K+ 25mM.

92

3.4.2. Liberación de 3H desde cortes de hipocampo cargados recientemente con 3H-NA, de

ratas control sin estresar tratadas crónicamente con Desipramina. Efecto de Yohimbina,

Clonidina y TGF-β1:

A continuación se estudió de qué manera el tratamiento crónico con DMI a animales controles

sin estresar, afecta la actividad del receptor α2 en el hipocampo de rata. En la Fig. 26, se puede

observar el patrón de liberación cuando se hacen dos estímulos con K+ 25mM (Fig. 26 A),

cuando en el E2 se agregó Yoh 5µM (Fig. 26 B), con Clo 5µM en el E2 (Fig. 26 C) y con

TGF-β1 0,4nM en el medio de incubación del segundo estímulo (Fig. 26 D)

93

Figura 26. Liberación de 3H desde cortes de hipocampo cargados con 3H-NA, de animales control tratados crónicamente con DMI. En cada gráfica se señala con una flecha el inicio de cada estímulo, y la barra negra señala el tiempo en que los tejidos estuvieron en presencia de un exceso de K+ (30s). También se destaca el área bajo la curva de cada estímulo menos el valor del promedio de las determinaciones basales, y además se indica el valor de esta área. (A) Ensayo de liberación con 2 estímulos de K+ 25mM. (B) Ensayo de liberación con Yoh 5µM en E2, la barra gris indica el periodo de tiempo en que los cortes estuvieron en presencia de la Yoh. (C) Ensayo de liberación con Clo 5µM en E2, la barra gris indica el periodo de tiempo en que los cortes estuvieron en presencia de la Clo. (D) Ensayo de liberación con TGF-β1 10ng/mL en E2, la barra gris indica el periodo de tiempo en que los cortes estuvieron en presencia de TGF-β1. (n=4 animales, y por cada animal se realizaron las 4 condiciones diferentes en forma simultanea)

Del análisis de las razones E2/E1 (Fig. 29 B) de cada ensayo de liberación se desprende que, al

igual que en los animales controles sin estresar y sin manipular, los dos estímulos solo con

K+ 25mM tienen áreas bajo la curva similares y que hacen que E2/E1 sea muy similar a la

unidad. También, se observa el efecto de la Yoh 5µM como antagonista α2, entregando un valor

de E2/E1 mayor que la de los estímulos solo con K+ 25mM, sin embargo, este efecto no es tan

grande como el observado en los animales control inyectados con una solución salino

94

(Fig. 29 A). Además se observa que la Clo 5µM en estos animales no tiene mayor efecto al

comparar el valor de E2/E1 con la razón del ensayo hecho solo con depolarización con

K+ 25mM. Por el contrario, TGF-β1 generó un aumento en el eflujo de 3H, que se refleja en una

E2/E1 significativamente mayor que la de los dos estímulos solo con K+ 25mM. Esta situación

es opuesta a la observada para animales control inyectados con vehículo, en donde se observó

que el TGF-β1 0,4nM producía una disminución en el eflujo de 3H.

3.4.3. Liberación de 3H desde cortes de hipocampo cargados recientemente con 3H-NA, de ratas

estresadas crónicamente, y efecto de Yohimbina, Clonidina y TGF-β1:

Evaluados los efectos de la administración crónica del antidepresivo DMI a animales control sin

estresar, se evaluó el efecto del estrés crónico por restricción de movimiento en la actividad del

receptor α2 hipocampal. En la Fig. 27, se puede observar el patrón de liberación cuando se hacen

dos estímulos con K+ 25mM (Fig. 27 A), cuando en el E2 se agregó Yoh 5µM (Fig. 27 B), con

Clo 5µM en el E2 (Fig. 27 C) y con TGF-β1 en el medio de incubación del segundo estímulo

(Fig. 27 D).

95

Figura 27. Liberación de 3H desde cortes de hipocampo cargados con 3H-NA, de animales estresados crónicamente. En cada gráfica se señala con una flecha el inicio de cada estímulo, y la barra negra señala el tiempo en que los tejidos estuvieron en presencia de un exceso de K+ (30s). También se destaca el área bajo la curva de cada estímulo menos el valor del promedio de las determinaciones basales, y además se indica el valor de esta área. (A) Ensayo de liberación con 2 estímulos de K+ 25mM. (B) Ensayo de liberación con Yoh 5µM en E2, la barra gris indica el periodo de tiempo en que los cortes estuvieron en presencia de la Yoh. (C) Ensayo de liberación con Clo 5µM en E2, la barra gris indica el periodo de tiempo en que los cortes estuvieron en presencia de la Clo. (D) Ensayo de liberación con TGF-β1 10ng/mL en E2, la barra gris indica el periodo de tiempo en que los cortes estuvieron en presencia de TGF-β1. (n=4 animales, y por cada animal se realizaron las 4 condiciones diferentes en forma simultanea)

El análisis de las razones de las áreas bajo la curva (Fig. 29 C), reveló que los dos estímulos con

K+ 25mM son de similar magnitud, entregando un valor de E2/E1 muy cercano a la unidad. La

Yoh 5µM tuvo un efecto muy leve sobre el eflujo de 3H, que generó un aumento no significativo

en el valor de E2/E1 en comparación con E2/E1 del ensayo con dos estímulos de K+ 25Mm. Por

el contrario, en estos animales estresados crónicamente, la Clo tuvo un efecto significativo, que

se refleja como una disminución en el valor de E2/E1, en comparación con la misma razón de

los ensayos con solo dos estímulos de K+ 25mM. Además, en este grupo de animales, la

96

presencia de TGF-β1 en el medio de incubación generó un aumento no significativo en el eflujo

de 3H, que genera un valor para E2/E1 mayor que la del ensayo con dos estímulos de K+.

Aunque aquí no hay un aumento significativo, el efecto de TGF-β1 en la liberación de 3H es

similar al observado en animales no estresados inyectados crónicamente con DMI (Fig. 29 B), y

por lo tanto opuesto a lo observado para animales controles sin estresar (Fig. 29 A)

3.4.4. Liberación de 3H desde cortes de hipocampo cargados recientemente con 3H-NA, de ratas

estresadas crónicamente tratadas con Desipramina, y efecto de Yohimbina, Clonidina y

TGF-β1:

Una vez evaluado el efecto del estrés crónico por restricción de movimiento en la actividad del

receptor α2 adrenérgico en el hipocampo de rata, se estudió el efecto del tratamiento crónico con

DMI a animales estresados durante 14 días continuos. En la Fig. 28, se puede observar el patrón

de liberación cuando se hacen dos estímulos con K+ 25mM (Fig. 28 A), cuando en el E2 se

incluyó Yoh 5µM (Fig. 28 B), con Clo 5µM en el E2 (Fig. 28 C) y con TGF-β1 en el medio de

incubación del segundo estímulo (Fig. 28 D).

97

Figura 28. Liberación de 3H desde cortes de hipocampo cargados con 3H-NA, de animales estresados crónicamente tratados con DMI. En cada gráfica se señala con una flecha el inicio de cada estímulo, y la barra negra señala el tiempo en que los tejidos estuvieron en presencia de un exceso de K+ (30s). También se destaca el área bajo la curva de cada estímulo menos el valor del promedio de las determinaciones basales, y además se indica el valor de esta área. (A) Ensayo de liberación con 2 estímulos de K+ 25mM. (B) Ensayo de liberación con Yoh 5µM en E2, la barra gris indica el periodo de tiempo en que los cortes estuvieron en presencia de la Yoh. (C) Ensayo de liberación con Clo 5µM en E2, la barra gris indica el periodo de tiempo en que los cortes estuvieron en presencia de la Clo. (D) Ensayo de liberación con TGF-β1 10ng/mL en E2, la barra gris indica el periodo de tiempo en que los cortes estuvieron en presencia de TGF-β1. (n=4 animales, y por cada animal se realizaron las 4 condiciones diferentes en forma simultanea)

El análisis de las razones de las áreas bajo la curva (Fig. 29 D) de cada ensayo de liberación

mostró que las magnitudes de los dos estímulos solo con K+ 25mM son similares, al entregar un

valor de E2/E1 muy cercano a la unidad. También es posible observar un efecto de la Yoh 5µM

en función de E2/E1, aunque el valor de esta razón no es significativamente mayor que la E2/E1

del ensayo con sólo dos estímulos con K+ 25mM. Además, también se observa un efecto

significativo de la Clo 5µM en comparación con la E2/E1 de la liberación de 3H-NA con sólo

dos estímulos de K+ 25mM. Finalmente, TGF-β1 0,4nM en el medio de incubación produce un

98

aumento en el eflujo de 3H, lo que se refleja como un aumento significativo de la E2/E1 de este

ensayo en comparación con la razón del ensayo donde soló se realizaron estímulos con K+

25mM. Este efecto es similar a lo observado en animales controles no estresados tratados

crónicamente con DMI (Fig. 29 B), y de alguna manera también es similar a lo que ocurre con

animales sometidos a estrés crónico y que sólo recibieron una inyección diaria de solución salina

(Fig. 29 C), aunque en esta última condición experimental, el aumento causado por la presencia

de TGF-β1 10ng/mL en el medio de incubación no fue significativo.

99

25mM

+

25mM/K

+K

Mµ

25mM +

Yoh 5

+

25mM/K

+K

Mµ

25mM +

Clo 5

+

25mM/K

+K

1β

25mM +

TGF-

+

25mM/K

+K

01234

*

* *

4.5

5.5

6.5

Raz

ón E

2/E1

25mM

+

25mM/K

+K

Mµ

25mM +

Yoh 5

+

25mM/K

+K

Mµ

25mM +

Clo 5

+

25mM/K

+K

1 β

25mM + TGF-

+

25mM/K

+K

0

1

2

3

4

**

Raz

ón E

2/E1

25mM

+

25mM/K

+K

Mµ

25mM +

Yoh 5

+

25mM/K

+K

Mµ

25mM +

Clo 5

+

25mM/K

+K

1β

25mM +

TGF-

+

25mM/K

+K

0

1

2

3

4

*

Raz

ón E

2/E1

25mM

+

25mM/K

+K

Mµ

25mM +

Yoh 5

+

25mM/K

+K

Mµ

25mM +

Clo 5

+

25mM/K

+K

1β

25mM +

TGF-

+

25mM/K

+K

0

1

2

3

4

*

*R

azón

E2/

E1

A B

C D

Control+SAL ip. Control+DMI ip.

Restricción+SAL ip. Restricción+DMI ip.

Figura 29. Razones E2/E1 de ensayos de liberación de 3H en animales control sin estresar, control tratados con DMI, estresados crónicamente, y estresados tratados con DMI. Se muestran los valores de la razones E2/E1, en los diferentes ensayos de liberación en que se incluyeron Yoh 5µM, Clo 5 µM y TGF-β1 10ng/mL en el medio de incubación. (A) Efecto de Yoh, Clo y TGF-β1 en el eflujo de 3H en animales Control+SAL. (B) Efecto de Yoh, Clo y TGF-β1 en en el eflujo de 3H en animales Control+DMI 10mg/kg ip. (C) Efecto de Yoh, Clo y TGF-β1 en en el eflujo de 3H en animales Restricción+SAL. (D) Efecto de Yoh, Clo y TGF-β1 en en el eflujo de 3H en animales Restricción+DMI 10mg/kg ip. Los valores representan media de las razones E2/E1±EEM. Esta determinación se realizó con 4 animales en cada condición experimental, y para cada animal se realizaron cada una de las determinaciones indicadas en la gráfica correspondiente y en forma simultanea. (*=p<0,05 al compararlos con K+ 25mM/K+ 25mM).

100

3.5. Bioactividad de TGF-β1. Desdiferenciación de fibroblastos a miofibroblastos:

Para evaluar si los efectos observados por acción del TGF-β1 sobre la liberación de 3H

corresponden un efecto de esta citoquina, se usó una alícuota del mismo TGF-β1 utilizado en

estos ensayos para transformar el fenotipo de fibroblastos neonatales cardíacos a miofibroblastos

(Soto, C., 2006). Para esto se agregó TGF-β1 0,2nM a un cultivo de fibroblastos. En la Fig. 30,

Se puede observar que los fibroblastos después de 84 h en cultivo, en medio al que se agregó

TGF-β1 0,2nM hay un cambio en la morfología de las células, observando células mas grandes,

de núcleos de mayor tamaño, y que abarcan mayor superficie que los fibroblastos del control

negativo. De acuerdo a la tinción de cristal violeta, estas células transformadas corresponden a

miofibroblastos (Soto, C., 2006), cuya principal función en el miocadio es la reparación tisular

(cicatrización) después de la injuria o daño tisular (Soto, C., 2006). Este efecto en la

transformación de fibroblastos a miofibroblastos confirma que el TGF-β1 utilizado en los

ensayos de liberación tiene efectos en otros sistemas biológicos, y que por lo tanto, los efectos de

esta citoquina observados en la liberación de 3H corresponden a la acción de TGF-β1.

Figura 30. Efecto de TGF-β1 en un cultivo de fibroblastos neonatales cardiacos. En estas microfotografías se muestra el efecto de TGF-β1 0,2nM sobre un cultivo primario de fibroblastos neonatales cardiacos. Se observa un cambio importante en la morfología celular por efecto de la citoquina en el medio de cultivo, lo que indica que los efectos observados en el eflujo de 3H desde cortes de hipocampo recientemente cargados con 3H-NA tras haber agregado TGF-β1 corresponden a efectos de este factor de crecimiento. Barra negra representa 100µm. Este ensayo fue realizado por Miguel Copaja, Raul Vivar y Francisca Mateluna en el laboratorio de Farmacoquímica del Dr. Guillermo Díaz-Araya, Facultad de Ciencias Químicas y Farmacéuticas. Universidad de Chile.

101

VI. Conclusiones:

El aplicar 2,5h diarias durante 14 días continuados de estrés por restricción de movimiento a

ratas macho induce una reducción en la ganancia del peso corporal y un aumento en los

niveles de GCs, en comparación con animales control sin estresar.

El tratamiento con DMI a animales estresados crónicamente previene parcialmente el

aumento en los niveles séricos de GCs e indujo una mayor reducción en la ganancia del peso

corporal.

El estrés crónico por restricción de movimiento indujo conductas similares a la depresión,

como disminución en la capacidad de adquisición de respuestas condicionadas, fallas en evitar

estímulos adversos, desesperanza aprendida y anhedonia, conductas que fueron prevenidas

específicamente por el antidepresivo DMI.

El tratamiento crónico con DMI a animales control, aumentó los niveles de ERK1/2 total en

hipocampo completo. También se observó un aumento significativo de estas proteínas por

efecto del estrés crónico por restricción de movimiento.

En el hipocampo completo de animales crónicamente estresados se observó un aumento en los

niveles de P-ERK1/2, comparado con los niveles hipocampales de las mismas proteínas en

animales control sin estresar. Este efecto fue prevenido por el tratamiento crónico con DMI a

ratas estresadas.

El estrés crónico aumentó los niveles de CREB total en hipocampo completo, efecto que no

fue alterado por el tratamiento crónico con DMI a animales estresados. Además el estrés

crónico aumentó los niveles de P-CREB en el hipocampo, efecto que tampoco fue prevenido

por el tratamiento con DMI en animales estresados.

No hubo cambios regionales de P-CREB en las distintas áreas del hipocampo por efecto del

estrés crónico. Mientras que el tratamiento con DMI a animales estresados produjo un

aumento de P-CREB en todas las regiones del hipocampo.

Los niveles del ARNm de BCL-2 se redujeron en todo el hipocampo por efecto del estrés

crónico, y esta disminución no es prevenida por el tratamiento crónico con DMI a animales

estresados.

En hipocampo total, el estrés crónico indujo un aumento en los niveles de la proteína BCL-2,

efecto que fue prevenido por el tratamiento con DMI en animales estresados crónicamente.

102

En las diferentes regiones del hipocampo, no se observaron diferencias en la

inmunoreactividad relativa de BCL-2 de animales estresados crónicamente y ratas control sin

estresar, sin embargo, el tratamiento crónico con DMI a ratas control sin estresar, y a animales

estresados, redujo significativamente la inmunoreactividad relativa de BCL-2 en todas las

regiones hipocampales estudiadas.

El estrés por restricción de movimiento, redujo los niveles hipocampales del ARNm de BDNF

en todas las regiones estudiadas del hipocampo. Este efecto fue prevenido por la

administración crónica de DMI a animales estresados, sólo en la región CA3 del hipocampo.

Los niveles del ARNm de TGF-β1 se redujeron en todas las regiones del hipocampo por

efecto del estrés crónico por restricción de movimiento, efecto que fue prevenido por el

tratamiento crónico con DMI a animales estresados en todo el hipocampo.

El tratamiento con HAL no indujo cambios en los niveles séricos de GCs, ni en animales

control sin estresar ni tampoco en animales estresados por restricción de movimiento. Además

indujo una reducción en la ganancia de peso corporal significativamente menor que la

observada para animales estresados crónicamente que no recibieron ningún tratamiento

farmacológico.

Las conductas similares a la depresión generadas por el estrés crónico, no fueron prevenidas

por el tratamiento crónico con HAL.

La administración de crónica de HAL, redujo la inmunoreactividad relativa de P-CREB en

todo el hipocampo, tanto de animales control sin estresar como de ratas sometidas a

restricción de movimiento.

El HAL redujo los niveles del transcrito de BCL-2 en todas las regiones hipocampales de

ratas control sin estresar, y animales sometidos a restricción de movimiento.

.El tratamiento crónico con HAL a animales estresados y no estresados disminuyó la

inmunoreactividad relativa de BCL-2, en todas las áreas del hipocampo.

La administración crónica de HAL redujo los niveles del ARNm de BDNF en todas las

regiones hipocampales de animales control, y estresados crónicamente.

El tratamiento con HAL redujo los niveles del transcrito de esta TGF-β1en todas las áreas

estudiadas del hipocampo de animales control y estresados.

La liberación de 3H desde cortes de hipocampo recientemente cargados con 3H-NA, de ratas

control es una liberación dependiente de Ca2+ y sensible a los efectos del antagonista del

autoreceptor presináptico α2 Yoh y también del agonista α2 Clo.

103

El tratamiento crónico con DMI a animales control sin estresar, reduce el efecto de la Yoh, en

comparación con animales control sin estresar que reciben sólo una inyección diaria de una

solución salina. También, el tratamiento crónico con DMI induce cambios en la sensibilidad

al agonista α2 Clo, el cual no es capaz de inhibir el eflujo hipocampal de 3H.

El estrés crónico por restricción de movimiento cambia la sensibilidad del autoreceptor α2,

haciendo que este sea sensible sólo a la acción del agonista Clo y no al antagonista Yoh en la

liberación de 3H desde cortes de hipocampo recientemente cargados con 3H-NA.

En animales estresados crónicamente, y tratados con DMI, se observa la misma sensibilidad a

Clo y Yoh que en animales estresados que sólo recibieron una inyección de vehículo, es decir,

hubo un efecto significativo del agonista α2 Clo, pero no un efecto significativo del

antagonista Yoh.

El TGF-β1 tiene efectos en la liberación 3H desde cortes de hipocampo recientemente

cargados con 3H-NA. En animales control sin estresar, TGF-β1 redujo el eflujo de 3H,

mientras que en animales control tratados crónicamente con DMI, la citoquina potenció la

liberación de 3H.

En ratas estresadas crónicamente, el TGF-β1 potenció la liberación de 3H. Este efecto también

se observó en animales estresados crónicamente y que fueron tratados con DMI.

El TGF-β1 utilizado en los ensayos de liberación de 3H, es capaz de cambiar el fenotipo de

fibroblastos cardiacos a miofibroblastos. De esta manera los efectos de la citoquina en la

liberación de 3H desde cortes de hipocampo recientemente cargados con 3H-NA corresponden

a la acción directa de TGF-β1.

104

VII. Discusión:

Uno de los principales sustratos de la acción de los antidepresivos pertinentes a esta tesis, es la

neurotransmisión noradrenérgica la cual se ha relacionado con procesos de plasticidad sináptica,

potenciación a largo plazo, y formación de memoria. Además se ha demostrado que la NA

induce la expresión de proteínas asociadas a plasticidad neuronal como moléculas de adhesión

celular, factores transcripcionales, cambios en neuritogénesis y diferenciación neuronal

(Laifenfeld, D., y cols., 2005, Laifenfeld, D., y cols., 2002). Se ha descrito que los antidepresivos

administrados en forma aguda ejercen cambios conductuales, y probablemente promueven

cambios rápidos en la expresión de ciertos genes dentro del SNC que puedan explicar estas

conductas (Cryan, J.F., y cols., 2002, Cryan, J.F., y cols., 2005, Duman, C.H., y cols., 2006,

Kodama, M., y cols., 2005). Sin embargo en pacientes con DM, los efectos de los antidepresivos

solo se manifiestan luego de semanas de tratamiento; por lo cual se ha sugerido que estos

fármacos ejercen efectos diferenciales a corto y a largo plazo. Es así que se ha descrito que los

antidepresivos ejercen efectos disímiles sobre la expresión del BDNF, la velocidad de descarga

de neuronas dopaminérgicas y la respuesta al miedo condicionado, dependiendo si la

administración es aguda o crónica (Burghardt, N.S., y cols., 2004, Khundakar, A.A., y cols.,

2006, Rodriguez-Landa, J.F., y cols., 2003). Por lo tanto es importante evaluar el efecto del

tratamiento crónico de un antidepresivo en animales estresados, emulando una condición de

depresión, y en controles de forma de determinar cambios tanto a nivel conductual como a nivel

de marcadores moleculares en estructuras como el hipocampo.

1. Respuestas fisiológicas asociadas al estrés crónico:

Las respuestas fisiológicas generadas por situaciones estresantes, permiten la adaptabilidad del

individuo a su entorno (Tsigos, C., y cols., 2002). Sin embargo, si estas situaciones de estrés

perduran en el tiempo, como en el estrés crónico, la capacidad fisiológica de adaptación del

individuo es sobrepasada (McEwen, B.S., y cols., 1995). Dentro de los efectores de la respuesta

al estrés, están los GCs, hormonas que se han asociado a los efectos patológicos del estrés

(McEwen, B.S., y cols., 1995). El estrés crónico por restricción de movimiento aumentó

significativamente los niveles séricos de GCs, posiblemente como una consecuencia de una

sobre estimulación del eje HHS generada por el estrés, similar a lo que se ha observado en

105

pacientes depresivos (Gold, P.W., y cols., 1995, Holsboer, F., 2001, Holsboer, F., y cols., 1986,

Holsboer, F., y cols., 1982, Holsboer, F., y cols., 1984). El alza en los GCs explicaría la menor

ganancia del peso corporal, apoyado en el hecho de que estas hormonas aumentan el

catabolismo. Se ha indicado que la administración crónica de CORT a ratas, reduce la ganancia

de peso corporal (Johnson, S.A., y cols., 2006). Por el contrario, la administración crónica de

DMI a animales control y estresados, redujo significativamente la ganancia de peso corporal.

Este efecto ya ha sido señalado por otros autores, aunque no se ha explicado el mecanismo por el

cuál esto ocurre (Izumi, J., y cols., 1997, Reynolds, J.L., y cols., 2004a, Reynolds, J.L., y cols.,

2004b, Shen, Y., y cols., 1999). Sin embargo, es factible que la DMI reduzca la ganancia de peso

por acción del fármaco a nivel sistémico, al aumentar los niveles de NA en tejidos. Es así que la

activación de receptores adrenérgicos en el hígado (α1 y β2) y en el músculo esquelético (β2)

incrementa la glicogenolisis (Hoffman, B., y cols., 2001), y a nivel del adipocito (β3) aumenta la

lipólisis (Hoffman, B., y cols., 2001); efectos que, en conjunto podrían explicar los cambios en la

ganancia de peso corporal inducidos por DMI. Hay que destacar que en experimentos similares a

los de esta tesis no se han observado una reducción en la ingesta de alimento (resultados no

mostrados) (Castañeda, P., 2006).

En este trabajo de tesis se observó que por el estrés crónico aumentaron los niveles de GCs,

cambio que no fue acompañado por alteraciones en el tamaño de la médula adrenal y contenido

de catecolaminas, lo que sugiere que no hubo cambios en la activación simpática, a diferencia de

otros modelos de estrés, como el estrés crónico variable, donde estos efectos aún se observan

luego de 21 días de estrés (Magarinos, A.M., y cols., 1995). No obstante, se debe considerar que

tras 14 días de estrés parte de los efectos a nivel simpático podrían haber revertido.

2. Efecto del estrés crónico por restricción de movimiento en conductas similares a la depresión

y efectos de la Desipramina:

El paradigma de estrés crónico, generó en ratas, conductas similares a la depresión, como

reducción en la adquisición de respuestas condicionadas, relacionado con la capacidad cognitiva

del animal; fallas en evitar activamente estímulos aversivos; aumento en la inmovilidad en la

prueba de natación forzada, que refleja una condición de desesperanza aprendida, y una

reducción en la preferencia por una solución azucarada como agua de bebida, que indica una

106

condición de anhedonia. Todas estas conductas son de utilidad clínica para el diagnostico de esta

psicopatología, siendo la anhedonia un síntoma fundamental en la depresión (APA, 1999).

Además estos cambios en conducta fueron prevenidos por un fármaco utilizado en la terapia para

le depresión.

2.1. El tratamiento con DMI mejora la adquisición de respuestas condicionadas en animales

estresados:

Se han señalado una serie de interacciones entre GCs, regulación del eje HHS y señalización por

NA en el SNC. Por ejemplo, las neuronas noradrenérgicas del Locus Ceruleus, proyectan sus

eferencias hacia el hipotálamo (Kiernan, J., 2000) donde participan en la regulación de la

liberación de CRH (Feuvrier, E., y cols., 1998). Hay que destacar que la actividad

noradrenérgica se ha relacionado con estados de alerta del animal (Berridge, C.W., y cols., 2003,

Kiernan, J., 2000), y procesos de consolidación de la memoria (Roozendaal, B., y cols., 2004).

Se ha descrito que en cultivos organotípicos de hipotálamo de rata, la liberación de CRH es

dependiente de NA (Feuvrier, E., y cols., 1998). Este neurotransmisor actuaría a través de

receptores α1 presentes en neuronas CRH, aumentando la liberación de CRH, el cual permite

activar al eje HHS como respuesta al estrés (Feuvrier, E., y cols., 1998), favoreciendo el estado

de alerta. En contraste, en un medio de cultivo libre de esteroides, la estimulación con NA inhibe

la liberación hipotalámica de CRH, efecto que fue prevenido al suplementar al medio con

CORT.(Feuvrier, E., y cols., 1998), sugieriendo que la regulación en la liberación de CRH es

independiente de la acción de los esteroides (Feuvrier, E., y cols., 1998). Estas evidencias

indican que en la retroalimentación negativa ejercida por GCs a nivel hipotalámico también

participa la neurotransmisión noradrenérgica (Feuvrier, E., y cols., 1998). Recientemente se ha

descrito que la activación del receptor β2-adrenérgico potencia la transactivación del GR

aumentando la afinidad de este receptor a su ligando, a través de la vía dependiente de la PI3K

en células HT22 (Schmidt, P., y cols., 2001).

Por otro lado los GCs modulan la función de receptores α y β adrenérgicos, dependiendo de la

concentración y de la duración en la exposición a este tipo de hormonas esteroidales (Duman,

R.S., y cols., 1989, Stone, E.A., y cols., 1986). Lo anterior evidencia una compleja interacción

107

entre la activación del GR y la neurotransmisión noradrenérgica en el SNC, cuya alteración

explicaría la disminuida capacidad cognitiva tras la aplicación del estrés.

La NA es necesaria para establecer la consolidación de la memoria de largo plazo (Roozendaal,

B., y cols., 2004). En ratones heterocigotos para la enzima tirosina hidroxilasa (Th +/-), y que

tienen una reducida neurotransmisión noradrenérgica, presentan una reducida capacidad para

adquirir respuestas condicionadas en la prueba de evitación activa (Kobayashi, K., y cols., 2000).

Consistente con esto, en esta tesis se determinó que el tratamiento con DMI previene las

conductas inducidas por estrés en la prueba de evitación activa. Es posible que este efecto ocurra

por un aumento en la NA permitiendo cambios que permitan el correcto funcionamiento del

sistema noradrenérgico, mejorando la generación de estados de alerta, el procesamiento de la

información sensorial (Berridge, C.W., y cols., 2003), y consolidación de la memoria

(Roozendaal, B., y cols., 2004). Los inhibidores de la recaptura de NA también afectan a la

neurotransmisión serotoninérgica, dado que los terminales nerviosos que se proyectan desde el

Rafe, tienen el receptor presináptico α2 cuya activación persistente permite la desensibilización

de este aumentando la liberación de 5-HT (Baldessarini, R., 2001, Glavin, G.B., 1985, Graeff,

F.G., y cols., 1996, Warsh, J., y cols., 1998). Este efecto mejoraría la respuesta de escape o pelea

(Graeff, F.G., y cols., 1996), y en conjunto optimiza los procesos de consolidación de memoria,

y conductas de escape.

Muchos de los cambios conductuales asociados al estrés se explican por alteraciones en los

niveles de de GCs. Se ha descrito que el tratamiento crónico con CORT a ratas, deteriora las

respuestas de evitación pasiva, ensayo en que los animales no son expuestos a estímulos

condicionantes (Bisagno, V., y cols., 2000). Además, la administración crónica de CORT reduce

los niveles de GR en estructuras del SNC (Bisagno, V., y cols., 2000), lo que sugiere que el

aumento en GCs inducido por el estrés crónico daría cuenta de la alteración en la capacidad de

aprendizaje de forma similar a lo que ocurre en pacientes depresivos (McEwen, B.S., y cols.,

1995).

Se ha descrito que la DMI aumenta la expresión de GR en el hipocampo (Frechilla, D., y cols.,

1998, McEwen, B.S., 2005, Nestler, E.J., y cols., 2002, Okugawa, G., y cols., 1999, Sapolsky,

R.M., 2001, Tsigos, C., y cols., 2002), restaurando y normalizando la retroalimentación negativa

108

del ejej HHS ejercida por los GCs a través de sus receptores (Frechilla, D., y cols., 1998,

Okugawa, G., y cols., 1999). En los animales estresados y tratados con DMI se observó una

disminución, aunque no significativa en comparación con ratas estresadas, de los niveles de GCs

aunque en valores similares a los controles. En la activación del eje HHS participan la CRH y la

arginina-vasopresina (AVP), ambos secretagogos de la ACTH (Dinan, T.G., y cols., 2005, Scott,

L.V., y cols., 1998, 2002). Se ha demostrado que el estrés crónico por inmovilización y el estrés

psicosocial en ratas, reduce la señalización por CRH y un aumenta la de AVP (Dinan, T.G., y

cols., 2005). La relevancia de este cambio está en que los GCs aumentan los niveles del ARNm

del receptor V3 de AVP y el acoplamiento de este receptor a su maquinaria de transducción de

señales (Aguilera, G., y cols., 2000, Dinan, T.G., y cols., 2005, Makino, S., y cols., 1995, Zhou,

J.N., y cols., 1996), sugiriendo que la regulación del eje HHS por AVP en condiciones de estrés

crónico perpetuaría un aumento sostenido en los niveles de GCs (Dinan, T.G., y cols., 2005).

Mas aun, la Fluoxetina, antidepresivo inhibidor de la recaptura de 5-HT, disminuye la liberación

hipotalámica de AVP en ratas sin estresar, mientras que la DMI no produce el mismo efecto

(Altemus, M., y cols., 1992). Es decir, el efecto sobre la liberación del AVP hipotalámico

dependería del tipo de antidepresivo usado.

2.2. El estrés crónico genera una condición de desesperanza aprendida: prueba de natación

forzada:

La prueba de natación forzada en roedores es ampliamente utilizada para evaluar potenciales

efectos agudos y crónicos de agentes antidepresivos (Cryan, J.F., y cols., 2005). En esta tesis se

demostró que el estrés crónico aumenta la conducta de inmovilidad en este ensayo lo que se

considera como una condición de desesperanza aprendida (Johnson, S.A., y cols., 2006, Kelliher,

P., y cols., 2003, Vazquez-Palacios, G., y cols., 2004). Más aún, este efecto se previno por la

administración crónica de DMI el que generó un aumento en la conducta de escalamiento. Este

resultado es concordante con otros estudios que indican que los inhibidores de la recaptura de

NA aumentan específicamente la conducta de escalamiento y no la de natación (Cryan, J.F., y

cols., 2002, Cryan, J.F., y cols., 2005), probablemente a través de mecanismos que impliquen

mejoras en los estados de alerta, procesamiento de la información sensorial, y también en la

respuesta de escape o pelea.

109

2.3. Los animales estresados tienen una reducida preferencia por una solución azucarada como

agua de bebida:

Se ha demostrado que la exposición de ratas o ratones a paradigmas de estrés crónico, causa una

reducción en las respuestas a recompensas, que generalmente son evaluadas como disminuciones

en el consumo o preferencia por una solución de sacarosa como agua de bebida (Bekris, S., y

cols., 2005). Para esta prueba se debe considerar que los animales anticipan el valor nutricional

de la solución endulzada dependiendo de la concentración de sacarosa utilizada, enmascarando

los efectos del estrés sobre la preferencia por la solución endulzada. Por esto, la palatabilidad de

la solución de sacarosa es importante para establecer los efectos del estrés crónico en la

preferencia por la bebida endulzada (Sclafani, A., 2002). Esto último se ve reforzado por el

hecho que al utilizar otro endulzante como la sacarina, no es observan los mismos resultados que

se obtienen si se emplea sacarosa (Bekris, S., y cols., 2005).

La conducta de anhedonia es un síntoma fundamental en el diagnóstico de la depresión en

clínica (APA, 1999), y además sirve como un criterio significativo para indicar que el modelo

animal utilizado en esta tesis tiene validez predictiva, para evidenciar cambios en conducta

inducidos por estrés y antidepresivos. En el presente trabajo, la preferencia por una solución de

sacarosa al 1% como agua de bebida se redujo significativamente a los 7 y 14 días de estrés, lo

que sugiere un comportamiento anhedónico inducido por estrés. Esta condición fue prevenida

por el tratamiento crónico con DMI a animales estresados. En contraste, el tratamiento crónico

con el antidepresivo a animales control sin estresar no mostró efectos en la preferencia por

sacarosa, sugiriendo que la acción de la DMI es específica para la condición de estrés crónico.

El hecho de que el modelo de estrés crónico por restricción de movimiento genere conductas

similares a la depresión y que estas sean prevenidas por un antidepresivo hace de este paradigma

de estrés un modelo animal de depresión que tiene validez predictiva, y además permite estudiar

cambios moleculares asociados a los efectos del estrés y del tratamiento con antidepresivos en

estructuras del SNC.

110

3. La Desipramina indujo cambios en marcadores asociados a la resiliencia celular y

neuroplasticidad en el hipocampo:

Los efectos inmediatos de la mayoría de los antidepresivos han sido bien caracterizados,

mostrando que involucran un aumento en la transmisión sináptica de NA y 5-HT, y cambios en

las cinéticas de los receptores noradrenérgicos y serotoninérgicos (Laifenfeld, D., y cols., 2005).

Sin embargo, solo recientemente se están describiendo las cascadas de señalización que se

activan por el tratamiento con antidepresivos y su posible relación con del efecto terapéutico de

estos fármacos (Laifenfeld, D., y cols., 2005).

Diversos estudios preclínicos han demostrado que diferentes modelos de estrés, agudo y crónico

(inmovilización, restricción de movimiento, estrés psicosocial, etc.), producen cambios

estructurales y funcionales en el cerebro, especialmente en estructuras del sistema límbico como

el hipocampo (Rosenbrock, H., y cols., 2005). Esta estructura participa en la regulación por

retroalimentación negativa de los GCs en el eje HHS (Nestler, E.J., y cols., 2002, Van Eekelen,

J.A., y cols., 1988), haciendo del hipocampo un blanco de acción de estas hormonas (Greiner,

M., y cols., 2001). También se ha mencionado que niveles elevados de GCs pueden afectar la

plasticidad neuronal y la resiliencia celular en el hipocampo. A modo de ejemplo, el estrés

crónico induce una reducción en habilidades cognitivas y una reducción en la arborización

dendrítica en neuronas piramidales de la región CA3 del hipocampo (Brown, E.S., y cols., 1999,

Magarinos, A.M., y cols., 1995, McEwen, B.S., 1999, 2005, Sapolsky, R.M., 1996a, b, Yehuda,

R., 1997). Todos estos cambios pueden relacionarse a modificaciones en la actividad del GR,

alterando la expresión génica de proteínas relacionada a la resiliencia y plasticidad neuronal. Los

cambios funcionales pueden deberse a variaciones en proteínas relacionadas a la plasticidad

sináptica como GAP-43, BDNF y sinaptofisina producida por GCs (Rosenbrock, H., y cols.,

2005). Esta evidencia lleva a establecer la importancia de estudiar los mecanismos moleculares

que subyacen a los diferentes procesos asociados a mantener la resiliencia celular en estructuras

como el hipocampo.

111

3.1. El estrés crónico aumenta el grado de fosforilación de las ERK1/2:

La inyección aguda de antidepresivos induce un aumento en la fosforilación de ERK1/2

(Valjent, E., y cols., 2004), probablemente mediado por la activación de receptores

serotoninérgicos y/o noradrenérgicos. En esta tesis se establecen por primera vez los efectos del

tratamiento crónico con DMI a animales estresados en los niveles hipocampales ERK1/2 y sus

formas fosforiladas. A través de inmunoblot se observó que el estrés crónico aumentó la

fosforilación de ERK1 y ERK2; efecto prevenido por el tratamiento con DMI a animales

estresados. Este resultado es concordante con los cambios conductuales, en el sentido que las

conductas similares a la depresión aparecen solo en animales sometidos a restricción de

movimiento. Este tipo de cambios en la fosforilación de P-ERK1 y P-ERK2 ha sido observado

en otros modelos animales de depresión y en individuos depresivos suicidas (Dwivedi, Y., y

cols., 2001, Einat, H., y cols., 2003, Kodama, M., y cols., 2005). Además, el aumento en

P-ERK1 y P-ERK2 se ha relacionado con conductas de desesperanza aprendida, observado

como una reducción en la inmovilidad en la prueba de natación forzada (Einat, H., y cols., 2003),

lo que sugiere que la activación por fosforilación de ERK1/2, se relaciona con el estado

depresivo, y mas aún, que los antidepresivos actuarían reduciendo o previniendo una mayor

fosforilación de estas proteínas. En este trabajo de tesis, la disminución en la fosforilación de

ERK1/2 puede ser una consecuencia de la acción de la DMI, a través del aumento en los niveles

de NA, que inducirían cambios en la densidad o sensibilidad de receptores noradrenérgicos (por

ejemplo, regulación hacia abajo) y de esta manera produciría cambios en la señalización por

fosforilación de ERK1/2. En este sentido, se encontró que el tratamiento crónico con DMI a

animales control sin estresar disminuyó los niveles de P-ERK2, al comparar con animales

control sin estresar. Hay que destacar que a través de este análisis no es posible establecer la

localización subcelular de estas proteínas, ya que cambios en la localización de estas pudieran

relacionarse con cambios en la actividad y conectividad neuronal en el hipocampo, lo que se

asociaría a los cambios conductuales. Estos resultados sugieren que el tratamiento crónico con

DMI induce cambios en la actividad de las ERK1/2, y en consecuencia cambios en la expresión

de otros genes.

La administración crónica de DMI produce un aumento en la masa de ERK1/2 independiente de

la condición de estrés del animal. Este resultado sugiere que en las vías de señalización

112

moduladas por antidepresivos existirían mecanismos por los cuales se inducen cambios en la

expresión y/o recambio de ERK1/2, que hasta ahora no han sido descritos. Este mecanismo da

cuenta del menor grado de fosforilación observado en el grupo de animales control tratados con

DMI. Además se observa que, a pesar de que por el estrés hay también un aumento en ERK1/2,

existe un aumento en la fosforilación, sugiriendo que por el estrés se activan vías aumentan la

fosforilación de ERK1/2. Además es posible que existan otros mecanismos de compensación,

como por ejemplo la activación de fosfatasas. Se ha descrito que la terapia electroconvulsiva en

ratas, utilizada como tratamiento en depresiones severas que no responden a los antidepresivos

(Altar, C.A., y cols., 2004), aumenta la expresión de fosfatasas de MAPK (MKPs) en el

hipocampo, que puedan estar dando cuenta de un término de la actividad de la señalización

mediada por P-ERK1 y P-ERK2 (Kodama, M., y cols., 2005). Estos efectos de la DMI pudieran

ser consecuencia de la acción directa del antidepresivo, sin mediar el bloqueo en la recaptura de

NA, ya que la DMI es capaz de promover cambios en la actividad de GR en células no

neuronales (fibroblastos de ratón) (Pariante, C.M., y cols., 1997).

3.2. CREB es modulado de manera diferente a la activación de ERK1/2 en las condiciones de

estrés crónico y tratamiento con DMI:

Se ha descrito que los antidepresivos inducen cambios en la actividad de ERK1/2 (Blendy, J.A.,

2006, D'Sa, C., y cols., 2002, Tardito, D., y cols., 2006), PKC (Mann, C.D., y cols., 1995),

quinasas activadas por calcio y quinasas activadas por AMPc (D'Sa, C., y cols., 2002), las cuales

permiten la activacion de factores transcripcionales como el CREB, permitiendo cambios en la

expresión génica como por ejemplo en la expresión de neurotrofinas y sus receptores

(Laifenfeld, D., y cols., 2005).

A través de inmunowestern blot, se observó que el estrés crónico de movimiento indujo un

aumento en P-CREB, como también en CREB total, cambios que se correlacionaron con un

aumento en el grado de fosforilación de las ERK1/2. En contraste a lo observado en P-ERK1/2,

el tratamiento crónico con DMI no previene el auemento en P-CREB. Con este tipo de análisis

es difícil evaluar cambios regionales de P-CREB en el hipocampo, por lo que se determinaron

cambios región-específicos de P-CREB a través de inmunohistoquímica. A través de este

análisis se observó que el estrés no modifica la inmunoreactividad relativa de P-CREB, mientras

113

que la administración crónica de DMI a animales estresados aumenta los niveles de P-CREB en

todas las regiones del hipocampo. En animales control tratados con DMI hubo un aumento

significativo de P-CREB pero solo en la capa CA3 del hipocampo. Estos resultados permiten

sugerir que la DMI es capaz de prevenir los efectos en el comportamiento inducidos por el estrés

crónico, independiente de los cambios en actividad de CREB. En concordancia con estos

resultados, se ha observado que los antidepresivos ejercen su acción, de acuerdo al ensayo de

natación forzada en ratones con una mutación en CREB que reduce su unión al elemento de

respuesta a AMPc (CRE) (Conti, A.C., y cols., 2002). Además, aunque hay muchos trabajos que

indican que el tratamiento con antidepresivos aumenta la fosforilación de CREB en el

hipocampo de animales de experimentación (Czeh, B., y cols., 2001, Nakagawa, S., y cols.,

2002, Nibuya, M., y cols., 1996, Tardito, D., y cols., 2006, Thome, J., y cols., 2000, Vaidya,

V.A., y cols., 2001), se ha descrito que el tratamiento crónico con antidepresivos no cambia los

niveles de P-CREB, y que por algunos procedimientos de estrés habría incluso una reducción

significativa de P-CREB (Laifenfeld, D., y cols., 2005). En este trabajo de tesis, el estrés crónico

no generó cambios en la marca inmunohistoquímica de P-CREB, lo que nuevamente no permite

establecer si hay o no participación de factor transcripcional en los mecanismos de estrés, ya que

estos resultados no concuerdan con los cambios conductuales observados por efecto del estrés.

3.3. BCL-2 cambia su expresión en condiciones donde la resiliencia celular se ve mas afectada:

La proteína BCL-2, tiene una serie de propiedades citoprotectoras (Prehn, J.H., y cols., 1994,

Zhu, Y., y cols., 2002), y cuya expresión en el hipocampo es modulada por GCs, principalmente

en las regiones CA1 y en el GD (Cardenas, S.P., y cols., 2002). El estrés reduce la expresión del

ARNm de BCL-2 en todo el hipocampo, sin embargo esta reducción en el transcrito no se

correlaciona con los cambios en la proteína. Estos resultados sugieren que ante una condición de

estrés, la activación de GR reprimiría de la transcripción del ARNm de BCL-2 y que de alguna

forma se modula la vida media de la proteína.

La expresión de BCL-2 se regula positivamente por P-CREB (Manji, H.K., y cols., 2001b) y

NFκB (Catz, S.D., y cols., 2001), y negativamente por GCs (Cardenas, S.P., y cols., 2002). La

menor expresión de BCL-2 observada en la condición de estrés no se puede explicar por

cambios en el estado de fosforilación de CREB, por lo que es factible que esta represión sea

114

producto de una menor actividad en factores transcripcionales que controlan la expresión de

BCL-2 producto del alza en los GCs. De hecho, estas hormonas reprimen la actividad de NFκB

en células del sistema inmune (Almawi, W.Y., y cols., 2002) factor transcripcional que regula

positivamente la expresión de BCL-2. Mas aun el efecto represor del estrés sobre la expresión

del BCL-2 no puede ser prevenida por el tratamiento con DMI. Se ha determinado que la

administración de clembuterol (Zhu, Y., y cols., 1999), un agonista β2-adrenérgico, induce la

expresión de BCL-2 en el hipocampo a las pocas horas de inyectado probablemente asociado al

aumento en la producción de AMPc y fosforilación de CREB. Sin embargo, por acción de la

DMI es probable que los receptores noradrenérgicos se hayan desensibilizado o bien

internalizado para compensar el aumento de la presencia de su ligando endógeno. Por lo tanto, el

aumento en la neurotransmisión noradrenérgica aguda o crónica induciría cambios diferenciales

en la expresión de BCL-2 en el hipocampo. No obstante, tras el estrés los niveles de proteína son

similares a la condición control en todas las áreas hipocampales, y en homogeneizado total de

hipocampo los niveles de BCL-2 fueron aun mayores que en los animales control. Considerando

estos resultados se puede sugerir que en el hipocampo, se produce un aumento en la vida media

de BCL-2 y/o en la eficiencia de la traducción durante el estrés, y la administración crónica del

DMI previene estos cambios que se traducen en reducción en los niveles de la proteína. Esto

sugiere que los antidepresivos, como la DMI, median su efecto a través de otros mecanismos,

que aun quedan por ser explorados, y que son independientes de cambios en la expresión de

BCL-2.

Hay que destacar que de acuerdo a los estados de fosforilación de ERK1/2 y CREB no se

correlacionan con los observados para BCL-2. Por lo tanto quedan por determinar las rutas

intracelulares por las que se regula la expresión de BCL-2 por el estrés y del tratamiento crónico

con antidepresivos, pudiendo ser este efecto independiente de la acción de la DMI sobre la

neurotransmisión noradrenérgica. De hecho la fluoxetina y la DMI, activan a la PKC (Mann,

C.D., y cols., 1995), efecto que está bien descrito para la DMI (Pepin, M.C., y cols., 1992a,

Pepin, M.C., y cols., 1992b). Además, en condiciones experimentales in vitro la DMI es capaz

de ejercer diferentes efectos en la transcripción de genes mediada por GR, dependiendo de

cambios en la concentración y el tiempo de exposición a dexametasona (Pariante, C.M., y cols.,

1997).

115

3.4. El ARNm total de BDNF se reduce por efecto del estrés crónico y la Desipramina previene

este efecto solo en la región CA3 del hipocampo:

El gen de BDFN es complejo, que tiene cuatro exones con diferentes regiones promotoras,

siendo el exón V que codifica para la proteína de BDNF completa (Aliaga, E., y cols., 1999,

Shieh, P.B., y cols., 1998). Se ha descrito que el transcrito que contiene al exón III y que es el

mas abundante en el hipocampo (Shieh, P.B., y cols., 1998) puede ser regulado por P-CREB

(Aliaga, E., y cols., 1999, Shieh, P.B., y cols., 1998). La disminución en los niveles de esta

neurotrofina se han relacionado con la depresión (Chen, A.C., y cols., 2001); en cambio el

tratamiento crónico con DMI aumenta la expresión de transcritos de BDNF que contienen a los

exones II y III, en cambio la administración aguda produce reducción región-específica en los

diferentes transcritos (Russo-Neustadt, A., y cols., 1999). Además, el BDNF inyectado en forma

aguda intrahipocampalmente ejerce acciones antidepresivas en la prueba de natación forzada

(Shirayama, Y., y cols., 2002). En estructuras límbicas, especialmente en el hipocampo, el

BDNF promueve procesos de arborización dendrítica en neuronas serotoninérgicas dañadas, y

aumenta la densidad de axones serotoninérgicos en la corteza cerebral (Lyons, W.E., y cols.,

1999). Además el estrés agudo de restricción de movimiento reduce la expresión del BDNF,

efecto prevenido por antidepresivos (Nibuya, M., y cols., 1995).

En esta tesis se demostró que el estrés reduce el transcrito de BDNF en todas las regiones

estudiadas del hipocampo; efecto prevenido por la DMI, solo en la región CA3 del hipocampo.

Hay que destacar que el oligonucleótido empleado aquí es complementario con el exon V, y por

lo tanto no es posible observar cambios diferenciales en los otros transcritos de esta neurotrofina.

La región CA3, se afecta por el estrés crónico por restricción de movimiento de 6h/día durante

21 días (Magarinos, A.M., y cols., 1995), reduciendo de manera significativa el largo de

dendritas y el número de puntos de ramificación en neuronas piramidales de esta región del

hipocampo (Magarinos, A.M., y cols., 1995). El tratamiento con antidepresivos previene estos

cambios morfológicos que son perjudiciales para la función hipocampal (Czeh, B., y cols., 2001,

van der Hart, M.G., y cols., 2002); permitiendo sugerir que en la región CA3 la DMI favorece la

funcionalidad de esta región del hipocampo, y por lo tanto la función de toda de esta estructura.

116

Como se menciona para los resultados obtenidos de la expresión de CREB y BCL-2, pareciera

que en este caso tampoco hubiera una corelación entre los cambios del comportamiento, el

efecto de la DMI y los cambios en el ARNm de BDNF.

3.5. Participación de otros factores de crecimiento en la resiliencia celular: participación del

TGF-β:

En este modelo animal que presenta conductas similares a la depresión, hubo diferentes efectos

en la expresión y actividad de los marcadores moleculares asociados a la resiliencia celular en el

hipocampo. Estos marcadores ya han sido relacionados a la depresión y la acción de los

antidepresivos en otros modelos; sin embargo no todos presentaron cambios de acuerdo a lo

observado en los estudios del comportamiento. Aunque esto pareciera contradecir lo descrito por

otros autores, los resultados del presente trabajo sugieren que en las respuestas adaptativas al

estrés crónico y los mecanismos de acción tras el tratamiento crónico con el antidepresivo

existiría la participación de otras estructuras anatómicas del SNC, otros sistemas fisiológicos y

otras rutas de señalización intracelular, que permitan explicar los cambios en el comportamiento.

Por ejemplo, existe evidencia que sugiere que los antidepresivos regulan la actividad del eje

HHS, mejorando la regulación por retroalimentación negativa por parte de los GCs, lo que a su

vez afectaría a varias estructuras del SNC incluyendo al hipocampo.

Recientemente ha habido interés en estudiar proteínas moduladoras del sistema inmune y su

relación con patologías del SNC (Dantzer, R., y cols., 2002, O'Brien, S.M., y cols., 2004). Estos

péptidos han sido involucrados en procesos de neuroplasticidad y/o neuroprotección en el SNC.

En relación a la depresión se ha observado que pacientes que están en tratamientos con

citoquinas, o tienen niveles séricos muy altos de citoquinas pro-inflamatorias, por efecto de

algún proceso infeccioso, presentan algunas conductas similares las de pacientes con depresión

(O'Brien, S.M., y cols., 2004). Adicionalmente, los antidepresivos son capaces de reducir la

razón IFNγ/IL-10 en cultivos de sangre completa de individuos sanos, lo que sugiere una

actividad inmunomodulatoria por parte de los antidepresivos (Maes, M., 2001, Maes, M., y cols.,

1999). Una importante proteína inmunomodulatoria presente en el hipocampo es TGF-β1

(Bravo, J.A., y cols., 2006, Flanders, K.C., y cols., 1995, Henrich-Noack, P., y cols., 1996,

Lehrmann, E., y cols., 1995, Nichols, N.R., y cols., 1991). Esta citoquina ha sido encontrada en

117

altas concentraciones en biopsias de pacientes con enfermedad de Parkinson (Mogi, M., y cols.,

1995), enfermedad de Alzheimer (Flanders, K.C., y cols., 1995) e infarto cerebral (Krupinski, J.,

y cols., 1996). También, la expresión de TGF-β1 se induce en el hipocampo después hipoxia,

isquemia y también tras traumas cerebrales e infecciones, todas condiciones relacionadas con

muerte celular (Henrich-Noack, P., y cols., 1996, Lehrmann, E., y cols., 1995, Nichols, N.R., y

cols., 1991). Estas observaciones han llevado a postular que TGF-β1 es un péptido relacionado

con deterioro neuronal, cuya expresión aumentada en respuesta a daño en el SNC es una

característica común con los factores neurotróficos clásicos. En acuerdo con esto, se ha

demostrado in vivo que TGF-β1 previene la degeneración neuronal inducida por hipoxia o daño

por exitoxicidad, y previene la muerte de neuronas CA1 hipocampales tras estos estímulos

(Henrich-Noack, P., y cols., 1996), lo que apoya un papel neuroprotector de esta citoquina en

SNC adulto. Más aun, TGF-β1 es capaz de inducir la expresión de BDNF y el receptor TrkB en

cultivos primarios de neuronas corticales (Sometani, A., y cols., 2001). También TGF-β1

protege contra la excitotoxicidad inducida por un aumento en la conductancia de Ca2+

dependiente de NMDA, evitando una entrada excesiva de Ca2+ a la célula y probablemente

induciendo la expresión de BCL-2 (Prehn, J.H., y cols., 1994). Además, la expresión de TGF-β1

en el hipocampo es reprimida por GCs, especialmente en el GD (Bravo, J.A., y cols., 2006). Los

resultados del presente trabajo muestran que el estrés crónico en ratas redujo el ARNm de

TGF-β1 en cada área hipocampal estudiada. Este efecto fue completamente prevenido por el

tratamiento con DMI a animales estresados. Este hallazgo permite postular a TGF-β1 como un

buen mediador de la acción de la DMI; aunque queda por determinar si en estos tratamientos

varían los niveles de las citoquina. Estudios recientes muestran que los pacientes depresivos

tienen niveles séricos de TGF-β1 más bajos que los individuos sanos. Estos niveles reducidos de

TGF-β1 se recuperan luego de 8 semanas de tratamiento con distintos antidepresivos (Myint,

A.M., y cols., 2005). Un posible mecanismo que explique el efecto de la DMI sobre TGF-β1

puede ser a través de la activación noradrenérgica, ya que se ha demostrado que la

administración de clembuterol en ratones, aumenta la expresión de TGF-β1 en el hipocampo

(Zhu, Y., y cols., 2001b). Por lo tanto, si DMI aumenta la disponibilidad de NA en el espacio

sináptico, este neurotransmisor actuaría sobre receptores β2 en el hipocampo y de esta forma se

induciría la expresión de TGF-β1 (Zhu, Y., y cols., 2001b). Este efecto que explicaría la acción

de la DMI sobre la expresión del ARNm de TGF-β1 de animales estresados y tratados

118

crónicamente con el antidepresivo, restaurando la citoprotección en el hipocampo, a través de un

aumento en la expresión de esta citoquina. No obstante no fue posible determinar los cambios en

la proteína TGF-β1 con los anticuerpos comercialmente disponibles (Santa Cruz, Santa Cruz,

CA, EE UU. Chemicon, Temecula, CA, EE UU), por lo tanto será necesario determinar si la

inyección intrahipocampal o la sobreexpresión región específica de esta citoquina produce

conductas antidepresivas, tal como se ha demostrado para el BDNF (Shirayama, Y., y cols.,

2002), y si además en esta acción el TGF-β1 señaliza a través de la vía de las SMAD y/o

ERK1/2. En otros trabajos, la activina βA, proteína miembro de la familia del TGF-β1, induce

efectos antidepresivos al ser inyectada en forma aguda en el hipocampo (Dow, A.L., y cols.,

2005). También su expresión en el hipocampo aumenta por terapia electroconvulsiva (Dow,

A.L., y cols., 2005). Sin embargo, no se observaron cambios en activina βA por el tratamiento

crónico con fluoxetina (Dow, A.L., y cols., 2005), aunque los niveles los niveles de SMAD2

fosforilada (P-SMAD2) aumentaron en la corteza prefrontal de ratas tratadas durante 21 días con

fluoxetina o DMI (Dow, A.L., y cols., 2005). Los cambios en P-SMAD2 también podrían ser

consecuencia del aumento del TGF-β1 por la administración de DMI. Esta información sugiere

que si el TGF-β1 estuviera en involucrado en los mecanismos de acción de los antidepresivos, la

vía de señalización intracelular involucraría a otros componentes distintos de la vía

ERK1/2-MAPK, como la vía de activación canónica de TGF-β1 mediada por las proteínas

SMADs, la que no estaría asociada a cambios en BCL-2. Además, la reducción en el ARNm de

BDNF en animales estresados es concomitante con la reducción en el transcrito de TGF-β1. Este

cambio podría estar sugiriendo algún tipo de interrelación entre citoquinas y neurotrofinas sobre

la base de que el TGF-β1 induce la expresión de BDNF y su receptor TrkB en cultivo primario

de neuronas corticales (Sometani, A., y cols., 2001). Esta inerrelación podría dar cuenta de los

cambios observados solo en la región CA3 del hipocampo.

3.6. El tratamiento con HAL no previene los efectos del estrés crónico:

En esta tesis el HAL fue utilizado para evaluar si los efectos de la DMI sobre la conducta y

marcadores de resiliencia y neuroplasticidad eran específicos para este antidepresivo. El HAL es

un antagonista de receptores D2 de dopamina (Baldessarini, R., y cols., 2001), y es utilizado en

el tratamiento de la esquizofrenia y trastornos psicóticos (Baldessarini, R., y cols., 2001). En el

119

hipocampo de rata, se ha descrito la presencia de receptores D2, principalmente hacia la región

mas dorsal del hipocampo (Closse, A., y cols., 1988, Grilli, M., y cols., 1988). La activación del

receptor D2 tiene efectos inhibitorios a través de proteína Gi, inhibiendo a enzimas como

adenilato ciclasa (Baldessarini, R., y cols., 2001), por lo que el HAL al antagonizar a este

receptor podría promover aumentos en los niveles de AMPc en circuitos neuronales regulados

por dopamina, y también en estructuras que presentan al receptor D2 como el hipocampo.

El tratamiento con HAL, redujo la ganancia de peso corporal independiente de las condiciones

de estrés; probablemente por una disminución en la movilidad del animal para alimentarse,

posibilidad no fue explorada durante este trabajo de tesis. En animales control sin estresar se

observó que el HAL redujo la adquisición de respuestas condicionadas sin mediar cambios en la

capacidad de escape de estimulos adversos, efecto que puede deberse a una deteriorada

capacidad motora inducida por este fármaco (Baldessarini, R., y cols., 2001). Esta sugerencia se

ve avalada por el aumento en el tiempo de inmovilidad observado en la prueba de natación

forzada. Esta situación ha sido descrita por otros autores (Aguilar, M.A., y cols., 2004, Reis,

F.L., y cols., 2004), aunque en ambos trabajos la administración del fármaco se realizó solo

minutos antes de la prueba.

Se ha indicado que el sistema dopaminergico a través del receptor D2 aumenta la adquisición de

respuestas condicionadas (Baldessarini, R., y cols., 2001). Por ejemplo, la administración aguda

de un agonista D2, como la apomorfina, es capaz de mejorar la adquisición de respuestas

condicionadas en ratas (Reis, F.L., y cols., 2004), mientras que la aplicación de antagonistas D2,

como el sulpiride o el HAL, disminuyen esta capacidad (Aguilar, M.A., y cols., 2004, Reis, F.L.,

y cols., 2004). Es posible que el HAL haya interrumpido el establecimiento de la asociación

entre la señal audible (estímulo condicionante) y el shock eléctrico (estímulo no condicionante),

ya que la dopamina se ha relacionado con procesos de aprendizaje asociativo (Stark, H., y cols.,

2000, Young, A.M., y cols., 1998), por lo que el HAL puede estar interfiriendo con este tipo de

aprendizaje asociativo.

El tratamiento crónico con HAL no altera la conducta hedonia en animales control, y tampoco

previene los efectos del estrés crónico. Los sistemas de neurotransmisión dopaminérgicos

participan en los mecanismos de recompensa, principalmente en la generación de conductas de

120

“querer algo” (“wanting”) mas que “gustar algo” (“liking”) (Berridge, K.C., 2006, Berridge,

K.C., y cols., 1998), por lo tanto fármacos como el HAL no afectan la conducta de hedonismo en

animales.

A nivel molecular, la administración crónica de HAL redujo significativamente la

inmunoreactividad de P-CREB, el ARNm de BCL-2 y su proteína, el ARNm de BDNF y

también el ARNm de TGF-β1, independiente de la condición de estrés. El efecto sobre BDNF ya

ha sido descrito en otros trabajos (Angelucci, F., y cols., 2004, Bai, O., y cols., 2003, Pillai, A., y

cols., 2006), no habiendo algun mecanismo que explique tal reducción. Mas aun este efecto se

ha asociado con una menor capacidad de aprendizaje espacial, tarea relacionada a la función

hipocampal (Terry, A.V., Jr., y cols., 2003). Es posible que la acción del HAL no necesariamente

corresponda al efecto directo de este fármaco sobre el hipocampo, si no más bien a un efecto

indirecto sobre alguna otra estructura, condición que afecte indirectamente al hipocampo. Esta

explicación podría aplicarse también a CREB, y en consecuencia se afectaría también la

expresión en BDNF y BCL-2. Estos resultados explicar los efectos colaterales del HAL en el

tratamiento de la esquizofrenia, como por ejemplo perdida de la capacidad cognitiva,

disminución en la señalización de vías asociadas a sobrevida neuronal y el aumento en la

apoptosis (Ukai, W., y cols., 2004).

Con respecto al efecto del HAL sobre la expresión del ARNm de TGF-β1, este resultado es la

primera descripción del efecto de este tipo de fármacos en la expresión de esta citoquina a nivel

del SNC. Hasta la fecha, existe solo un trabajo ha reportado los efectos de diferentes fármacos

antipsicóticos en la expresión de citoquinas (Szuster-Ciesielska, A., y cols., 2004). En ese

trabajo, se cultivaron células mononucleares de individuos sanos, las que se estimularon con

fitohemaglutinina en presencia de diferentes fármacos antipsicóticos incluidos el HAL. Tras 72h

de cultivo se observó que la presencia del HAL 1µM produjo un aumento en IL-10 y TGF-β1,

aunque no existe explicación de cómo este fármaco induce a estos mediadores del sistema

inmune (Szuster-Ciesielska, A., y cols., 2004). Por otra parte, la reducción de la señal del ARNm

de TGF-β1 podría deberse a un fenómeno similar al descrito para BDNF. Además, estos

resultados sugieren que TGF-β1 en el hipocampo sería importante para el adecuado desempeño

del animal en tareas que impliquen adquirir respuestas condicionadas, ya que los animales que

121

tienen niveles de ARNm de TGF-β1 reducidos (animales estresados y animales tratados con

HAL) son los que mostraron una capacidad disminuida en la adquisición de respuestas

condicionadas.

4. Estrés crónico, actividad del receptor α2 presináptico y efecto de la DMI:

La activación del receptor noradrenérgico presinaptico α2 inhibe la liberación de diversos

neurotransmisores (De Langen, C.D., y cols., 1979, Meyer, H., y cols., 2000). Por otro lado,

fármacos que inhiben la recaptura de NA regulan hacia abajo los receptores α2, favoreciendo aun

más la disponibilidad de NA en el espacio sináptico, y mejorando así el efecto del antidepresivo

(Warsh, J., y cols., 1998). Diferentes modelos animales de estrés (agudo y crónico) producen un

aumento en la liberación de NA en distintas estructuras del SNC (Corrodi, H., y cols., 1968,

Flugge, G., y cols., 1992, Tjurmina, O.A., y cols., 1999), efectos que se ven acompañados por

una reducción en densidad y sensibilidad del receptor presináptico α2 (Corrodi, H., y cols., 1968,

Flugge, G., y cols., 1992). Se descrito en otros animales de experimentación, como en Tupaia

belengeri, que la inyección aguda de cortisol es capaz de regular hacia abajo al receptor α2 en

distintas regiones del cerebro, mientras que la administración de cortisol en el agua de bebida

por 5 días regula hacia arriba la expresión de este mismo autoreceptor en casi todas las regiones

del cerebro analizadas (Flugge, G., 1999). A pesar del aumento en la liberación de NA que se

induce por el estrés, se logran observar conductas depresivas en los animales; probablemente a

que en el espacio sináptico no se obtienen las concentraciones de NA adecuadas y/o no ocurren

las adaptaciones neuroquímicas que se observan tras el tratamiento crónico con antidepresivos

necesarias para la correcta respuesta del individuo.

Los ensayos de liberación de esta tesis fueron realizados en ausencia de inhibidores de las MAO,

o inhibidores de la catecol-O-metil transferasa (COMT), enzimas que participan en la

terminación de la señalización por catecolaminas. También, hay que considerar que de la

radioactividad de 3H medida se desconoce el porcentaje relacionado a los metabolitos generados

por la actividad de la MAO y de la COMT y a la 3H-NA, por este motivo es que los resultados se

expresan como eflujo de 3H. Sin embargo, los cambios observados por efecto de la ausencia de

Ca2+, y por la presencia de Yoh y Clo en los medios de incubación sugiere que parte del eflujo de

122

3H corresponde a 3H-NA. Dado que el contenido de NA en el hipocampo es reducido, fue

imposible determinar los efectos agonistas y antagonistas del receptor α2 en la liberación

endogena de este neurotransmisor.

4.1. El tratamiento crónico con DMI a animales sin estresar cambia la sensibilidad del receptor

α2 presináptico:

La liberación de NA en cortes de hipocampo de ratas tratadas crónicamente con DMI no es

potenciada por antagonistas del receptor α2 (idazoxan o Yoh), lo que sugiere una

desensibilización del autoreceptor α2 por el antidepresivo (Nickola, T.J., y cols., 2001, Reynolds,

J.L., y cols., 2005a). Estos resultados concuerdan con los obtenidos en esta tesis, donde la Yoh

potencia el eflujo de 3H inducida por la depolarización por K+ desde cortes de hipocampo de

ratas controles cargados con 3H-NA; efecto que se ve reducido por el tratamiento crónico con

DMI. En apoyo a esta observación, un agonista del receptor α2 como la Clo, no inhibió el eflujo

de 3H. La desensibilización a agonistas α2 por efecto de la administración crónica de DMI ya ha

sido descrita por otros autores (Esteban, S., y cols., 1999). Hay que destacar que el tratamiento

con DMI produce aparentemente cambios en la afinidad del receptor α2 en forma diferencial

para agonistas y antagonistas. Esto puede deberse a que los receptores pueden existir en

diferentes estados conformacionales que puedan dar cuenta de una mayor unión hacia agonistas

y/o antagonistas (Ross, E., y cols., 2001). Por otro lado, se puede considerar que los receptores

pueden coexistir en conformaciones activas e inactivas; y si la forma inactiva es la que

predomina en ausencia de un fármaco, el efecto observado va a ser mínimo. Por otra parte, la

cantidad de efecto observable por acción de un fármaco va a depender de cómo este es capaz de

unirse con mayor afinidad relativa a la forma activa, y además desplazar el equilibrio hacia esta

conformación del receptor (Ross, E., y cols., 2001). Así, considerando las posibles

conformaciones del receptor, sería posible explicar por qué en ciertas condiciones, la activación

de un receptor por el agonista, puede preponderar con respecto a la acción de un antagonista.

En el caso de los animales sometidos a restricción de movimiento, el eflujo de 3H fue en

magnitud mayor a la de los animales control sin estresar. Este resultado es concordante con lo

descrito como efecto del estrés en la liberación de NA en el SNC de rata (Corrodi, H., y cols.,

123

1968, Tjurmina, O.A., y cols., 1999); pudiendo además este efecto ser explicado por la

contribución de los GCs. Un posible mecanismo de acción indirecta de los GCs sobre la

neurotransmisión noradrenérgica podría implicar la participación de otro neurotransmisor capaz

de estimular la liberación de NA en el hipocampo. En este sentido, el glutamato sería un buen

candidato, ya que se ha descrito que este aminoácido puede estimular la liberación de NA a nivel

hipocampal (Vizi, E.S., y cols., 1998). También se sabe que la neurotransmisión glutamatérgica

se ve aumentada por efecto de un aumento sostenido en los niveles de GCs (Gould, E., y cols.,

1999, Sapolsky, R.M., 1996a, 2000). Se ha descrito que la estimulación de receptores α1, y β

adrenérgicos, posiblemente ubicados en los somas de las neuronas piramidales CA1 y CA3 del

hipocampo son capaces de disminuir la liberación de glutamato (Vizi, E.S., y cols., 1998). Así, el

control inhibitorio de los receptores α y β adrenárgicos sobre la liberación del glutamato se

reduciría por una desensibilización de estos receptores noradrenérgicos. Este tipo de regulación

de la liberación de NA por glutamato se ha establecido para otras estructuras del SNC (Forray,

M.I., y cols., 1995). Estos antecedentes sugieren que para que exista una deficiencia en la

neurotransmisión noradrenérgica, no solo deben producirse cambios o alteraciones en los

receptores de este sistema en particular, si no que también la contribución de otros sistemas de

neurotransmisión pudieran estar subyaciendo a la pérdida de la regulación del sistema

noradrenérgico en el SNC.

Por efecto del estrés hubo una desensibilización del autoreceptor α2 solamente evidenciado por

la Yoh; en contraste la Clo aun fue capaz de disminuir el eflujo de 3H, probablemente por el

aumento en la NA en el espacio sináptico. Esto sugiere que existe una mayor afinidad del

receptor α2 por el agonista. Esta proposición se ve avalada por el hecho de que en distintas

regiones del cerebro de individuos depresivos suicidas se ha encontrado un aumento en el

número de sitios de unión para agonistas del receptor α2, y no así para antagonistas α2 (Callado,

L.F., y cols., 1998); sugiriendo que un un desplazamiento del equilibrio hacia las formas activas

del receptor (Ross, E., y cols., 2001). Por otro lado hay que destacar que tanto en animales no

estresados y tratados con DMI y ratas sometidas a estrés crónico, ocurrieron cambios en la

sensibilidad hacia un antagonista (Yoh) y un agonista (Clo) del receptor α2. Las diferencias en

este parámetro pueden deberse a la naturaleza con que ocurre un aumento en la disponibilidad de

NA. En animales control tratados con DMI, es posible considerar un aumento en la

124

disponibilidad de NA por efecto del bloqueo de la recaptura; mientras que en ratas estresadas

habría mayor disponibilidad de NA por efecto del estrés crónico, donde podrían participar la

interacción de otros sistemas (otros neurotransmisores, cambios en el metabolismo, efecto de

hormonas, etc.), que por un lado permitan explicar el aumento en la liberación de NA, y en

segundo lugar expliquen el cambio de conformación del receptor α2 hacia la forma mas afin por

el agonista. De esta forma, en un episodio de estrés con aumento en los niveles de GCs es

posible sugerir cambios en la densidad de receptores α2 presentes en el hipocampo de rata; y

además de la participación de otros sistemas asociados a la respuesta estrés permite modular o

generar algún mecanismo de compensación.

La administración crónica de DMI a animales estresados no produce efectos diferentes a los

observados en las ratas solamente estresadas, sobre el eflujo de 3H, frente a la adición de

agonistas y antagonistas del receptor α2. De esta manera se puede sugerir que el efecto de la

restricción crónica de movimiento, es más importante que la administración de DMI en el eflujo

de 3H, o bien que el efecto de otros componentes de la respuesta de estrés estén enmascarando

los efectos de la DMI en la regulación de la liberación de neurotransmisores moduladas por el

receptor α2.

4.2. El TGF-β1 es capaz de afectar el eflujo de 3H de cortes de hipocampo recientemente

cargados con 3H-NA:

El procedimiento de estrés crónico y el tratamiento crónico con DMI generaron una serie de

cambios en la expresión de marcadores asociados a la resiliencia celular en el hipocampo. Uno

de estos marcadores fue el ARNm de TGF-β1, cuyos niveles se redujeron por acción del estrés

en todo el hipocampo, efecto que fue prevenido por la acción de la DMI. Además estos cambios

en los niveles del ARNm de TGF-β1 fueron concomitantes a los cambios conductuales y a los

cambios en los niveles séricos de GCs en los diferentes grupos de experimentación. Por este

motivo, se evaluó el posible rol neuromodulador del TGF-β1 en la liberación de la NA en el

hipocampo a una concentración de 0,4nM que ha demostrado producir efectos biológicos como

la prevención de la excitotoxicidad del glutamato (Prehn, J.H., y cols., 1994), inducción de la

expresión de BCL-2, BDNF y TrkB en cultivos primario de neuronas (Prehn, J.H., y cols., 1994,

125

Sometani, A., y cols., 2001). Esta proposición se avala por los efectos de otra citoquina como el

TNF-α que modula la liberación hipocampal de NA en animales controles y tratados

crónicamente con DMI (14 días) (Ignatowski, T.A., y cols., 1997, Nickola, T.J., y cols., 2001,

Reynolds, J.L., y cols., 2004a, Reynolds, J.L., y cols., 2005a, Reynolds, J.L., y cols., 2004b,

2005b).

Se observó que la presencia del TGF-β1 por periodos cortos (3,5 min) en el medio de

incubación, produjo una inhibición significativa en el eflujo de 3H desde cortes hipocampales de

ratas controles, efecto de similar magnitud a lo observado por la acción de la Clo en este mismo

grupo experimental. Hay que destacar que hasta la fecha no se han reportado estudios sobre la

acción de TGF-β1 en la liberación de neurotransmisores en el SNC, y particularmente en el

hipocampo. El efecto inhibidor de esta citoquina en la liberación de 3H pueda estar mediado por

un efecto rápido sobre los influjos de Ca2+ (Prehn, J.H., y cols., 1994), aunque queda por

determinar el mecanismo por el cual ocurre.

En contraste, el efecto inhibidor del TGF-β1 se transformó en uno potenciador de la liberación

de 3H observado sólo por la administración crónica de DMI y el estrés crónico. Este fenómeno

podría asociarse a cambios en la actividad del receptor a TGF-β1 en función de cambios en la

maquinaria transduccional. Esta acción también puede explicarse en términos de variaciones en

el influjo de Ca2+, probablemente asociado a modificaciones en permeabilidades iónicas que

pueden regular la actividad de canales de Ca2+ regulados por voltaje. En este sentido parecen

jugar un rol importante flujos iónicos que regulan el grado de excitabilidad permitiendo una

regulación en la actividad de canales de Ca2+ dependientes de voltaje. Por ejemplo, los canales

de K+ rectificadores de corrientes de entrada (K+ inward rectifier, Kir), están ampliamente

expresados en el SNC, y modulan la excitabilidad celular favoreciendo la repolarización luego

de un potencial de acción (Chen, L., y cols., 2004, Cohen, N.A., y cols., 1996, Neusch, C., y

cols., 2003, Perillan, P.R., y cols., 2002, Perillan, P.R., y cols., 2000). En el hipocampo se han

detectado estos canales, especialmente de la familia Kir2.0, en neuronas y glias (Stonehouse,

A.H., y cols., 1999). Estos Kir2.0 se regulan por fosforilaciones que alteran la probabilidad de

apertura de dichos canales (Cohen, N.A., y cols., 1996, Perillan, P.R., y cols., 2002, Perillan,

P.R., y cols., 2000). Por ejemplo, el Kir2.3 presente en el hipocampo (Stonehouse, A.H., y cols.,

126

1999), su probabilidad de apertura, disminuye por fosforilación dependiente de PKC-δ (Perillan,

P.R., y cols., 2002, Perillan, P.R., y cols., 2000). En astrocitos en cultivo, TGF-β1 es capaz de

activar la PKC-δ, a través de mecanismos de transducción de señales asociados a su receptor

(Perillan, P.R., y cols., 2002). Este efecto rápido de TGF-β1 puede dar cuenta del mayor eflujo

de 3H inducido por despolarización (Perillan, P.R., y cols., 2002). En este sentido, queda por

explorar si el estrés crónico o los antidepresivos, afectan la actividad de los Kir (Cathala, L., y

cols., 1999, Quignard, J.F., y cols., 2003), particularmente Kir2,3, canal que además puede ser

rápidamente modulado por TGF-β1 (Perillan, P.R., y cols., 2002).

Queda por evaluar si el estrés crónico y/o los GCs afectan la actividad de los Kir en el

hipocampo; puesto que algunos de estos miembros pueden ser afectados por agonistas a GR

como dexametasona (Gallazzini, M., y cols., 2003), o bien por cambios circadianos (Yamashita,

T., y cols., 2003), variando la actividad de estos canales (Cathala, L., y cols., 1999, Quignard,

J.F., y cols., 2003). En este sentido queda por evaluar si los receptores de TGF-β1 modulan la

actividad de PKC-δ, y de esta manera cómo esta activación modula a Kir2.3 en el hipocampo

que establecería un mecanismo de acción presináptico para esta citoquina. También será

importante estudiar si los efectos de TGF-β1 son directos sobre las terminales noradrenérgicas u

otros sistemas, y además sobre las glias.

VIII. Proyecciones:

Los resultados obtenidos en esta tesis sugieren que el tratamiento crónico con antidepresivos,

como la DMI, ejercen cambios que se observan a largo plazo modificando los niveles de

proteínas asociadas a neuroplasticidad y resiliencia celular. Si bien es cierto que no se evaluaron

cambios por la administración aguda de DMI, será importante evaluar a futuro si las variaciones

en la expresión y niveles de proteínas ocurren en la misma dirección a lo observado tras el

tratamiento crónico. Esto permitirá establecer la dinámica de los cambios plásticos que ocurren a

nivel del SNC y más aún quedará por determinar si estos se requieren para permitir cambios

conductuales apropiados y necesarios para producir la mejoría clínica. Además debido a que el

estrés induce la expresión de BCL-2, proteína con reconocida acción antiapoptótica en el

hipocampo, se deberá determinar si los cambios observados se asocian o no a cambios en

127

procesos de muerte neuronal y si además participan otras proteínas neuroprotectoras cuya

expresión pueda ser modificada por el estrés o antidepresivos como respuestas compensatorias

frente a situaciones que inducen daño neuronal.

Uno de los aspectos relevantes de esta tesis fue el hallazgo de la modificación de la expresión de

TGF-β1 por el estrés, DMI y HAL; sugiriendo que esta citoquina puede ser modulada en forma

diferencial por antidepresivos y antipsicóticos. Queda por precisar si estos cambios ocurren en

otras areas del cerebro, con especial interes en aquellas estructuras que se alteran por la

depresión. También será importante establecer si dichos cambios dependen de la naturaleza del

antidepresivo utilizado. Más aún, para adjudicarle un rol a esta citoquina en los mecanismos de

acción de antidepresivos se deberá probar su acción como molécula antidepresiva en pruebas

conductuales que se validaron en esta tesis como evidencia de depresión animal. Tambien queda

por precisar si la reducción en la expresión de TGF-β1 por el estrés es capaz de inducir deterioro

neuronal en el hipocampo que se pueda asociar a cambios en la capacidad cognitiva trelacionada

a la estructura hipocampal. Además, y dado que TGF-β1 afecta el eflujo de 3H en cortes de

hipocampo cargados con 3H-NA, queda por evaluar si esta citoquina modula la liberación de

neurotransmisores a través de interacciones con el receptor α2 presináptico, de forma similar a lo

descrito para TNF-α. También se deberá evaluar la acción de esta citoquina a nivel de la

excitabilidad neuronal, para explicar los efectos a nivel de la liberación de neurotransmisores

que pudiese estar involucrada en el reestablecimiento de la función hipocampal.

También queda por evaluar cómo este factor de crecimiento altera otras vías de transducción,

que pudieran asociarse al efecto de una acción antidepresiva. De esta forma el efecto

inmunomodulatorio de los antidepresivos a nivel del SNC abre nuevas posibilidades al estudio

de la acción de los antidepresivos, así como también permitiría plantear nuevas estrategias

farmacológicas para el tratamiento de la depresión.

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