j~~~~~~~~~ db un aditivo alimanticion a …148.206.53.84/tesiuami/uam20918.pdf · de sorgo sin...
TRANSCRIPT
T
t
U
L
J~~~~~~~~~ DB UN ADITIVO ALIMANTICION A PAR~IR
DE SORGO (SoTghum b i c o l o r ( & e $ moench)
FdiWiiNTADO CON AL HONGO Rhizorms oliaosporus
J Nabor P. Alvarez Kiranda.
Neftalf E. E s c a l o n a Alba.
Universidad Autónoma Metropoli tana- I
Depart amento) de Bio t e cnolog fa . J I n g . Bioquímica I n d u s t r i a l .
4 s e s o r e s :
M. e n C. Eduardo E. González H. R. e n C. Oscar Monroy. H. M. en C. S e r g i o Revah M.
F ?. .
~
OBTdNCION DS UN ADIT IVO ALIT?dNYICIO A PAHTIR
D& SONGO (Sorghum bicolor (2. ). moench)
PERWNTADO CON isL EONGO Rhizopus ol igocoorus.
INFOBEIS FINAL,
Nabor P. h l v a r e z lid. (No. de cta . 76312999).
Neftalí E. f i sca lom A. (No. de cta. 77327750).
Junio, 1982.
____.," ....
9
7 ,
L .
a k
c
- i -
R E S U M E N .
Sorghum b i c o l o r (La) moench, .parcialbente desta-
nizado, se u t i l i z ó ) como sustrato básico de una fermenta-
c i ón só l i da con Rhizouus o&igosporus ATCC 22959, con
eT f i n de obtener un producto con mayor contenido, de pro-
t e ína que e i grano or ig ina l .
E1 trabajo experimentar comprende esencialmente t r e s
partes, que en una forma muy breve se exponen a continua-
ción:
l'). Aná l i s i s de l a Composición Química de l Sorgo.
Inicialmente, fue necesario l ' levar a cabo pruebas f i s i c o -
qu&micas para cuant i f i car l'os principales componentes del'
sorgo que s e r í a empieado en i a investigación.
Los resultados obtenidos en l a s determinaciones de
las sustancias de mayor re levancia para i a fermentación,
fueron: 78.87 $, para almidón; 9.91 %, para proteína 9p
2.342 $ de taninos.
2 ) . Destanización dell Sorgo. La destanización par-
c i a r d e l grano ae l l e v ó a cabo apl'icando tratamientos
térmico-alcalinos, con soluciones de NaOH'aT 5, 10 y 1 5 $;
50 C de temperatura, 10 minutos de extracción y ag i tac ión
controlada.
O
c - ii -
T
L 1
La máxima destanización se obtubo con alcriii a l
3.5 56, logrando ex t rae r e l 90.77 $ de Xos taninos to ta les .
L i ent ras que en Xos otros dos casos se extra jeron 85.75%
y 75.58 $, respectivamente.
3). Fermentación. Para Tos procesos de fermentación
se u t i i i z d como'sustrato, muestras de sorgo tratado a l a s
t r e s d i ferentes concentraciones; incl'uyendo además una
de sorgo s i n tratamiento.
Los mejores resultados fueron obtenidos en e l Lote A
d e l segundo proceso de fermentación, con l o s medios de
sorgo sometido a tratamiento con NaOH a l 5 % y sorgo s i n
tratamiento. 21 máximo incremento de proteína alcanzado
en los productos, con respecto a l a d e l grano or i g ina l ,
fue de 93.63 $ y 51.87 $, respectivamente. E l tiempo re-
queridos para l a fermentación fue de 72 horas-
c - iii -
T
En nuestro país ae han r e a l i z a d o muy pocas inves-
t i g a c i o n e s b i o t e c n o l ó g i c a s donee e l sorgo s e a u t i l i z a d o
como s u s t r a t o básico de a l g h t i p o de fermentación. Los e s t u d i o s que s e han publicado son esencialmente sobre
mejoramiento g e n é t i c o de s e m i l l a s , con el: o b j e t o de d i s -
minuir e i contenido de l a n i n o s , a c e l e r a r s u produccián
e incrementar Ea cant idad de proteína. An e s t o s traba-
j o s s e han obtenido f r u c t í f e r o s r e s u l t a d o s , pero han
surgido nuevos problemas, como i a p e r d i d a de r e s i s t e n c i a
a i ataque de los pájaros y a aigunas enfermedades causa-
das por microorganismos ( l , 2 , 3 ) .
En algunos p a í s e s de Africa e s t e c e r e a l e s u t i l i z a -
do para obtener bebidas alcohóllicas, de gran aceptac ión
popular, como e s e l caso de l a cerveza d e l BantÚ, a l sur de Africa. Se preparan también aEgunos a l imentos t r a d i -
cional'es ae consumo i n f a n t i z , e n t r e los que destaca e l
Ogi de Sorgo, en Niger ia í4,5). Ambos productos s e ob-
t i e n e n p o r fermentación sumergida con microorganismos
E á c t i c o s , principalmente. La prote ína de e s t o s a l imentos
e s de ba ja calidad y prac t i canente tampoco varia en can-
t i d a d con r e s p e c t o a l a d e l grano o r i g i n a l .
0. - i v -
f
L 4
c
t
L
Otros paises han desarrozlado var ias técnicas con
e l f i n de mejorar l a cal idad de d ie tas preparadas a ba-
se de sorgo. dntre l a s más importantes se encuentran:
l a f o r t i f i c a c i ó n de aminoáciüos, adicionando concentra-
dos prote icos; l a germinación de l a semi l la y l a fermen-
tac ión sumergida d e l grano (6,7,8,9).
i
Actualmente, l a l i t e r a tu ra sólo reporta un t rabaja
cuya f ina l i dad fue mejorar ca l idad y contenido de prote i -
na en sorgo, mediante un proceso de fermentación s ó l i da
con dicho cereal: Hesselt ine -- e t a l (1967) ( l o ) , u t i l iha-
ron semi l la comercial de grado No. I de sorgo blanco y
lo ' ferme6taron con el' hongo R. oligosporus NRRi27IO.
El' producto obtenido, a l igual' que otros preparados
con d i f e rente ce rea l , fue rebanado, metido en agua de
s a l y f r i t o en a c e i t e vege ta i , con e l ob je to de va lo rar
e l crecimiento de l hongo, a831 como e l sabor, o l o r y co-
l o r .
Los resultados de l a s pruebas anter iores indicaron
un crecimiento muy pobre, pérdida de textura, desinte-
grac ión a l rebanar10 y un c a s i inpersept ible o l o r a l e -
vadura. Por estas razones, l o s investigadores concluye-
ron que e ra un producto' poco, a t rac t i vo para consumo hu-
mano.
c
- v -
CONTENIDO
il
iii
C O N T ~ N I D O V
CUADROS Y PIGUtL4S v i i i
1-1. Obje t ivo ................................. 3
CAPITULO 11:. BMVS S T U D I O DdL SORGO 4
Cul'tivo ............................... 4
..................... Producción y Usos 4 Composición d e l Grano ................. 5
Taninos 5 Taninos en Sorgo ...................... 6,
interacciones Tanino-Proteína e Almidón ............................... TO P r o t e í n a .............................. 12
............................... .........
CAPITULO 111:: PdRiúdNTACIONdS TIWDICIONiiLdS Y4
IIId. Generalidades ......................... 1'4 111.2. P r i n c i p a l e s Alimentos Fermentaoos ..... 14 111.3. Algunos Microorganismos U t i l i z a d o s .... 15 111.3.1. Breve Descr ipc ión d e l Hongo
Rhizopus oliKosvorus ................. 17
,. - v i - 7
111.4. Tempeh .............................. 2T - 111.4.1. D e f i n i c i ó n 21
111.4.2. Propiedades ......................... 22
\I .......................... I
CAPITULO I V : ANALISIS DA LA COMEOSICION
QUIE',ICA DAL SORGO 23
P
i
IV.1.
I V . 2 .
I V . 3 . IV .3 .Y. I V . 3 . 2 .
IV.4
IV .5 . I V . 5 . 1 .
I V .5 - 2 .
S e l e c c i ó n y Pretra tamiento de l a s e m i l l a 23
E x t r a c c i ó n de Taninos ............... 24
Determinación de Taninos ............ 26
Método de l a V a i n i l l i n a (hW-HCl) ..... 26
Ldtodol d e l Complejo A z u l de P r u s i a ... 29
Determinación de Almidón ............ 32
Determinación de P r o t e í n a ........... 36
Método de B i u r e t .................... 36
Ftlétodo de Kjel.dah1 .................. 4 0
CAPITULO V : FARK.U?TACION 4 3
V . 1 .
v.2.
v.3. v.4. v.5. V.6.
v.7. V . 8 .
............ Preparación d e i S u s t r a t o 4 3 Obtención d e l 1nÓcul.o 4 3 Primer Proceso de Fermentación ...... 44
Humedad d e l Kedio, 45 Segundo Proceso de Fermentación ..... 4 6
Prueba de Rebanado 47
Secado d e l Alimento ................. 47
Fermentación Sumergida 48
............... ................... ..................
..............
- v i i -
L . CAPITULO V I : RXSULTADOS Y COXCLEIONES
VI.1.
V I .2.
V I . 3 .
VI .4.
V I . 5 .
V I -6 .
VI.6.1.
VI.6.2.
VI.6.3.
V I . 7 .
S e l e c c i ó n y P r e t r a t a m i e n t o ............. A p l i c a c i ó n de l o s t r a t a m i e n t o s
Térmico-alcal inos ............... ....... Contenido de Taninos ................... C u a n t i f i c a c i b n de P r o t e í n a ............. D e t e m i n a c i ó n de AXmidÓn ............... Procesos de Fermentación ............... Primer Proceso de Fermentación ......... Segundo Proceso de Fermentación . . . . . . . Fermentación Sumergida ................. CmclusiÓn General ...... ..... . .........
SUGEWNC IAS
B I BLI OGFZAPIA
5r
52
5 3 5 5 65
69
7 3
74
79
82
84
85
86
E
.!
.*
,. - v i i i -
u
1’
2
3
4
5
6
7
8
9
ro
11
1’2
1’3
CUADROS Y PIGUHirS
P r i n c i p a l e s Alimentos Producidos por Fermentación de Soya y Algunos Cerea les ..................... Extracción de Taninos ........................... Cuadro Resumen d e l Contenido de Taninos e n las
d i f e r e n t e s muestras de sorgo analimadas ......... Contenido de Taninos, medidos como^
Penoles t o t a l e s ............................... Cuadro Comparativo‘ de l o s v a l o r e s obtenidos
p o r l o s dos métodos ............................ P o r c i e n t o de P r o t e í n a determinada p o r e l método
de R j e l d h a l , en m i c e l i o y d i f e r e n t e s muestras
de sorgo ...................................... Contenido de Almidón en las d i f e r e n t e s mues-
tras de sorgo anal ivadas ...................... Evaluación visual: d e l producto obtenido en e l Pr imer Proceso de Pernsntación. Lote A ........ Cuadro comparativo d e l contenido de p r o t e í n a en
e l s u s t r a t o o r i g i n a l y en e l producto..........,
16 57
58
62
63
68
71
34
76 BvalbaciÓn Visual’ d e l Producto obtenido en e l
Primer Proceso de Fermentación. Lote B ........ 77
Lote A ...................................... 79 Contenido de E r o t e i n a d e l Lote A d e l 20. Proceso. . 80 Cuadro comparativo d e l contenido de p r o t e í n a en
ros productos de ambos procesos y en‘ s u s t r a t o
o r i g i n a l ....................................... 81
Evaluación d e l Segundot Proceso de Fermentación
, CAPIT'LJLO I.
INTRODUCCION
Actualmente uno de l o s pr inc i2a les problemas de E$-
x i c o y de muchos países de l mundo es l a excesiva e insa-
t i s f echa demanda de aliment 39, causada por l a insuf ic ien-
t e producción ag r í co l a y l a eleva(?a tasa de crecimiento
de sus poblaciones.
Ante es ta s i tuación, en nuestro país, se invest igan
diversas soluciones FOSibleS. Por una parte, se encuen-
t r a l a obtención de proteína a base de algunos microor-
ganismos t a l e s como bacterias, Ievaduras, honzos filamen-
tosos y algas, empleando para SU crecimiento sustratos
de escaso v a l o r b io lóg i co , t a l e s como almidones, residuos
ce lu lós i cos y algunos derivados de l petróleo, a s í como
desechos tanto de l a inciustria a l iment ic ia corno de l a 'a- groindus t r i a .
Por o t r o lado, i a tecno log ía agropecuaria r e a l i z a
constantes mejoramientos genét icos con e i f i n de aceie-
r a r y e l e v a r i a ca l idad y cantidad de l a producción
ag r í co l a y ganadera.
ET maíz, e l sorgoi y e l trigo, son TOS cerea les re-
presentat ivos de l a agr icul tura mexicana. E l cu l t ivo , de l
sorgo,comparado con e l de o t ros cereales, es r e l a t i va -
mente nuevo y constituye l a fuente de un gran número de
invest igaciones, principalmente de t i p o genético. Quizá
sea uno de Toe cerea les más estudiados en nuestros dias.
c
i
Un nuevo estudio de e s t e cerea l , con un enfoque d i - f e r en t e a l o s realizn.dos anter iomente en T?éxico, Consis-
t e en e fectuar una fsrnentación só l ida , u t i l i zando como
sustrato básico sorgo, y e l hongo f i lamentoso &. - oli-
Lospo ius .
El s9rgo empleado en l a fermentación, Sori;F.ulr &- co l o r (5.) aoench, es una variedad representat iva, entre
l a s miis cult ivadas en nuestro pais; se caracter i za por
t ener a l t a concentración de taninos y por su uso básico
como f o r r a j e . Se espera que e l producto de es te proceso
fermentat ivo pueda s e r u t i l i z a c o como a d i t i v o en alimen-
tos balanceados, consumidos principalnente por ganado de
engorda.
Las fermentaciones só l i das de es te t i p o ofrecen
granües ventajas sobre 2 . a ~ l í qu idas o sumergidas y l a s
semisólidas. Las ventajas encontradas son l a s siguientes:
31 eouipo requerido en fermentaciones só l idas normalinen-
t e e s peque3o) y poco so f i s t i cado , con un gasto mínimo de
energía para mantener la a i reac ión y temperatura reque-
r idas en e I proceso. No se requiere e f e c tua l procesos de
separación, ya que l a blonasa d e l microorganismo es com-
pletamente inocua y constituye parte esenc ia l de l prodcc-
t o f i n a l .
Las fermentaciones sumergidas, por l o ceneral , re-
quieren f ermentadores de grsn volumen, elevados consumos
de a i r e y energía, ag i tac ión controlada, tecnología so- f i s t i c a d a para e l cont ro l de i a fermentación, compiica-
L - 3-
1
Y dos procesos de separac ión d e l producto p r i n c i p a l y sub- productos, además s e debe i n c l u i r e l t ra tamiento de de-
sechos orgánicos para e v i t a r contaminación b i o l ó g i c a .
Consecuentemente, l o s productos obtenidos p o r e s t e t i r o
de fermentaciones tendrán un c o s t o más a l t o , aunque SUB
rendimientos sean mayoren que l o s alcanzados por v í a f e r -
mentación s ó l i d a .
&a t e c n o l o g í a para fermentaciones s ó l i d a s s e encuen-
tra muy poco desarro l lada . Consideramos que una f a s e si-
g u i e n t e de e s t a i n v e s t i g a c i ó n deberá t e n e r corno o b j e t i v o
e l d e s a r r o l l o de una t e c n o i o g i a s e n c i l l a y de b a j o c o s t o ,
de manera t a l , que pueda ser t r a n s f e r i d a a l medio rural. c e r c a de los p r i n c i p a l e s c e n t r o s de c u l t i v o de sorgo.
1 .X . Obje t ivo .
Obtener mediante una fermentación s ó l i d a , un a d i t i -
vo a l i m e n t i c i o , usando como mater ia pr ima sorgo b i c o l o r ,
(Sorghum b i c o l o r (L.) - moench), y e l hongo Bhizopus oli ,qos-
=, con e l f i n de incrementar e l contenido y c a l i d a d
de proteha, e n r e l a c i ó n a la d e l sorgo o r i g i n a l ,
E
i
CUI? ‘LO 11.
BFf3VE ESTUDI3 DZL SOZGO.
1I.l’. Cult ivo.
ET sorgo es un ce r ea l o r i g i na r i o de A f r i c a (11).
c d t i v o se ha extendido rapidamente a muchos países,’ hasta
ocupar en l’a actual’idad ei quinto fugar en i a producción
m d d i a l de cerea les c12), y e i segundo) a n i v e l nacional( l3) .
Este notable incremento se debe a su f á c i l adaptación
en 10s d‘ i ferentes medios agr í co las , que es 10, que caracte-
r i z a a e s t e cereal’. Crece en condic imes extremas de tempe-
ratura, humedad, a l t i t u d y composicioxes edáf icas de l sue-
To. Además presenta gran res i s tenc ia a sequías prolongadas
y a l ataque de pájaros, a s í como a algunas enfermedades
propias de l’os cereales. Debido a l a precocidad de su ci- c lo ) de v ida, en condiciones favorables, es posible obtener
doe cosechas por año c14).
Su
11.2. Producción y USOS.
ET Banco de México en su informe correspondiente a l a
década 1970-80, reporta que en el: c i c l o ’ an t e r i o r se cu i t i -
varon l‘,579,000 Ha, ocupando> el’ segundo) rugar en área de
siembra; con una producción t o t a l de 4,812 Toneladas y un
rendimiento de 3 TON/Ha (13). El’ usofundamental’ de e s t e ce rea l es como f o r r a j e y
piensos para arimento de ganado, tanto monogástrico como
po l i gás t r i co . ATgunas especies genéticamente mejoradas,
como i a s de so rgo blanco, se ocupan para alimentación hu-
. mana, con un v a l o r n u t r i , t i v o s u p e r i o r a l d e l maíz.
h x i s t e un gran nÚme,ro de variedades h í b r i d a s de s o r -
go. S u composición química v a r í a de acuerdo a .Ta e s p e c i e
var iedad a l a que pertenezca. Cabe s e ñ a l a r aue los agri -
c u l t o r e s generalmente s e l e c c i o n a n las variedades de semi-
x la para siembra, en las d i f e r e n t e s zonas d e l país , de-
acuerdo a las c a r a c t e r í s t i c a s arronómicas dex h í b r i d o y
nunca por su val'or n u t r i t i v o ! (15).
Entre las variedades más c u l t i v a d a s en Fnéxico s e en-
c u e n t r a l a de Sorghum b i c o l o r (4.) moench, clasificada co-
mo de a l t p > contenido, de t a n i n o s , ros c u a l e s causan proble-
mas de d i g e s t i b i l i d a d cuando s e usa e s t e cereal: como! base
en i-a aximentación de animales no:rumientes CIA) .
11.3. Composición del' Grano de Sorgo.
11.3 .I. Taninos . E l e s t u d i o d e l contenido de tan inos en e l grano de
sorgo! ha adqujlrido gran i n t e r é s . desde que s e encontró.
que l a p r e s e n c i a de é s t o s en al'gunas var iedades , reduce
considerablemente s u v a I o r b i o l ó g i c o , cuando. s e a l imenta
con e l l a s a animales monogástricos y a humanos (16).
a). D e f i n i c i ó n .
Los t a n i n o s s e def inen generaxmente como compuestos
p o l o f e n ó l i c o s , h i d r o s o l u b l e s , con un p e s o moXecular e n t r e
500 y 3 O00 q$/gmolj presentan Tas r e a c c i o n e s clásicas de '
fenoLes. Tienen como c a r a c t e r í s t i c a e s e n c i a l ia capacidad
de p r e c i p i t a r a l c a l o i d e s , g e l a t i n a s y o t r a s p r o t e í n a s . Se
0.
-6-
C
1
W
combinan también con algunos o t ros poliméros como celulo-
sa y pectina (17).
La inhib ic ión de l a 8-glucosidasa (18) y algunas
enzimas d igest ivas como l a t r ips ina, l a ac-arnuasa y l a
l i p a sa (lg),. se debe a l a combinación de l tanino con l a
f racc ión pro te i co de l a misma. La astr ingencia percibida
en e l paladar cuando se ing i e r e taninos, es caueada por
la prec ip i tac ión de l a s proteínas y g l i c op r o t ehas de l a
sa l i va , l o que reduce su propiedad lubricante (141, (15).
ii.3.2. Taninos en Sorgo.
50s taninos que se encuentran en el’ grano de sorgo,
son principalmente de l t i p o de los condensados. Se ioca-
I i izen en e i per icarp io y están asociados con l a pigmenta-
c i ón de l a t es ta 116).
Los taninos condensados son Tos más comunes en e l
r e ino vegetal . Son mezclas de productos de condensación
de moléculas t i p o f laván, combinadas en dimeros, trimeros
o polimeros. Los f lavonoides más importantes que l o s f o r -
man son los fiaván-3-oies o catequinas y los fiaván-3-4-
d i o l e s o leucoantocianidinas. A pesar de s e r economica-
mente muy importantes, han s i do poco estudiados debido a
la d i f i cu l t ad de ana l i zar l a s grandes moléculas por cro-
matografias, ya que éstas reaccionan con i a ceiuiosa de1
papel o con 10s polimeros u t i l i zados como soporte en ca-
pa f i na , dando manchas difusas por l a formación de com-
p l e jos moleculares.
-7-
I LOS únicos compuestos que pueüen s e r separados sa-
tisfactoriamente son ros fiavanes monoméricos y algunos
dimeros, pero es muy d i f i c i l oDtenerlos puros debido a l a
habi l idad que tienen de formar puentes de hidrógeno con
otras moléculas ( 20 ) .
Las fórmulas estructurales de l a s catequinas y Xas
Ducoantocianidinas, son:
Catequinas:
OH
Af cerequina R=R*'=H
Catequina R=OH; R%H
Galocatequina R=R*=OH
(21).
Leucoantocianidinas: i
R
1
b s
Leucopelargonidina R=R*,=H
Leucocianidina R=OH; R*=H
Le ucodelf i n i dina R=R *'=OH
(22)
i3n realidad l a s leucoantocianidinas se encuentran
tan extendidas en e l reino vegetal , que son l a s responsa-
b les de l a s reacciones atribuidas a ros taninos (23).
,
,*
!
L
-9-
' 11.3.3. InteracciÓn con l a s Proteínas.
Se ha sugerido que l a formación de l o s complejos ta-
nino-proteína, se i i e v a a cabo, por t r e s t i pos de interac-
ciones químicas (24), que se describen a continuación:
a). Formación de puentes de hidrógeno entre e 1 grupo
oxh id r i l o (-OH), de l o s f eno les que constituyen l a estruc-
tura de las Teucoantocianidinas, y los grupos receptores
de l a s proteínas (-NH2, -COOHI u otros poliméros.
b). iSnlaces ión icos entre Tos grupos aniónicos de 10s
taninos ( f eno les ionizados o' grupos carboxi loe 1 y grupos
cat ión icos de l o s aminoácidos de l a s proteínas, como el:
grupo amino (-NH2) éps i ion de i a i i s i na .
c). Bnlaces covalentea formados por l a unión entre
quinonas, l a s oue pueden e s t a r formando parte de l a estruc-
tura de l tanino o pueden s e r producidas POT l a oxidación,
y algunos grupos reac t i vos de i a proteína, u o t r o pol i&-
r o . Este enlace es de par t i cu lar importancia, ya que im-
parte gran es tab i l idad s i l complejo' tanino-proteína (20).
L
-10-
. L
bi
‘ 11.3.4. Almidón.
E l almidón e s uno de 1,os carbohidratos más ampliamen-
t e d i s t r i b u i d o s e?l l a natura leza . Se forma a partir de C02
y H20, en las h o j a s y p a r t e s verdes de las p l a n t a s , por medio de l a c l o r o f i l a y l a l u z s o l a r .
E l almidón e s un homopolisacárido, ya que sus monome-
ros son de un só lo t i p o . I g u a r que i a c e l u l o s a , e i almidón
e s un glucano que s e encuentra en e l r e i n o v e g e t a l , s i n
embargo t i e n e grandes d i f e r e n c i a s en s u s propiedades fhi-
cas y quimicas. hl ientras que l a c e l u l o s a t i e n e i a func ión
de s e r v i r como base e s t r u c t u r a l de las p l a n t a s , e l almidón
s e cons idera como f u e n t e de e n e r g í a de r e s e r v a . Se almace-
na en r a í c e s , tubércul’os f r u t a s y s e m i l l a s en forma de grá-
nulos i n s o l u b l e s , los c u z l e s e s t á n debidamente ordenados
para impedir i a d i f r a c c i 6 n de Rayos x (25).
a) . i?ktructura d e l liimidbn.
E1 producto comerciar l’lamado almidón e s generalmente
una mezcla de p o i i s a c á r i d o s . Los p r i n c i p a l e s componentes
son l a amilosa y l a amilopect ina . Los almidones comunes
t i e n e n de un 75-80 % de ami lopect ina y de un 20-25 $
amilosa. Los almidones de c e r e a l e s de t i p o c e r o s o , como ma-
í z , a r r o z y sorgo, cont ienen casi unicamente amiiopect ina
con una pequeña f r a c c i ó n de amilosa (Y% o menos) (26).
de
l
La amilosa e s t á c o n s t i t u i d a de grandes cadenas l i n e a -
r e s de D-Glucosa, l as c u a l e s e s t á n unidas por e n l a c e s
a ( 1 - 4 ) . Bstas cadenas s e encuentran d i s p e r s a s y s u peso
molecular v a r i a de 1x103 a 1x10 5 gr/gm>i. ds poco soiu-
I
.. -11-
b le en agua, pero’ forma nic21as hidratadas l a s cuales dan
un c o l o r azÚl con Iodo . ñn t a l e s micelas l a cadena d e l po-
I i s a cá r i do tome forma he l i c o i da l (27).
La amilopectina es tá altamente rdmificada. La longui-
tud promedio, de l a s ramif icaciones var ía de 24 a 30 r es i -
duos de glucosa., Se encuentran unidas en enlaces a: (1-4),
pero en 10s puntos de rami f icac ión los enlaces son cc(1-6).
La amilopectina da soluciones co lo ida les o ,mice la res l a s
cuales dan un c o l o r ro jo -v io l e ta con Iodo. Su peso molecu-
Tar puede s e r tan a x t o comQ 10 g/gmUl. 8
Cuando e l almidón se h i d r o l i z a con ácidos, se obtiene
unicaniente D-Glucosa como producto de I a h i d r ó l i s i s t o t a l .
La composición der a.lmidÓn d i f i e r e ampliamente depen-
diendo de l a fuente de don¿!e provenga, t a l e s como maíz,
sorgo, papas, etc., (26).
b). Almidón de Sorgo.
E l almidón de sorgo se caracter i za por su composición
d i f e r en t e a l a de otros cereales. Contiene de 20 a 30 % de
amilosa y de 70 a 80 $ de amilopectina en sorgo cornÚn, mien-
tras aue e l sorgo de t i 2 0 ceres0 contiene 1 $ de amilosa y
99 ‘$ de amilopectina (28).
La d i s t r i b u c i h d e l almidón en e l grano, obtenida por
d isecc ión manual d e l sorgo (291, es l a s iguiente:
83 $ en e l endospermo.
1 3 ’$ en e l gérmen.
34.6 $ en l a testa .
I
-12-
. 1.
Los gdnui!oe de aEmid6n &ex endosperm del eosgo’ mm l’igeramente d e grandee que ios der alhLd6nide meh. =den
aproximadamente entzis 1IQ y 25 p bd, de diámetro reepee- tivamente,, on cambio> Tom gránuToe der gerlicsspiio, a d muoh0
pequeños (30) .
c). GeBatfai%mu&n*
LOS t i pos de proteína que se encuentran en e 1 grano
de sorgo son:
Axbuminas T.3 - 1.7 s6 Globulinas 2.0 - 9.3 $
Prolaminas 32.6- 58.8 % (Ka f i r ina )
Gliltel ’ inas 19.0 - 37.4 % (39)
Como se observa, l a ka f i r ina es l a proteína represen-
t a t i v a de es te cerea l , y a l igual’ que l a s prolaminas se sa-
i ’ub i l i za en etanoli a l 70 u 80 $. Son insolubles en agua
al’cohoi e t í l i c o absoluto. y
a) . Composición de ].a i r o t e í na de l Sorgo.
La proteína de sorgo, como i a de otros cereales, t i e -
ne como pr inc ipa les aminodcidos ximitantes i i s i n a y treo-
nina, en primero y segundo lugar respectivamente. Eet ioni-
na, t r i p t o f ano, arginina y g l i c i na , también han sido seaa-
Xados cono aminoácidos Timitantes (40). - sa Ka f i r ina es tá constituida por una a l t a proporción
de ácido giutámico ( i iutamina) y aminoácidos no porares co-
mo leucina e isoleucina, pro l ina y alanina (41). Se ha observado que l a a l t a r e l ac i in : leucina/isoleu-
cina, contenida en esta proteína, causa pelagra cuando se
consumen considerables cantidades de sorgo cotno alimento
de humanos (42).
i
FRBMBNTACION& TRBDICIONALSS
111.1. Generalidades.
En algunos países de o r i e n t e , principalmente a q u e l l o s
que s e encuentran a l s u r o e s t e de Asia, l'os al imentos más n u t r i t i v o s y económicos s e preparan comunmente p o r f e r -
mentación s ó l i d a 01 semisó i iüa de soya y/.) algunos c e r e a -
l e s con hongos f i iamentosos (43) . Tales p r o d u c t o s t i e n e n
una importante c o n t r i b u c i ó n en l a d i e t a de l a gente , como
f u e n t e básica de prote ína , calorías y algunas vi taminas
(44) .
I11 -2. P r i n c i p a l e s Xlimentos Fermentados.
R 1 f r i j o l ' de soya es l'a f u e n t e 0 1 s u s t r a t o p r i n c i p a l
en l a preparación de una amplia var iedad de a l imentos f e r -
mentados. Entre 10s más importantes ss encuentran, princk-
palmente, l o s c u a t r o s i g u i e n t e s : Piso , , Shoyu, Tempeh y To-
fu . E l miso y e l shoyu se c a r a c t e r i z a n p o s su f u e r t e sa-
b o r , por l o que se usan como condimentos o agentes sabo-
r i z a n t e s , más que como'al imentos n u t r i t i v o s . E l t o f u con- t i e n e mayor cant idad de prote fna y grasa, por l o que con-
t r i b u y e sustancialmente en l a n u t r i c i ó n de l o s consumido?
r e s (43) . E l tempeh, e s e l producto más c o m h y estudiado; c o n s t i t u y e l a base de n u e s t r a i n v e s t i g a c i ó n y por ta l ra-
zón, sus propiedades se d e s c r i b i r á n ampliamente en e l pun-
t o 4.
I
!
. U
111.3. Algunos Uicroorganismos U t i l i z a d o s . ,
Generalmente l a l i teratura sobre microbio logia de a l i -
mentos y fermentaciones , micamente menciona e l u s o de es-
p e c i e s de bacterias Acido-Eáct icas , algunos A s p e r g i l l u s y
levaduras , para l a obtención de a l imentos fennentaaos , y
no hace r e f e r e n c i a a l u s o de hongos f i l a m e n t o s o s , d e l or- den de Tos mucorales, t a n extensamente empleados en muchos
países A s i á t i c o s desde hace c i e n t o s de años (45). Algunos
géneros t a l e s como Rhizopus, Xucor y Actinomucor, s e ca-
r a c t e r i z a n por s u c r e c i m i e n t o extremadamente rápido. Son
capaces de formar grandes c o l o n i a s sobre e l s u s t r a t o a par-
tir de una s o l a e s p o r a ; producen gran cant idad de enzimas
y hasta donde s e sabe, d i o se han reportado una o dos m i -
c o t o x i n a s de algunos miembros d e l orden de l o s Kucorales
(46) Existe una g r a n c a n t i d a d de especies de hongos que han
s i d o u t i l i z a d o s en las fermentaciones t r a d i c i o n a l e s e n e l
o r i e n t e ; s i n embargo, casi todas e l l a s pertenecen a l o s
géneros ya mencionados a n t e r i w m e n t e . 0
En l a f i g u r a No. X, se mencionan algunas de las espe-
c i e s p r i n c i p a l e s para l a obtenc ión de tenpeh, miao, Shoyu
y t o f u .
Para l a e l a b o r a c i ó n de tempeh se usan además, las s i - g u i e n t e s e s p e c i e s de Rhizopus:
- R. s t o l o n i f e r
- R. orysae
- R. a r r h i z u s
- R. f o m a s a e n s i s
R. achlamydosporuz . (45 1.
., "
3111. do:!
]PO.
A l i - Ter-
Tc' (SO.
"'i?
- -1 6-
i:x:paies alimentos producidos por fermentación de soya y
122s consumidores y estado f í s i c o d e l producto (46). dareales; d i f e rentes especies de microorganismos u t i i i z a -
ñicroorganismo Sustrato Apariencia Pr inc ipa les usado en l a b.dSiC0 de l producto. países con-
I Fermentación - - sumidores.
- R. ol'iposporus soya só l i do
Ac. elegans soya g e l K c o r sp
As. oryzae arroz, pastoso Sc. roux i i soya Y
o t ros cerea les
- As. oryzae soya Y l í qu ido Lactobaci l lus sp t r i g o Saccharomyces sp Hansenula sp
Indonesia
China y Formosa
Japón, China y o t ros luga- res de Oriente
China, Japón, F iUp inas y ot ros países o r i enta l es
-1'7-
111.3.1. Breve Descripción d e l Hongo E= oliRosPoruS-
Uno de los hongos f i iamentosos más ampliamente usa-
dos en l a preparación t rad ic iona l de tempeh en paises o- r i en t a l e s y actualmente en Norte América, es Rhizopus
oligosporus, con l a c l a s i f i c a c i ón NBBL 2710; a is lado pr i -
meramente en e l Regional Research Center de l Cepario de
Peor ia, ILLinois , y ahora también disponible como AYCC
22959 (471.
a). c l a s i f i cac i ón .
La base para l a c l a s i f i c a c i ón e i den t i f i cac i ón de
los hongos ea l a morfología de l a s unidades fi lamentosas
o h i f a s y de su conjunto, a s í como de l a estructura re-
productora (451.
Según Alexopoulus e t a l , l a c l a s i f i c a c i ón de e s t e
hongo s e r í a (46) (48):
Super-reino: Eucarionta
División: Wastigomycota
Subdivisión: Diplomastigomycotina
Clase : Zigomycetes
Orden: Eucorale 8
Familia: Kucoraceas
Gknero: BhiZODUS Oli.&?OSROrUS
I
I
-18-
O t r a forma importante de c l a s i f i c a r a a. ol igosporus
e s l a e s t a b l e c i d a por K ü l l e r e t a l (451, (49 ) .
Reino: V e g e t a l
D i v i s i 4 n 2 Fungi
Subdivis ión: iQunycotha
Superc iase : Phycomycetes ( c l a s e
Clase: Zigomycetes ( s u b c l a s e )
Orden: Muc o r a l e s
Pamil’ia: JEucoraceas
Género: Wizopus ol igosporus .
+
+
+ La d i f e r e n c i a que e x i s t e con l a c l a s i f i c a c i ó n dada por
o.tros a u t o r e s , e s e l cambio de e s t o s términos.
b). C a r a c t e r í s t i c a s P o r f o l ó g i c a s .
- - R. o l i g o s p o r u s , presenta h i f a s no, septadas , pol inucleadas . - Posee es torones y r i z o i d e s poco d e s a r r o l l a d o s que gene-
ralmente s e oscurecen al’ enve jecer .
- P r e s e n t a e s t r u c t u r a s de r e s i s t e n c i a llamadas zigosporas ,
después de una reproducción sexual .
- Cuando l a reproducción es de t i p o a s e x u a l , sus e s t r u c -
turas de r e s i s t e n c i a son esporangiosporas. Se encuen-
t r a n dentro de un esporangio , s o s t e n i d o 3 p o r un esporan-
L
-13-
g i ó f o r o , mediante e s c i s i ó n d e l plasma e n porciones.
- Los esporangióforos son cortos y s e o r i g i n a n en nódu-
l o s , en l o s que también s e forman los r i z o i d e s .
- Los esporangios son grandes y generalmente ne&ro".
- Columela h e m i e s f é r i c a y a p ó f i s i s (base d e l esporangio)
en forma de copa.
- m i c e l i o abundante y algodonoso; puede cont inuar s u c r e -
c imiento h a s t a l l e g a r a l l e n a r l a v a s i j a que l o cont iene .
- Carece de esporangio losr
- Abundantes clamidosporas.
- Las esporangiosporas carecen de paredes gruesas y son de tamaño y medida i r r e g u l a r .
- En medio natural ' v i v e como s a p r ó f i t o .
c ) . Aspectos Bioquimicos y F i s i o l ó g i c o s .
- E s t e hongo s e c a r a c t e r i z a por t e n e r desarro l lado un s b -
tema enzimático a l tamente i i p o i i t i c o y p r o t e o i í t i c o .
- La a c t i v i d a d de s u s i s tema a m i l o l i t i c o es m u y baja y
algunas veces casi nula , dependiendo d e l s u s t r a t o por
degradar.
- Además de u t i l i z a r l i p i d o s como fuente de carbono, pue- de c r e c e r degradando azúcares pentosas como ia x i l o s a ;
hexosas , como l a g lucosa y l a g a l a c t o s a ; d i s a c á r i d o s
come l a t r e a l o s a y l a c e l o b i o s a , y p o l i s a c á r i d o s como
e l almidón s o l u b l e .
- .No> puede degradar e l t r i s a c á r i d o r a f i n o s a .
,. -20-
- Como f u e n t e de n i t rogeno , además de p r o t e í n a , puede in- y aminoáci- corporar sales de anonio, como L N H ~ ) ~ so4,
dos como asparagina (C H O N ), para c u b r i r sus reque-
r i m i e n t o s p r o t e i c o s . 4 8 3 2
- Cuando se cul'tiva en medio s ó l i d o Ctubos i n c l i n a d o s o'
p l a t o p e t r i ) , presenta c rec imiento superf i c i a i , desa-
r r o l l a n d o gran cant idad de h i fas e s t o l ó n ; penetra a l
medio a t r a v e z de r i z o i d e s . - S u máxima esporulación Ia a l c a n z a d e s p d s de 7 días,
incubado a 2OoC de temperatura, en medio PDA. - bn medio l í q u i d o , dependiendo de l a a g i t a c i ó n , c r e c e
formando pequeñas e s f e r a s conocidas como " P e l l e t s " .
- Por s u s b a j o s requerimientos de oxígeno, s e clasif ica
como m i c r o a e r o f f i i c o .
- P o r l a temperatura óptima de c rec imiento , s e l e c o n s i b -
ra mesóf i io .
,
L
-21-
, 111.4. Tempeh (pronunciado correctamente: Tern-pay)
IiI .4.1. Def in ic ibn.
El’ tempeh es un al’imento fermentado,, de traaicionál.
consumo en Indonesia. Comiste basicamente de soya f rag-
mentada u otras leguminosas y cerea les ( o ) por combinación
de és tos ) fermentados con R. oligosporus. Los fragmentos
de l a soya y/o r o s cereales, constituyen e l sustrato de
l a fermentación, se hayan completamente unidos por un denso y blanco m ice l i o de aspecto algodonoso durante l a
fermentación. Con e l secado e l producto toma una l i g e r a
co lorac ión café y su forma es m u y s im i l a r a l a de una pa-
lanqueta de cacahuate (dulce de consumo popular en nues-
t r o país) . Su sabor es m u y aceptable y t i ene un agradable
y ca rac t e r i s t i c o oilor a levadura u, hongo (47).
IiI 4.2 . Propiedades.
E l contenido de proteína en e l tempeh de soya es a-
r r i b a de l 46 $, en base seca, 6.19.5 6 en peso h6medo
(47). Su excelente d i g es t i b i l i dad , demostrada por Hacitier
-- e t a i (r964) (53) y s u az to val‘or nu t r i t i v o l a constitu-
ye en un buen sus t i tu to de Ila carne en l a d i e t a de huma-
nos. Se ha observado que el’ tempeh obtenido con c u l t i v a
puro de - R. ol igosporus contiene menores cantidades de vi- tamina Biz, que e l tempeh hecho en forma t rad ic iona l . EB- to- Be debe a que en e l segundo proceso hay una benéfica
-22-
contaminación con l a b a c t e r i a K l e b s i e l l a pneumoniae, l a
c u a l e s responsable de l incremento en el contenido de as-
t a vi tamina, ya que e s capaz &e s i n t e t i z a r l a durante e x
proceso de fermentación ( 4 4 ) (47). También s e ha encontrado que las personas que consu-
men tempeh con regular idad en s u d i e t a , d i f i c i l m e n t e pa-
decen anemia p e r n i c i o s a ( 5 4 1 , causada por d e f i c i e n c i a s de
vitamina B y presentan mayor r e s i s t e n c i a a algunas in- f e c c i o n e s b a c t e r i a n a s (55).
12
CAPITULO I V .
ANALISIS Di3 LA COK?2OGICION Q U B I C A DEL SORGO.
1 V . i . Seiecc ión y Pretratamiento, de l a Semilla.
Para f i n e s de nuestra invest igación, fue neceear io
u t i l i z a r semi l la de sorgo sin t r a t a r con fungicidas n i in-
eect ic idas , u o t ra c lase de agentes químicos de es te t i po ,
para su preservación.
Generalmente cuando se Ievanta l a cosecha de granos,
éstos se hayan infestados por plagas de insectos, a s í
como por algunos microorganismos que constituyen l a mi-
c r o f l o r a natural o nativa, que fác i ihente se desarrol lan
durante su almacenamiento. Por esta razón fue necesario
desarro l la r una técnica que nos permitiera conservar en
buen estado l a semi l la de sorgo, durante l a i n v a s t i g a c i b ,
s i n emplear agentea químicos como se hace comunmente.
i V . 1 . i . Procedimientoi
E1 eorgo. obtenido en el Edo. de Guanajuato, correa-
pondiente a l a cosecha de Septiembre (19811, se d i v i d i ó
en l o t e s de 500 gr y se tamiz¿ en mallas No.8 y No. 10,
con el proposito de obtener granos de tamaño homogdneo,,
así corno, para separar semillas contaminantes, residuos de
eorgo quebrado y basura en general.
de 250 gr y se puso en vasos de precipitados de 1 I t , pa-
ra l a v a r l o t r e s vecee consecutivas con 400 m l de agua
Terminada l a c r iba se subdividid e 1 eorgo en I o t e s
/
-24-
dest i lada a temperatura ambiente y ag i tac ión magnética
durante 5 minutos. Se desechó e l agua de lavado y e l exce-
so de humedad se q u i t & . con papel absorbente. Zn seguida
se metió a secado durante 24 horas a 50 C, en una es tu fa
"Precision" GCA Co. Yodelo> l%,, con cor r i ente de a i r e .
Transcurrido este tiempo se envasó en f rascos de vidrio,
completamente cerrados, de 500 gr, poniéndolos en conge-
l a c i ó n durante 24 horas. Concluido este tiempo se almace-
naron dichos f rascos a temperatura ambiente.
O
Durante e l desar ro l l o de e s t e procedimiento se de jó
un f r asco t e s t i g o que contenía i a misma cantidad de sor- go que los demás, pero envasado con granos unicamente ta-
mizados, con e l ob j e t i vo de observar su deter ioro, a s í
como e l rápido ataque de plagas, durante e l transcurso de
l a invest igación.
1v.2. Extracción de Taninos.
Empleando soluciones de NaOIi, KOH y Na CO , y combi-
naado l a s variables: tiempo,, temperatura y concentración,
se ensayaron aigunos métodos OJ tratamientos con e l fin de
extraer l a mayor cantidad de taninos s i n dañar l a s d i f e -
rentes partes de l a semil la . Algunos estudios a l respec-
to , rea l i zados por Bllessin C.W. e t a l , concluyen que un tratamiento con NaOH a l 20$ a 16OoP i71.11°C), en un ran-
go de 4 a 8 minutos,, se remueve unicamente e l per icarpio,
quedando intactos e l germen y e l endospermo (56).
N8OH o KOH a l 0.276 (0.05V) a 3OoC y 24 horas, o incremen-
2 3
Chavan, J.K. e t a l , reportan que un tratamiento con
. O tandoi l a temperatura a 100 C,. en 20 minutos, se l o g ra ex-
t r a e r de un 75 a 85 $ de l o s taninos t o ta l e s , Tocalizados
principalnente en el: pericarpio. Bajo condiciones s imi la-
res, Na CO se remueve un 77 46; mientras que remojando
con agua dest i lada, unicamente se extrae un 30 $ (57).
Considerando estos resultados y con e l f i n de e v i t a r e l
mínimo daño en l a semil la , se ap l i có un tratamiento térmi- co-alcal ino menos drástico, descr i to a continuación.
2 3
IV.2.l’. Procedimiento.
IniciaiiEente se fijaron l a temperatura y e l tiempo, O de extracción a 50 C y 1’0 minutos respectivamente, mane-
jando cono var iab les tres d i f e rentes concentraciones de
NaOH: 5, 10 y 1 5 $. Preparadas estas soluciones, se adi-
cionaron 25 ml a t r e s matraces erlenmeger de 125 m l , ma-
ne jando cada maestra por duplicado y etiquetando debida-
mente todos los matraces. A continuación se colocaron d i -
chos matraces en un ag i tador g i r a t o r i o con baño de agua
a temperatura constante, Giratory water bath shaker, New
Brunwick s c i e n t i f i c co. model 0-74. Cuando l a s soluciones
en el’ i n t e r i o r de l o s matraces alcanzaron los 50 C s e a-
gregaron 5 g r de sorgo n cada matraz y bajo estas condl-
ciones, se agitó durante 10.minutos. Transcurrido e s t e
tiempo,. se separó rapidamente e l ’ e x t r a c t o de l a semilla
O
se adicionaron 25 Q1‘ be agua dest i lada a cada matraz,
para neut ra l i zar con una so luc ión de ácido l á c t i c o i N, usando un potencibmetro, pH-meter E 520 Vetrohm Herisau.
Posteriormente, l a s muestras fueron puestas nuevamente en
,. , .
-26-
ag i tac ión durante 5 minutos y se midió o t ra v e z e l pH, como había algunas variaciones, se reajustó a 7. Cada
muestra se pasó por una malla No. 20, para separar e l a-
gua de l a semil la, s i n tener pérdidas considerables; e l
exceso de hmedad se qui tó con papel absorbente. Después,
se sometió a secado i a semil la , en las mismae condiciones
d e l punto IV.l. Transcurridas Ins 24 horas de secado se
pesaron nuevamente l a s 6 muestras, con e l f i n de ca l cu lar
e l porciento de materia seca perdida con los tratamien-
tos y se pulverizaron dichas muestras; e l harina se alma-
cenó en pequeños frascos de v id r i o , para comemar la dis-
ponible y en buen estadoy para l as determinaciones poste-
r i o res .
I V . 3 . Determinación de faninos.
Eo8 metodos reportados para l a cuant i f l cac ión colo-
rirnétrica de taninos en sorgo, han s ido modificados y e-
valuados por var ios autores en d i ferentes ocasiones, de-
bido a que l a composición de l a s estructuras po l i f enó l i -
cas de estos compuestos es poco conocida a h , a s í como a
l a interferencia de algunos plgmentos que se hayan asocia-
dos con l o s taninos condensados.
IV.3.l. M6todo de l a Va in i l l i na (W-HCl).
En esta inves t i gacGn e i método seleccionado para l a
determinacldn de taninos es e l establec ido por Burns - e t
- a l (1971) (58), con l a s modificaciones hechas por Naxson-
-27-
/
Booney (1972) ( 59 ) y Price-Butler (1977) (60). Se r e v i s ó
además, l a Última evaluación reportada por Barp F.C.
a l (1981) (61). Este método se basa quimicamente, en l a reacción de
La v a i n i l l i n a con e l a n i l l o "A" de las moléculas de l a s
catequinas g leucoantocianidinas para dar un complejo de
co lo rac ión ro ja , cuya tonalidad depende de l a concentra-
c i ón de estos polimeros.
a ) Procedimientot.
Se pesacon p o r dupl'icado 5 muestras de 500 mg de ña-
rina de sorgo, de l a s cuales 3 fueron de sorgo. con trata-
miento térmico-alcalino, (5,. IO JT: 1'5 % de NaOH),
muestras de harina de sorgo sin tratamiento. A I mismo dos
tiempa,. se colocaron en el' ag i tador g i r a t o r i o los matra-
ces erlenmeyer de I25 m l , l o s cuales contenha 25 mT de
RCI: a l 1% en metanol, cuando, l a solución aTcanzÓ los 40QC,
se agregaron los 500 mg de harina de cada muestra, a los
respect ivos matraces previamente etiquetados. se a g i t ó au- rante una hora . Los tapones de hule. usados para Tos ma-
t races , se cubrieron con papel garafilm,. para e v i t a r que
fueran atacados por e l HCT y se leberaran grupos sul fhi-
d r i l o j d e l hüke,, los cuales a f ec tan l a absorbancia de las muestras (14).
Después de i a ag i tac ión, se centr i fugd e r ex t rac to
a 3500 rpñi durante TO minutos. Del' sobrenadante se toma-
ron 2 al icuotas de 1 ml, de l a s cuales una fue u t i l i z ada
para l a reacción con v a i n i l l i n a y l a o t r a para e l blanco.
-2%
.
Para Xa determinación se agregaron 5 mi de l a mezcla reac-
ción: v a i n i l i i n a a i 4 $ d isue l ta en metanoi y HC1 a l 8 $
en metanoi, mezclados en proporción.T:i; e s ta mezcla se
preparó a l instante de s e r usada, pues por oxidación se
a l t e r a su c o l o r de blanco a amari l lento.
B1 blanco de cada muestra se preparó agregando 1 m i
de ex t rac to a 5 mi de o t ra mezcla semejante a l a de reac-
c i ón pero ?a v a i n i l l i n a fue sust i tu ida por HC1 (2.5 m l de
HC1 a l 4 5 en metanol + 2.5 ml de HC1 a l 8 s6 en metanol),
88 üecir , 5 m l de una solución de HC1 en metanol a l 6 5. A p a r t i r d e l instante en que se adicionaron l a s mezclas
de reacción, con in te rva los de medio minuto entre tubo y
tubo, se cronometraron 20 minutos para toner l a e lec turas
de absorbancia en un espectrofot&netro Bausch and Lomb,
Spectronic 20, puesto a funcionar una hora antes. Ajustan-
do a cero, momentos antes de s e r usado, con 6 ml d e l reac-
t i v o MV-HCl a una longuitud de onda de 525 nm. Por ot ra parte, el sedimento obtenido> en los tubos
después de l a centr i fugación, se resuspendiói con oitros
20 m l de HC1 a l 1’ $ en metanol, agitando vigoroeamente en
un Vortex-Genie, y se t r a n s f i r i ó a los matraces de 125 m i
para e fec tuar una segunda extracción, incrementando e i
tiempo, a doe horas Pasado e s t e tiempo, se hizo! l a deter-
minación de l a misma manera que l a primera vez. Con e l
sedimento> se e fec tuó~uas Última extracc ión durante 3 ho- rae B se r e p i t i ó i a determinación.
-29-
b). Curva Estandar. ?
Debido) a que no, fue posible adqu i r i r l a D-catequina,
i a curva patrón se preparó empieando.taninos naturales obtenidos de Acacia (Donados por Interco s. A,) con un
grado de pureza d e l 71.7 $, procediendo, de l a s iguiente
manera:
139.47 mg de taninos fueron pesados y disueltos en
una solución de HC1 a l 1% en metanol, a forando,a 50 m l .
Con e l f i n de separar l a materia insoluble, se filtró a
vac í o ut i l i zando una capa doble de papel Watman Nb. 5. A p a r t i r de esta solución s tock se prepararon i o di luciones,
variando l a concentración de 0.02 a 2 mg/ml!. En seguida
se tomaron a i icuotas de i m l de cada diluci.6n y se trans-
f i r i e r o n a tubos de ensaye que contenían 5 m l de l a mez-
c l a r eac t i vo ETV-HCl. Transcurridos 20 minutos se leyeron
l a s absorbancias de l a s 10 muestras.
iía preparación de l a curva patrón se hizo, junto) con
l a de las primeras extracciones de l a s muestras problema,
con e l f i n de tener un Zote de Xecturas.
IV.3.2. Método del: Complejoj Azul de Prusia.
Price y Butler (1977), (60) desarrol laron un método
cuantitativo para determinar feno les t o t a l e s en e l grano de sorgo, 20s cuales son capaces de reducir e l cl’orurs
i 6 r r i c o a c loruro f e r roso y éste reacciona con e l f e r r i -
cianuro Be potasio dando e l complejo soauble ferr ic ianuro j
i6 , r r i co de potas ia , cónociao.como h u i de Pruaia.
in ic ia lmente l a mezcla r e a c t i v a de c i o rum férricob y
- -30-
f e r r i c ianuro de potasioxes amari l la , pero en presencia de
pequeñísimas cantidades die los reductores fenó l icos , una
parte de l f err ic ianuro , reacciona con e l ión f e r roso ya
reducido por l o s fenoles, para producir e l pigmento azul
que es d i lu ido en e l r es to d e l f e r r i c ianuro en solución,
apareciendo una coloraci6n verde, que cambia a turquesa
y a azul en presencia de mayores concentraciones de feno-
les.
a)!. Erocedimiento.
La extracción de los taninos condensados fue hecha
en tuboe de centr i fuga con 6 nrl' de HC1 a2 l% en metano1
y muestras de 60 mg de harina de sorgo, a l o s d i ferentes
tratamientos y s i n t ratar , pesados en portaobjetos. Los 8
tubos que contenían e l harina y e l solvente fueron tapa-
dos con papel parafilm y se agi taron durante un minuto en
un ag i tador vortex-genie. Inmediatamente después ae cen-
trifugó a 3500 rpm durante 10 minutos. EI sobrenadante
se diluyó. en 50 m l de agua desti lada, contenida en matra-
cea erlenmeyer de 125 m l y e l aedimento se suspendió con
6 ml de agua desti lada, agitando duxmiiie un minuto. En seguida se centrifugó., adicionando e l sobrenadante a Tos
matraces respectivo€?, y se de jó reposar durante 30 minu-
tos, con e i propósito de que Be el iminara ex a i r e aisuel-
to, en e i metanox durante i a extracción.
Transcurrido e s t e tiempo, se agregaron 3 m l de l a so+
X!uciÓn de c loruro f d r r i c o 0.1 iU dieue l to en HC1 0.1N g 3 mT de f e r r i c ianuro de potasio 0.008 E, cronometrando el!
c
-31-
.
e l tiempo. de adic ión; a los 10 minutos se l e y ó l a absor-
bancia a 720 nm, a jwtandm el' espectrofotómetro, Varian-
Techtron rodelo. 634, a cero con una d i luc ión preparada de
i,cgaal forma, pero omitiendo e l extracto de harina de sor-
eco *
b). Curva Patrón.
De l a misma manera que en e l método de E V - H C l , l a
curva estandar se construyó emplean do^ taninos condensadcm
naturales, en i-ar de ácido tanino como sugieren algunos
autores, por considerar que a i ser és te un tanino s inte-
tico e h idro l i sab le , es menos representativo.
Se preparó una soluci&n stock con 139.47 mg de tani-
nos disue l tos en HC1 a l 1$ en metanal,. aforando a IO0 m l d
Se filtró, dicha solución y a p a r t i r de és ta se prepararon
l a s d i f e rentes d i im iones , variando i a concentración de
EO a 1'50 y9/"1. Posteriormente, se s iguió e l procedimien-
t o descr i to en e l primer inc i so , procurando l e e r l a s ab-
sorbancias, tanto de l a curva patrón como de las muestras,
en un sólo l o t e .
h e d i a t a m e n t e después de terminar e i l o t e de lectu-
ras, l a s f o toce ldas fueron lavadas perfectamente con una sozucián saturada de ác ido oxái ico, ya que el: c o l o r de
e s t e complejo se impregna demaaiado y resu l ta muy d i f i c i l !
qu i tar lo , si. se deja t ranscurr i r algún tiempo.
c
-32- ,
I IY.4. Determimación de Almidón. \
I
La cantidad de almidón presente en e l grano de sor-
go. u t i l i z ado , se determinó por e i método de Fairbairn,
(621 e l cual se basa teoricamente en l a h id ró l i s i s t o t a l
d e l almidón con e l reac t i vo de antrona (obtenido con an-
trona pura d isue l ta en ácido> su l fú r i co concentrado). Es- t a mezcla r e a c t i v o h id ro l i sa dichos porímero hasta su uni-
dad más simDie que es i a giucoea, y es ta forma un queia-
t o co l o r ido con l a antrona. Dependiendo) de l a concentra-
ci6n de glucosa i a coioracihn va r í a desde un tono verde
Timón transparente hasta azu l oscuro.
En e l primer paso ente técnica, es l a extracción de
1’0s carbohidratos t o ta l e s contenidos en l a s muestras de
harina de sorgo, En seguida, a l almidón se separa de a d -
care8 sojLubles como glucosa,. fructuosa y sucrosa (16), prhcipaihente, . empleando para e s t e f i n una eoiución
e tano i a i S@$. Posteriormente, se procede a d i s o l v e r e 1
almidón de l a f r acc i ón s ó l i da obtenida después de l a ex-
t racc ión e tanói ica , adicionando. una s o ~ u c i ó n de ácido1
pe rc l ó r i co a l 52%. que es un excelente so lub i l i zante de
dicho po l isacár ido , (63). 21’ almidón a s í 8olLibil izado se
a i s i a por i a formación de un querato co;lorido (armidón-
yodo) que se l o g r a al‘ ad ic ionar una solución yodo-yoduro
de potasior E1 complejo a s í formado,, e s desintegrado en almidón y Iodo. Una ve z l i b e rado e l ’ almidón se determina
co~orimetr icamente con er r e a c t i v o ae antrona.
de
-33-
a ) . Procedimiento.
Preparación de l a s muestras. Se pesan 500 m~ de se-
m i l l a de sorgo sin t r a t a r y se muelen hasta obtener una f i n a harina que pase por marla No. 40. Se toman 2 mues-
t r a s de TOO mg, y 6 más de harina de sorgo sometido a l oa
3 d i f e r en t es tratamientos térmico-aicaiinos.
Bxtracci6n de Carbohidratos. Pesadas l a s 8 muestras,
se t rans f i e ren a tubos cónicos de centr i fuga de 50 m l , hu-
medeciendo e l harina con 3 gotas de e tano i a i 80 96. Se
agregan 5 m l de agua dest i lada y se a g i t a vigorosamente
en un ag i tador Vortex-Genie, 2 minutos. En seguida los tu- bos se sumergen durante 2 minutos en baño de agua cal ien-
t e , entre 60 y 65 OC. Transcurrido e s t e tiempo, se sacan
y se l e s agrega 25 mr de e tano l a l 80 $ g nuevamente se
ag i t an 5 minutos, a a l t a velocidad. Poster iomente , los tubos se ponen o t r a v e z en e l baño p o r dos minutos y sea-
gitan. Ea mezcla se en f r i a a temperatura ambiente y 88
centr i fuga 10 minutos a 3500 rpm. Los sobrenaaantes 8e de-
sechan y a l o s sedimentos empacados en ToB tubos, se les rypricrr ex mismo tratamiento, de extracción 3 veces más.
SoXubilizaciÓn d e l AlBiiidÓn. Terminada l a extracc ión de
Toe carbohidratos, se adicionan 5 mP de agua dest i lada a l
& . i d o contenido en los tubos y se ag i t a fuertemente has-
t a homogenizar l a mezcla; en seguida l o s tubos se meten
en baño de agua h i r v i en t e durante 15 minutos. Se en f r ían
a temperatura ambiente y se l e s agrega 6.5 m l de ácido>
-34-
percl6ri.c temperalaid ambiente, se sacan dichos tubos y se ag i tan
3 veces en lapsos de 5 minutos. Después de es ta ag i tac ión
se l e s adiciona 20 m l de agua dest i lada, se ag i tan y se
centr i fuga 15 minutos a 3,500 rpm. E1 sobrenadante obte-
nido se t rans f i e r e a un matraz aforado y el‘ sedimento1 se
resuspende con 6.5 m l de ác ido percPÓrico; se agregan 1’0
m l de agua dest i lada, se homogeniza y se centr i fuga como en e l caso anter ior . E l sobrenadante se t r ans f i e r e a l ma-
t r a z y e l sedimento se desecha. Se a fo ra con agua desti-
Yada y e s t e ex t rac to se f i l t r a en un embudo con f i l t r o
de v i d r i o o en un buchner con f i l t r o de lana de v id r i o .
Formación de l Quelato Almid6n-yodo. Se toma una a l í cuo ta
de 1’0 r n l y se t rans f i e r e a un tubo. de centr i fuga, ad ic io-
nando 5 m1’ de NaCl a l 20% y 5 ml. de yodo-yoduro de pota-
sio, se a g i t a en Vortex 3 minutos y se deja reposar 20.
En seguida, se centr i fuga 1’0 minutos a 3,500 rpm; se de-
secha el’ sobrenadante, separándolo cuidadosamente para
e v i t a r pérdidas de l sbi ido, ex cual ’se l a va 2 veces con
10 ml de cl’oruro) de sodio en etanol‘, agitando) 4 minutos
en vor tex a a l t a ve loc idad y centrifugando 10 minutos a
3,500 rpm. En cada lavado1 se desecha el’ sobrenadante.
a l 52%. Se ponen 2 minutos en baño agi tado a
A l só l ido jobtenido en cada tubo se l e agrega 4 ml’ de
una solución de NaOH etanÓ1ico.i 0.25 N y se a g i t a hasta
que e l c o l o r azu l desaparezca completamente. Estas solu-
aiones son centrifugadas a 3,500 rpm 10 minutos, dese-
ciiando el! sobrenadante. S l s ó l i d o de l o s tubos se l a va y
.
.
1)
L
-35-
se centri fuga, como en el’ caso anter ior . B1 sedimento la -
vado se s o lub i l i z a agitando vigorosamente con 5 m l de a-
gua dest i lada a 65 C. Las soluciones que se obtienen son
t ransfer idas a matraces aforados de 50 a, lavando 10s
tubos de centr i fuga con agua dest i lada 3 veces y l a s aguas
se adicionan a l matraz afomndo finalmente con agua des-
tilada.
O
b). Determinación.
De cada matraz se tomó una a l ícuota de 1 ml de l a
solución de almidón, que contiene aproximadamente de 20
a 200 p? Y se di luye a 10 ml’ con agua desti lada. De es-
ta nueva solución se toman por duplicado ai ícuotas de i
m l y se di luyen a 2 con agua desti lada. Los tubos con es-
ta solución su sumergen en h i e l o frap.pé, hasta que l a
temperatura sea aproximadamente de 4 C, y se l e agregan
10 m l de l r eac t i vo de antrona, también a 4 C y se ag i t a
suavemente sin sacar los d e l baño de h i e l o - Una vez que l a
mezcla adquiere un c o l o r amar i l lo o amarillo-verdoso, se sacan l o s tubos y se meten a un bazo de agua h irv iente ,
durante 15 minutos o hasta que desarrol len su &imo co-
l o r . Transcurrido e l tiempo necesario,, se sacan rapida-
mente y se pasan a un baño de agua f r í a . cuando su tempe-
ratura es igual a de1 ambiente se l e en l a s absorban-
cias a 620 nm en un espectrofotómetro Spectronic 20, pre-
viamente ajustado a cero con e l r eac t i vo de antrona tra-
tado de l a misma forma que l a s muestras.
O
O
.
c
-36-
c). Curva Estándar
La curva patrón se prepara con i o di luciones de
D-Glucosa, variando l a concentración de O a 200 /llghll;,
siguiendo e l misma. procedimiento para l a determinación de
a lb idón en l a s d i f e rentes muestra8 y tratadas junto con
éstas . XV.5. Determinación de Proteína.
Los métodos seleccionados para e l a n á l i s i s de prote i -
na, en e s ta invest igac ión fueron: Biuret y Rjeldahl. Pa-
ra l a s muestras de harina de sorgo se u t i l i z ó Kjeldahl’,
miestras que l a proteína de l a biomasa se determinó p o r
ambos métodos, descr i tos a continuación.
IV.5.1. ?&todo de Biuret.
i3sta tdcnica color imdtr ica, descr i ta por Herbert fi - a l (641, es una de las más empleadas para l a determina-
ción de protefna en cé lu las microbianas. Se basa en l a
formación de l quelato Cobre-proteína que da una coloración
sa&-violeta, en soluciones aicarinaa.
En es ta determinación se requiere l i a a r previamente
l a s cé lu las con una solución concentrada de NaOH, para que sua proltefnas sean l iberadas a l medio y éstas puedan
reacionar con e l su l f a t o de cobre acuoso, agregado.
La mezcla e s centrifugada con e l f i n de separar e l exceso de cobre jun to~con e l NaOH y o t ros residuos celu-
la res .
1
I
.
En e s t e método, s i n embargo, puede haber algunas i n -
t e r f e r e n c i n s debidas a elevadas concentraciones de gluco-
sa u o t r o s azúcares reductores que s e caramelizan con e l
calentamiento alcal ino, dando; un c o l o r amarillo f u e r t e ;
a s í como a l a p r e s e n c i a de substanc ias que reducen e l
s u l f a t o de cobre a 6xido de c o b r e , por l o cual es reco-
mendable s e g u i r cuidadosamente l a t é c n i c a de pesar un
máximo de 5 mg de muestra en base s e c a .
a),. Procedimiento.
Con e l f i n de obtener s u f i c i e n t e rnicelio. para l a de-
terminación de p r o t e h a p o r los métodos de B i u r e t y Kjel -
d a h l , primeramente 88 prepararon 4 F a t r a c s a erlenmeyer
de 500 m l , l o s c u a l e s contenían 300 m l de un medio e n r i - quecido, cuya composic ión e s is s i g u i e n t e :
Glucosa Peptona
K2H?204
Ext . Cev.
Bio t i n a
CaC12
N a C l
PH
1 5 g r h t I1 8
2
2
U
U
80~1'0-~ u
11 0.1
0.1
4 -5
~ e s p u 6 a de s e r debidamente e s t e r i l i z a d o s , dichos ma- t r a c e a fueron inoculados y puestos en a g i t a c i ó n a 3 4 ' ~ y
5 unidades de ve loc idad, segiui is e s c a l a d e l a g i t a d o r (SIiratory water bath shaker , New Brunwick s c i e n t i f i c co .
-38-
Rodel G-74. El ’w t ra z que s e r í a u t i l i z ado para l a técnica de biu-
ret, unicamente se de jó en ag i tac ión 24 horas, los demás
se dejaron 84.
E l mice l i o d e l primer matraz fue separado de l medios
de crecimiento f i l t d n d o l o a vac ío en un embudo buchner,
con papel’ f i l t r o NO.. 4 y lavándolo a i mismo tiempo con
agua desti lada, var ias veces. Después del último lavado,
e l m i ce i i o fue t ransfer ido a un macerador de t e j i d o s ma-
nual, marca Pyrex, con el: propósito de obtener una suepen-
siÓn completamente homogdnea. De esta suspensión de mice-
l i o se tomaron 4 al ícuotas de 2 m i , de l a s cuales 2 se u t i l i z a r on para l a determinación coior imétr ica y l a s o-
t r as fueron t ras fe r idas a c r i so l e s , previamente puestos
a peso constante, con e l f i n de obtener e l peso seco de
l a biomasa contenida en l o s 2 m l ocupados para l a reacción
coior imétr ica.
Las muestras usadas para l a cuant i f i cac ión de prote í -
na se pusieron en tubos cónicos de centr i fuga, adicionan-
do 1’ m l de NaOH 3 N a cada tubo. En seguida los tubos se sumergieron en baño de agua hi rv i ente durante 5 minutos.
Transcurrido e s t e in te rva lo de tiempo, l o s tubos se pasa-
ron a un baño1 de agua f r í a , y cuando l a temperatura de
éstos iguaIÓ a l a de l ambiente, se agregó 1 m l de una so-
IUciÓn acuosa de su l f a t o de cobre a l 2.5s (p/v), se tapa-
ron con papel paraf i lm y se ag i taron fuertemente. Después
de 5 minutos de reposo :Los tubos son centrifugados a
P0,OOO rpm durante 10 minutos. E l sobrenadante obtenido
.
- -39-
se l e y ó en un espectrofotómetro Bausch and lomb Spectro-
n i c 20 a 555 nm. Por ot ra parte, e l m i ce l i o contenido en los 3 matra-
ces restantes fue separado de l medio de crecimiento de
l a misma manera que e l anter ior . Después de s e r lavado se
sometió a secado durante 24 horas a 7OoC y se molió para
tener e l harina l i s t a para l a determinación de proteína
por e l método de KjeldahX.
ml' de agua dest i lada en lugar de proteína eetandar o s w -
pensión de cél'ul'as. & t e blanco se m a para a justar
espectrofotómetro a cero, o bien, se l e e y l a absorbancia
de éste se resta a las de l a s muest&s.
Se prepara junto con l a s muestras, un blanco con 2
e l
b). Curva Estándar.
&a proteína de las muestras fue caicuiada ut i l i zando
una curva patrón de Absorbancia vg mg de proteína están-
dar, preparada de l a s iguiente manera:
Se tomaron 2.27 ml de una solución s tock de Q-Albu-
mina a i 2246 (p/v) y se i i e va ron a 100 mi. h p a r t i r de es-
ta solución se obtuvieron las s iguientes concentraciones:
0.5, 2, 2, 3, 4 y 5 &mi. Posteriormente se s i gu i ó e l
mismo procedimiento que en l a s muestras, hasta terminar
i s técnica.
.. -4.0-
IV.5.2. ?&todo de Kje ldahl .
E l método más usado para l a determinación cuantita- t i v a de proteína en granos, es e l de K je ldah l (65). No
es recomendable usar técnicas colorim&ricas, como Biuret
o Folin-Cicalteau, debido a l a in te r f e renc ia de taninos,
almidones y o t ros compuestos so lubi l i zadoe con e l NaOH
empzeado para l a l i s i e ce lu lar .
El método de Kje ldahl , se basa en l a oxidación d e l
nitrogen0 de l a materia biorgánica, por ebu l l i c i ón con
H2S04 concentrado, hasta amoniaco, e l cual con e l exceso
de ácido queda como su l f a t o de amonio.
E1 hidrógeno y e l carbono de l a materia son oxidados
hasta R20 y C02. La ve loc idad de reacción de es te proce-
so ox ida t i vo 8e incrementa adicionando un cata l i zador que
puede s e r F2S04, Óxido de mercurio, su l f a t o de cobre an-
Hidro, omuna mezcla de sulX'ato f e r roso y se lenio.
Después de l a ebu l l i c i ón (d igest ión t o t a l ) e l amonia-
co se l ibera por adición de NaOH y se d e s t i l a recibiendo-
se en una soluci6n de ácido bór ico a l 496.
Reacciones:
l-. Digestion:
3 C H O N S + (muestra ) H2S04
A H2S + H20 + GO2 + NH
NH + H2S04(exceso) ( m4 ) p4 3
-41-
! 2. Des t i lac ibn:
i Na2S04 + NH t+ H2Q, 3 (NH4)2S04 + NaOH
B N H 3 + H B 0 - 4 8H + H2B03
3 3
3 0 Tlitulación:
Nñ4Cp + H BO ( v i r e ) 3 3
C d l C u l O S :
(V HCG- V HCBB) x 0.014 x N X I00 $ N’= I? de M
$ N = Porciento de nitrogen0 en l a muestra
V HC1,= Volumen de HCl gastado en l a t i t u l a c i ón de l a
V H C ~ B = Volumen de HC1 gastado en l a t i t u l a c i ón del’ blan-
N = Normalidad e l ácido t i tu lante .
P de M = Peso de l a muestra, en gramos.
$ P = Porciento tie proteina.
f n f a c t o r de conversión, de porciento de a t r o g e n o a par-
muestra. ‘
co.
c i ento de proteina.
. -4.2-
i) . Procedimiento.
2 . Diges t ión . Se c o l o c a 2 g r de l a muestra en un ma-
‘Faz k j e l d h a l de c u e l l o l a r g o y se agregan 3 g r de mez- !la d i g e s t o r a , pesando cuidadosamente. S e c a l i e n t a e l ma-
+az y s e agregan 20 ni de á c i d o s u l f ú r i c o . En seguida,
% cont inúa l a d i g e s t i ó n hasta que l a mezcla reaccionan-
% quede completamente i n c o l o r a y luego durante 30 minu-
$09 más.
2. D e s t i l a c i ó n . Tenninada l a d i g e a t i ó n , s e e n f r f a n
;as muestras y s e lea agrega 1 5 0 ml de agua d e s t i l a d a ,
%O ml de NaOH al: 4046 y dos g o t a s de f e n o l f t a l e h a , para
k r s i l a s o l u c i ó n e a básica ( c o l o r rosa) : s e l e agrega
. ,araf ina , como antiespuman$e y polvo de z i n c , como cata-
Zizador. s e conec ta e l matraz a uc r e f r i g e r a n t e cuya sa-
: i d a ea sumergida en 70 m l de á c i d o b ó r i c o a l 4% y g o t a s
:e anaranjado o r o j o de meti lo , . hasta o b t e n e r un volumen
% 1‘40 m l , aproximadamente.
3. Valoración. Después de l a d e s t i l a c i ó n s e d e j a n
< a f r i a r l as muestras y s e v a l o r a n con á c i d o c l o r h í d r i c o
‘$.I Nt hasta e l v i r e a c o l o r naranja o r o j o t dependienda
C.el’ indicador u t i l i z a d o .
Se prepara también, un blanco y un estándar . El ma-
h a z con e l b lanco c o n t i e n e todos ros r e a c t i v o s excepto
Ea muestra: e l e s t á n d a r c o n t i e n e un compuesto) cuya c a n t i -
Oad de nitrogeno. e s conocida.
CAPITULO V.
i FERM?NTACION.
v.1. Preparación de l Sustrato.
El’ primer paso] para Xlevar a cabo) e s t e proceso f e r -
mentativo, fue l a ppricación de ros tratamientos térmico-
aicai inos,. seleccionados para l a destanización parcial’
d e l sorgob siguiendo e l procedimiento descr i to en e l pun-
t o IV.2.1. ; ut i l i zando en es t e caso ) l o tes de 250 g para
cada una de l a s d i ferentes concentraciones de hidroxido
de sodio,, y- modificando el’ pH a 4 con ácido l á c t i c o . Des-
pués d e l tratamiento, se f racc ionó e l grano y se aimace-
nó en f rascos de v id r i o .
V.2. Obtención del’ Inócul-o.
Con e l f i n de obtener una cantidad su f i c i ente de es-
poras se prepararon 10 tubos incl inados de 75 m l . C i n c o
de los cuales contenían 15 m i de medio papa, dextrosa
agar (PDA) y 1’0s ot ros cinco fueron preparados con 4 gr
de sorgo>fraccionado, s i n tratamiento)térmico-aicaiino 9
adicionando, 8 ml’ de agua dest i lada, acidulada con ácido
l á c t i c o a pH 4 y con ol igoelamentos (ADACLO). Poster ior-
mente l o s tubos fueron e s t e r i l i z ados a 15 lb/in , duran-
t e 1‘5 minutos, e inoculados con esporas de l’a cepa o r i g i -
nal’ de R. oligosporus, c l as i f i cada en e l cepario como
ATCC-22959, y se incubaron a 32OC durante 5 días (51),.
para que alcanzaran su máxima esporuación.
~r
2
.
-44-
La suspensión de esporas para ei i n ó c u i o s e obtuvo I
de l a s i g u i e n t e forma:. Hanteniendo la e s t e r i l i d a d , s e Bdicionaron 1 5 m l de
agua ADhCLO e s t é r i l a cada uno de Tos tubos con medio €DA
y fueron ag i tados vigorosamente en un a g i t a d o r v o r t e x ,
teniendo cuidado de no d e s t r o z a r e l medio. t a suspensión
homogénea obtenida e n los tubos f u e t r a n s f e r i d a a un ma-
t r a z erlenmeyer de 100 nil, previamente e s t e r i l i z a d o .
V.3. Primer Proceso de Fermentación.
Una vez preparado el! s u s t r a t o y obtenido el kiócul'o,
s e procedió, a e f e c t u a r l a fermentación, en l a que se ma-
ne j ó POT dupyicado sorgo a cuatro ' d i f e r e n t e s condic iones :
Sorgo sin t ra tamiento (SST).
Sorgo con t r a t a m i e n t o a l 5% (SCT5). Sorgo .con t ra tamiento a i 10% (SGTIO).
Sorgo. con t ra tamiento a l 15% (SCTT5).
B a t e primer proceso f e n n e n t a t i v o s e divididaen dos l o t e s :
a). Lote con s u s t r a t o sometido a e s t e r i l i z a c i ó n .
b). Lote con s u s t r a t o sometido a t ra tamiento a s é p t i c o
En e 1 primer l o t e , porciones de 3 gr de s u s t r a t o
fueron t r a n s f e r i d a s a ocho. cajas p e t r i pyrex (60x15), a-
dicionando 5 m2 de agua ADACLO. Poster iormente l a e cajas 2 p e t r i fueron oster i i ' izadas e n autoc lave a 1 5 lbf/in de
p r e s i ó n , durante 15 minutos. Después de l a e s t e r i l i z a c i ó n
se procedi& a i n o c u l a r 'todas las cajas p e t r i con t r e s m i
-45-
O de suspensión de esporas y se incubó a 32 C durante 96
horas. En e l segundo Tote, ocho muestras de 3 g r de sustra-
to , fueron sometidas a un tratamient0.de asepcia que con- s i s t i & , e n mantener dichafl porciones dentro de una estufa
a 65OC de temperatura, durante 6 horas. Despds de e s t e
tratamiento, l o s d i f e rentes t i pos de sustrato se trans-
f i r i e r o n a su9 respect ivas ca jas p e t r i pyrex (60x15), es-
t é r i l e s y debidamente etiquetadas. En seguida se l e s adL-
cionaron 5 ml de agua ADHCLO es té r i l ’ y se dejaron remojar
p o r una hora; transcurrido e s t e tiempo, los medios fue-
ron inoculados con 3 m i de suspensión de esporas e incu-
bados junto con e l l o t e anter ior .
Bn ambos casos se s i gu i ó l’a fermentación, haciendo
observaciones cada 6 horas; és tas s i r v i e r on basicamente
para mejorar e l segundo proceso.
V.4. Humedad de l Medio.
Ca humedad de lbs medios de fermentación se calculd
considerando ros m i l i l i t r o s de agua agregada en forma de
i n k d o , y i a empleada para i a e s t e r i l i z a c i ó n o e l remo-
jo\ del’ sustrato, La humedad i n i c i a l d e l sorgo se tomb>
como! cero. De es ta manera, l a humedad r e l a t i v a de los me-
dios se obtuvo con el’ cociente de l a ecuación dada: i
$ h p (A + B) TOO (A + B + C )
.
L
-4 6-
$ h = porciento de humedad i n i c i a l d e l medio
A = masa de l agua agregada como inócuio.
B = masa de l agua agregada para l a e s t e r i l i -
zación o remojo d e l sustrato.
C = masa del sustrato.
v.5. Segundo, Proceso1 de Fermentación.
Este proceso e fectuó siguiendo e i procedimiento an-
t e r i o r , pero modificando algunos parametros, en base a Tos resultados obtenidos en e l primer proceso fermenta-
t i v o .
l’). Se increment6 l a humedad de l mediob. adicionando 6 m l de agua en todas l a s cajas pe t r i .
2). 61‘ tamaño del’ inóculol también s e increment6 a 4 idl,
en lugar de t res , con l a misma concentración de
esporas, aproxiaadamente.
3). Se suprimió, l a fermentación en e l medio) et iqueta-
do, como SCTl’5.
4 ) . BE tiempo de fermentación se redujo, a 72 horas.
5 ) . Después de ia e s t e r i l i z a c i ón , e l sustrato conteni-
do en loa p la tos p e t r i , fue removido para desempa-
Carlo, ya que con e l c a l o r y l.a humedad, e l almi-
d6n de i a semi l l a se g e i a t in i za , d i f i cu l tando Ta
penetración de l a s h i f a s d e l m i ce l i o hasta e l fon-
Bo de l a caja. Esta operación se e fectuó mantenien-
do l a s condiciones de e s t e r i l i d ad en e l medio.
L
-4.7-
. En ambos Totes se posaron l a s cajas p e t r i entes de
meterlas a incubación.
V,6. Prueba de Sebanado.
En estos procesos de fermentación s ó l i da es m u g im- portante determinar l a textura y comis t enc ia d e l produc-
to , debida a l crecimiento y penetración de las h i f a s d e l hongo en e l sustrato. Por esta razón se ap l i ca l a prueba
de rebanado, l a cual consiste en hacer var ios cor tes
transversales 9; examinar l a s fracciomes en microscopio de
disección para observar l a distr ibución del’ m ice l i o sob=
e l sustrato, Xsta prueba se apXica antes de someter ei!
producto a secado.
V.7. Secado d e l Alimento.
Al’ terminar e l proceso de fermentación y despds de
r e a l i z a r l a prueba anterior,, e l al’imento,fue sometido a secado, en una estufa a 70 C durante’ 1’6 horas. Después
de este tiempo, las cajas que contenían e l producto se dejaron en f r ia r , hasta temperatura ambiente, y se pesa-
ron nuevamente.
O
Por Úl-timob. l’os diferentes Zotes fueron pu lver i zadw
e l contenido de proteína s e determinó por e l &toa0 de
kje ldahl , descr i to anteriormente, en e l punto LV.5.2.
-4 8-
.
I V . 8 . Permentación Sumergida. I
Con l a f i n a l i d a d de v e r i f i c a r s i hubo h i d r ó l i s i s de I
almidón, y pérdidas de p r o t e í n a durante el: t ra tamiento t é r m i c o - a l c a l i n o a p l i c a d o a l a s e m i l l a , se prepararon d i -
f e r e n t e s medios para fermentación sumergida, u t i l i z a n d o
eT e x t r a c t o de dichos t r a t a m i e n t o s ; y suponiendo que de
haber almidón y p r o t e í n a s o l u b i l i z a c o s y d i s p o n i b l e s e n
e l e x t r a c t o , R. o l i z i s p o a seria cap& de c r e c e r b a j o e s -
tas condic iones .
Considerando oue e l almidsn es e l p r i n c i p a l coaponen-
t e d e l sorgo y que s e encuentra , aunque en bajas c a n t i -
d a d e s , e n las &pas más cercanas a l a cáscara de l a s e v i -
l l a , s e r i a f a c t i b l e una h i d r ó l i s i s de éste s i n afectar e n a b s o l u t o a l a p r o t e í n a , que se halla en e l endosperm0
principalmente ; e n base a e s t o , se prepararon medios con
e x t r a c t o adicionando ni trogeno. La f u e n t e u t i l i z a d a , t e o -
r icamente sería de f á c i l a s i m i l a c i ó n para e l h o x o .
Finalmente, restaría a n a l i z a r l a p o s i b i l i d a d de Que
- R. ol inospn-us
z imát ico degradador de t a n i n o s , y que u t i l i z a n d o é s t o s
como f u e n t e de carbono, y no1 e1 almidón h idror izado , pu-
d i e r a c r e c e r e n los medios preparados con e x t r a c t o . Para
c o r r o b o r a r é s t o y t e n e r a lguna información d e l comporta-
miento de e s t e hongo en ta les condic iones , se prepararon medios con t a n i n o s , d e l misma t i p o de l o s que s e han veni-
do usando desde e l p r i n c i p i o de l a i n v e s t i g a c i ó n .
fuera cap& de d e s a r r o l l a r un sistema en-
. -4.9 -
(SE, n e c e s a r i o , s i n f:mbargo, a n o t a r a q u í que mayores
i n v e s t i g a c i o n e s a l r e c p e c t o d e s v i a r í a n e l o b j e t i v o Fro-
puezto i n i c i a l m e n t e . & t e punto s e r € motivo de un e s t u -
d i o complementario a nuestro t r a b a j o ) .
Los medios s e d i v i d i e r o n e n ' d o s grupos: Nedios con
faente de n i t rogeno y medios s i n f u e n t e de nitrogeno.
En e l primer caso, 50 m l de e x t r a c t o de las d i f e r e n -
t e s muestras, fueron t r a n s f e r i d a s a matraces erlenmeyer
de 125 m i , a jus tando e l pH a 4 , con ác ido . I á c t i c o , y a d i -
ckonando i gr/it de s u i f a t o de amonio. di segundo grupQ,
de matraces se preparó de i g u a l forma, pero) sin a d i c i o n a r
f u e n t e de n i t rogeno . Al mismo. tiempo. s e prepararon también d i f e r e n t e s me- . .
con tan inos de o r i g e n v e g e t a l , como fuente de carbono.
Las concentrac iones manejadas fueron: 5 , 10 y 20 gr/ l t .
S e u t i l i z ó i a mima f u e n t e de nitrogeno, en igual' cant idad.
La composición d e l medio t e s t i g o u t i l i z a d o en e s t e
l o t e , fue :
Ghcosa 30 g r / l t
dxt. de Lev. 1 I'
'2"4 I "
0.1 'I
8.1
- Ajo-
Todos los matraces de e s t e l o t e , delbidamente e t i a u e -
t a d o s , fueron e s t e r i l i z a d o s y posteriormrnte inoculados
con asa, tomando l a s esporas de hongo c r e c i d o e n un medio\
de PD.4; e n seguida se incubaron a 32 C durante 10 días ,
en un baño de agua a temperatura c o n s t a n t e y agi tac ibn
controlada.
O
Creemos que es imporatante a n o t a r que i a c o l o r a c i ó n
de l o s medios con t a n i n o s , tomó, un c o l o r café oscuro con
ia e s t e r i l i z a c i ó n , i n t e n r i z i c a n d o s e conforme se incremen-
taba la concentrac ión &e t a n i n o s .
,
CAPITULO VI.
RESULTADOS Y C0NCLUSIO:US
.
B1 a d l i s i s de l o s resultados fue hecho de acuerdo a
loa datos obtenidos en e l t raba jo experimental. La prime-
ra parte se h i zo con e l f i n de determinar la composición
química de l grano de sorgorut i i i zado.
La cuant i f i cac ión de los componentes d e l grano inclu-
ye unicamente l a s substancias de mayor re levancia para l a
fermentación, t a l e s como proteína, almidón y taninos. La presencia de otros compuestos como grasas, vitaminas, m i -
nerales, etc., s i bien, not dejan de tener impartancia por
formar parte d e l sustrat,o básico. para e s t e proceso, tampo-
co in t e r f i e r en , por t a l motivo su cuant i f i cac ión se con-
sideró innecesaria.
La segunda parte de i a invest igac ión reportada con-
t i ene l o s dos pr inc ipa les procesos de fermentación só l ida ,
donde los parametros manejados fueron: temperatura, pH,
humedad, tiempo de fermentación, tamaño de in6cul0, t i p o
de sustrato (sorgo a d i f e rentes tratamientos) y conüicio-
nee de e s t e r i l i d a d 01 asepcia.
Las pruebas rea l i zadas para f i j a r los param6tros con
los cuales se t i enen mejores resultados, indican que s i
estos funcionan y son fac i lmente reproducibles, s in duda,
es factibl 'e optimisarl'os .
. 1 1
\ VI .i. Selecc ión y Pretratamiento.
Por medio de un a d i i s i s en mtcroscopim de disección,
se pudo observar que el ’ sorgo sometido a tratamiento de
lavado y congelación, no presentaba problemas de in festa-
ción, mientras que en frasco t e s t i g o e l de te r io ro alcanzó
su mhimo grado. 23n l a3 muestras observadas, ninguna se-
m i l l a se encontró completa, y 109 residuos harinosos, a s í
como e l gran número de insectos permitian ver faci imente
l o a grandes destroeos debidos a l ataque de plagas de gor-
go jos . estos coleópteros y revisando l i t e r a tu ra apropiada,
pos ib le c l a s i f i c a r l o s de l a s iguiente manera:
considerando algunas carac te r í s t i cas morfoiógicas de
fue
Plaga i Plaga 2
Phylum: Arthropoda Arthropoda
Subphylum: Fandibulata Mandibulata
Clase : Insecta Insecta
Subclase: P te r i go tos P t e r i g o t os Orden: Coleóptera Coxe ó t e ra
Suborden: Pol’yphaga Polyphaga
Familia:. Curculionidae Tene brionidae
Género y Bspecie:
Si tophi lus Oryza Tribolium sp
SFtoRhiiUs nranarius
(66)
c
-53-
I ’ VI.2. Apl icación de los Tratamientos Térmico-Alcalinos.
Mediante una inspección v i sua l de l a s 3 muestras de
sorgo tratadas bajo l a s condiciones de tiempo, temperatu-
ra, concentración de NaOH y ag i tac ión, f i j a d a s anter ior -
mente, f u e pos ib le observar los di ferentes grsdos de des-
trucción o extracc ión de pequeñas cantidades de l a siguien-
te capa de l a semil la , denominada testa.
Como era de esperarse, e l tratamiento con NaOH a l 1549
present& mayor e f i c i e n c i a que los otros dos. En estas con-
dic iones, l a c a s ca r i l l a se destruye completamente y e l
ex t rac to es visiblemente más denso y viscoso. Presenta tarn-
bién, una coloración más intensa.
ib Tos otros dos tratamientos, e l extracto presenta
ca rac t e r í s t i cas descr ipt ivas muy s imi lares, pero gradurr’i.-
mente menos acentuadas, y fáci lmente d is t inguib les entre
ambos.
u s pérdidas de materia, en l a s muestras tratadas se
encuentra en un rango de 4.482 +I 0.475 $, en peso. S in
embargo, estos va lo res son r e l a t i v o s , ya que se obsed6
que no var ían proporcionaImente cuando se incrementa
tamafio. de l Tote. En 200 g de sorgo tratado para u t i l i z a r -
se como sustrato en ia fermentación, se tuvieron pérdidas
hasta de l 10 46.
e i
Este aná l i s i s v i sua l es meramente cua l i ta t i vo . Para
saber en una forma más conf iab le y. cuant i ta t iva qué tanta.
t
.. -54-
I ' / I
afecta e l tratamiento a l a semilla, se hlcieron determi-
naciones coiorimétricas de taninos y almidón; ia proteína
se determinó por e l rn6todo de Kjeldhal. De esta manera fue
posible e laborar tablas comparativas de los resultados ob-
tenidos en las cuatro muestras manejadas.
.
- -55-
, I
v vZ.3. Contenido de Taninos.
La cantidad de taninos medidos por e l método de MV-HC1
se calculó leyendo l a absorbancia de las muestras analiza-
&as, en i a curva patrón previamente construida con l o s s i -
guientes datos :
Concentración Absorbancia mg/ml 525 nm
0.00 o .o00
0.20 0.060 O 640 0.1'25
0.60 0.215
0.80 0.333 1 .o0 0.397 r.20 0.456
r.40 0.538 1.60 O 602 r.80 0.668 2.00 0.745
A justando. Xos datos por regresión l i nea l , obtenemos
las constantes para i a ecuación de la curva:
F=mñ+ b
m 0.3798 sO.380 b E -0.00359 S-0.0036 r = 0.998
-56-
I S us t it uy e nd o : ,
A mC f ~ b I
A 0,380 C - 0..00360
Despejando C:
C I 2.632 A + 0.00945
Datos:
Xuestra = 500 mg de harina de sorgo
Volumen = 20 m l de solvente
Cdlculos t
Concentración t o t a l : Ct= 20 C
5 Taninoa =(Ct /500)100 = Ct / 5
$ T = 20C2.632 A + 0.00945)/ 5
= 4(2.632 A + 0.00945)
Porciento ,de Taninos gxtraidos:
$ T E =cT - $ Tm /2.342)SOO, I 100 - 42.7($T,,,)
$ Tm = Borcienteo de taninos en alguna nuestra analizada.
En l a f i gu ra No. 2, se tabulan l a s absorbancias y l a s
concentraciones respectivas, correspondientes a cada mues-
t r a analizada.
En la fieura No. 3 B e encuentran tabulados 108 re-
sultados de contenido de taninos, en base 8eca y el por- c i ento de taninos extraídos con e i tratamiento.
I
L
-57- I
I 1 I \
Figura No. 2 /
Primera &,tracción.
Muestra Abs o rbancia Concentración Concentración - Erome d i o w/mi t o t a l
SST 0.1’110 O e 302
SCT5 0.0507 0.143
SCTlO O -0325 0.095
SCT1’5 0.01’82 0.054
Segunda Extracción.
6.03
2.86
1-90
1.08
]dues t r a $Transmi tancia C, oncentrac iÓn C once nt rac i Ón - Promedio mg/ml To-kal . SS T 83.61 a.214 4 e28
SCT5 99.00
SCT1’0 99 033 SCTT5 99 a 5 0
- - - - - -
Tercera Extracción.
Muestra $Transmitancia Concentración concentración. - Promedio d m 1 Total
SST 97 .o0 0.70 1’-40
Figura No. 3
Cuadro resumen del’ contenido de taninos en
l a s diferentes mueatras de sorgo analizadas . Nuestra $ Taninos $ Taninos
Analizada Base Seca iCxtra2dos
ss T 2.342 o .o0 SCT5 0.572 75.58
SCT1’0 O. 380 83 -15
SCT15 Q.216 90.77
I
L
-59-
La cuant i f i cac ión de taninos condensados por e l mé- todo de metano1 v a i n i l l i n a ácido c l o rh íd r i co (MV-HCT), es
t
s e n c i l l a y los resultados fác i lmente reproducibles. Las modificaciones apl‘icadas en l a extracción, fueron
con e l f i n de e v i t a r i a descomposición de los taninos en
medio ácido (61); f avorecer la e incrementarla, por l a di-
f e renc ia de concentraciones dada por e l cambio de solven-
te; as€ como reducir e i tiempo t o t a l empleado en e f ec tuar
i a técnica.
1
Como se observa en l a f i gu ra No. 2, l a determinación
de taninos en muestras de sorgo s i n tratamiento requiere
t r e s extracciones, mientras que en l a s de sorgo tratado,
eon una extracción fue su f i c i en t e , ya que en i a segunda
determinación se obtuvieron transmitancias m u y cercanas al’
TOO $. Cabe señalar que por e s ta razón se tabulan l a s trans-
mitancias en lugar de l a s absorbancias, como se hizo. en e l primer caso.
Con estos resultados es pos ib le reaf irmar que 1’8 ma-
yor parte de los taninos se hayan loca l i zados en e l per i -
carp io de i a semil la , y l a destrucción de é s t e con 10s tratamientos térmico-aicaiinos permite ex t raer un
porciento de estos polimeros.
arto )
Por otra parte, l a in t e r f e r enc ia de algunos pigmen-
toa naturales como.xantofi las, carotenos u o<tros, presen-
t e s en e l extracto, y que podrian a l t e r a r l a absorbancia
y, por tanto,. l a cantidad de taninos, se co r r i g e midiendo I ex c o l o r d e l ex t rac to o r i g ina l , bajo las condiciones ya l
descr i tas en is sección correspondiente.
c
-160-
.
EX oegundo método empleado para la determinación de
t a n i n o s f u e e l d e l Complejo Azul' de Prusia ( C - U ) , e l cual
mide t a n i n o s como f e n o l e s t o t a l e s .
Los d a t o s obtenidos para l a e l a b o r a c i ó n de l a c u r v a
patdn, . s o n l o s s i g u i e n t e s :
Concentrac ión Absorbancia.
720 nm wmi ~~~ ~
O0
20
40 60 80
PO0
125 r5o
o .o00 0.088 0.173 O 233 0.305 O -378 0.506
0.593 #
, Ajustando l o s d a t o s por r e g r e s i ó n l ineal , obtenemos I
1 I I
las c o n s t a n t e s para la ecuación de la curva:
Z = m X + b
= 3.9 10-3 b = 3.56 x
r = 0,9985
.
c
-61-
Sustituyendo :.
A = m C + b
A = 3.9 x IO-3~ + 3.56 x 10-3
Despe jando C:
C 256.41 A .. 0.9130
Datos :
Lueetra = 60 O00 ,ug de harina de sorgo
Volumen = 12 m l de so lvente
Cdlculoa :
% F ~ ( 2 2 C / 60 0OO)iOO = C/50. . Porc iento de Fenoles Extraídos:
% F E =(l - 46 Fm / 2 4 8 4 ) I00
% F B = 1’00 - 40.26($ Pm>
Los resultados obtenidos en este método, se encuen- *
tran tabulados en l a f i gu ra No. 4. Las abreviaturas u t i l i -
zadas son l a s mismas que en e l caso anterior.
En l a figura No. 5 se construye un cuadro comparati- 1
, I
vo Be l o s datos obtenidos por ambos métodos.
c
-62-
Figura No. 4 ~
Contenido de t a n i n o s , medidos como fenol3j-s t o t a l e s .
Muestra Abs orbancia $ P $ P i 3
~~
SST 0.488 2.844 O0 .o00
SCT5 0.117 0.583 76.580
SCTXO O .08T 0.397 84 .O20
SCT15 0.047 0.223 91 .O20 .
,. -63-
Figura No.. 5
Cuadro comparativo. de ros valores obtenidos por
los dos métodos.
.
~~ -~
SS T 2.342 O0 .o0 2 -484 00.00
SCT5 0.572 75.58 0.583 76.58
SCTl’0 O 380 83 e75 0.397 a4 .o2
SCTl5 0.216 90.77 0.223 91.02
.
Haciendo un breve aná l i s i s d e l Último cuadro se ob-
serva que ambos resultados son s imi lares, l o cual propor-
siona una mayor conf iab i l idad a l dato obtenido. En l a
mayoría de l a s muestras analizadas, por e l método d e l
C-AP, l o s datos son ligeramente más a l t o s que en e l p r i -
mer caso, l o que s i g n i f i c a que e l harina de sorgo contie-
ne una pequeña cantidad (0.142 $) de f eno lee no-taninos,
?os que pueden s e r precursores de taninos, u ottros com-
puestos que también reaccionan con dicho react ivo.
Tomando como base los resultados experimentales re-
portados por algunos autores (54) (57) (61), considera-
mos que el’ porciento encontrado en l a semilla ut i l i zada,
se haya en un rango muy aceptable, l o cual nos permite
reaf irmar que trabajamos con una variedad de sorgo previa-
mente c l as i f i cada como de a l t o contenido de taninos g co-
munmente denominadas ”pa jareras”.
Después de e f ec tuar l a s dos técnicas, podemos dec i r
que l a cuant i f i cac ión de taninos es más s e n c i i i a y exac-
ta p o r e l método de w-mi, que por e i o t ro , ya que e s t e
&timo presenta como mayor desventaja no poder usar cual- I
qu ie r fo toco lor ímetro para e f ec tuar las lec turas de ab-
eorbancia, debido a que a una l’onguitud de onda de 720 m, algunos aparatos se tornan muy sensibles y l a s lec turas
generalmente l l e v an un a l t o indice de error . 8s recomen-
dable usar un esdectrofotómetro t i p o Varian-Techtron.
( . . I
.. -65-
.
VI.4. C u a n t i f i c a c i ó n de P r o t e í n a .
La p r o t e í n a presente en m i c e l i o D de a. oiigosporus,
c u a n t i f i c a d a p o r e l método.de Biuret , . s e calculó u t i l i -
zando l a ecuación de i a curva es tándar , previamente e i a -
borada con l o s s i g u i e n t e s d a t o s :
Concentración Absorbancia
mg t o t a l e s . 555 nm
a
I!
2
4
6
8 10
o *o000 0.0680
0.1’756
O 3517
0-4983
0,6676
0..8462
La c o r r e l a c i ó n obtenida después de a j u s t a r los pun-
t o s , por r e g r e s i ó n l ineal ea :
X = m X + b
m E 0.08447
b P -0.001’606
r = 0-9995
L
-66-
Sustituyendo :
A 1 0.08447 C - 0.001'606 Despejando C :
C = 11.8385 A + 0.019
La cantidad de proteína, en peso,seco, encontrada en
biomasa de g . o l i ~ospo rus fue de 42.5 $, calculada con l a
ecuación y los datos siguientes:
Suatituyenao C :
A I 0.5997 Absorbancia promedio de l a s muestras
w = 1'6.75 mg peso seco de l a biomasa contenida en
2 ml' de suspeneión homogénea de mice-
l i o , . ut i l i zada para l a determinación.
.
- -67-
.
Con e l método de Kje ldhal , l a proteína encontrada
tanto en l a muestra de micel io. como en l a s d i ferentes
muestras de sorgo, se hayan tabuladas en l a f i gu ra No. 6
Datos:
Blknco = 0.4 m l
Normalidad d e l HC1 = 0.1
Peso de l a Muestra = 1 gr
Factor = 6.25
M.R.O. = Mice l i o de - R. ol’iaosuorus
Ecuación: (V HCXm- V HCXB) x N-x OoOT4 x 100,
$ N = P de M
$ E = $ N x f
Suet i t uyendo : (V HC1,- V H C ~ B ) x N X 0.014 X 100
$ B = 6.25 3
$ Ii = 0.875 ( HCT, - 0,04)
-68-
Porciento de proteína determinada por e l
m6todo de K jeldhal,, en .micelio y diferentes
muestras de sorgo. -
Xuestra V HC1 P Eroteína.
. SST 11 -75 9..91'
SCT5 1'1 -35 9.58
SCTlO 1'0-60 8 a925
ET .R -a. 44 a.7.0 38 e760
i c i
.
vL.5. Deteminación de Almidón. /
I
Los resultados de l a cuantificación de almidón, en
las diferentes muestras de sorgo, se hayan tabulados en
l a f i gu ra No. 7. Fueron calculados utilizando la cuma
patrón obtenida mediante un ajuste p o r regresión Tinear,
de l’os siguientes puntos:
concentración Absorbancia
620 nm P O0
20 40 60 80 100 1’20
X40 1’60 180 200
Ecuac i6n : Y i = m X + b
A = m C + b
o .o000 O .O681 O -1667 0.2560
0.3471 0.5060
0.542CI 0.5615 O -7000 0.7834 0.8400
.
c
,-?O- ‘ 1 1
I li
, I , , ), Datos:
m = 0.00432 ,, I
b 0,00339
r = 0.995
Suetituyendo datos:
C 23T.5 A - 0.7047 $ s =(C/w) x 100
S = Porciento de almidón en l a muestra
w = peso de l a muestra contenida en 1 m l .
231’ A”- 0.7847 Too % S = 20
$ S = TT57.5 A“ - 0.15694 A”= 0.9 A
$ S = P041’.75 d - 0.15694
I
I
.
.
. .
L
-71-
Figura No. 7
Contenido de almidón en i a s diferentes
muestras de sorgo analizadas.
Muestra Absorbancia $ Al’mid6n
SST .o.oai070 78.87
SCT5 O -072837 78 -72
SCTXO 0.071670 77.37
I
L
-72-
c
1 , \
Como se pudo observgr en l a s figuras No. 5,6 y 7, ex is ten algunas var isc ioaes en e l contenido de almidón y
proteína en l a s muestraslde sorgo tratadas, con respecto
a las no tratadas.
Consideramos que estas variaciones se deben posible-
mente a pérdidas de materia, debida a una hidrólisis b8-
aica de pequeñas cantidades de almidón y protefna, 01 bien,
unicamente se deben a erFores v isuales de lec tura en ell
espectroiotómetro.
Por o t ra parte, l a l i t e r a t u r a revisada, reporta que
e l contenido de almidón en sorgo var ia de 70 a 82 ’$
(67-701, y e l de protefna se encuentra en un rango de 6
a 12 46, en variedades mexicanas (71).
Los resultados expegimental’es obtenidos en esta in-
vest igación: 9.91 %, para protefna y 78.87 $ de aimid&,
nos permiten otorgar graxl con f iab i l idad a ambos datos ya
que se hayan dentro de l &ntervalo. preestablecido por o t ros
investigadores, cuyo ob j e t i v o de su estudio. fue basica-
mente ei aná i l s i s químioo d e l sorgo.
.
I V . I . 6 . PROCPSGU D E F E F E E N T A C I O N .
Preparac ión d e l Sus t ra to .
Durente Ir. a p l i c e c i ó n d e l o o t r a t s r : i e n t o s termico-aica- l i n o s y el p o s t e r i o r zlmecene.ciento, e l s u s t r c t o no presen-
t 6 p r o b l e m s de ningún t i p o , por lo que se f a c i l i t ó s u meni
p u l a c i ó n durante l a prepcrcx ión de l o s r;.ec?ios de fermenta-
c i ó n .
Obtención d e l inoculo .
El tamaiio proifiedio 6el in9ci i lo obtenido f u e de l x l 0 es- poras/ ml, niismo aue s e ~ r t i l i z 6 para i n o c u l e r los nedios en
7
l o s d i f e r e n t e s procecos de fer1i:entncion. Considenrrou que la cd2.d d e l inócu.10 fue 1.0 s u f i c i e n t e a e n t e joven n ~ . r r - l o g r o r une. rápide. g e r n i n ~ c i 6 r i de 1 ~ s enpores y &si dieminuir 12 fz se Lag, l a cual e s f m c i 6 n de l a e?ad y e l tanaíio del i n ó c s l o fundementalmente, aunque tnnbién es importcnte e l t i p o de s u s t r c t o 2.1 que s e t r : ins fer i rá .
V . I . 6 . 1 Primer Proceso de Fenrentcici6n.
a) Lote con Gustrato Sometido a E a t e r i i i z e c i 6 n .
La e s t i m m i 6 n v i s u e l de dgumsi c e r a c t c r í s t i c n s encontrg I
das a las 96 horas de fermentpci6n, se i n d i c a en le figurr
N o . 8 . En l a f i g u r e No. 9, se muestra la cantidad de ficido c l a r -
ñ i d r i c o usado en ia t i t u k c i o n de p r o t e í n e y e l de e s t a , para rnuestrm de e e t e l o t e , t a n t o d e l producto obtenido c0-
no’ l e s $ e 1 RW t r c t o ?ir. fen . cn tcr .
Bueno ro DEL
HONGO.
O C O abunda; e , algodon o , l i g e r n -
Frisa eo, b i e n i s t r i b u i d o
i s t r i b u i d o .
E x e l e n t e Bueno
o c a , no pe- Poca, no oca, no pe e t r a comple n e t r a e t r n c o r q l
CION Dd HI_ r t r FAS. ( ~ J Q
t r a t o . t r z t o .
PENSTRIG
TEXTURA
(RsqA1:llno)
~ , C ~ O R U L ~ ~ - k:inina, no s blíninn, no Minima, . p e r c i b e c ae perc ibo se p e r c i b e
F. s i q l e a simple vista. v i s te.
CION. p l e vista.
r i m e , no s e Firme,rio se Firme, no desintegra ?es inte ,yrz s e d e s i n t e - 2.1 rebt-rzr. a l rebaner. Tra a l r e b a -
Pro
Pobre
No es cbun- drate, r i a snseo, 0.1~2
iíonoeo, di : - t r i b u c i ó n he t e rogénei
Nuie, e l c r e c i n i e n t c fué ouyer- f i c i c l .
Iiláxima, s e p e r c i b e e simple v i c - ta.
Firme, no I
s e d e s i t o - I ra al rebi nzr.
.- 75-
Humedad dei Kedio8
La humeded rel:. :t iva i r s c i a l pror: d i o de 10s medios en en!- boa l o t e s , p?.m es te primar proccco ? e ferner:t,?ciÓn f u k de
72.7275, le. cue se cc l cu ló de acuerdo 2. l e ecuzzci6ri eel pun-
t o V.4. Todm las nuestres d e l l o t e ( a ) , presentaron d e f i c i e n - cici de hwne<l:id. a l f i 2 e . l d e 16 fem.cr.tnción.
Les xueztrc3'í: f ie l lote (P.), quedaron ni-y compactas d.espu-
6s de la e s t e r i l i z n c i 6n debido F 1c gelntini ,acion d e l suo-
trczto, bato i ~ p i d i ó UIIP bucm Tcne t r r c i jn Pe lp.8 h i f u s d e l
hongo ai fondo de l a c R j n p e t r i . La f n se big duró aproxinn-
damente 30 horrs; es ta se eatuvo cor.trolrndo ca da 6 hr, por
medio de ectirración visu21 ptravez de un microscopio $ e diso-
ccion.
Las muestras d e l l o t e (b), Sustrrto Sorretido ?. Trata-
miento Aséptico, de es te moceco, no fueron considera?cs para los e.n,nliris s iguientes debido a que l o s renul$edon ob-
tenidos no fueron s i , y . i f j cr t i voc . d
En e l s epndo proccso de fcn;.enteci6n, se suprinio el d e
le. muectra X'Pl5, l a cual presentó inh ib ic ión en e l crecimie?
t o d e l how0 como rcsultndo ?el primer proceso. c
La evcluecion v i s u a l d e l Lote (b) se ind ica en l a fi>rar,n
No. 10.
.
. .
~
,.
Lib - ai I /
\ \ FIGURA 9. CUA-DRO COILPXRATIVO D;;L COKTER'I~G DE PROTEINA a11
SUSTRATO 0IIIGIilf.L Y PHODUCIIO. ',
c
.-77 -
XXkCTERIS
PICaS. -
YRECII~UEIITO
DUL .
HONGO.
P1GUTt;l 10. EVnLUAUIOII VISCAL DEL PRODUCTO 0ETEi:IDO EN EL PRIiBR PROCZ.50 DE FERhW:Tr.CION, LOTE ( b ) .
I
MUJ~ST~ - SST SCT5
Bueno Bueno
~XCHJO
P m m b - C I O N DE HL
YAS (REBti - I?Aí)o).
~ S P O R U U -
C I O N .
Poco Rbundan - Doco abundar t e , al.Todono - t e , al.codonc - so, i i g e r s - s o , Ligera- mente grisa- Tente -risa- s e o , b i e n seo , b i e n d i s t r i b u i d o . d i u t r i b u i d o .
Nula N u l a
Fr!!nioi3., s e hifnima, se p e r c i b e a p e r c i b e P. simple vis- simple vis-
ta.
TEXTUU
(bBma- DO).
S
SCTlO
No es f i r m e , Ro e s f i rme R e d e s i n t e - se d e s i n t e - gra al reha- ern a i reba. nar . nar .
Bueno
Poco abuni dante , qri saseo, al- Kodonoso, d i s t r i b u - c i o n h a t e r ,yenep..
Nula
Hinim, s e p e r c i b e a simple vista.
'o e s f i rme ie desinte- :ra al reba - ET.
SCT15
!&y pobre.
lo OS abw- Lante, i 1,:o- lonoso, g r i - : ?seo, epe- ES percep- i t i b l e P sir - ] l e viotr..
Nula
üáxim: : , s e J e r c i b e con nayor faci- lidad.
No e s f i r m s e des inte . p a a l reb, nar .
L
-78- ' I 1
I 1 I
I
71.6.2. Secyndo Proceso die Fermentación, proceso Be 72 horns.
A l fi-1 d_n e s t e s e p n d o proceso ninguna de 19s muestras manejadas presentó d e f i c i e n c i a de humedad. E l desempacamiento
d e l s u s t r a t o , después de l a e s t e r i l i z ~ . c i ó n , f a v o r e c i ó nota- blemente u= nnyor p e n e t r a c i ó n de l e s hifes d e l a i c c l i o n t r n
vez de todo el s u s t r a t o , l legando a l fondo .le In caj?. p e t r i . La f a s e Lag f u é de aproximadamente 30 h o r a s , l a cual s e con- t r o l 6 de l a misma f o r m que en e l primer proceso Oe ferment$ c ión . U humedad r e l a t i v a in ic ia l promedio de todas las mues - tras f u é de 7Y.9231.. l a que s e c a l c u l ó de la misma forma que
e l >roceso a n t e r i o r . E l tamaño d e l i n o c u l o fu6 e l M s n o que e l a n t e r i o r . .
U s c w a c t e r í s t i c r s cunl i tcr t ivns evaluadas e n e s t e s e p m - do proceso de f e r n e n t a c i h n , s e niuestmn en l a fi,gura 11.
E l contenido de prote ín? de los productoa obtenidos en
e s t e p r o c e s o , para e l Lote (a ) , s e muestran en Ir. fi,pra 12.
F i n e l n e n t e , e n l a figura 1 3 , s e muestra un cuadro compa- r a t i v o d e l contenido de p r o t e í n a t a n t o de los dos procesos 8
de fermentación como le d e l sorgo s i n fermentar.
L
-79 -
FIGURA 11. EVr.LUtLCION VIZUAL DEL P30DUCTO OBT3FIDO ZN XL
..
.
SEGLTUDG PRCCEUG Dn TERI.EXTJLCION, LOTZ (2).
cwcIr!?ILm- TO DEL Bueno
HONGO.
Abundente, al- Abundante l r lgo-
F I C X L I O donoso, c l a r o , b i e n d i s t r i b u i r bien
~~ ~
:ample tc ,r.trs.-?ez Completa a t r a v e z PERETI¿xCION l e 1 s u s t r n t o ,
d e l s u s t r n t o , DE I I I F A Y i iegando a1 f o n ( KEBJLI.:AU~) . lleE;r,n¿io a l f02 -
óo de 1n cage P. -
SCTlO
Bueno
Abundente, ?.lq donoso, c l e r o ,
b i e n d i c t r i b u -
ida Comple tn,ztr?.vi
d e l s u s t r c t o ,
llc@nc',o r.1 Yo: ¿!o r'e Ir. ceja
ISnim, no s e
percibe 2 eim-
p l e vista.
. 18.1562
,
15 O 5
FIGURA 13. CUADRO COXPARATITO DL CONTSNIDO
18.90
15.925
LOS PR03U,"TOS 32 AMBOS PR0;ECOS Y SI1 EL STISTRATO
0RIGIII;i .L -
18.550
14 525
- S U S T R l T O SIN
FERIJdNTAR
BLANCO
SST
SCT5
SCTlO
9.91
9.58
8.925
P R I M R
P R W S S O
SEGUIiDO
PRO'ZSO
.
-132- ‘ i /
‘ I
\ I V I . 6.3. F e m e n t a c i ó n 3xner$=iz.
I
?.1 teminar e l proceso de Fermentación Sumer$.da, las
muetras s e evaluaron visualmente , encontrando las s i ,guien - t e s c a r a c t e r i s t i c a s :
TESTIGO. P r e s e n t 6 el mejor c rec in i iento , auncue no fu6 vigo-
roso. hubo formacidn de peque::ori p e l l e t s de c o l o r l e c h o s o ,
MCT5. Su c r e c i m i e n t o f u é considerzblemente menor cl d e l t o s
t i s o , hubo formación de p e l l e t s pequexoo.
ñICT10. Su creci.xi.ento fué cons idemñlenente menor a l del t e s - t iUo; no hubo formación de p e l l e t s , e l m i c e l i o s e encontra-
b a d i s p e r s o en e l medio.
PJCT20. Es ta muestra presentó e l c rec imiento más oobre que e l de 12.s muestras NCT5 y blST10; no hubo formación de p e l l e t s .
UEDIOS CON EXTKCTO, CFN y SFN. En e s t o s medios no hubo c r e - c i m i e n t o d e l hongo.
c
., -8 3-
1 ' 1 1
Los r e s u l t a d o s neZEtivos de l a fermehtnción sumerzida, . . efectuaPte con medios a base de e x t r a c t o , (on de gran i:npor-
tancin p a r a n u e s t r a conc lus idn , ya que nos permite e s t a b l e -
c e r c o n mayor s e p r i d a d que los t ratnmientos t é r m i c o - a l c a l i -
nos a p l i c a d o s a l a s e m i l l a , no a f e c t a n e n forma significati - va e l contenido de almiddn y p r o t e i n a ; ya que de o t r a mane- ra, con e s t o s dos compuestos d i s p o n i b l e s en e l medio, e l
hongo habria s i d o capaz de c r e c e r .
Con r e s p e c t o a l a fermentación con taminos como s u s t r a t o ,
e l c r e c i m i e n t o presentado por e l hongo podría deberse a dos
raqones:
P r i n e r o , que e l hongo haya s i d o capaz de i n c o r p o r a r ta- I ninos : o b i e n su c r e c i n i c n t o 3e d e b i s a Is d e ~ a d n c i ó n de la m a t e r i a i n s o l u b l e quo cont ienen los taninos de ori;)on r e - s i n i c o u t i l i z a d o s en c q t e >roceno; can.i:?orrznos mcis acepta- bLe l a segunda p o s i b i l i d a d , ya que como 38 . n o t 6 , e l c r e c i - miento didminuye conforme s e incrementa l a concentrac ión de
tan inos e n e l medio.
.
L
-84-
.
V I -7 . CONCLUSION GENdBBL.
De acuerdo a l o s resultados obtenidos en esta inves-
t i gac i ón fue posible l l e g a r a l a s s iguientes conclusiones:
En e l estudio químico d e l sorgo podemos estab lecer
que l a s técnicas de aná l i s i s desarrolladas, y en algunos
casos modificadas, son conf iab les ya que l o s resultados
caen en e l rango establec ido por o tros investigadores.
Con respecto a l a d e s t an i z a c ih podemos a f i m a r que
e l mejor tratamiento, para l o s ob je t i vos de l a presente
invest igac ión es e l de NaOH a l 5 %. Aunque l a mejor ex-
t racc ión de taninos se alcanzó con a l c a l i a l 1 5 %.
De l a fermentación só l ida , que constituye l a parte
de mayor re levancia en nuestra investigación, se puede
conc lu ir que e l producto con mayor cantiflad de proteína
se obtuvo en e l l o t e A de l segundo proceso, en l o s me-
d ios con sustrato tratado con Na OH
l a s s iguientes condiciones: a l 5 $ (5CT5), bajo
Temperatura 32OC
PH 4 Humedad r e l a t i v a 77 % Tiempo de fermentaoión 72 horas Tamaño, promedio de l inócuio 1 . ~ 1 0 ~ iisp/mi
Fermentadores: k latos P e t r i 60x15
!
I ! I
.
SUGBIUNCIAS
A cont inuac ión , se mencionan algunas recomendaoio-
nes, que consideramos podrían s e r de gran u t i l i d a d para
i n v e s t i g a c i o n e s p o s t e r i o r e s , re lac ionadas con e s t e tra-
ba j o c
. .
I
X). D i s t r i b u c i ó n c u a l i - c u a n t i t a t i v a de l o s aminoáci-
dos e s e n c i a l e s p r e s e n t e s en l'a p r o t e í n a d e l a i i -
mento producido.
2). Evaluación, in v i v o , de l a d i g e s t i b i l i d a d de l a
p r o t e í n a contenida en e l producto f i n a l , usando
animales de l a b o r a t o r i o o cepas microbianas.
3 ) . Evaluación técnico-económica para l a i n s t a l a c i ó n de una a g r o i n d u s t r i a , en las p r i n c i p a l e s zonas
productoras de sorgo en e l pads.
4 ) . Escalamiento de e s t e proceso , de n i v e l l a b o r a t o -
rio, a planta p i l o t o .
5) . Adaptacion de l a cepa R. ol igosporus a c r e c e r e n
medios con h a r i n a de s o r g o , e n tubo incl inado, t r a n s f i r i e n d o las esporas de un medio PDX.
6 ) . Aislar m i c r o f l o r a n a t u r a l d e l sorgo, degradadora
de tan inos .
L
-86-
I BIBLIOGRAPIA.
1.- Anónimo. Proyecto , CIID-CII37YT. X:e joramiento, de Sor-
go> de Al ' tura To lerante al' Fr ío . Informe Anual de A-
vances en e l CIhiBYT. Centro) I n t e r n a c i o n a l de Me jo-
ramiento de Maíz y Trigo, MéxicoY 1976.
2.- Vaxdivia, B, R. Estudio, de AXgunos Aspectos Bioquími-
cos y FisiolÓgicos Relacionados con l a GerminaciÓn
e n Panoja del Grano de Sorgo (Sorahum b i c o l o r (5.) moench). T e s i s de a. en C. C o l e g i o de Postgraduados,
RNA. Chapingo, Ifex., X977.
3.- i n s t i t u t o de I n v e s t i g a c i o n e s A g r í c o l a s , I N I A . XV &os de i n v e s t i g a c i ó n Agrícola. S A G , Néxico. 1976.
4.- Hessel ' t ine, C.W. Some Important Fermented Foods of Mid-Asia, t h e r i d d l e East, and Africa, J. Am. O i l
Chemist's Soc.. V. 56, 22.367-374. 1979.
5.- Muller , 8. G , Fermented Cereal Products of T r o p i c a l
Africa. Advances i n Biotechnology.. B;. Kao-Yang A d i t o r ,
Pergaman P r e s s . V.11, pp. 541-546. 1981 . . 6.- Au,di. P. and F i e l d s , K. N u t r i t i v e Q u a l i t y o f Permen-
ted Sorghum. J . o f Food S c i , V.46, pp. 652-654. 1981.
7.- Chang, S. I. And F u l l e r , Ii. L. d f f e c t o f Tannin Con-
t e n t of Grain Sorghum on t h e i r Feeding Value on Gro- w i n g Chicks. POIXI.. Sc i . 43:32. 1964.
c
-87-
8.- Nuria, K. and F i e l d s , El. N u t r i t i o n a l : Improvement o f
Sorghum by Fermentation. J. of Pood Aci. V. 46, pp.
819-821. 1981.
9.- Watson, T. G. I n h i b i t i o n of Microbial Fermentations
by Sorghum Grain and Falta J. Appl', Bact . V. 38.
pp. 133-142- 1'975.
TO.- H e s s e l t i n e , C. W., Smith, M. and Wang, H. L. New
Fermented Cerea l Eraduts. Develop. Ind. Micr. V. 8. pp 179-186.
21.- Zvelyn, S . H. Sorghum Breeding i n t h e Sudan. World
Crops. V. 3 , pp. 65-68. 1951.
12.- FAO. "Production Yearbook". Rome I ta ly . v. 31. I977
i3.- Banamex. Néxico en Cifras. Periodo 1970-1980.
14.- Cejudo GÓmez, R. E. Estudio de Eetodologias Físicas
para la Determinación de Taninos y l a Act ividad de l a
Enzima Catecoroxidasa en Granos de Sorgo (Sorghum b i -
- c o l o r (Lo) moench) U t i l i z a d o s para l a Alimentación.
T e s i s de E?. en C . Coleg io de Postgraduados, dNA. Cha-
pingo Nex., 1'978.
-
1'5.- Suarez Fernández, A. J- Estudio Comparativo e n t r e
Variedades de Sorgo con D i f e r e n t e Contenido de Tani-
nos en Dietas para E'oKtos. T e s i s de H. en C. Colegio
%e Postgraduados, ENA, Chapingo Yéxho. 1977.
T6.- Guiragossian, e t a l . Chemical and B i o l o g i c a l Xethods
for Grain and Forage Sorghum. C o p i l a t i o n , USA. 1977.
L
-88-
.
4
.
, 17.- Swain, T. y Bate-Smith, E. C. T ie Tannins. Compara-
t i v e Biochemistry. V. 3. A. H. Pl'orkin and H. S. Ma-
son. Academic Press, N. Y. 1962.,
18.- Goldstein, J. L. and T. Swain. The Inh ib i t i on o f En-
zimes by Tannins. Phitochm. v. 4, pp. 185-192. 1965.
19.- Tamir M. and E. Alumont. Inh ib i t i on o f Digest ive En-
aimes by Condensed Tannins from Green and Ripe Carobs.
J. Food Agr ic . V. 20, pp. 199-202. 1968.
20.- Bibereau-Gayon, P. Elant Phenolic. Traducción d e l
Prances por V. H. Heywood. Univers i ty Reviews i n h- tany. O l i v e r and Boyd. Edinburgh. p. 254. 1968.
21.- Preudenberg, R. y K. Weinges. The Chemistry of Fla-
vonoid Compounds. Geissman T. A. Eergaman Eress, Ox- f o rd , England. 1962.
22.- Natheu, A. G. and A. A. B. zarpía. Food Broming as
a polyphenoTs Reaction. Adv. i n Food Research. V. 19, pp. 75-147. Academic Press, N. Y. and London, 13-71.
23.- Bate-Smith, C. and Lerner N. H. Leuco-Anthocyanins
Sistematic Dis tr ibut ion o f Leuco-Anthocyanins i n Lee,-
ves. Bioch. J. V. 58, pp. 120-129. 2954.
24.- Loomis, W.. D. and B a t t a i l l e J. Ellant Phenolic. P lant
Phenolic Compounds and I s o l a t i o n of Blant Enzimes.
Phytochem. V. 5, pp. 423-438. 1'966.
-89 -
L .
.
.
25.- Fe r r i e r , R. J. and Co l l i ns P. AI. Nonosacharide Che-
mistry. Pinguins Books. LTD. p. 246. 1972.
26.- Gond l e z Hernández, E. E. Eroduction o f Punga1 Ero-
t e i n from Corn Starch. TJ. i n Sci. Thesis. Gwen's
Univers i ty o f KhgsCon. Kingston, Ontario Canadá. 1978.
27.- Ceacer G. V., Gruenhut No S., and Cushing M. L. Mo- l e cu l a r Weight and Lntr isec V iscos i ty o f N i t r i c T r i -
esters o f Corn Starches and Dextrine. J. Am. Chem.
SOC. V. 69, p. 617. T947.
28.- Pomerans, Y., Chaiman. Industr ia l Uses of Cereals.
Am. Assoc. o f Cereal Chemist. V. 4-8, pp. 316-339.1973.
29.- Hubbard J. E., Hall. K. H., and Earle F. R. Composi-
tion of the Components Par t of the Sorghum Kernel.
Cereal Chem. V. 27, pp. 415-420. 2950.
3V.- Schoch, T- J. and Maywald, E* C. Microscopic dxamina-
t ion o f Modi f ied Staches. Bnal. Chem. V. 28, pp. 382-
387. 1356- ,. 31.- Leach, N. PI. Ge la t in i t a t i on of Starch. I n Starch
Chemistry and Tecnology. 1. Fundamental Aspects. B. C. Whistler and E. F. Paschal1 (.Zditors). Academic
Press, N. Y. 2965.
32.- Burleson C. mi., W. B. Cowley and G. Otey. Afect of Nitrogen F e r t i l i z a t i o n on Y i e l d and Pro te in Content
of Grain i n tñe Lower Bio Grande Va l l e y o f Texas. A-
gronomic J. V. 43, pp. 524-525. 1956.
c
-go-
¡ l¡ ¡ I
33.- Byrid A., K; R. T e f e r t i l l e r and A. $ape. Higher Sor- I
ghum Y i e l d Plus nxtra Feeding Value. P lant E'ood Rev.
V. 6 (41, PP. 4-7. 1960-
34.- K i l l e r G. D,, C. \V., Deyoe, f. L. Watler and F. w. Smith. Variantions i n Pro te in Levels in Kanzas S o r ghum Grain. Agron., J. V. 56, pp. 302-304. 1964.
35.- Deyoe, C. W. t r o t e in Contents o f Grain Sorghum. Peed-
stuffs. V o 35, p. 409 1963.
36.- Shoup f. K., C. W. Deyoe, P. 12. Sanford and L. S. Eiurphy. Comparison of High vg &ow F e r t i l i z a t i o n on i r r i g a t e d vg ury Land Produced Sorghum Gra in . P.oultry
SCi, V e 477 p. 1719- 2968.
37.- Eguiarte, v. A. Determinacidn de l a Energía Ketabo-
r i z ab l a y de l Valor n u t r i t i v o de Cinco Variedades H I -
bridas de Sorgo en Po l l o s de Engorda. Tesis rrofesio- nal. E N A , Chapingo, Eéxico. X976.
30.- Stphenson, E, E., A.O. Yorsk, D.B. dragg and C.A.
I vy . The aminoacid Content and A v a i l a b i l i t y o f d i f f e -
r ent s t r a i n o f gra in sorghum t o the chick. Paul t ry SC. V 50: 581-584 (19713.
39.- Virapaksha, !V. K. tk Sastry, L.V.S. Studies on the
P ro t e in Contents and AminoacFd Composition and some Var i e t i e s o f Grain Sorghum. J. Agr. Food Chem. V: 16, 199-204, 11970).
40,- Permra &. De k 'ao l i s , Y . Appl ica t ion of Sorghum i n
Feeding Domestic Animals. Research on the Content o f Aminoacid o f t h e Grain o f Hybrid Sorghum. Acta Ked.
Vet . V: 6 , pp 337-343, (1950) .
-
41.- S e c k i n g e r , H.L. eC r ío l f , M.J. Sorghum P r o t e i n Ultra-
e s t r u c t u r a l as it R e l a t e s t o Composition. C e r e a l Cham.
In P r e s s , ( 1 9 7 3 ) .
42.- Krishnawamy, K. & Gopolan, C. Annual Report o f Na-
t i o n a l I n s t i t u t e of Nutr i t ion . Hyderab. India . In "Sorghum i n the S e v e n t i e s " Ad. Reo, N.G.Y. dc Iiause,
L.R. Oxford & 1.B.H. Publ i sh ing Co. New U e l i , ( 1 9 7 1 ) .
43.- Winarno, P. G. Pesmented Vegetable P r o t e i n and He-
l a t e s Poods of Southeast A s i a with s p e c i a l Beferense
t o Indonesia . J. Am. O D Chemist% Soc. V: 5 6 ,
PP. 363-366, ( 1 9 7 9 )
44.- H e s s e l t i n e , C.W. & Wang, H.L. rermented Soybeans
Food Products. Soybeans Chemistry and Technology.
A I l a n K. S m i t . S idney J. C i r c l e . Ghap. 11, (1972) .
45.- F r a z i e r , C a w . E i c r o b i o l o g í a de los Alimentos. &d.
A c r i b i a , &pana. 2a. g d . Cl979).
46.- H e s s e l t i n e , . C. W. A UlLLlenium of Pungi, Food and
Fermentation. Kycol'ogia. V, 5 7 , pp 276-280. 1965.
47.- S h u r t l e f f , W. &: Aoapagi, A. Tempeh Production. The
Book o f Tempeh. V . 2 . New-Age Foods, (1980) .
- -9 2-
/ 4 8 .- Alexopouios, C .J. & Mhs C .W. Zntroductory F.iycolo-
L
gy. 3a. Ed. John Wil’ey ¿k Sons. N.Y.. (1’979).
49.- Mül‘ler, H. h!icol.ogia. la. Ed. Ed. Omega, España 1’976.
50.- S a i t o , R. Rhizopus o l iaosporus . dia Never Technis-
c h e r P i l z Chinas. Centr . B a k t e r i o l . y-2, 14. pp
623-627 ( r 9 0 5
51.- Wang, H.L., Swin E.W* & . H e s s e l t i n e , C,W- Mass Produc-
t i o n of .Rhizopus o l igosporus spores and t h e i r AppTi-
c a t i o n s i n Tempeh Fermentation. J. of Food ScF. V, 40,
PP 168-1709 (1975) .
52.- Cebal lOs, J*L., Tomasini C.A. y S a n t i a g o G.P. Pro-
)i duccidn de Tempeh de Soya. Reporte De S e r v i c i o Soc ia l .
UAM-I, México. (1981) . b
53.- H a c H e r , L.R., e t a l Jurnal’ Nutr i t ion . V, 8 2 , pp.
4 5 2 , (.I9641
54.- S t e i n k r a u s , K.H*, s. P i 2 o t Exant S t u d i w oa Tm-
peh, Proc. of the Conference on Soybeans Product for P r o t e i n i n Human. Food Agric. Res. S e r v i c e , P e o r i a
I l l i n o i s , (1961) .
c
55.- Hermana, S.S. %.Her l inda . P e n e l i t i a n G i z i Dan kTaaka-
nan. Balai Penel ’ i t ian G i z i Unit. S d i t e d by Kart inoja i
- - e t a i V.2, pp 5761, (2972) .
t
4
L
-93-
56.- B l e s s i n , C.W., a. E f f e c t of Alcal'i on Composi- I
t i o n and Wet-Mil'ling C h a r a c t e r i s t i c s o f Sorghum Grain. Am. Assoc. Cereal Chemists. v. 4 , pp 529-532.(1971).
57.- Chavan, J.R., Kadam S.S., Ghonsikar C.2. &.S.D.K.
Removal of Tannins and Improvement of i n V i t r o Pro- t e i n D i g e s t i b i l i t y of Sorghum by Soaking Aicaii. J.
of Food Sci. V.4.(1979).
58.- Burns, R.B. Method o f E s t i m a t i o n of Tannin i n Grain Sorghum. Agron. J.V. 63, pp 512-512, (1971).
59.- Maxon, E.D. y L A - Rooney. Evaluation of Eethods f o r
0 Tamin Analysis i n Sorghum Grain, Cereal Chem. v. 49,
pP. 719-7299 (1972).
60.- P r i c e , k1.L. y C.G. Butler . Rapid V i s u a l Estimation and Espectrophotometric Determination of Tannin Con- t e n t of Sorghum Grain. J. Agric.
pp 1268-T273, (1977) Food Chem. V. 2 5 ( 6 ) ,
61.- Earp, C.F., e t al . Evaluation of Severa l Hethoas t o Determine Tannin i n Sorghums with Varying Kernel' Cha-
r a c t e r i s t i c - Cereal Chem. V. 5 8 ( 3 ) , pp 234-238, (1985).
62.- H a s s i d , W d 4 - &. Neuflend B.F. Quant i ta t ive Determina- t i o n of Starch i n Plant Tissues. Methods i n Carbohy-
. drate. Chem V. 33, pp 34-3ó.
63.- Zomerams &Meroan. Qood Analysis: Theory and Practi-
ce. Revised Edit ion. AVI . 1979.
I
.
a
64.- Herbert , D., Phipgs P - J . & Strange B.d.(J.R. N o r r i s
a n d D.W. Ribbons A d s . ) Llethods i n l i c r o b i o l o g y . V. 5b, pp 244-245. Academic P r e s s , N * Y * ( 1 9 7 1 ) .
65.- D i r e c c i ó n General de I n v e s t i g a c i ó n en S a l u d P Ú b l i -
ca. Técnicas para e l A n a l i s i s Pis icoqufmico de A l l -
mantos. S S A. ( 1 9 7 6 ) .
66.- Herbert , H.R. In t roducc ión a la Bntomologia Gene- ral y Aplicada. 4a. Bd. Ed. Omega, Barcelona iispaña
(1978) .
67.- hhindi , P.J. &. Thomke S. The N u t r i t i v e Valile f o r Rats o f High and Low-Tannins Sorghum Treated w i t h
lagadi Soda, J . S c i . Agrc. V. 32, pp 139-145, (1981) .
68.- Banigo, E.O.I. ¿k H.G. M i l l e r . Can I n s t . Food Sci .
Technol. V. 5 , pp 217-221, (1972) .
69.- R i z l e y , N.P. S u t e r D.A. Sorghum T o r t i l l a s E r o c e s s
Product A t r i b u t e s . J. o f Food Sci. V. 4 2 , pp 135- 1’38, (1977)
70.- Yous i f , A.1‘1. A Study o f Tannins i n Sorghum. Ph. D.
Leads U n i v e r s i t y (1’979).
71.- Cuca, G.B. y E. Avi la . La Allmentacidn de las Aves
de Corra l . Colegio de Postgraduados, Chapiryo e I n s t .
Nal’. Inv. Pec. S A G. E é x i c o , (1’978).