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PREVALENCIA DE Listeria monocytogenes EN QUESOS FRESCOS DISTRIBUIDOS EN BOGOTA D.C.
JANET PAOLA VERGARA RINCON
UNIVERSIDAD DE LOS ANDES FACULTAD DE CIENCIAS
PROGRAMA DE MICROBIOLOGIA OPCION DE MICROBIOLOGIA DE ALIMENTOS E INDUSTRIA
BOGOTA 2004
PREVALENCIA DE Listeria monocytogenes EN QUESOS FRESCOS DISTRIBUIDOS EN BOGOTA D.C.
JANET PAOLA VERGARA RINCON
TRABAJO DE MONOGRAFIA COMO REQUISITO PARCIAL PARA OPTAR AL TITULO DE OPCION EN MICROBIOLOGIA DE ALIMENTOS E INDUSTRIA
DIRECTORA MARIA CONSUELO VANEGAS
UNIVERSIDAD DE LOS ANDES FACULTAD DE CIENCIAS
DEPARTAMENTO DE CIENCIAS BIOLOGICAS PROGRAMA DE MICROBIOLOGIA
OPCION EN MICROBIOLOGIA DE ALIMENTOS BOGOTA
2004
NOTA DE ACEPTACION
MARIA CONSUELO VANEGAS Directora Trabajo de Monografía
Microbióloga. Laboratorio de Ecología Microbiana de Alimentos LEMA. Docente Departamento de Ciencias Biológicas
UNIANDES.
NOHORA DE SANCHEZ Coordinadora del programa de Microbiología
Microbióloga. Departamento de Ciencias Biológicas UNIANDES.
AGRADECIMIENTOS
A Dios y mis Padres por darme la compañía y el apoyo necesario para culminar una meta
más en mi vida. A mis hermanos, por ser mi motor de inspiración y por quien seguiré
buscando nuevos logros, Martha por tu amistad, Henry por tu sonrisa y Anayancy por tu
ternura. A Fabián de quien aprendí que las luchas y los sueños se cumplen en vida, a mis
primas y en general a toda mi familia, quienes siempre ocupan un lugar especial en mi
corazón.
A la Doctora María Consuelo Vanegas, quien con su apoyo y confianza, ha formado en mi
una mejor persona, mujer y futura profesional.
A la Doctora Johanna Rojas por sus consejos, enseñanzas y amistad.
A todos mis compañeros de aulas y cuitas, Adriana, Clemencia, Juan Camilo, Ingrid, Luis
Eduardo y Rogelio y demás personas que con su carisma y amistad han estado ahí, para ser
realidad este proyecto.
TABLA DE CONTENIDO
PAGINA 1. JUSTIFICACION 8
2. OBJETIVOS 2.1 GENERAL 9
2.2 ESPECIFICOS 9 3. MARCO TEORICO
3.1 GENERALIDADES SOBRE EL GÉNERO LISTERIA 10 3.2 Listeria monocytogenes
3.2.1 FISIOLOGIA 11 3.2.2 ECOLOGIA 13
3.3 LISTERIOSIS Y EPIDEMIOLOGIA 3.3.1 LISTERIOSIS HUMANA 13 3.3.2 LISTERIOSIS ANIMAL 16
3.3 DETECCION 17
4. MATERIALES Y METODOS 4.1 MUESTREO 20 4.2 MEDIOS DE CULTIVO 20
4.3 CEPAS 20 4.4 METODOLOGIA
4.4.1 ENRIQUECIMIENTO 21 4.4.2 AISLAMIENTO E IDENTIFICACION 21
DE L. monocytogenes
5. RESULTADOS 24
6. DISCUSION 28
7. BIBLIOGRAFIA 31
LISTA DE TABLAS Página
Tabla 1. Características que permiten diferenciar entre especies de Listeria spp. 10
Tabla 2. Serologia de las diferentes especies de Listeria. 11 Tabla 3. Reacciones Bioquímicas características
de Listeria monocytogenes. 12 Tabla 4. Resultados obtenidos del análisis de presencia
de Listeria monocytogenes y Listeria spp., según lugar de procedencia y tipo de queso analizado. 25
Tabla 5. Prevalencia de Listeria según tipo de queso 26
LISTA DE GRAFICAS Página
Grafica 1. Colonias características de Listeria monocytogenes en Agar Palcam y Agar Oxford 18 Grafica 2. Modificación del Método horizontal para la investigación
de Listeria monocytogenes PNT-AL- 023.1, basado en la
norma ISO 11290-1 (Diciembre 1997) 23
Grafica 3. Prueba de CAMP, para muestras de queso 24 Grafica 4. Prevalencia de Listeria según lugar de procedencia de las muestras 26 Grafica 5. Prevalencia de Listeria spp. y Listeria monocytogenes según tipo de queso analizado 26 Grafica 6. Morfología de microorganismos diferentes a Listeria
aislados en Agar Palcam. 27
8
1. JUSTIFICACION A pesar de los avances en el estudio de Listeria monocytogenes como agente etiológico de
listeriosis y del conocimiento de su alta mortalidad, a nivel mundial continúa siendo
pobremente entendida es por esto que algunos autores han planteado diferentes líneas de
interés de investigación que se deben abordar, para la seguridad alimenticia y reducir la
incidencia; entre estas líneas está el tener disponibles cepas de Listeria monocytogenes para
estudios serológicos, moleculares, epidemiológicos etc., y también establecer la frecuencia
de esta bacteria en alimentos; es por esto que se hace necesario que de igual manera que en
otras partes del mundo, en Colombia se recupere e identifiquen las cepas circulantes de
Listeria monocytogenes y otras especies de Listeria en alimentos, distribuidos en nuestro
medio como parte inicial y básica del conocimiento de esta bacteria, para continuar con
estudios más avanzados de este patógeno y su relación con alimentos, ya que teniendo
conocimiento de las cepas e identificando la magnitud del problema se contribuirá con
información para el desarrollo de programas de control y de calidad en la industria de
alimentos. Adicionalmente esta información también es importante para los organismos
estatales, debido a que los datos aportados en este trabajo complementarán las
investigaciones que ellos realizan y de esta manera se contribuya con el análisis de riesgos
en nuestro medio; es por esto que la realización de éste estudio, se justifica en la medida
que aportará información útil para la industria alimenticia, para salud pública y aumentará
el conocimiento sobre la microbiología de alimentos en nuestro medio.
9
2. OBJETIVOS 2.1 GENERAL
Determinar la prevalencia del genero Listeria spp y L. monocytogenes, en quesos de
fabricación artesanal, de la zona cundiboyacense, distribuidos en plazas de mercado en la
ciudad de Bogotá, D.C.
2.2 ESPECIFICOS
- Aislar e identificar Listeria monocytogenes a partir de diferentes tipos de queso.
- Determinar la prevalencia de Listeria spp. y Listeria monocytogenes en los tres
tipos de queso analizados distribuidos en 8 diferentes puntos de venta, en Bogotá
D.C.
- Comparar los dos medios de cultivo, Palcam y Oxford, para determinar cual de
estos es más eficiente en la recuperación de Listeria monocytogenes.
10
3. MARCO TEORICO
3.1 GENERALIDADES SOBRE EL GENERO Listeria
De acuerdo a la clasificación taxonómica de el manual de Bergey, en su novena edición, el
genero Listeria, comprende 8 especies, así: L. monocytogenes, L. innocua, L., welshimeri,
L. ivanovii, L. seeliger, L. denitrificans, L. grayi y L. murrayi. L. denitrificans (Invima,
Muñoz y Díaz 1998, Scheu), debido a sus diferencias morfológicas, bioquímicas y
serológicas, así como a estudios de ácidos nucleicos, ha sido considerada dentro de un
nuevo género Jonesia (Muñoz). La tabla 1 muestra las especies de Listeria reportadas, con
las características que permiten diferenciarlas1.
Tabla No. 1. Características que permiten diferenciar entre especies de Listeria spp.1
1 Anthony D. Hitchins, U.S. FDA Bacteriological Analytical Manual 8th Edition, Current through Revision A, 1998, Chapter 10: Listeria monocytogenes
11
Además de estas características, las cinco verdaderas especies de Listeria, poseen antígenos
que dan origen a 17 serovariedades (tabla 2), las cuales son muy importantes a nivel
epidemiológico.
Tabla No. 2. Serologia de las diferentes especies de Listeria 2 .
ESPECIES SEROTIPOS
L. monocytogenes 1/2ª, 1/2B, 1/2C, 3ª, 3B, 3C, 4A, 4AB, 4B, 4C, 4D, 4E, “7”
L. ivanovii 5
L. innocua 4AB, 6ª, 6B, Una
L. welshimeri 6ª, 6B
L. seeligeri 1/2B, 4C, 4D, 6B, Una
Una indefinido.
3.2 Listeria monocytogenes
3.2.1 FISIOLOGIA
Listeria monocytogenes es la única especie de este género que está directamente
relacionada con salud humana. Es una bacteria gram-positiva, pleomorfica, que ha sido
comúnmente caracterizada como un bacilo no esporulado, de 0.5 a2.0 micras de largo por
0.5 micras de grueso, es facultativa intracelular, su crecimiento optimo se produce en una
atmósfera de 5% de oxigeno y de 5-10% de dióxido de carbono (Muñoz y Díaz 1998), entre
– 4° C a 50° C aunque comúnmente es considerado psicrofilo (Nichols, Niemira, Payàn) y
causa diferentes enfermedades tanto en el hombre como en animales (Antoniollo,
Kathariou, Muñoz y Díaz 1998).
2 Muñoz Ana I., Díaz G., Listeriosis, Santa Fe de Bogotá, Invima, 1998, pagina 12
12
Además de las características anteriormente mencionadas, para la identificación de L.
monocytogenes en el laboratorio, es útil es uso de importantes pruebas bioquímicas que
permiten definir su metabolismo (Tabla 3).
Tabla No. 3. Reacciones Bioquímicas características de Listeria monocytogenes
REACCIONES BIOQUIMICAS RESULTADO Técnica de Henry Azul - Gris Catalasa Positivo Oxidasa Negativa Motilidad en forma de sombrilla (25 ° C) Positiva Producción de H2S Negativo Indol Negativo Reducción de nitratos Negativo Hidrólisis de la esculina Positivo Hidrólisis de la Gelatina Negativo Fermentación sin gas de : Glucosa Positivo Ramnosa Positivo Maltosa Positivo Fermentación de : Xilosa Negativo Manitol Negativo
La habilidad de Listeria monocytogenes para crecer en frío y el hecho de ser un patógeno
oportunista, le da a este patógeno gran importancia en alimentos refrigerados y alimentos
listos para en consumo, los cuales no se calientan, ni se cocinan para su consumo.
Adicionalmente, debido a sus características de alta resistencia a diversos factores adversos,
ha estado implicada en numerosos brotes alimenticios de alimentos refrigerados, con baja
actividad acuosa, con concentraciones altas de sal, pH ácido, afectando la inocuidad de los
alimentos y salud publica (Karatzas, Knuganti, Muñoz y Díaz 1998, Nogva),
13
3.2.2 ECOLOGIA
Se ha aislado de una gran variedad de ambientes incluyendo suelos, fuentes de agua, aguas
residuales, así como productos alimenticios de origen animal y vegetal. Ha logrado aislarse
de una gran variedad de alimentos crudos y procesados. Los reportes en alimentos de L.
monocytogenes alrededor del mundo están asociados principalmente con productos
cárnicos, derivados lácteos, productos marinos, frutas y vegetales (Carroll, Czuprynski,
Destro, Nogva, Waak). Listeria monocytogenes está ampliamente distribuida en la
naturaleza, en el suelo, en vegetales, en agua, es flora normal de animales como ganado
vacuno, cabras, etc., por lo que también ha sido aislada de materia fecal de estos animales,
así como del hombre.
De acuerdo a su presencia en alimentos listos para el consumo “ready to eat”, países
desarrollados como USA, han reglamentado que deben estar libres de Listeria
monocytogenes, es decir cero tolerancia en 50g de muestra analizada, de lo contrario debe
ser retirado del mercado. (Gombas, Muñoz y Díaz 1998, Nogva).
En nuestro país organismos como el ICONTEC, tienen normas para la detección de Listeria
monocytogenes en alimentos, sin embargo, no existen normas obligatorias en la cuales se
exija la ausencia de este microorganismo en alimentos de riesgo, como los productos
lácteos, cárnicos y pescados donde su incidencia ha sido mayor (Czuprynski, Delgado da
Silva, Silva, Vogel).
3.3 LISTERIOSIS Y EPIDEMIOLOGIA
3.3.1 LISTERIOSIS HUMANA
Listeria monocytogenes fue reconocido como patógeno humano por primera vez en 1929 y
desde 1983 es considerado un microorganismo oportunista que causa infecciones
alimentarias, principalmente por la ingestión de alimentos crudos (Delgado da Silva,
14
O’connor, Vogel) y epidemiológicamente, cada día es más importante debido a que se
detectan nuevos casos y brotes de listeriosis. Uno de los factores de patogenicidad de ésta
bacteria es la producción de la hemolisina Listeriolisina O (LLO), originando β- hemólisis
de los glóbulos rojos.
El 95 % de los aislamientos en humanos, corresponde a los serotipos 1/2a, 1/2b, 4b, sin
embargo las epidemias presentadas de listeriosis, en Estados Unidos y Europa, están
usualmente relacionados con el serotipo 4b. (Czuprynski, Mereghetti, Muñoz y Díaz 1998)
“La transmisión hombre a hombre no ha sido documentada excepto en los casos de
transmisión vertical madre-hijo y por contaminación nosocomial en la sala de recién
nacidos”3.
L. monocytogenes, debido a sus características como microorganismo facultativo, es capaz
de crecer en células mamíferas, incluyendo fagocitos, enterocitos y hepatocitos. Varios
genes se encuentran involucrados en la patogénesis de la bacteria (Listeriolisina O, dos
fosfolipasas y la proteína Act A) y están localizados en un grupo de genes definidos dentro
del cromosoma de la bacteria. Al ingerirse un producto que está contaminado por Listeria
monocytogenes, hay penetración de ésta en el enterocito y en las células M que cubren las
placas de Peyer, donde la bacteria además, se replica. Posteriormente hay diseminación a
órganos como el hígado y bazo. Una gran mayoría de las células que alcanzan el
hígado, son eliminadas por el sistema inmune del individuo (macrófagos), pero aquellas
que pueden sobrevivir, pueden infectar al sistema nervioso central, placenta y fetos.
Cuando L. monocytogenes se disemina por el sistema nervioso, puede ocasionar
enfermedades como la meningitis supurativa aguda y/o cerebritos focal o multifocal. El
periodo de incubación en adultos es de varias semanas y en neonatos, el periodo de
incubación es de 1 a 4 semanas después del nacimiento (Kathariou, Muñoz 1998).
3 Crespo M, Vélez J., Castañeda C.R., Hoyos F, López M, Salazar J., Aislamiento de Listeria monocytogenes en un hospital de tercer nivel, Fundación Valle del Lili, Cali. Colombia Médica, 1999.
15
Entre el 5 y 10% de la población mundial son portadores de la bacteria (Notermans). A
nivel mundial, los casos de listeriosis humana reportados son pocos, pero la mortalidad es
muy alta, cercana al 25% (Czuprynski, Gombas, Notermans, Stopforth),
epidemiológicamente cada día es más importante, debido a que se detectan nuevos casos y
brotes de listeriosis. Los niños, ancianos, pacientes inmunosuprimidos y mujeres
embarazadas se consideran el grupo de alto riesgo para desarrollar esta enfermedad
(Czuprynski, Mereghetti, Payàn, Vogel).
Los primeros brotes de listeriosis a nivel mundial fueron reportados a inicios de los años 80
en Nueva Escocia y Canadá, donde el alimento implicado fue ensalada de repollo
fertilizado con estiércol de ovejas infectadas con la bacteria, ocasionando la muerte a 18
personas. En 1983 fue reportado un brote en Boston (Massachusetts), donde 7 recién
nacidos y 42 adultos, se vieron involucrados, y de los cuales murieron 14 personas. Otros
brotes de gran importancia han sido reportados: en 1985 en California, 142 personas
resultaron afectadas por la ingesta de queso fresco tipo mexicano; 1986-1987 en Filadelfia
(Pennsylvania), hubo 36 casos reportados, de los cuales 16 terminaron en muerte de los
pacientes involucrados; y durante el periodo de 1983 a 1993 en Europa se registraron
múltiples casos en países como Suiza con 122 casos, Reino Unido registro 2 casos
esporádicos, en mujeres embarazadas, en las cuales se produjo aborto, y con queso y pollo
como los alimentos directamente implicados; en Francia en 1992 se reportaron 279 casos
antes de culminar el año y en 1993 carnes de cerdo ocasionaron 25 casos de listeriosis
(Muñoz y Díaz 1998). Datos epidemiológicos obtenidos en estudios por el CDC (Center
Disease Control of USA) indican que entre 1998 y 1999, L. monocytogenes ha causado un
estimado de 2500 casos de meningitis como encefalitis, muerte fetal, entre otros, dejando
cerca de 500 muertes en USA anualmente (Czuprynski, Gombas, Mereghetti, Muñoz y
Díaz 1998)
En Colombia, desde 1993 se han reportando casos de listeriosis en neonatos y se ha
presentado cada vez mas frecuente esta infección en pacientes inmunosuprimidos, por lo
cual hace pensar que la listeriosis debe contemplarse como una infección de consideración
16
en nuestro país (Muñoz y Díaz 1998). En un hospital del Valle del Cauca, se realizó un
estudio, donde en un total de 19 casos confirmados bacteriológicamente 10 se presentaron
en adultos inmunosuprimidos, 2 en mujeres embarazadas, 6 en neonatos y una adolescente
(Crespo).
En estudios en alimentos se ha encontrado una incidencia de 34% en leches crudas y 3% en
leches pasteurizadas específicamente en la región cundiboyancense. Otro estudio realizado
en el Departamento de Antioquía, en 172 muestras procesadas, determinó una prevalencia
de L. monocytogenes de 33.1% en una amplia variedad de quesos blancos (Díaz. G. y A.
Muñoz. 1994-1998)
La listeriosis tiene un período de incubación extremadamente variable. En grandes brotes,
ha oscilado entre tres y 70 días. Sin embargo, los síntomas generalmente aparecen en el
plazo de un mes (New York State Department of Health). Puede estar acompañada de
meningitis, mortinato, aborto, septicemia y en algunos casos encefalitis, a pesar de que
puede ser tratada con antibióticos como la ampicilina, carbenicilina, cefaloridina,
cloramfenicol, eritromicina, furazolidina, neomicina, novobiocina, oleandomicina,
azlocilina, meticilina (Payán), no siempre se curan los pacientes debido a que tiene una alta
mortalidad, cercana al 25% según los estudios epidemiológicos realizados en diferentes
partes del mundo, además se debe tener en cuenta que Listeria monocytogenes es resistente
a sulfato de colistina, ácido nalidixico, polimixina B y sulfonamidas (Payàn).
3.3.2 LISTERIOSIS ANIMAL
La listeriosis animal, es más común en animales adultos que en los pequeños (GoatWorld),
suele ser reportada como una zoonosis, puede atacar ganado ovino, vacuno y equino, ratas,
ratones, animales salvajes y domésticos (Zellen).
Entre la sintomatología presentada por los animales atacados por la bacteria, se observa,
perdida de peso, diarrea, prolapso rectal y eventualmente síntomas neurológicos como
17
convulsiones (Zellen). Al igual que la listeriosis humana, puede ser tratada con mezclas de
antibióticos, teniendo en cuenta el estado de la enfermedad en el animal (GoatWorld).
De acuerdo a diversos estudios, la listeriosis animal se clasifica así (Muñoz):
• Infección de la gravidez con el subsecuente aborto, mortinatos o muerte neonatal.
• Infecciones viscerales o septicemias
• Encefalitis en rumiantes.
• Mastitis bovina
• Infecciones mixtas
• Septicemia en aves de corral.
3.4 DETECCION
Los métodos de microbiología utilizados para la identificación han sido muy útiles, ya que
se utilizan medios de cultivo altamente selectivos, fundamentalmente por el alto contenido
de antibióticos y de sustancias bactericidas. La detección de L. monocytogenes se realiza
por métodos tradicionales de laboratorio reconocidos por organizaciones como FDA (Food
and Drug Administration of USA), AOAC (Association of Oficial Analytical Chemist),
IDF-FIL (International Dairy Federation), USDA (United States Department of
Agriculture) e ISO (International Estándar Organization) (Ministerio de Salud, INVIMA).
“Aun no es posible recomendar un solo método para el aislamiento y la identificación de L.
monocytogenes que sea completamente satisfactorio para todos los alimentos. Los métodos
que se utilizan son en esencia similares en principio...”4
En cada uno de estos casos, la detección de Listeria monocytogenes, involucra varias
etapas, enriquecimiento selectivo, siembra en placa en medios de cultivo selectivos,
identificación por pruebas bioquímicas, serología y tipificación por bacteriófagos.
4 Muñoz Ana I., Díaz G., Listeriosis, Santa Fe de Bogotá, Invima, 1998, pg. 31
18
En general las técnicas utilizadas por la microbiología clásica, consisten en tomar 25g o mL
de muestra y llevarlos a 225 mL, de caldo de enriquecimiento para Listeria (LEB), que es
incubado a 30ª C +/- 2, durante 24-48 horas. Luego de este enriquecimiento, se transfiere
una asada del cultivo a placas con medio de cultivo Oxford y Palcam (Grafica 1), por
aislamiento, incubándoles por 24-48 horas a 35ª C + 2. Se toman colonias típicas de las
placas, en agar Oxford son de color verde oliva con halo negro, por hidrólisis de la
esculina. En agar Palcam son de color verde grisáceo con halo marrón negro sobre un fondo
rojo cereza, nuevamente por la hidrólisis de la esculina y una no fermentación del manitol
(Muñoz y Díaz 1998, Nannapaneni).
Grafica No. 1. Colonias características de Listeria monocytogenes en Agar Palcam y Agar Oxford
La identificación de Listeria suele utilizar dos etapas, en la primera de ellas se usan pruebas
bioquímicas. Inicialmente se realiza purificación de las colonias en agar triptosa ácido
nalidixico (ATN), se incuban a 35 ° C +/- 2 por 18-24 horas al cabo de las cuales se
observa con el método de iluminación de Henry, a contraluz o con estereoscopio, donde las
colonias de L. monocytogenes, exhiben un borde nítido, de superficie azulada. Así mismo
se realiza prueba de Catalasa que debe ser positiva para L. monocytogenes, tinción de
Gram., motilidad, fermentación de carbohidratos (xilosa, ramnosa y manitol). Además de
estas pruebas, se utiliza la prueba de CAMP, cuyo objetivo es determinar la presencia de
hemolisinas por parte de la bacteria, esta prueba consiste en colocar una colonia sospechosa
19
de Listeria, en agar tripticasa soya con 5% de sangre de cordero, en línea paralela y
horizontal con cepas control positivo y negativo (L. monocytogenes (+) con S. aureus), L.
ivanovii (+ con R. equi) y L. innocua (sin hemólisis) que están perpendiculares a dos
líneas verticales, una de una cepa certificada de S. aureus y R. equi. (Muñoz y Díaz 1998).
La segunda etapa de identificación consiste en pruebas serologicas, que permiten
corroborar al organismo como agente etiológico de enfermedad, para ello son
serotipificados con sueros tipo 1, tipo 4 (Kathariou, Muñoz y Díaz 1998).
Los protocolos de aislamientos que se han utilizado en general son eficientes; sin embargo
los medios son costosos y los protocolos pueden tomar hasta 14 días, razón por la cual se
ha optado en muchos casos en realizar análisis de biología molecular con el fin de obtener
mayor confiabilidad y rapidez en los resultados. Entre varios estudios realizados por
diversos autores, para la detección de L. monocytogenes en alimentos, se pueden anotar, la
serotipificacion por anticuerpos monoclonales, (Nannapaneni), PCR-ELISA (Scheu),
Pulsed Electric Field (Lado), Ribotipificaciòn y Electroforesis enzimática multilocus
(Waak).
20
4. MATERIALES Y METODOS 4.1 MUESTREO Durante un período de 3 meses, se colectaron 152 muestras de tres (3) diferentes tipos de
quesos blandos, campesino, doble crema y Paipa, de fabricación artesanal, para la detección
de Listeria monocytogenes. Dichas muestras fueron tomadas de ocho (8) diferentes plazas
de mercado de Bogotá.
4.2 MEDIOS DE CULTIVO
1. Agar nutritivo (AN; Oxoid Ltda., Basingtoke, Hampshire, England. 2. Listeria Caldo Base de Enriquecimiento (Oxoid LTD., Basingstonke, Hampshire,
England; UVM-I y suplemento SR142E) 3. Agar Base PALCAM (Oxoid, LTD., Basingstonke, Hampshire, England y
suplemento SR150E) 4. Agar OXFORD (Oxiod, LTD., Basingstonke, Hampshire, England y suplemento
SR140E) 5. Carbohidratos (ramnosa, xylosa y manitol) 6. Agar Motilidad 7. Agar sangre de cordero 5%
4.3 CEPAS
• Listeria monocytogenes ATCC 7644 • Listeria innocua ATCC 73016 • Listeria ivannovi ATCC 19119.
21
• Sthaphylococccus aureus ATCC 25923
• Rhodococcus equi,
4.4 METODOLOGIA
Las muestras fueron tomadas de diferentes plazas de mercado de Bogotá y analizadas por
una modificación de la metodología descrita por el método horizontal para la investigación
de Listeria monocytogenes PNT-AL- 023.1, basado en la norma ISO 11290-1 (Diciembre
1997) (Vandevenne) así (figura 1):
4.4.1 Enriquecimiento: se pesaron 10 gramos de queso y se transfirieron a 90 ml de
Listeria Caldo Base de Enriquecimiento (Oxoid LTD., Basingstonke,
Hampshire, England; UVM-I y suplemento SR142E), homogenizadas y
posteriormente incubadas inicialmente por 48 horas y luego por 7 días más
según resultado de el aislamiento a 30° C.
4.4.2 Aislamiento e identificación de Listeria spp.: a partir del enriquecimiento, se
realizó siembra por aislamiento de cada una de las muestras en Agar Base
PALCAM (Oxoid, LTD., Basingstonke, Hampshire, England y suplemento
SR150E) y Agar OXFORD (Oxoid, LTD., Basingstonke, Hampshire, England
y suplemento SR140E) se incubo por 24 y 48 horas a 37° C. Las colonias
sospechosas en agar Palcam, fueron observadas como colonias pequeñas, de
color verde oliva, centro negro, brillantes y redondeadas de halo negro
indicativo de hidrólisis de esculina y en agar Oxford colonias pequeñas color
grisáceo, centro negro y rodeadas de un halo negro. Aquellas placas cuyo
resultado fue negativo luego de 48 horas, fueron nuevamente aisladas de sus
respectivos enriquecimientos, luego de 7 días más de incubación en iguales
condiciones
22
Se seleccionaron dos colonias típicas de cualquiera de los medios analizados y
a partir de esta, se hicieron las siguientes pruebas para confirmar género:
motilidad a 25° C, fermentación de los azúcares Ramnosa, Xilosa y Manitol,
posteriormente se realizó la prueba de CAMP en placas de agar sangre de
cordero, con cepas de S. aureus ATCC 25923 y R. equi, y como cepas control a
Listeria monocytogenes ATCC 7644, Listeria innocua ATCC 73016 y Listeria
ivannovi ATCC 19119 a fin de estudiar la producción de hemolisinas por parte
de las cepas obtenidas. Estas placas al igual que los azúcares, se incubaron a
37° C por 24 horas.
23
Gráfica 2. Modificación del Método horizontal para la investigación de Listeria monocytogenes
PNT-AL- 023.1, basado en la norma ISO 11290-1 (Diciembre 1997)
* Resultados después de Incubación
24
5. RESULTADOS
Los resultados obtenidos en las pruebas bioquímicas (Fermentación de Carbohidratos y
Motilidad) y prueba de CAMP (Grafica 3), fueron comparados con los reportados por la
bibliografía, para confirmar la presencia de Listeria monocytogenes en las muestras
analizadas.
Las pruebas realizadas a las cepas aisladas, permitieron evidenciar que de las 152 muestras
analizadas, 45, fueron identificadas por el método anteriormente mencionado, como
Listeria monocytogenes, lo cual corresponde a un 29.6% (tabla 4); igualmente se observó
que de los quesos analizados, el queso campesino, presentó la mayor prevalencia de la
bacteria sobre los otros dos tipos de queso analizados (doble crema y Paipa)
respectivamente (tabla 5). Así mismo se logró recuperar un 18.42% de cepas de Listeria
spp., diferentes al género monocytogenes y siendo nuevamente el queso campesino, el que
mayor prevalencia de la bacteria presentó, así mismo se observó que en el queso Paipa no
se encontró cepas de otra especie de Listeria, diferentes al género monocytogenes.
Grafica 3. Prueba de CAMP, para muestras de queso.
R. equi S. aureus
Listeria monocytogenes
Listeria ivanovii
Listeria innocua
Muestras de queso
25
La tabla 4, permite evidenciar la diferencia de prevalencias entre cada uno de los quesos
analizados y su lugar de procedencia, permitiendo confirmar que el queso Paipa, es el que
menor prevalencia presenta de la bacteria y que la prevalencia en el queso campesino y el
doble crema, tiene un comportamiento muy similar en casi todos los puntos de venta.
Los datos mencionados en las tablas, pueden ser vistos con mayor claridad en las gráficas 4
y 5, que en su orden muestran, la prevalencia de la bacteria, según el lugar donde fueron
adquiridas las muestras y prevalencia de Listeria según tipos de queso.
Tabla 4. Resultados obtenidos del análisis de presencia de Listeria monocytogenes y Listeria spp., según lugar de procedencia y tipo de queso analizado.
PROCEDENCIA TIPO DE QUESO % L. monocytogenes % Listeria sp. Campesino 66,60% 0
Paloquemao Doble crema 100% 0 Paipa 100% 0 Campesino 35,71% 14,28%
Restrepo Doble crema 20% 0 Paipa 0 0 Campesino 60% 40%
20 de Julio Doble crema 80% 20% Paipa 0 0 Campesino 25% 5%
Las Flores Doble crema 26,60% 13,33% Paipa 66,60% 0 Campesino 50% 0
Usaquen Doble crema 0 0 Paipa 0 0 Campesino 41,17% 11,76%
12 de Octubre Doble crema 10% 20% Paipa 33,30% 0 Campesino 0 60%
7 de Agosto Doble crema 16,66% 8,30% Paipa 50% 0
Campesino 33,30% 50% Otros Doble crema 40% 0
Paipa 0 0
26
Grafica 4. Prevalencia de Listeria según lugar de procedencia de las muestras.
Tabla 5. Prevalencia de Listeria según tipo de queso
TIPO DE QUESO MUESTRAS % L. monocytogenes % Listeria sp.
Campesino 87 28,73% 25,28% Doble crema 54 27,7% 11,11% Paipa 11 45,4% 0%
Gráfica 5. Prevalencia de Listeria spp. y Listeria monocytogenes según tipo de queso analizado
Prevalencia de Listeria spp. y Listeria monocytogenes Según Procedencia
0,00%20,00%40,00%60,00%80,00%
100,00%
Procedencia
Porc
enta
je
Listeria monocytogenes Listeria sp.
Prevalencia de Listeria spp y Listeria monocytogenes según tipo de queso
0,00%
5,00%
10,00%
15,00%
20,00%
25,00%
30,00%
35,00%
40,00%
45,00%
50,00%
Campesino Doble crema PaipaTipo de queso
Porc
enta
je
l. monocytogenes Listeria spp.
27
Durante el periodo de estudio el medio Oxford, mostró mejor recuperación de Listeria,
pues del número total de pruebas positivas obtenidas (total positivas = 85), en nueve
ocasiones (10.58 %), recupero más que el medio Palcam, mientras que en solo una ocasión
(1.17 %) el medio Palcam funcionó mejor que Oxford, para la recuperación de la bacteria.
Tanto en el medio Palcam, como en Oxford, se observó la recuperación de
microorganismos como bacilos y levaduras, siendo el medio Palcam, el que mayor
contaminación de éste tipo recobró (gráfica 6).
Las 107 muestras negativas, luego de 48 horas de incubación del enriquecimiento,
permanecieron en iguales condiciones por 7 días, alcanzando recuperación de la bacteria
solo en cuatro ocasiones.
Gráfica 6. Morfología de microorganismos diferentes a Listeria, aisladas en Agar
Palcam.
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6. DISCUSION
Durante el período de junio a agosto de 2003, se recolectaron 152 muestras de diferentes
tipos de quesos, con periodicidad semanal, a razón de 15-25 quesos semanales. A las 152
muestras de queso se realizó una modificación del análisis para la presencia de L.
monocytogenes de acuerdo con la metodología descrita por el método horizontal para la
investigación de Listeria monocytogenes PNT-AL- 023.1, basado en la norma ISO 11290-1
(Diciembre 1997). Los datos obtenidos, fueron mencionados en el punto anterior y
permiten observar una alta prevalencia de Listeria monocytogenes, en quesos de fabricación
artesanal distribuidos en Bogotá, producto que según “el decreto 3075 de 1997, forma parte
de los alimentos de mayor riesgo en salud pública, por sus características de composición
especialmente en sus contenidos de nutrientes, actividad acuosa y pH…..” de igual manera
el decreto 3075 de 1997 menciona que “… por el riesgo que representa, por su capacidad
de producir abortos en mujeres en embarazo y meningitis en la población infantil5”, datos
que son coherentes con los anteriormente reportados por Díaz y Muñoz en 1994.
En todos las plazas de mercado donde se realizo el muestreo de los quesos, se logró el
aislamiento de cepas de Listeria monocytogenes, siendo las muestras de la plaza de
mercado de Paloquemao, la que mostró una mayor prevalencia de la bacteria, y la plaza del
7 de Agosto, en la que se presento menor prevalencia de ésta (gráfica 4). Así mismo se
logró asilar especies diferentes a monocytogenes en la mayoría de las plazas de mercado,
siendo la plaza de Paloquemao la única, donde no se logró recuperación de especies
diferentes a la anteriormente mencionada y la plaza del 7 de Agosto, en la que hubo mayor
recuperación de éstas.
5 Boletín Epidemiológico Distrital, Secretaria Distrital de Salud de Bogotá, 2000.
29
De igual manera se puede observar en la tabla 4, que el queso campesino mostró presencia
de L. monocytogenes, en la mayoría de las plazas de mercado, con excepción de la plaza del
7 de Agosto; de igual manera, el queso doble crema permitió recuperar la bacteria en la
mayoría de las plazas, con excepción de la plaza de Usaquen, donde además no se logro
recuperar L. monocytogenes del queso Paipa. La presencia de la bacteria en este tipo de
queso, según lo observado en la gráfica 5, es la mayor de todas, pero es necesario tener en
cuenta que no es posible realizar un análisis completo de los datos, pues el número de
muestras por sitio no fue igual, pues la cantidad de quesos campesinos analizados fue
mucho mayor que la de quesos Paipa o Doble Crema, lo cual no permite tener datos de
comportamiento normal estadísticamente.
Estos datos permiten confirmar los anteriormente reportados por Díaz y Muñoz en 1994,
donde se encuentran valores similares sobre la incidencia de L. monocytogenes en leches
del altiplano cundiboyacence. Esto permite pensar que las medidas de control durante la
cadena de producción, para los pequeños productores de derivados lácteos en esta zona son
mínimos, especialmente, para la presencia de este microorganismo.
Los resultados obtenidos al comparar los dos medios de cultivo permiten notar que la
mejor selectividad para la recuperación de Listeria monocytogenes a partir de muestras de
quesos, es del medio Oxford, pues no solamente recuperaba mejor la bacteria, si no que la
presencia de otros microorganismos contaminantes fue mínima, a diferencia del medio
Palcam, donde hubo recuperación de microorganismo de morfología macroscòpica y
microscópica de bacilos y levaduras. Se considera que el crecimiento de estos
microorganismos en el medio Palcam, pudo influir en la recuperación de Listeria
monocytogenes, pues hay competencia por nutrientes y espacio entre los microorganismos.
30
De igual manera se puede considerar que los microorganismos recuperados diferentes al
genero Listeria, presentan una alta resistencia a antibióticos como la Polimixina B,
Acriflavina entre otros, los cuales hacen parte de los suplementos adicionados, tanto al
caldo de Enriquecimiento, como al medios Palcam.
Las muestras negativas luego de 48 horas de incubación del enriquecimiento,
permanecieron en incubación hasta por 7 días, alcanzando recuperación de la bacteria solo
en cuatro ocasiones. A pesar de ser muy pocas las muestras que lograron recuperación
luego de 7 días, se considera que siempre debe dejarse los enriquecimientos un tiempo
prudencial, con el fin de no informar resultados falsos negativos, que pueden traer graves
consecuencias para los consumidores del producto.
El presente estudio muestra además de la prevalencia de L. monocytogenes, en quesos
frescos distribuidos en plazas de mercado de Bogotá D.C., una modificación al método
clásico para la determinación de L. monocytogenes en este tipo de muestras, al disminuir la
cantidad de muestra y de enriquecimiento, presentando óptimos resultados, por lo cual se
considera que se puede continuar su uso con un numero mayor de pruebas, así como
ampliar esta modificación a otro tipo de matrices.
31
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