introducción a la identificación -...

Introducción a la identificaciónautomática de organismos

y estructuras microscópicas y macroscópicas

Introducción a la identificaciónautomática de organismos

y estructuras microscópicas y macroscópicas

Universidad de GuadalajaraCentro Universitario de Ciencias Exactas e Ingenierías

Centro de Investigación Científica y de Educación Superior de Ensenadacicese

Centro de Investigación en Alimentación y Desarrollo A. C.ciad

Josué Álvarez BorregoMaría Cristína Chávez Sánchez

(Editores)

Primera edición, 2008

© D. R. 2008, Universidad de Guadalajara

Centro Universitario de Ciencias Exactas e Ingenierías

Blvd. Marcelino García Barragán esq. Calzada Olímpica

44430, Guadalajara Jalisco, México

© D. R. 2008, Centro de Investigación Científica

y Educación Superior de Ensenada, CICESE

Km. 107 Carretera Tijuana - Ensenada

22860, Apdo. Postal 360

Ensenada, B.C. México

© D. R. 2008, Centro de Investigación en Alimentación

y Desarrollo A. C., CIAD/Unidad Mazatlán en Acuacultura

y Manejo Ambiental del Centro de Investigación

en Alimentación y Desarrollo A. C.

Av. Sabalo Cerritos s/n

82010, Apdo. Postal 711

Mazatlán, Sinaloa, México

ISBN: 978-97027-1396-8

Cada capítulo de este libro fue rigurosamente arbitreado.

Impreso y hecho en México

Printed and made in Mexico

Contenido

Prólogo 9Introducción 11

Capítulo 1Análisis de imágenes como una herramienta en citogenética de moluscos 15

Josué Álvarez Borrego, Cristian Gallardo Escárate, Vitaly Kobery Miguel Ángel del Río Portilla

Capítulo 2Identificación de especies de copépodos por medio de algoritmosde correlación invariante 47

Ernestina Castro-Longoria y Josué Álvarez-Borrego

Capítulo 3Identificación de algunas especies de fitoplancton mediante sistemasóptico-digitales:una primera aproximación 61

Josué Álvarez Borrego, José Luis Pech Pacheco y Roberto Cortés Altamirano

Capítulo 4Correlación óptico-digital a color para el reconocimiento de Vibrio cholerae O1en muestras de laboratorio y ambientales 91

Rosa R. Mouriño Pérez y Josué Álvarez Borrego

Capítulo 5Sistema de evaluación automática para la detección del bacilo de la tuberculosis 113

Manuel G. Forero y Gabriel Cristóbal

Capítulo 6Identificación específica de parásitos en peces mediante correlacióninvariante con filtros compuestos 129

Emma Fajer Ávila y Josué Álvarez Borrego

Capítulo 7Algoritmo de correlación digital a color en histopatología para la diagnósisde enfermedades en camarón 149

Maria Cristina Chávez Sánchez, Josué Álvarez Borrego, Vitaly Kober ySelene Abad Rosales

Capítulo 8Sistemas adaptativos para el reconocimiento de patrones biológicos 159

Vitaly Kober, José Ángel González-Fraga, Víctor Hugo Díaz-Ramírez yJosué Álvarez-Borrego

Capítulo 9Sistema de adquisición de partículas biogénicas 177

Josué Álvarez Borrego, Mario Alonso Bueno Ibarra y María Cristina Chávez Sánchez

Capítulo 10Autoenfoque y fusión 193

Josué Álvarez Borrego, Mario Alonso Bueno Ibarra y María Cristina Chávez Sánchez

Capítulo 11Inspección óptica automatizada de circuitos impresos 217

Jorge L. Flores, Guillermo García Torales y Josué Álvarez Borrego

Capítulo 12Alineación del interferómetro de desplazamiento vectorial utilizando filtros digitales 227

Guillermo García Torales, Jorge Luis Flores Núñez y Josué Álvarez Borrego

Los autores 241

Prólogo

Recientes avances en las ciencias cognitivas in-dican que, por instinto, el Homo sapiens modula sonidos para comunicarse Aparentemente, tam-bién por instinto los humanos enumeramos Ja-cob Bronowski señaló amenamente que no existe un lugar o un momento en la historia en donde se pueda decir que nace la aritmética

Quizás algo parecido se puede afirmar de la óptica El estudio de la interacción de la ra-diación electromagnética con la materia está omnipresente en el quehacer diario del Homo sapiens

Desde los albores de la civilización, el Homo sapiens ha utilizado la radiación luminosa para adquirir información, orientarse y transformar su entorno No es exagerado afirmar que la ma-yor parte de la información extraterrestre que hemos adquirido ha sido capturada empleando radiación electromagnética

La óptica posee un estatus único Es una ciencia venerable que atiende preguntas funda-mentales de la realidad física, y es también una vigorosa rama de las ingenierías La instrumen-tación basada en el uso del espectro electromag-nético ha aportado tecnologías esenciales para el desarrollo de otras disciplinas del conocimiento y de la tecnología

Elegantes experimentos de óptica forman parte de la física moderna En biología y bioquí-mica, ingeniosos instrumentos ópticos han sido desarrollados para esclarecer la estructura y la función de los órganos y los tejidos, las células y sus componentes Los endoscopios de fibra óptica, inventados por Harold H Hopkins para la medicina clínica, han demostrado ser valiosos

instrumentos para el diagnóstico y la terapia no-invasiva

En las últimas décadas del siglo xx, la óptica física fue vinculada con la ingeniería de la infor-mación De este modo, en la nomenclatura de Thomas S Kuhn se estableció un nuevo paradig-ma en la instrumentación óptica contemporánea En holografía y en el procesamiento de imáge-nes, las aportaciones de Dennis Gabor, Emmett N Leith y Adolf W Lohmann son elocuentes ejemplos de esta nueva conceptualización

En el presente libro, Josue Álvarez Borrego y María Cristina Chávez Sánchez, junto con un selecto grupo de colegas, han reunido sus ex-periencias de investigación en instrumentación óptica contemporánea para el desarrollo de las ciencias marinas A nivel nacional, ambos edito-res y sus colegas son pioneros en la aplicación de óptica de la información en las ciencias marinas Sus valiosas experiencias, análisis de imágenes, correlación óptica-digital, reconocimiento de patrones y procesamiento de imágenes, se pre-sentan en doce ensayos temáticos

El loable esfuerzo de los autores para com-partir sus experiencias, acercará a nuevas gene-raciones a novedosas aplicaciones de óptica de la información Estoy convencido que esta singular obra será sumamente apreciada por alumnos de posgrado en varias disciplinas

Jorge Ojeda-Castañedafimee, Universidad de Guanajuato

Salamanca, GuanajuatoFebrero de 2008

Introducción

El siglo xx se caracterizó por el enorme avan-ce científico y tecnológico en todos los campos El hombre ha procurado garantizar y mejorar su nivel de vida a través de un mejor conocimiento del mundo que lo rodea y un dominio más efi-caz del mismo, mediante un desarrollo constante de la ciencia y la tecnología El desarrollo de la navegación y la aeronáutica, la microelectrónica, la tecnología computacional, las fibras ópticas o la biotecnología son ejemplos de los importantes avances en la ciencia y la tecnología del siglo pa-sado que le han dado a la humanidad innumera-bles beneficios

A pesar de que se inventó varios siglos atrás (siglo xvi), el microscopio óptico tuvo durante el siglo xx también importantes progresos, tales como el desarrollo de los microscopios de con-traste de fases y fluorescencia; se desarrollaron además los microscopios electrónicos, de efecto túnel y fuerza atómica, los cuales, junto con los primeros, significaron un enorme avance para el mundo de la medicina y otros campos de la ciencia y la tecnología Hoy día los microscopios se utilizan en medicina forense, geología, en la industria petrolera, arqueología, en el análisis y procesamiento de los alimentos, en la electró-nica para la fabricación de micro-componentes, así como para el estudio de todas las áreas de la biología y en una larga lista de usos a lo largo de todas las ramas de la ciencia y la tecnología El microscopio es, sin duda, un elemento funda-mental en cualquier laboratorio Sin embargo, como todos los equipos e instrumentos, tiene sus limitaciones; algunas de ellas son la lentitud de análisis cuando se trata de numerosas muestras y la distorsión que le puede dar el observador a lo observado por el cansancio después de muchas

horas de trabajo Es necesario, por lo tanto, con-tar con herramientas de diagnóstico de enferme-dades, de descripción e identificación de orga-nismos o partículas que ofrezcan mayor rapidez y precisión

Este libro trata de los avances tecnológicos logrados a la fecha para la identificación rápida y precisa de partículas biológicas, tales como cro-mosomas, bacterias, plancton, virus y parásitos, con el apoyo del microscopio óptico y técnicas o algoritmos utilizados en la física-óptica, así como los avances tecnológicos en el control de calidad de tarjetas electrónicas y alineaciones de nuevos sistemas interferométricos de desplazamiento vectorial

Las técnicas de procesamiento de imágenes y los diversos algoritmos matemáticos utilizados en la física-óptica pueden ser utilizadas en com-binación con otras técnicas tales como la citoge-nética (análisis del número cromosómico) y mar-cadores moleculares para identificar especies, analizar poblaciones, reconocer y caracterizar los progenitores de un híbrido, estudiar la organiza-ción del genoma y la arquitectura nuclear, etc En el primer capítulo se describen los estudios realizados para determinar mediante imágenes fluorescentes e hibridación in situ el tamaño genómico y el contenido de adn cromosómico de varias poblaciones de abulones de México y Chile Se discuten las relaciones cromosómicas entre las diferentes especies estudiadas, la dis-tribución geográfica de las especies, la existencia de híbridos, las relaciones filogenéticas con otros abulones del mundo y se analizan tres hipótesis de la distribución geográfica de la familia Halio-tidae

María Cristina Chávez Sánchez12

Por otro lado, la elevada complejidad taxo-nómica del plancton en general, requiere de microscopios inteligentes conectados a bases de datos que tengan la información necesaria para dar respuestas rápidas a las identificaciones re-queridas La identificación de microorganismos del plancton requiere de profesionistas altamen-te especializados en las diversas familias de mi-croalgas y los diferentes grupos zoológicos que lo componen, tales como los protozoarios, rotí-feros, foraminíferos, sifonóforos, medusas etc , así como larvas y huevos de peces, crustáceos, y moluscos La estructura de estos microorganis-mos es compleja y la labor de los diversos traba-jos que requieren de su conocimiento es ardua, toma tiempo y en muchas ocasiones —por las altas cantidades de muestras por revisar— no es muy precisa En el capítulo II se presentan los avances realizados para el estudio de zooplanc-ton, los cuales servirán de base para que en un futuro cercano sea posible el desarrollo de un sistema automatizado de identificación de estos organismos Con base en un catálogo de imáge-nes digitales elaborado por un experto y la apli-cación de técnicas de correlación invariante, se podrían identificar rápidamente diferentes espe-cies, ahorrando así tiempo y esfuerzo

El método para procesar imágenes se en-frenta a varios retos: a) cómo eliminar con téc-nicas ópticas los problemas de fondo (detritus, burbujas, intensidad de iluminación del micros-copio); b) variación de sedimentación de la cé-lula en el campo de observación; c) variación morfológica natural de la especie en una mues-tra; d), problemas de similitud ínter-específicos entre dos especies; e) organismos fragmentados comparados con organismos enteros entre otros En el capítulo III se muestra cómo resolver esta problemática y se concluye que el sistema híbri-do óptico-digital presentó una eficiencia de 90% en la identificación de cinco especies de una microalga; las especies se identificaron correc-tamente sin importar la rotación, escala y ubi-cación de los organismos de cada especie de la imagen problema analizada

Otro grupo de organismos importantes, y en muchas ocasiones difíciles de identificar, son las bacterias (capítulos Iv y v) En el caso particu-lar de la bacteria Vibrio cholerae 01, responsable de la enfermedad del cólera, cuenta con méto-

dos de identificación no muy efectivos (medios de cultivo y pruebas bioquímicas) Para solucionar este problema, se han desarrollado técnicas mo-leculares (pCr) que son altamente específicas Sin embargo, para evaluar numerosas muestras am-bientales, estas pruebas resultan ser sumamente costosas El sistema de correlación a color mul-ticanal utilizado en el capítulo Iv en lo referente a la eficiencia del sistema para el reconocimiento de Vibrio cholerae 01 fue casi de 100% Este siste-ma es una herramienta útil, independientemente de la forma, tamaño y posición de las bacterias en muestras de laboratorio y ambientales, que per-mite contar el número de organismos presentes en cada imagen problema con mayor eficiencia

Otra bacteria de importancia en la salud pú-blica es Mycobacterium tuberculosis causante de la tuberculosis pulmonar y principal causa de muerte por enfermedad infecciosa en el mundo El diagnóstico de la microbacteriosis se realiza a través del cultivo de muestras de esputo, usando técnicas poco sensibles, por lo cual los especia-listas deben esperar los resultados de los cultivos hasta dos meses El estudio automático puede ofrecer varias ventajas, tales como una reduc-ción sustancial en el trabajo de los especialistas, mejorar la sensibilidad de la prueba, aumentar la precisión en el diagnóstico y el número de imá-genes que pueden ser analizadas En el capítu-lo v se muestra que la técnica de segmentación desarrollada permite extraer la mayor parte de bacilos presentes en una imagen, eliminando la mayoría de detritus y proporciona un buen fun-cionamiento en términos de especificidad y sen-sibilidad, por lo tanto es susceptible de ser utili-zada en un sistema automatizado de análisis de muestras con fines de diagnóstico

El diagnóstico de enfermedades por histopa-tología se basa en el reconocimiento de cambios en las células, tejidos y órganos sanos En el caso de la actividad acuícola, los diagnósticos son uti-lizados ampliamente para determinar la presen-cia de patógenos (virus, bacterias, hongos, endo-parásitos) o cambios patológicos derivados de deficiencias nutricionales, factores ambientales o genéticos en poblaciones cultivadas de peces, crustáceos o moluscos Para ello hay que analizar a veces cientos de muestras y el procesamiento y análisis lleva días; pero los acuicultores deman-dan rapidez y precisión en la entrega de los diag-

Introducción 13

nósticos Si se lograra hacer una lectura de las laminillas en forma automática, rápida y precisa, los histopatólogos serían relevados de la identi-ficación de patógenos conocidos o de daños muy característicos y se dedicarían solamente al es-tudio de nuevas patologías o nuevos patógenos, lo cual redundaría en una mayor eficiencia para esta tarea Con el fin de probar si la metodología de correlación a color y procesamiento de imá-genes podía ser usada para identificar cambios histopatológicos, se llevó a cabo un estudio pre-vio en el que se usaron diapositivas con imágenes de tejidos de camarón con cuerpos de inclusión del virus conocido como ihhn En el capítulo vI se demostró el potencial de la técnica de diagnós-tico y que el método puede aplicarse para otros campos de la histopatología y en estudios epide-miológicos de cualquier organismo, incluyendo el humano Se mostró también que los tiempos de identificación se pueden reducir a segundos, pero que es preciso investigar más para conside-rar aspectos como rotación, escala, color, mor-fología de los virus y el uso de diferentes clases de filtros, dependiendo de la complejidad de los cuerpos de inclusión por reconocer

Las técnicas óptico-digitales no son sola-mente útiles para la identificación de virus, bac-terias o el plancton La identificación específica de parásitos usando datos morfológicos necesita mejores técnicas, debido a que es lenta y laborio-sa y se requiere de preparaciones microscópicas de calidad que serán utilizadas para medir y ana-lizar con claves de identificación Además, fre-cuentemente se deben comparar los especíme-nes bajo estudio con las descripciones originales y consultar con expertos del grupo taxonómico de que se trate Con el fin de identificar parási-tos en dos especies de peces, se tomaron imáge-nes con una cámara de alta resolución conecta-da a un microscopio y utilizando un programa instalado en una computadora Se aplicaron las técnicas de filtros sólo de fase con invariancias a posición, rotación y escala Los resultados indi-can que este sistema es sencillo y que el sistema de filtros es una herramienta útil para la iden-tificación de parásitos, independientemente de su forma, tamaño y posición Este trabajo es el primer paso para desarrollar un sistema automá-tico que facilite la identificación de parásitos a investigadores y biólogos que no sean especialis-

tas en taxonomía y que permita procesar un gran número de muestras en corto tiempo El periodo de tiempo requerido para identificar una imagen en este sistema digital es de pocos segundos

En el capítulo vIII se revisan los sistemas digitales y los sistemas híbridos opto-digitales diseñados con base en filtros adaptativos para mejorar el reconocimiento de objetos biológicos que pueden encontrarse en un fondo real Se de-mostró que los algoritmos de diseño de los filtros pueden ayudar a tomar el control sobre todo el plano de correlación con pocas iteraciones para el entrenamiento Los sistemas digitales están basados en un entrenamiento iterativo de filtros sdf y, como consecuencia, poseen los beneficios de tener una buena tolerancia a las distorsiones geométricas y al ruido aditivo Los sistemas híbri-dos, además, toman en cuenta las características reales de los dispositivos ópticos empleados Los sistemas digitales pueden implementarse fácil-mente en una computadora, mientras que los sis-temas híbridos pueden proporcionar resultados en tiempo real para realizar el reconocimiento de patrones Las simulaciones por computado-ra y los resultados experimentales demostraron que los filtros propuestos para el reconocimiento de datos biológicos poseen un desempeño muy bueno comparado con aquellos filtros por corre-lación clásicos Los filtros recomendados poseen una buena adaptatividad a la escena y una buena robustez al ruido de entrada

Los estudios y avances anteriores no se hu-bieran logrado sin el desarrollo de un sistema de adquisición de partículas, es decir un microsco-pio complementado con una nueva tecnología computacional y diversos programas Estas téc-nicas son presentadas en el modelo base de los capítulos Ix y x para la captura y procesamiento de imágenes tales como inicio, adquisición, mo-saico, autoenfoque, técnicas de fusión, adqui-sición del campo y procesamiento del campo, procesamiento del mosaico, técnicas top-hat o rolling ball, filtraje, técnica del triángulo, detec-tar, localizar, etiquetar, aproximación elíptica, análisis de ejes principales mayor y menor, análi-sis de tamaños, identificación a partir del mosai-co, invarianza de posición, invarianza de escala, invarianza de rotación, correlación invariante, correlación de fase con filtros simples (sfpC) y la técnica de correlación de fase con filtros com-

puestos (CfpC) Todos estos algoritmos y técnicas fueron desarrollándose de acuerdo a las necesi-dades de identificación de partículas biológicas y sus particularidades

En el capítulo xI se lleva a cabo una aplica-ción de filtros de raíz (filtros no lineales) para el control de calidad de tarjetas electrónicas en el proceso de manufactura Se describe un con-junto de técnicas de reconocimiento de objetos, basadas en filtros acoplados no lineales, que han mostrado su eficiencia en la solución de proble-mas relacionados con la extracción de rasgos viables para clasificar un objeto, i. e. posición, orientación, tamaño, etc En particular, se enfo-ca al monitoreo de defectos en tarjetas de circui-tos impresos Además, fue posible discriminar entre componentes en condición de aceptación y componentes parcialmente dañados, es decir, en condición de defecto

Recientemente se ha desarrollado el inter-ferómetro de desplazamiento vectorial Este instrumento posee la cualidad de poder realizar pruebas ópticas de superficies con y sin simetría de rotación, ya que incorpora en su diseño algu-nas de las ventajas tanto de los interferómetros tradicionales como de los interferómetros de desplazamiento más comunes En el capítulo xII se realiza una aplicación de varios filtros lineales para determinar la alineación interferométrica en este tipo de nuevos sistemas Estos filtros pre-

sentan la ventaja de ser de fácil implementación en sistemas automáticos

En conclusión, dada la rapidez con la que los problemas se presentan actualmente y la necesi-dad de resolverlos, es imperante lograr que los trabajos de identificación de partículas biológicas para fines de taxonomía, diagnóstico de enferme-dades u otro tipo de investigaciones en los que se utilice el microscopio, se lleven a cabo con la mayor rapidez posible y con alta precisión (alta especificidad y sensibilidad) En este libro se de-muestra que es posible lograrlo con el desarrollo de sistemas ópticos o digitales automatizados para el procesamiento de imágenes Hace falta mucho trabajo por realizar, se tienen que elaborar bases de datos lo suficientemente representativas de cada grupo o partícula biológica para alcanzar alta confiabilidad en los resultados, asimismo se tie-nen que resolver los problemas ópticos para cada caso; sin embargo, con las bases y los avances de este libro se puede ir más rápido en la obtención de dichos sistemas automatizados Para lograr lo anterior, se requiere también del apoyo de los di-ferentes especialistas en los diferentes campos de la biología o la medicina Esperamos que con la ayuda de la presente publicación se incremente el número de investigadores que deseen contribuir a los avances de este desarrollo tecnológico

María Cristina Chávez Sánchez

I. Introducción

I.1 El valor de estudios citogenéticos

A través del análisis citogenético es posible des-cribir el número cromosómico de una célula u organismo El establecimiento de la identidad cromosómica es el primer paso para los estudios de mapeo genómico También pueden ser utili-zados en análisis taxonómicos, dado que cada es-pecie posee un cariotipo distintivo, en términos de número y morfología cromosómica Asimis-mo, mediante el análisis citogenético es posible reconocer y caracterizar los progenitores de un híbrido, además identificar un organismo poli-ploide (Gersen y Keagle, 1999)

El estudio del número cromosómico, estruc-tura, función y comportamiento con relación a la herencia genética, es una parte integral en la citogenética Los cromosomas son reconocidos como portadores de adn en eucariontes, dado que proveen la base estructural para la transmi-sión de la información genética Las caracterís-ticas morfológicas de los cromosomas han sido estudiadas con microscopía de alta resolución aunada a tinciones específicas de adn De esta forma, características morfológicas comunes como constricción primaria (centrómero) en di-ferentes posiciones a lo largo del cromosoma ha permitido la identificación y clasificación cromo-sómica (Levan et al., 1964) Sin embargo, dado que las características centrales de estructura y función de los cromosomas están definidas a ni-vel del adn, el análisis citogenético ha integra-do información sobre la estructura molecular, con lo cual se ha descubierto la forma en que los genes están organizados dentro de los cromoso-

mas, definiendo así su funcionalidad (Appels et al., 1998; Allen et al., 1999)

El estudio de los cromosomas ha tenido un mayor impacto en estudios de mapeo genómico en distintas especies, tanto animales como vege-tales La identificación de regiones específicas de adn mediante técnicas moleculares permite observar microscópicamente la localización de estas regiones en los cromosomas (Schwarza-cher y Heslop-Harrison, 2000) Adicionalmente, el entendimiento de la estructura cromosómica provee una medida de análisis de los cambios secundarios que pueden ocurrir durante proce-dimientos de ingeniería genética y manipulación cromosómica (Appels et al., 1998)

I.2 Citogenética molecular

El hallazgo de técnicas para identificar genomas y cromosomas en preparaciones cromosómicas ha representado un gran progreso en la citoge-nética vegetal y animal, ya que disponer de mar-cadores cromosómicos permite estudiar la orga-nización del genoma y la arquitectura nuclear Las técnicas de bandeos permiten revelar zonas de adn altamente repetido (heterocromatina constitutiva), pero no diferencian la composi-ción molecular del adn En ausencia de bandas marcadoras no es posible identificar cromoso-mas con morfología similar Además, en espe-cies alógamas suele existir polimorfismo para número y posición de zonas heterocromáticas, lo que dificulta la caracterización cromosómica y la detección de regiones con presencia de intro-gresión Un notable ejemplo de polimorfismo en bandas heterocromáticas lo constituye el estudio de líneas y razas nativas de maíz (Poggio et al.,

Josué Álvarez BorregoCristian Gallardo Escárate

Vitaly KoberMiguel Ángel del Río Portilla

capítulo 1Análisis de imágenes como una herramienta

en citogenética de moluscos

Josué Álvarez Borrego, Cristian Gallardo Escárate, Vitaly Kober y Miguel Ángel del Río Portilla16

2000) Los marcadores moleculares combinados con la citogenética han resultado ser de gran uti-lidad para entender la organización cromosómi-ca y la distribución física de las secuencias repe-tidas (Gersen y Keagle, 1999) El gran potencial de las técnicas de hibridación in situ resulta de combinar información acerca de la morfología nuclear o cromosómica con la información mo-lecular de la estructura de las secuencias Aun-que estas técnicas se conocen desde los años sesenta, la marcación radioactiva en organismos marinos se comenzó a aplicar a fines de la déca-da de los ochenta debido a la gran disponibilidad de secuencias clonadas para ser utilizadas como sondas Además, la posibilidad de utilizar adn genómico total como sonda (Gish) y modernos sistemas de marcación y detección no radioac-tivos han impulsado el uso de esta técnica en forma rutinaria, complementando los resultados obtenidos por metodologías más clásicas Me-diante la aplicación de estas técnicas se obtienen datos que podrán ser utilizados en estudios de sistemática, filogenia, biodiversidad, evolución, mejoramiento y biotecnología (Sessions, 1996)

La hibridación in situ (ish) de sondas de ácidos nucleicos en preparaciones cromosómicas involucra cuatro pasos fundamentales: 1 Obte-ner una sonda marcando secuencias de adn, 2 Reacción de hibridación entre la sonda y el adn blanco (cromosomas), ambos desnaturalizados previamente Las secuencias complementarias de la sonda y del adn de los cromosomas hibri-darán, en relación a su homología, 3 Remoción de la sonda que no se unió o que se hibridó en forma inespecífica, 4 Detección de la hibrida-ción y visualización de la hibridación a través de fluorocromos (Wilkinson, 1998; Schwarzacher y Heslop-Harrison, 2000)

Una de las aplicaciones de la técnica de “fluo-rescent in situ hybridization” (fish) es la obten-ción de un mapa físico, funcional y estructural del genoma utilizando secuencias de distinto origen como sondas El análisis de la organización física de secuencias repetidas, genes, secuencias clona-das, rdna, transgenes, retrovirus, etc , permite identificar cromosomas, analizar la arquitectura nuclear del genoma y verificar hipótesis acerca de la relación entre posición y función de deter-minadas secuencias Otras aplicaciones de esta técnica consisten en determinar la distribución

y posición de material cromosómico extraespe-cífico, la existencia de apareamiento y recombi-nación intergenómica, la existencia de segrega-ción preferencial (responsables de herencia no mendeliana de algunos tipos cromosómicos), la presencia y tipo de rearreglos cromosómicos y analizar la segregación de determinados cromo-somas en estudios evolutivos y programas de me-joramiento genético Éstos son relevantes para comprender la relación entre estos fenómenos y variaciones en la expresión génica (Wilkinson, 1998)

La hibridación in situ utilizando adn genó-mico total como sonda (Gish o Genomic ish) revela homologías específicas del adn, princi-palmente en lo que respecta a secuencias repe-tidas, y ha permitido realizar aportes relevantes en estudios evolutivos, sistemáticos y en mejo-ramiento tanto animal como vegetal Esta técni-ca ha facilitado, por ejemplo, el reconocimiento de especies parentales en híbridos y poliploides, analizar afinidades genómicas interespecíficas, detectar reestructuraciones cromosómicas, co-rroborar que en el núcleo existen dominios es-paciales de genomas o secuencias particulares, detectar la existencia de apareamiento interge-nómico y recombinación (Marasek et al., 2004) Además, permite analizar la organización nu-clear y desarrollo cromosómico en especies e hí-bridos; detectar la presencia de cromosomas o segmentos cromosómicos introgresantes en pla-nes de mejoramiento; analizar afinidades genó-micas interespecíficas en cuanto a variación en secuencias de adn repetitivo (Pita et al., 2003)

I. 3 Citogenética de organismos acuáticos

Probablemente la mayor parte de los estudios citogenéticos en organismos acuáticos están ba-sados principalmente en peces y en moluscos En referencia a peces, diversos estudios citogenéti-cos han sido llevados a cabo principalmente en salmónidos, ciprínidos y cíclidos (Mandrioli et al., 2000; Inafuku et al., 2002; Porto-Foresti et al., 2002; Martins et al., 2004) Dentro de estos estu-dios, ha despertado un especial interés el estudio de la distribución genómica de regiones de adn altamente repetitivas, adn satélite, regiones te-loméricas, adnr 45S y 5S, y elementos nucleó-tidos intercalados (sines y lines) (Martins et

Análisis de imágenes como una herramienta en citogenética de moluscos 17

al., 2004) Recientemente, estudios citogenéticos relacionados con los mecanismos de determina-ción sexual en peces han generado un especial interés debido a la posibilidad de producir líneas monosexuales en el cultivo de algunas especies (Devlin y Nagahama, 2002) Sin embargo, en pe-ces es posible encontrar un amplio espectro de mecanismos genéticos de determinación sexual, con lo cual los estudios de mapeo cromosómi-co permanecen aún inconclusos (Nanda et al., 2003)

I.4 Citogenética de moluscos

Antes de la década de los setenta, se realizaron estudios de citogenética en moluscos, principal-mente con base en el número cromosómico de las especies (Patterson, 1969) Posteriormente, técnicas basadas en tinciones cromosómicas, medidas de longitud relativa, proporción de bra-zos e índices centroméricos han proporcionado información sobre la morfología de los cromo-somas, permitiendo la comparación entre cario-tipos a nivel ínter e intraespecífico (Nakamura, 1986; Thiriot-Quiévreux, 1990; Insua y Thiriot-Quiévreux, 1991; Thiriot-Quiévreux, 1994; La-drón de Guevara et al., 1996; Jarayabhand et al., 1998; Park et al., 2000)

Entre los moluscos, los ostrélidos han sido los más extensamente estudiados en cuanto a aspectos genéticos; esto último, debido proba-blemente a su importancia comercial De las veintidós especies de la familia Ostrelidae que han sido estudiadas citogenéticamente todas po-seen un número diploide de 2n=20, excepto por una especie, Dendrostrea folium, la cual posee un complemento cromosómico de 2n=18 (Ieyama e Inaba, 1974) Esta estabilidad en el número de los cromosomas no refleja necesariamente una igualdad morfológica, ya que existen variaciones tanto en forma como en tamaño y, por lo tanto, en el contenido de adn Estos polimorfismos pueden ser explicados por procesos de natura-leza Robertsoniana, los cuales pueden incluir fi-sión cromosómica (paracéntrica o pericéntrica) o fusión de brazos cromosómicos El proceso de fisión ocasionaría un aumento en el número cromosómico, mientras que la fusión de brazos o segmentos cromosómicos probablemente oca-sionaría una disminución en el número de cro-

mosomas de la especie En ambos casos la mor-fología de los cromosomas cambia por aumento o disminución de segmentos (Gersen y Keagle, 1999) Estudios de polimorfismos cromosómicos en moluscos han sido llevados a cabo en el gas-trópodo Nucella lapillus usando técnicas de tin-ción de plata y fish para la región organizadora de nucleolos (Pascoe y Dixon, 1994; Pascoe et al., 1996; Pascoe et al., 2004)

I.5 Implicaciones de tamaño genómico

Dentro del análisis citogenético, recientemente han recibido una gran atención las relaciones evolutivas implicadas en el contenido de adn nuclear en plantas y animales Las primeras me-diciones detalladas del contenido de adn nu-clear se realizaron en la década de los cuarenta, varios años antes de que Watson y Crick propu-sieran la estructura molecular del adn En los años siguientes, Hewson Swift desarrolló el con-cepto de “valor-C” en referencia a la fase haploi-de de adn en plantas Posteriormente, Mirsky y Ris (1951) llevaron a cabo el primer estudio sistemático de tamaño genómico en animales, incluyendo representantes de las cinco supercla-ses de vertebrados así como también de algunos invertebrados A partir de estos resultados pre-liminares, se hizo evidente que el contenido de adn varía enormemente entre las especies y que esta variación no guarda relación con la no-ción intuitiva de la complejidad del organismo Posteriormente, esta observación fue reafirmada en los años siguientes a medida que aumentaron los estudios sobre tamaño genómico, denomi-nando así a esta característica de los organismos como la “Paradoja del valor-C” (Thomas, 1971) Pocos años después junto con el descubrimiento del adn no-codificante la paradoja fue resuelta, sin embargo, numerosos cuestionamientos per-manecen hasta hoy en día sin respuesta, llevando a denominar este tipo de estudios como el “enig-ma del valor-C” (Gregory, 2001a) En este senti-do, han despertado gran interés los mecanismos por los cuales el adn no-codificante se distri-buye o se pierde a través del genoma Asimismo, existe un mantenimiento diferencial o supresión entre las especies, además de las implicaciones citológicas y fisiológicas del tamaño genómico (vinogradov, 1995)


El tamaño genómico en eucariontes varía más de 200,000 veces, incluyendo a los protis-tas En animales, el rango es aproximadamente de 2,500 veces mientras que en los vertebrados son alrededor de 350 veces (Gregory, 2001b) Actualmente, han sido descritos los tamaños genómicos de aproximadamente 3,000 animales (Gregory, 2001b) y cerca de 4000 plantas (Ben-nett y Leitch, 2001), así como una variedad de hongos, protistas y bacterias

El conocimiento del tamaño genómico de una especie no sólo es relevante en términos generales de cuestionamientos biológicos, sino también puede ser útil en la clasificación de or-ganismos conjuntamente con la información ca-riológica de una especie Probablemente hoy en día en el clima de la biología molecular, el aspec-to más importante del tamaño genómico sea que éste es un factor importante para el desarrollo de futuros proyectos genómicos de secuenciación, así como para estudios de estructura genómica y evolución (Gregory, 2002)

La relevancia de la información obtenida a través del estudio de tamaño genómico ha oca-sionado una intensificación en el desarrollo de metodologías capaces de estimar de manera más precisa la cantidad de adn nuclear, con lo cual se han utilizado diversos métodos para cuantifi-car adn nuclear (Hardie et al., 2002) Algunas de las primeras metodologías de estimación de tamaño genómico estuvieron basadas en técni-cas de extracción de adn genómico Sin embar-go, esta técnica fue reportada como imprecisa debido a que era necesario conocer la concen-tración celular desde la cual se había realizado el proceso de extracción del adn (Hardie et al., 2002) Posteriormente, estas técnicas de ex-tracción fueron reemplazadas por metodologías densitométricas, las cuales están basadas en la cuantificación de la coloración de muestras so-metidas a reacción de Feulgen Brevemente, las técnicas densitométricas parten de la premisa de que la intensidad de coloración es directamente proporcional con la cantidad de adn presente La cantidad de tinción es determinada mediante la cantidad de luz que es absorbida (densidad), sin embargo, no es posible realizar directamente la cuantificación de densidad, con lo cual debe ser estimada indirectamente a través de la trans-

mitancia La transmitancia de una muestra debe ser calculada mediante la diferencia entre la luz incidente que pasa a través de un objeto (por ejemplo, un núcleo) y la luz total transmitida (Hardie et al., 2002) A pesar que los métodos densitométricos son actualmente muy utiliza-dos para estimar tamaño genómico (Gregory, 2003), debido a que han integrado algunos pro-cedimientos de análisis de imágenes, la principal desventaja es que al pasar por una muestra la luz será afectada por los fenómenos que le son propios: difracción, absorción, reflexión y refrac-ción, con lo cual la medición precisa de la luz transmitida total podría afectar la cuantificación de la absorbancia o densidad Como una alter-nativa a las tinciones densitométricas, es posible cuantificar la intensidad de fluorescencia me-diante el uso de tinciones específicas para adn En este sentido, la fluorometría se ha desarro-llado tanto para mediciones estáticas o cuantifi-cación directa en un solo plano o en mediciones dinámicas como en el caso de la citometría de flujo En el caso de mediciones estáticas, se han desarrollados microscopios especiales capaces de medir directamente la fluorescencia desde un frotis celular, con lo cual ha sido posible deter-minar niveles de ploidía tanto en espermatozoi-des como en organismos poliploides (Uchimura et al., 1989; Ishibashi et al., 2003) En referencia a la citometría de flujo, probablemente es la téc-nica con mayor aceptación y difusión en cuanto a medición de tamaño genómico (Dolezel et al., 2004) Desde su desarrollo, a finales de los años setenta, para detectar contenidos anómalos de adn en células cancerígenas, la citometría de flujo se ha vuelto esencial en la investigación del tamaño genómico de animales y plantas (Tiersch et al., 1989; Rodriguez-Juiz et al., 1996) Breve-mente, este método consiste en tratar una mues-tra de células en suspensión con fluorocromos adn-específicos La medición de la fluorescen-cia se realiza mediante la incidencia de un haz de luz láser sobre un flujo de células teñidas con el fluorocromo (Martínez et al., 1990) Esta técnica ha sido descrita como rápida y precisa (Haynes, 1988) Sin embargo, presenta algunas limitacio-nes como la necesidad de células en suspensión, un gran número de células por análisis y, eviden-temente, un mayor costo de equipamiento


I.6 Análisis de imágenes como una herramienta en citogenética

El mayor desarrollo de tecnologías de análisis de imágenes ha estado asociado sin duda a estudios de citogenética humana (Schrock et al., 1996; Trask, 2002) Asimismo, las aplicaciones citoge-néticas moleculares han aumentado considera-blemente mediante el uso de nuevas tecnologías de análisis de imágenes Dispositivos modernos de captura de imágenes permiten la visualización de señales de fluorescencia indetectables para el ojo humano De esta forma, es posible obtener información cuantitativa y, conjuntamente con análisis matemáticos, procesar una mayor canti-dad de información (Young, 1996) Sin embargo, la mayoría de los estudios citogenéticos en inver-tebrados disponibles hasta ahora, establecen las diferencias cromosómicas entre especies a partir del análisis cariológico clásico Los cromosomas son clasificados cualitativamente en categorías (metacéntrico, submetacéntrico, subtelocéntri-co y telocéntrico) con base en la relación de la longitud entre el brazo largo y brazo corto de cada par cromosómico (Levan et al., 1964) Este método separa la variación continua de la posi-ción del centrómero en clases discretas y no con-sidera el tamaño absoluto de cada cromosoma Este procedimiento considera diferentes a pares cromosómicos similares que caen en distintas clases cualitativas o considera iguales a pares que, siendo distintos, caen dentro de la misma categoría Sin embargo, variaciones morfológi-cas debidas al grado de condensación del adn en los cromosomas pueden originar errores en la identificación adecuada del cariotipo de una especie o individuo (Appels et al., 1998) Lo an-terior ha hecho necesaria la búsqueda de modifi-caciones a la metodología clásica propuesta por Levan et al. (1964) y de nuevos procedimiento de identificación y clasificación cromosómica En este sentido los métodos de biología mole-cular aplicados en citogenética, conjuntamente con la aplicación de procedimientos de análisis de imágenes, han aportado nueva información en torno al grado de diferenciación genómica de los cromosomas (Netten, 1997) Adicionalmen-te, la integración de análisis estadísticos en las mediciones morfométricas de los cromosomas ha permitido verificar diferencias significativas

en el tamaño medio de brazos cromosómicos en algunas especies de fisurélidos, pectínidos y os-treídos (Ladrón de Guevara et al., 1996; Gajardo et al., 2002; Amar, 2003) Otro tipo de aproxima-ción es la utilización de herramientas computa-cionales; en este sentido, la utilización de análisis de imágenes permite reducir el error ocasionado por las mediciones manuales, generando resul-tados más cuantitativos y detallados de la natu-raleza morfológica de los cromosomas (Schrock et al., 1996) En la ostra Crassostrea virginica se ha descrito, a través de mediciones digitales, que la variación individual cromosómica en larvas es de 5%, lo cual estaría relacionado directamente con las variaciones morfológicas debidas tanto a factores biológicos como a diferentes grados de condensación del adn durante el ciclo celular (Zhang et al., 1999)

Recientemente han recibido mayor atención las técnicas de identificación mediante la utiliza-ción del teorema de convolución En un principio esta aplicación estuvo centrada en la industria militar Sin embargo, a partir de los años setenta se ha incluido en el reconocimiento óptico-digi-tal de imágenes cada vez más complejas como objetos movidos, rotados, escalados, degradados o fuera de foco Esto ha dado lugar al desarrollo de técnicas invariantes, es decir, técnicas que re-conocen como idénticos a objetos iguales a pesar de tener cambios de posición, escala, rotación, entre otras Sin embargo el procesamiento inva-riante es una tarea difícil, motivo por el cual las técnicas encaminadas a resolver este problema son variadas (Pech-Pacheco y Álvarez-Borrego, 1998; Álvarez-Borrego y Chávez-Sánchez, 2001; Castro-Longoria et al., 2001; Álvarez-Borrego et al., 2002; Fájer-Ávila y Álvarez-Borrego, 2002; Pech Pacheco et al., 2002; villalobos-Flores et al., 2002; Castro-Longoria et al., 2003; Pech Pacheco et al., 2003)

II. Obtención de cariotipos en moluscos: caso de estudio en abulones

II.1 Obtención de organismos

Para el presente estudio se utilizaron ejemplares adultos maduros de abulón rojo Haliotis rufes-cens, azul H. fulgens y amarillo H. corrugata Los


ejemplares de abulón rojos fueron obtenidos de la granja Abulones Cultivados sa, localizada en el Ejido Eréndira Los ejemplares de abulón amari-llo y azul fueron colectados desde Isla de Cedros (28°03’N; 115°8’W) Ambas localidades ubicadas en Baja California, México Los organismos fue-ron mantenidos y acondicionados para desovar tanto en el laboratorio húmedo del Departamento de Acuicultura (CiCese), como en el laboratorio de producción larval de la Cooperativa de Pesca-dores Nacionales del Abulón, Isla de Cedros

II.1.1 Obtención de placas metafásicas

Para la obtención de placas metafásicas se utiliza-ron larvas 24 h post-fertilización (figura 1) Como antimitótico se utilizó colchicina, que es un alca-loide que impide la formación del huso mitótico deteniendo las células en metafase Las larvas re-cién recolectadas fueron puestas en un medio con colchicina 0 05% disuelta en agua de mar micro-filtrada a temperatura ambiente por 4 h

II.1.2 Tratamiento hipotónico

La hipotonía permite que las células aumenten de volumen, facilitando la técnica de aplastado o goteo, mejorando así la dispersión de los cro-mosomas Las larvas fueron tratadas con agua de mar microfiltrada a 50% durante 30 minutos

II.1.2.1 Fijación

Se utilizó Carnoy modificado (metanol: ácido acético, 3:1) recién preparado, a una tempera-tura de 4 ºC aproximadamente El fijador frío se deslizó lentamente por las paredes del tubo Eppendorf de 1 5 ml para evitar dañar el tejido Se realizaron 3-4 cambios por decantación y du-ración de 30 minutos cada uno Las muestras se mantuvieron en solución Carnoy por aproxima-damente una semana y posteriormente en etanol a 70% a 4ºC

28

Figura 1

Figura 1. Esquema de procedimiento de obtención de placas en metafase desde larvas de abulón.


29

Figura 2

Figura 2. Cromosomas de Haliotis rufescens. a) Imagen digital de placa metafásica, b) Cariotipo de H. rufescens.

II.1.2.2 Confección de preparaciones

El tejido fue disgregado con ácido acético 50% a temperatura ambiente en un tubo de 1 5 ml Luego de mantenerlo en forma vertical y sin mo-verlo durante 10 minutos, se extrajo el sobrena-dante con una pipeta Pasteur El líquido se goteó sobre un portaobjeto precalentado entre 40-50 ºC y desde una altura aproximada de treinta centímetros Las preparaciones se dejaron se-car al aire En el caso de los abulones azules y amarillos se tiñeron los cromosomas con dapi (4,6-diamidino-2-phenylindole) en buffer fosfa-to salino (1xPBS) pH 7 4 a una concentración 0 5 µg/ml por periodos que variaron entre 10-20 mi-nutos En el caso del abulón rojo se utilizó sólo contraste de fases

II.1.2.3 Desarrollo de cariotipos

La figura 1 muestra el procedimiento general de obtención de placas metafásicas desde lar-vas de abulón Adicionalmente, las mejores pla-cas metafásicas fueron capturadas digitalmente a 1000x en un microscopio de epifluorescencia (Leica modelo DMRxA2) equipado con una cá-mara digital a color de 36-bits y 3 3 MegaPixel (Leica modelo DC300) Las imágenes captura-das fueron utilizadas para obtener dos tipos de aproximaciones La primera fue obtener valores morfométricos de los brazos de cada cromosoma a través del programa Image Pro-Plus versión 3 0 (Copyright© 1993-1998 Media Cybernetics) Las mediciones fueron usadas para determinar la longitud relativa de los cromosomas (longitud del par cromosómico / longitud total del juego cromosómico x 100) y el índice centromérico de cada cromosoma (longitud del brazo corto / longitud total del cromosoma x 100) Con las mediciones de las mejores placas en metafase se construyó el cariotipo promedio Asimismo, el ordenamiento de los cromosomas fue realizado con base en la nomenclatura propuesta por Le-van et al. (1964)

II.2 Cariotipo cuantitativo de Haliotis rufescens

Para la obtención del cariotipo de H. rufescens se capturaron y procesaron varias imágenes digitales para eliminar ruido y bajo contraste Después de

procesar la imagen fue posible obtener imágenes cromosómicas de mejor contraste y, por tanto, fue posible realizar mediciones más exactas de la morfología de los cromosomas La figura 2a muestra una placa metafásica sin teñir y mejo-rada mediante procesamiento de imágenes Las observaciones cariológicas en células larvales de abulón rojo mostraron un número diploide igual a 36 cromosomas La distribución relativa de lon-gitudes cromosómicas fue deducida para obtener el cariotipo del abulón rojo del Pacífico Haliotis rufescens (figura 2b) Los valores medios y desvia-ciones estándar de los 18 pares cromosómicos se muestran en la tabla I (Gallardo et al., 2004)

La relación de longitudes de los brazos cro-mosómicos se utilizó para graficar el cardiograma representativo para la especie Este indicó que el abulón rojo posee ocho pares metacéntricos (1, 3, 6, 7, 14, 15, 17 y 18), nueve pares submetacén-tricos (2, 4, 5, 8, 9, 10, 11, 12 y 13) y un par cro-mosómico clasificado como subtelocéntrico (16) Los pares cromosómicos 14 y 17 fueron difíciles


30

0

1

2

3

4

5

0 1 2 3 4 5% Brazo corto

% B

razo

larg

o

MSMSTT

16

18

1

7

15

1417

6

3

12

10

8

2

4 5

11

13

9

Figure 3

Figura 3. Carioidiograma de Haliotis rufescens. M, metacéntrico; SM, submetacéntrico; ST, subtelocéntrico; T, telocéntrico.

de identificar debido principalmente al traslape de sus respectivas longitudes porcentuales cro-mosómicas (figura 3)

31

Figura 4

Figura 4. Cariotipo de Haliotis fulgens (2n=36).

II.3 Cariotipo cuantitativo de Haliotis fulgens

Cromosomas metafásicos de abulón azul H. ful-gens mostraron un número diploide de 2n=36 (figura 4) Los valores medios y de desviación estándar de la longitud total, longitud relativa

Tabla I Longitud cromosómica total, longitud relativa e índice centromérico para Haliotis rufescens (2n=36)

CromosomaPar núm.

Longitud total (μm)(media ± de)

Longitud relativa (%)(media ± de)

Índice centromérico(media ± de)

Tipocromosómico*

1 5 67 ± 0 19 6 52 ± 0 56 43 95 ± 0 15 M2 5 58 ± 0 07 6 42 ± 1 03 32 53 ± 0 18 SM3 5 39 ± 0 06 6 20 ± 0 55 46 91 ± 0 11 M4 5 30 ± 0 10 6 09 ± 0 78 31 30 ± 0 13 SM5 5 24 ± 0 01 6 03 ± 0 91 29 91 ± 0 09 SM6 5 20 ± 0 03 5 97 ± 0 26 44 66 ± 0 15 M7 5 08 ± 0 13 5 84 ± 0 44 41 68 ± 0 03 M8 5 07 ± 0 07 5 83 ± 0 68 31 72 ± 0 29 SM9 4 99 ± 0 07 5 74 ± 1 01 26 38 ± 0 15 SM10 4 65 ± 0 04 5 34 ± 0 80 28 97 ± 0 13 SM11 4 63 ± 0 09 5 32 ± 0 70 29 70 ± 0 13 SM12 4 58 ± 0 02 5 26 ± 0 52 34 67 ± 0 08 SM13 4 50 ± 0 04 5 17 ± 0 78 27 59 ± 0 17 SM14 4 44 ± 0 07 5 10 ± 0 17 46 23 ± 0 21 M15 4 32 ± 0 05 4 96 ± 0 31 42 74 ± 0 20 M16 4 31 ± 0 05 4 95 ± 1 63 16 31 ± 0 14 ST17 4 46 ± 0 06 4 45 ± 0 27 45 56 ± 0 15 M18 3 75 ± 0 07 4 31 ± 0 34 44 48 ± 0 19 M

* M, metacéntrico; SM, submetacéntrico; ST, subtelocéntrico


32

0

1

2

3

4

5

0 1 2 3 4 5% Brazo corto

% B

razo

larg

o

MSMSTT1

36

4

2

78

10

911

16

1718

13

12

514

15

Figura 5

Figura 5. Carioidiograma de Haliotis fulgens. M, metacéntrico; SM, submetacéntrico; ST, subtelocéntrico; T, telocéntrico.

e índice centromérico fueron estimados a partir de las mediciones de brazos cromosómicos usan-do análisis de imágenes (tabla II) La longitud máxima de los cromosomas fue 6 07 ± 0 12 µm y la mínima fue de 3 13 ± 0 21 µm El carioidio-grama obtenido para el abulón azul mostró que esta especie posee ocho pares metacéntricos (1, 3, 6, 9, 10, 16, 17 y 18), ocho pares submetacén-tricos (2, 4, 5, 7, 8, 11, 12 y 13), y dos pares de cromosomas subtelocéntricos (14 y 15) (figura 5) (Gallardo-Escárate et al., 2005a)

II.4 Cariotipo cuantitativo de Haliotis corrugata

Las metafases examinadas en el abulón amarillo H. corrugata, mostraron un número cromosómi-co diploide de 2n=36 (figura 6) La longitud cro-mosómica total mostró un máximo de longitud cromosómica de 5 82 ± 0 12 µm y un mínimo de 3 46 ± 0 05 µm, adicionalmente se obtuvieron los valores de longitud relativa e índice centro-mérico (tabla III) Mediante el arreglo de pares cromosómicos, el cariotipo consistió en diez pa-res metacéntricos (1, 3, 6, 9, 10, 11, 14, 15, 17 y 18), siete pares submetacéntricos (2, 4, 5, 7, 8, 12 y 13), y un par de cromosomas subtelocéntricos (16) (figura 7) (Gallardo-Escárate et al., 2005b)

III. Desarrollo de un método para estimar tamaño genómico mediante análisis de imágenes fluorescentes

III.1 Material biológico

Para determinar las relaciones entre el tama-ño genómico y desvanecimiento fluorescente de adn, se utilizaron distintas especies de va-lor-C conocido (cantidad total de adn conte-

Tabla II Longitud cromosómica total, longitud relativa e índice centromérico para Haliotis fulgens (2n=36)

CromosomaPar núm.



Índice centromérico(media ± de)

Tipocromosómico*

1 6 07 ± 0 12 8 00 ± 0 27 47 45 ± 0 16 M2 5 06 ± 0 81 6 67 ± 0 12 34 09 ± 0 15 SM3 4 84 ± 0 11 6 37 ± 0 38 48 37 ± 0 17 M4 4 72 ± 0 68 6 23 ± 0 49 39 81 ± 0 18 SM5 4 16 ± 0 93 5 48 ± 0 22 34 16 ± 0 14 SM6 4 62 ± 0 35 6 08 ± 0 12 44 69 ± 0 13 M7 4 56 ± 0 68 6 01 ± 0 07 39 41 ± 0 10 SM8 4 41 ± 0 79 5 82 ± 0 40 37 27 ± 0 17 SM9 4 24 ± 0 49 5 59 ± 0 20 42 74 ± 0 15 M10 4 14 ± 0 36 5 45 ± 0 10 43 77 ± 0 12 M11 4 04 ± 0 69 5 32 ± 0 20 37 98 ± 0 15 SM12 3 98 ± 0 87 5 24 ± 0 26 34 51 ± 0 09 SM13 3 81 ± 0 51 5 02 ± 0 31 40 59 ± 0 15 SM14 3 86 ± 1 38 5 09 ± 0 21 24 73 ± 0 14 ST15 3 63 ± 1 29 4 78 ± 0 25 24 82 ± 0 17 ST16 3 50 ± 0 25 4 61 ± 0 19 44 97 ± 0 12 M17 3 13 ± 0 08 4 13 ± 0 23 48 29 ± 0 20 M18 3 13 ± 0 21 4 13 ± 0 22 45 20 ± 0 09 M



nido dentro del complemento haploide medida en picogramos (pg)) Peces: tilapia Mozambica, Oreochromis mossambicus valor-C=0 81 pg (Cui et al., 1991) y trucha arco iris, Oncorhynchus my-kiss valor-C=2 40 pg (Hardie y Hebert, 2003) Moluscos: abulón rojo, Haliotis rufescens valor-C=1 8 pg, abulón azul, H. fulgens valor-C =1 70 pg y abulón amarillo, H. corrugata valor-C = 2 0 pg (Hinigardner, 1974)

33

Figura 6

Figura 6. Cariotipo de Haliotis corrugata (2n=36).

34

0

1

2

3

4

5

0 1 2 3 4 5

% Brazo corto

% B

razo

larg

o

MSMSTT

1

11 9

3

1817

15

14610

2

45

128

7

13

16

Figura 7

Figura 7. Carioidiograma de Haliotis corrugata. M, metacén-trico; SM, submetacéntrico; ST, subtelocéntrico; T, telocén-trico.

Tabla IIILongitud cromosómica total, longitud relativa e índice centromérico para Haliotis corrugata (2n=36)

CromosomaPar núm.



Índice Centromérico(media ± de)

Tipocromosómico*

1 5 82 ± 0 12 7 28 ± 0 27 48 02 ± 0 06 M2 5 00 ± 0 08 6 26 ± 0 12 35 90 ± 0 11 SM3 4 82 ± 0 03 6 03 ± 0 38 46 70 ± 0 05 M4 4 80 ± 0 06 6 00 ± 0 49 39 95 ± 0 08 SM5 4 59 ± 0 02 5 74 ± 0 22 36 93 ± 0 06 SM6 4 53 ± 0 06 5 66 ± 0 12 43 81 ± 0 09 M7 4 52 ± 0 05 5 66 ± 0 07 34 51 ± 0 09 SM8 4 45 ± 0 02 5 57± 0 40 36 91 ± 0 08 SM9 4 44 ± 0 04 5 55 ± 0 20 49 16 ± 0 07 M

10 4 34 ± 0 01 5 43 ± 0 10 41 09 ± 0 07 M11 4 32 ± 0 08 5 40 ± 0 20 47 98 ± 0 16 M12 4 29 ± 0 02 5 36 ± 0 26 37 38 ± 0 04 SM13 4 24 ± 0 02 5 30 ± 0 31 34 82 ± 0 08 SM14 4 22 ± 0 09 5 28 ± 0 21 44 74 ± 0 10 M15 4 07 ± 0 03 5 09 ± 0 25 47 04 ± 0 03 M16 4 03 ± 0 02 5 04 ± 0 19 22 44 ± 0 04 ST17 4 01 ± 0 01 5 02 ± 0 23 48 59 ± 0 02 M18 3 46 ± 0 05 4 32 ± 0 22 45 50 ± 0 07 M



III.1.1 Recolección de muestras y preparación celular para tinción de ADN

Para la estimación de tamaño genómico en pe-ces se utilizaron eritrocitos así como núcleos de espermatozoides La sangre de los peces fue re-colectada por punción del arco braquial con una jeringa de 1 5 ml Previamente, los peces fueron anestesiados con hydroxyl-phenol (0 2 mg/ml) Monocapas de células de glóbulos rojos fueron adheridas sobre los portaobjetos según Hardie et al. (2002) Posteriormente, los frotis fueron deja-dos secar al aire junto con metanol como solución fijadora Después de la fijación, los frotis fueron deshidratados mediante el incremento del grado de etanol (70%, 90% y 100%), dos cambios por 5 minutos cada vez y finalmente almacenados a 4 °C Las muestras de espermatozoides fueron ob-tenidas de tilapias en estado reproductivo median-te masaje abdominal Los frotis de espermatozoi-des fueron fijados sobre portaobjetos con solución de Carnoy fresco (metanol: ácido acético, 3:1) a 4 °C y posteriormente dejados secar al aire Para la recolección de muestras en moluscos, se utiliza-ron hemocitos y espermatozoides de abulones La hemolinfa fue obtenida directamente desde el nó-dulo sinusal cardiaco mientras que los espermato-zoides fueron obtenidos por inducción al desove de ejemplares adultos según Morse et al. (1977) Los frotis fueron procesados de manera similar a las muestras de espermatozoides de tilapia

Las células fijadas sobre los portaobjetos fue-ron lavadas tres veces con tampón fosfato salino (1xPBS; 13 mM NaCl, 0 2 mM KCl, 0 8 mM Na2-HPO4, 0 2 mM KH2PO4, pH 7 4) por 15 minutos Posteriormente, los frotis fueron incubados con tinción de dapi en oscuridad por 25 minutos a temperatura de laboratorio La solución de dapi fue preparada con 4,6-diamidino-2-phenylindole (dapi) (Sigma Chemical; St Louis, MO) en 1xPBS a una concentración de 0 5 µg/ml Esta concentración permitió obtener imágenes fluo-rescentes con la menor cantidad de fluorocromo adherido al citoplasma (sobretinción)

III.1.2 Captura de imágenes

Para la captura digital de imágenes fluorescentes se programó una subrutina de captura mediante el programa QWIN (Copyright® by Imaging Sys-

tems Ltd , Cambridge, U K , 1997) La subrutina permitió capturar una imagen digital de 348 x 258 píxeles cada 1600 milisegundos durante un periodo de desvanecimiento fluorescente en el mismo campo de observación Adicionalmente, el programa almacenó las imágenes capturadas en un archivo para su análisis Las condiciones de captura fueron: tiempo de exposición de CCd de 509 milisegundos, gamma igual a 1 (respues-ta lineal) y profundidad de color de 8 bits/canal Para la medición de fluorescencia, se utilizó un microscopio motorizado de epifluorescencia mo-delo Leica DMRxA2, equipado con una cámara color de 36-bits modelo Leica DC300 (3 3 Mega Pixels) Las condiciones de fluorescencia fueron; filtro de excitación de Uv 340-380 nm, espejo dicromático DM 400 nm, filtro de supresión LP 425, banda de absorción AB 435-485 nm y lente objetivo Fluotar PL 63x/0 7

III.1.3 Análisis de imágenes fluorescentes

El análisis de imágenes fue llevado a cabo me-diante el desarrollo de un algoritmo específica-mente construido con lenguaje MATLAB (Co-pyright© 1984-2000, The MathWorks, Inc ) El algoritmo fue construido con la finalidad de pro-cesar la información de la intensidad de fluores-cencia durante un periodo de desvanecimiento dapi-fluorescente, para lo cual se midió la in-tensidad de fluorescencia mediante una ventana de 13x13 píxeles alrededor del núcleo Esta ven-tana fue utilizada para estimar el promedio de la intensidad “adn-dapi fluorescente” o formal-mente como intensidad media pixélica (imp) Las imágenes fluorescentes fueron convertidas desde color a 256 niveles de brillo (8 bits/canal) Adicionalmente, el algoritmo permitió analizar simultáneamente numerosos núcleos sobre la muestra De esta forma, el proceso generó una captura secuencial durante un periodo de des-vanecimiento fluorescente hasta la pérdida total de fluorescencia del adn Gráficamente, si uni-mos todos los puntos imp durante un periodo de pérdida de fluorescencia, el área bajo la curva representará una función de integración de des-vanecimiento fluorescente (id) como:

(1) tIMPID

n

ii D∗= ∑

=1)(


Donde el subíndice i representa el número de imágenes en un periodo de desvanecimiento y

tD el intervalo entre la captura de imágenes Así, id representa la función integral mediante la suma de la intensidades medias pixélicas a través del período de desvanecimiento fluorescente del adn

Adicionalmente, se construyeron una se-rie de algoritmos con la finalidad de estimar el número de núcleos necesarios para obtener un valor representativo de id y determinar la infor-mación de brillo que contribuye cada canal rGB Después de obtener los valores de id para cada tipo celular utilizado como referencia, se ajusta-ron los resultados a un modelo lineal entre id y el tamaño genómico reportado para las especies de referencia Adicionalmente se obtuvo 95% de intervalo de confianza para los descriptores de la ecuación lineal La figura 8 muestra el procedi-miento general de la medición de tamaño genó-

35

Figura 8

Figura 8. Procedimiento general de medición de tamaño genómico a través de la cuantificación del desvanecimiento fluores-cente de ADN.

mico a través de la cuantificación del desvaneci-miento fluorescente de ADN

III.2 Tamaño genómico mediante análisis de imágenes fluorescentes

III.2.1 La naturaleza del desvanecimiento DAPI-fluorescente

Con la finalidad de establecer la relación entre el desvanecimiento dapi-fluorescente y el tamaño genómico, se compararon los perfiles de desva-necimiento en núcleos de distintos tipos celu-lares de tilapia Mozambica, abulón rojo, azul y amarillo y trucha arco iris Con la finalidad de visualizar el periodo de desvanecimiento fluo-rescente, la figura 9 muestra sólo doce imágenes de núcleos de eritrocitos de tilapia teñidos con dapi La secuencia muestra un periodo entre t = 1 6 a t = 192 segundos a diferentes intervalos


de tiempo La secuencia muestra que la fluores-cencia decrece rápidamente bajo la exposición de luz ultravioleta La intensidad de fluorescen-cia fue visualizada por intensidad pixélica de 256 niveles de brillo

Para comparar el desvanecimiento fluores-cente en diferentes especies y por tanto dife-rentes tamaños genómicos, se obtuvieron los perfiles de desvanecimiento en espermatozoides (eZt) y eritrocitos (ert) de tilapia Mozam-bica, espermatozoides de abulón rojo (eZr) y eritrocitos de trucha arco iris (ERTr) Los per-files adn-dapi mostraron una disminución de la intensidad de fluorescencia en función del tiempo de exposición a luz ultravioleta (uv) La variabilidad de los perfiles en diferentes fro-tis mostró que la dispersión de los datos ocurre principalmente en los primeros 20 segundos de exposición a luz uv, después de este intervalo de tiempo el perfil de desvanecimiento se vuelve más estable, independientemente del número de campos medidos Asimismo, fue posible observar una diferencia en los tiempos requeridos para que ocurra completamente el desvanecimiento, de esta forma el tiempo guarda relación con el tipo celular analizado (figura 10)

El fluorocromo dapi unido al adn emite fluorescencia principalmente en el intervalo de longitudes de onda del color azul Sin embargo, en imágenes digitales el color es aportado por la contribución de tres canales; rojo, verde y azul (rGB) Con la finalidad de estudiar la contribu-ción de los tres canales rGB, y así determinar

36

Figura 9

Figura 9. Secuencia de desvanecimiento fluorescente en eritrocitos de tilapia, Oreochromis mossambicus. La barra de color indica la intensidad pixélica de 0 a 255.

cuál de ellos aporta la mayor información de in-tensidad durante el periodo de desvanecimiento, se analizaron los perfiles de fluorescencia des-compuestos en los tres canales rGB La figura 11 muestra una imagen de eritrocito de tilapia teñida con dapi y descompuesta en los tres ca-nales rGB Se observa que el canal azul es el que aporta la mayor cantidad de información en comparación con los canales verde y rojo, res-pectivamente Sin embargo, la mayor cantidad de información de intensidad aportada por el canal azul puede estar afectada por ruido de fondo En tal caso, la intensidad medida no necesariamente puede provenir del núcleo

Para determinar si la contribución de cada ca-nal rGB fue similar en los tipos celulares de re-ferencia e independiente al tamaño genómico, se obtuvieron perfiles de desvanecimiento para cada canal de color por separado De esta forma, cada canal (rGB) fue graficado conjuntamente con un perfil promedio de los tres canales (figura 12) Este análisis mostró que durante el periodo de desvanecimiento, el canal azul fue el que aportó la mayor cantidad de información de brillo, mien-tras que los canales verde y rojo contribuyeron en menor grado El canal verde mostró una posición intermedia entre los otros perfiles, lo cual indicó que este canal posee la capacidad de atenuar las altas intensidades del canal azul producido por el ruido de fondo e incrementar la baja señal obte-nida por el canal rojo En este sentido, es posible trabajar sólo con el canal verde para establecer una curva representativa de desvanecimiento fluorescente Sin embargo, el trabajar sólo con un canal incrementa los tiempos de cómputo debi-do a que es necesario generar una rutina adicio-nal que extraiga el canal verde desde la imagen rGB A partir de estos resultados, las mediciones realizadas de desvanecimiento fluorescente en el presente trabajo fueron realizadas mediante la correlación de los tres canales de color rGB, el cual no requiere ningún procesamiento adicional (figura 12)

III.2.2 La relación entre el desvanecimiento DAPI-fluorescente y el tamaño genómico

Los perfiles de desvanecimiento de fluorescencia fueron usados para estimar el área bajo la curva mediante una función de integración o integral


de desvanecimiento (ecuación 1) Para verificar la hipótesis, que la integral de desvanecimiento (id) era función del tamaño genómico de una célula, se estimaron los valores de id en esper-matozoides y eritrocitos de tilapia Mozambica El valor estimado para espermatozoides id = 2266 52, mostró ser equivalente a la mitad del valor obtenido para eritrocitos id = 4521 44 Esta relación representa los valores de tamaños

37

Figura 10

Figura 10. Perfiles de desvanecimiento DAPI-fluorescente para distintos tipos celulares. EZT, espermatozoides de tilapia. ERT, eritrocitos de tilapia. EZR, espermatozoides de abulón rojo. ERTr, eritrocitos de trucha arco iris.

genómicos haploide y diploide para O. mossam-bicus (figura 13)

Los valores medios de id para cada especie utilizada en el presente estudio como referencia se muestran en la tabla Iv

Con el objetivo de estimar la variabilidad de los valores de id en un tipo celular específico y de esta forma calcular el tamaño muestreal necesario para obtener un valor representativo


de id, se desarrolló una aproximación gráfica para estimar el número de núcleos en el cual los descriptores se estabilizan De esta forma se generaron números aleatorios para ordenar los valores y graficarlos Esto minimizó el efecto del campo sobre el punto de estabilización del valor id De este modo, el punto de estabilización fue representativo del tamaño muestreal El análisis fue realizado para cada uno de las especies y ti-pos celulares estudiados La figura 14 muestra gráficamente la dispersión del promedio id a medida que se incrementa el número de núcleos espermáticos en abulones Del mismo modo, el análisis de la dispersión de la varianza mostró ser estable después de los 100 núcleos medidos (figura 15)

39

Figura 12

Figura 12. Descomposición de canales RGB en perfiles de desvanecimiento fluorescente. EZT, espermatozoides de tilapia. EZR, espermatozoides de abulón rojo. ERT, eritrocitos de tilapia. ERTr, eritrocitos de trucha arco iris.

38

Figura 11

Figura 11. Imagen digital DAPI-fluorescente descompuesta en los tres canales de color (rojo, verde y azul) en eritrocitos de tilapia.


De acuerdo a los resultados obtenidos median-te la medición de id en los distintos tipos celula-res, se procedió a ajustar dichos datos a un modelo lineal junto con los valores de tamaño genómico descritos para dichas especies A partir del modelo se estimaron los descriptores a y b, con los cuales se determinó la ecuación de la recta:

(2) 8.596ˆ2.3337ˆ += xy Donde x e y representan los valores de tama-ño genómico e integral de desvanecimiento (id) respectivamente El valor de correlación obteni-do para la relación entre id y tamaño genómico fue de r = 0 99 (figura 16)

Para estimar los intervalos de confianza a 95% se determinó la esperanza matemática (E) mediante un análisis de Fisher, donde

(tabla v)

Tabla v Intervalos de confianza (95%) de a, b y j

calculado en sobre el modelo lineal

-95% Parámetros +95%

3321 8 < a < 3358 5581 4 < b < 805 80 596 < j < 0 999

40

Figura 13

Figura 13. Relación de integral de desvanecimiento fluores-cente (ID) con el contenido genómico haploide y diploide en eritrocitos de tilapia Mozambica.

Tabla Ivvalor medio y desviación estándar de ID para las especies de valor-C conocido

Especie Tipo celular n Valor IDO. mossambicus espermatozoide 362 2229 4 ± 99 9O mossambicus Eritrocito 244 4495 3 ± 83 8O. mykiss Eritrocito 721 15205 2 ± 47 9H. rufescens espermatozoide 264 5312 8 ± 114 8H. rufescens Hemocito 371 11667 1 ± 117 9H fulgens espermatozoide 374 4972 3 ± 130 4H. fulgens Hemocito 214 10592 1 ± 157 2H. corrugata espermatozoide 399 6404 1 ± 129 5H. corrugata Hemocito 239 12953 2 ± 289 9

41

Figura 14

Figura 14. Estimación de la media de la integral de desvane-cimiento (ID) en espermatozoides de tres especies de abu-lones. EZR, abulón rojo. EZAZ, abulón azul. EZAM, abulón amarillo.

8

fluorescente en el presente trabajo, fueron realizadas mediante la correlación de los tres canales de color RGB, el cual no requiere ningún procesamiento adicional (Fig. 12). III.2.2 La relación entre el desvanecimiento DAPI-fluorescente y el tamaño genómico Los perfiles de desvanecimiento de fluorescencia fueron usados para estimar el área bajo la curva mediante una función de integración o integral de desvanecimiento (ecuación 1). Para verificar la hipótesis, que la integral de desvanecimiento (ID) era función del tamaño genómico de una célula, se estimaron los valores de ID en espermatozoides y eritrocitos de tilapia Mozambica. El valor estimado para espermatozoides ID = 2266.52, mostró ser equivalente a la mitad del valor obtenido para eritrocitos ID = 4521.44. Esta relación representa los valores de tamaños genómicos haploide y diploide para O. mossambicus (Fig. 13).

Los valores medios de ID para cada especie utilizada en el presente estudio como referencia se muestran en la Tabla IV. Con el objetivo de estimar la variabilidad de los valores de ID en un tipo celular específico y de esta forma calcular el tamaño muestreal necesario para obtener un valor representativo de ID se desarrolló una aproximación gráfica para estimar el número de núcleos en el cual los descriptores se estabilizan. De esta forma se generaron números aleatorios para ordenar los valores y graficarlos. Esto minimizó el efecto del campo sobre el punto de estabilización del valor ID. De este modo, el punto de estabilización fue representativo del tamaño muestreal. El análisis fue realizado para cada uno de las especies y tipos celulares estudiados. La figura 14 muestra gráficamente la dispersión del promedio ID a medida que se incrementa el número de núcleos espermáticos en abulones. Del mismo modo, el análisis de la dispersión de la varianza mostró ser estable después de los 100 núcleos medidos (Fig. 15). De acuerdo a los resultados obtenidos mediante la medición de ID en los distintos tipos celulares, se procedió a ajustar dichos datos a un modelo lineal junto con los valores de tamaño genómico descritos para dichas especies. A partir del modelo se estimaron los descriptores y , con los cuales se determinó la ecuación de la recta:

8.596ˆ2.3337ˆ xy 2

donde x e y representan los valores de tamaño genómico e integral de desvanecimiento (ID) respectivamente. El valor de correlación obtenido para la relación entre ID y tamaño genómico fue de r = 0.99 (Fig. 16). Para estimar los intervalos de confianza al 95% se determinó la esperanza matemática mediante un análisis de

Fisher, donde )(r , )ˆ( y )ˆ( (Tabla V). En referencia a la aplicación del modelo lineal (ecuación 2) para calcular tamaño genómico en muestras problema, se obtuvo la siguiente ecuación:

ˆ

ˆIDuADNu 3

donde ADNu = valor de tamaño genómico desconocido y IDu = valor medio de ID obtenido para la muestra. Los

valores ˆ y ˆ representan los valores de pendiente de la recta e intercepto, los cuales a su vez integran la variación del modelo lineal al incrementar el número tipos celulares medidos. De esta forma, la ecuación de la recta podría cambiar a medida que se aumenta el número de puntos, ajustándose cada vez más al valor real de intercepto y pendiente. Sin embargo, al calcular los intervalos de confianza se puede considerar que la ecuación tendrá un comportamiento lineal dentro de los límites de la esperanza matemática (E) calculada en la tabla VIII. Adicionalmente, ésta ecuación es válida únicamente para el intervalo de tamaño genómico 0.81 ADNu 4.8 pg. IV. Estimación de contenido de ADN cromosómico en abulón rojo Haliotis rufescens IV.1 Análisis de imágenes en contenidos de ADN cromosómicos La captura de imágenes fue realizada mediante la programación en QWIN descrita anteriormente pero modificado para capturar un imagen digital de 2088 X 1550 píxeles y con un tiempo de exposición de CCD de 209 milisegundos. El procedimiento de análisis de imágenes fue llevado a cabo por tres algoritmos desarrollados en MATLAB. El primer

8



8.596ˆ2.3337ˆ xy 2



ˆ

ˆIDuADNu 3




En referencia a la aplicación del modelo li-neal (ecuación 2) para calcular tamaño genómi-

co en muestras problema, se obtuvo la siguiente ecuación:

(3)

Donde ADNu = valor de tamaño genómico des-conocido y IDu = valor medio de id obtenido para la muestra Los valores y representan los valores de pendiente de la recta e intercep-to, los cuales a su vez integran la variación del modelo lineal al incrementar el número de tipos celulares medidos De esta forma, la ecuación de la recta podría cambiar a medida que se aumen-ta el número de puntos, ajustándose cada vez más al valor real de intercepto y pendiente Sin embargo, al calcular los intervalos de confianza se puede considerar que la ecuación tendrá un comportamiento lineal dentro de los límites de la esperanza matemática (E) calculada en la ta-bla v Adicionalmente, esta ecuación es válida únicamente para el intervalo de tamaño genómi-co 0.81 ≤ ADNu ≤ 4.8 pg.

IV. Estimación de contenido de ADN cromosómico en abulón rojo Haliotis rufescens

Iv.1 Análisis de imágenes en contenidos de ADN cromosómicos

La captura de imágenes fue realizada median-te la programación en QWIN descrita anterior-mente pero modificado para capturar un imagen digital de 2088 x 1550 píxeles y con un tiempo de exposición de CCd de 209 milisegundos El procedimiento de análisis de imágenes fue lle-vado a cabo por tres algoritmos desarrollados en MATLAB El primer algoritmo fue construido con el propósito de obtener sub-imágenes de 51 x 51 píxeles a partir de las imágenes inicial-mente capturadas de 2088 x 1550 píxeles Cada sub-imagen de 51 x 51 píxeles contiene un solo cromosoma metafásico, el cual fue capturado se-cuencialmente durante un periodo de desvane-cimiento fluorescente La identificación del tipo cromosómico contenido en la sub-imagen fue realizada según el cariotipo de H. rufescens El segundo algoritmo fue usado para generar una máscara binaria (valores pixélicos 0 y 1) sobre el

42

Figura 15

Figura 15. Estimación de la varianza de la integral de desva-necimiento (ID) en espermatozoides de tres especies de abu-lones. EZR, abulón rojo. EZAZ, abulón azul. EZAM, abulón amarillo.

43

Figura 16

Figura 16. Modelo lineal entre tamaño genómico e integral de desvanecimiento. Espermatozoides: EZT, de tilapia; EZR, de abulón rojo; EZAZ, de abulón azul; EZAM, de abulón ama-rillo. Hemocitos: HemAZ, de abulón rojo; HemR, de abulón rojo; HemAM, de abulón amarillo. Eritrocitos: ERT, de tilapia; ERTr, de trucha arco iris.

8



8.596ˆ2.3337ˆ xy 2



ˆ

ÎDuADNu 3



8



8.596ˆ2.3337ˆ xy 2



ˆ

ÎDuADNu 3



8



8.596ˆ2.3337ˆ xy 2



ˆ

ÎDuADNu 3




contorno del cromosoma El propósito de esta máscara fue filtrar las intensidades pixélicas del fondo de la imagen mediante la multiplicación entre la imagen fluorescente y la máscara bina-ria De esta forma, fue posible obtener la mayor cantidad de información sólo del adn cromo-sómico El tercer algoritmo fue generado para estimar los valores de id para cada tipo cromo-sómico (Gallardo-Escárate et al., 2005c)

Iv.2 Análisis estadístico

Para obtener las variaciones del contenido de adn de cada par homólogo, se estimó el por-centaje de variación de adn cromosómico y su contribución a la variación total del tamaño genómico Estos cálculos fueron realizados me-diante un anova de una vía y una prueba a posteriori Tukey Los supuestos de anova, dis-tribución normal y homogeneidad de varianza fueron comprobados usando las pruebas de Kol-mogorov-Smirnov y de Bartlett, respectivamen-te Los análisis estadísticos fueron realizados mediante el paquete estadístico STATISTICA® 6 1 (Copyright® StatSoft, Inc 1998-2002)

Iv.3 Contenido de ADN cromosómico en abulón rojo del Pacífico Haliotis rufescens

Con la finalidad de determinar la intensidad de fluorescencia en cromosomas teñidos con dapi se obtuvo la información de brillo en imágenes de 8 bits, esto permitió convertir las imágenes digita-les en pseudocolor para visualizar y cuantificar la intensidad de fluorescencia mediante 256 niveles de brillo (figura 17)

En el presente estudio se utilizó el método de desvanecimiento fluorescente con la finalidad de estimar contenido de adn cromosómico en abulón rojo H. rufescens. El procedimiento para obtener la medición de fluorescencia a partir de adn cromosómico se muestra en la figura 18 El primer paso fue identificar y clasificar según el cariotipo de H. rufescens, cada cromosoma cap-turado a través de mediciones digitales (figura 18a) Las imágenes fluorescentes fueron trans-formadas a pseudocolor en 256 niveles de brillo (figura 18b) Con la finalidad de discriminar el trasfondo de la imagen, se generó una máscara binaria capaz de detectar el borde cromosómi-co (figura 18c) Finalmente, la aplicación de la máscara sobre la imagen en pseudocolor (mul-tiplicación entre (b) y (c)) permitió discriminar la información de brillo proveniente del adn cromosómico (figura 18d)

44

Figura 17

Figura 17. a) Imagen original de placa metafásica teñida con DAPI. b) Imagen digital convertida en pseudocolor o en 256 niveles de brillo.

45

Figura 18

Figura 18. Procedimiento de análisis de ADN cromosómico fluorescente. a) Mediciones cromosómicas, b) Imagen en pseudocolor, c) Máscara binaria para detección de borde, d) Región de ADN cromosómico de interés obtenido por multi-plicación entre (b) y (c).

Para demostrar el desvanecimiento fluo-rescente en un solo cromosoma, la figura 19 muestra una secuencia de imágenes desde la ex-posición inicial a luz ultravioleta hasta la pérdi-da total de fluorescencia Del mismo modo, se


46

Figura 19

Figura 19. Secuencia de desvanecimiento fluorescente en cro-mosoma 16 de H. rufescens.

47

Figura 20

Figura 20. Curva desvanecimiento fluorescente en cromosoma 16 de H. rufescens.

Tabla vIContenido de ADN en cromosomas de Haliotis rufescens y su conversión a Mega pares de base

(Mpb)

Cromosoma Contenido medio de ADN (pg)

Desviación estándar (pg)

Mpb*

1 0 1106 0 0045 108,2012 0 1051 0 0098 102,7523 0 1035 0 0053 101,1754 0 1010 0 0093 98,8245 0 0999 0 0077 97,6556 0 0976 0 0072 95,4907 0 0997 0 0089 97,4748 0 0982 0 0099 96,0879 0 0994 0 0063 97,24310 0 1006 0 0094 98,39311 0 0975 0 0104 95,31912 0 0979 0 0085 95,75713 0 0969 0 0075 94,78414 0 0958 0 0087 93,69015 0 0934 0 0090 91,35516 0 0939 0 0076 91,82517 0 0917 0 0077 89,64018 0 0890 0 0060 87,056

Total 1 7717 0 0050 1,732,720

* Número de pares de base = masa en pg x 0 978x109 (Dolezel et al., 2003)

obtuvo la curva de desvanecimiento mediante la aplicación de la ecuación 1 La figura 20 muestra la curva de desvanecimiento del cromosoma 16 de H. rufescens

El análisis de varianza realizado para detec-tar los efectos de variabilidad del contenido de adn en cromosomas de Haliotis rufescens, mos-tró diferencias significativas entre los tipos cro-mosómicos (p<0 001) No obstante, un análisis a posteriori mediante una prueba de Tukey, mostró diferencias estadísticas sólo entre los cromoso-mas extremos, específicamente entre los cro-mosomas 1-4 y cromosomas 13-18 (p<0 05) El contenido medio de adn mostró un incremento significativo desde el cromosoma 18 al par cro-mosómico 1 (p<0 001) (figura 21) La mayor va-riabilidad de contenidos de adn fue observada entre los cromosomas 2, 4, 8, 11 y 15

La correlación entre el contenido de adn cromosómico y el tamaño cromosómico fue pro-bada mediante la medición tanto de longitud como el área cromosómica El valor de correla-ción encontrado fue estadísticamente significati-vo (p<0 001) para la relación adn/longitud (r = 0 8783) (figura 22) y adn/área (r = 0 9066) (figura 23) Sin embargo, este aumento en el va-

Mediante la aplicación del modelo lineal obtenido en la ecuación 3 se determinó el con-tenido de adn para cada tipo cromosómico de H. rufescens (tabla vI) Los valores mayores de contenido de adn cromosómico fueron encon-trados en el par cromosómico 1, mientras que la cantidad menor de ADN fue encontrada en el par cromosómico 18


lor de correlación no fue estadísticamente signi-ficativo (p>0 05)

Con el propósito de determinar el contenido de pares de base de cada cromosoma, se asumió que el número de pares de base (pb) es equiva-lente a la masa en picogramos (pg) x 0 978x109

pb (Dolezel et al., 2003) Adicionalmente, la can-tidad total de contenido de adn cromosómico obtenido por la suma de todos los valores cro-mosómicos fue equivalente al tamaño genómico de H. rufescens, 1 7717 ± 0 0050 pg o 1,732,724 convertidos en Mega pares de bases (Mpb)

48

Figura 21

Figura 21. Contenido medio de ADN en cromosomas de H. rufescens (n=18). Las barras representan dos desviaciones estándar.

49

Figura 22

Figura 22. Correlación entre contenido de ADN cromosó-mico y longitud cromosómica en H. rufescens. Los números representan el par cromosómico según el cariotipo. Líneas discontinuas representan el error estándar del modelo.

50

Figura 23

Figura 23. Correlación entre contenido de ADN cromosómico y área cromosómica en H. rufescens. Los números represen-tan el par cromosómico según el cariotipo. Líneas disconti-nuas representan el error estándar del modelo.

V. Estimación de tamaño genómico en dos poblaciones de Argopecten purpuratus (Bivalvia: Pectinidae)

v.1 Material biológico

Treinta ejemplares de A. purpuratus provenien-tes de dos poblaciones fueron utilizados para estimar su tamaño genómico promedio Quince ejemplares fueron recolectados desde una po-blación silvestre en la localidad de Arica (18° 28’ Sur) y quince fueron recolectadas desde una po-blación de cultivo en Bahía Tongoy (30° 15’ Sur), ambas áreas están localizadas al norte de Chile Datos de longitud (lc), ancho (anc) y altura (alc) de concha fueron obtenidos para cada ejemplar Asimismo se calculó la proporción de anc/lc y alc/lc (Gallardo-Escárate et al., 2005d)

v.1.1 Obtención de hemocitos y tinción fluorescente de ADN

El tamaño genómico de A. purpuratus fue esti-mado a través de núcleos de hemocitos en ejem-plares adultos (8-9 cm de altura de concha) La hemolinfa fue extraída desde el músculo aductor de animales vivos usando una jeringa de insuli-na Posteriormente, la hemolinfa fue fijada sobre portaobjetos con solución Carnoy (metanol: áci-do acético, 3:1) a 4 °C


v.1.2 Análisis estadístico

En referencia a las longitudes de concha y a las proporciones anc/lc and alc/lc, éstas fueron comparadas entre las poblaciones mediante una prueba t Para obtener la variación de tamaño ge-nómico tanto a nivel intraespecífico como a nivel interpoblacional, se realizaron distintos análisis estadísticos para estimar el porcentaje de varia-ción a cada nivel muestreal (individuo y pobla-ciones) y su contribución a la variación total del tamaño genómico El coeficiente de variación se estimó desde la dispersión de los valores de con-tenido de adn individual (desviación estándar * 100) Asimismo se realizaron análisis de varianza anidado de una y dos vías mediante la utilización del paquete estadístico STATISTICA® 6 1

v.1.3 Mediciones morfológicas

La longitud media de concha fue registrada en 7 69 ± 1 290 y 6 97 ±0 481 cm para las poblacio-nes de Tongoy y Arica, respectivamente, mientras que la razones alc/lc fue 1 063 ± 0 027 y 1 064 ± 0 021, y las razones anc/lc fueron 0 339 ±0 019 y 0 443 ± 0 023, respectivamente El análisis es-tadístico no mostró diferencias significativas en-tre las medias de longitud de concha (t(17)=2 03, p=0 058) o entre las medias de la razones anc/lc (t(28)= -0 12, p=0 90) para ambas poblacio-nes No obstante, la media de las razones alc/lc de la población de Tongoy fue estadísticamente menor que la población de Arica (t(28)= -13 50, p<0 0001)

v.1.4 Análisis de tamaño genómico mediante desvanecimiento fluorescente

La población de Arica mostró un mínimo de ta-maño genómico o valor-C de 0 932 pg y un máxi-mo de 1 179 pg de adn El número total de núcleos medidos fue de 5,628 La variación indi-vidual (desviación estándar) fue menor que 0 32 pg de adn en todos los organismos muestrea-dos La población de Tongoy en cambio, mostró un tamaño genómico mínimo de 1 044 pg de adn y un máximo valor de 1 285 pg de adn en 7,538 núcleos medidos La variación individual fue entre 0 105 pg y 0 397 pg (tabla vII)

Tabla vIIMedición de tamaños genómicos en dos

poblaciones de A. purpuratus mediante análisis de imágenes fluorescentes (n=15 individuos)

Ejemplares de Arica

Número de núcleos

Valor-C Desviación estándar

1 420 1 106 0 1772 168 1 023 0 0943 387 1 053 0 3194 116 1 063 0 1305 194 1 120 0 1566 601 1 088 0 0937 930 1 103 0 1488 595 1 043 0 2499 370 0 932 0 12110 457 1 094 0 15011 257 1 016 0 31912 379 0 994 0 25913 333 1 078 0 14814 223 1 179 0 31415 188 1 089 0 172

Total 5,628 1.057* 0.057*

Ejemplares de Tongoy

Número de núcleos

Valor-C Desviación estándar

1 463 1 164 0 2842 446 1 084 0 1813 135 1 082 0 1054 427 1 201 0 3895 654 1 044 0 2436 485 1 197 0 1737 942 1 261 0 3008 396 1 106 0 1719 555 1 231 0 28510 450 1 198 0 26711 486 1 070 0 17212 502 1 285 0 39713 662 1 093 0 21014 515 1 141 0 21615 420 1 106 0 177

Total 7,538 1.139* 0.066*

*valores medio

La variación ínter-individuos (n=15) fue me-nor a 6% para ambas poblaciones (coeficiente de variación) Mientras que la variación del tamaño genómico mostró una estabilidad tanto en me-dia como en varianza cercana a los 1000 núcleos medidos (figuras 24 y 25) En este contexto, es posible obtener un valor-C representativo en un tamaño muestreal de 150 núcleos medidos por organismo


52

FIGURA 25

Figura 25. variación de valor-C en población Tongoy de A. purpuratus. El valor-C fue calculado por aproximación de desvanecimiento fluorescente en núcleos de hemocitos.

Figura 24. variación de valor-C en población Arica de A. purpuratus. El valor-C fue calculado por aproximación de desvanecimiento fluorescente en núcleos de hemocitos.

51

Figura 24

La población de Arica mostró un tamaño ge-nómico de 1 057 ± 0 057 pg de adn Los inter-valos de confianza calculados a 95% fueron 1 026 ≤ valor-C ≤ 1.089 pg de adn La población de Tongoy mostró un valor-C de 1 139 ± 0 066 pg

de adn Los intervalos de confianza calculados fueron 1.102 ≤ valor-C ≤ 1.175 pg de adn

El análisis de varianza realizado para detec-tar diferencias a nivel individual y poblacional del tamaño genómico de A. purpuratus, mostró que existen diferencias estadísticas entre ambas po-


blaciones (p=0 0011) De este modo, el tamaño genómico de la población de Tongoy fue significa-tivamente mayor comparado con organismos de la población de Arica, 1 139 ± 0 066 pg y 1 057 ± 0 057 pg, respectivamente

La contribución de los diferentes niveles muestreales (individuos, población y error) al total de la varianza del tamaño genómico fue analizado mediante una prueba anova de dos vías anidado (tabla vIII) La subdivisión de los porcentajes de varianza atribuidos a cada ni-vel mostró que la varianza del error (variación intra-individual) representa <1% del total De este modo, la mayor parte de la variación en el tamaño genómico ocurre entre las poblacio-nes Adicionalmente, el análisis de la variación ínter-individual mostró que existen diferencias estadísticamente significativas cercanas a 6% de contenido de adn nuclear para ambas pobla-ciones

versiones pericéntricas y las translocaciones de brazos cromosómicos, combinados con cambios como borrados y duplicaciones en tándem de se-cuencias de adn de mediana y alta repetición, así como las secuencias dispersas transponibles, son reordenamientos que han sido claves en la especiación de varios taxa de animales (Fontde-vila, 1987) Estos reordenamientos, llevarían a variaciones en la morfología cromosómica ba-sados en cambios de la longitud relativa de los brazos cromosómicos involucrados, así como a modificaciones en el tamaño absoluto de los cro-mosomas (Bianchi et al., 1988)

La distribución simpátrica de Haliotis rufes-cens, H. fulgens y H. corrugata permite suponer la existencia de mecanismos que impiden, al menos parcialmente, el flujo génico entre estas especies Los mecanismos de aislamiento repro-ductivo pueden ser clasificados en: pre-copula-torios (aislamiento estacional-hábitat, etológi-co y mecánico) y pos-copulatorios (mortalidad gamética, mortalidad cigótica, inviabilidad del híbrido y esterilidad híbrida) (Maynard, 1989) Sin embargo, estudios en poblaciones naturales de abulones han descrito la presencia de híbri-dos en seis especies de abulones en la costa de California (Owen et al., 1971) La evidencia de hibridación natural en poblaciones de abulones fue aportada por características morfológicas intermedias y reacciones inmunológicas Pos-teriormente, Leighton y Lewis (1982) llevaron a cabo una serie de cruzas experimentales con cuatro especies de abulones Cruzas entre hem-bras de H. rufescens y machos de H. corrugata, H. fulgens y H. sorenseni, demostraron que es posible obtener entre 30% y 60% de desarrollo embrionario en fertilizaciones efectuadas dentro de los primeros 30 minutos posdesove En los cruces realizados entre hembras de H. rufescens y machos de H. fulgens se observan que las F1 y F2 son fértiles Las mejores tasas de crecimiento fueron encontradas en híbridos de H. rufescens x H. sorenseni y H. rufescens x H. fulgens, respecti-vamente La evidencia aportada por el registro de híbridos naturales (Owen et al., 1971), así como las cruzas experimentales, demuestra que existe una estrecha relación filogenética entre las especies de haliótidos de la costa de California y Baja California Asimismo, las diferencias en los porcentajes de desarrollo embrionario y supervi-

Tabla vIIIPrueba ANOVA para tamaños genómicos de dos

poblaciones de A. purpuratus

Fuente de variación SC GL MC F p

Población 15 87 1 15 87 277 3 <0 001Individuo (dentro de población)

59 82 28 2 12 37 0 <0 001

Error 739 67 12926 0 06

vI. Discusión

vI.1 Relaciones cromosómicas entre Haliotis rufescens, H. fulgens y H. corrugata

La concepción genético-poblacional de especie se entiende como un sistema biológico discreto e integrado de organismos reproductivamente aislados de otros sistemas de características si-milares (Maynard, 1989) Dentro de los factores que llevarían a la diferenciación de especies, la segregación espacial no constituye un requisito ineludible para que surja el aislamiento repro-ductivo Desde un punto de vista genético, los reordenamientos cromosómicos, entre otros factores, constituyen importantes mecanismos involucrados en el aislamiento reproductivo poscigótico, por su incidencia en la meiosis de los eventuales híbridos (Maynard, 1989) Las in-


vencia larvaria encontradas en los experimentos de cruzas (Leighton y Lewis, 1982), se pueden explicar en términos de inestabilidad cromosó-mica del híbrido, sin embargo, dichos estudios no han sido realizados hasta el momento

Las primeras evidencias de las relaciones filo-genéticas en abulones de California fueron apor-tadas mediante comparación de hemocianinas por Meyer (1967) El grado de interacción inmu-nológica mostró que H. rufescens, H. sorenseni, H. kamtschatkana assimilis estarían cercanamen-te relacionadas, mientras que H. corrugata, H. fulgens, H. walallensis aparecen moderadamente distantes Adicionalmente, el análisis mostró que H. cracherodii sería una especie con una mayor diferenciación genética Posteriormente, los aná-lisis de secuenciación de la lisina llevados a cabo por Lee y vacquier (1995) y Swanson y vacquier (1998) mostraron que H. cracherodii se encuen-tra más relacionado con H. corrugata y ambos a su vez con los abulones japoneses H. gigantea y H. discus hannai Adicionalmente, estos estudios dejaron a una distancia genética mayor a H. ful-gens en comparación con las otras especies de abulones californianos Recientemente, estudios realizados por Coleman y vacquier (2002) en se-cuenciación de its (Internal Transcribed Spacer) de genes ribosomales de la subunidad 5 8S, mos-traron que esta última a pesar de ser altamente conservada dentro del género Haliotis y no apor-ta información relevante para la reconstrucción filogenética, los its1 e its2 proveen informa-ción de longitud y composición de base similar a la encontrada en la mayoría de los eucariontes (Badwin, 1992) Los alineamientos de las se-cuencias its en todas las especies de abulones de California confirma la presencia de dos prin-cipales agrupamientos El primero conformado por H. sorenseni, H. walallensis y H. rufescens y el segundo conformado por H. corrugata y en es-trecha relación con los abulones japoneses como H. discus hannai Las especies de H. fulgens y H. cracherodii aparecen filogenéticamente más dis-tantes con respecto a los agrupamientos anterio-res En este sentido, la evidencia aportada por el presente estudio en cuanto a la comparación cro-mosómica en tres especies de abulones de Baja California, es congruente con la evidencia apor-tada por los estudios de secuenciación de genes, debido a que muestra que H. rufescens y H. co-

rrugata son entre sí más similares que cualquie-ra de ellas con respecto a H. fulgens Del mismo modo, los análisis estadísticos muestran que de los 18 pares cromosómicos que posee cada uno de los cariotipos promedios, 8 pares son iguales en las tres especies estudiadas, 7 son propios de H. fulgens, 3 de H. rufescens, y 2 de H. corrugata De acuerdo a Thiriot-Quiévreux (1994) dentro de la evolución cromosómica de ciertos organis-mos acuáticos es frecuente encontrar un incre-mento en tipos cromosómicos submetacéntricos y telocéntricos debido principalmente a procesos de fisión cromosómica En este sentido, el bajo número de cromosomas propios de H. corrugata, así como un mayor número de pares metacén-tricos (10 pares) con respecto a las otras espe-cies estudiadas demuestra una condición basal o filogenéticamente muy cercana a los abulones japoneses como H. discus hannai Adicional-mente, dada la evidencia cromosómica descrita es posible ubicar a H. rufescens en una posición evolutivamente intermedia, mientras que la ma-yor cantidad de cromosomas propios de H. ful-gens demuestra que esta especie se encuentra filogenéticamente más alejada y probablemente con cambios cromosómicos más recientes evolu-tivamente El análisis de similitud cromosómica o patrón de agrupamiento demuestra que H. ru-fescens comparte más pares cromosómicos con H. corrugata (14 pares) con lo cual quedan uni-dos dentro de un grupo, mientras que el menor número de cromosomas compartidos H. fulgens (menos de 50%) deja fuera del agrupamiento al abulón azul

En referencia a la distribución biogeográfi-ca de la familia Haliotidae, se han propuesto tres hipótesis; modelos del borde Pacífico, Indo-Pací-fico y Tethys (Geiger y Groves, 1999) El modelo del borde Pacifico, sustenta que el origen de la familia estaría en la zona del Noreste de Aus-tralia En este sentido, el punto de radiación de la familia estaría relacionado con procesos de dispersión larval provenientes desde Japón Por otra parte, el modelo Indo-Pacífico describe a esta zona como centro de radiación, debido prin-cipalmente a la alta correlación existente entre la diversidad actual de una especie y de su origen biogeográfico El tercer modelo denominado Te-thys sustenta la radiación de la familia desde el Mediterráneo (mar de Tethys) hasta el Pacifico


nororiental Según este modelo, la radiación pue-de ser explicada con base en el número cromo-sómico de las especies de abulones actualmente descritas, el cual se incrementa desde el Medite-rráneo, siendo representativo H. tuberculata (2n = 28) (Arai y Wilkins, 1986), moviéndose hacia la región Indo-Pacífico (2n =32) (Jarayabhand et al., 1998) y finalmente llegando hasta la región del Pacifico Norte (2n=36) (Nakamura, 1986) No obstante, los antecedentes cariotípicos de esta última región han sido aportados principalmente por especies distribuidas en la costa del Pacífico occidental, mientras que el abulón negro, Halio-tis cracherodii (2n=36) (Minkler, 1977), era la única especie reportada para la costa del Pacífico oriental de Baja California En este contexto, la información cariotípica descrita para H. rufescens (8M+9SM+1ST), H. fulgens (8M+8SM+2ST) y H. corrugata (10M+7SM+1ST), aporta nueva información para haliótidos distribuidos sobre la costa de California El número cromosómico diploide descrito en las tres especies estudiadas (2n=36), corrobora una condición conservada entre las especies de abulones del Pacífico Nor-te Con lo cual el presente estudio aporta nuevos antecedentes para sustentar el modelo de Tethys en cuanto a la distribución biogeográfica de la familia Haliotidae.

vI.2 Desarrollo de un método de cuantificación de contenido de ADN genómico mediante análisis de imágenes fluorescente

El tamaño genómico es conocido por variar con-siderablemente entre especies, no obstante es relativamente constante entre individuos de una misma especie (Hancock, 2002) De este modo, el grado de variabilidad entre las especies ha sido descrito como más de 200,000 veces entre los eucariontes (Gregory, 2001b) Sin embargo, la mayor o menor cantidad de adn no guarda ninguna relación con la complejidad del organis-mo Diversas hipótesis han sido propuestas para explicar esta variación de tamaño genómico La teoría del gen egoísta sugiere que la acumulación de adn genómico a través del tiempo evolutivo puede ser resultado del proceso de replicación celular, de esta forma el aumento de tamaño ge-nómico cesa cuando éste comienza a comprome-ter la viabilidad celular (Orgel y Crick, 1980) De

acuerdo a lo anterior, tamaños celulares mayo-res pueden tolerar mayor cantidad de adn y de esta forma influenciar en el grado de adecuación biológica de una especie a través de un efecto nu-cleoesquelético (Cavalier-Smith, 1978) De esta forma, el tamaño genómico puede ser conside-rado como un carácter selectivo debido a que un aumento en el tamaño celular necesita asimismo un incremento nuclear para preservar el balance metabólico (Cavalier-Smith y Beaton, 1999)

Avances recientes en computación y la tec-nología de análisis de imágenes han permitido obtener estimaciones rápidas y confiables de la cantidad de adn nuclear que poseen diversas especies (Hardie et al., 2002) En este sentido, la densitometría mediante análisis de imágenes ha sido ampliamente aceptada como un méto-do preciso de cuantificación de adn genómico (Bertino et al., 1994) y de esta forma utilizado en la estimación de tamaño genómico tanto en plantas como en animales (Hardie et al., 2002) No obstante, la desventaja de esta metodología radica básicamente en dos aspectos; el protoco-lo de tinción o específicamente de reacción de Feulgen y el proceso de cuantificación La reac-ción de Feulgen se ha utilizado principalmente en densitometría de adn debido a que la colo-ración obtenida en presencia de adn obedece a una serie de reacciones químicas, con lo cual la intensidad del color es directamente proporcio-nal a la cantidad de adn contenido en un nú-cleo Sin embargo, para que ocurra la reacción de Feulgen es necesario producir una hidrólisis del contenido nuclear y de esta forma dejar en contacto el reactivo de Schiff (principal compo-nente de la reacción) con el adn genómico Las condiciones de la hidrólisis han sido realizadas tanto en un medio de ácido débil (HCl 1N a 60 °C) o en un medio ácido fuerte (HCl 5 N a 20-30 °C) De esto, se puede considerar que las condi-ciones de reacción son altamente variables entre protocolos y tipos celulares estudiados, por lo cual es necesario una estandarización rigurosa tanto de los reactivos, fijación de muestra y tiem-pos de hidrólisis (Schulte, 1991) En referencia al proceso de cuantificación, la densitometría de Feulgen requiere cuantificar la absorbancia de la luz sobre los núcleos teñidos dado que ésta es di-rectamente proporcional a su concentración Sin embargo, la medición de absorbancia es relati-


vamente compleja, por lo cual debe ser estima-da indirectamente a través de la transmitancia En este sentido, la transmitancia representa la luz incidente que no es alterada por algún me-dio capaz de absorberla La problemática de esta aproximación es que la captura digital desprecia los fenómenos intrínsecos de la luz como son reflexión y refracción De este modo, la luz que pasa a través de una muestra siempre será afec-tada por partículas, suciedad, edad de la mues-tra, tipos celulares, etcétera

En el campo de la microscopía de fluorescen-cia, el retardo en el desvanecimiento de la fluores-cencia desde imágenes iniciales de alta intensidad a imágenes de mayor ruido de fondo producto de la pérdida de fluorescencia, es uno de los factores más importantes en la obtención de calidad foto-gráfica (Ono et al., 2001) Dentro de la variedad de fluorocromos existentes específicos para adn, el dapi (4-6-diamidino-2-phenylindole) es el más ampliamente utilizado debido a su intensidad de fluorescencia Sin embargo, la fluorescencia de dapi se pierde rápidamente al ser expuesto a luz ultravioleta y especialmente bajo condiciones óptimas de observación como longitud de onda de máxima excitación y lentes objetivos de alta apertura numérica (Johnson y Nogueira-Araujo, 1981) Por otro lado, el proceso fotoquímico bajo el cual la fluorescencia decrece no ha sido expli-cado en su totalidad Existen algunas teorías que sugieren procesos oxidativos y de desnaturaliza-ción de proteínas asociadas a adn (Hirschfeld, 1979; Johnson et al., 1982) Adicionalmente, con la finalidad de retardar el proceso de desvane-cimiento se han propuesto diversos métodos en microscopía (Ono et al., 2001), no obstante todos ellos se basan en tratar de remover o disminuir la difusión de oxígeno de la muestra teñida con algún fluorocromo La idea es tratar de disminuir el proceso oxidativo del fluorocromo y de esta for-ma retardar la pérdida de fluorescencia Debido a esto, actualmente todas las observaciones fluores-centes en microscopía utilizan medios de montaje capaces de aumentar la viscosidad de la muestra y así retardar la difusión de oxígeno

De acuerdo con los resultados aquí obteni-dos, se encontró evidencia que el desvanecimien-to fluorescente en núcleos teñidos con dapi es función del tiempo de exposición a luz ultraviole-ta Mediante procedimientos de análisis de imá-

genes fue posible estimar el área bajo la curva de desvanecimiento y de esta forma establecer una unidad de medida (integral de desvanecimiento, id) de la pérdida de fluorescencia en núcleos teñidos con dapi Adicionalmente, mediante la estimación de id en varios tipos nucleares, se observó que dicho proceso es característico de una especie en particular o tipo celular específi-co En este sentido, el presente estudio demos-tró mediante la comparación de id provenientes tanto de espermatozoides como de eritrocitos de tilapia Mozambica, que el comportamiento del desvanecimiento fluorescente guarda una estre-cha relación con las cantidades de adn nuclear haploide y diploide, respectivamente Ahora bien, si los valores de id son característicos de una especie o tipo nuclear específico, su relación con diferentes tamaños nucleares puede ser ajus-tada a un modelo matemático En este contexto, el presente estudio determinó que existe una relación lineal entre el tamaño genómico y el valor calculado de id De este modo, dado que el valor de id medido en un tipo celular especí-fico es directamente proporcional con respecto al tamaño genómico, es posible entonces estimar tamaños genómicos desconocidos mediante la aplicación de la ecuación lineal propuesta en el presente trabajo

vI.3 Contenido de ADN cromosómico en abulón rojo Haliotis rufescens

Por varias décadas, los cromosomas han sido analizados mediante técnicas convencionales ca-riológicas, las cuales dependen de la caracteri-zación de patrones de bandeo a lo largo de cada cromosoma en particular La mayor desventaja de los patrones de bandeo es la limitada reso-lución en algunas especies (Langer et al., 2004) Alternativamente, se han aplicado análisis cro-mosómicos computarizados principalmente en cromosomas de mamíferos, con lo cual actual-mente existen una variedad de paquetes com-putacionales capaces de agilizar los análisis ci-togenéticos clínicos en humanos (Weierich et al., 2003) En plantas, sistemas analizadores de imágenes cromosómicas, han permitido aplicar procedimientos de identificación y clasificación cromosómica en una variedad de estudios de


citogenética vegetal (Fukui et al., 1998; Kato y Fukui, 1998; Lee et al., 2004)

Alternativamente, la estimación de conteni-dos de adn cromosómico se ha utilizado como una vía de identificación y mapeo cromosómico (Dolezel et al., 2004) Sin embargo, el princi-pal método aplicado para estimar contenido de adn cromosómico ha sido la citometría de flu-jo Dicha técnica emplea cromosomas aislados en una suspensión con presencia de uno o dos fluorocromos Mediante la incidencia de un lá-ser sobre los cromosomas es posible obtener un registro de la cantidad de adn a través de la cuantificación de la fluorescencia La desventaja de este método es que requiere un gran número de cromosomas en suspensión para minimizar las variaciones debidas a patrones de condensa-ción (Langlois et al., 1982)

Los estudios citogenéticos en invertebrados y en especial en moluscos son particularmente problemáticos debido al pequeño tamaño cro-mosómico Adicionalmente, la aplicación de ci-tometría de flujo en cromosomas de moluscos se ve dificultada por la actual imposibilidad de ob-tener líneas celulares in vitro (Rinkevich, 1999). En este contexto, el presente estudio representa un método alternativo para estimar contenido de adn cromosómico en moluscos median-te análisis de imágenes fluorescentes Nuestros resultados mostraron una correlación positiva (p<0 001) entre el contenido de adn y los res-pectivos tamaños cromosómicos de H. rufescens, de este modo los valores de correlación estima-dos fueron superiores a 87% Las variaciones en-contradas entre el tamaño cromosómico y la can-tidad de adn pueden ser debidas a variaciones en los patrones de condensación cromosómica En este sentido, según Zhang et al. (1999) es po-sible encontrar en moluscos una variación mor-fológica de los cromosomas de alrededor de 9% entre diferentes placas metafásicas provenientes de distintas preparaciones y tejidos No obstante, a pesar de existir dicha variabilidad morfológica, la suma de contenidos individuales de adn cro-mosómico (1 7717 ± 0 0050 pg) muestra una es-trecha relación con el tamaño genómico descrito para H. rufescens (1 8 pg) (Hinigardner, 1974)

vI.4 Estimación de tamaño genómico en dos poblaciones de Argopecten purpuratus mediante análisis de imágenes fluorescentes

La estimación del tamaño genómico del bivalvo A. purpuratus fue planteada inicialmente como una aplicación directa del método propuesto de desvanecimiento fluorescente en una especie en la cual hasta el momento no existen anteceden-tes de su valor-C, a pesar que han sido descritas otras características citogenéticas como constitu-ción cariotípica y localización de NOR (Gajardo et al., 2002; von Brand-Skopnik e Ibarra-Hum-phries, 2002) Nuestros resultados mostraron diferencias estadísticamente significativas en dos poblaciones de A. purpuratus (p=0 0011) La población de Tongoy mostró un tamaño ge-nómico significativamente mayor con respecto a la población de Arica, con valores medios de 1 139±0 066 pg y 1 057±0 057 pg de adn res-pectivamente Según Dolezel et al. (2003), 1 pg es equivalente a 0 978 x 109 pb, de esta forma la diferencia entre ambas poblaciones fue de 8 019 x 107 pb Los valores encontrados de variación de tamaño genómico a nivel ínter-individual fue equivalente a 6% de contenido de adn genó-mica para ambas poblaciones En este contexto, Rodríguez-Juiz et al. (1996) describieron una variación significativa del contenido de adn nuclear entre individuos de la misma especie, así como también entre diferentes especies de bivalvos Dicho estudio mostró que un alto por-centaje de la variación del tamaño genómico fue localizada a nivel de especies (97%), mientras que a nivel de individuos de la misma especie la variación encontrada fue del 7% Estos da-tos y nuestros resultados (6%) sugieren que una fracción significante del genoma en moluscos es capaz de variar entre individuos de la misma es-pecie sin consecuencias fenotípicas o biológicas Adicionalmente el valor-C descrito en el pre-sente estudio para A. purpuratus fue encontrado muy cercano a A. irradians (valor-C = 1 2 pg) y dentro del intervalo descrito para otras especies de pectínidos

La explicación de la variación del tamaño genómico en las dos poblaciones estudiadas de A. purpuratus puede centrarse en diferentes as-pectos de la evolución del contenido de adn en eucariontes Estudios recientes en poblaciones


de Drosophila han descrito cambios en el tama-ño genómico producidos por la activación de elementos transponibles (ETs) y asociados con la incursión de los organismos en nuevos hábitats (viera et al., 2002) El principal cuestionamiento que emerge de este resultado es que el número de sitios de inserción de ETs sobre las zonas de eucromatina sólo contribuye con 5% a 9% de la variación total de tamaño genómico observada Esto sugiere que la variación del tamaño genó-mico puede ser causada por otros factores (Kid-well, 2002), así como también por la inserción de ETs en la eucromatina Un antecedente impor-tante es que las poblaciones utilizadas para esti-mar el tamaño genómico de A. purpuratus pro-vinieron tanto de una población silvestre (Arica) como de una población de cultivo (Tongoy) En este sentido es difícil atribuir que el aumento del tamaño genómico en la población de Tongoy sea debido a un proceso de domesticación Sin em-bargo, en las últimas tres décadas esta especie de bivalvo se han cultivado exhaustivamente en Ba-hía de Tongoy, Chile (Gajardo y Núñez, 1992) Probablemente, el manejo de la producción lar-val y el método de selección de semilla hayan originado un proceso selectivo hacia un genoti-po en particular, lo cual puede evidenciarse por el análisis morfológico realizado en los organis-mos utilizados para estimar el tamaño genómi-co Dicho análisis mostró diferencias estadísticas (p<0 0001) entre la morfología de la concha de ejemplares de Tongoy (más aplanados) y ejem-plares de Arica (menos aplanados) En referen-cia a estudios genéticos poblacionales en esta especie, desafortunadamente se han realizado pocos estudios utilizando marcadores de adn (von Brand-Skopnik e Ibarra-Humphries, 2002) Sin embargo, análisis cariotípicos en A. purpura-tus (Gajardo et al., 2002) mostraron evidencia de diferencias cromosómicas a nivel poblacional y particularmente en 7 pares cromosómicos de los 32 pares de la especie Dicho estudio, utilizó dos poblaciones de cultivo y una de origen silvestre

Referencias

Allen, T , H García, J Tucker (1999) “PCR in situ followed by microdissection allos whole chromosome painting probes to be from sin-

gle microdissected chromosomes” Mamma-lian Genome, 10: 628-631

Álvarez-Borrego Josué y M C Chávez-Sánchez (2001) “Detection of IHHN virus in shrimp tissue by digital color correlation” Aquacul-ture, 194: 1-9

Álvarez-Borrego, Josué, M-P Reyna R , G Cris-tóbal, J Pech-Pacheco (2002) “Invariant optical color correlation for recognition of vibrio cholerae 01” Optical Engineering, 41: 827-833

Amar, G (2003) “Comparación cariotípica de tres especies de Fissurelidos (Mollusca: Ar-chaeogastropoda)” Magíster en Ciencias del Mar Facultad de Ciencias del Mar, Dep Biología Marina, Coquimbo-Chile

Appels, R , R Morris, B Gill y C May (1998) Chromosome Biology Kluwer Academic Pu-blishers, Nueva York

Arai, K y N Wilkins (1986) “Chromosomes of Haliotis tuberculata L” Aquaculture, 58: 305-308

Badwin, B (1992) “Phylogenetic utility of the internal transcribed spacer of nuclear ribo-somal DNA in plants: an example from the Compositae” Molecular Phylogenetics and Evolution, 1: 3-16

Bennett, M e I Leitch (2001) Plant DNA C-va-lue database

Bertino, B , W Knape, M Pytlinska, K Strauss y J Hammou (1994) “A comparative study of DNA content as measured by flow cytome-try and image analysis in 1884 specimens” Analytica Cellular Pathology, 6: 377-394

Bianchi N , J López-Camelo, O Olivero y E Lopreto (1988) “An equation to determina-te the index of karyological conservantism among phylogenetically related species” Caryologia, 1: 9-15

Castro-Longoria E , Josué Álvarez-Borrego y J L Pech-Pacheco (2001) “Identification of species of calanoid copepods using a new in-variant correlation algorithm” Crustaceana, 74: 1029-1039

Castro-Longoria, E , Josué Álvarez-Borrego, A Rocha-Olivarez, S Gómez, v Kober (2003) “The power of a multidisciplinary approach: using morphological, molecular and digital methods in the study of harpacticoid cryptic species” Marine Ecology, 249: 249-297


Cavalier-Smith, T (1978) “Nuclear volume con-trol by nucleoskeletal DNA selection for cell volume and cell grow rate, and the solution of the DNA C-value paradox” Journal of Ce-llular Science, 34: 247-278

Cavalier-Smith, T y M Beaton (1999) “The ske-letal function of non-genetic nuclear DNA: new evidence from ancient cell chimeras” Genetica, 106: 3-13

Coleman, A y v vacquier (2002) “Exploring the Phylogenetic Utility of ITS Sequences for Animals: A Test Case for Abalone (Haliotis)” Journal of Molecular Evolution, 54: 246-257

Cui, J , x Ren y Q Yu (1991) “Nuclear DNA content variation in fishes” Cytologia, 56: 425-429

Devlin, R e Y Nagahama (2002) “Sex deter-mination and sex differentiation in fish: an overview of genetic, physiological, and en-vironmental influences” Aquaculture, 208: 191-364

Dolezel, J , J Bartos, H voglmayr y J Greilhu-ber (2003) “Nuclear DNA content and ge-nome size of trout and human” Cytometry, 51A: 127-128

Dolezel, J , M Kubalákavá, J Bartos y J Macas (2004) “Flow cytogenetics and plan genome mapping” Chromosome Research, 12: 77-91

Fájer-Ávila, E J y Josué Álvarez-Borrego (2002) “Invariant digital color correlation for the identification of worm parasites from bullse-ye pufferfish” SPIE, Applications of Digital Image Processing xxv: 4790

Fontdevila, A (1987) “Taxonomía y especiación” En: Espinosa, J , Labarta U (eds ) Genética en acuicultura CAICYT

Fukui, K , S Nakayama, N Ohmido, H Yoshiaki y M Yamabe (1998) “Quantitative karyoty-ping of three diploid Brassica species by ima-ging methods and localization of 45s rDNA loci on the identified chromosomes” Theor Appl Genet, 96: 325-330

Gallardo, C , Josué Álvarez-Borrego, M A del Río-Portilla, v Kober (2004) “Karyotype of the red abalone Haliotis rufescens (Ar-chaeogastropoda: Haliotidae), using image analysis” Journal of Shellfish Research, 23(1): 205-209, abril

Gallardo-Escárate, C , Josué Álvarez-Borrego, M A del Río-Portilla, I Cross, A Merlo y L

Rebordinos (2005a) “Fluorescence in situ hy-bridization of rDNA, telomeric (TTAGGG)n and (GATA)n repeats in the red abalone Haliotis rufescens (Archaeogastropoda: Ha-liotidae)” Hereditas, 142: 73-79

Gallardo-Escárate, C , Josué Álvarez-Borrego, M A del Río-Portilla, I Cross, A Merlo y L Rebordinos (2005b) “Karyotype analysis and chromosomal localization by FISH of ri-bosomal DNA, telomeric (TTAGGG)n and (GATA)n repeats in Haliotis fulgens and H corrugata (archeoGastropoda: Haliotidae)” Journal of Shellfish Research, 24(4): 1153-1159

Gallardo-Escárate, C , Josué Álvarez-Borrego, M A Bueno, M A del Río Portilla y E von Brand Skopnik (2005c) “Analysis of chromo-somal DNA contents in Pacific red abalone Haliotis rufescens (Archaeogastropoda: Ha-liotidae) by fluorescence image analysis”. Jo-urnal of Shellfish Research, 24(4): 1161-1168

Gallardo, C , Josué Álvarez-Borrego, Elisabeth von Brand Skopnik y M A del Río-Portilla (2005d) “Genome size estimation in two po-pulations of the northern scallop Argopec-ten purpuratus (Lamarck, 1879), using fluo-rescence image analysis” Journal of Shellfish Research, 24(1): 55-60

Gajardo, G y J Núñez (1992) “Seed production, the critical factor for mollusk farming in Chi-le” World Aquaculture, 24: 72-77

Gajardo, G , M Parraguez y N Colihueque (2002) “Karyotype analysis and chromosome banding of the Chilean-Peruvian scallop Ar-gopecten purpuratus (Lamarck, 1819)” Jo-urnal of Shellfish Research, 21: 585-590

Geiger, D y L Groves (1999) “Review of fossil abalone (Gastropoda: vestigastododa: Ha-liotidae) with comparison to recent species” Journal of Paleontology, 73: 872-885

Gersen, S y M Keagle (1999) The principles of clinical cytogenetics Humana press Inc, New Jersey

Gregory, R (2001a) “Coincidence, coevolution, or causation? DNA content, cell size, and the C-value enigma” Biological Reviews, 76: 65-101

Gregory, R (2001b) Animal genome size data-base


Gregory, R (2002) “Genome size and develop-mental complexity” Genetica, 115: 131-146

Gregory, R (2003) “Genome size estimates for two important freshwater molluscs, the ze-bra mussel (Dreissena polymorpha) and the schistosomiasis vector snail (Biomphalaria glabrata)” Genome, 46: 841-844

Hancock, J (2002) “Genome size and the accu-mulation of simple sequence repeats: impli-cations of new data from genome sequencing projects” Genetica, 115: 93-103

Hardie, D , R Gregory y P Hebert (2002) “From pixels to picograms: A beginners’ guide to ge-nome quantification by feulgen image analy-sis densitometry” Journal of Histochemistry & Cytochemistry, 50: 735-749

Hardie, D y P Hebert (2003) “The nucleotypic effects of cellular DNA content in cartila-ginous and ray-finned fishes” Genome, 46: 683-706

Haynes, J L (1988) “Principles of flow cytome-try” Cytometry Supp, 3: 7-17

Hinigardner, R (1974) “Cellular DNA content of the Mollusca” Comparative Biochemestry and Physiology, 47A: 447-460

Hirschfeld, T (1979) “Fluorescence background discrimination by prebleaching” Journal of Histochemistry and Cytochemistry, 27: 96-101

Ieyama, H y A Inaba (1974) “Chromosome numbers of ten species in four families of Pteriomorpha (Bivalvia) venus Jpn” Jour-nal Malacological, 33: 129-137

Inafuku, J , M Nabeyama, Y Kikuma, J Saitoh, S Kubota y S Kohno (2002) “Chromosomal location and nucleotide sequences of 5S ri-bosomal DNA of two cyprinid species (Os-teichthyes, Pisces)” Chromosome Research, 8: 193-199

Insua, A y C Thiriot-Quiévreux (1991) “The characterization of Ostrea denselamellosa (Mollusca, Bivalvia) chromosomes: Karyoty-pe, constitutive hetericromatin and nucleo-lus organizer regions” Aquaculture, 97: 317-325

Ishibashi, R , K Ookubo, M Aoki, M Utaki, A Komaru y K Kawamura (2003) “Androge-netic Reproduction in a Freshwater Diploid Clam Corbicula fluminea (Bivalvia: Corbicu-lidae)” Zoological Science, 20: 727-732

Jarayabhand, P , R Yom-La y A Popongviwat (1998) “Karyotypes of marine molluscs in the family Haliotidae found in Thailanad” Journal of Shellfish Research, 17: 761-764

Johnson, G , R Davidson, K McNamee, G Russell, D Goodwin y E Holborow (1982) “Fading of inmunofluorescence during mi-croscopy: a study of the phenomenon and its remedy” Journal of Immunological Methods, 55: 231-242

Johnson, G y G Nogueira-Araujo (1981) “A simple method of reducing the fading of im-munofluorescence during microscopy” Jour-nal of Immunological Methods, 43: 349-350

Kato, S y K Fukui (1998) “Condensation pat-tern (CP) analysis of plant chromosomes by an improved chromosome image analyzing system, CHIAS III” Chromosome Research, 6: 473-479

Kidwell, M (2002) “Transposable elements and the evolution of genome size in eukaryotes” Genetica, 115: 49-63

Ladrón de Guevara, B , F Winkler, F Rodríguez-Romero y C Palma-Rojas (1996) “Compara-tive karyology of four American oyster spe-cies” The Veliger, 39: 260-266

Langer, S , K Jurgen, I Jentsch y M Speicher (2004) “Multicolor chromosome painting in diagnostic and research applications” Chro-mosome Research, 12: 12-15

Langlois, G , L Yu, J Gray y A Carrano (1982) “Quantitative karyotyping of human chro-mosomes by dual beam flow cytometry” Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79: 7876-7880

Lee, J-H, Y Ma, T Wako, L C Li, K-Y Kim, S-W Park, S Uchiyama y K Fukui (2004) “Flow karyotypes and chromosomal DNA contents of genus Triticum species and rye (Secale ce-reale)” Chromosome Research, 12: 93-102

Lee, Y y v vacquier (1995) “Evolution and sys-tematics in Haliotidae (Mollusca: Gastro-poda): inferences from DNA sequences of sperm lysin” Marine Biology, 124

Leighton, D y C Lewis (1982) “Experimental hy-bridization in abalones” International Journal of Invertebrate Reproduction, 5: 273-282

Levan, A , K Fredga y A Sandberg (1964) “No-menclature of centromeric positions on chro-mosomes” Hereditas, 52: 201-220


Mandrioli, M , M Colomba y R vitturi (2000) “Chromosomal analysis of repeated DNAs in the rainbow wrasse Coris julis (Pisces, La-bridae)” Genetica, 108: 191-195

Marasek, A , R Hasterok, K Wiejacha y T Or-likowska (2004) “Determination by GISH and FISH of hybrid status in Lilium” Here-ditas, 140: 1-7

Martínez, J , J Beck, W Allsbrook y C Pantazis (1990) “Flow cytometric DNA analysis” Cli-nical Lab. Sc., 3: 180: 183

Martins, C , C Oliveira, A Wasko y J J Wright (2004) “Physical mapping of the Nile tilapia (Oreochromis niloticus) genome by fluores-cent in situ hybridization of repetitive DNAs to metaphase chromosomes—a review” Aquaculture, 231: 37-49

Maynard, J (1989) Evolutionary genetics Oxford, Nueva York

Meyer, R (1967) “Hemocyanins and the syste-matics of California Haliotis” Tesis docto-ral

Minkler, J (1977) “Chromosomes of the black abalone (Haliotis cracherodii)” Experientia, 33: 1143

Mirsky, A y H Ris (1951) “The desoxyribonu-cleic acid content of animal cells and its evo-lutionary significance” Journal of Genetics and Physiology, 34: 451-462

Morse, D , H Duncan, N Hooker y A Morse (1977) “Hydrogen peroxide induces spaw-ning in mollusks, with activation of prosta-glandin endoperoxide synthetase” Science, 196: 298-300

Nakamura, H (1986) “Chromosomes of Ar-chaeogastropoda (Mollusca: Prosobranchia), with some remarks on their citotaxonomy and phylogeny” Publication Seto Marine Bio-logy Laboratory, 31: 191-297

Nanda, I , U Hornung, M Kondo, M Schmid y M Schartl (2003) “Common Spontaneous Sex-Reversed xx males of the Medaka Oryzias latipes” Genetics, 163: 245-251

Netten, H (1997) “Automated image analysis of FISH--stained cell nuclei” Tesis doctoral, Delft

Ono, M , T Murakami, A Kudo, M Isshiki, H Sawada y A Segawa (2001) “Quantitative Comparison of Anti-Fading Mounting Me-dia for Confocal Laser Scanning Microsco-

py” Journal of Histochemistry and Cytoche-mistry, 49: 305-312

Orgel, L y F Crick (1980) “Selfish DNA: the ultimate parasite” Nature, 284: 604-607

Owen, B , J McLean y R Meyer (1971) “Hy-bridization in the Eastern Pacific abalones (Haliotis)” Bulletin of the Los Angeles County Museum of Natural History Science, 9: 1-37

Park, G , T Yong, K Im y E Chung (2000) “Kar-yotypes of three species of Corbicula (Bival-via: veneroida) in Korea” Journal of Shelfish Research, 19: 979-982

Pascoe, P , N Awadhesh y D Dixon (2004) “va-riation of karyotype composition and geno-me size in some muricid gastropods from the northern Hemisphere” Journal of Molluscan Studies, 70: 389-398

Pascoe, P y D Dixon (1994) “Structural chromo-somal polymorphism in the dog-whelk Nuce-lla lapillus (Mollusca: Neogastropoda)” Ma-rine Biology, 118: 247-253

Pascoe, P , S Patton, R Critcher y D Dixon (1996) “Robertsonian polymorphism in the marine gastropod, Nucella lapillus: advances in karyology using rDNA loci and NORs” Chromosoma, 104: 455-460

Patterson, C (1969) Chromosomes of molluscs Proceedings of symposium on Mollusca, Mari-ne Biology Association, India, pp 635-690

Pech-Pacheco, J L y Josué Álvarez-Borrego (1998) “Optical-digital processing applied to the identification of five phytoplankton spe-cies” Marine Biology, 132: 357-365

Pech Pacheco, J , Josué Álvarez-Borrego y C Cristóbal-Pérez (2003) “Automatic object identification irrespective of geometric chan-ges” Optical Engineering, 42: 551-559

Pech Pacheco J , C Cristobal-Pérez, Josué Álva-rez-Borrego y L Cohen (2002) “Automatic system for phytoplanktonic algae identifica-tion” Limnetica, 20: 143-158

Pita, M , J Fernández y J Gosálvez (2003) “Whole-comparative genomic hybridization (W-CGH): 1 The quick overview of repetiti-ve DNA sequences on a genome” Chromo-some Research, 11: 673-679

Poggio, L , v Confalonieri, C Comas, G Gon-zález y C Naranjo (2000) “Evolutionary re-lationships in the genus Zea: analysis of re-petitive sequences used as cytological FISH


and GISH markers” Genetics and Molecular Biology, 23: 1021-1027

Porto-Foresti, F , C Oliveira, Y Aiko, M Rigo-lino y F Foresti (2002) “NORs inheritance analysis in crossings including individuals from two stocks of rainbow trout (Oncorhyn-chus mykiss)” Hereditas, 136: 227-230

Rinkevich, B (1999) “Cell cultures from mari-ne invertebrates: obstacles, new approaches and recent improvements” Journal of Biote-chnology, 70: 133-153

Rodríguez-Juiz, A M , M Torrado y J Méndez (1996) “Genome-size variation in bivalve molluscs determined by flow cytometry” Marine Biology, 126: 489-497

Schrock, E , S du Manoir, T veldman, B Scho-ell, J Wienberg, M Ferguson-Smith, D Ning, H Ledbetter, I Bar-Am, D Soenksen, Y Garini y T Ried (1996) “Multicolor spec-tral Karyotyping of human chromosomes” Science, 273: 494-497

Schulte, E (1991) “Standardization of the Feul-gen reaction for absorption DNA image cito-metry: a review” Analytical Cellular Patholo-gy, 3: 167-182

Schwarzacher, T y P Heslop-Harrison (2000) Practical in situ hybridization BIOS Scientific Publishers Ltd , Nueva York

Sessions, S (1996) “Chromosomes: Molecular cytogenetics” En: Hillis, D , Moritz C , Ma-ble B (eds) Molecular systematics Sinawer, pp 121-167

Swanson, W y v vacquier (1998) “Concerted evolution in an egg receptor for rapidly evol-ving abalone sperm protein” Science, 281: 710-712

Thiriot-Quiévreux, C (1990) “Karyotype analy-sis in several pelagic gastropods” American Malacological Bulletin, 8: 37-44

Thiriot-Quiévreux, C (1994) “Advances in cyto-genetics of aquatic organisms” En: Beau-mont A (ed ) Genetics and evolution of aquatic organisms Chapman and Hall, Lon-dres, pp 369-388

Thomas, C (1971) “The genetic organization of chromosomes” Annual Review in Genetics, 5: 237-256

Tiersch, T , R Chandler, S Wachtel y S Elias (1989) “Reference standards for flow cyto-metry and application in comparative stu-

dies of nuclear DNA content” Cytometry, 10: 701-710

Trask, B (2002) “Human cytogenetics: 46 chro-mosomes, 46 years and counting” Nature, 3: 769-778

Uchimura, Y , A Komaru, K Wada, Ieyama H , M Yamaki y H Furuta (1989) “Detection of induced triploidy at different ages for larvae of the Japanese pearl oyster, Pinctada fucata martensii, by microfluorometry with DAPI staining” Aquaculture, 76: 1-9

viera, C , C Nardon, C Arpin, D Lepetit y C Biémont (2002) “Evolution of genome size in Drosophila Is the invader’s genome being invaded by transposable elements?” Molecu-lar Biology and Evolution, 19: 1154-1161

villalobos-Flores, E , Josué Álvarez-Borrego, v Kober, C Gabriel y E Castro-Longoria (2002) “Study of 21 fragmented fossil dia-toms using a digital invariant correlation” SPIE, Applications of Digital Image Proces-sing xxv: 4790

vinogradov, A (1995) “Nucleotypic effect in ho-meotherms: Body mass-corrected basal me-tabolic rate of mammals is related to genome size” Evolution, 49: 1249-1259

von Brand-Skopnik, E y A Ibarra-Humphries (2002) “Genética de pectínidos iberoameri-canos” En: Maeda-Martínez, A (ed ) Los moluscos pectínidos de Iberoamérica: ciencia y acuicultura Noriega Editores, México, pp 105-126

Weierich, C , A Brero, S Stein, J von Hase, C Cremer, T Cremer (2003) “Three-dimen-sional arrangements of centromeres and telomeres in nuclei of human and murine lymphocytes” Chromosome Research, 11: 485-502

Wilkinson, D (1998) In situ hybridization: a practical approach Oxford University Press, Nueva York

Young, I (1996) “Quantitative Microscopy” IEEE Engineering in Medicine and Biology Magazine, 15: 59-66

Zhang, G , G Yu, R Cooper y T Tiersch (1999) “High-resolution analysis of karyotypes pre-pared from different tissue of the Easter oys-ter Crassostrea virginica” Journal of Shellfish Research, 18: 115-120

capítulo 2 Identificación de especies de copépodos por medio

de algoritmos de correlación invariante

I. Introducción

Los copépodos son microorganismos pertene-cientes al reino animal, la mayoría pertenecen al zooplancton marino Estos organismos son el grupo dominante y llegan a constituir hasta más de 70% de la abundancia total (Raymont, 1983) El grupo de los copépodos posee una gran di-versidad ya que existen alrededor de 11,500 es-pecies descritas (Humes, 1994) y el número se va incrementando rápidamente con la descrip-ción de nuevas especies, como las encontradas en las cuevas anquihalinas (Fosshagen e Iliffe, 1991), las ventilas hidrotermales (Humes, 1991) y aquellas que por mucho tiempo se han confun-dido con otras especies (Bradford, 1976; Soh y Suh, 2000)

Los copépodos son muy importantes en los ecosistemas marinos ya que la mayoría se ali-menta de fitoplancton, son la fuente principal de alimento para una gran variedad de inverte-brados y larvas de peces, por lo que forman así un eslabón directo entre la producción primaria y los peces de interés comercial, como el aren-que y la sardina Debido a este importante pa-pel, los cambios interanuales en la abundancia de copépodos pueden determinar fluctuaciones importantes en las poblaciones de peces explo-tados comercialmente Por otro lado, la impor-tancia de los copépodos no solamente estriba en el papel que éstos juegan en la transferencia de energía de la producción primaria a niveles tró-ficos superiores, sino que algunas especies son utilizadas como indicadoras de masas de agua (Cross y Small, 1967; Longhurst, 1967; Dawson y Knatz, 1980; Mauchline, 1998), o como bio-

indicadores de contaminación y/o eutroficación (Dawson y Knatz, 1980)

Por otro lado los sistemas semi-encerrados como lagunas costeras y estuarios son impor-tantes debido a que son zonas de reproducción y crianza de muchos organismos, incluyendo es-pecies comercialmente importantes, y en ellas la comunidad de copépodos está dominada por especies del género Acartia (Conover, 1956; Abraham, 1969; Alcaraz, 1983; Lakkis, 1994) y el número de especies de este genero varía entre las diferentes regiones geográficas, des-de una o dos especies (Conover, 1956; Jeffries, 1962; Greenwood, 1981), hasta once (Abraham, 1969)

Existen algunas especies de copépodos cu-yas características morfológicas los hacen muy similares entre sí, las diferencias entre especie y especie no son muy evidentes y por lo tanto con frecuencia son identificadas erróneamente Di-chas especies son denominadas como “especies crípticas” En este caso se encuentran algunas de las especies de Acartia que han sido conside-radas como cosmopolitas, sin embargo estudios recientes demuestran que debido a que algunas especies son muy similares, se han clasificado de manera equivocada (Alcaraz, 1976; Bradford, 1976; Park, 1994; Reid, 1997/8; Soh and Suh, 2000) De la misma manera, recientemente se demostró que tres especies del género Cleto-camptus habían sido identificadas como una sola especie, C. dietersi (Rocha-Olivares et al., 2001)

El hecho de que algunas especies puedan ser confundidas con otras demuestra que la correc-ta identificación de un organismo es difícil y re-quiere mucha experiencia, y por lo general toma años llegar a ser un experto taxónomo Además

Ernestina Castro-LongoriaJosué Álvarez-Borrego

48 Ernestina Castro-Longoria y Josué Álvarez-Borrego

del tiempo de entrenamiento que requiere llegar a ser un experto, el análisis de las muestras zo-oplanctónicas, las cuales están constituidas por miles de estos organismos, requiere de un gran número de horas-hombre separando e identifi-cando organismos Aunque el tiempo de análi-sis se puede acortar analizando solamente una submuestra, cada vez se hace más necesario el desarrollo de nuevas técnicas de identificación automatizada que sean herramientas de apoyo para el taxónomo Un problema frecuente en el análisis de muestras de zooplancton es también la falta de claves de identificación de rápido ac-ceso, mismo que se podría solucionar mediante la elaboración de un catálogo de imágenes digi-tales Mediante el uso de este catálogo, la captu-ra de imágenes del organismo a identificar y la aplicación de técnicas de correlación invariante se podrían identificar rápidamente especies de copépodos ahorrando así tiempo y esfuerzo

Los primeros trabajos en los cuales se ha in-tentado la identificación de especies zooplanc-tónicas por medio de técnicas especiales fue-ron realizados por medio de siluetas tomadas de fotografías (Ortner et al., 1979) e imágenes de videocámaras (Latrous, 1984; Rolke y Lenz, 1984) Sin embargo la resolución de las imágenes y la orientación de los organismos resultaron fac-tores limitantes para una correcta identificación Recientemente el uso del patrón de difracción se ha reconocido como una herramienta útil para la identificación de especies planctónicas Zava-la-Hamz et al. (1996) y Zavala Hamz y Álvarez-Borrego (1997) realizaron un trabajo en donde fue posible discriminar entre tres especies de copépodos utilizando contornos binarios digita-les Pech-Pacheco et al. (1999) demostró también la utilidad del patrón de difracción en la iden-tificación de especies de fitoplancton En este capítulo se detallan los trabajos más recientes (Castro-Longoria et al., 2001; Álvarez-Borrego y Castro-Longoria, 2003; Castro-Longoria et al., 2003) acerca de la identificación automática de copépodos en el cual se aplican diversos algorit-mos de correlación invariante para la identifica-ción de estas especies Dichos trabajos servirán de base para que en un futuro cercano sea posi-ble el desarrollo de un sistema automatizado de identificación de estos organismos

II. Discriminación entre cuatro especies de copépodos calanoides

La primera etapa consistió en el desarrollo de algoritmos de correlación invariante para la identificación de especies de copépodos, para lo cual se utilizaron cinco especies que ocurren frecuentemente en la región de la Corriente de California (Fleminger, 1967) Se utilizaron esta-dios adultos de Calanus pacificus, Rhincalanus nasutus, Pleuromamma gracilis, Temora discau-data y Acartia tonsa Se seleccionaron 30 machos y 30 hembras de cada especie Los especímenes se observaron mediante un microscopio este-reoscópico y se capturaron imágenes digitales utilizando una cámara CCd (Charge Coupled Device) La imagen de cada organismo se cap-turó en su vista dorsal, excepto en el caso de C. pacificus, al cual usualmente se le encuentra en las muestras de plancton en posición lateral, por lo que en este caso se capturaron 15 imágenes en posición lateral derecha y 15 en posición lateral izquierda Todas las imágenes utilizadas fueron de un tamaño de 256 x 256 píxeles Se realizó una simulación numérica para correlacionar los patrones de difracción (pd) de las especies de copépodos con filtros de fase (Horner y Gianino, 1984) Todo el proceso se realizó digitalmente, se utilizaron dos transformadas, la de Fourier y la de Escala En este método la introducción de un factor de escala r (donde r es la frecuen-cia radial espacial, cuyo origen es la frecuencia cero en la representación óptica del espectro de Fourier; Pech-Pacheco et al., 2001) está asociada con el módulo de la transformada de Fourier de imágenes candidatas, con el propósito de obte-ner la transformada de escala descrita por Co-hen (1993, 1995)

La figura 1 muestra los pasos para obtener un filtro de un objeto que se desea reconocer Como un ejemplo se utiliza como imagen inicial la letra “E” (figura 1a) El primer paso es obte-ner el módulo cuadrado de la transformada de Fourier de la imagen (figura 1b) Después, las frecuencias altas se realzan usando una función parabólica como la que se muestra en la figura 1c En la figura 1d se muestra la imagen del con-tenido de frecuencias realzada, en la cual las fre-cuencias altas se observan con más detalle Una mejor definición de las frecuencias altas ayuda

49Identificación de especies de copépodos por medio de algoritmos de correlación invariante

a obtener una buena identificación del objeto por reconocer Después, el factor de escala r (figura 1e) se aplica a la imagen de la figura 1d para la obtención de la figura 1f Como se men-ciona en el párrafo anterior, este proceso es lo que diferencia la transformada de escala de la transformada de Mellin Después de todos estos pasos las coordenadas cartesianas se mapearon (figura 1f) a coordenadas polares (figura 1g), esto es necesario para obtener la invariancia a rotación En este paso se introduce una interpo-lación bi-lineal de los primeros datos de conver-sión de coordenadas (Pech-Pacheco et al., 2001) Esto se realiza para minimizar la fuga de informa-ción, lo cual puede interferir en la identificación de los objetos La figura 1h muestra la imagen en coordenadas polares, pero con un logaritmo en la

parte r, la cual va a facilitar la identificación in-variante a escala La transformada de Fourier de la imagen resultante es la que forma un filtro de fase, cuando el módulo de esta transformación la hacemos igual a uno (filtros con la información acerca de la especie por identificar) Los pasos de las figuras 1b a 1h son necesarios para asegurar que la información contenida en los patrones de difracción es invariante a rotación, escala y posi-ción, obteniendo así la correlación invariante de los patrones de difracción

Para discriminar entre especies de copépodos y entre sexos, todos los patrones de difracción se transformaron como en la figura 1b-h, y después de este proceso se correlacionaron con diferen-tes filtros Como filtro se seleccionó el patrón de difracción de cada hembra y de cada macho para cada una de las especies, por ejemplo, para dis-criminar la hembra de C. pacificus del resto de los organismos, se seleccionaron 10 patrones de difracción de las hembras de esta especie, por lo tanto se utilizaron 10 filtros en total para identi-ficar a cada especie Los 10 filtros muestran 10 posiciones aleatorias de cada especie

En la figura 2 se muestran las cinco especies de copépodos que se utilizaron en la primera etapa de este estudio así como sus patrones de difracción

Los patrones de difracción fueron modifica-dos sólo en esta figura, para una mejor visuali-zación, se obtuvieron en log10 y los resultados se binarizaron (la media se multiplicó por 1 5, los valores binarios más grandes que 1 5 fueron 255 y los menores que 1 5 fueron cero)

El filtro de cada especie y sexo (cada uno de los 10 filtros seleccionados) se correlacionó con cada uno de los patrones de difracción de los or-ganismos, los valores obtenidos se representaron en gráficas de caja Para cada grupo de organis-mos se representó la media y el error estándar (ee) (figura 3a-j) (los valores de correlación no fueron normalizados) Cada especie de copépo-do está representada por tres letras, la primera letra representa el género (C = Calanus, R = Rhincalanus, P = Pleuromamma, T = Temora y A = Acartia), la segunda letra representa la es-pecie (p = pacificus, n = nasutus, g = gracilis, d = discaudata y t = tonsa) y la tercera letra repre-senta el sexo (H = Hembra, M = Macho)

13

a b

c d

e f

g h @TIT CUADRO = Figura 1

Figura 1. Imágenes del método invariante: a) imagen de en-trada; b) módulo al cuadrado de la transformada de Fourier; c) máscara parabólica; d) módulo al cuadrado con efecto parabólico; e) factor de escala; f) imagen (d) con factor de escala; g) mapeo polar de (f); h) mapeo polar-log de (g), esta imagen se usa para el cálculo de la correlación invariante a rotación y escala.


Para las hembras de C. pacificus se obtuvo un valor promedio de 6 64 ± 0 04 (tabla I) cuan-do el filtro CpH se correlacionó con los patrones de difracción de las hembras de C. pacificus, este valor fue distinto al obtenido para los machos de la misma especie (6 18 ± 0 04), en la gráfica se observa como un grupo independiente (figura 3a) También el valor de correlación obtenido con respecto a las otras especies fue diferente y separado del grupo de las hembras de C. pa-

cificus El valor de correlación promedio para los machos de C. pacificus con el filtro CpM fue de 6 2 ± 0 04, en la gráfica se observa comple-tamente separado del valor promedio obtenido para las hembras (6 63 ± 0 04) de la misma espe-cie y también de todas las otras especies (figura 3b) En el caso de las hembras de R. nasutus, el valor de correlación promedio fue de 6 76 ± 0 1 con respecto al filtro RnH, dicho valor se encon-tró separado del valor de correlación promedio 14

a

b

c d

e f

g h

i j @TIT CUADRO = Figura 2

Figura 2. Especies de copépodos calanoides utilizados en el estudio: a) Calanus pacificus hembra; b) C. pacificus macho; c) Rhincalanus nasutus hembra; d) R. nasutus macho; e) Pleuromamma gracilis hembra; f) P. gracilis macho; g) Temora discaudata hembra; h) T. discaudata macho; i) Acartia tonsa hembra; j) A. tonsa macho. El patrón de difracción de cada organismo se en-cuentra a la derecha de imagen.


Figura 3. valores de correla-ción promedio de los patro-nes de difracción de las espe-cies de copépodos utilizando los siguientes filtros: a) Cala-nus pacificus hembra, b) C. pa-cificus macho, c) Rhincalanus nasutus hembra, d) R. nasu-tus macho, e) Pleuromamma gracilis hembra, f) P. gracilis macho, g) Temora discaudata hembra, h) T. discaudata ma-cho, e) Acartia tonsa hembra, f) A. tonsa macho. Las flechas representan el filtro usado en cada caso.

15

Valo

r de

corr

elac

ión

prom

edio

1.5

2.5

3.5

4.5

5.5

6.5

7.5

CpH

CpM RnH

RnM Pg

H

PgM

TdH

TdM

AtH

AtM

a

Valo

r de

corr

elac

ión

prom

edio

1.5

2.5

3.5

4.5

5.5

6.5

7.5

CpH

CpM RnH

RnM Pg

H

PgM

TdH

TdM

AtH

AtM

b

Valo

r de

corr

elac

ión

prom

edio

1.5

2.5

3.5

4.5

5.5

6.5

7.5

CpH

CpM RnH

RnM Pg

H

PgM

TdH

TdM

AtH

AtM

c

Valo

r de

corr

elac

ión

prom

edio

1.5

2.5

3.5

4.5

5.5

6.5

7.5

CpH

CpM RnH

RnM Pg

H

PgM

TdH

TdM

AtH

AtM

d

Valo

r de

corr

elac

ión

prom

edio

1.5

2.5

3.5

4.5

5.5

6.5

7.5

CpH

CpM RnH

RnM Pg

H

PgM

TdH

TdM

AtH

AtM

e

Valo

r de

corr

elac

ión

prom

edio

1.5

2.5

3.5

4.5

5.5

6.5

7.5

CpH

CpM RnH

RnM Pg

H

PgM

TdH

TdM

AtH

AtM

f

16

Valo

r de

corr

elac

ión

prom

edio

1.5

2.5

3.5

4.5

5.5

6.5

7.5

CpH

CpM RnH

RnM Pg

H

PgM

TdH

TdM

AtH

AtM

G

Valo

r de

corr

elac

ión

prom

edio

1.5

2.5

3.5

4.5

5.5

6.5

7.5

CpH

CpM RnH

RnM Pg

H

PgM

TdH

TdM

AtH

AtM

h

Valo

r de

corr

elac

ión

prom

edio

1.5

2.5

3.5

4.5

5.5

6.5

7.5

CpH

CpM RnH

RnM Pg

H

PgM

TdH

TdM

AtH

AtM

I

Valo

r de

corr

elac

ión

prom

edio

1.5

2.5

3.5

4.5

5.5

6.5

7.5

CpH

CpM RnH

RnM Pg

H

PgM

TdH

TdM

AtH

AtM

j

Media

± 1.00 * Err Estd. ± 1.96 * Err Estd.

@TIT CUADRO = Figura 3


para R. nasutus machos (6 22 ± 0 09), así como de los valores para las otras especies (figura 3c) El valor promedio para los machos de R. nasutus con respecto al filtro RnM fue de 6 32 ± 0 09, el cual también se encontró que se separaba del valor obtenido para las hembras (6 82 ± 0 09) (figura 3d) En el caso de P. gracilis también fue posible discriminar entre machos y hembras, el valor de correlación para hembras con el filtro PgH fue de 4 89 ± 0 03, este valor se separa del obtenido para machos (4 87 ± 0 03) y como se observa en la figura 3e, ambos valores se separan de los obtenidos para el resto de las especies Los valores de correlación para machos de P. gracilis con el filtro PgM dieron un promedio de 4 64 ± 0 01, el cual fue diferente al valor promedio ob-tenido para hembras (4 62 ± 0 01) (figura 3f) El valor de correlación promedio para hembras de T. discaudata con el filtro TdH fue de 5 39 ± 0 04 y para machos 5 38 ± 0 04 (figura 3g), para los machos de T. discaudata se obtuvo un valor de 5 28 ± 0 02 con el filtro TdM y con este mismo filtro se obtuvo un valor de 5 26 ± 0 02 para las hembras (figura 3h)

Los valores de correlación para T. discauda-ta se traslapan ligeramente a 1 96 ee, pero a 1 ee es posible la separación entre hembras y ma-chos En el caso de los patrones de difracción de las hembras de A. tonsa, correlacionados con el filtro AtH dieron un valor promedio de 4 35 ± 0 01 y de 4 30 ± 0 01 con respecto a los machos El valor promedio para los machos de A. tonsa correlacionados con el filtro AtM fue de 4 24 ± 0 01 y 4 29 ± 0 0 para hembras En ambos casos, machos y hembras de A. tonsa se separaron del resto de las especies (figura 3i-j) y a pesar de que los valores de correlación promedio resultaron muy cercanos entre sí, la discriminación entre machos y hembras resultó positiva

Los resultados obtenidos en la discrimina-ción de las cuatro especies de copépodos inclui-dos en el trabajo resultaron muy buenos, consi-derando que se utilizaron imágenes digitales de los organismos en lugar de siluetas (Ortner et al., 1979; Jeffries et al., 1984) y contornos binarios di-gitales (Zavala-Hamz et al., 1996; Zavala-Hamz y Álvarez-Borrego, 1997) utilizados en algunos estudios previos También es importante recal-car que a pesar de la gran similitud taxonómica entre machos y hembras, la técnica utilizada es

lo suficientemente sensible como para discrimi-nar entre los dos sexos La técnica desarrollada en esta primera parte para la discriminación de especies de copépodos resultó muy prometedora, sin embargo las imágenes utilizadas sólo incluían a los organismos en su vista ventral y dorsal, y en el caso de C. pacificus su vista lateral derecha e izquierda, todas en su vista vertical En la segunda parte de este estudio se trabajó para el desarrollo de un filtro compuesto en el cual se incluye más información en cuanto a las diferentes posiciones en las que comúnmente se encuentran a los orga-nismos en las muestras y se incluyeron especies que son taxonómicamente muy similares

III. Discriminación entre especies de copépodos congenéricos

La discriminación de diferentes especies de co-pépodos por medio de la aplicación de algorit-mos de correlación invariante fue posible para especies de diferente género (Castro-Longoria et al., 2001), sin embargo existen especies como las del grupo de las Acartias que son particular-mente fáciles de confundir entre ellas por la gran similitud en su taxonomía Así mismo algunas es-pecies de copépodos harpacticoides son particu-larmente difíciles de identificar, en este caso se trabajó con tres especies del género Cletocamp-tus, las cuales habían sido previamente identifi-cadas como C. deitersi (Gómez et al., 2004)

Como se mencionó previamente, en la segun-da etapa del análisis se trabajó con especies de copépodos del mismo género pero de diferente especie, en este caso se incluyeron cuatro espe-cies del género Acartia y tres especies del género Cletocamptus Las especies de Acartia utilizadas fueron: A. discaudata, A. clausi, A. margalefi y A. tonsa de Southampton Water, Inglaterra (figura 4) Las especies del género Cletocamptus fueron: C. stimpsoni, de Jackson Alabama; C. deborah-dexterae de Salton Sea, California, y C. fourchen-sis, de Port Fourchon, Louisiana Las especies de Cletocamptus utilizadas en este trabajo se repor-taron recientemente como especies nuevas por Gómez et al. (2004)

El procedimiento de captura de imágenes fue el mismo que se realizó para las especies anali-zadas en la primera etapa del proyecto, se utilizó


también el mismo tamaño de imagen, ),,( yxf 256 x 256 píxeles

Se utilizó una simulación numérica con la finalidad de correlacionar los patrones de di-fracción con los filtros de fase (Horner y Gi-anino, 1984), todo el procedimiento se llevó a cabo digitalmente En la figura 5 se detalla me-diante un diagrama de flujo el procedimiento para la obtención de los filtros compuestos En este caso las imágenes de las especies de Acar-tia se tomaron con los organismos en diferentes vistas, y con todas estas imágenes se construyó el filtro compuesto Como primer paso se selec-cionan las imágenes que compondrán el filtro

),(...,),,(),,( 21 yxfyxfyxf n (paso 1), se ob-tiene el patrón de difracción usando la transfor-

mada de Fourier (fft) de cada una (paso 2) para obtener invarianza a posición Después de esto se suman todos los patrones de difracción para obtener solo uno (que contendrá toda la informa-ción de las imágenes seleccionadas) (paso 3)

Después las frecuencias altas se realzan usando el filtro pasa alta De esta manera las frecuencias altas de los patrones de difracción se observan con mayor detalle Una mejor defini-ción de las frecuencias altas, consecuentemente será de utilidad para una buena identificación de la especie del organismo por identificar

Después de estos pasos, las coordenadas car-tesianas (wx, wy) se mapean a coordenadas pola-res (paso 4) para lograr invariancia a rotación Al aplicar la transformada de Fourier al paso 4,

17

A

b

C

d

E

f

G

h


Figura 4. Especies del género Acartia utilizadas en el estudio: a) Acartia discaudata hembra; b) A. discaudata macho; c) Acartia clausi hembra; d) A. clausi macho; e) Acartia margalefi hembra; f) A. margalefi macho; g) Acartia tonsa hembra; h) A. tonsa macho.


se obtiene el filtro compuesto SPOF(uρ, vθ), (filtro que tiene la información de la especie que se va a identificar) el cual se usará en la correlación invariante a posición y rotación

Para discriminar entre cada especie, todas las imágenes que se analizaron fueron transfor-madas como se muestra en el diagrama de flujo

18


f2(x,y)

(Paso 1)

(Paso 2)

f1(x,y)

fn(x,y)

FFT

2

yx1 )w,(wF

2

yx2 )w,(wF

2

yxn )w,(wF

SPOF(u ,v )

2

yx )w,F(w

Filtro pasa alta

(Paso 5)

Sum

FFT

F(r, ) (Paso 3)

(Paso 4)

Figura 5. Diagrama de flujo representando los pasos que se realizaron para la obtención de los filtros compuestos.

de la figura 6, excepto que en el paso 1 tenemos solamente una imagen de entrada En el paso 6 de la figura 6 se realiza la correlación digital in-variante a posición y rotación El paso 5 en la figura 6 es el resultado obtenido en la figura 5

Los filtros compuestos conteniendo la in-formación de cada especie y sexo se correla-

19


Transformada de Fourier

F(r, )

Correlación digital

invariante

SPOF(u ,v )

S(u ,v )

2

yx )w,F(wf(x,y)

Filtro pasa alta

Procedimiento de correlación

(Paso 1) (Paso 2) (Paso 3)

(Paso 4)

(Paso 5)

(Paso 6)

Procedimiento normal de imagen

Figura 6. Diagrama de flujo que representa el sistema de correlación numérica invariante a posición y rotación.


Patr

ones

de

difr

acci

ón

Filtr

os u

sado

s(M

edia

± 1

EE

)C

pHC

pMR

nHR

nMP

gHP

gMT

dHT

dMA

tHA

tMC

pH6

64±

0 04

6 63

±0

043

95±

0 03

4 03

±0

036

43±

0 04

6 36

±0

046

56±

0 04

6 51

±0

046

3±0

046

19±

0 04

CpM

6 18

±0

046

2±0

043

45±

0 03

3 54

±0

036

06±

0 03

5 99

±0

036

15±

0 04

6 12

±0

045

94±

0 03

5 85

±0

03R

nH4

11±

0 09

4 13

±0

086

76±

0 10

6 82

±0

093

7±0

063

59±

0 05

3 91

±0

083

9±0

073

59±

0 05

3 57

±0

05R

nM3

6±0

113

65±

0 11

6 22

±0

096

32±

0 09

3 41

±0

13

38±

0 09

3 49

±0

103

52±

0 11

3 41

±0

093

4±0

08P

gH4

78±

0 02

4 81

±0

022

35±

0 01

2 33

±0

104

89±

0 03

4 87

±0

034

83±

0 02

4 84

±0

024

82±

0 02

4 76

±0

03P

gM4

49±

0 01

4 52

±0

012

17±

0 0

2 14

±0

04

62±

0 01

4 64

±0

014

55±

0 01

4 56

±0

014

61±

0 01

4 56

±0

01T

dH5

34±

0 04

5 38

±0

042

67±

0 02

2 71

±0

035

37±

0 03

5 33

±0

035

39±

0 04

5 38

±0

045

28±

0 03

5 21

±0

03T

dM5

21±

0 02

5 26

±0

022

57±

0 01

2 58

±0

025

28±

0 02

5 24

±0

025

26±

0 02

5 28

±0

025

19±

0 02

5 13

±0

02A

tH4

21±

0 01

4 23

±0

012

04±

0 0

2 02

±0

04

32±

0 01

4 36

±0

014

26±

0 01

4 28

±0

014

35±

0 01

4 3±

0 01

AtM

4 14

±0

014

16±

0 01

2 0±

0 0

1 98

±0

04

25±

0 01

4 28

±0

014

19±

0 01

4 2±

0 01

4 29

±0

04

24±

0 01

Tabl

a I.

Valo

res

de c

orre

laci

ón p

rom

edio

(un

idad

es r

elat

ivas

) de

los

patr

ones

de

difr

acci

ón d

e al

guna

s es

peci

es d

e co

pépo

dos

utili

zand

o lo

s si

guie

ntes

filtr

os: (

CpH

) C

alan

us

paci

ficus

, hem

bra;

(C

pM)

Cal

anus

pac

ificu

s, m

acho

; (R

nH)

Rhi

ncal

anus

nas

utus

, hem

bra;

(R

nM)

Rhi

ncal

anus

nas

utus

, mac

ho; (

PgH

) Pl

euro

mam

ma

grac

ilis,

hem

bra;

(Pg

M)

Pleu

ro-

mam

ma

grac

ilis,

mac

ho; (

TdH

) Te

mor

a di

scau

data

, hem

bra;

(Td

M)

Tem

ora

disc

auda

ta, m

acho

; (A

tH)

Aca

rtia

ton

sa, h

embr

a; (

AtM

) A

cart

ia t

onsa

, mac

ho.


cionaron contra los patrones de difracción de todas las especies y los resultados obtenidos se representaron en graficas de cajas, la media, un error estándar (1ee) y (2ee) de cada grupo de organismos se representa en la figura 7 (los va-lores de correlación están en unidades relativas) Cada especie está representada por tres letras, 20


Valo

r de

corr

elac

ión

prom

edio

0.0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

AdM AdH AcM AcH AmM AmH AtM AtH a

Valo

r de

corr

elac

ión

prom

edio

0.0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

AdM AdH AcM AcH AmM AmH AtM AtH B

Valo

r de

corr

elac

ión

prom

edio

0.0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

AdM AdH AcM AcH AmM AmH AtM AtH c

Valo

r de

corr

elac

ión

prom

edio

0.0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

AdM AdH AcM AcH AmM AmH AtM AtH D

Valo

r de

corr

elac

ión

prom

edio

0.0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

AdM AdH AcM AcH AmM AmH AtM AtH e

Valo

r de

corr

elac

ión

prom

edio

0.0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

AdM AdH AcM AcH AmM AmH AtM AtH f

Valo

r de

corr

elac

ión

prom

edio

0.0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

AdM AdH AcM AcH AmM AmH AtM AtH g

Valo

r de

corr

elac

ión

prom

edio

0.0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

AdM AdH AcM AcH AmM AmH AtM AtH h

Figura 7. valores de correlación promedio (●) de los patrones de difracción de las especies de Acartia utilizando los siguientes filtros compuestos: (a) AdM, Acartia discaudata machos; (b) AdH, A. discaudata hembras; (c) AcM, Acartia clausi machos; (d) AcH, A. clausi hembras; (e) AmM, Acartia margalefi machos; (f) AmH, A. margalefi hembras; (g) AtM, Acartia tonsa machos; (h) AtH, Acartia tonsa hembras. Las cajas representan ± 1 Error estándar (EE), la barra en cada caja representa ± 2EE.

en donde la primera indica el género, la segunda, la especie y la tercera el sexo: A = Acartia; d = discaudata, c = clausi, m = margalefi, t = tonsa; M = macho, H = hembra

El valor de correlación promedio para A. discaudata machos al ser correlacionado con el filtro AdM fue de 0 28 ± 0 01, este valor fue di-


ferente al obtenido para hembras de la misma especie y también con respecto a las otras espe-cies (figura 7a) Para hembras de A. discaudata el valor promedio fue de 0 43 ± 0 01 cuando se correlacionaron las hembras de esta especie con el filtro AdH, mediante este filtro fue posible la separación entre machos y hembras de la misma especie y también entre el resto de las especies (figura 7b) En el caso de A. clausi, el filtro usado para discriminar machos (AcM) dio un resultado promedio de 0 30 ± 0 01, dicho valor se traslapó ligeramente a 2ee con el valor obtenido para las hembras de la misma especie, sin embargo a 1ee aún fue posible la separación entre machos y hembras y las demás especies (figura 7c) Los valores de correlación para las hembras de A. clausi con el filtro AcH dieron un promedio de 0 39 ± 0 01, el cual se separó del valor obtenido para machos (figura 7d)

El filtro usado para la discriminación de los machos de A. margalefi fue AmM y los valores de correlación obtenidos dieron un valor promedio de 0 44 ± 0 0 Al graficarse este valor se puede observar que se separa del valor obtenido para las hembras y el resto de las especies (figura 7e) El valor de correlación promedio para las hem-bras de A. margalefi con el filtro AmH fue de 0 34 ± 0 01 el cual también se separó de la de los ma-chos de la misma especie y del resto del grupo (figura 7f) En el caso de A. tonsa, el filtro AtM se utilizó para la discriminación de los machos de esta especie, aunque los valores obtenidos (0 35 ± 0 02) se traslapan un poco con los valores ob-tenidos para las hembras de A. tonsa a 2ee, pero a 1ee los valores sí se separan por lo que aún es posible separar entre machos y hembras (figura 7g) Por otro lado, cuando se utilizó el filtro AtH para discriminar las hembras, los valores se sepa-ran totalmente de los obtenidos para los machos de la misma especie y del resto del grupo (figura 7h) con un valor de correlación promedio de 0 51 ± 0 0 Por lo tanto, la discriminación entre sexos resultó mejor utilizando el filtro conteniendo la información de las hembras (AtH)

El procedimiento para la separación entre las tres especies de Cletocamptus fue el mismo que se utilizó para las especies del grupo de las Acartias (figura 8), sólo que en este caso no se separaron por sexos Se utilizaron tres filtros conteniendo la información de cada una de las

21


),(1 yxf

),(2 yxf

(a) (b)

(c)

(d)

(e)

(f)

),( yxfn

2

yx1 )w,(wF

2

yx2 )w,(wF

2

yxn w,(wF

2

yx )w,F(w

F(r, )

Scpf(u , v )

FFT

FFT

FFT

FFT

Figura 8. Diagrama de flujo representando los pasos a seguir para la obtención de los filtros compuestos. a) Imágenes re-presentativas de Cletocamptus, b) Módulo al cuadrado de la transformada de Fourier (FFT) de cada imagen, c) suma de todos los módulos al cuadrado, d) altas frecuencias resalta-das, e) coordenadas polares, f) obtención del filtro compues-to sólo de fase.

tres especies, cada filtro se correlacionó con los patrones de difracción de todas las especies En la figura 9 se observa la correlación promedio y el error estándar obtenido para cada especie Al correlacionarse el filtro de C. stimpsoni con las otras especies dio un promedio de 0 24 ± 0 02 el cual fue diferente del obtenido para las otras dos especies (figura 9a) En el caso del filtro de C. deborahdexterae el valor promedio obtenido fue de 0 22 ± 0 02, el cual también fue eficiente para la discriminación entre las tres especies (fi-gura 9b) El valor de correlación obtenido para C. Fourchensis fue de 0 19 ± 0 02, el cual se tras-lapó ligeramente con C. deborahdexterae a 2ee Sin embargo a 1ee la separación entre estas dos especies fue posible (figura 9c)


El desarrollo de un sistema automatizado en la identificación de organismos tales como los copépodos sería de gran utilidad para el taxóno-mo, ya que como se mencionó previamente, la identificación de estos organismos es una tarea que consume mucho tiempo y se necesita una gran experiencia para la correcta identificación de estos organismos

Cabe destacar que es necesaria la elabora-ción de catálogos de imágenes digitales de las especies que habitan en distintas regiones geo-gráficas, de tal manera que al realizar las corre-

22

Valo

r de

corr

elac

ión

prom

edio

0.00

0.04

0.08

0.12

0.16

0.20

0.24

0.28

C. stimpsoni C. deborahdexterae C. fourchensis a

Valo

r de

corr

elac

ión

prom

edio

0.00

0.04

0.08

0.12

0.16

0.20

0.24

0.28

C. stimpsoni C. deborahdexterae C. fourchensis b

Valo

r de

corr

elac

ión

prom

edio

0.00

0.04

0.08

0.12

0.16

0.20

0.24

0.28

C. stimpsoni C. deborahdexterae C. fourchensis c


Figura 9. valor promedio de correlación (●) de los patrones de difracción utilizando los siguientes filtros compuestos: a) Cletocamptus stimpsoni, b) C. deborahdexterae, c) C. fourchen-sis. Las cajas representan ± 1 EE, las barras ± 2EE.

laciones para discriminar entre especies no se incluyan filtros de especies que no habiten la re-gión y así optimizar el tiempo de procesado de información

En resumen, los resultados obtenidos en este estudio demuestran la factibilidad del uso del método de algoritmos de correlación inva-riante como sistema automatizado más rápido y preciso de identificación de copépodos Este método puede aplicarse a otros organismos del plancton

Referencias

Abraham, S (1969) “A preliminary systematic survey of the family Acartiidae with special reference to Cochin backwaters” First All-India Symp. Estuar. Biol., diciembre 27-30, 1969, Madras (abstracts), p 6

Alcaraz, M (1976) “Description of Acartia mar-galefi, a new species of pelagic Copepod, and its relationship with A. clausi” Inv. pesq., 40: 59-74

Alcaraz, M (1983) “Coexistence and segrega-tion of congeneric pelagic copepods: spatial distribution of the Acartia complex in the ría of vigo (NW Spain)” J. Plankton Res., 5: 891-900

Álvarez-Borrego, J y E Castro-Longoria (2003) “Discrimination between Acartia (Copepo-da: Calanoida) species using their diffraction in a position, rotation invariant digital corre-lation” J. Plankton Res., 25: 229-233

Bradford, J M (1976) “Partial revision of the Acartia subgenus Acartiura (Copepoda: Ca-lanoida: Acartidae)” Nueva Zelanda Jour-nal of Marine and Freshwater Research, 10: 159-202

Castro-Longoria, E , J Álvarez-Borrego y J L Pech-Pacheco (2001) “Identification of spe-cies of calanoid copepods using a new invari-ant correlation algorithm” Crustaceana, 74: 1029-1039

Castro-Longoria, E , J Álvarez-Borrego, A Rocha-Olivares, S Gómez y v Kober (2003) “Power of a multidisciplinary approach: use of morphological, molecular and digital methods in the study of harpacticoid cryptic species” Mar. Ecol. Prog. Ser., 249: 297-303


Cohen, L (1993) “The scale representation” IEEE Trans. On signal Proc., 41(12): 3275-3292

Cohen, L (1995) Time frequency analysis: 1-299 Prentice Hall Signal Processing series, Alan v Oppenheim, New Yersey

Conover, R J (1956) “Oceanography of Long Is-land Sound vI The biology of Acartia clausi and A. tonsa” Bull. Bingham Oceanogr. Coll., 15: 156-233

Cross, A F y L F Small (1967) “Copepod in-dicators of surface water movements off the Oregon coast” Limnol. Oceanogr., 12: 60-72

Dawson, K J y G Knatz (1980) “Illustrated key to planktonic copepods of San Pedro Bay, California” Tech. Rep., Allan Hancock Foundation, 2: 1-125

Fleminger, A (1967) “Distributional atlas of ca-lanoid copepods in the California Current region, Part II” CalCOFI Atlas, 7: 1-213

Fosshagen, A y T Iliffe (1991) “A new genus of calanoid copepod from an anchialine cave in Belize” Bull. Plankton Soc. Japan (vol espe-cial) 1991: 339-346

Gómez, S , J W Fleeger, A Rocha-Olivares y D Foltz (2004) “Four new species of Cleto-camptus Schmankewitsch, 1875, closely rela-ted to Cletocamptus deitersi (Richard, 1897) (Copepoda: Harpacticoida)” J. of Nat. Hist., 38: 2669-2732

Greenwood, J G (1981) “Occurrences of con-generic pairs of Acartia and Pseudodiaptomus species (Copepoda; Calanoida) in Moreton Bay, Queensland” Estuar. Coast. and Shelf Sci., 13: 591-596

Horner, J L y P D Gianino (1984) “Phase-only matched filtering” Applied Optics, 23(6): 812-816

Humes, A G (1991) “Zoogeography of cope-pods at Hydrothermal vents in the Eastern Pacific Ocean” Bull. Plankton Soc. Japan (vol especial) 1991: 383-389

Humes, A G (1994) “How many copepods?” En: F D Ferrari y B P Bradley (eds ) Ecolo-gy and morphology of copepods. Hydrobiolo-gia, 292/293: 1-8

Jeffries, H P (1962) “Succession of two Acartia species in estuaries” Limnol. Oceanogr., 7: 354-364

Jeffries, H P , M S Berman, A D Poularikas, C Katsinis, I Melas, K Sherman y L Bi-vins (1984) “Automated sizing, counting and identification of zooplankton by pattern re-cognition” Mar. Biol., Berlín, 78: 329-334

Lakkis, S (1994) “Coexistence and competition within Acartia (Copepoda, Calanoida) con-geners from Lebanese coastal water: niche overlap measurements” En: Ferrari, F D y Bradley, B P (eds ), Ecology and Morphology of Copepods, Kluwer Academic Publishers, 530 pp

Latrous, S (1984) Pattern recognition and au-tomatic zooplankton classification by image analysis: 1-117 Rennes-I University, Ren-nes

Longhurst, A R (1967) “Diversity and trophic structure of zooplankton communities in the California Current” Deep Sea Res., 14: 393-408

Mauchline, J (1998) “The biology of calanoid copepods” Advances in Marine Biology, 33: 1-707

Ortner, P , S R Cummings, R P Aftring y M E Edgerton (1979) “Silhouette photography of oceanic zooplankton” Nature, Londres, 277: 50-51

Park, T (1994) “Geographic distribution of the bathypelagic genus Paraeucheta (Copepoda, Calanoida)” Hydrobiologia, 292/293: 317-332

Pech-Pacheco, J L , J Álvarez-Borrego, E Orellana-Cepeda, y R Cortez-Altamirano (1999) “Diffraction pattern applicability in the identification of Ceratium species” Jo-urn. Plankton Res., 21: 1455-1474

Pech-Pacheco, J L , J Álvarez-Borrego, G Cris-tóbal y M Keil (2001) “Automatic object identification irrespective of geometric chan-ges” Optical Engineering, 42: 551-559

Raymont, J E G (1983, 2ª ed ) Plankton and productivity in the oceans, 2, Zooplankton: 1-824 Pergamon Press, Oxford

Reid, J W (1997/8) “How ‘cosmopolitan’ are the Continental Cyclopoid copepods? Compari-son of the North American and Eurasian fau-nas, with description of Acanthocyclops para-sensitivus sp nov (Copepoda: Cyclopoida) from the USA” Zool. Anz., 236: 109-118


Rocha-Olivares, A , J W Fleeger y D W Foltz (2001) “Decoupling of molecular and mor-phological evolution in deep lineages of a meiobenthic harpacticoid copepod” Mole-cular Biology and Evolution, 18: 1088-1102

Rolke, M y J Lenz (1984) “Size structure analy-sis of zooplankton samples by means of an automated image analysing system” Journ. Plankton Res., 6: 637-645

Soh, H Y y H -L Suh (2000) “A new species of Acartia (Copepoda, Calanoida) from the Ye-llow Sea” Journ. Plankton Res., 22: 321-337

Zavala-Hamz, v A y J Álvarez-Borrego (1997) “Circular armonic filters for the recognition of marine microorganisms” Applied Optics, 36: 484-489

Zavala-Hamz, v A , J Álvarez-Borrego y A Tru-jillo-Ortíz (1996) “Diffraction patterns as a tool to recognize copepods” Journ. Plankton Res., 18: 1471-1484

capítulo 3 Identificación de algunas especies

de fitoplancton mediante sistemas óptico-digitales: una primera aproximación

Josué Álvarez BorregoJosé Luis Pech Pacheco

Roberto Cortés Altamirano

tener un panorama global de estos fenómenos En este capítulo veremos cómo son los métodos para caracterizar una muestra de fitoplancton, cómo han evolucionado y cuál es el método que se propone como una solución al problema del análisis de grandes cantidades de muestras de fitoplancton

Las partículas biogénicas son indicadores de cómo se encuentra un ecosistema, ya que éstas muestran cualquier desequilibrio provocado por cualquier agente extraño al sistema El material biológico puede ser usado para indicar los efec-tos de cualquier compuesto estresante químico en un ecosistema Existen muchos organismos bioindicadores que son usados actualmente para diagnosticar ciertas áreas de interés como son: contaminación natural o antropogénica, produc-tividad de zonas, regiones biogeográficas, cam-bios climáticos, sanidad, paleoclimas, paleoeco-logía, etc Un grupo importante de partículas biogénicas es el fitoplancton; el fitoplancton es la base de la cadena alimenticia, se ha usado como un buen bioindicador para describir cier-tos comportamientos de los ecosistemas, entre otras cosas En este capítulo se analizará de ma-nera general la importancia de estos organismos, sus usos en la ecología, biogeografía, cambio cli-mático global, contaminación, acuicultura y por último —de forma somera— cómo afectan estas células; se verá, por ejemplo, cuando existe ma-rea roja, que es una respuesta de algunas espe-cies de fitoplancton a los cambios climáticos que actualmente se están presentando Además se mencionarán algunas técnicas de procesamiento de imágenes utilizadas en el pasado para iden-tificar de manera automática algunas especies de fitoplancton Se analiza y discute una técnica

I. Introducción

Actualmente el principal tema de los programas internacionales como son GLOBEC (Global Ocean Biological Ecosystems), JGOFS (Joint Global Ocean Flux Study), LOICZ (Land Ocean Interaction Continental Zone) y GOOS (Global Ocean Observing System) abarca el cómo los ecosistemas pelágicos marinos de nuestro plane-ta pueden ser afectados por impactos antropo-génicos y cómo este efecto puede contribuir al cambio climático global Los cambios espaciales y temporales en la estructura de una comunidad, población biológica y la diversidad, presentan cambios que afectan a gran escala a la biosfera En el centro de estos problemas está una de las más grandes “dificultades” de la investigación biológica que es la taxonomía Desde el siglo an-tepasado hasta el actual se ha invertido tiempo y esfuerzo para la elaboración de claves taxonómi-cas que faciliten el laborioso trabajo en la iden-tificación También se han desarrollado nuevas técnicas de caracterización de estos organismos El desarrollo de nuevas tecnologías es contem-plado en todos los programas internacionales como un camino importante para cumplir con sus objetivos El desarrollo de técnicas ópticas, digitales, acústicas y sistemas foto-ópticos que son calibradas con mediciones in situ de perfiles de distribución de fitoplancton y monitoreo cua-litativos y cuantitativos por medio de muestras de red o de botellas hidrológicas, demandan la creación de sistemas de identificación y conteo automatizados, para así poder tener una buena base de datos que servirá en el futuro para la estimación de propiedades biológicas del fito-plancton por medio de sensores remotos y poder

62 Josué Álvarez Borrego, José Luis Pech Pacheco y Roberto Cortés Altamirano

reciente de procesamiento óptico-digital para la identificación de especies de Ceratium.

I.1. Importancia del fitoplancton como partícula biogénica

Las plantas microscópicas marinas que se en-cuentran flotando en el océano, conocidas como fitoplancton, presentan una gran distribución glo-bal y estas poblaciones contribuyen con el 25% del total de la vegetación del planeta (Jeffrey y Hallegraeff, 1990)

La importancia primordial del fitoplancton radica en que son los productores primarios de la cadena trófica alimenticia del océano, su bioma-sa determina directamente la productividad del agua, por lo tanto el fitoplancton marino repre-senta una de las más importantes fuentes de ali-mentación para todos los organismos filtradores (almejas, ostiones, ballenas, etc ) y para un gran número de larvas, crustáceos y peces de impor-tancia comercial En aguas someras se considera como uno de los principales alimentadores de la comunidad bentónica (Zeitzschel, 1978)

Una ventaja de trabajar el fitoplancton es su rápida respuesta a los cambios en el ambiente, de-bido a que multiplican sus poblaciones en cuestión de horas pues tienen tasas de división celular has-ta de 1 0 día-1 (Roberts, 1979; Epley, 1986 y Tomas et al.; 1993) de tal forma que cualquier alteración se ve reflejada en la comunidad del fitoplancton (Smayda y Shimizu, 1993)

Debido a que las células presentan adap-taciones según las condiciones de su ambiente (Steeman-Nielsen, 1933; Morris, 1980; Bidigare y Ondrusek, 1990; y Sathyendranath et al., 1991) es interesante relacionar el contenido total de biomasa con la abundancia y estructuras taxonó-micas, así como con la variabilidad espacio-tem-poral de la población para poder interpretar de mejor forma las fluctuaciones de la comunidad (Harris, 1986)

La principal diferencia de la producción pri-maria en los océanos y en la tierra es que en el mar frecuentemente todo el fitoplancton es con-sumido por el zooplancton, mientras que en la tierra las vegetales sólo son consumidas en 10% por los herbívoros Además, los tiempos de ge-neración en los vegetales terrestres son grandes comparados con los tiempos de crecimiento del

fitoplancton en el mar (se regeneran cada día) Smayda (1970)

Las especies fitoplanctónicas y sus caracte-rísticas biológicas han sido estudiadas desde di-ferentes puntos de vista: su índice de refracción (Carder et al., 1972); su crecimiento en sistemas de cultivo (de Pauw et al , 1984); análisis de sus pigmentos (Faust y Norris, 1982); relación de crecimiento con respecto a la luz y temperatu-ra (Hitchcock, 1980); prueba de ecotoxicología (Jensen, 1984); ecofisiología del fitoplancton costero (Orellana et al , 1993) De estos trabajos se demuestra que las características del medio pueden verse reflejadas en la composición espe-cífica del fitoplancton

I.2. Usos de los organismos del fitoplancton

I.2.1. Ecología y biogeografía

Las regiones pueden ser caracterizadas por una especie típica o por un conjunto de especies en-démicas Estudios de biogeografía de las comu-nidades del plancton han concluido que los orga-nismos del fitoplancton son buenos indicadores de regiones naturales, las cuales están definidas por la latitud y por los procesos dinámicos de los océanos (Braarud et al., 1953 y Smayda, 1958) De tal manera que estos organismos son utiliza-dos para encontrar la relación existente entre las condiciones particulares de cada región y para conocer los cambios que generan las alteracio-nes globales atmosféricas que está experimen-tando nuestro planeta en un tiempo geológico, utilizando información de la micropaleontología de un cierto lugar (Funnell y Riedel, 1971)

I.2.2. Cambio climático global

El fitoplancton contribuye significativamente en los cambios climáticos globales (Jeffrey y Man-toura, 1996) Los organismos fitoplanctónicos presentan una influencia en los procesos quími-cos globales y, por ende, provocan modificacio-nes climáticas globales por diversos mecanismos Existen tres áreas en donde se pueden observar estos mecanismos provocados por el fitoplanc-ton: a) la utilización del dióxido de carbono a través de la fotosíntesis, esto afecta al ciclo del dióxido de carbono global (Williamson y Grib-

63Identificación de algunas especies de fitoplancton mediante sistemas óptico-digitales

bin, 1991); b) contribuyen al calentamiento de la superficie de los océanos (Sathyendranath et al., 1991) por medio de la absorción y dispersión de la luz del sol y c) producción de cantidades de compuestos volátiles (ejemplo: dimetil sulfato) el cual es liberado a la atmósfera y actúa como un efecto de nubes (Cloud-seeding nuclei ) par-ticularmente en el Atlántico norte (Malin et al., 1992)

I.2.3. Contaminación

El fitoplancton proporciona información muy útil para entender el funcionamiento de ecosis-temas con cierto grado de contaminación (Bo-deanu, 1993; Segovia-Zavala et al., 1988; y Enca-lada-Fleites y Millán-Núñez, 1990)

Las aguas residuales domésticas tienen alto contenido de detergentes (Devik, 1976; y Cacho-López, 1992), estos compuestos orgánicos están formados esencialmente de polifosfatos que posteriormente son degradados a ortofosfatos (Snóyeink, 1990), convirtiéndose en uno de los nutrientes primordiales para el desarrollo de po-blaciones fitoplanctónicas (Berger et al., 1989) Se tienen registros de que excesos de ortofosfa-tos generan un crecimiento acelerado del fito-plancton en la zona donde son vertidos, motivo por el cual los fosfatos se han usado como indica-dores para monitorear la contaminación domés-tica (Friligos, 1981)

En las últimas dos décadas, investigadores de diversos países han intentado interpretar los patrones de fluctuaciones bióticas ocasionados por alteraciones ambientales del hombre y así encontrar alguna relación entre las característi-cas físico-químicas del agua y las estructuras fito-planctónicas (Alasaarela, 1979; Thompson y Ho, 1981) Estos autores encontraron que las altas concentraciones de materia orgánica y fosfatos incrementaron los pigmentos fotosintéticos del fitoplancton y presentaron cambios en la estruc-tura taxonómica del fitoplancton (con una mayor dominancia y abundancia) en las zonas afectadas por descargas residuales

Autores como Friligos y Koussouris (1984) y Friligos (1989) han detectado en el mar medite-rráneo algunos géneros dominantes de microal-gas asociadas a descargas de origen doméstico Específicamente señalan a los dinoflagelados

(Gymnodinium sp , Prorocentrum micans, Peri-dinium sp , Ceratium sp.) como indicadores de contaminación, mientras que la abundancia y la diversidad de diatomeas (Chaetoceros sp , Lepto-cylindrus sp , Nitzschia seriata y Skeletonema cos-tatum) son más variables según las condiciones hidrográficas (vilicic et al., 1995)

Existen diversos trabajos en donde se han monitoreado los organismos del fitoplancton como indicadores de desequilibrio ecológico provocado por contaminantes orgánicos e inor-gánicos

I.2.4. Paleoecología

Los microfósiles son considerados de gran im-portancia como herramientas para realizar re-construcciones paleoecológicas debido a que éstos presentan una distribución espacial defini-da por las características físico-químicas del am-biente en el que se desarrollaron, además de que se preservan fácilmente (Dodd y Stanton, 1981)

Las diatomeas son uno de los grupos de microfósiles más importantes en los estudios paleoecológicos Muchas especies presentan rangos específicos de temperatura y salinidad Debido a esto se pueden realizar interpretacio-nes paleoclimáticas y en forma más general in-terpretaciones paleoambientales (Hajós, 1976; y Kiozumi y Tanimura, 1985)

I.2.5. Acuacultura

Las microalgas son un componente fundamental de las dietas de los moluscos bivalvos (ejemplos: ostiones, almejas, etc ), larvas de algunos gastró-podos (abulón), larvas de crustáceos (camarones y langostinos), varias especies de peces de agua dulce, salobre y marina Las microalgas incre-mentan la supervivencia de las larvas de cultivo, son un factor de mejor crecimiento de la larva en el cultivo o actúan como un agente bactericida (Fujimura y Okamoto, 1972; Bernabé, 1976; Co-hen, et al., 1976; Manzi et al., 1977; y Malecha, 1983)

Otros usos de los cultivos de microalgas son: como medicamento en problemas de corazón (Durand-Chastel, 1980), uso de las propiedades de fijación de nitrógeno de las algas verde-azules para inocular los campos de arroz en la India


(venkataraman et al., 1980) y la utilización de las microalgas como complemento alimenticio hu-mano, especialmente en el este de Asia (Soeder, 1976)

I.2.6. Marea roja

Los florecimientos algales masivos de tipo tóxi-co o mareas rojas tóxicas constituyen fenómenos naturales que se han manifestado a lo largo de la historia

Actualmente, este mismo impacto o similar se ha dado por florecimientos masivos de mi-croalgas tóxicas en la acuacultura, pesquerías y salud humana, en ciertas regiones del planeta Hasta la fecha se han registrado aproximada-mente 20,000 casos de intoxicación por ficotoxi-nas, con un porcentaje de mortalidad de 15% (Hallegraeff, 1993)

En la actualidad, los resultados de las inves-tigaciones sobre fitoplancton tóxico, así como de las variables biológicas y ambientales que pro-pician los florecimientos masivos y los estudios de las toxinas, han permitido establecer que de las 26,000 especies de microalgas que compo-nen la diversidad fitoplanctónica en los océanos, 405 son especies formadores de marea roja, 148 de las cuales tienen la capacidad de producir ficotoxinas (Cortés, 1998) La mayoría de estas especies tóxicas están representadas por seis grupos: Cianobacterias, Dinoflagelados, Diato-meas, Raphidophyceae, Chrysophyceae, Prym-nesiophyceae, de los que sobresalen del grupo de dinoflagelados, especialmente a los géneros Prorocentrum, Dinophysis, Amphidinium, Gym-nodinium, Karenia, Gonyaulax, Alexandrum, Ostreopsis, Gambierdiscus y Pyrodinium (Stei-dinger, 1993), la mayoría productores de PSP y brevetoxinas Sin embargo, recientemente se ha comprobado que cuando menos 10 especies de diatomeas producen toxinas como el ácido do-moico, Pseudonitzschia, Nitzschia navis-varingica y Amphora coffeaeformis (Fryxell y Hasle, 2003); flagelados como Prymnesium parvum, P. patelli-forum, Chrysochromulina polylepis, C. leadbeateri (Meldahl et al., 1993 y Meldahl et al., 1995); cia-nobacterias como Oscillatoria erythraea (Hahm y Capra, 1992) y otras 57 especies de agua dul-ce han mostrado una gran variedad de neuro-hepatoxinas (Cronberg et al , 2003) Aunque es

un grupo pequeño, las Rhapidophytas presentan varias ictiotoxinas que han afectado a diversos cardúmenes en todo el mundo

Shumway (1989 y 1990) señala que entre los elementos que desencadenan los florecimientos algales nocivos están el enriquecimiento de nu-trientes en el ambiente marino, el decremento de la presión de pastoreo de la especie en cues-tión, los cambios meteorológicos a gran escala (disminución de la capa de ozono, efecto inver-nadero, el fenómeno de El Niño, entre otros), las surgencias, el aporte de aguas continentales y la incursión al ambiente marino de contaminantes (desechos industriales, domésticos y de la agri-cultura)

En el ámbito mundial las mareas rojas repre-sentan un reto a la salud humana y a las pesque-rías, puesto que es evidente su extensión geográfi-ca y el aumento en la toxicidad de los organismos que la forman (Anraku, 1984; Hallegraeff, 1993; vega, 1989; y Cortés-Altamirano et al , 1995) Internacionalmente se ha escrito mucho sobre las mareas rojas Lo que antes era un fenóme-no raro e impredecible hoy es, en determinadas áreas, muy común y de cierta temporalidad La información de mareas rojas desde el principio del siglo pasado es muy vasta y abarca diferen-tes temáticas, desde descripciones taxonómicas de los microorganismos y efectos del fenómeno hasta el desarrollo y distribución de los eventos con la mayoría de los aportes al medio En 1957 Brongersma-Sanders reúne la mayoría de los casos catastróficos ocurridos mundialmente ha-ciendo una relación con las zonas de surgencias y diferenciando la “agua roja” con y sin morta-lidad masiva, y observa que no son únicamente rojas sino que hay otras coloraciones e incluye casos reportados en el siglo antepasado

Tan grandes han sido los efectos deletéreos producidos por las microalgas nocivas que desde noviembre de 1974 en Boston, Massachussets, se realizó “The First Internacional Conference on Dinoflagellate Blooms” A la fecha se han cele-brado 11 reuniones internacionales en diferen-tes regiones del mundo; la última, 12th Interna-cional Conference on Harmful Algae, se llevó a cabo del l3 al 18 de septiembre de 2006 en Co-penhague, Dinamarca En ellas se analiza y dis-cute lo más sobresaliente de las investigaciones plasmadas en memorias, ya no sólo de dinoflage-


lados sino de todas las microalgas que producen toxinas

En 1990, Shumway describe los efectos pro-ducidos por los florecimientos masivos de mi-croalgas en la acuicultura de moluscos bivalvos; estos efectos han causado que zonas en donde se explotaba la almeja desaparezcan y, por lo tanto, afecten a la economía de la industria del marisco La magnitud de este efecto económico en Nueva Jersey (eu) fue de 430 millones de dólares

En 1993 los estudios reportados por Ha-llegraeff han permitido conocer el aumento en la frecuencia, intensidad y duración de las ma-reas rojas Menciona que las mareas rojas han aumentado debido a que los organismos forma-dores de mareas rojas (quistes resistentes) son transportados por medio del agua de lastre de los barcos de un lugar a otro Es decir, que la descarga de esta agua en lugares en donde las condiciones son óptimas para que los organis-mos florezcan ha propiciado el aumento en las frecuencias y distribución geográfica de las ma-reas rojas Concluye que no hay duda que el de-terioro ambiental causado por el aumento de la población humana en las costas y sus descargas de aguas negras, así como la proliferación de la acuicultura —cuyas aguas de desecho son alta-mente fertilizadas— están, por lo menos en par-te, desequilibrando el medio estuarino, ayudado por las desforestaciones de mangles

Cortés-Altamirano (1998) menciona que po-siblemente exista una relación actual en el cam-bio climático global provocado por el fenómeno de El Niño, el efecto invernadero y la depleción del ozono como responsables de alguna influen-cia en los eventos de marea roja en las diferentes costas del mundo México no ha estado al mar-gen de esto El amplio desarrollo turístico y la constante proliferación de granjas acuículas han ocasionado que las zonas costeras sean presas de la eutrificación, favoreciendo un medio propicio para el desarrollo de las mareas rojas Dada la importancia del estudio de las mareas rojas, se requiere tener un sistema de monitoreo conti-nuo para determinar cuál es la frecuencia de este fenómeno en las costas mexicanas y su grado de toxicidad de la misma, así como su impacto en el ecosistema

Los registros de marea roja en México se han presentado en su mayoría en zonas turísticas y

en donde se ha dado el desarrollo potencial de la acuicultura Una buena revisión sobre estos registros la han presentado Cortés-Altamirano et al. (1998)

El principal problema para tener un mejor control y poder prevenir catástrofes —como mortandades humanas o pérdidas económicas en las pesquerías, provocada por los efectos de la marea roja— es un constante monitoreo en zo-nas claves Para poder sostener proyectos de in-vestigación en donde el monitoreo sea continuo, es de suma importancia el desarrollo de técnicas de cuantificación y cualificación automatizadas de estas especies

II. ¿Cuáles son las ventajas del uso de los patrones de difracción en los sistemas de identificación automatizados?

Actualmente, un tema de gran interés para la comunidad científica es cómo desarrollar un sis-tema de monitoreo automático de organismos formadores de mareas rojas Los avances en los sistemas para realizar el monitoreo automatiza-do han demostrado que sí se puede lograr esta automatización Sin embargo, existen problemas clave, que afectan los resultados en la correcta identificación y cuantificación de los organis-mos: fondo de la imagen (detritus, burbujas, in-tensidad de iluminación del microscopio), varia-ción de sedimentación de la célula en el campo de observación, variación morfológica natural de la especie en una muestra, problema de similitud ínter-específicos entre dos especies, organismos fragmentados comparados con organismos ente-ros

El problema de identificar el fitoplancton con mayor eficiencia, velocidad y con el mismo error de identificación es difícilmente solucio-nado, debido a la experiencia que deben poseer los especialistas para esta práctica Así, los in-vestigadores que estudian al fitoplancton se han preocupado por desarrollar nuevas técnicas que permitan identificar a estos organismos con una mayor facilidad

El presente capítulo retoma la técnica de los patrones de difracción —proporcional al módulo cuadrado de la transformada de Fourier (conte-nido de frecuencias de una imagen)— para iden-


tificar cinco especies de fitoplancton del género Ceratium, con la finalidad de realizar un análisis mucho más profundo en la aplicabilidad de la técnica (Pech Pacheco et al., 1999) El objetivo es cuantificar, mediante la correlación de los pa-trones de difracción de las imágenes, cada uno de los problemas que se presentan en el recono-cimiento de las especies, como son: iluminación, detritus, posición de sedimentación de la célula, variación natural de los organismos de una espe-cie en una muestra de agua de mar de una loca-lidad y la variación en la identificación cuando el organismo viene segmentado

El primer objetivo particular es determinar los índices de correlación entre los patrones de difracción de las imágenes ( )2

1R y entre las imáge-nes directamente ( )2

2R La hipótesis es que 22

21 RR >

El cumplimiento de esta hipótesis dará como fundamento el usar o no usar los patrones de di-fracción en un sistema de identificación automá-tica de especies fitoplanctónicas

El segundo objetivo particular es determi-nar la asociación de las especies entre un mismo subgénero mediante los patrones de difracción( )1A y entre las imágenes directamente ( )2A La hipótesis es que 21 AA >

El tercer objetivo particular es determinar los índices de correlación de los patrones de di-fracción entre las especies de un mismo subgé-nero ( )2

...1abcpdR y entre otro subgénero ( )2...2abcpdR

La hipótesis es que ( ) ( )2...2

2...1 abcpdabcpd RR > cuando un

subgénero ( )1pd en particular es analizado Por otra parte, las especies del fitoplancton

que están compuestas de placas, cuando son co-lectadas por red o filtradas, pueden fragmentarse debido a su fragilidad Ya que estos organismos estaban vivos al momento de la colecta deben ser cuantificados Así, el cuarto objetivo particular es determinar los índices de correlación entre los patrones de difracción de las imágenes ( )2

1FR y entre las imágenes directamente ( )2

2FR , cuando estas especies están fragmentadas La hipótesis es que ( ) ( )2

22

1 FF RR < El cumplimiento de esta hipó-tesis dará a conocer qué fracción de la célula ca-racteriza mejor la especie

II.1. Especies analizadas del género Ceratium

Se analizaron seis especies del género Ceratium, comprendidas en tres subgéneros: Ceratium,

Tripoceratium y Amphiceratium (Balech, 1988; Sournia, 1986)

Las especies del subgénero Ceratium son Ceratium furca (Ehrenberg) (Balech, 1988: 131, placa 59, figuras 4-6) y Ceratium pentagonum (Gourret) (Balech, 1988: 129, placa 56, figuras 15 y 16) (figura 1)

Ceratium furca Ceratium pentagonum

Figura 1.

Ceratium furca Ceratium pentagonum

Figura 1.

Figura 1. Especies del subgénero Ceratium.

Estas especies se caracterizan por tener la epiteca con un cuerno apical; ambos cuernos an-tapicales son rectos y dirigidos hacia atrás, para-lelos o poco divergentes; uno de estos cuernos es menor que el otro La diferencia entre estas dos especies es que en C. furca la epiteca disminuye gradualmente, prolongándose con la parte api-cal del organismo Los bordes de la epiteca son rectos o ligeramente cóncavos y los cuernos an-tapicales están bien desarrollados En cambio en C. pentagonum existe una diferenciación entre la epiteca y el cuerno apical y el cuerpo presenta una forma pentagonal

Las especies del subgénero Tripoceratium son: Ceratium macroceros (Ehrenberg) (Balech, 1988, placa 5, figura 10), Ceratium tripos (O F Muller) (Balech, 1988: 138, placa 58, figuras 1-6) y Ceratium dens (Ostenfeld y Schmidt) (Balech, 1988: 197, placa 69, figuras 3, 4 y 5) (figura 2)

Ceratium tripos Ceratium macroceros Ceratium dens Figura 2.

Figura 2. Especies del subgénero Tripoceratium.


Este subgénero se caracteriza por una célula con epiteca con cuerno apical, células no fusifor-mes, los cuernos antapicales de igual o diferente longitud, la base de éstos es recta y forma con la parte posterior de la epiteca una superficie cón-cava, y si los cuernos antapicales dirigidos están hacia atrás y hacia afuera entonces es la especie C. macroceros C. tripos, en cambio, tiene base convexa, los cuernos antapicales no siguen el contorno del cuerpo, el cuerno apical sin apéndi-ces o con éstos muy pequeños, los antapicales en forma curvada y después rectos y generalmente terminan paralelamente con el cuerpo apical o divergiendo de éste Y C. dens, que muestra un cuerpo de forma y proporciones variadas, a ve-ces netamente más alto que ancho pero en oca-siones el ancho es igual o excede el alto Esta especie está caracterizada por sus cuernos anta-picales que se dirigen hacia afuera, sin curvarse sensiblemente hacia adelante como en tripos y en otras especies del subgénero Tripoceratium Ge-neralmente el desarrollo de esos cuernos es ne-tamente diferente de uno respecto al otro aun-que en ocasiones la diferencia es muy pequeña: ambos, sobre todo el derecho, pueden reducirse extremadamente hasta hacerse rudimentarios

El tercer subgénero analizado fue Amphice-ratium y la especie representante fue Ceratium fusus (Ehrenberg) (Balech, 1988: 132, placa 54, figuras 5, 6 y 8) (figura 3)

la epiteca no dilatada y uno de los antapicales au-sente o rudimentario

Cinco especies fueron colectadas mediante una red cónica de la bahía Todos Santos, Ense-nada, B C , México; entre 31°41’ y 31°56’ de la-titud norte, y 116°34’ y 116°51’ de longitud oeste (C. furca, C. pentagonum, C. macroceros, C. tri-pos y C. fusus) y la especie C. dens fue colectada en Mazatlán, Sin , México entre 23°11’ y 23°15’ de latitud norte, y 106°25’ y 106°29’ de longitud oeste Estas muestras de red fueron preservadas al 4% formaldehído y neutralizado con borato de sodio (Throndsen, 1978) Una sub-muestra de 0 30 ml fue tomada de la muestra de red y co-locada en 0 70 ml de agua limpia en una cámara Sedgwick-Rafter La cámara fue colocada en el microscopio de luz para obtener las imágenes

II.2. Digitalización de las imágenes

Las imágenes fueron tomadas con un sistema di-gital Photometrics Star I El cual consiste de una cámara CCd (Charge-Coupled Device) con reso-lución de 384x576 píxel y grabada y digitalizada en una computadora Mc Intosh IIcx usando el sistema Star I, con una interfaz IEEE-488 de la National Instruments NB-GPIB NuBus board y el programa IPlab Spetrum™ Todas las imáge-nes fueron de un tamaño de 256 x 256 píxeles para su edición y procesamiento

II.2.1. Procesado de imágenes

II.2.1.1. Problema de ruido de fondo debido a detritus y a intensidad de iluminación

De 30 imágenes de 10 organismos de C. furca se procedió a realizar tres condiciones de fondo Diez de intensidad normal (tomada automática-mente por medio de un dispositivo de la cámara de video) y con presencia de detritus (condición original, O); diez imágenes en donde se quitó el detritus y se varió la intensidad luminosa hasta encontrar una imagen clara (condición A) y diez imágenes en donde se varió la intensidad has-ta encontrar una imagen obscura y contrastada (condición B) Las imágenes y sus patrones de difracción fueron correlacionados y estadística-mente agrupados

Ceratium fusus

Figura 3.

Figura 3. Especie del subgénero Amphiceratium.

Caracterizado por organismos con epiteca con cuerno apical, células largas y estrechas, de aspecto fusiforme, sólo uno de los cuernos anta-picales desarrollado, C. fusus presenta el cuerno apical recto o ligeramente curvado hacia un lado,


II.2.1.2. Problemas intra-específicos

El estudio de los problemas intra-específicos analizados para las dos especies (C. furca y C. dens) dorsal versus ventral, fueron: a) Sí había diferencia significativa Fueron com-

parados los resultados obtenidos de las co-rrelaciones de las imágenes y de las correla-ciones de los patrones de difracción de los organismos que presentan una cara ventral versus dorsal Sólo se eligieron los organis-mos que fueron encontrados en estas dos po-siciones, ya que cuando se sedimenta una co-lumna de agua, el 98% de estos organismos cae en cualquiera de estas dos posiciones (este resultado está basado en la observación realizada previamente antes del experimen-to de 1,000 organismos tomados de diferen-tes muestras de agua de mar, datos no pu-blicados) En este análisis se procesaron 16 imágenes de organismos en vista dorsal y 24 imágenes de organismos en vista ventral

b) Se analizó el grado de variación natural de cada especie usando las correlaciones de las imágenes de los organismos y las correlacio-nes de los patrones de difracción de las imá-genes En este proceso se analizó una muestra de agua de mar, en donde se seleccionaron un conjunto de 200 campos del microscopio en forma aleatoria En cada campo se obtuvo la imagen del organismo presente En total se obtuvieron 100 organismos de C. furca y 100 organismos de C. dens Se calculó el patrón de difracción de cada imagen Posteriormente se correlacionaron por separado las imágenes y los patrones de difracción y fueron agrupados por el método del vecino más cercano

II.2.1.3. Problemas ínter-específicos

Con doscientos organismos, 100 de cada una de las dos especies, se procedió a correlacionar las imágenes y, por separado, sus patrones de di-fracción Posteriormente se agrupó cada uno de los resultados en dendrogramas

De las seis especies se seleccionó una imagen de un organismo de cada una para observar la discriminación ínter-específica de las imágenes y de los patrones de difracción Posteriormente se obtuvo la correlación de las imágenes y la de los

patrones de difracción, estos dos fueron agrupa-dos por separado

II.2.1.4. Identificación de las especies usando células fragmentadas

Para observar el efecto de especímenes fragmen-tados se procedió a seleccionar seis organismos, uno de cada especie Estos organismos se bina-rizaron de tal forma que solamente fuera 255 el valor del píxel dentro de cada imagen del orga-nismo y 0 para el píxel fuera de ella Cada ima-gen representante de cada especie se le procedió a fragmentar de la siguiente manera:

Caso 0 Imagen completa (imagen original) Caso I A la imagen original se le segmentó el

cuerno antapical derecho Caso II A la imagen original se le segmentó el

cuerno antapical izquierdo Caso III A la imagen original se le segmentó el

cuerno apical Caso Iv A la imagen original se le segmentó la hi-

poteca Caso v A la imagen original se le segmentó la

epitecaCaso vI De la imagen original se eliminaron los

dos cuernos antapicales

II.2.1.5. Comparación de los fragmentos de las seis especies intra e ínter-específicamente

Para observar la variación intra e ínter-específica de cada fragmento de las especies, se realizaron las correlaciones de las imágenes y de los pa-trones de difracción Con el fin de que por me-dio del análisis estadístico se puedan comparar los casos del I al v con el caso 0 Se realizó la comparación de los seis casos de las seis espe-cies todos contra todos La última comparación fue seleccionando sólo los casos que tienen una importancia biológica, es decir, que pueden ser contados como un individuo, estos casos fueron: caso 0, caso I, caso II, caso III y caso vI

II.2.1.6. Algoritmos usados y prueba estadística

La transformada rápida de Fourier de cada imagen se realizó en una computadora Origin 2000 de la Silicon Graphic con 10 procesadores


R10000 de 195 Mhz y una memoria principal de 1280 Mbytes con sistema operativo IRIS 6 4 El tiempo de procesamiento para una matriz de 256 x 256 datos fue de 100 ms

Las correlaciones fueron realizadas en la mis-ma computadora por medio del algoritmo com-putacional descrito por Peón y Álvarez-Borrego (1990) El tiempo de procesamiento de cada co-rrelación fue de 500 ms

A cada grupo de correlaciones (imágenes y patrones de difracción) se les aplicó un aná-lisis estadístico multivariado de agrupación Este análisis agrupa correlaciones que tengan ciertas similitudes en sus valores y los separa de las correlaciones que no las tienen Los re-sultados de las agrupaciones son las distancias entre cada grupo de correlaciones similares A esto se le llama distancia de unión La dis-tancia usada fue la euclidiana, que matemáti-camente es expresada de la siguiente manera:

jHIHJHHIKH DDDDD ,,,, 5.05.05.0 −−+= , donde D es la distancia existente entre dos agrupaciones, H y K son los grupos de datos y J e I son los datos La técnica usada para unir los grupos de valores de correlación fue la del vecino más cercano, que es la distancia más pequeña entre dos elementos de grupos diferentes Esta técnica se empleó en este estudio ya que es la forma más simple de realizar dendrogramas de agrupaciones, sin manipular de una manera más compleja las agrupaciones de los datos

Este proceso se realizó en una computadora PC Pentium MMx de 233 Mhz con 32 Mbytes de memoria principal y con un programa comercial de nombre STATISTICA® para WINDOWS®, los resultados se presentan en forma de dendro-grama, los cuales muestran los grupos de corre-laciones en el eje de las x y en el eje de las y las distancias de unión existentes entre cada grupo Para un mejor entendimiento de la técnica esta-dística, véase Zupan (1982)

II.3. Resultados y discusiones

De un total de 718 organismos pertenecientes a las seis especies del género Ceratium, se obtuvie-ron: 718 imágenes y sus respectivos patrones de difracción Los problemas que se analizaron fue-ron los siguientes:

II.3.1. Problema del ruido de fondo

En la figura 4 se muestran en (a) las diferentes condiciones de fondo que fueron examinadas y descritas en la metodología como (O) la con-dición original, (A) imagen clara y (B) imagen contrastada

O A B

(a)

(b)

0

0.5

1

1.5

2

2.5

3

BBBBBBBBBBAOAOAOAOAOOAOAAOAOAO (c)

Figura 4.

Figura 4. Resultados del análisis con respecto al problema de fondo de la imagen: (a) condiciones de fondo, (b) den-drograma de imágenes y (c) dendrograma de patrones de difracción.

En el tratamiento de las imágenes (figura 4b) se observa que la condición original (O) y la con-dición (A), son iguales a un 0 78 de distancia de unión Sin embargo las tres condiciones de fondo son agrupadas a una distancia de 2 98 Lo que indica que el fondo es una variable importante cuando se correlacionan las imágenes Se nota que la cantidad de detritus afecta en la unión de las condiciones de fondo


En el caso de este análisis, la cantidad de de-tritus encontrada en las imágenes fue de menor a 50% de la cobertura del total de la imagen Sin embargo, el mayor efecto en las diferentes condi-ciones de fondo fue la intensidad de iluminación En la condición (B), en la cual las condiciones de luz y contraste fueron extremas, se observa que la distancia de unión aumenta 4 5 veces más que el efecto de detritus y la poca intensidad de fondo que es la condición (A) comparada con la condición original (O)

En cambio en donde se agrupa a las correla-ciones de los patrones de difracción (figura 4c), se observa que el efecto de las tres condiciones de fondo tratadas en este trabajo presentaron una distancia de unión máxima de 0 48; sólo 16% de la máxima distancia de unión encontrada en las imágenes También se observa que el detritus y la condición de iluminación clara (condición A) sólo afectaron en una distancia máxima de 0 26 (me-nos de 50% de lo encontrado en las imágenes)

Por lo tanto se puede decir que sí existe una diferencia significativa entre los dos resultados, siendo 84% menor el efecto del ruido de fondo en los patrones de difracción que en las imágenes

II.3.2. Problemas intra-específicos

II.3.2.1. Problema en la posición de sedimentación de los organismos

En la figura 5 se observa el efecto de la posición de sedimentación en 40 organismos de C. dens, es decir vista ventral o dorsal (figura 5a) En la figura 5b se presenta un dendrograma de agru-pamiento de las correlaciones de las imágenes A 0 41 de distancia de unión se observa que no existe una diferencia entre las diferentes vistas de sedimentación en un grupo de 27 organismos Sin embargo, observamos que 13 organismos que presentaron una vista ventral difieren del grupo anteriormente mencionado en una distancia de unión igual a 0 74 Lo que indica que existe una fuerte variación en las correlaciones debido a los siguientes factores: a) sedimentación, b) ilumi-nación, c) variación morfológica y d) detritus En este caso, del total de organismos analizados, 60% (24 organismos) presentaron la vista ven-tral en la imagen y 40% (16 organismos) la vista dorsal en las imágenes

En cambio, en los patrones de difracción los efectos antes mencionados no causaron un efec-to significativo en las agrupaciones (figura 5c), ya que sólo presentaron una distancia de unión de 0 23 (que es igual a 27% del error que fue encontrado en las imágenes) y la diferencia en-contrada entre el valor máximo y mínimo en la distancia de unión fue de 0 02%, el cual es des-preciable Por lo tanto, existe una diferencia sig-nificativa entre los dos resultados

Además, por medio de los patrones de di-fracción es posible identificar una especie usan-do cualquiera de las dos posiciones de sedimen-tación

II.3.2.2. Problemas de la variación natural morfológica

Con el fin de evaluar la variación natural de la morfología de cada especie que se presenta en diferentes muestras de agua de mar, la figura 6

Vista dorsal (D) Vista ventral (V)

(a)

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

VVVVVVVVVVD

VVDDDDDD

VVVVD

VVVDDDDDDDD

VVVVV

(b)

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

VVDDDD

VDD

VDD

VD

VD

VVDDD

VVVVDD

VVVVVVVVVVVVV

(c)

Figura 5.

Figura 5. Resultados del análisis del problema de sedimenta-ción de los organismos. (a) condiciones de sedimentación de los organismos, (b) dendrograma de imágenes y (c) dendro-grama de patrones de difracción.


muestra los resultados de las diferentes agrupa-ciones de imágenes y de patrones de difracción de 100 organismos de C. furca (figura 6a y b) y 100 organismos de C. dens (figura 6c y d) Para las dos especies los resultados fueron similares

En las agrupaciones de las correlaciones de las imágenes (figura 6a y figura 6c) se observa que sí existe un efecto en la distancia de unión en las correlaciones Lo que indica que existen diferentes formas morfológicas que pueden ser agrupadas como variación tipo morfológica na-tural (de 4 a 5 formas en una distancia de unión de 0 3) y una marcada variación de formas a una distancia de 0 98 para C. furca (figura 6a) y 0 96 para C. dens (figura 6c)

En las agrupaciones de las correlaciones de los patrones de difracción se muestra que a una distancia de unión de 0 23 no existe variación morfológica en los organismos de C. furca (fi-gura 6b) y C. dens (figura 6d) Por lo tanto, se puede decir que cualquier organismo de los 100 analizados que se usan como organismo tipo de estas dos especies puede identificar a los cien or-ganismos de cada especie si se usan los patrones de difracción En cambio, si se utilizan las imáge-nes se tendrían que necesitar de 4 a 5 organismos tipos para identificar a estos cien organismos de la misma especie, esto para las dos especies

Las variaciones de la morfología son uno de los problemas que presentan más grande ruido en un sistema de procesamiento automático Se puede concluir que las variaciones morfológicas de los organismos son importantes en las corre-laciones de imágenes pero no tienen el mismo impacto en las correlaciones de los patrones de difracción Así, la identificación es más precisa en sus resultados si se utilizan los patrones de di-fracción, que los resultados obtenidos utilizando las correlaciones de imágenes

II.3.3. Problemas ínter-específicos

II.3.3.1. Discriminación de dos especies con 200 organismos de C. furca y C. dens

En la figura 7 se observan los resultados obte-nidos en las agrupaciones de las correlaciones de doscientos organismos, 100 de C. furca y 100 de C. dens. Esto con el fin de observar el poder de discriminación de estos dos procedimientos (imágenes y patrones de difracción) cuando se trata de comparar 200 imágenes de dos especies diferentes

En la figura 7a se observa el procedimiento cuando se usan las correlaciones de las imágenes

Cien imágenes 0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

Cien patrones de difración 0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

(a) (b)

Cien Imágenes 0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

Cien patrones de difracción 0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

(c) (d) Figura 6.

Cien imágenes 0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0


0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

(a) (b)

Cien Imágenes 0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0


0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

(c) (d) Figura 6.

Cien imágenes 0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0


0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

(a) (b)

Cien Imágenes 0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0


0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

(c) (d) Figura 6.

Cien imágenes 0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0


0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

(a) (b)

Cien Imágenes 0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0


0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

(c) (d) Figura 6.

Figura 6. Resultados del análisis del problema de la variación natural de la morfología de las especies. Para C. furca: (a) dendrograma de imágenes y (b) dendrograma de patrones de difracción; para C. dens: (c) dendrograma de imágenes y (d) dendrograma de patrones de difracción.


Existen varios grupos de imágenes que se aso-cian a un mismo valor de unión y también existen grupos de imágenes que están asociados a dife-rentes distancias de unión, siendo la máxima de un valor de 2 52 Estas combinaciones pueden ser un factor de confusión en los resultados

En cambio, en los patrones de difracción (figura 7b) cuando se agrupan sus correlaciones observamos solamente dos grupos que presen-tan una distancia de unión de 0 43, cada grupo representa a 100 organismos de cada especie Además en esta misma gráfica se muestra que la variación intra-específica de cada especie es de 0 2 a 0 3 como máximo Lo que indica que en los patrones de difracción se observa una fuer-te discriminación entre organismos de especies diferentes y una fuerte asociación entre organis-mos de la misma especie que facilita una identi-ficación correcta del organismo de interés Con-trario a lo obtenido en los resultados basados en las imágenes

está representada por tres letras La primera le-tra está representada por el subgénero que per-tenece la especie (C = Ceratium, T = Tripoce-ratium y A = Amphiceratium), la segunda letra representa a la letra inicial de la especie (F = furca, P = pentagonum, M = macroceros, T = tripos, D = dens y F = fusus) y la tercera letra representa a la imagen de la especie entera (0 = especie entera)

En la figura 8b se muestran las agrupaciones de las correlaciones de las imágenes y en la figu-ra 8c las agrupaciones de las correlaciones de los patrones de difracción En la figura 8b se obser-va que la máxima distancia de unión alcanzada es de 0 55 y además existe una confusión en la agrupación de cada subgénero, que se muestra con barras horizontales colocadas en la parte su-perior de cada gráfica

La barra con líneas verticales representa al subgénero Ceratium (CFO = C. furca y CPO = C. pentagonum), las de líneas horizontales repre-senta al subgénero Tripoceratium (TMO = C. macroceros, TTO = C. tripos y TDO = C. dens) y las de líneas cruzadas representan al subgéne-ro Amphiceratium (C. fusus (AFO)) Se observa que la barra de Tripoceratium abarca 83 33% de las especies analizadas, confundiéndose en la agrupación dos especies ajenas a este subgénero, de la misma forma el subgénero Ceratium abar-ca tres especies, confundiéndose una especie de otro subgénero; también observamos que el subgénero Amphiceratium se encuentra agrupa-do dentro del subgénero Tripoceratium

En cambio en la figura 8c se observa una dis-tancia de unión de 0 77 que es 40% más grande que las imágenes, dando así una mejor discrimi-nación entre las especies; además se nota que, de acuerdo a las barras horizontales, que no existe ningún problema de traslape en los tres subgéne-ros, por lo tanto se puede decir que los patrones de difracción presentan una buena discrimina-ción ínter-específica con respecto a los subgéne-ros y una fuerte asociación intra-específica entre las especies del mismo subgénero

La diferencia entre el poder de discrimina-ción de las seis especies del género Ceratium de los dos resultados es significante en 60% de di-ferencia, lo que da un poder de discriminación a los patrones de difracción 40% mayor que en las imágenes Esta cualidad es un factor importante

C. dens C. furca 0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

3.0

(a)

C. dens C.furca 0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

3.0

(b)

Figura 7.

Figura 7. Resultados del análisis del problema ínter-específi-cos de dos especies: C. furca y C. dens. (a) dendrograma de imágenes y (b) dendrograma de patrones de difracción.

II.3.3.2. Discriminación de seis especies del género Ceratium

En la figura 8a se observan las imágenes de las seis especies del género Ceratium Cada imagen


en el sistema de identificación de dichas espe-cies

de cada especie La nomenclatura usada fue simi-lar a la descrita anteriormente en la figura 8a, sólo que para representar cada caso la tercera letra se varió dependiendo del número del caso corres-pondiente (0, 1, 2, 3, 4, 5, y 6, véase figura 9)

En la figura 10a se presenta la comparación del caso I con respecto a la imagen original de cada especie En la gráfica de la izquierda se muestran las agrupaciones de las correlaciones de las imágenes y en la gráfica derecha las dadas por los patrones de difracción Se observa que las imágenes presentan una mejor asociación entre el caso I y la imagen original de cada es-pecie, pero una menor discriminación entre las especies; además, existen problemas en las agru-paciones en las especies de cada subgénero En el caso de los patrones de difracción aunque pre-sentan una mejor asociación entre el caso I y la imagen original de cada especie, ésta es buena ya que presentan un 0 2 de distancia de unión, ade-más se observa que existe una mayor discrimina-ción entre las especies de 0 28 y una excelente asociación de 0 11 de distancia de unión entre las especies de cada subgénero

En la figura 10b están representadas estas agrupaciones de correlación para el caso II y la imagen original de cada especie Se presenta un comportamiento similar al descrito para el caso I Sin embargo, los patrones de difracción (dere-cha) presentan una discriminación entre las espe-cies mayor de 0 3 de distancia de unión, compa-rada con las imágenes (izquierda) que presentan una discriminación menor de 0 3 de distancia de unión para la mayoría de las especies

En la figura 10c se observa el comportamien-to para el caso III y la imagen original En esta

CF0 CP0 TM0 TT0 TD0 AF0

(a)

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

TMO AFO

TTO CPO

TDO CFO

(b)

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

TTO TMO

TDO AFO

CPO CFO

(c)

CF0 CP0 TM0 TT0 TD0 AF0

(a)

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

TMO AFO

TTO CPO

TDO CFO

(b)

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

TTO TMO

TDO AFO

CPO CFO

(c)

Figura 8. Resultados del análisis del problema ínter-especí-ficos de seis especies: (a) especies contempladas y su no-menclatura, (b) dendrograma de imágenes y (c) dendrogra-ma de patrones de difracción.

II.3.4. Problemas con organismos fragmentados de las seis especies del género Ceratium

II.3.4.1. Condiciones de fragmentación de las especies

En la figura 9 se presentan los diferentes casos que se usaron para analizar los problemas con organismos fragmentados Los casos son: ima-gen original o entera (0), caso I sin el cuerno antapical derecho (1), caso II sin el cuerno anta-pical izquierdo (2), caso III sin el cuerno apical (3), caso Iv solamente la parte apical (4), caso v solamente la parte antapical (5) y el caso vI que presenta a la especie pero sin los dos cuernos an-tapicales (6) Cada caso fue analizado con res-pecto a la imagen original y también se observó la variación intra-específica e ínter-específica de cada fragmento analizado

En la figura 10 (a, b, c y d), se observan cua-tro condiciones de comparación de especies frag-mentadas con respecto a los organismos enteros

Figura 8.

Original Caso I Caso II Caso III Caso IV Caso V Caso VI (O) (1) (2) (3) (4) (5) (6) Figura 9.

Figura 8.

Original Caso I Caso II Caso III Caso IV Caso V Caso VI (O) (1) (2) (3) (4) (5) (6) Figura 9.

Figura 9. Imágenes de cada fragmentación, según el caso.


comparación, las imágenes (izquierda) no pre-sentan una fuerte asociación entre las del caso III y las originales de cada especie Además no existe una buena asociación entre las imágenes de las especies del mismo subgénero, confun-diendo la imagen original de la especie C. dens (TDO) perteneciente al subgénero Tripocera-tium con las especies del subgénero Ceratium (CF3 = C. furca, caso III y CP3 = C. pentago-num, caso III) En cambio, en los patrones de difracción (derecha) sí existe un incremento en

la distancia de unión entre el caso III y la especie entera, pero no difiere mucho de las asociacio-nes de los casos anteriores Además en este caso sí presentan una fuerte asociación entre las es-pecies de cada subgénero (distancia de unión < 0 4) y una discriminación mayor que 0 28 entre los subgéneros

En la figura 10d se presentan las compara-ciones de los casos Iv y v, que son cuando el organismo presenta la parte apical —caso Iv, (4)— y la parte antapical —caso v, (5)— de la

Figura 10. Resultados de la comparación intra-específicas de los cinco casos vs. el original: (a) caso I, (b) caso II, (c) caso III, (d) casos Iv y v.

Imágenes Patrones de difracción

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

T

M1

T

MO

A

F1

A

FO

T

T1

T

TO

C

P1

C

PO

T

D1

T

DO

C

F1

C

FO

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

T

M1

T

MO

A

F1

A

FO

T

T1

T

TO

T

D1

T

DO

C

P1

C

PO

C

F1

C

FO

(a)

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

T

M2

T

MO

A

F2

A

FO

T

T2

T

TO

C

P2

C

PO

T

D2

T

DO

C

F2

C

FO0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

T

M2

T

MO

A

F2

A

FO

T

T2

T

TO

C

P2

C

PO

T

D2

T

DO

C

F2

C

FO

(b)

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

T

M3

T

MO

A

F3

A

FO

T

T3

T

TO

T

D3

C

P3

C

PO

T

DO

C

F3

C

FO

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

TM

3

T

MO

A

F3

A

FO

T

T3

T

TO

T

D3

T

DO

C

P3

C

PO

C

F3

C

FO

(c)

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

T

M5

T

M4

T

MO

A

F5

AF4

A

FO

TT4

T

T5

TD

5

CP

5

TTO

C

P4

C

F5

TD

4

CF4

T

DO

C

PO

C

FO

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

T

M5

T

M4

T

MO

A

F5

AF4

A

FO

CF5

C

P4

T

T4

TD

5

TT5

C

P5

C

F4

TD

O

TD

4

TTO

C

PO

C

FO

(d)

Figura 10.

Patrones de difracción


especie comparada con la imagen entera de la especie En las imágenes (izquierda) se observa una menor discriminación que en los patrones de difracción: de 0 59 En cambio, para los pa-trones de difracción (derecha) el valor es de 0 73 de distancia de unión En las imágenes se pre-senta confusión en el agrupamiento de los casos con respecto a cada imagen entera de la mayoría de las especies También en los patrones de di-fracción se observa este comportamiento, lo que indica que cuando la especie viene fragmentada en estos casos es muy difícil su identificación; sin embargo cuando en una muestra vienen las especies a este grado de segmentación, biológi-camente no se cuentan como un individuo vivo Los patrones de difracción muestran que cuando el individuo está fragmentado en estos casos los asocia a una distancia mayor a 0 3 de distancia de unión y no existe una discriminación entre ellos, dando así un resultado de no-identificación de estas partes de la especie

De esta sección se concluye que los patrones de difracción no podrán asociar fragmentos de otras especies con la de interés, dado a su alto poder discriminatorio En cambio, los fragmen-tos que son del caso I y caso II presentan una importante característica en la identificación de estas especies, ya que ellos no son fácilmente re-conocidos por los otros fragmentos Se observó que los cuernos antapicales son la principal ca-racterística para reconocer a estas especies

II.3.4.2. Problemas con las seis especies fragmentadas

II.3.4.2.1. Correlación de los seis casos de fragmentación

En la figura 11 se presentan las agrupaciones cuando se correlacionan los seis casos de seg-mentación de las seis especies La nomenclatura de este análisis para cada especie fue la siguien-te: una letra que identifica a la especie y nume-rada del 0 al 6 que identifica a los casos, la letra (A) fue para la especie C. furca, la letra (B) para C. pentagonum, la letra (C) para C. macroceros, la letra (D) para C. tripos, la (E) para C. dens y (F) para C. fusus

En la figura 11a se presentan las imágenes y en la figura 11b los patrones de difracción

esta especie que con los demás fragmentos de las otras especies Para la especie B (C. pentagonum) en los dos tratamientos se agruparon los mismos fragmentos (B0, B1, B2 y B6) En esta especie se tuvo problemas con el fragmento B3 que repre-senta a la especie sin el cuerno antapical que se confundió con el mismo caso (E3) de la especie E (C. dens)

También se observa la consistencia de una mayor discriminación entre estos fragmentos con respecto a los demás en los patrones de difrac-ción; en el caso de la especie D (C. tripos) sí exis-tió una mejor asociación entre sus fragmentos en

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

C

4

C5

C

3

C6

C

2

C1

C

O

F5

F

3

F4

F

6

F2

F

1

FO

D

4

D5

E

5

D3

B

5

E3

B

3

B6

B

2

B1

B

O

A5

B

4

D6

D

2

D1

D

O

E4

A

4

E6

E

2

E1

E

O

A3

A

6

A2

A

1

AO

(a)

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

C

5

C3

C

4

C6

C

2

C1

C

O

F5

F

3

F4

F

6

F2

F

1

FO

D

4

B4

A

5

E5

B

5

A4

E

3

B3

B

6

B2

B

1

BO

D

5

E4

D

3

D6

D

2

D1

D

O

E1

E

6

E2

E

O

A3

A

6

A2

A

1

AO

(b)

Figura 11.

Figura 11. Resultados de la comparación intra e ínter-específi-cas de los fragmentos de las seis especies: (a) dendrograma de imágenes y (b) dendrograma de patrones de difracción.

En ambos tratamientos la distancia máxima de unión fue casi la misma —0 76 para las imáge-nes (figura 11a) y 0 77 para los patrones de di-fracción (figura 11b)— En los dos tratamientos no existieron problemas en la asociación de los fragmentos de la especie de C. macroceros (C0…C6) y en los fragmentos de la especie C. fusus (F0…F6) De la misma manera se asociaron los mismos fragmentos de la especie C. furca, estos fueron A0, A1, A2, A6 y A3, teniendo el mismo problema de no asociar correctamente los casos en donde la especie viene fragmentada a la mi-tad (casos 4 y 5)

Además, los patrones de difracción presen-taron mejor discriminación de los fragmentos de


los patrones de difracción que en las imágenes, ya que los patrones de difracción asociaron a los fragmentos de los casos 0, 1, 2, 3, y 6 En cambio las imágenes sólo asociaron a los fragmentos 0, 1, 2, y 6 de esta especie Además se nota nueva-mente la consistencia de la discriminación de los fragmentos de esta especie con las demás Cosa que no sucede en las imágenes, donde la asocia-ción de los fragmentos está entre fragmentos de otras especies como son las B4 (C. pentagonum, caso Iv) y E4 (C. dens, caso Iv), respectivamen-te En la especie E (C. dens), los mismos frag-mentos fueron asociados en los dos tratamientos (E1, E2, E6 y E0) la única diferencia fue el grado de discriminación de estos fragmentos con res-pecto a los demás de las otras especies, siendo mayor en los patrones de difracción

Los resultados obtenidos en esta compara-ción se debe posiblemente al efecto que tienen los fragmentos de los casos Iv y v que no tiene un significado biológico y que presentan un fac-tor de confusión grande como se observó en la figura 10d

II.3.4.2.2. Fragmentos de las especies con significado biológico

En la figura 12 se presentan los casos en que sí se tiene un significado biológico como especíme-nes y no tener la incertidumbre de que se está contando dos veces al mismo organismo Estos casos son: I, II, III y el vI, usando la misma no-menclatura que la figura anterior La figura 12a representa a las imágenes y la figura 12b a los patrones de difracción En general, los patrones de difracción presentaron una mejor asociación entre los fragmentos de cada especie y una ma-yor unión entre las especies Es decir, cuando ve-mos el análisis con los fragmentos que presentan un significado biológico en los dos tratamientos sólo se confunden una sola vez, que es la compa-ración del fragmento E3 (C. dens, caso III) con B3 (C. pentagonum, caso III)

Sin embargo, consistentemente presentan las mismas propiedades en los resultados basa-dos en los patrones de difracción que es la fuerte asociación intra-específica y la fuerte discrimina-ción ínter-específica de tales fragmentos de estas especies

III. Métodos óptico-digitales para la identificación de fitoplancton

III.1 Métodos para caracterizar una muestra de fitoplancton

Las poblaciones de fitoplancton pueden ser ca-racterizadas por medio de varios métodos, los cuales son: a) los métodos indirectos que involu-cran analizar las poblaciones por medio de aná-lisis espectrales fluorescentes, que pueden deter-minar aspectos muy propios para cada grupo de organismos planctónicos involucrando los dife-rentes pigmentos que los constituyen (Yentsch y Yentsch, 1979); otro método indirecto es la apli-cación de los contadores de partículas para la de-terminación del número de células y frecuencias de tamaños de las mismas, como es el contador de partículas Coulter Counter (Sheldon y Par-sons, 1976), que es una técnica rápida de análisis pero tiene el problema de que no identifica a la partícula que se está midiendo o contando (Gor-sky et al , 1989); esta misma desventaja presenta

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

C

3

C6

C

2

C1

C

O

F3

F

6

F2

F

1

FO

D

3

D6

D

2

D1

D

O

E3

B

3

B6

B

2

B1

B

O

E6

E

2

E1

E

O

A3

A

6

A2

A

1

AO

(a)

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

C

3

C6

C

2

C1

C

O

F3

F

6

F2

F

1

FO

E

6

E2

E

1

EO

D

3

D6

D

2

D1

D

O

E3

B

3

B6

B

1

B2

B

O

A3

A

6

A2

A

1

AO

(b)

Figura 12

Figura 12. Resultados de la comparación intra e ínter-espe-cíficas de los fragmentos de las seis especies que presentan un significado biológico: (a) dendrograma de imágenes y (b) dendrograma de patrones de difracción.


el análisis por bloqueo de luz (Pough, 1976) que convierte a la señal producida en una esfera del tamaño de la partícula (Gorsky et al , 1989) b) Los métodos directos que se basan en analizar la muestra con un microscopio (conteo e identifi-cación directa) La identificación de organismos del fitoplancton por medio del microscopio sigue siendo un método tedioso para el taxónomo, ya que el tiempo que se utiliza para su evaluación va a depender de su experiencia Además, el error de identificación va a ser diferente para cada per-sona, ya que se involucra el criterio para recono-cer una especie (Simpson et al , 1992)

Con adelantos en las ciencias como la ópti-ca, electrónica y computación, se pueden imple-mentar técnicas que realicen identificaciones de organismos marinos de una forma automatizada, en donde los errores y lo tedioso sea superado de manera estándar Implementar un sistema auto-matizado resulta ser la solución de este problema de conteo y de identificación, y aunque los cos-tos del sistema sean un poco elevados, el tiempo de análisis de muestra se reduciría; además, en un sistema automatizado los gastos de manteni-miento y operación serán mínimos

III.2. Sistemas analizadores de imágenes aplicados a los organismos del plancton

Los sistemas analizadores de imágenes aplicados a organismos de plancton son: el realizado por Uhlmann et al. (1978) que utiliza las mediciones de las formas de los organismos, es decir, el área, ancho, largo y la proporción largo-ancho Estos análisis se llevaron a cabo con cinco géneros de fitoplancton (Asterionella, Melosira, Fragilaria, Ceratium y Peridinium)

Furuya (1981, 1982) realizó una estimación de los diferentes tamaños de fitoplancton por medio de un analizador de imágenes, las especies que trabajó fueron: Fibrocapsa japonica, Ptycho-discus brevis, Prorocentrum dentatum y Chaetoce-ros debile

Tsuji y Nishikawa (1984) determinaron la especie de fitoplancton Prorocentrum triestinum por medio de un analizador de imágenes fluores-centes

Dietrich y Uhlig (1984) llevaron a cabo cuan-tificaciones de Artemia salina y diferentes esta-dios de copépodos por medio de mediciones de

longitud, ancho, área y la relación ancho-longi-tud

Cynar et al. (1985) llevaron a cabo estima-ciones del fitoplancton por medio de una técni-ca que realizaba mediciones morfológicas de los organismos

Gorsky et al. (1989) realizaron un método en el cual se pueden estimar los organismos del fitoplancton mediante un analizador de formas, los organismos que estimaron fueron Prorocen-trum micas, Nitzschia closterium y Hymenomonas elongata

Brown et al. (1989) cuantificaron fitoplanc-ton con un intervalo de tamaño de 1 a 20 µm en monocultivos de especies como Nannochloris ba-cillaris, Chrysochromulina breviturrita y Euglena gracilis, con un analizador de imágenes que usó las formas de estas especies, tomando el número de píxeles ocupados por la imagen

Un grupo de investigadores en Plymouth, Reino Unido, propone el uso de los sistemas de redes neurales, con el fin de realizar un análi-sis de patrones de reconocimiento biológico (Simpson et al., 1992; Culverhouse et al., 1994; Culverhouse et al., 1996) Este método ha anali-zado dibujos de siluetas de dinoflagelados y tin-tínidos, además de 23 fotografías de organismos fitoplanctónicos Estas pruebas han servido para observar dos parámetros, uno es la variación na-tural de la morfología de las especies y la otra es el efecto del ruido provocado por el detritus La inteligencia artificial que involucran estas técnicas pueden ser un camino para resolver el problema del monitoreo a gran escala o de una manera más rápida la identificación y conteo de estas especies (Culverhouse et al., 1996) Sin em-bargo hasta la fecha no existe el sistema comple-to de identificación que proponen

III.2.1 Procesado óptico coherente

Durante las últimas dos décadas se han reali-zado investigaciones en este sentido, como es la técnica de procesado óptico coherente en el reconocimiento y caracterización de especies de microalgas, específicamente diatomeas, microor-ganismos que presentan simetría en sus dos ejes de forma estriada y compuestos principalmente de dióxido de silicio (Almeida et al , 1972)


Cairns et al (1972) utilizaron la técnica de filtrado espacial óptico coherente en el reconoci-miento de patrones de las diatomeas: Navicula sp y Cyclotella sp con filtros espaciales comple-jos del tipo vander Lugt construidos con un in-terferómetro de Rayleigh modificado

Almeida y Eu (1976) presentaron resultados en la identificación de diatomeas, aplicando la técnica de correlación óptica convencional con filtros espaciales acoplados u hologramas con la transformada de Fourier También presentaron resultados en el monitoreo de la contaminación del agua, la cual está relacionada con el número de diatomeas contenidas y contadas en función de las especies en un cierto periodo de tiempo

Almeida et al. (1978) realizaron análisis de algas en transparencias fotográficas de 35 mm utilizando un procesador óptico híbrido, en el cual el procesamiento de la información se reali-za óptica y digitalmente por medio de una com-putadora Las señales de correlación grabadas mediante una vidicón fueron digitalizadas y al-macenadas en cintas magnéticas Seleccionaron 25 especies de diatomeas diferentes con el pro-pósito principal de compararlas consigo mismas y formar una matriz de 25 x 25 valores de corre-lación para probar la habilidad de discriminación del sistema

Fujii y Almeida (1979a) elaboraron filtros espaciales acoplando patrones simulados y obte-niendo correlaciones parciales ópticas entre el pa-trón simulado (contornos, contornos con estrías y características morfológicas de importancia taxo-nómica) y los microorganismos Mostrando que este filtro es menos sensible a las variaciones de tamaño del objeto, lo cual reduce el número de filtros requeridos para el análisis En este caso sólo estuvieron considerando el contorno de las diatomeas El problema consiste en que un taxó-nomo no solamente reconoce el contorno del objeto, sino también su estructura interna, como son la densidad de estrías, la dirección y formas de éstos Generalmente estos organismos nunca son iguales; por ejemplo, las diatomeas que perte-necen a una misma especie son muy similares en forma pero pueden ser diferentes en tamaño y en el patrón de estrías Muchas veces es más impor-tante encontrar parecidos o similitudes en vez de diferencias, para la identificación o clasificación de dichos organismos

Posteriormente, Fujii et al. (1980) desarrolla-ron un método para el reconocimiento de formas microbiológicas, rotando el filtro espacial aco-plado mediante un prisma de cuña motorizado y controlado por una computadora Este análisis se basa en el conteo de los píxeles de los picos de correlación con un programa de computación sencillo El filtro constaba de patrones de difrac-ción de varias diatomeas de diferentes tamaños, de tal manera que pudiera cubrir un amplio ran-go en cambios de escala para la identificación de estos microorganismos Los filtros generados fueron tomando ciertas características de una es-pecie de diatomea modelo, es decir, realizaron filtros en donde se contemplara al organismo con todas sus características morfológicas (con-tornos, rasgos morfológicos que caracterizan a la especie taxonómicamente y tamaños de los or-ganismos) En las correlaciones de estos filtros con una serie de 29 diatomeas diferentes en ta-maño con una misma orientación, encontraron que cuando se quería identificar organismos de un tamaño grande, el conteo de píxeles presen-taba problemas, ya que este filtro se confundía con la mayoría de los tamaños de los organismos que contenía la imagen problema (existía mas ruido), caso contrario cuando se usó un organis-mo de tamaño pequeño que pudo identificar a los organismos del mismo tamaño sin presentar problemas en el conteo de píxeles Respecto a la rotación tuvieron problemas, ya que algunas diatomeas sí se pudieron discriminar y otras no, rotando el filtro entre 0° y 180°, lo que indicó una fuerte deficiencia del método; sin embargo lo importante de este trabajo es el análisis de las correlaciones por medio de un contador de píxe-les que de una manera disminuye el tiempo de identificación de estos organismos; en este tra-bajo no se presenta el porcentaje de diferencia en las correlaciones para cada especie

Cairns et al. (1982) presentaron un traba-jo sobre un sistema de identificación automa-tizado basado en los patrones de difracción de diatomeas, generados por medio de un sistema micro-óptico controlado por computadoras; una de las principales aportaciones de este trabajo es la interfaz del microscopio al sistema óptico que se usó, de esta forma se superan algunos erro-res que se tiene en la calibración cuando se uti-lizan negativos fotográficos como interfaz de la


imagen al sistema, aunque también encontraron problemas en escala y rotación de los organis-mos comparados pero fueron menores que los encontrados por Fujii et al. (1979b)

Coronel (1988) utilizó un sistema óptico coherente invariable a rotación y ubicación del organismo en una diapositiva, aplicado a las dia-tomeas

Un sistema óptico-digital fue aplicado a la identificación de cinco especies de fitoplancton del género Ceratium colectados en la bahía de Todos Santos, Ensenada, B. C., México (Pech-Pacheco y Álvarez-Borrego, 1998) Dicho siste-ma puede reconocer estas especies con un por-centaje de confiabilidad de 90%, sin importar la escala, rotación y ubicación de los organismos en la imagen analizada Un filtro holográfico para cada especie fue construido con el fin de correla-cionarlos con seis imágenes problemas que con-tienen organismos de esta especie Para evaluar la efectividad de este sistema de correlación, se utilizaron imágenes de un gran número de orga-nismos de una especie como entrada al sistema Con un solo filtro holográfico se identificaron cien organismos de esta especie Las especies de fitoplancton del género Ceratium que fueron analizadas son importantes como indicadores, ya que algunas de estas especies son responsables del florecimiento de las mareas rojas en el área de la bahía de Todos Santos de Ensenada, Baja California

En este trabajo se aplica la técnica descrita por Casasent y Psaltis (1976 a, b, c,), que presen-tan un sistema de patrones de reconocimiento para convertir un objeto invariante a rotación y escala La técnica es aplicada por primera vez en un sistema híbrido óptico-digital para la identifi-cación de cinco especies de fitoplancton del géne-ro Ceratium (familia Ceratiidae)

III.2.2 Materiales y métodos

Se seleccionó al género Ceratium porque existen problemas en su discriminación taxonómica, ya que existen muchas variaciones en la morfología natural de sus especies (López, 1966; Mc Call et al., 1996) Las especies estudiadas son: C. Furca y C. Pentagonum (subgénero Ceratium), C. ma-croceros y C. tripos (subgénero Tripoceratium) y

C. fusus (subgénero Amphiceratium) (Sournia, 1986; Balech, 1988)

Las fotografías fueron tomadas en un mi-croscopio compuesto “Wild Heerbrugg” M20 EB con un dispositivo adaptador para cámara de 35 mm de la marca Canon La película usada fue Technical-Pan 2415 de alto contraste con un ASA de 250 El intervalo de tiempo de exposi-ción para cada imagen fue 10 (± 2 segundos) El rollo fotográfico fue revelado según la técni-ca desarrollada por Álvarez-Borrego (1987) Se seleccionaron las fotografías que presentaron un mejor contraste y limpias de detritus Se usó un digitalizador (scanner) HP Scanjet IIP de la Hewlett-Packard, para obtener las matrices de datos de las fotografías (256 x 256 píxeles) y se definió la función ),( yxf para cada píxel de la imagen en las coordenadas x e y

La figura 13 muestra los nueve pasos de la correlación invariante a escala, rotación y ubica-ción Los primeros cuatro pasos son realizados digitalmente y los demás en una forma óptica La ventaja de usar un sistema híbrido (óptico-digital) sobre un sistema digital es que el tiempo de procesamiento se reduce considerablemente

La transformada de Mellin, ( )jvjuM , , es usada en este proceso de correlación porque es invariante a escala En dos dimensiones se defi-ne según Casasent y Psaltis (1976b), como:

(1)

donde ( )vu, son las nuevas coordenadas de la imagen obtenidas por esta ecuación y j es el número imaginario 1− ; además en una dimen-sión es:

(2)

donde ( )w es la nueva coordenada de la imagen Por simplicidad M(jw) puede ser escrita como M(w) Ya que la operación básica realizada por una lente en un sistema óptico es la transformada de Fourier (Goodman, 1996), tenemos que rea-lizar la transformada de Mellin ópticamente vía transformada de Fourier (la cual es invariante a

Cairns et al. (1982) presentaron un trabajo sobre un sistema de identificación automatizado basado en los patrones de difracción de diatomeas, generados por medio de un sistema micro-óptico controlado por computadoras; una de las principales aportaciones de este trabajo es la interface del microscopio al sistema óptico que se usó, de esta forma se superan algunos errores que se tiene en la calibración cuando se utilizan negativos fotográficos como interface de la imagen al sistema, aunque también encontraron problemas en escala y rotación de los organismos comparados pero fueron menores que los encontrados por Fujii et al. (1979b).

Coronel (1988) utilizó un sistema óptico coherente invariable a rotación y ubicación del organismo en una diapositiva, aplicado a las diatomeas.

Un sistema óptico-digital fue aplicado a la identificación de cinco especies de fitoplancton del género Ceratium colectados en la bahía de Todos Santos, Ensenada, B. C. México (Pech-Pacheco y Álvarez-Borrego, 1998). Este sistema puede reconocer estas especies con un porcentaje de confiabilidad de un 90%, no importando la escala, rotación y ubicación de los organismos en la imagen analizada. Un filtro holográfico para cada especie fue construido con el fin de correlacionarlos con seis imágenes problemas que contienen a organismos de esta especie. Para evaluar la efectividad de este sistema de correlación, se utilizaron imágenes de un gran número de organismos de una especie como entrada al sistema. Con un sólo filtro holográfico se identificaron a cien organismos de esta especie. Las especies de fitoplancton del género Ceratium que fueron analizadas son importantes como indicadores ya que algunas de estas especies son responsables del florecimiento de las mareas rojas en el área de la bahía de Todos Santos de Ensenada Baja California.

En este trabajo, se aplica la técnica descrita por Casasent y Psaltis (1976 a,b,c,), que presentan un sistema de patrones de reconocimiento para convertir un objeto invariante a rotación y escala. La técnica es aplicada por primera vez en un sistema híbrido óptico-digital para la identificación de cinco especies de fitoplancton del género Ceratium (familia Ceratiidae).

III.2.2 Materiales y métodos Se seleccionó al género Ceratium porque existen problemas en su discriminación taxonómica, ya que existen muchas variaciones en su morfología natural de sus especies (López, 1966; Mc Call et al., 1996). Las especies estudiadas son: C. Furca y C. Pentagonum (subgénero Ceratium), C. macroceros y C. tripos (subgénero Tripoceratium) y C. fusus (subgénero Amphiceratium) (Sournia (1986) y Balech (1988) )

Las fotografías fueron tomadas en un microscopio compuesto “Wild Heerbrugg” M20 EB con un dispositivo adaptador para cámara de 35 mm de la marca Canon. La película usada fue Technical-Pan 2415 de alto contraste con un ASA de 250. El intervalo de tiempo de exposición para cada imagen fue 10 (± 2 segundos). El rollo fotográfico fue revelado según la técnica desarrollada por Álvarez-Borrego (1987). Se seleccionaron las fotografías que presentaron un mejor contraste y limpias de detritus. Se usó un digitalizador (scanner) HP Scanjet IIP de la Hewlett-Packard, para obtener las matrices de datos de las fotografías (256 x 256 pixeles) y se definió la función ),( yxf para cada pixel de la imagen en las coordenadas x e y .

La figura 13 muestra los nueve pasos de la correlación invariante a escala, rotación y ubicación. Los primeros cuatro pasos son realizados digitalmente y los demás en una forma óptica. La ventaja de usar un sistema híbrido (óptico-digital) sobre un sistema digital es que el tiempo de procesamiento se reduce considerablemente.

La transformada de Mellin, jvjuM , , es usada en este proceso de correlación porque es invariante a escala. En dos dimensiones se define según Casasent y Psaltis (1976b), como:

dxdyyxyxfjvjuM jvju

0

11,, , (1)

donde vu, son las nuevas coordenadas de la imagen obtenidas por esta ecuación y j es el número imaginario

1 ; además en una dimensión es:

dxxxfjwM jw

0

1 , (2)

donde w es la nueva coordenada de la imagen. Por simplicidad M(jw) puede ser escrita como M(w). Ya que la operación básica realizada por una lente en un sistema óptico es la transformada de Fourier (Goodman, 1996), tenemos que realizar la transformada de Mellin ópticamente vía transformada de Fourier (la cual es invariante a posición). Esto es posible ya que una operación matemática lineal puede ser escrita en la forma general como:

dx xKxfgx

x

2

1

, , (3)

donde g( ) es la integración de el producto de la función xf con el núcleo xK , (Arfken 1981) y es cualquier variable. La única diferencia entre una transformada es su núcleo xK , . Por ejemplo la transformada de Fourier es

dx xjxfg exp , (4)

donde exp[-j x] es el núcleo de la transformación y la transformada de Mellin es:

dxx xfg 1

0

, (5)

donde 1x es el núcleo de la transformación.

Así, podemos usar lo anterior para escribir la transformada de Mellin mediante la transformada de Fourier, haciendo un cambio de variable de la forma x = exp[q] en la ecuación (2):

dq jwq qfwM expexp , (6)

donde q es cualquier variable.

La transformada de Mellin de la función xf puede ser escrita semejante a la transformada de Fourier de la función qf exp y esto permite realizar ópticamente la transformada de Mellin. Con la combinación de las transformadas

de Fourier-Mellin, se obtiene la correlación invariante a escala y rotación de la función de entrada.

De acuerdo con Casasent y Psaltis (1976a) es más fácil hacer un correlacionador invariante a escala por medio de la manipulación de la transformada de Fourier que cambiando directamente la función de entrada (Fig. 13). Inicialmente se tiene en el paso 1 (Fig. 13) una función de entrada f(x,y), a la cual se le calcúla el módulo de la rápida transformada de Fourier |F(wx,wy)| (paso 2), de esta manera cualquier desplazamiento de la función de entrada, f(x,y) es evitada. Un ángulo de rotación en f(x,y) afecta en la misma forma a |F(wx,wy)|, al igual que un cambio de escala “a” en f(x,y) se refleja en |F(wx,wy)| por un factor de |a|-1.

Los efectos de la rotación y la escala pueden ser separados por medio de una transformación polar de |F(wx,wy)|, de las coordenadas (wx,wy) a las coordenadas (r, ). Si


posición) Esto es posible ya que una operación matemática lineal puede ser escrita en la forma general como:

(3)

donde g(a) es la integración del producto de la función ( )xf con el núcleo K(a, x) (Arfken, 1981) y a es cualquier variable La única diferen-

cia entre una transformada es su núcleo K(a, x) Por ejemplo la transformada de Fourier es:

(4)

donde exp[-jax] es el núcleo de la transforma-ción y la transformada de Mellin es:

(5)

Figura 13.

Figura 13. Diagrama de flujo que presenta los nueve pasos para la correlación invariante a ubicación, rotación y escala. dxxxfjwM jw

0

1 , (2)


dx xKxfgx

x

2

1

, , (3)


dx xjxfg exp , (4)


dxx xfg 1

0

, (5)









dxxxfjwM jw

0

1 , (2)


dx xKxfgx

x

2

1

, , (3)


dx xjxfg exp , (4)


dxx xfg 1

0

, (5)









dxxxfjwM jw

0

1 , (2)


dx xKxfgx

x

2

1

, , (3)


dx xjxfg exp , (4)


dxx xfg 1

0

, (5)










donde xa–1 es el núcleo de la transformación Así, podemos usar lo anterior para escribir la

transformada de Mellin mediante la transforma-da de Fourier, haciendo un cambio de variable de la forma x = exp[q] en la ecuación (2):

(6)

donde q es cualquier variable La transformada de Mellin de la función

( )xf puede ser escrita semejante a la transfor-mada de Fourier de la función [ ]( )qf exp y esto permite realizar ópticamente la transformada de Mellin Con la combinación de las transforma-das de Fourier-Mellin, se obtiene la correlación invariante a escala y rotación de la función de entrada

De acuerdo con Casasent y Psaltis (1976a) es más fácil hacer un correlacionador invariante a escala por medio de la manipulación de la trans-formada de Fourier que cambiando directamente la función de entrada (figura 13) Inicialmente se tiene en el paso 1 (figura 13) una función de en-trada f(x,y), a la cual se le calcula el módulo de la rápida transformada de Fourier |F(wx,wy)| (paso 2), de esta manera cualquier desplazamiento de la función de entrada, f(x,y) es evitada Un án-gulo q de rotación en f(x,y) afecta en la misma forma a |F(wx,wy)|, al igual que un cambio de escala “a” en f(x,y) se refleja en |F(wx,wy)| por un factor de |a|-1

Los efectos de la rotación y la escala pueden ser separados por medio de una transformación polar de |F(wx,wy)|, de las coordenadas (wx,wy) a las coordenadas (r, θ ) Si

(7)

y

(8)

un cambio de escala en |F(wx,wy)| por “a”, afec-taría a la coordenada r en r’ = ar, sin afectar este cambio a la coordenada θ Así, cualquier cambio de escala en la función de entrada bidimensional solamente afectaría en una dimensión la función F(r,θ ) (paso 3 de la figura 13)

La transformada de Mellin en r de la función F(r,θ ) daría una transformación invariante a es-cala en la forma de:

(9)

donde ρ = ln (r) Por lo tanto la transformada de Mellin de la función escalada F(ar,θ ) es

(10)

siendo los módulos de estas dos transformacio-nes los mismos y por lo tanto invariantes a esca-la La ecuación (9) puede ser reescrita como

(11)

y esta ecuación puede ser realizada ópticamente En el paso 4 de la figura 13, un cambio de va-

riable fue realizado con respecto a r: F(exp(ρ),θ), donde ρ es el ln (r) Esta transformación (paso 4) fue colocada en un sistema óptico coherente para producir la transformada de Mellin (paso 5) vía transformada óptica de Fourier (paso 6) La imagen digital obtenida en el paso 4 fue co-locada en un sistema interferométrico modifica-do de Rayleigh (Goodman, 1996) (paso 7) para así obtener un filtro óptico de Mellin (paso 8) La correlación del filtro óptico (paso 8) con la transformada de Mellin de la imagen a identi-ficar (paso 6), produce valores muy bajos para organismos geométricamente diferentes y va-lores muy altos de correlación para organismos geométricamente similares (paso 9)

Cinco filtros holográficos fueron realizados (paso 7) uno para cada especie de Ceratium: C. furca (figura 14a), 81 micras (tamaño real), con un aumento de 400x, C. pentagonum (figura 14b), 100 micras, con 350x de aumento; C. macroce-ros (figura 14c), 186 micras, con un aumento de 225x, C. tripos (figura 14d), 110 micras, con 285x de aumento; C. fusus (figura 14e), 106 micras, con 270x de aumento Un sistema interferomé-trico modificado de Rayleigh (Goodman, 1996)

dxxxfjwM jw

0

1 , (2)


dx xKxfgx

x

2

1

, , (3)


dx xjxfg exp , (4)


dxx xfg 1

0

, (5)









x

y

ww1tan , (7)

y

22yx wwr , (8)

un cambio de escala en |F(wx,wy)| por “a”, afectaría a la coordenada r en r’ = ar, sin afectar este cambio a la coordenada . Así, cualquier cambio de escala en la función de entrada bidimensional solamente afectaría en una dimensión la

función F(r, ) (paso 3 de la Fig. 13).

La transformada de Mellin en r de la función F(r, ) daría una transformación invariante a escala en la forma de:

drr rFwM jw 1

0

,, , (9)

donde = ln (r). Por lo tanto la transformada de Mellin de la función escalada F(ar, ) es

,, wMawM jw , (10)

siendo los módulos de estas dos transformaciones los mismos y por lo tanto invariantes a escala. La ecuación (9) puede ser reescrita como

djwFwM exp,exp, , (11)

y esta ecuación puede ser realizada ópticamente.

En el paso 4 de la figura 13, un cambio de variable fue realizado con respecto a r: F(exp( ), ), donde es el ln (r). Esta transformación (paso 4) fue colocada en un sistema óptico coherente para producir la transformada de Mellin (paso 5) vía transformada óptica de Fourier (paso 6). La imagen digital obtenida en el paso 4 fue colocada en un sistema interferométrico modificado de Rayleigh (Goodman, 1996) (paso 7) para sí obtener un filtro óptico de Mellin (paso 8). La correlación del filtro óptico (paso 8) con la transformada de Mellin de la imagen a identificar (paso 6), produce valores muy bajos para organismos geométricamente diferentes y valores muy altos de correlación para organismos geométricamente similares (paso 9).

Cinco filtros holográficos fueron realizados (paso 7) uno para cada especie de Ceratium: C. furca (Fig. 14a), 81 micras (tamaño real), con un aumento de 400x, C. pentagonum (Fig. 14b), 100 micras, con 350x de aumento; C. macroceros (Fig. 14c), 186 micras, con un aumento de 225x, C. tripos (Fig. 14d), 110 micras, con 285x de aumento; C. fusus (Fig. 14e), 106 micras, con 270x de aumento. Un sistema interferométrico modificado de Rayleigh (Goodman, 1996) fue usado para generar los filtros ópticos de estas imágenes (Fig. 15) (paso 8 de la Fig. 15).

Por medio de un sistema computacional cada imagen de la especie digitalizada fue convertida en valores binarios. Dos imágenes problemas fueron fabricadas aleatoriamente y se repitieron los pasos 2, 3, 4,. y 5 (Fig. 13). La función F(exp( ), ), de cada imagen problema fue fotografiada y almacenada en un negativo fotográfico. Este negativo fue correlacionado ópticamente (paso 9) con cada filtro holográfico de cada especie a identificar.

El filtro óptico fue puesto en una montura con movimiento x, y, y z del plano E, (Fig. 16).

x

y

ww1tan , (7)

y

22yx wwr , (8)




drr rFwM jw 1

0

,, , (9)


,, wMawM jw , (10)








x

y

ww1tan , (7)

y

22yx wwr , (8)




drr rFwM jw 1

0

,, , (9)


,, wMawM jw , (10)








x

y

ww1tan , (7)

y

22yx wwr , (8)




drr rFwM jw 1

0

,, , (9)


,, wMawM jw , (10)








x

y

ww1tan , (7)

y

22yx wwr , (8)




drr rFwM jw 1

0

,, , (9)


,, wMawM jw , (10)









fue usado para generar los filtros ópticos de es-tas imágenes (figura 15) (paso 8 de la figura 15)

Por medio de un sistema computacional cada imagen de la especie digitalizada fue con-vertida en valores binarios Dos imágenes pro-blemas fueron fabricadas aleatoriamente y se repitieron los pasos 2, 3, 4, y 5 (figura 13) La función F(exp(ρ),θ), de cada imagen problema fue fotografiada y almacenada en un negativo fo-tográfico Este negativo fue correlacionado ópti-camente (paso 9) con cada filtro holográfico de cada especie a identificar

El filtro óptico fue puesto en una montura con movimiento x, y, y z del plano E, (Fig 16)

En la figura 16 se observa el sistema comple-to para la identificación automatizada en tiempo real de partículas biogénicas Las partes del sis-tema óptico de correlación se representan con números Estas partes son: la fuente de luz láser (1), el filtro espacial (2), la lente colimadora (3), la pantalla de cristal líquido (4), la lente transfor-madora de Fourier (5), el carrusel de filtros ho-lográficos (6) que es una estructura que contiene varios filtros que son movidos manualmente, la lente correlacionadora (7) y el plano de salida

de la correlación en donde se encuentra el CCD-C72E (8)

En esta misma figura se muestran los dife-rentes pasos que se realizan y los diferentes com-ponentes que se cuenta para realizar la identi-ficación automatizada en tiempo real El paso A es en donde se colecta la muestra, esta debe ser evaluada con respecto a su volumen para co-nocer la densidad de las especies en la muestra; el paso B muestra el sistema de captura de la imagen, se realiza por medio de un microscopio compuesto de transmisión de luz en el cual se selecciona el objetivo y el ocular adecuado para tener una imagen clara y de alta calidad de la es-

Figura 14.

Figura 14. Especies del género Ceratium. Procesamiento de cada filtro óptico para cada especie. (i) imagen binaria, (ii) módulo de la transformada de Fourier correspondiente a la imagen binaria; (iii) transformada polar de las coordenada del módulo (ii); (iv) similar como en (iii), pero con theta vs. ln(r). (v) transformada de Mellin de las imágenes (a-e).

Figura 15

Figura 15. Sistema interferómetro modificado de Rayleigh para generar filtros holográficos. La luz es un láser Helio-Neón (He-Ne) [Lentes: L

1, L

2, L

3; longitud focal f; x

1, y

1, x

2, y

2,

representan las coordenadas del plano de entrada y plano del filtro respectivamente].

Figura 16

Figura 16. Sistema de correlación óptico coherente.


pecie que se quiere procesar, la imagen es captu-rada digitalmente por un sistema digital (CCD) que manda la información a una computadora; con la letra C se representa el paso en el cual la información de la especie es cambiada del cam-po espacial (imagen de la especie) a un campo de frecuencia por medio de un algoritmo de la transformada de Fourier, a esta información se le aplica en esta misma computadora un cambio de coordenadas de cartesianas a polares donde el eje de las x representa el ln r y el eje de la y representa a θ por medio de un algoritmo de cambio de coordenada; esta imagen es desple-gada en el monitor de la computadora y además mandada automáticamente en tiempo real a la pantalla de cristal líquido que es el paso D, la pantalla de cristal líquido despliega la informa-ción que se va a correlacionar con los diferentes filtros holográficos de cada especie (paso E) En este paso E es en donde manualmente se coloca el filtro holográfico que tiene la información de la especie que se quiere identificar, además se dispone de un catálogo de filtros para así poder identificar varias especies en el análisis de una muestra de agua de mar; en el paso F se obtiene el resultado de la identificación automatizada en tiempo real de partículas biogénicas Estos resul-tados se muestran en forma de picos de correla-ción que indican la presencia de organismos de la especie que se está identificando

III.3 Resultados

Usando imágenes binarias de (a) C. furca, (b) C. pentagonum, (c) C. macroceros, (d) C. tripos y (e) C. fusus, se obtuvieron las imágenes de los contornos de cada especie (de la a a la e, figura 14 ) La figura 14i muestra las imágenes binarias de cada especie; la figura 14ii muestra el módulo de la transformada de Fourier de cada una de las imágenes binarias, la figura 14iii muestra las coordenadas polares del módulo (figura 14ii), donde theta presenta valores de 0 a 360° y r de 0 a 181 02; en la figura 14iv se observa esta misma transformación pero graficando ln (r) vs theta, los valores de ln (r) son de 0 a 5 20 y theta de 0 a 360° y la figura 14v muestra la transformada de Mellin de cada imagen

El siguiente paso fue identificar una especie en particular en imágenes en donde existen va-rias especies de Ceratium Dos imágenes proble-mas fueron creadas aleatoriamente

La correlación de la primera imagen proble-ma, como un ejemplo (figura 17a) con el filtro óptico de Ceratium furca (figura 14a), muestra un pico que indica la presencia de un individuo de C. furca en esta imagen problema La corre-lación de la segunda imagen problema (figura 17c) con el mismo filtro holográfico (figura 17d) muestra tres picos de correlación, indicando tres individuos de esta especie en la imagen La loca-lización de los picos depende del tamaño y rota-ción de cada individuo en la imagen

Figura 17

Figura 17

Figura 17. Resultado de la identificación de Ceratium furca. a) primera imagen problema b) su correspondiente pico de correlación, c) segunda imagen problema y d) sus correspon-dientes picos de correlación.

La figura 18 presenta los valores de corre-lación de 100 individuos de C. furca, tomados directamente del microscopio (no limpias), con el filtro holográfico de la misma especie limpia de detritus y burbujas y fragmentos de especies diferentes o similares, y la figura 19 presenta seis imágenes representativas de estos 100 indivi-duos


III.3.1 Comparación de los resultados de identificación de C. dens con otras especies de fitoplancton

En la figura 20 se presentan los resultados del sistema automático de identificación de C. dens cuando se analiza un conjunto de imágenes de 9 especies fitoplanctónicas En el eje de las x se ob-servan las diferentes especies que se analizaron en el sistema, de izquierda a derecha se presen-tan a C. dens, C. furca, C. pentagonum, C. tripos, A. ingens, T. kozlovii, N. reinholdii, P. cinamo-meum y Heterocapsa rotundatum Cada especie está representada por individuos que presentan de 0° a 180° de rotación y porcentajes de tamaño de 70%, 80% y 90% En el eje de las y se obser-van los valores de correlación, los valores de co-rrelación cuando el sistema identifica a C. dens son mayores de 0 80 no importando la rotación ni la diferencia de escalas de los individuos de esta especie y cuando procesa a los individuos de otras especies el valor de correlación es menor a 0 20 Lo que demuestra que el sistema auto-mático de identificación de C. dens funciona co-rrectamente y no se confunde en sus resultados cuando existen en el análisis otros individuos de otras especies

Figura 18

Figura 18

Figura 20. Respuesta del sistema cuando se correlaciona la especie de interés con otras especies del fitoplancton.

Figura 18. Ceratium furca. valores de correlación de 100 in-dividuos: a) resultados numéricos y b) media ± desviación estándar (D. E.)

Figura 19

Figura 19

Figura 19. Ceratium furca. Imágenes con detritus, burbujas y fragmentos de varias especies.

Figura 20.

En esta misma figura se muestra la variación del valor de correlación para cada especie identi-ficada La variación de los valores de correlación para cada especie está representada con más o menos una desviación estándar Los resultados indican que sí existen diferencias significativas entre la identificación de estas especies, es decir,


que el sistema puede identificar correctamente a los individuos de C. dens y no confundirlos con los individuos de las otras especies De esta ma-nera se puede decir que si el valor de identifi-cación del sistema es mayor a 0 20, el resultado puede ser considerado como un individuo de la especie C. dens Lo que muestra que el sistema puede ser usado para monitorear esta especie y de tal manera estar observando la presencia o ausencia de esta especie en una determinada localidad o a través del tiempo en una zona de importancia económica o ecológica

III.4 Discusiones

Las cinco especies de Ceratium examinadas siempre presentaron las vistas dorsales o ventra-les; debido a dicha característica, las especies re-feridas son ideales para este tipo de análisis (ya que son dorso-ventralmente aplanados) Sin em-bargo, su morfología varía mucho intra-específi-camente y por lo tanto es muy difícil diferenciar entre las especies, especialmente cuando existen más de 20 especies en la muestra de fitoplancton analizada

Para poder evaluar la eficiencia de la técnica de correlación satisfactoriamente fue utilizado un gran número de imágenes de organismos de diferentes muestras, a fin de medir la variación morfológica natural de la especie Los filtros óp-ticos que no son invariantes comúnmente fallan en dar resultados buenos, ya que en diferentes muestras la misma especie presenta distintos ángulos de vista, condición de luz, etc En este trabajo (Pech-Pacheco y Álvarez-Borrego, 1998) se usaron 100 muestras para determinar si es po-sible identificar a esta especie usando solamente un filtro

Los resultados indican que existe muy poca variación cuando los patrones de difracción son correlacionados con las imágenes problemas (figura 5); en este resultado sólo fue usado un filtro holográfico La asociación entre estas 100 muestras fue claramente buena, indicando que la técnica trabajó satisfactoriamente en la identi-ficación (figura 6)

Los resultados han demostrado la sensibili-dad y confiabilidad del método propuesto de Ca-sasent y Psaltis (1976a, b, c), así mismo demues-tran que el sistema es altamente discriminante

(>90%) Cuando el filtro óptico es comparado con imágenes de organismos de la misma especie que la del filtro, pero estas imágenes presentan contaminación de detritus, burbujas de aire y fragmentos de otras especies; la sensibilidad del método es del 0 85±0 019 (figura 18b)

Cuando C. dens fue comparada con otras nueve especies distintas, los resultados de la identificación fueron totalmente satisfactorios El tiempo de identificación para cada microor-ganismo fue menos de dos segundos

IV. Conclusiones

Las cuatro hipótesis que fueron presentadas en el comienzo de este capítulo fueron probadas

Los resultados del análisis de las correlacio-nes de los patrones de difracción de las imágenes y las correlaciones de las imágenes presentaron que:

El ruido ocasionado por los problemas de fondo de la imagen, por la variación en la sedi-mentación de la célula, por la variación natural de la morfología de la especie y además los pro-blemas intra-específicos es menor en los patro-nes de difracción

Los patrones de difracción presentaron una mejor asociación y un mayor valor de correlación entre las especies de un subgénero que con espe-cies de otro subgénero del género Ceratium

Los patrones de difracción presentaron una mejor asociación y una mayor correlación entre los fragmentos que tienen un significado biológi-co en cada especie del género Ceratium

Estas ventajas en los patrones de difracción pueden ser de gran utilidad cuando se pretende realizar un sistema automatizado de identifica-ción de especies fitoplanctónicas

Se concluye que el sistema híbrido óptico-di-gital, presentó una eficiencia en la identificación de estas cinco especies del género Ceratium de 90%

Las especies fueron identificadas correcta-mente no importando la rotación, escala y ubi-cación de los organismos de cada especie de la imagen problema analizado

Se observó que sólo se requiere un filtro ho-lográfico de cada especie para realizar una co-rrecta identificación en el sistema óptico-digital,


aun existiendo variación morfológica en las es-pecies

Se concluye que la utilidad de tener un sis-tema que dé información de una especie que presente propiedades de bioindicador ecológi-ca o económica es importante, ya que se puede prevenir una catástrofe o se puede usar como un indicador de beneficios

Con los análisis realizados en este trabajo se demuestran las ventajas que se presentan en un sistema óptico-digital automático y el uso de las pantallas de cristal líquido como interfaz entre lo digital y óptico

El uso de estos sistemas reducirá considera-blemente el tiempo de procesamiento de iden-tificación y cuantificación de muestras de fito-plancton de mareas rojas, que es actualmente estimado de dos horas por un especialista (Cul-verhouse et al , 1996)

Referencias

Almeida, S P , D del Baiizo, J Cairns, K Dick-son y G Lanza (1972) “Holographic micros-copy of diatoms” Trans. Kans. Acad. Sci., 74: 257-260

Almeida, S P y J K T Eu (1976) “Water po-llution monitoring using matched spatial fil-ters” Appl. Opt., 15: 510-515

Almeida, S P , S K Case, J M Fournier, H Fu-jii, J Jr Cairns, K L Dickson y P Pryfogle (1978) “Analysis of algae samples using cohe-rent optical processing” Proceedings of ICO-11 Conference Madrid, España, pp 351-354

Álvarez Borregom Josué (1987) “Optical analy-sis of two simulated images of the sea sur-face” Proceedings SPIE “Advances in Image Processing”, vol 804, pp 192-200, agosto

Alasaarela, E (1979) “Spatial, seasonal and long-term variations in the phytoplankton blomass and species composition in the coas-tal waters of th Bothnian Bay of Oalu” Ann. Bot. Fenn., 6(2): 108-122

Anraku, M (1984) “Shellfish poisoning in Japa-nese waters” En: A W White, M Anraku y K-K Hoot (eds) Toxic red tides and shell-fish toxicity in Southeast Asia, Proceedings of a Consultative Meeting, Singapur, 1-14 sept 1984 Southeast Asian Fisheries Develop-

ment Center and the International Develo-pment Research Center Singapore 105-109 pp

Arfken, G (1981, 3ª ed ) Mathematical methods for physicists Academic Press, Inc Harcourt Brace Jovanovich San Diego 200 pp

Balech, E (1988) “Los dinoflagelados del Atlán-tico Sudoccidental” Publ. espec. Inst. Esp. Oceanogr., 1: 1-310

Bidigare, R R y M E Ondrusek (1990) “In vivo absorption properties of algal pigments” Ocean Optics X. SPIE, 1302: 290-302

Bernabé, G (1976) “La réproduccion induite du loup, Dicentrarchus labrax” En : P Bougis (ed) Oceanographie Biologique Appliquée, L’Exploitation de la Vie Marine París, pp 275-282

Berger, W H , v S Smetacek y G Wefer (1989) Productivity of the ocean, Present and past Wiley Gran Bretaña 471 pp

Bodeanu, N (1993) “Microalgal blooms in the Romanian area of the Black sea and con-temporary eutrophication conditions” En: Smayda, T J y Y Shimizu (eds ) Toxic phyto-plankton blooms in the sea Elsevier Países Bajos, pp 203-209

Braarud, T , K R Gaarder y J Grontved (1953) “The phytoplankton of the North sea and ad-jacent waters in May 1948” Rapp. P.-v. Réun. CIEM, 133: 1-87

Brongersma-Sanders, M (1957) “Mass mortali-ty in the sea” En: J W Hedgpeth (ed ) Tra-tise on marine ecology and paleoecology. Geol. Soc. Am. Memoir, 67 Washington, D C , pp 941-1010

Brown, L M , I Gargantini, D J Brown, H J Atkinson, J Govidarajan y G C vanlerberg-he (1989) “Computer-based image analysis for the automated counting and morpholo-gical description of microalgae in culture” Jour. Appl. Ecol., 211-225

Cacho-López, L (1992) “variación estacional de nutrientes al noroeste de la bahía de Todos Santos (1989-1990)” Tesis de licenciatura Universidad Autónoma de Baja California Ensenada, B C México 46 pp

Cairns, J Jr , K L Dickson, G R Lanza, S P Almeida, y D del Balzo (1972) “Coherent optical spatial filtering of diatoms in water


pollution monitoring” Arch. Mikrobiol, 83: 141-6

Cairns, Jr , S P Almeida y H Fujii (1982) “Auto-mated Identification of Diatoms” BioScien-ce, 32(2): 98-102

Carder, K L , R D Tomlinson y G F Jr Berds-ley (1972) “A technique for the estimation of indices of refraction of marine phyto-plankters” Limnol. Oceanogr., 17: 833-839

Casasent, D y D Psaltis (1976a) “Scale inva-riant optical correlation ussing Mellin trans-forms” Opt. Commun., 17: 59-63

Casasent, D y D Psaltis (1976b) “Scale invariant optical transforms” Opt. Eng., 15: 258-261

Casasent, D y D Psaltis (1976c) “Position, rota-tion, and scale invariant optical correlation” Appl. Opt., 15: 1795-1799

Cohen, D , A Filkel y M Sussman (1976) “On the role of algae in larviculture of Macrobra-chium rosenbergii” Aquaculture, 8: 199-207

Coronel-Beltrán, A (1988) “Correlacionador óptico invariante aplicado a la identificación de microorganismos fitoplanctónicos” Tesis de maestría, CICESE, Ensenada, B C Méxi-co. 110 pp

Cortés-Altamirano, R (1998) Las mareas rojas AGT Editor, México 161 pp

Cortés-Altamirano, R , F Manrique y R Luna-Soria (1995) “Presencia de mareas rojas en la costa Este del golfo de California” Rev. Lat. Amer. Microbiol, 37: 337-342

Cortés-Altamirano, R y R Luna-Soria (1998) “Lista mundial de microalgas responsables de florecimientos, mareas rojas y toxicas” En: AGT Editor, Las Mareas Rojas México, pp 141-153

Cronberg, G , E J Carpenter y W W Carmichael (2003) “Taxonomy of harmful cyanobacteria” En: Hallegraeff, G M , D M Anderson y A D Cembella (eds ) Manual on Harmful Ma-rine Microalgae, UNESCO, Mon. on Oceangr. Meth., núm 11, pp 523-562 París

Culverhouse, P , R G Simpson, R Ellis, J A Lindley, R Williams, T Parisini, B Regue-ra, I Bravo, R Zoppoli, G Earnshaw, H McCall y G Smith (1996) “Automatic classi-fication of field-collected dinoflallates by ar-tificial neural network” Mar Ecol Prog Ser., 139: 281-287

Culverhouse, P F , R Ellis, R G Simpson, R Williams, R W Pierce y J T Turner (1994) “Categorisation of 5 species of Cymatocylis (Tintinidae) by artificial neural network” Mar. Ecol. Prog. Ser., 107: 273-280

Cynar, F J , K W Estep y J McN Sieburth (1985) “The detection and characterization of bac-teria-sized protists in ‘Protist-free’ filtrates and their potential impact on experimental marine ecology” Microbial Ecology, 11(4): 281-288, diciembre

De Pauw, N , J Morales, y G Persoone (1984) “Mass culture of microalgae in aquaculture systems: progress and constrains” Hydrobio-logia, 117: 121-134

Devik, O (1976) Harvesting Polluted Waters Ple-num Press N Y , 324 pp

Dietrich A y G Uhlig (1984) “Stage specific classification of copepods with automatic image analysis” Crustaceana, 7: 159-165

Dodd, J R y Jr R J Stanton (1981) Paleoeco-logy, concepts and application Waley inters-cience publications 17 pp

Durand-Chastel, H (1980) “Production and use of Spirulina in México” En: G Shelef y C J Soeder (eds ) Algas Biomass Elsevier North-Holland Biomedical Press, pp 51-64

Eppley, R W (1986) Plankton dynamics of the southern California Bight. Lectures notes in costal estuarin studies Springer-verlag N Y , 373 pp

Encalada-Fleites, R R y E Millán-Nuñez (1990) “Impacto de las aguas residuales industriales y domésticas sobre las comunidades bento-nicas de la bahía de Todos Santos, Baja Ca-lifornia, México” Ciencias Marinas, 16(4): 121-139

Faust M y Norris K, 1982 Rapid in vivo spectro-photometric analysis of chlorophyll pigments in intact phytoplankton cultures Br Phycol J , vol 17, 351-362 pp

Friligos, N (1981) “An index of marine pollu-tion in the Saronikos Gulf” Marine Pollution Bull., 12(3): 61-66

Friligos, N y T Koussouris (1984) “Preliminary observations on sewage nutrient enrichment and phytoplankton ecology in the Ther-maikos Gulf, Thessalonik, Greece” Vie et Milieu, 31(1): 35-39


Friligos, N (1989) “Hydrographic and plankton variability in the Saronikos Gulf” Toxicolo-gical and Environmental Chemistry, 24: 155-170

Fryxell, G A y G R Hasle (2003) “Taxonomy of harmful diatoms” En: Hallegraeff, G M , D M Anderson y A D Cembella (eds ) Manual on Harmful Marine Microalgae, UNESCO, Mon. on Oceangr. Meth. núm 11, pp 465-509 París

Fujii, H y S P Almeida (1979a) “Partially mat-ched spatial filtering with simulated input” SPIE. 177 Optical Information Storage

Fujii, H y S P Almeida (1979b) “Coherent spa-tial filtering with simulated input” Appl. Opt., 18: 659-1662

Fujii, H , S P Almeida y J E Dowiing (1980) “Rotational matched spatial filter for bio-logical pattern recognition” Appl. Opt., 19: 1190-1193

Fujimura, T y H Okamoto (1972) “Notes on progress made in developing a mass cultu-ring technique for Macrobrachium rosenbergii in Hawaii” En: T v R Pillay (ed ) Coastal Aquaculture in the Indo-Pacific Region Fis-hing News Books Ltd , pp 313-327

Funnell, B M y W R Riedel (eds ) (1971) The micropaleontology of oceans Univ Press London, Cambridge, 828 pp

Furuya, K (1981) “Studies in phytoplankton communities in subsurface chlorophyll maxi-ma” Tesis doctoral Univ Tokyo, 235 pp

Furuya, K (1982) “Measurement of phyto-plankton standing stock using an image analyzer system” Bull. Plankton Soc. Japan, 29: 133-135

Goodman, J W (1996, 2ª ed ) Introduction to Fourier Optics McGraw-Hill, Nueva York, 287 pp

Gorsky, G , P Guilbert y E valenta (1989) “The autonomous image analyzer- enumeration, measurement and identification of marine phytoplankton” Mar. Ecol. Prog. Ser., 58: 133-142

Hahm, S C y M F Capra (1992) “The cyano-bacterium Oscillatoria erythraea a potential source of toxic in the ciaguatera food-chain” Food Add. Cont., 9(4): 351-355

Hajós, M (1976) “Upper eocene and lower oli-gocene diatomaceae, archaemonadaceae

and silicoflagellates in southwestern paci-fic sediments” DSSP, leg 29. Initial Reports DSPP, 5(35): 817-883

Hallegraeff, G M (1993) “A review of harmful algal blooms and their apparent global in-crease” Phycologia, 32: 79-99

Harris, G P (1986) Phytoplankton Ecology Cha-pman and Hall Nueva York, 384 pp

Hitchcock, G L (1980) “Influence of tempera-ture on the growth rate of Scheletonema cos-tatum in response to variations in dayly light intensity” Mar. Biol., 57: 261-269

Jeffrey S W y R F G Mantoura (1996) “De-velopment of pigment methods for oceano-graphy: SCOR-supported Working Groups and objectives” En: Jeffrey S W , Mantoura, R F C y S W Wright (eds ) Phytoplankton pigments in oceanography UNESCO Publis-hing, 662 pp

Jeffrey, S W y G M Hallegraeff (1990) “Phyto-plankton ecology of Australian waters” En: Clayton, M N y R J King (eds ) Biology of Marine Plants, Longman Cheshire, Melbour-ne, pp 310-348

Jensen, A (1984) “Marine ecotoxicological test with phytoplankton” En: Persoone, G , Jas-pers, E y C Claus (eds ) Ecotoxicological Testing for the Marine Environment State & University of Ghenrt and Institute for Ma-rine Scientific Research Bredene Belgium, 1: 195-214

Kiozumi, I y U Tanimura (1985) “Noegene dia-tom bioestratigraphy of the middle latitude western north pacific” Deep sea Drilling Project leg 86 Initial Report DSDP, 86: 269-300, noviembre 1985

López, J (1966) “variación y regulación de la forma en el género Ceratium” Inv. Pesq., 30: 325-427.

Malin, G , S M Turner y P S Liss (1992) “Sul-fur: The plankton/climate connection” J. Phycol., 28: 590-597

Manzi, J J , M B Maddox y P Sandifer (1977) “Algal supplement enhancement of macro-brachium rosenberrgii (De Man) larvicultu-re” Proceeding of the world mariculture socie-ty, 8: 207-223

McCall H , Bravo I, Lindley J A , Reguera B (1996) “Phytoplankton recognition using pa-


rametric discriminants” J. Plankton Res., 18: 393-410

Meldahl, A S , B Edvardsen y F Fonnum (1993) “The affect of Prymnesium toxic on neuro-transmiter transport mechanisms; the deve-lopment of a sensitive test method” En: T Smayda y T Shimizu (eds ) Toxic plankton blooms in the sea Elsevier, pp 895-900

Meldahl, A S , J Kvernstuen, G J Grasbakken, B Edvardsen y F Fonnum (1995) “Toxic ac-tivity of Prymnesium spp y Chrysochromuli-na spp test by different test methods” En: P Lassus (ed ) Harmful marine algal blooms Lavoisier, pp 315-320

Malecha, S (1983) “Commercial seed produc-tion of the freshwater prawn Macrobrachium rosenbergii, in Hawaii” En: J P Mcvey (ed ) CRC Handbook of Mariculture. Crustacean Aquaculture Boca Raton, pp 205-230

Morris, I (1980) The physiological ecology of phytoplankton University of California Press, EU, 625 pp

Orellana, E , L Zamorano, R Pinet y N Castro (1993) Ecofisiología del fitoplancton costero Proyecto de investigación de la Universidad Autónoma de Baja California 100 pp

Pech-Pacheco, José Luis y J Álvarez-Borrego (1998) “Optical-digital system applied to the identification of five phytoplankton species” Marine Biology, 132(3): 357-366

Pech-Pacheco, José Luis, Josué Alvarez-Borre-go, Elizabeth Orellana-Cepeda y Roberto Cortés-Altamirano (1999) “Diffraction pat-terns applicability in identification of Cera-tium species” Journal of Plankton Research, 21(8): 1455-1474

Peón, R M y J Álvarez-Borrego (1990) “Opti-cal and digital correlation of simulated sea superfaces” Óptica Pura y Aplicada, 23: 31-54

Pough, P R (1976) The application of particle counting to an understanding of the small -sca-le distribution of plankton communities Ple-num Press, Nueva York, pp 111-129

Roberts, B S (1979) “Occurrence of Gymnodi-nium breven red tides along the west coast of Florida during 1976 and 1977” En: L D Ta-ylor y H H Seliger (eds ) Toxic dinoflagellate blooms Elsevier/North Holland, EEUU, pp 199-202

Segovia-Zavala, J A , I Rivera-Duarte y F J del valle-villorin (1988) “Efectos de dese-chos orgánicos en las zonas adyacentes a los efluentes en bahía de Todos Santos: Nutrien-tes” Ciencias Marinas, 14(1): 81-94

Sathyendranath, S , A D Gouveia, S R Shetye, P Ravindram y P Platt (1991) “Biological control of surface temperature in the Ara-bian Sea” Nature, 349: 54-56

Sheldon, R W y T R , Parsons (1976) A practical manual on the use of the Coulter Counter in marine science Coulter Electronics, Toronto, 116 pp

Simpson, R , R Williams, R Ellis, y P F Culver-house (1992) “Biological pattern recognition by neural networks” Mar. Ecol. Prg. Ser., 79: 303-308

Smayda, T J (1958) “Biogeographical studies of marine phytoplankton” Oikos, 9(2): 158-91

Smayda, T J (1970) “The suspension and sin-king of phytoplankton in the sea” Oceanogr. Mar. Biol. Ann. Rev., 8: 353-414

Smayda, T J y Y Shimizu (1993) Toxic phyto-plankton blooms in the sea Elsevier Países Bajos 952 pp

Snoyeink, J (1990) Química del agua AGT México 99 pp

Soeder, C J (1976) “The technical production of microalgae and its prospects in marine aquaculture” En: O Devik (ed ) Harvesting Polluted Waters Plenum Press, N Y , pp 11-26

Sournia, A (1986) Atlas du phytoplancton marin. Vol. I. Introduction, Cyanophycées, Dictyo-chophycées, Dinophycées et Raphidophycées Centre National de la Recherche Scientifi-que, París, 200 pp

Silva, E (1990) “Intracellular Bacteria: the ori-gin of dinoflagellate toxicity” JEPTO, 10 (3): 124-128

Shumway, E (1989) “Toxic algae A serious threat to shellfish aquaculture” World Aqua-cul., 20(4): 65-74

Shumway, E (1990) “A review of the effects of algal blooms on shellfish and aquaculture” J. World Aquacult. Soc., 21(2): 65-104

Steeman-Nielsen, E (1933) “Uber quantitati-ve Untersuchung von marinem Plankton mit Utermohl umgekehrten Mikroskop J Const ”, CIEM, 8(2): 201-210


Steidinger, K (1983) “A re-evaluation of toxic dinoflagellate: biology and ecology” En: Round y Chapman (ed ) Progress in physiolo-gical research 2 Elsevier, pp 147-188

Thompson, G B y J Ho (1981) “Some effects of sewage discharge upon phytoplankton in Hong Kong” Marine Pollution Bull., 12(2): 168-173

Throndsen, J (1978) “Preservation and storage” En: A Sournia (ed ) Phytoplankton manual UNESCO París, pp 69-74

Tomas, C R , G Daniel y G D Baden (1993) “The influence of phosphorus source on the growth and cellular toxic content of the ben-tic Dinoflagellate Prorocentrum lima”. En: T J Smayda y Y Shimizu (eds ) Toxic phyto-plankton blooms in the sea Elsevier Países Bajos, pp 565-570

Tsuji T y T Nishikawa (1984) “Automated iden-tification of red tide triestinum in coastal areas by image analysis” Journal of Oceano-graphy, 40(6): 425-431, diciembre

Uhlmann, D , O Schlimpert y W Uhlmann (1978) “Automated phytoplankton analysis by a pattern recognition method” Int. Rev. Ges. Hydrobiol., 63: 575-583

venkataraman, L v , P B Nigan y P K Rama-nathan (1980) “Rural oriented fresh water cultivation and production of algae in India” En: G Shelef y C J Soeder (eds ) Algae bio-mass Elsevier North-Holand Biomedical Press, pp 81-85

vega, M J M (1989) “Who’s working on tropi-cal red tides?” NAGA, 12(3): 11

vilicic, D , F Krsinic, M Caric, N Jasprica, S Bobanovic y J Mikus (1995) “Plankton and hydrography in a moderately eutrophicated eastern Adriatic bay (Gruz Bay)” Hydrobio-logia, 304: 9-22

Williamson, P y J Gribbin (1991) “How plankton changes the climate” New Scientist, 129: 44-48

Yentsch, C S y C M Yentsch (1979) “Fluores-cense spectral signatures: The characteriza-tion of phytoplankton populations by the use of excitation and emission spectra” J. Mar. Res., 37: 471-483

Zeitzschel, B (1978) “Why study phytoplankton?” En: Sournia A (ed ) Phytoplankton manual UNESCO París, pp 1-5

Zupan, J (1982) Clustering of large data sets Re-search Studies Press N Y , 100 pp

capítulo 4 Correlación óptico-digital a color para

el reconocimiento de Vibrio cholerae O1 en muestrasde laboratorio y ambientales

Rosa R. Mouriño PérezJosué Álvarez Borrego

salud pública en las poblaciones humanas, parti-cularmente en países en vías de desarrollo (Fer-nández de Castro, 1991; Colwell, 1996)

El cólera es considerado una aflicción an-cestral de los seres humanos Se han encontrado descripciones de epidemias de esta enfermedad en escritos árabes, hindúes, griegos y romanos La palabra cólera ha sido usada por más de 2,500 años para describir cualquier diarrea y vómito, no sólo causado por bacterias Aunque la eti-mología del término cólera ha estado en disputa por muchos años, se dice que proviene del grie-go chole (bilis) y rein (flujo), que juntos signifi-ca “flujo de bilis”; otros investigadores sugieren que viene de la palabra griega cholera que signi-fica gotera (Blake, 1994; Colwell, 1996; Sánchez y Taylor, 1997)

Los microbiólogos han desarrollado diversas técnicas para la identificación de esta bacteria; el Vibrio cholerae O1 ha sido usualmente iden-tificado a través de técnicas tradicionales como recuperación por cultivo en medios específicos y de una cascada de pruebas bioquímicas (Back y Kroll, 1991; Bingen, 1993; Bostock, 1993) Esta batería de pruebas ha resultado ineficiente en al-gunos casos, en parte por problemas intrínsecos del uso de los medios y duración de las pruebas, así como porque el bacilo del cólera puede so-brevivir en un ambiente adverso en un estadio de latencia, que se ha denominado como “viable pero no cultivable” y no puede ser recuperado por estos métodos

La biología molecular ha propuesto técnicas altamente específicas, algunas que van encami-nadas a identificar a la bacteria por el fenotipo y otras, como la reacción de la cadena de poli-merasa (PCR) (Giesendorf, 1994), que van di-

I. Introducción

La validez de los resultados de estudios ecoló-gicos sobre organismos microscópicos depende en gran medida de la correcta identificación y cuantificación del organismo bajo estudio en su ambiente natural

Por ejemplo, sobre el Vibrio cholerae O1, bac-teria responsable de la enfermedad del cólera, hay un gran número de preguntas sin resolver sobre su ecología, que podrían ser contestadas a través de la observación de un gran número de muestras de agua de mar de diversas partes del mundo, para poder hacer inferencias sobre el comportamiento del bacilo en su hábitat natural

Los cambios climáticos globales que modifi-can los factores ambientales permiten un mejor entendimiento de la desaparición y reaparición del cólera El comportamiento de esta enferme-dad es un excelente ejemplo de cómo los fenó-menos climáticos pueden ayudarnos a explicar la virulencia del agente causal, así como las carac-terísticas de la transmisión del padecimiento y su epidemiología (Colwell y Patz, 1997)

El cólera es una infección intestinal aguda, grave, que se caracteriza por diarrea producida por la enterotoxina del Vibrio cholerae O1. Este padecimiento de aparición súbita puede llevar a los individuos susceptibles a la deshidratación severa, a alteraciones vasculares e incluso a la muerte en menos de 24 horas de no ser tratado adecuadamente (Fernández de Castro, 1991; Gio-no-Cerezo et al , 1991; Sánchez y Taylor, 1997)

A pesar de los avances de la ciencia médica, esta enfermedad —al igual que otras infecciones consideradas como padecimientos emergentes— representa un grave y persistente problema de

92 Rosa R. Mouriño Pérez y Josué Álvarez Borrego

rigidas al genoma propiamente, haciendo una lectura de la secuencia de los pares de aminoá-cidos presentes y que resulta ser la prueba más sensible y específica hasta hoy desarrollada Sin embargo, si se considera que para evaluar mues-tras ambientales de agua de mar se requiere ha-cer un tamizaje inicial, estas pruebas resultan ser sumamente caras y aunque relativamente senci-llas no dejan de ser sofisticadas para cumplir este propósito

Las técnicas directas como la tinción con naranja de acridina (Back y Kroll, 1991) y 4,6 diamidino-2-fenilindol (DAPI) han sido también muy usadas, sin embargo la inexactitud de am-bos métodos sólo provee información sobre la presencia de materia orgánica o de organismos unicelulares en general La inmunofluorescencia directa (DFA) es un método altamente específico de tinción (Huq et al., 1990; Colwell et al., 1992; Hasan et al., 1993, 1994; Chowdhury et al., 1995), pero las muestras procesadas con esta técnica deben ser evaluadas por un observador con ex-periencia Aunado a lo anterior, la observación de laminillas es una actividad aburrida, que con-sume mucho tiempo y que produce cansancio y esto repercute en la validez de las observaciones conforme el número de muestras se incrementa

La utilización de métodos automatizados puede ser la respuesta a este problema Si se lo-gra hacer una lectura de las laminillas en forma automática, los investigadores se verán releva-dos de la tediosa actividad de identificar y contar organismos y esto redundará en mayor eficien-cia para esta tarea En este sentido, los sistemas ópticos de reconocimiento empiezan a ser de interés para los biólogos, ya que permiten hacer observaciones más rápidas y precisas sobre los organismos a identificar

Desde la introducción de las técnicas de filtraje por vander Lugh (1964), se han venido utilizando con éxito métodos de correlación óp-tica en el reconocimiento de patrones, utilizando diversos tipos de filtros basados en la forma del objeto

En biología, se pueden mencionar los trabajos con filtros armónicos circulares de Zavala-Hamz y Álvarez-Borrego (1997) para el reconocimien-to de diferentes especies de copépodos y los de Pech-Pacheco y Álvarez Borrego (1998) sobre fil-tros clásicos para especies fitoplanctónicas

Sin embargo, el reconocimiento de una bac-teria es una tarea compleja La forma de las bacterias no provee información suficiente para su identificación, porque además de ser organis-mos muy simples, muchas especies comparten la misma forma El Vibrio cholerae O1 es un bastón curvo transparente, igual que todo el género Vi-brio y la familia vibrionaceae

Para resolver este problema, se puede marcar a esta bacteria con anticuerpos monoclonales y darle un color verde fluorescente específico Con la técnica de la correlación óptica a color incre-menta la capacidad de los filtros para el reconoci-miento de patrones El análisis de la información, tanto de la forma como de color específico, sería la variante metodológica que da la posibilidad de identificar al bacilo con eficiencia

El color y la forma de la bacteria dependen de la longitud de onda con que es iluminada, esto quiere decir que el color introduce información adicional para la efectividad del reconocimiento La descomposición de un objeto policromático en tres canales monocromáticos (rojo, verde y azul RGB, por sus siglas en inglés) permite rea-lizar un reconocimiento independiente en cada uno de ellos, la suma de estos resultados produce un alto nivel de certeza en la identificación del organismo En este caso en particular, la pre-sencia de información de valores altos de corre-lación en el canal verde y valores muy bajos de correlación en los otros dos canales, rojo y azul, nos ayuda a identificar al Vibrio cholerae O1 y discriminar otras partículas o bacterias (Mouri-ño-Pérez, 1998)

Los cambios de morfología, orientación y ta-maño de esta bacteria son un problema que se tiene que resolver; para esto se necesita de un sistema invariante a posición, escala, rotación y color como el que se muestra en el capítulo II de este libro (aunque ahí sólo se usaron imágenes de blanco y negro) donde se utiliza la transformada de escala combinada con otras transformaciones Una alternativa al respecto pueden ser los siste-mas ópticos coherentes que se han desarrollado para la identificación de diversos objetos a par-tir de su patrón de difracción o transformada de Fourier (TF) Esta transformación contiene toda la información de las frecuencias (forma) de los objetos por detectar; a través de filtros digitales realizados con esta información, se comparan

93Correlación óptico-digital a color para el reconocimiento de Vibrio cholerae O1

muestras reales con un sistema de correlación que permite identificar la presencia o ausencia del objeto y, en su caso, cuantificarlo

Basadas en la transformada de Fourier, se han desarrollado diversas técnicas para el re-conocimiento óptico de patrones Los primeros experimentos de filtraje de imágenes fueron rea-lizados a fines del siglo pasado por Abbe (1873) y retomados por Porter en 1906 En estos pri-meros trabajos se establecieron las bases para el tratamiento óptico de imágenes a través de su espectro de frecuencias o de Fourier

Maréchal (1952) introdujo lo que se conoce como correlacionador óptico, utilizando la trans-formada de Fourier para mejorar la calidad de fotografías mediante filtraje de luz coherente

vanderLugt (1964) inició con el uso de téc-nicas ópticas coherentes Consiste en el recono-cimiento de patrones utilizando filtros acoplados (matched filters) o “clásicos” a través de corre-laciones matemáticas de la imagen de entrada y la imagen grabada en el filtro, reconociendo los objetos sin importar su posición en el plano de entrada gracias al patrón de difracción que colo-ca la información en el centro

Posteriormente se han desarrollado diversas técnicas de filtraje espacial que han sido utiliza-das ampliamente para el reconocimiento de di-versos objetos En un principio esta aplicación se centraba en la industria militar (Caufield y Ma-loney, 1969; Casasent y Psaltis, 1976) A partir de los años setenta se utilizaron para reconocimien-to óptico de imágenes cada vez más complejas con objetos movidos, rotados, escalados, degra-dados o fuera de foco Esto ha dado lugar al de-sarrollo de técnicas invariantes, es decir, técnicas que reconocen como idénticos a objetos iguales a pesar de tener cambios de posición, escala, orientación, etc Sin embargo el procesamiento invariante es una tarea difícil y es por esto es que hay múltiples técnicas encaminadas a resolver este problema (Cairns et al , 1972; Almeida et al , 1976; Jeffries et al , 1980, 1984; Wood, 1996; Zavala-Hamz y Álvarez-Borrego, 1997; Pech-Pacheco y Álvarez-Borrego, 1998)

En este sentido las técnicas híbridas opto-di-gitales permiten un procesamiento rápido y efi-ciente de imágenes y facilitan el reconocimiento invariante al realizar un preprocesamiento di-gital a la imagen de entrada del sistema óptico

(Jeffries et al , 1980, 1984; Arsenault, 1986; Zava-la-Hamz y Álvarez-Borrego, 1997; Pech-Pacheco y Álvarez-Borrego, 1998)

II. Metodología

El presente trabajo consta de dos etapas La pri-mera es el procesamiento microbiológico para el desarrollo de diferentes estadios de Vibrio cho-lerae O1 a través de la creación de un microcos-mos con baja concentración de nutrientes para conducir a la bacteria hasta el estadio de “viable pero no cultivable” Esta etapa incluyó la tinción de muestras con anticuerpos monoclonales y la preparación de muestras para la vigilancia de los cambios morfológicos con el microscopio elec-trónico de barrido Además se procesaron mues-tras de agua de mar con y sin la bacteria con la técnica de inmunofluorescencia directa

La otra etapa consistió en la toma de imáge-nes con el microscopio de epifluorescencia para ser sometidas al procedimiento de reconoci-miento y conteo de la bacteria haciendo un pre-procesamiento digital para la descomposición de las escenas en canales (RGB) Se seleccionaron las imágenes idóneas para elaborar los filtros y hacer las correlaciones de cada imagen proble-ma con los filtros de fase sin invariancias Para el reconocimiento invariante a posición, rotación y a escala se llevó a cabo la metodología presenta-da en la primera parte del capítulo II (Álvarez Borrego et al., 2002)

II.1. Procedimiento microbiológico

II.1.1. Preparación del microcosmos

Dos frascos (Pyrex) de 250 ml fueron lavados y enjuagados seis veces consecutivas con agua li-bre de partículas, bidestilada y deionizada (Des-tilador Corning Mega-PureTM System MP-IIA y Deionizador Barnstead Mod D0604) Los fras-cos se llenaron con 160 ml de una simulación de agua de mar con 20 0/00 de salinidad, prepara-da con 13 7 g de NaCl, 2 3 g de Na2SO4, 0 38g de KCl, 0 112g de NaHCO3, 0 015g de H3BO3, 0 0016g de NaFl, 0 023g de MgCl2

6H2O, 0 5g extracto de bilis en 1000 ml de agua bidestilada y deionizada y 0 5% de peptona con un pH ajus-


tado de 7 4 y esterilizado por autoclave a 121ºC por 20 minutos

II.1.2 Desarrollo de estadios de Vibrio cholerae O1

II.1.2.1 Inoculación del microcosmos y procesamiento de muestras

Dos cepas de Vibrio cholerae O1 de la Facultad de Medicina de la unam, Inaba Eltor FMv087145 y Owaga Eltor FMv088226 fueron cultivadas en T1 N1 por 24 horas a 37 ºC

Cada frasco con 160 ml de agua de mar simu-lada a 20 0/00 de salinidad, fue inoculado con una asada de cada cepa e incubado a 25 ºC por 120 días Se recolectó un ml del contenido de cada uno de los frascos diariamente y se sembró una asada en T1 N1 para corroborar el cambio al es-tadio no cultivable A partir de la fecha en que dejó de crecer en el medio de cultivo, se tomó una muestra cada 15 días hasta completar 120 días Las muestras tomadas se estabilizaron con 3% de formaldehído para su conservación

Cada muestra se procesó tanto por la técni-ca de inmunofluorescencia directa (DFA) como para ser observadas por microscopía electrónica de barrido En ambos casos se tomaron imáge-nes, las procesadas con DFA para utilizarlas en el sistema de reconocimiento y las otras para la vigilancia de los cambios morfológicos en cada uno de los estadios del Vibrio cholerae O1

II.1.2.2. Tinción del Vibrio cholerae O1 con inmunofluorescencia directa

El kit IFD (New Horizons Diagnostic Co ) con-siste en MAb-FITC conjugado liofilizado, un me-dio de montaje fluorescente que contiene 2 5% (wt/vol ) 1,4-diazobicyclo-(2,2,2) octano (Sigma Chemical Co ) y un agente antifotoblanquea-dor (que protege a las bacterias de un desteñi-do rápido de la tinción por inmunofluorescencia durante su observación por el microscopio de epifluorescencia), un control positivo (107 Vibrio cholerae O1 por ml en formaldehído al 3%) y un control negativo (107 Vibrio cholerae no-O1 por ml en formaldehído al 3%)

El procedimiento para la tinción con anti-cuerpos monoclonales consiste en los siguientes

pasos: se coloca una gota de 5 µl de cada una de las muestras en un portaobjetos con ocho pozos cada uno, junto con 5 µl del control positivo y negativo Las muestras se secaron a 37 ºC y se fijaron con metanol puro El liofilizado de MAb-FITC conjugado se reconstituye con 1 ml de agua bidestilada y deionizada, aplicando 5 µl en cada pozo Los portaobjetos se incuban en una cámara obscura húmeda a 37 ºC por 30 minutos, después se lavan con PBS (Buffer fosfato) al 0 01 Mol y se secan gentilmente con papel absorben-te En cada orificio se aplica una gota de glicerol y se cubren con un cubreobjetos

Para la lectura de las laminillas se utilizó un microscopio de epifluorescencia Axiovert 100 (Carl Zeiss, Inc New York, N Y ) con una lámpara de mercurio de alta presión Hbo50W Se usó un filtro excitador pasa banda de 450-490 nm (25-mm de diámetro; Carl Zeiss) para trans-mitir la longitud de onda para la excitación de la fluorescencia

II.2. Muestras ambientales

Las muestras de agua de mar que se utilizaron para las imágenes de especimenes ambientales fueron aportadas por el Laboratorio de Biotec-nología Marina del Departamento de Acuicultu-ra del CICESE y procesadas con la técnica de DFA La presencia de Vibrio cholerae O1 fue confirmada por reacción de la cadena de poli-merasa

II.2.1 Toma y procesamiento de imágenes de Vibrio cholerae O1 fluorescente

Se grabaron imágenes de Vibrio cholerae O1 con una cámara CCD a color (EDC-1000E) con píxe-les de 7 4 µm x 7 4 µm, y una resolución espa-cial de 652(H) x 494(v) píxeles Cada escena se almacenó en un archivo bitmap digitalizándola con el programa Electrim-1000 Las imágenes se fraccionaron en matrices de 256 x 256 píxeles e incluso se generaron imágenes aleatorias, la infor-mación en los canales rojo, verde y azul (RGB) se separó mediante el programa Adobe Photoshop v 5 0 y se definió como la función f(x,y) para cada píxel de las coordenadas x y y de la imagen


II.2.2. Procedimiento para el reconocimiento de Vibrio cholerae O1

II.2.2.1. Reconocimiento de Vibrio cholerae O1 en imágenes a color con filtros de fase sin invariancias

Como se mencionó antes, el reconocimiento de una especie particular de bacterias a través de los patrones de difracción es muy difícil si se considera exclusivamente la forma, porque ésta no brinda la suficiente información para diferen-ciar una especie de otra, debido a que muchas de ellas la comparten En el caso específico del Vibrio cholerae O1 el color resulta una fuente im-portante de información para el reconocimiento de esta bacteria

El procedimiento en un sistema óptico se lleva a cabo utilizando un correlacionador 4F como el que se mostró en el capítulo III de este libro Este correlacionador consta de dos fuentes de luz coherente de láser de HeNe (λ=633nm) para la longitud de onda del canal rojo y de un láser Argón para los canales verde y azul (λ=514 y λ=477 respectivamente), de tres lentes, la pri-mera para colimar la luz convirtiéndola de on-das esféricas a planas, la segunda que realiza la transformada óptica de Fourier y la tercera para la transformada inversa de Fourier

En el plano de entrada se encuentra una pantalla de cristal líquido que está conectada a un microscopio a través de una computadora y un CCD a color (Charged Coupled Device) para captar las imágenes por analizar En el plano de Fourier se encuentra otra pantalla de cristal lí-quido conectada a una computadora donde son colocados los filtros que serán utilizados en el re-conocimiento de la bacteria en cada canal RGB y en el plano de salida una cámara CCD para el registro del resultado de la correlación

II.2.2.1.1. Procedimiento de correlación

La correlación se realiza colocando la función fλi (x1,y1) (con i=R,G,B) en el plano de entrada que corresponde a la imagen problema separa-da en sus componentes RGB digitalmente En el plano de Fourier se coloca la señal gλi del filtro, grabada también en cada uno de los canales En

el caso de los filtros vander Lugt o clásicos esta función se escribe como:

(1)

donde Gλi , es la transformada de Fourier de gλi(x2,y2), en coordenadas cartesianas en el plano de Fourier y jλi es la fase

Ahora,

(2)

cuando la amplitud Gλi (u,v)=1, por tratarse de un filtro exclusivamente de fase (POF), que son los utilizados para las correlaciones en este tra-bajo

Para cada canal la correlación entre la fun-ción de entrada fλi (x1,y1) y la función del filtro gλi(x2,y2) se obtiene cuando el correlacionador es iluminado con la misma longitud de onda que se utiliza para grabar el filtro y está dada por:

(3)

que es la función de correlación en el plano sa-lida, Fλi(x2,y2) es la FFT de fλi(x1,y1) y FFT-1 es la transformada inversa de Fourier (Mouriño-Pé-rez et al., 2006)

En general, los objetos que tienen un deter-minado componente Fλi(x2,y2) similar al compo-nente del filtro Gλi(x2,y2) tendrán una correlación máxima en ese canal (λi) La identificación co-rrecta se lleva a cabo cuando simultáneamente se encuentran picos máximos de correlación en los tres canales Sin embargo, en el caso particu-lar del Vibrio cholerae O1, que es teñido con an-ticuerpos monoclonales de un color verde fluo-rescente específico, la identificación correcta se da por la presencia de un máximo de correlación en el canal verde y mínima en los canales rojo y azul en los que no tiene información, así cual-quier objeto que presente picos de correlación en el verde al igual que en el rojo y el azul no se considerarán como Vibrio cholerae O1, sirviendo como un criterio de discriminación

En este trabajo se llevó a cabo una simulación numérica del procedimiento del correlacionador 4F haciendo tres correlaciones Cλi(x3,y3) entre la escena a ser analizada fλi(x1,y1) y el filtro de la bacteria a ser detectada Gλi(x2,y2) Se utilizaron

5

( =633nm) para la longitud de onda del canal rojo y de un láser Argón para los canales verde y azul ( =514 y =477 respectivamente), de tres lentes, la primera para colimar la luz convirtiéndola de ondas esféricas a planas,

la segunda que realiza la transformada óptica de Fourier y la tercera para la transformada inversa de Fourier.

En el plano de entrada se encuentra una pantalla de cristal líquido que está conectada a un microscopio a través de una computadora y un CCD a color (Charged Coupled Device) para captar las imágenes a analizar. En el plano de Fourier se encuentra otra pantalla de cristal líquido conectada a una computadora donde son colocados los filtros que serán utilizados en el reconocimiento de la bacteria en cada canal RGB y en el plano de salida una cámara CCD para el registro del resultado de la correlación.

II.2.2.1.1 Procedimiento de correlación La correlación se realiza colocando la función f i (x1,y1) (con i=R,G,B) en el plano de entrada que corresponde a la imagen problema separada en sus componentes RGB digitalmente. En el plano de Fourier se coloca la señal g i del filtro, grabada también en cada uno de los canales. En el caso de los filtros Vander Lugt o clásicos esta función se escribe como:

)),(exp(),(),( vujvuGvuGiii

, (1)

donde G i , es la transformada de Fourier de g i(x2,y2), en coordenadas cartesianas en el plano de Fourier y i es la fase. Ahora,

),( vuGi

= )),(exp( vuji

, (2)

cuando la amplitud ),(G vui

1, por tratarse de un filtro exclusivamente de fase (POF), que son los

utilizados para las correlaciones en este trabajo.

Para cada canal la correlación entre la función de entrada f i (x1,y1) y la función del filtro g i(x2,y2) se obtiene cuando el correlacionador es iluminado con la misma longitud de onda que se utiliza para grabar el filtro y está dada por:

)),(),((),( 22*

221

33 yxGyxFFFTyxCiii

i=R,G,B (3)

que es la función de correlación en el plano salida, F i(x2,y2) es al FFT de f i(x1,y1) y FFT-1 es la transformada inversa de Fourier (Mouriño-Pérez et al., 2006).

En general, los objetos que tienen un determinado componente F i(x2,y2) similar al componente del filtro G i(x2,y2) tendrán una correlación máxima en ese canal ( i). La identificación correcta se lleva a cabo cuando simultáneamente se encuentran picos máximos de correlación en los tres canales. Sin embargo, en el caso particular del Vibrio cholerae O1, que es teñido con anticuerpos monoclonales de un color verde fluorescente específico, la identificación correcta se da por la presencia de un máximo de correlación en el canal verde y mínima en los canales rojo y azul en los que no tiene información, así cualquier objeto que presente picos de correlación en el verde al igual que en el rojo y el azul no se considerarán como Vibrio cholerae O1, sirviendo como un criterio de discriminación.

En este trabajo se llevó a cabo una simulación númerica del procedimiento del correlacionador 4F haciendo tres correlaciones C i(x3,y3) entre la escena a ser analizada f i(x1,y1) y el filtro de la bacteria a ser detectada G i(x2,y2). Se utilizaron para cada una los componentes R, G y B obtenidos de manera digital tanto de las imágenes de entrada y del filtro, se aplicó la transformada rápida de Fourier (FFT) y se consideró positivo el reconocimiento cuando se encuentran picos máximos de correlación sólo en el canal verde. III. Resultados

5






, (1)


),( vuGi

= )),(exp( vuji

, (2)





)),(),((),( 22*

221

33 yxGyxFFFTyxCiii

i=R,G,B (3)




5






, (1)


),( vuGi

= )),(exp( vuji

, (2)





)),(),((),( 22*

221

33 yxGyxFFFTyxCiii

i=R,G,B (3)




5






, (1)


),( vuGi

= )),(exp( vuji

, (2)





)),(),((),( 22*

221

33 yxGyxFFFTyxCiii

i=R,G,B (3)





para cada una los componentes R, G y B obte-nidos de manera digital tanto de las imágenes de entrada y del filtro, se aplicó la transformada rápida de Fourier (FFT) y se consideró positivo el reconocimiento cuando se encuentran picos máximos de correlación sólo en el canal verde

III. Resultados

Después de inocular el microcosmos con 0 5% de peptona y 20 0/00 de salinidad con las dos cepas de Vibrio cholerae O1 (Inaba y Ogawa) tomadas de especímenes clínicos de la colección de la Fa-cultad de Medicina de la unam, se mantuvo a 25 07±0 23 ºC durante 120 días La concentra-ción inicial de la bacteria se determinó por el método de dilución (vargas y Lizárraga, 1997), sembrando de 100 a 10-5, encontrando 69,000 UFC por ml

El Vibrio cholerae O1 creció en T1N1 hasta el día 22 del seguimiento, incluso en el duplica-do del experimento Se tomaron muestras de 1 ml durante los primeros 23 días de seguimiento y después cada quince días hasta completar 28 muestras en total

Las 28 muestras se procesaron con la técnica de inmunofluorescencia directa y se tomaron 70 imágenes de 652x494 píxeles con el CCD a color y se almacenaron en formato bitmap

III.1. Análisis de muestras de laboratorio

Se seleccionaron morfologías del estadio cultiva-ble y del no cultivable, la mayoría del primero tenían una forma de bastón recto o curvo y de la segunda casi una esfera De acuerdo a un análi-sis de dendrogramas no hay una distinción entre estas dos formas, la distancia euclidiana las agru-pa tomándolas indistintamente

III.2. Análisis de muestras del microcosmos inoculado con Vibrio cholerae O1

Las 70 imágenes tomadas se fraccionaron en 94 de 256 x 256 píxeles; además se grabaron 10 es-cenas de partículas de materia orgánica y otras bacterias del control negativo del kit de inmu-nofluorescencia, que a su vez se fraccionaron en

Se llevó a cabo la correlación de las 94 imá-genes con Vibrio cholerae O1 y de las 14 con par-tículas y otras bacterias (Vibrio cholerae no O1) con filtros de fase, con el procedimiento descrito en la metodología, repitiéndolo para cada canal

El promedio de los valores absolutos de co-rrelación de las 94 imágenes procesadas (vci), en el canal rojo fue de 24 77±14 06 con un in-tervalo de confianza al 95% (IC95%) de 21 89 a 27 65, para el canal verde de 265 20±114 6 y un IC 95% de 241 80 a 288 60 y para el canal azul de 23 62±14 06 y un IC95% de 20 75 a 26 50

En la figura 1 se muestran escenas de los cul-tivos de Vibrio cholerae O1 y la correlación en los canales RGB, respectivamente Se observa que el único canal con información sobre la correla-ción es el verde; el rojo y el azul tienen valores muy bajos

Este procedimiento se llevó a cabo en cada una de las etapas de desarrollo de la bacteria y

18

Figura 1

a b c

Imag

en

prob

lem

a C

anal

roj

o C

anal

ver

de

Can

al a

zul

Figura 1. Imágenes Vibrio cholerae O1 el primer día de segui-miento y los resultados de las correlaciones en los canales RGB con filtros de fase.

14 imágenes de las mismas dimensiones Cada imagen se descompuso en canales RGB

Imag

en p

robl

ema

a b c

Can

al ro

joC

anal

ver

deC

anal

azu

l


a b cen todos se hizo un reconocimiento y conteo ade-cuado del Vibrio cholerae O1 Sólo en aquellas imágenes en donde había bacterias muy cercanas se encontraron algunas dificultades, pero casi en todos los casos el sistema resolvió el problema

Las correlaciones de partículas y otras bacte-rias que principalmente son Vibrio cholerae no O1 (Nvc) mostraron un promedio del valor absoluto de correlación para el canal rojo de 145 70±32 19 con un IC95% de 127 90 a 163 55, para el canal verde de 272 34±88 44 con un IC95% 223 36 a 321 31 y en el canal azul de 81 51± 22 83 y un IC95% de 53 95 a 109 07

Los promedios de los valores absolutos de correlación para los canales rojo y azul son más altos en las escenas con partículas diferentes a Vibrio cholerae (t=23 31 y 6 64 respectivamente) (p<0 01) En el canal verde no se observan dife-rencias (t=0 32) (p>0 01) Al utilizar el isocci-nato de fluoresceína todo lo que está incluido en la muestra se tiñe de color verde; sin embargo, el bacilo del cólera es el único que tiene un color exclusivamente verde fluorescente más intenso en la pared bacteriana

Algunas partículas no toman un color pro-piamente verde, pero al ser descompuestas en canales RGB todas muestran información en uno o los dos canales adicionales Por esto los pi-cos de correlación son tan altos en el canal verde, pero igualmente importantes en los otros dos

En la figura 2 se muestran los resultados de las correlaciones de imágenes de materia orgáni-ca y otras bacterias En los canales rojo y azul apa-recen picos de correlación de los objetos al igual que en el canal verde En aquellos casos en los que además de la correlación positiva en el verde, se tiene una correlación positiva en uno o ambos canales espectrales adicionales, el objeto presente no es Vibrio cholerae O1

III.3. Análisis de muestras ambientales

Se tomaron 33 imágenes de muestras de agua de mar positivas a Vibrio cholerae O1 y 34 negativas Estas últimas se grabaron con una cámara foto-gráfica marca Nikon en película para diapositivas Elite chrome Extra Color de Kodak, ISO 100, revelada de manera convencional y digitalizadas con un digitalizador de diapositivas Nikon

En la tabla I se muestran los resultados de las correlaciones con los filtros de fase para cada canal y cada imagen procesada se etiquetó como positivas (mi) y negativas (mni)

Para aquellas que contenían el Vibrio chole-rae O1 se encontró un promedio de los valores absolutos de correlación de 67 36±39 61 y un IC95% de 53 31 a 81 40 para el canal rojo, de 180 50±55 86 con un IC95% de 160 69 a 200 31 para el canal verde y de 47 00±31 10 y un IC95% de 35 97 a 58 03 para el canal azul

Para las imágenes sin Vibrio cholerae O1 el promedio de los valores absolutos de correla-ción fueron en el canal rojo de 76 23±59 19 y un IC95% 55 59 a 96 86, para el canal verde de 237 14±72 83 y un IC95% de 211 73 a 262 56 y para el canal azul de 82 86±49 77 con un IC95% de 63 87 a 101 84

Al comparar los promedios de cada canal en-tre las muestras de agua de mar con y sin Vibrio cholerae O1 se encontraron diferencias entre los tres canales con una p<0 01

19

Figura 2

a b c

Imag

en

prob

lem

a C

anal

roj

o C

anal

ver

de

Can

al a

zul

Figura 2. Imágenes de bacterias y partículas parecidas a Vi-brio cholerae O1, y los resultados de las correlaciones en los canales RGB con filtros de fase.

Imag

en p

robl

ema

Can

al ro

joC

anal

ver

deC

anal

azu

l


Los valores promedio en todos los canales fueron más altos, incluyendo el verde en las imá-genes negativas al bacilo del cólera

La figura 3 muestra ejemplos de las imáge-nes positivas en las que se hizo un reconocimien-to eficiente de la bacteria, a pesar del ruido de fondo generado por los demás elementos en las escenas

20

Figura 3.

Can

al

rojo

Can

al

verd

e C

anal

azu

l Im

agen

pr

oble

ma

a b c d

Figura 3. Imágenes de Vibrio cholerae O1 en muestras de agua de mar y las correlaciones en los canales RGB con filtros de fase.

La figura 4 muestra las imágenes en las que el ruido de fondo impedía un reconocimiento claro de la bacteria Para resolver este problema se realizó un preprocesamiento (resaltando los bordes) de las imágenes problema y del filtro

En la figura 5 se presentan los resultados de las mismas imágenes de la figura 4 pero prepro-cesadas para la correlación Observamos que en todos los casos mejoró el reconocimiento

La figura 6 muestra ejemplos de las imáge-nes de agua de mar con diferentes partículas pero negativas al Vibrio cholerae O1

De las 33 imágenes positivas, con la correla-ción directa se identificó a la bacteria en 21 (0 64) y con el preprocesamiento en 31 (0 94) En las 34 escenas negativas se discriminaron como tales 29 (0 85), siendo dudoso el resultado en 4 y se obtuvo un falso positivo

21

Can

al

verd

e C

anal

azu

l Im

agen

pr

oble

ma

a b c d

Figura 4. C

anal

roj

o

Figura 4. Imágenes de Vibrio cholerae O1 en muestras de agua de mar y las correlaciones en los canales RGB con filtros de fase, en las que no hay un claro reconocimiento de la bacteria.

22

Can

al v

erde

C

anal

azu

l

Imag

en

prob

lem

a

a b c d

Figura 5

Can

al r

ojo

Figura 5. Imágenes de Vibrio cholerae O1 en muestras de agua de mar preprocesadas y las correlaciones en los canales RGB con filtros de fase.

La tabla I resume todos los resultados de las correlaciones por grupos de imágenes Se corro-bora que en aquellas imágenes sin Vibrio chole-rae O1 los promedios de los valores absolutos de correlación son más altos en los canales rojo y azul; incluso si se forman dos grandes grupos

Imag

en p

robl

ema

Can

al ro

joC

anal

ver

deC

anal

azu

l

Imag

en p

robl

ema

Can

al ro

joC

anal

ver

deC

anal

azu

l

Imag

en

prob

lem

aC

anal

rojo

Can

al v

erde

Can

al a

zul


considerando todas las imágenes positivas y to-das las negativas

III.4 Reconocimiento invariante a rotación, escala y posición

La figura 7 muestra los resultados de cada uno de los pasos de la transformada de escala, en el inciso (a) se observa tanto el filtro como la imagen problema en la que hay tres organismos con un ángulo θ distinto a la posición del filtro y variaciones mínimas de escala En el inciso (b) se presenta el módulo de la transformada de Fourier y se notan patrones claramente diferen-tes Posteriormente en (c) se muestra el filtro parabólico que atenúa las bajas frecuencias y re-salta las altas

En el inciso (d) se aplica el factor r que da la transformada de Escala vía la transforma-da de Mellin, siendo su efecto sólo en la escala Por último, en el inciso (e) se hace un cambio de variable con respecto a la escala con el Ln (r) incluyendo la interpolación bilineal que minimi-za el problema de fuga de información En estas figuras se observa como un todo el procesamien-to digital de cambio de escala de dos imágenes

23

Figura 6

a b c Im

agen

pro

blem

a C

anal

roj

o C

anal

ver

de

Can

al A

zul

Figura 6. Imágenes de agua de mar sin Vibrio cholerae O1 y los resultados de las correlaciones en los canales RGB con filtros de fase.

Tabla 1 Resumen de los valores absolutos de correlación en los canales

RGB de todas las imágenes con y sin Vibrio cholerae O1

Imágenes n Canales Media Intervalo de confianza al 95%

Desviaciónestándar

Error estándar

Vibrio cholerae O1 de muestras del microcosmos 94

RGB

24 77265 2023 62

21 89-27 65241 80-288 60

20 75-26 50

14 06114 2514 06

1 4511 781 45

Vibrio cholerae O1 de muestras de agua de mar

33RGB

67 36180 5047 00

53 31-81 40160 69-200 31

35 97-58 03

39 6155 8631 10

6 899 725 41

Partículas y otras bacterias (Vibrio cholerae No O1) 15

RGB

145 73272 3481 51

127 90-163 55223 36-321 3153 95-109 07

32 1988 4449 77

8 3122 8312 85

Sin Vibrio cholerae O1 de muestras de agua de mar 34

RGB

76 23237 1482 86

55 59-96 86211 73-262 5663 87-101 84

59 1372 8354 41

10 1412 49

9 33Total positivos

127RGB

35 84243 1929 70

30 58-41 09224 10-262 28

25 78-33 61

29 93108 7122 30

2 669 651 98

Total negativos 48 RGB

97 50247 9282 44

79 91-115 10225 30-270 53

67 36-97 53

61 2778 7252 52

8 7511 247 50

a b cIm

agen

pro

blem

aC

anal

rojo

Can

al v

erde

Can

al a

zul


diferentes, se convierten en casi idénticas y final-mente se realiza la correlación de la transforma-da de Fourier de estas funciones

Para corroborar el reconocimiento de las va-riaciones de escala se llevó a cabo la modifica-ción de una imagen de Vibrio cholerae O1 de 20 a 50% de su tamaño original con un delta de 5%

Las 27 imágenes resultantes se correlaciona-ron con la del tamaño inicial con y sin transfor-mada de escala Los coeficientes de correlación se presentan en la figura 8, donde se observa que

En el cuadro señalado con la letra (a) el punto aparece justo en el medio porque corresponde a la autocorrelación del tamaño original y se ob-serva el desplazamiento, en el eje y de los puntos de correlación de acuerdo al incremento y decre-mento del tamaño Esto mismo ocurre respecto al ángulo θ, donde hay un corrimiento en el eje x de 0 a 360º con respecto a la posición del orga-nismo en el filtro

También se valoró la correlación de los cam-bios de ángulo del organismo con respecto del filtro Se rotó la imagen de un Vibrio cholerae O1

24

Figura 7

Figura 7. Pasos de la trasformada de escala: a) Imágenes del filtro y del problema en el canal verde, b) Módulo de la trans-formada de Fourier, c) Función parabólica, d) Factor r apli-cado, e) Transformación de variables x, y a variables Ln(r), θ, e interpolación bilineal.

25

Figura 8

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

1.2

20 35 50 65 80 95 110

125

140

% de cambio

Coe

ficie

nte

de c

orre

laci

ónInvarianciasSin Invariancias

25

Figura 8

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

1.2

20 35 50 65 80 95 110

125

140

% de cambio

Coe

ficie

nte

de c

orre

laci

ón

InvarianciasSin Invariancias

Figura 8. Coeficientes de correlación de imágenes de Vibrio cho-lera O1 escaladas de 20 a 150% con una incremento de 5%.

son más altos cuando se realiza la transformada, a excepción de las variaciones de tamaño muy cercanas a la original Conforme se incrementa el cambio en ambos sentidos, la correlación sin invariancias baja

En la gráfica del resultado de la correlación de la imagen problema con el filtro, hay un cam-bio en la posición del pico de correlación Éste se va desplazando con respecto al centro, hacia aba-jo cuando el tamaño del organismo en la imagen problema es menor que el utilizado como filtro y hacia arriba cuando es mayor

Esta situación se ve muy claramente en la fi-gura 9, en la que se presentan las correlaciones de cada una de las imágenes en dos dimensiones


de 0 a 360º cada 10º y se llevó a cabo la correla-ción de las 37 imágenes resultantes con la que correspondía a 10º

En la figura 10 se muestran los coeficientes para cada una con y sin transformada de Escala Se observa que hay un valor superior cuando se realiza el procedimiento

En las figuras 11 y 12 se muestran algunos ejemplos de las imágenes de Vibrio cholerae O1 tomadas de muestras del microcosmos en las que

se aplicó un reconocimiento con transformada de escala

En la figura 11 en el inciso (e) se muestra una imagen problema en la que el organismo se encuentra en el mismo ángulo θ pero en tres ta-maños diferentes (120%, 100% y 60%) con res-pecto al filtro (11f) y en el inciso (a), el resultado de la correlación en el canal verde Se observa en el sitio que corresponde a 0º la presencia de tres picos uno en el centro y otros dos a la izquierda y derecha que es el corrimiento que se produce por

26

Figura 9

a

25%

150%

Figura 9. Correlación con la transformada de escala utilizando filtros de fase: a) Correlación en la que coincide el tamaño del Vibrio cholerae O1 del filtro y de la imagen problema.


27

Figura 10

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

1.2

0 30 60 90 120

150

180

210

240

270

300

330

360

Grados

Coe

ficie

nte

de c

orre

laci

ón

InvarianciasSin invariancias

27

Figura 10

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

1.2

0 30 60 90 120

150

180

210

240

270

300

330

360

Grados

Coe

ficie

nte

de c

orre

laci

ón

InvarianciasSin invariancias

Figura 10. Coeficientes de correlación de imágenes de Vibrio cholerae O1 rotadas de 0 a 360º con un incremento de 10º con transformada de escala.

28

Figura 11

Figura 11. Correlación con transformada de escala: a) y b) Correlación en el canal verde con filtros de fase. c) Gráfica de la línea 1 y 2 del inciso (a). d) Gráfica de las líneas 55, 60 y 65 del inciso (b). e) y g) Imágenes problema en el canal verde y f) y h) Imágenes del filtro en el canal verde.

el cambio de escala con respecto al filtro, a 180º se observa un armónico de este resultado pero de menor intensidad Si se grafica el transecto de la línea 1 y 2 del eje y, se observa con mayor claridad la presencia de los tres picos de correlación y ade-más se puede valorar cómo el ruido de fondo se encuentra en un nivel mas bajo (11c)

En el inciso 11(b) se presenta la correlación en el canal verde de la misma imagen pero con un filtro con un tamaño y orientación diferente, se puede observar como a 90º se presentan los tres picos de correlación Los picos se presentan en ese punto porque es el ángulo al que se en-cuentran los organismos de la imagen problema con respecto al filtro Al graficar los transectos de las líneas 55, 60 y 65 (11d) aparecen los tres picos de correlación: en azul el más parecido al tamaño del organismo del filtro, en verde el or-ganismo mediano y en rojo el más pequeño

En la figura 12e y g, la imagen problema pre-senta dos organismos con mínimas diferencias en escala y rotación, al correlacionarla con el filtro 12f que tiene la misma orientación y un tamaño similar, el pico de correlación se presenta a 0º Si la correlación se lleva a cabo con el filtro con el organismo a 90º (12h) y el resultado se muestra en el lugar del eje x que corresponde a esa ubi-cación Aunque son dos organismos se presenta un solo pico de correlación porque se enciman ambos resultados Este es un inconveniente para contar los organismos en un campo, pero la in-variancia a escala incrementa la eficiencia del reconocimiento, al aumentar los valores de co-rrelación independiente de la posición, escala y rotación

La figura 13a, b y c presenta los resultados en el canal verde de diferentes imágenes problema 13d, e y f y su correlación con dos filtros dife-rentes 13g, h e i En todos los casos se realizó un reconocimiento positivo de los organismos, y la ubicación de los picos de correlación tuvieron el mismo comportamiento, su posición en el eje x dependió del ángulo y en el eje y de la escala en referencia al filtro

La figura 14 muestra la correlación entre los dos filtros, que tienen un tamaño y orientación diferente, y aunque se presentan varios armó-nicos de la correlación en 14a el mas alto a 90º indica el verdadero pico de correlación; al pre-sentar este resultado en dos dimensiones se ve


el circulo rojo a 90º y corrido en el eje y hacia abajo (14b)

IV. Discusión

El impacto de las condiciones climáticas globales en la incidencia y distribución de enfermedades infecciosas, tales como el cólera, es un punto de gran interés actualmente para la epidemio-logía y la salud pública Para tener impacto en la prevención de los millones de muertes que se presentan al año por enfermedades emergentes, es necesario un mejor entendimiento de cómo los factores climáticos afectan la diseminación y persistencia de estas enfermedades

Tener clara la relación entre los cambios cli-máticos de pequeña a gran escala y sus efectos en la salud humana, permitirá hacer prediccio-nes sobre el comportamiento de organismos pa-tógenos, vectores, reservorios y huéspedes rela-cionados con un padecimiento en particular

El cólera es un claro ejemplo de cómo la incidencia, resurgencia y persistencia de los pa-decimientos infecciosos están íntimamente rela-cionadas con lo que ocurre en forma global en el ambiente El conocimiento de la ecología del Vibrio cholerae con relación a los cambios climá-ticos permitirá responder muchas de las pregun-tas que existen en torno a estos padecimientos

Figura 14. Correlación con transformada de escala: a) Corre-lación en el canal verde. b) Gráfica en dos dimensiones de la correlación, el círculo rojo encierra el pico que corresponde al reconocimiento. c) Imagen problema en el canal verde y d) Imagen del filtro canal verde.

29

Figura 12

Figura 12. Correlación con transformada de escala: a) y b) Correlación en el canal verde. c) y Gráfica de la línea a 0º del inciso (a). d) Gráfica de la línea a 90º del inciso (b). e) y g) Imagen problema en el canal verde y f) y h) Imagen del filtro en el canal verde.

30

Figura 13

Figura 13. Correlación con transformada de escala con filtros de fase: a), b) y c) Correlación en el canal verde. d), e) y f) Imágenes problema en el canal verde y g), h) e i) Imágenes del filtro en el canal verde.

31

Figura 14


(Colwell, 1996; Colwell y Patz, 1997) Sin em-bargo, esta tarea requiere de la generación de información confiable que permita establecer la asociación entre las variaciones estacionales, in-teranuales, interdecadales, decadales y de mayor periodo, la ecología del germen causal y las ca-racterísticas de la enfermedad (Colwell, 1996)

La ciclicidad de las pandemias de cólera y los patrones de ocurrencia de la enfermedad sugie-ren una estrecha relación con el océano y todo lo que en él ocurre (Colwell, 1996; Mouriño-Pérez, 1998) Las causas de esta ciclicidad no han sido bien establecidas, pero se han planteado algunas hipótesis sobre la relación del Vibrio cholerae con especies marinas menores como el fitoplancton y zooplancton, y la determinación de sus caracte-rísticas de acuerdo a los factores físicos que son los que rigen todos los cambios en el mar (Tam-plin et al , 1990; Colwell y Huq 1994a, 1994b; Co-lwell, 1996; Epstein, 1995)

Ha sido bien documentado el comporta-miento del cólera en relación con las variaciones climáticas estacionales y se ha especulado sobre su vinculación con cambios interdecadales como puede ser el evento de El Niño (Epstein, 1995; Colwell, 1996; Mouriño-Pérez, 1998)

La aparición y desaparición del Vibrio chole-rae de aguas costeras se produce con relación a las abundancias de organismos planctónicos que tienen relación con los factores antes menciona-dos (Colwell, 1996)

Si hay una deprivación de nutrientes y las condiciones de temperatura y salinidad no son adecuadas, es difícil la recuperación del baci-lo del cólera, no así cuando estas condiciones cambian (Singleton, 1982a, 1982b; Roszak et al , 1984; Rollins y Colwell, 1986; Tamplin y Colwell, 1986; Colwell y Huq, 1994a)

En el ambiente natural las condiciones de aporte de nutrientes y las características físicas y químicas son muy variables, esto condiciona que la presencia y virulencia del Vibrio cholerae pue-de cambiar en un sentido u otro (Colwell et al , 1995) Aportar información sobre la presencia de la bacteria en zonas costeras y su relación con las características del agua podría permitir hacer in-ferencias sobre su comportamiento y predecir su impacto en la población humana Sin embargo, determinar si la bacteria está presente o no y en qué concentración no es una tarea fácil, ya que

no basta con tomar una muestra de unos cuantos litros de agua e iniciar su búsqueda Aun cuando las condiciones ambientales sean óptimas para la bacteria, es factible aislarla a través de métodos convencionales de cultivo, si éstas cambian, sólo es posible detectarla por métodos directos por-que desarrolla un estadio en el que está viable pero no puede cultivarse

Otro problema para la detección es que el Vibrio cholerae en el ambiente marino no es muy abundante, por lo que la información necesaria sólo puede ser generada mediante la observación de un gran número de muestras con alguna técni-ca que tenga validez y confiabilidad y que permita identificar a la bacteria independientemente del estadio en que se encuentre

En este sentido se llevó a cabo el trabajo para evaluar el uso de los sistemas digitales con correlación a color para realizar en forma auto-matizada la identificación de la bacteria del có-lera y facilitar el aporte de información para el conocimiento de la ecología del Vibrio cholerae O1 y la epidemiología del cólera

Se reprodujo en un microcosmos un ambien-te similar al que se pudiera encontrar en un es-tuario, donde el aporte de nutrientes está limi-tado, para promover el desarrollo de diferentes estadios del Vibrio cholerae O1 con la finalidad de tener disponible la gama de posibilidades morfológicas en las que se puede encontrar el bacilo en su hábitat natural

Para sobrevivir en el ambiente acuático con deprivación de nutrientes, los microorganismos desarrollan mecanismos de supervivencia; uno de ellos es la rápida división y la involución de su tamaño y su virulencia (Baker et al , 1983) Aun-que en este caso no se corroboró la capacidad de la bacteria para producir enfermedad, sí se observó el incremento en el número de bacilos y reducción de su tamaño en un medio hostil al ser inoculado en el microcosmos simulando el agua de mar con 0 5% de peptona y 200/00 de salinidad e incubado durante 120 días a 25 ºC

A través del seguimiento por microscopía electrónica de barrido se registraron los cambios morfológicos de la bacteria desde una forma inicial de bastón curvo hasta la transformación a la forma esférica característica de los cocos y la paulatina reducción hasta 20% de su tamaño (de 2 5 µm a 0 5 µm) Cabe mencionar que se


eligió el microscopio de barrido en lugar del de transmisión, que es el utilizado en forma habi-tual, en virtud de que sólo se pretendía registrar la morfología y no los cambios internos de la cé-lula bacteriana

La metodología desarrollada de deshidrata-ción alcohólica con diferentes concentraciones de etanol (del 30% al grado reactivo) y la subse-cuente metalización con aluminio fue suficiente para que no se presentara deformación de la cé-lula Este procedimiento garantiza una adecuada observación de las características morfológicas bacterianas y no es necesario realizar los proce-dimientos costosos y complicados que describen algunos autores (Mercer y Birbeck, 1974)

Al sembrar diariamente las muestras del mi-crocosmos en T1N1, se recuperó por cultivo hasta el día 22 La duración de la bacteria en el estadio cultivable fue mayor que lo reportado por Grimes (1986), quien en sus hallazgos menciona que al-rededor del día diez de seguimiento decrece la concentración de bacterias de tal forma que a partir de ese día sólo fue posible observarlas me-diante técnicas directas como tinción con naranja de acridina o DAPI Estas diferencias pueden de-berse a que en este caso la concentración inicial de bacterias con la que se inoculó el microcosmos fue menor a la que empleó este autor Sin embar-go, hay coincidencia en que hasta el último día de seguimiento se logró identificar al bacilo con inmunofluorescencia directa, con la salvedad que no se corroboró su viabilidad, por no ser relevante para este trabajo

Uno de los objetivos planteados en este es-tudio es que el sistema de correlación a color re-conociera al Vibrio cholerae O1 haciendo distin-ción entre los estadios cultivable y no cultivable, por las características morfológicas y de tamaño de cada uno de ellos Se realizó un análisis de dendrogramas para establecer la distancia Eucli-diana de las posibles variaciones de la forma y la escala y seleccionar los filtros que identifica-rán cada estadio Sin embargo, los resultados no mostraron distancias euclidianas cuya magnitud permita distinguir por estas características si el Vibrio cholerae O1 podía ser recuperado por cul-tivo Es decir, no hubo diferencias suficientes para poder elaborar filtros que discriminaran en-tre uno y otro estadio

Con el sistema digital de correlación a color sin invariancias se evaluaron escenas grabadas en CCD de: a) muestras del microcosmos inoculado con Vibrio cholerae O1, b) control negativo del kit de inmunofluorescencia directa, c) muestras ambientales con Vibrio choleraea O1 y d) mues-tras ambientales libres de bacilos del cólera, gra-badas en película para diapositiva

Las 94 correlaciones multicanal de las esce-nas de Vibrio cholerae O1 obtenidas de las mues-tras del microcosmos, mostraron que la infor-mación más importante para la identificación y conteo de la bacteria se encuentra en el resulta-do de la correlación en el canal verde (promedio 265 20±114 25) Los canales rojo y azul mues-tran valores de correlación muy bajos (promedio de 24 77±14 06 y 23 62±14 06)

Al analizar las imágenes que no contenían a la bacteria, se encontraron valores de co-rrelación en los canales rojo y azul (promedio 145 73±32 19 y 81 51±49 77, respectivamente) significativamente diferentes a los observados en las imágenes con Vibrio cholerae O1

Basándose en esta evidencia, el algoritmo de decisión sobre la presencia de la bacteria se ha-ría de la siguiente manera: se considerará como positivas aquellas muestras que tengan picos de correlación en el canal verde y ausencia de éstos en los canales rojo y azul Si está presente la in-formación en estos últimos canales, se utilizará un umbral haciendo un corte a la mitad del valor de correlación en el canal verde De acuerdo a este algoritmo se evaluaron todas las escenas

En los trabajos realizados (Millán et al , 1989, 1991, 1992, 1995; Kober et al , 1997) por el grupo de la Universidad Autónoma de Barcelona, el al-goritmo de reconocimiento de un objeto se rea-liza mediante la suma aritmética o lógica de los máximos en cada canal Es decir, que se conside-rará identificado un objeto cuando los máximos valores de correlación coincidan en los tres ca-nales y se descartarán aquellos objetos que sólo tengan picos de correlación en uno de ellos

Las diferencias del algoritmo propuesto en este trabajo con los realizados antes se debe a que el reconocimiento de un objeto depende de analizar por separado los componentes mono-cromáticos en los canales RGB, después de se-parar la información de un objeto policromático en cada uno de ellos Si un objeto, como es el


caso del Vibrio cholerae O1, teñido con anticuer-pos monoclonales tiene información casi exclusi-vamente en un sólo canal, se tendrá que decidir el reconocimiento de acuerdo a lo propuesto en este trabajo Por lo tanto, para establecer el al-goritmo idóneo primero se deberá hacer un aná-lisis del contenido en cada canal del objeto por identificar Esto aportará información sobre la importancia de cada canal De hecho en los tra-bajos mencionados se ha eliminado sistemática-mente el canal azul, porque se ha fundamentado el escaso aporte de las correlaciones en este ca-nal En el presente trabajo también el canal rojo brindó más información para la discriminación entre objetos, pero en algunos casos negativos a la bacteria hubo máximos de correlación sólo en el canal azul, por lo que se recomienda realizar siempre el procedimiento en los tres canales

Es importante señalar que esta técnica sólo se había probado con problemas como letras o formas geométricas, y es la primera vez que se aplica en el análisis de organismos vivos, por lo que algunas de estas diferencias también se de-ben a la naturaleza de los objetos analizados en cada caso

Los valores de correlación en el canal verde son muy similares para todos los tipos de escenas valoradas incluso en algunos casos, donde no hay bacilos del cólera, son más altos Esto se debe a que los anticuerpos monoclonales tienen isocci-nato de fluoresceina que es un pigmento verde (Hasan et al., 1994, 1995) y al ser aplicado a la muestra, todo lo que está incluido se tiñe en to-nos de verde aunque su color original sea otro, esto parecería que dificulta el reconocimiento Sin embargo, sólo el Vibrio cholerae O1 toma un color verde brillante que tiene componentes mí-nimos en los otros dos canales y esa es la clave de la especificidad de la identificación

En lo referente a la eficiencia del sistema de correlación a color para el reconocimiento de Vibrio cholerae O1 en muestra del microcosmos y del control negativo, el reconocimiento de la bacteria fue casi de 100%

En la aplicación del sistema en muestras ambientales positivas y negativas, que es donde estriba la aplicación potencial de éste, se tuvo una sensibilidad de 64% y una especificidad de 85% realizando el procedimiento descrito en la metodología sin invariancias Esto quiere decir,

que de las 33 muestras positivas analizadas por el sistema de correlación a color, en 21 hubo un máximo de correlación en el canal verde que permitió reconocer a la bacteria (figura 3), en diez apareció el pico de correlación en la posi-ción del organismo pero también se presentaron picos producidos por el ruido de fondo en algu-nos casos con valores superiores a los del bacilo (figura 4) y sólo en dos el ruido de fondo tapó por completo los picos que correspondían con las bacterias (figura 4)

Para eliminar el ruido de fondo, se llevó a cabo un preprocesamiento de las imágenes pro-blema y del filtro; al evaluar nuevamente las imá-genes la sensibilidad, se incrementó hasta 94% (31 de 33) y sólo las dos imágenes que desde el proceso anterior no pudieron valorarse fueron falsas negativas

Se considera que la utilidad de una prueba está en función del nivel de medición que se pre-tende realizar y se ha definido que el propósito de la utilización del sistema de correlación a co-lor es realizar un tamizaje para facilitar la identi-ficación de las características de zonas de riesgo de cólera y su evolución Estos resultados sobre la validez de dicha técnica son satisfactorios para cumplir con el fin para el cual está siendo desa-rrollada

En este sentido, los resultados de la sensibi-lidad y especificidad son muy alentadores en la aplicación del sistema de correlación a color en muestras ambientales

Otro aspecto muy importante es la confiabi-lidad del sistema, se considera ésta como la capa-cidad que tiene una prueba o método para repe-tir una medición en circunstancias similares con la mínima variación Se puede afirmar que cual-quier observador humano, por experto que sea, puede tener variaciones al presentarle después de un tiempo una misma escena y sobre todo si ha tenido que valorar muchas antes que ésa La ventaja de la correlación a color es que para una misma imagen tendremos siempre el mismo re-sultado y esto no variará, independientemente del número de imágenes que se evalúen, y entre las imágenes también hay una mínima variación Prueba de ello es el error estándar de la media que se obtuvo para los valores absolutos de co-rrelación en cada uno de los canales y para cada


tipo de escena, en los que observamos valores bajos (tabla I)

La eficiencia del sistema también fue pro-bada en una serie de situaciones que pueden presentarse cuando se procesan imágenes, como puede ser el hecho de encontrar fuera de foco los objetos o hacer modificaciones en la escala o cualquier situación que propicie una pérdida de información; en estos casos el color resultó ser el elemento importante, debido a que la forma no proporcionaba datos suficientes

Al considerar imágenes más complejas, por tener un número mayor de píxeles, se pudo va-lorar que el sistema digital es útil para evaluar la matriz completa del sensor de la cámara CCD (652x494 píxeles) y fue factible reconocer y con-tar a la bacteria en las escenas evaluadas

Con el procedimiento sin invariancias fue po-sible cuantificar cuántas bacterias había en cada escena; una ventaja en las muestras ambientales es que la concentración en la que es posible en-contrarla es muy reducida, en un solo campo se encontraron únicamente de una a dos bacterias

Al utilizar la técnica de transformada de Es-cala para el reconocimiento invariante a escala, posición, rotación y color, se encontró que los valores de correlación normalizados son más al-tos al aplicar esta técnica que cuando se realiza la correlación sin invariancias, cuando la proba-mos en imágenes con diferencias exclusivamente de escala o de rotación

Al analizar las imágenes problema, se ob-serva que hay un desplazamiento de los picos de correlación de derecha a izquierda de acuerdo a la rotación con respecto al organismo en el fil-tro y de abajo hacia arriba de acuerdo a las di-ferencias en escala En las imágenes valoradas se reconoció la presencia del Vibrio cholerae O1, incluso cuando en una misma escena se encon-traban hasta tres organismos Esta técnica sólo había sido utilizada para correlaciones con imá-genes con un solo carácter (Pech-Pacheco et al , 2003) El único inconveniente de esta técnica es que en los casos en los que en una misma escena se tengan organismos con la misma orientación y escala, los picos de correlación se superpondrán en el resultado y se contarán como una sola

La utilización de este sistema es sencilla y requiere elementos mínimos de equipo de cóm-puto y de una cámara CCD a color El desarrollo

de las rutinas computacionales sin invariancias se lleva aproximadamente 5 segundos, y con in-variancias 8 segundos

V. Conclusiones

A través del seguimiento por microscopía elec-trónica de barrido se registraron los cambios morfológicos de la bacteria, desde una forma inicial de bastón curvo hasta la transformación a la forma esférica característica de los cocos, y la paulatina reducción hasta 20% de su tamaño (de 2 5 µm a 0 5 µm) La metodología desarro-llada de deshidratación alcohólica con diferen-tes concentraciones de etanol (de 30% al grado reactivo) y la subsecuente metalización con alu-minio fue suficiente para que no se presentara deformación de la célula bacteriana Este proce-dimiento garantiza una adecuada observación de las características morfológicas bacterianas y no es necesario realizar los procedimientos costosos y complicados que describen algunos autores

Al sembrar diariamente las muestras del mi-crocosmos en T1N1, se recuperó por cultivo hasta el día 22

Los resultados en el análisis estadístico por conglomerados no mostraron distancias eucli-dianas suficientes para distinguir el estadio del Vibrio cholerae O1 por sus características mor-fológicas, observándose de esta manera que no existen demasiados pleomorfismos (como lo aseguran otros investigadores) Los patrones de difracción tienen mayor similitud y guardan una mejor correlación entre sí que la correlación entre las propias imágenes Las distancias eucli-dianas de las imágenes originales son menores a las de las correlaciones de las que se alinearon a 90º, repitiéndose este mismo resultado en los patrones de difracción de las imágenes origina-les y alineadas

Las 94 correlaciones multicanal de las esce-nas de Vibrio cholerae O1 obtenidas de las mues-tras del microcosmos, mostraron que las corre-laciones más altas fueron en el canal verde En este canal es donde se hace la identificación y el conteo de la bacteria Los canales rojo y azul muestran valores de correlación muy bajos

Los valores de correlación en los canales rojo y azul en las imágenes que no contenían a


la bacteria fueron significativamente más altos (p<0 05) a los observados en las imágenes con Vibrio cholerae O1 El algoritmo de decisión so-bre la presencia de la bacteria es: se considera-rán como positivas aquellas muestras que tengan picos de correlación en el canal verde y ausencia de éstos en los canales rojo y azul Si está pre-sente la información en estos últimos canales, se utilizará un umbral haciendo un corte a la mitad del valor de correlación en el canal verde

Las diferencias del algoritmo propuesto en este trabajo con los realizados en otros grupos se deben a que el reconocimiento de un objeto de-pende de analizar por separado los componentes monocromáticos en los canales RGB

Los valores de correlación en el canal rojo fueron mayores que en el canal azul, por lo que los picos de correlación en este canal proporcio-naron más información para la discriminación entre objetos Pero en algunos casos negativos, sólo se presentaron picos en el azul Por tal razón se recomienda realizar siempre el procedimiento en los tres canales

Los valores de correlación en el canal verde son muy similares para todos los tipos de esce-nas valoradas; incluso en algunos casos donde no hay bacilos del cólera, son más altos

En lo referente a la eficiencia del sistema de correlación a color para el reconocimiento de Vi-brio cholerae O1 en muestra del microcosmos y del control negativo, el reconocimiento de la bac-teria fue casi de 100%

En la aplicación del sistema en muestras ambientales positivas y negativas, se tuvo una sensibilidad de 64% y una especificidad de 85% realizando el procedimiento descrito en la meto-dología sin invariancias

El preprocesamiento de las imágenes pro-blema y del filtro para encontrar bordes (trans-formada de Laplace) elimina el ruido de fondo La sensibilidad se incrementa hasta 94% (31 de 33) con preprocesamiento

Con la correlación a color con una misma imagen siempre se tendrá el mismo resultado y esto no variará, independientemente del nú-mero de imágenes que se evalúen La variación de las correlaciones entre imágenes similares es mínima

El sistema es eficiente en la identificación de Vibrio cholerae O1 en situaciones tales como: ob-

jetos fuera de foco, con modificaciones en la esca-la o cualquier situación que propicie una pérdida de información

El sistema digital es útil para evaluar la matriz completa del sensor de la cámara CCD (652x494 píxeles)

Con el procedimiento sin invariancias fue posible cuantificar las bacterias

Al utilizar la técnica de transformada de es-cala a través de la transformada de Mellin para el reconocimiento invariante a escala, posición y rotación, se encontró que los valores de correla-ción normalizados son más altos

Hay un desplazamiento de los picos de co-rrelación de derecha a izquierda, de acuerdo a la rotación con respecto al organismo en el filtro, y de abajo hacia arriba, de acuerdo a las diferen-cias en escala

En las imágenes valoradas se reconoció la presencia del Vibrio cholerae O1, incluso cuando en una misma escena se encontraban hasta tres organismos

El único inconveniente de esta técnica es que en los casos en los que en una misma escena se tengan organismos con la misma orientación y escala, los picos de correlación se superpondrán en el resultado y se contarán como una sola

La utilización de este sistema de correlación a color es sencilla y tiene requerimientos míni-mos de un equipo de cómputo y una cámara CCD a color

El desarrollo de las rutinas computacionales sin invariancias se lleva aproximadamente 5 se-gundos y con invariancias 8 segundos

El sistema de correlación a color multicanal es una herramienta útil para la identificación del Vibrio cholerae O1, independiente de su forma, tamaño y posición en muestras de laboratorio y ambientales, que permite contar el número de organismos presentes en cada imagen problema con mayor eficiencia cuando no se hace el proce-dimiento de transformada de escala

VI. Referencias

Abbe, E (1873) Archiv. Mikroskopische Anat., 9: 413

Almeida, S P , J K T Lu, P F Lai, J Cairns Jr y K L Dickson (1976) “Applications of holo-


graphy and optical data processing” En: E Maronm, A A Friesem y E Wiener-Aunear (eds ) Pergamon Press, 573 pp

Álvarez-Borrego, Josué, Rosa Reyna Mouriño Pérez, Gabriel Cristóbal Pérez, José Luis Pech Pacheco (2002) “Invariant recognition of polychromatic images of Vibrio cholerae 01”. Optical Engineering, 41(4): 827-833

Arsenault, H H (1986) “Rotation invariant composite filters” En: Nonlineal Optics and Applications SPIE, vol 613

Back, J P y R G Kroll (1991) “The differential fluorescence of bacteria stained with acridi-ne orange and the effects of heat” J. Appl Bacteriol, 71: 51-18

Baker, R M , T L Singleton y M A Hood (1983) “Effects of nutrient deprivation on Vibrio cholerae” Appl. Environ. Microbiol., 46: 930-940

Bingen, B (1993) “Arbitrarily primed polyme-rase chain reaction as a rapid method to di-fferentiate crossed form independent Pseu-domonas cepacia infections in cystic fibrosis patients” J Clin Microbiol., 31: 2589-2593

Blake, P A (1994) “Historical perspectives on pandemic cholerae” En: Vibrio Cholerae and cholera: Molecular to global perspectives American Society for Microbiology Was-hington, D C , pp 293-295

Bostock, J (1993) “Comparison of PCR fin-gerprinting, by random amplification of po-lymorphic DNA with other molecular typing methods for Candida albicans” J Gen Micro-biol., 139: 2179-2184

Cairns, Jr J , J K L Dickson, G R Lanza, S P Almeida y D del Balzo (1972) “Coherent optical spatial filtering of diatoms in water pollution monitoring” Arch. Microbiol., 83: 141-146

Casasent, D y D Psaltis (1976) “Scale invariant optical correlation using Mellin transforms” Opt. Comun., 17: 59-63

Caulfield, H J y W T Maloney (1969) “Impro-ved discrimination in optical character re-cognition” Appl. Opt., 8(11): 2350-2356

Cholera Working Group (1993) “Large epide-mic of cholerae like disease in Bangladesh caused by Vibrio cholerae O139 synonym Bengal” Lancet, 342: 387-390

Chowdhury, M A R , B xu, R Montilla, J A K Hasan, A Huq, R R Colwell (1995) “A simplified immunofluorescence technique for detection of viable cells of Vibrio chole-rae O1 and O139” J. Microbiol. Methods, 24: 165-170

Colwell, R R , J A K Hasan, A Huq, L Loomis, R J Siebeling, M Torres, S Galvez, S Islam, D Bernstein (1992) “Development and evaluation of a rapid, simple, sensitive, monoclonal antibody-based co-agglutination test for direct detection of Vibrio cholerae O1” FEMS Microbiol Letters, 97: 215-220

Colwell, R R , A Huq (1994a), “vibrios in the Environment: viable but non culturable Vi-brio cholerae” En: Vibrio cholerae and cho-lera. Molecular to global perspectives ASM Press

Colwell, R R y A Huq (1994b) Environmen-tal reservoir of Vibrio cholerae Annals New York Academy of Sciences, pp 44-54

Colwell, R R , A Huq, M A R Chowdhury, P R Brayton y B xu (1995) “Serogroup con-version of Vibrio cholerae” Can. J. Microbiol., 41: 946-950

Colwell, R R (1996) “Global climate and infec-tious disease: The cholera paradigm” Scien-ce, 274: 2025-2031

Colwell, R R y J A Patz (1997) Climate, infec-tious disease and health. An interdisciplinary perspective (a report) The American Acade-my of Microbiology, 23 pp

Epstein, P R (1995) “Emerging diseases and ecosystems instability: new threats to public health” Am. J. Public Health, 85: 168-172

Fernández de Castro, J (1991) “El cólera Un problema no resuelto” Ciencias, 24: 33-44

Ferreira, C , M S Millán, M J Yzuel y J Cam-pos (1992) “Experimental results in color pattern recognition by multichannel mat-ched filtering” Optical Engineering, 31(10): 2231-2238

Giesendorf, L (1994) “Polymerase chain reac-tion-mediated DNA fingerprinting for epi-demiological studies on Campylobacter spp” J. Med. Microbiol , 40: 141-147

Giono-Cerezo, S , L Gutiérrez Cogco, A M Hi-nojosa Ahumada (1991) Manual de procedi-mientos para aislamiento y caracterización de


Vibrio cholerae O1 Publicación Técnica del INDRE, núm 10 México

Grimes, T (1986) “The fate of entric pathogenic bacteria in estuarine and marine environ-ment” Microbiol Sciences, 3(11): 324-329

Hasan, J A K , A Huq, G B Nair, S Garg, A K Mukhopadhyay, L Loomis, D Bernstein y R R Colwell (1995) “Development and testing of monoclonal antibody-based rapid immunodiagnostic test kits for direct detec-tion of Vibrio cholerae O139 Synonym Ben-gal” J. Clin. Microbiol., 33(11): 2935-2939

Hasan, J A K , D Bernstein, A Huq, L Loomis, M L Tamplin y R R Colwell (1994) “Cho-lera DFA: An improved direct fluorescent monoclonal antibody staining kit for rapid detection and enumeration of Vibrio cholerae O1” FEMS Microbiol. Letters, 120: 143-148

Hasan, J A K , A Huq, M L Tamplin, R J Siebeling y R R Colwell (1993) “A novel kit for rapid detection of Vibrio cholerae O1” J. Clin. Microbiol., 32(1): 249-252

Huq, A , R R Colwell, R Rahman, A Ali, M A R Chowdhury, S Parveen, D A Sack y R Russek-Cohen (1990) “Detection of Vi-brio cholerae O1 in the aquatic environment by fluorescent-monoclonal antibody and cul-ture methods” Appl. Environ. Microbiol., 56: 2370-2373

Jeffries, H P , K Sherman, R Maurer y C Kat-sinis (1980) “Computer processing of zoo-plankton samples” En: Estuarine Perspec-tives v Kennedy, Ed Academic Press pp 303-316

Jeffries, H P , M S Berman, A D Poularikas, C Katsinis, I Melas, K Sherman y L Bivins (1984) “Automates sizing, counting and iden-tification of zooplankton by pattern recogni-tion” Mar. Biol., 78: 329-334

Kober, v , v Lashin, I Moreno, J Campos, L P Yaroslavsky y M J Yzuel (1997) “Color component transformations for optical pat-tern recognition” J. Opt. Soc. Am., 14(10): 2656-2669

Maréchal, A (1952) “Traité doptique instrumen-tale: première section, la formation des ima-ges” Revue dóptique théoretique et instrumen-tale, pp 23-35

Mercer, E H y M S C Birbeck (s/f) Manual de microscopía electrónica para biólogos Blume España CIC(5) 1064, 1974

Millán, M S , J Campos, C Ferreira, M J Yzuel (1989) “Matched filter and phase only filter performance in colour image recognition” Optics Communications, 73(4): 277-284

Millán, M S , M J Yzuel, J Campos y C Ferrei-ra (1991) “Strategies for the colour character recognition by optical multichannel correla-tion” SPIE Holographic Optics III: Principles and Aplications, 1507: 183-193

Millán, M S , M J Yzuel, J Campos y C Fe-rreira (1992) “Different strategies in optical recognition of polychromatic images” Appl. Optics, 31(14): 2560-2567

Millán, M S , M Corbalán, J Romero y M J Yzuel (1995) “Optical pattern recognition based on color vision models” Optics Letters, 20(16): 1722-1724

Mouriño-Pérez, R R (1998) “Oceanography and the seventh cholera pandemic” Epide-miology, 9(3): 355-358

Mouriño-Pérez, R R , J Álvarez-Borrego y C Gallardo-Escárate (2006) “Digital Color Correlation for the Recognition of Vibrio cholerae 01 in Laboratory and Environmen-tal Samples” Revista de Biología Marina y Oceanografía, 41(1): 77-86

Pech Pacheco, J L y J Álvarez-Borrego (1998) “Optical-digital system applied to the iden-tification of five phytoplankton species” J. Marine Biology, 132(3): 357-366

Pech Pacheco, J L , J Álvarez-Borrego, G Cris-tóbal-Pérez y M Keil (2003) “Identification and registration of image invariant to shi-ft, rotation and scale” Optical Engineering, 42(2): 551-559

Porter, A B (1906) “On the diffraction theory of microscopic vision” Phil. Mag., 11: 154-160

Rollins, D M y R R Colwell (1986) “viable but nonculturable stage of Campylobacter jejuni and its role in survival in the natural aqua-tic environment” Appl. Environ, Microbiol., 52(3): 531-538

Roszak, D B , D J Grimes y R R Colwell (1984) “viable but non-recoverable stage of Salmonella enteritidis in aquatic systems” Can. J. Microbiol., 30: 334-338


Sánchez, J L y D N Taylor (1997) “Cholera” The Lancet, 349: 1825-1830

Singleton, F L , Attwel T W , Jangi M S y Co-lwell R R (1982a) “Effects of temperature and salinity on Vibrio cholerae growth” Appl. Environ. Microbiol., 44: 1047-1058

Singleton, F L , T W Attwel, M S Jangi y R R Colwell (1982b) “Influence of salinity and organic nutrient concentration on survi-val and growth of Vibrio cholerae in aquatic microcosms” Appl. Environ. Microbiol., 43: 1080-1085

Tamplin, D L , A L Gauzens, A Huq, D A Sack y R R Colwell (1990) “Attachment of Vibrio cholerae serogroup O1 to zooplankton and phytoplankton of Bangladesh waters” Appl. Environ. Microbiol., 56: 1977-1980

Tamplin, M L y R R Colwell (1986) “Effects of microcosm salinity and organic substrate

concentration on production of Vibrio cho-lerae enterotoxin” Appl. Environ. Microbiol., 52(2): 297-301

vander Lugt, A (1964) “Signal detection by complex spatial filtering” IEEE Trans. Inf. Theory, IT-10,139

vargas Cárdenas, María Guadalupe y Marcial Leonardo Lizárraga Partida (1997, 2ª ed co-rregida y aumentada) Manual de prácticas de laboratorio del curso: “Bacteriología Marina” Manual de laboratorio, pp 82

Wood, J (1996) “Invariant pattern recognition: A review” Patern Recognition, 29(1): 1-17

Zavala Hamz, v y J Álvarez-Borrego (1997) “Circular harmonic filters for the recogni-tion of marine microorganisms” Appl. Op-tics., 36(2): 484-489

capítulo 5Sistema de evaluación automática para la detección del

bacilo de la tuberculosis

Manuel G. ForeroGabriel Cristóbal

I. Introducción

La bacteria Mycobacterium tuberculosis es la cau-sante de la tuberculosis pulmonar, aunque pue-de llegar a infectar otros órganos o tejidos tales como el cerebro, los riñones, los huesos y la piel La tuberculosis es la principal causa de muerte por enfermedad infecciosa en el mundo Según la Organización Mundial de la Salud (oms) un tercio de la población mundial (1722 millones de personas) está infectado por esta bacteria, se producen anualmente 10 millones de casos nuevos de tuberculosis activa en todo el mundo y fallecen tres millones de personas (Ginsberg, 1998) Algunos factores que han favorecido el incremento de la incidencia de esta enfermedad se deben a infecciones con el virus vih (a nivel mundial, la tuberculosis es la causa principal de muerte entre personas infectadas con el vih) y el aumento de la resistencia del bacilo a los fár-macos

Además de la sospecha clínica, el diagnóstico de la micobacteriosis debe ser hecho a través del cultivo de muestras de esputo La identificación del bacilo Mycobacterium tuberculosis se hace

rutinariamente usando técnicas fluoroscópicas en muestras de esputo tinturadas con auramina fluorescente, empleando un microscopio de fluo-rescencia El carácter no invasivo de este proce-dimiento es importante para el análisis del espu-to puesto que debe repetirse varias veces para lograr una detección precoz de la enfermedad (Crncevik-Urek et al., 2002) Estas técnicas care-cen de sensibilidad, por lo cual los especialistas deben esperar los resultados de los cultivos, los cuales pueden demorar hasta dos meses debido al hecho de que este bacilo requiere de 5 a 20 horas para duplicarse El análisis manual para la identificación de los bacilos involucra un trabajo intensivo en el cual se presenta una alta tasa de falsos negativos (veropoulos et al., 1999) El es-tudio automático puede ofrecer varias ventajas, tales como una reducción sustancial en el trabajo de los especialistas, mejorar la sensibilidad de la prueba, mayor precisión en el diagnóstico y un aumento en el número de imágenes que pueden ser analizadas

El proceso de análisis de las bacterias com-prende un proceso complejo, pues la forma no es suficiente para ser usada como característica dis-criminante, debido a que otros bacilos, especies y partículas presentan morfologías similares Por este motivo, el proceso de segmentación debe tener en cuenta la información aportada por el color de la bacteria para mejorar su respuesta En cuanto al estado de la técnica, cabe señalar que algunos trabajos ya han sido desarrollados para la segmentación de bacterias y otro tipo de células Wilkinson (1996) propuso una técnica rápida de segmentación basada en la obtención de diferentes umbrales para diferentes zonas de una imagen monocromática mediante técnicas

* Los autores agradecen a Luis Alcalá y María Jesús Ruiz, del Hospital General Gregorio Marañón de Madrid (HGGM), el haber puesto a su disposición las muestras clínicas que en este trabajo se mencio-nan, así como su ayuda inestimable en la evaluación de las muestras A Rafael Samaniego del HGGM, por su ayuda en la captura de imágenes en microscopía confocal Los autores también agradecen a Manuel Desco, del HGGM, y Jan Flusser, de la Academia de Ciencias de la República Checa, por las fructíferas dis-cusiones Este trabajo estuvo parcialmente financiado por los proyectos TEC2004-834, 2004CZ0009 y la red temática de investigación cooperativa IM3

114 Manuel G. Forero y Gabriel Cristóbal

de multirresolución Otros autores utilizaron la información de color como factor discriminante para la segmentación e identificación de bacte-rias (Álvarez-Borrego et al., 2000; Demantova et al., 2001) o en la segmentación de células en el diagnóstico del cáncer de pulmón (Sammouda et al., 1997, 1998) Una revisión de varios descrip-tores para caracterizar la forma y tamaño de mi-croorganismos presentes en imágenes digitales se encuentra en Liu et al. (2001) veropoulos et al. 1998, 1999, fueron los primeros en proponer técnicas de aprendizaje para la identificación del bacilo Mycobacterium tuberculosis. veropoulos empleó redes neuronales y máquinas de vector de soporte (SvM, por sus iniciales en inglés) para la clasificación de bacilos de la tuberculo-sis (veropoulos et al., 1998, 1999; veropoulos, 2001) En la literatura acerca del aprendizaje por máquinas, el problema de distinguir una cla-se (bacilo) de una clase formada por todos los demás elementos o clase rechazada es conocido como outlier detection o clasificación de una sola clase

Las soluciones más frecuentemente emplea-das están basadas en máquinas de vector de so-porte, algoritmos de agrupamiento y estimación de la densidad del núcleo (kernel density estima-tion) Este capítulo presenta el resultado de un trabajo que se ha llevado a cabo en los últimos años (Forero et al., 2001, 2002; Forero y Cristó-bal, 2003; Forero et al., 2004), y que ha conclui-do en el desarrollo de una nueva técnica para la segmentación e identificación de bacterias de la tuberculosis con el fin de establecer una muestra como positiva o negativa El método de segmen-tación incluye la información de color, como an-teriormente se ha indicado

Para su identificación, se utilizaron varios momentos invariantes como descriptores de ca-racterísticas de los bacilos El modelo estadístico empleado está basado en un modelo Gaussia-no mixto y una aproximación por Expectación-Maximización para encontrar la función de den-sidad de probabilidad del conjunto editado de bacilos de muestra y que representan las formas más comunes de los bacilos encontradas en las imágenes Por último, se utilizó un clasificador basado en la teoría de decisión Bayesiana para lograr su identificación

II. Material

El proceso de tinción de las muestras se llevó a cabo con especímenes clínicos tanto respirato-rios como no respiratorios, exceptuando la orina y la sangre Estos especímenes fueron teñidos con Auramina Flurocromada O y las imágenes se adquirieron mediante un microscopio de fluo-rescencia con una magnificación ×250

Debido a los artefactos que pueden presen-tarse en las muestras, es necesario revisar cui-dadosamente la morfología de los bacilos La confirmación de las muestras fluorocromas po-sitivas se llevó a cabo observando el crecimiento del bacilo Mycobacterium tuberculosis en cultivos de especímenes en medios sólidos y líquidos Las tomas de las muestras fueron analizadas con un fotomicroscopio Leica dotado de un sistema de iluminación fluorescente La adquisición de las imágenes se realizó con una cámara digital Spot Insight de Diagnostic Instruments, Inc El tiem-po de exposición fue de 0 9 segundos por imagen Se adquirieron de 8 a 100 imágenes cromáticas RGB de 1600 × 1200 píxeles por cada muestra (extensión) de esputo de varios sujetos Un resu-men del conjunto de datos obtenido se muestra en la tabla I Se adquirieron 473 imágenes nega-tivas críticas de 35 sujetos sanos y 308 positivas de 8 pacientes La expresión imágenes críticas se refiere a aquellas imágenes en las cuales se observa algún tipo de objeto, puesto que en mu-chas imágenes no se observa nada, tan sólo un fondo más o menos uniforme, que puede tomar una coloración negra o rojiza Para desarrollar las técnicas de segmentación e identificación se extrajo un conjunto de 1412 subimágenes de ba-cilos aislados a partir de 139 de las 308 imáge-nes positivas Las restantes 169 imágenes posi-tivas fueron empleadas para verificar la técnica desarrollada Debe notarse que el conjunto de bacilos adquiridos incluye todos los objetos en-contrados en las 139 imágenes que son supuestos bacilos Sin embargo, es preciso indicar que se presenta una dificultad debido a la subjetividad de los especialistas acerca de qué decisión habría de tomarse para considerar un objeto como baci-lo Por ello, se decidió tomar todas las subimáge-nes para analizarlas y luego emplear un método de edición para tratar de eliminar la subjetividad

115Sistema de evaluación automática para la detección del bacilo de la tuberculosis

en este conjunto de referencia, como se presenta más adelante

da produciendo una apariencia moteada Esta información es importante en el desarrollo de

Figura 1

Figura 1. Ejemplos de la morfología del Mycobacterium tuber-culosis.

Figura 2

la segmentación y el proceso de identificación como se presenta más adelante La figura 2 re-sume el proceso completo de segmentación, ex-tracción de características y clasificación seguido para evaluar una imagen, es decir identificarla como positiva o negativa Aunque es posible per-der varios bacilos en el proceso, la técnica debe producir el resultado correcto mediante la eva-luación de los objetos detectados

El barrido espectral de los bacilos teñidos con Auramina O fue realizado excitando la muestra con un láser azul (405 nm) y variando el filtro barrera El resultado, como se observa en la fi-gura 3, muestra que el bacilo presenta un brillo intenso en la frecuencia correspondiente al ver-de, mientras que la emisión es menos importan-te en otras frecuencias espectrales También se observa que el esputo y otras partículas no fluo-recen en la longitud de onda correspondiente al verde (550-625 nm), mientras que son más bri-llantes en el rojo (650-750 nm) donde presentan autofluorescencia La emisión correspondiente al azul (400-550 nm) no es significativa y pue-de descartarse Dado que el bacilo se manifiesta

Figura 2. Esquema de las etapas seguidas para la evaluación de una imagen.

Tabla 1Resumen de las imágenes usadas

Tabla 1

Resumen de las imágenes usadas.

Tabla 2

Descriptores del conjunto de bacilos de muestra editado

Tabla 3

Resultados obtenidos. 473 imágenes negativas y 169 positivas fueron empleadas en la prueba.

Tabla 4

Especificidad y sensibilidad encontrados por imagen para varios valores de . La prueba fue hecha con 473 imágenes negativas y 169 positivas.

Además de las imágenes mencionadas, y con el fin de verificar el mejor intervalo espectral para el análisis de las muestras, se adquirieron 14 imágenes más, en un microscopio confocal Leica TCS-SP2-AOBS, usando un barrido es-pectral (400 ≤ λ ≤ 750nm, en pasos de 25 nm) de unos bacilos de muestra teñidos con Aurami-na O También, con el fin de saber si los obje-tos redondos que aparecen en las imágenes son Mycobacterium tuberculosis, se adquirieron dos series de imágenes constituidas por cuatro pla-nos tomados a diferentes profundidades de foco de una muestra donde se observan tanto objetos redondos como alargados candidatos a ser iden-tificados como bacilos

II.1. Segmentación de imágenes

Dado que el fluorocromo utilizado para teñir la muestra es Auramina O, los bacilos presentan una fluorescencia verde que pasa por el amari-llo y puede llegar al blanco Esta bacteria mide entre 1 y 10 μm de largo, y 0 2 y 0 6 μm de ancho aproximadamente, pudiendo aparecer curvadas o rectas, tal como se aprecia en la figura 1 In-dividualmente los bacilos pueden mostrar zonas fuertemente teñidas y áreas de tinción alterna-


principalmente en el color verde, se escoge este canal para su detección mediante la segmenta-ción por bordes

El proceso de segmentación consta de varios pasos El primero, similar al propuesto con el mis-mo fin en (veropoulos et al., 1998, 1999), consiste en un operador de Canny, empleando un valor de a = 1, y se utiliza para detectar los bordes en el canal verde de la imagen Tras ese paso, se efectúa un proceso de selección de los máximos locales

del gradiente Posteriormente se realiza una um-bralización por histéresis con el fin de retener tan sólo los bordes formados por píxeles cuya magni-tud de gradiente es superior a un umbral bajo y que contienen al menos un píxel por encima de un umbral alto (Canny, 1986)

Debido a que algunas estructuras pueden es-tar abiertas en las imágenes obtenidas, se realizó una operación de cerrado morfológico Como resultado, puede observarse, tal como lo ilustra la figura 4c, que en algunas imágenes pueden se-guir apareciendo algunos bordes abiertos que no

Figura 3

Figura 3

Figura 3. Barrido espectral de una muestra de esputo.

Figura 4

Figura 4

Figura 4. Detalle de una muestra negativa. (a) Imagen origi-nal. (b) Canal verde. (c) Detección de bordes. (d) Cerrado. (e) Llenado de regiones cerradas. (f) Apertura. (g) Segmentación por color. Las figuras (c-g) muestran una zona ampliada de la imagen (a) para facilitar la visualización de los resultados de las operaciones morfológicas.


pertenecen a bacilos Puesto que estos bordes en general no tienen más que un píxel de ancho, su eliminación se logra llenando los pequeños agu-jeros que algunos contornos cerrados pueden contener y ejecutando luego una apertura mor-fológica

Posteriormente los objetos obtenidos son dis-criminados por su color, como se explica a conti-nuación

Los histogramas de color de cada canal y el perfil cromático de los bacilos permitieron com-probar que, como era de esperar de acuerdo al análisis espectral presentado antes, aquellos ba-cilos que presentan una coloración verde mues-tran un valor alto en ese canal y siendo muy bajo en los otros Los amarillos muestran un valor alto y similar en los canales rojo y verde Final-mente, cuando los bacilos aparecen con una co-loración blanca, el valor es alto y similar en los tres canales Además, se confirmó que el canal azul no aporta información para distinguir a los bacilos, lo cual concuerda con las conclusiones de Demantova et al. (2001)

Basados en estas características, se propuso una técnica adaptativa para binarizar las imáge-nes con el fin de extraer regiones que posean el color característico del bacilo Para encontrar el umbral se hizo un análisis del color del fondo y los valores máximos de color de las imágenes con el propósito de tomar en cuenta las variaciones en la iluminación

La figura 5 presenta una sección de una ima-gen típica conteniendo un bacilo, el perfil RGB correspondiente (figura 5c) a la línea que atra-viesa el bacilo (figura 5a) y el perfil RGB prome-dio (figura 5d) del rectángulo resaltado en la fi-gura 5b ubicado sobre el fondo de la imagen En ambos perfiles se observa que el canal verde pre-senta un valor uniforme, excepto en la pequeña zona correspondiente al bacilo Por lo tanto, una buena estimación de la luminosidad promedio puede obtenerse usando solamente la informa-ción entregada por el canal verde El umbral se define como una diferencia ponderada entre los valores de luminancia máxima y promedio obte-nidos del canal verde El valor de umbral t para segmentar las imágenes a color está dado por:

Figura 5

Figura 5

Figura 5. Características cromáticas de la imagen. (a) Ejemplo de una región que contiene un bacilo. (b) Región del fondo estudiada. (c) Perfil cromático RGB de la línea mostrada en (a). Puede observarse que el canal verde presenta los valores más altos. (d) Perfil cromático promedio del fondo corres-pondiente a la zona resaltada en (b). En éste puede verse como los valores de los canales rojo y azul son despreciables cuando se comparan con el verde.

donde representan los valores verde promedio y máximo, respectivamente

El peso a permite ajustar el umbral y fue se-leccionado de acuerdo a la intensidad promedio de las muestras de bacilo utilizadas Se evaluaron valores de a entre 1/3 y 2/3 Finalmente se eligió empíricamente un valor de a = 3/5, debido a que permite eliminar la mayoría de objetos que no son bacilos y que presentan un valor verde bajo

Dado que se observó que en la mayoría de bacilos el valor del verde es superior al rojo, lue-go de la binarización sólo se retuvieron aquellos objetos que poseen al menos un píxel en el cual el valor del color verde es mayor que el del rojo De esta manera pudieron ser suprimidos los detritus, que presentan una muy alta intensidad en todos los canales y permanecían aún sin eliminar

Así, un objeto es conservado si tiene al me-nos un píxel cuyo valor en el canal verde es supe-rior a 180 y mayor que el valor del canal rojo, en caso contrario el objeto es eliminado Las figuras 4 y 6 muestran los resultados obtenidos con esta técnica tras su aplicación a una imagen negativa y una positiva, respectivamente

proceso de identificación como se presenta más adelante. La figura 2 resume el proceso completo de segmentación, extracción de características y clasificación seguido para evaluar una imagen, es decir identificarla como positiva o negativa. Aunque es posible perder varios bacilos en el proceso, la técnica debe producir el resultado correcto mediante la evaluación de los objetos detectados.

El barrido espectral de los bacilos teñidos con Auramina O fue realizado excitando la muestra con un laser azul (405 nm) y variando el filtro barrera. El resultado, como se observa en la figura 3, muestra que el bacilo presenta un brillo intenso en la frecuencia correspondiente al verde, mientras que la emisión es menos importante en otras frecuencias espectrales. También se observa que el esputo y otras partículas no fluorecen en la longitud de onda correspondiente al verde (550-625 nm), mientras que son más brillantes en el rojo (650-750 nm) donde presentan autofluorescencia. La emisión correspondiente al azul (400-550 nm) no es significativa y puede descartarse. Dado que el bacilo se manifiesta principalmente en el color verde, se escoge este canal para su detección mediante la segmentación por bordes. El proceso de segmentación consiste de varios pasos. El primero, similar al propuesto con el mismo fin en (Veropoulos et al., 1998, 1999), consiste en un operador de Canny, empleando un valor de = 1, y se utiliza para detectar los bordes en el canal verde de la imagen. Tras ese paso, se efectúa un proceso de selección de los máximos locales del gradiente. Posteriormente se realiza una umbralización por histéresis con el fin de retener tan sólo los bordes formados por pixeles cuya magnitud de gradiente es superior a un umbral bajo y que contienen al menos un pixel por encima de un umbral alto (Canny, 1986). Debido a que algunas estructuras pueden estar abiertas en las imágenes obtenidas, se realizó una operación de cerrado morfológico. Como resultado, puede observarse, tal como lo ilustra la figura 4.c, que en algunas imágenes pueden seguir apareciendo algunos bordes abiertos que no pertenecen a bacilos. Puesto que estos bordes en general no tienen más que un píxel de ancho, su eliminación se logra llenando los pequeños agujeros que algunos contornos cerrados pueden contener y ejecutando luego una apertura morfológica. Posteriormente, los objetos obtenidos son discriminados por su color como se explica a continuación. Los histogramas de color de cada canal y el perfil cromático de los bacilos permitieron comprobar que, como era de esperar de acuerdo al análisis espectral presentado antes, aquellos bacilos que presentan una coloración verde muestran un valor alto en ese canal siendo muy bajo en los otros. Los amarillos muestran un valor alto y similar en los canales rojo y verde. Finalmente, cuando los bacilos aparecen con una coloración blanca, el valor es alto y similar en los tres canales. Además, se confirmó que el canal azul no aporta información para distinguir a los bacilos, lo cual concuerda con las conclusiones de Demantova et al. (Demantova et al., 2001). Basados en estas características, se propuso una técnica adaptativa para binarizar las imágenes con el fin de extraer regiones que posean el color característico del bacilo. Para encontrar el umbral se hizo un análisis del color del fondo y los valores máximos de color de las imágenes con el propósito de tomar en cuenta las variaciones en la iluminación. La figura 5 presenta una sección de una imagen típica conteniendo un bacilo, el perfil RGB correspondiente (Fig 5.c) a la línea que atraviesa el bacilo (Fig 5.a) y el perfil RGB promedio (Fig. 5.d) del retángulo resaltado en la figura 5.b ubicado sobre el fondo de la imagen. En ambos perfiles se observa que el canal verde presenta un valor uniforme, excepto en la pequeña zona correspondiente al bacilo. Por lo tanto, una buena estimación de la luminosidad promedio puede obtenerse usando solamente la información entregada por el canal verde. El umbral se define como una diferencia ponderada entre los valores de luminancia máxima y promedio obtenidos del canal verde. El valor de umbral t para segmentar las imágenes a color está dado por:

GGGt máx ,

donde G y máxG representan los valores verde promedio y máximo respectivamente. El peso permite ajustar el umbral y fue seleccionado de acuerdo a la intensidad promedio de las muestras de bacilo utilizadas. Se evaluaron valores de entre 1/3 y 2/3. Finalmente se eligió empíricamente un valor de =

proceso de identificación como se presenta más adelante. La figura 2 resume el proceso completo de segmentación, extracción de características y clasificación seguido para evaluar una imagen, es decir identificarla como positiva o negativa. Aunque es posible perder varios bacilos en el proceso, la técnica debe producir el resultado correcto mediante la evaluación de los objetos detectados.

El barrido espectral de los bacilos teñidos con Auramina O fue realizado excitando la muestra con un laser azul (405 nm) y variando el filtro barrera. El resultado, como se observa en la figura 3, muestra que el bacilo presenta un brillo intenso en la frecuencia correspondiente al verde, mientras que la emisión es menos importante en otras frecuencias espectrales. También se observa que el esputo y otras partículas no fluorecen en la longitud de onda correspondiente al verde (550-625 nm), mientras que son más brillantes en el rojo (650-750 nm) donde presentan autofluorescencia. La emisión correspondiente al azul (400-550 nm) no es significativa y puede descartarse. Dado que el bacilo se manifiesta principalmente en el color verde, se escoge este canal para su detección mediante la segmentación por bordes. El proceso de segmentación consiste de varios pasos. El primero, similar al propuesto con el mismo fin en (Veropoulos et al., 1998, 1999), consiste en un operador de Canny, empleando un valor de = 1, y se utiliza para detectar los bordes en el canal verde de la imagen. Tras ese paso, se efectúa un proceso de selección de los máximos locales del gradiente. Posteriormente se realiza una umbralización por histéresis con el fin de retener tan sólo los bordes formados por pixeles cuya magnitud de gradiente es superior a un umbral bajo y que contienen al menos un pixel por encima de un umbral alto (Canny, 1986). Debido a que algunas estructuras pueden estar abiertas en las imágenes obtenidas, se realizó una operación de cerrado morfológico. Como resultado, puede observarse, tal como lo ilustra la figura 4.c, que en algunas imágenes pueden seguir apareciendo algunos bordes abiertos que no pertenecen a bacilos. Puesto que estos bordes en general no tienen más que un píxel de ancho, su eliminación se logra llenando los pequeños agujeros que algunos contornos cerrados pueden contener y ejecutando luego una apertura morfológica. Posteriormente, los objetos obtenidos son discriminados por su color como se explica a continuación. Los histogramas de color de cada canal y el perfil cromático de los bacilos permitieron comprobar que, como era de esperar de acuerdo al análisis espectral presentado antes, aquellos bacilos que presentan una coloración verde muestran un valor alto en ese canal siendo muy bajo en los otros. Los amarillos muestran un valor alto y similar en los canales rojo y verde. Finalmente, cuando los bacilos aparecen con una coloración blanca, el valor es alto y similar en los tres canales. Además, se confirmó que el canal azul no aporta información para distinguir a los bacilos, lo cual concuerda con las conclusiones de Demantova et al. (Demantova et al., 2001). Basados en estas características, se propuso una técnica adaptativa para binarizar las imágenes con el fin de extraer regiones que posean el color característico del bacilo. Para encontrar el umbral se hizo un análisis del color del fondo y los valores máximos de color de las imágenes con el propósito de tomar en cuenta las variaciones en la iluminación. La figura 5 presenta una sección de una imagen típica conteniendo un bacilo, el perfil RGB correspondiente (Fig 5.c) a la línea que atraviesa el bacilo (Fig 5.a) y el perfil RGB promedio (Fig. 5.d) del retángulo resaltado en la figura 5.b ubicado sobre el fondo de la imagen. En ambos perfiles se observa que el canal verde presenta un valor uniforme, excepto en la pequeña zona correspondiente al bacilo. Por lo tanto, una buena estimación de la luminosidad promedio puede obtenerse usando solamente la información entregada por el canal verde. El umbral se define como una diferencia ponderada entre los valores de luminancia máxima y promedio obtenidos del canal verde. El valor de umbral t para segmentar las imágenes a color está dado por:

GGGt máx ,

donde G y máxG representan los valores verde promedio y máximo respectivamente. El peso permite ajustar el umbral y fue seleccionado de acuerdo a la intensidad promedio de las muestras de bacilo utilizadas. Se evaluaron valores de entre 1/3 y 2/3. Finalmente se eligió empíricamente un valor de =


II.2. Filtrado por tamaño y forma

Una vez que la imagen ha sido segmentada, sólo se conservan aquellos objetos cuyo color es cer-cano al de l bacilo Ahora es posible realizar un proceso de identificación con el fin de averiguar si los objetos son bacilos, en cuyo caso la imagen será dada como positiva Pero antes de realizar este proceso es aún posible eliminar algunos ob-jetos debido a su tamaño o forma De esta ma-nera, los objetos son filtrados de acuerdo a su área y excentricidad, eliminando aquellos obje-tos cuyo tamaño es demasiado grande o peque-ño, o cuya excentricidad es demasiado baja, es

decir que el objeto es demasiado redondo para ser un bacilo

La excentricidad, e, de un objeto se define como la razón entre la distancia focal y el eje mayor de la elipse que mejor se ajusta al objeto Con el fin de establecer las áreas mínima y máxi-ma aceptables y la mínima excentricidad acepta-ble se realizó un análisis estadístico del conjun-to editado de bacilos de muestra El proceso de edición de esta muestra se presenta en la sección 2 3 1

Dado que el área no es invariante al cambio de escala, se decidió tomar como valores de um-bral los valores de área mínima y máxima encon-trados en la muestra De esta manera se estable-ció 43 ≤ Area ≤ 207 (véase tabla II)

Figura 6

Figura 6

Figura 6. Muestra de imagen positiva. (a) Imagen original. (b) Canal verde. (c) Detección de borde. (d) Cerrado. (e) Llenado de regiones cerradas. (f) Apertura. (g) Segmentación por co-lor. Las figuras (c-g) presentan una zona ampliada de la figura (a) para facilitar la visualización de los resultados de las ope-raciones morfológicas.

Tabla 1


Tabla 2


Tabla 3


Tabla 4


Tabla IIDescriptores del conjunto de bacilos

de muestra editado

Puesto que la excentricidad es invariante al cambio de escala, la traslación y la rotación, su valor mínimo puede ser tomado de modo más restrictivo Por ello se escogió el valor medio entre las excentricidades promedio em y míni-ma mine, es decir e ≥( em −mine)/2 +mine = 0,8924

II.3. Análisis de características

Las imágenes de tuberculosis que se van a ana-lizar se caracterizan por contener una gran va-riedad de detritus, tanto en términos de tamaño como de forma Por consiguiente, se tiene un problema que a primera vista se presenta como una clasificación de objetos entre dos clases: ba-cilos y objetos rechazados Obviamente algunos objetos pueden tener una forma y tamaño simi-lar a la de los bacilos, lo cual puede producir un


incremento en el error de clasificación Por este motivo, se necesita definir un procedimiento que permita conseguir una distribución más restricti-va de la clase bacilo de tal manera que una gran mayoría de detritus pueda ser eliminado Como se observa en el conjunto de muestras tomadas, algunas de las cuales aparecen en la figura 7, los bacilos no presentan una forma uniforme Por consiguiente, es posible suponer que puede con-seguirse una mejor representación de los mismos si se organizan en varios grupos de acuerdo a su forma, grosor y longitud, tal como se ilustra en la figura 8

fin de retener y reconocer los descriptores más útiles, se desarrolló un proceso de eliminación y análisis Lo que se pretende es que los descrip-tores empleados sean independientes o que su grado de dependencia sea mínimo El empleo de un menor número de descriptores disminuye el tiempo de cálculo y en muchos casos permite obtener mejores resultados en la clasificación Suponiendo que los descriptores siguen una distribución Gaussiana, se representaron gráfi-camente todos los descriptores para un número diferente de grupos y se observó un cierto grado de superposición entre los grupos Como se ob-serva en la figura 9 para varios momentos de Hu, la excentricidad y la compacidad presentan una buena separación entre cada grupo de la clase bacilo Para conseguir una identificación más robusta es necesario que los descriptores sean invariantes al cambio de escala, traslación y rotación Debido a ello, sólo fueron retenidos la compacidad, la excentricidad, los momentos de Hu y los descriptores de Fourier, mientras los demás fueron descartados por no cumplir dicha condición Dado que algunos de los descriptores retenidos pueden ser irrelevantes o redundantes, fue necesario desarrollar un análisis para deter-minar cuáles pueden ser los más discriminantes

El primer criterio empleado para reducir el número de descriptores está dado por su gra-do de dependencia entre sí Los momentos in-variantes m se obtuvieron a partir de imágenes binarizadas, donde el interior del objeto toma el valor 1 y el fondo el 0 Los momentos centrales están dados por:

donde f(x, y) representa la imagen binaria, p y q son dos números enteros positivos siendo p + q ≤ 3 y x , y representa el centro de gravedad de f(x, y)

A partir de los momentos centrales es posi-ble definir momentos invariantes al cambio de escala, rotación y traslación Hu definió 7 mo-mentos de segundo y tercer orden φ1 a φ7 (Hu, 1962) Dado que los bacilos tienen una forma simétrica, los momentos de tercer orden e impar de orden superior son muy cercanos a cero Por esta razón, el primer momento de tercer orden de Hu φ3 es suficiente para reconocer los objetos

Figura 7

Figura 7. Muestras del conjunto de referencia usado para el desarrollo del estudio.

Figura 8

Figura 8

Figura 8. Representación de una clase. (a) Pobre represen-tación de la clase al usar solamente un agrupamiento repre-sentado por la elipse. (b) Mejor representación de la clase empleando varios agrupamientos para aproximar su distri-bución.

Se evaluaron varios descriptores para la re-presentación de los bacilos: área, compacidad, ejes mayor y menor, excentricidad, perímetro, solidez, los 7 momentos de Hu y los primeros 16 descriptores de Fourier normalizados Con el


Figura 9

Figura 9. Distribución de algunos descriptores (a) c. (b) e. (c) φ1. (d) φ

2 . (e) φ

3 . (f) φ

11 .

simétricos entre las muestras por estudiar, sien-do los demás redundantes (φ4 a φ7) Debe men-cionarse además cómo Flusser y Suk (Flusser y Suk, 1998) probaron la redundancia de algunos momentos de Hu, la cual no se presenta entre los primeros tres momentos escogidos Puesto que la discriminación puede incrementarse aña-diendo momentos invariantes pares de orden su-

perior, también se evaluaron algunos momentos invariantes de cuarto orden Sin embargo, tan sólo el denominado onceavo momento de Hu (voss et al., 2001) permitió obtener una buena separación entre agrupamientos (una referencia muy completa para las construcción de momen-tos invariantes se encuentra en Flusser, 2000)


Los tres primeros y el onceavo momentos de Hu están dados por:

(1)

donde

Es bien conocido que existe una relación en-tre los descriptores de Fourier y los momentos geométricos, dada por la siguiente expresión (Flusser y Suk, 1998):

(2)

donde (f, g) son las coordenadas en el dominio de la frecuencia Como se observa en la ecuación 2, esta relación es solamente válida cuando to-dos los momentos geométricos y los descriptores de Fourier son calculados hasta el infinito Sin embargo, no es frecuente utilizar estos descrip-tores simultáneamente En nuestro caso se prefi-rieron los momentos, puesto que los bacilos son objetos demasiado pequeños comparados con el tamaño total de la imagen y, por consiguiente, las características obtenidas de los contornos de los objetos son más susceptibles al ruido que los descriptores basados en la información de todo el objeto

La excentricidad e también puede obtener-se a partir de los momentos de Hu, mediante la expresión:

(3)

por lo tanto, e no es independiente de los dos primeros momentos de Hu y aunque fue utiliza-da para filtrar los objetos en el proceso previo, es inadecuada en el proceso final de clasificación de los mismos

La compacidad c se define como:

(4)

donde A y P representan el área y el perímetro del objeto respectivamente

La compacidad proporciona una medida de cómo la forma del objeto se acerca a la de un cír-culo y es independiente de los demás descripto-res usados Aunque la compacidad fue original-mente usada como descriptor, se encontró que no mejoraba sustancialmente los resultados de la clasificación y por ello fue descartada

Por consiguiente, para este problema en particular se concluyó que los tres primeros y el onceavo momentos de Hu eran suficientes para obtener una adecuada representación de la for-ma de los bacilos

II.3.1. Edición del conjunto de bacilos de referencia

El conjunto original de bacilos usados como referencia está constituido por los objetos se-ñalados como bacterias por los expertos en las imágenes positivas Este conjunto fue analizado con el fin de estudiar y sacar conclusiones acerca de su forma Este proceso permite establecer la distribución de las muestras y definir los pasos por seguir en la ejecución de la clasificación De esta manera es posible establecer, por un lado, si el conjunto de muestras tomado es adecuado y representativo y por el otro poder determinar si existen patrones o formas extrañas que pueden producir errores en la asignación de los objetos

El proceso de edición permitirá, por tanto, establecer si las características de los objetos a analizar se alejan de los objetos a clasificar (ba-cilos) o se acercan más a la de objetos a rechazar (no-bacilos) pudiendo aumentar el error en la clasificación Estos últimos no pueden ser utili-zados como prototipos, porque suelen aparecer en zonas cercanas a las regiones de decisión, afectando seriamente el resultado de la clasifica-ción (Cortijo, 2001) Para reducir la presencia de estos prototipos se realiza una edición del con-junto de referencia

irrelevantes o redundantes, fue necesario desarrollar un análisis para determinar cuales pueden ser los más discriminantes. El primer criterio empleado para reducir el número de descriptores está dado por su grado de dependencia entre sí. Los momentos invariantes m se obtuvieron a partir de imágenes binarizadas, donde el interior del objeto toma el valor 1 y el fondo el 0. Los momentos centrales están dados por:

donde f(x, y) representa la imagen binaria, p y q son dos números enteros positivos siendo p + q 3 y x , y representa el centro de gravedad de f(x, y). A partir de los momentos centrales es posible definir momentos invariantes al cambio de escala, rotación y traslación. Hu definió 7 momentos de segundo y tercer orden 1 a 7 (Hu, 1962). Dado que los bacilos tienen una forma simétrica, los momentos de tercer orden e impar de orden superior son muy cercanos a cero. Por esta razón, el primer momento de tercer orden de Hu 3 es suficiente para reconocer los objetos simétricos entre las muestras a estudiar, siendo los demás redundantes ( 4 a 7). Debe mencionarse además como Flusser y Suk (Flusser and Suk, 1998) probaron la redundancia de algunos momentos de Hu, la cual no se presenta entre los primeros tres momentos escogidos. Puesto que la discriminación puede incrementarse añadiendo momentos invariantes pares de orden superior, también se evaluaron algunos momentos invariantes de cuarto orden. Sin embargo, tan sólo el denominado onceavo momento de Hu (Voss et al., 2001) permitió obtener una buena separación entre agrupamientos (una referencia muy completa para las construcción de momentos invariantes se encuentra en (Flusser, 2000). Los tres primeros y el onceavo momentos de Hu están dados por:

donde Es bien conocido que existe una relación entre los descriptores de Fourier y los momentos geométricos dada por la siguiente expresión (Flusser and Suk, 1998):

donde (f, g) son las coordenadas en el dominio de la frecuencia. Como se observa en la ecuación 2, esta relación es solamente válida cuando todos los momentos geométricos y los descriptores de Fourier son calculados hasta el infinito. Sin embargo, no es frecuente utilizar estos descriptores simultáneamente. En nuestro caso se prefirieron los momentos, puesto que los bacilos son objetos demasiado pequeños comparados con el tamaño total de la imagen y por consiguiente las características obtenidas de los contornos de los objetos son más susceptibles al ruido que los descriptores basados en la información de todo el objeto.

irrelevantes o redundantes, fue necesario desarrollar un análisis para determinar cuales pueden ser los más discriminantes. El primer criterio empleado para reducir el número de descriptores está dado por su grado de dependencia entre sí. Los momentos invariantes m se obtuvieron a partir de imágenes binarizadas, donde el interior del objeto toma el valor 1 y el fondo el 0. Los momentos centrales están dados por:

donde f(x, y) representa la imagen binaria, p y q son dos números enteros positivos siendo p + q 3 y x , y representa el centro de gravedad de f(x, y). A partir de los momentos centrales es posible definir momentos invariantes al cambio de escala, rotación y traslación. Hu definió 7 momentos de segundo y tercer orden 1 a 7 (Hu, 1962). Dado que los bacilos tienen una forma simétrica, los momentos de tercer orden e impar de orden superior son muy cercanos a cero. Por esta razón, el primer momento de tercer orden de Hu 3 es suficiente para reconocer los objetos simétricos entre las muestras a estudiar, siendo los demás redundantes ( 4 a 7). Debe mencionarse además como Flusser y Suk (Flusser and Suk, 1998) probaron la redundancia de algunos momentos de Hu, la cual no se presenta entre los primeros tres momentos escogidos. Puesto que la discriminación puede incrementarse añadiendo momentos invariantes pares de orden superior, también se evaluaron algunos momentos invariantes de cuarto orden. Sin embargo, tan sólo el denominado onceavo momento de Hu (Voss et al., 2001) permitió obtener una buena separación entre agrupamientos (una referencia muy completa para las construcción de momentos invariantes se encuentra en (Flusser, 2000). Los tres primeros y el onceavo momentos de Hu están dados por:

donde Es bien conocido que existe una relación entre los descriptores de Fourier y los momentos geométricos dada por la siguiente expresión (Flusser and Suk, 1998):

donde (f, g) son las coordenadas en el dominio de la frecuencia. Como se observa en la ecuación 2, esta relación es solamente válida cuando todos los momentos geométricos y los descriptores de Fourier son calculados hasta el infinito. Sin embargo, no es frecuente utilizar estos descriptores simultáneamente. En nuestro caso se prefirieron los momentos, puesto que los bacilos son objetos demasiado pequeños comparados con el tamaño total de la imagen y por consiguiente las características obtenidas de los contornos de los objetos son más susceptibles al ruido que los descriptores basados en la información de todo el objeto.

La excentricidad e también puede obtenerse a partir de los momentos de Hu, mediante la expresión:

por lo tanto, e no es independiente de los dos primeros momentos de Hu y aunque fue utilizada para filtrar los objetos en el proceso previo, es inadecuada en el proceso final de clasificación de los mismos. La compacidad c se define como:

donde A y P representan el área y el perímetro del objeto respectivamente. La compacidad proporciona una medida de como la forma del objeto se acerca a la de un círculo y es independiente de los demás descriptores usados. Aunque la compacidad fue originalmente usada como descriptor, se encontró que no mejoraba sustancialmente los resultados de la clasificación y por ello fue descartada. Por consiguiente, para este problema en particular se concluyó que los tres primeros y el onceavo momentos de Hu eran suficientes para obtener una adecuada representación de la forma de los bacilos. II.3.1. Edición del conjunto de bacilos de referencia El conjunto original de bacilos usados como referencia está constituido por los objetos señalados como bacterias por los expertos en las imágenes positivas. Este conjunto fue analizado con el fin de estudiar y sacar conclusiones acerca de su forma. Este proceso permite establecer la distribución de las muestras y definir los pasos a seguir en la ejecución de la clasificación. De esta manera es posible establecer, por un lado, si el conjunto de muestras tomado es adecuado y representativo y por el otro poder determinar si existen patrones o formas extrañas que pueden producir errores en la asignación de los objetos. El proceso de edición nos permitirá por tanto establecer si las características de los objetos a analizar se alejan de los objetos a clasificar (bacilos) o se acercan más a la de objetos a rechazar (no-bacilos) pudiendo aumentar el error en la clasificación. Estos últimos no pueden ser utilizados como prototipos, porque suelen aparecer en zonas cercanas a las regiones de decisión, afectando seriamente el resultado de la clasificación (Cortijo, 2001). Para reducir la presencia de estos prototipos se realiza una edición del conjunto de referencia. Algunos objetos aunque son bacilos tienen una forma ovoide, la cual no es una característica propia del bacilo M. tuberculosis como anteriormente se señaló y por consiguiente puede ser confundido con otros objetos (véase los ejemplos que se presentan en la figura 10). Dicho hecho, que fué confirmado por los expertos microbiólogos clínicos consultados, indica que algunos objetos no pueden ser distinguidos como tales debido a su forma en caso de aparecer aislados, y sólo pueden ser considerados como tales si en la misma imagen se distinguen otros fácilmente reconocibles. En un trabajo previo se especuló si esta forma podía corresponder a bacilos que estaban ubicados en forma perpendicular al observador (Forero et al., 2004). Sin embargo y tras un análisis más exhaustivo con un microscopio confocal, se pudo verificar que esta hipótesis no era cierta. Para ello, se tomaron con el microscopio confocal dos series de imágenes con diferentes planos focales de dos muestras de esputo donde se observaban simúltaneamente bacilos de forma alargada y objetos ovoides. Como se muestra en la serie presentada en la figura 10, los objetos ovoides no son objetos alargados, puesto que tan sólo alcanzan hasta 3 m de profundidad. En realidad son objetos denominados cocobacilos, es decir bacilos en formación.

La excentricidad e también puede obtenerse a partir de los momentos de Hu, mediante la expresión:

por lo tanto, e no es independiente de los dos primeros momentos de Hu y aunque fue utilizada para filtrar los objetos en el proceso previo, es inadecuada en el proceso final de clasificación de los mismos. La compacidad c se define como:

donde A y P representan el área y el perímetro del objeto respectivamente. La compacidad proporciona una medida de como la forma del objeto se acerca a la de un círculo y es independiente de los demás descriptores usados. Aunque la compacidad fue originalmente usada como descriptor, se encontró que no mejoraba sustancialmente los resultados de la clasificación y por ello fue descartada. Por consiguiente, para este problema en particular se concluyó que los tres primeros y el onceavo momentos de Hu eran suficientes para obtener una adecuada representación de la forma de los bacilos. II.3.1. Edición del conjunto de bacilos de referencia El conjunto original de bacilos usados como referencia está constituido por los objetos señalados como bacterias por los expertos en las imágenes positivas. Este conjunto fue analizado con el fin de estudiar y sacar conclusiones acerca de su forma. Este proceso permite establecer la distribución de las muestras y definir los pasos a seguir en la ejecución de la clasificación. De esta manera es posible establecer, por un lado, si el conjunto de muestras tomado es adecuado y representativo y por el otro poder determinar si existen patrones o formas extrañas que pueden producir errores en la asignación de los objetos. El proceso de edición nos permitirá por tanto establecer si las características de los objetos a analizar se alejan de los objetos a clasificar (bacilos) o se acercan más a la de objetos a rechazar (no-bacilos) pudiendo aumentar el error en la clasificación. Estos últimos no pueden ser utilizados como prototipos, porque suelen aparecer en zonas cercanas a las regiones de decisión, afectando seriamente el resultado de la clasificación (Cortijo, 2001). Para reducir la presencia de estos prototipos se realiza una edición del conjunto de referencia. Algunos objetos aunque son bacilos tienen una forma ovoide, la cual no es una característica propia del bacilo M. tuberculosis como anteriormente se señaló y por consiguiente puede ser confundido con otros objetos (véase los ejemplos que se presentan en la figura 10). Dicho hecho, que fué confirmado por los expertos microbiólogos clínicos consultados, indica que algunos objetos no pueden ser distinguidos como tales debido a su forma en caso de aparecer aislados, y sólo pueden ser considerados como tales si en la misma imagen se distinguen otros fácilmente reconocibles. En un trabajo previo se especuló si esta forma podía corresponder a bacilos que estaban ubicados en forma perpendicular al observador (Forero et al., 2004). Sin embargo y tras un análisis más exhaustivo con un microscopio confocal, se pudo verificar que esta hipótesis no era cierta. Para ello, se tomaron con el microscopio confocal dos series de imágenes con diferentes planos focales de dos muestras de esputo donde se observaban simúltaneamente bacilos de forma alargada y objetos ovoides. Como se muestra en la serie presentada en la figura 10, los objetos ovoides no son objetos alargados, puesto que tan sólo alcanzan hasta 3 m de profundidad. En realidad son objetos denominados cocobacilos, es decir bacilos en formación.


Algunos objetos aunque son bacilos tienen una forma ovoide, la cual no es una caracterís-tica propia del bacilo M. tuberculosis —como anteriormente se señaló— y por consiguiente puede ser confundido con otros objetos (véanse los ejemplos que se presentan en la figura 10) Tal hecho, confirmado por los expertos micro-biólogos clínicos consultados, indica que algunos objetos no pueden ser distinguidos como tales debido a su forma en caso de aparecer aislados, y sólo pueden ser considerados como tales si en la misma imagen se distinguen otros fácilmente reconocibles En un trabajo previo se especuló si esta forma podía corresponder a bacilos que es-taban ubicados en forma perpendicular al obser-vador (Forero et al., 2004) Sin embargo, y tras un análisis más exhaustivo con un microscopio confocal, se pudo verificar que esta hipótesis no era cierta Para ello, se tomaron con el micros-copio confocal dos series de imágenes con dife-rentes planos focales de dos muestras de esputo donde se observaban simultáneamente bacilos de forma alargada y objetos ovoides

Como se muestra en la serie presentada en la figura 10, los objetos ovoides no son objetos alargados, puesto que tan sólo alcanzan hasta 3μm de profundidad En realidad son objetos denominados cocobacilos, es decir bacilos en formación

inapropiado en este caso, porque una cantidad relativamente grande de muestras presenta esta forma no-característica Por lo tanto se utilizó una técnica usada corrientemente en estadísti-ca para eliminar estos objetos, denominados en terminología anglosajona outliers Para ello, se calcula la media y la desviación estándar de cada descriptor Asumiendo que las muestras siguen una distribución normal, se tiene que el 99 7% de los objetos se encuentra dentro de un inter-valo cuyos límites son tres desviaciones estándar por encima y por debajo de la media Puesto que la forma de los bacilos que se desea elimi-nar se caracterizan por el bajo valor de excentri-cidad, compacidad y momentos, se rechazaron todos aquellos objetos cuyos descriptores eran inferiores a la media menos tres veces la desvia-ción estándar El tercer momento de Hu no fue considerado, puesto que este valor es cero para los objetos simétricos, lo cual constituye una ca-racterística propia de los bacilos De esta manera, un bacilo cuya excentricidad, primer, segundo y undécimo momentos de Hu estén por debajo de este umbral fueron descartados Por lo tanto, la cantidad de bacilos de muestra pasó de 1412 a 929 (tabla III)

II.4. Agrupamiento de bacilos

Para la clasificación se analizaron varios algorit-mos de agrupamiento, con objeto de poder de-terminar el número de grupos que mejor definían el conjunto de muestras de bacilos usado como referencia empleando los descriptores escogidos (tres primeros y onceavo momentos de Hu) Los métodos analizados fueron: adaptativo, distan-cias encadenadas (mapa de cadena), k-medias, secuencial, máxima distancia también conocida como máximo-mínimo y, Batchelor y Wilkinson, ISODATA y matriz de similitud (Cortijo, 2001) Estas técnicas resultan útiles cuando se trata de

Figura 10

Figura 10

Figura 10

Figura 10

Se han desarrollado diversas técnicas para hacer la edición de un sistema de referencia To-das ellas básicamente evalúan la semejanza en-tre cada objeto del sistema con respecto al res-to de objetos Sin embargo, este criterio resulta

Tabla IIIExcentricidad, compacidad y momentos de Hu

Figura 10. Ejemplos de objetos eliminados debido a su forma.


agrupar objetos sin información a priori, es decir, a partir de un conjunto de objetos no etiquetados Cada algoritmo es controlado por diferentes pa-rámetros y heurísticas, lo cual proporciona una gran flexibilidad en el proceso de clasificación Dada su simplicidad se escogió finalmente el al-goritmo k-medias para realizar el agrupamiento En esta técnica el único parámetro a determinar, definido por el usuario, es el número de grupos a encontrar Este algoritmo trata de agrupar los objetos con objeto de minimizar la suma de las distancias entre cada objeto y el centro del grupo al cual es asignado Un problema que se suele presentar en este tipo de métodos consiste en la introducción de sesgo debido a la mala elección de los centroides iniciales y que se suele presen-tar cuando el número de muestras es alto Ello puede producir que los centros de los agrupa-mientos encontrados no se correspondan al mí-nimo global sino a un mínimo local

Para evitarlo, se calcularon los centros varias veces, seleccionando aleatoriamente distintos objetos como centros iniciales y comparando los resultados obtenidos hasta encontrar un mínimo que se repitiera de manera consistente En este caso, se aplicó el algoritmo k-medias para encon-trar entre 3 y 10 agrupamientos Con el fin de conseguir una mejor estimación del número de grupos que conforma el conjunto de referencia, se evaluaron la silueta y el coeficiente de silueta de los grupos encontrados La silueta proporcio-na una representación gráfica acerca de cómo se encuentran separados los grupos obtenidos El coeficiente de silueta S(i) proporciona una me-dida cuantitativa del grado de semejanza entre un objeto i con respecto a los demás objetos de su grupo, comparada con los objetos pertene-cientes a los demás grupos (Rousseeuw, 1987) El valor de la silueta varía en un rango entre -1 cuando el objeto ha sido probablemente asigna-do a un grupo incorrecto y a 1 cuando el objeto se ajusta muy bien a los objetos de su grupo El coeficiente de silueta fue definido por Rous-seeuw (Rousseeuw, 1987), y viene dado por la siguiente expresión,

(5)

donde a(i) es la distancia media entre el objeto i y los demás objetos de su grupo y b(i) es la dis-tancia promedio entre i y los objetos del segundo grupo más cercano El promedio o coeficiente de silueta CS está dado por el promedio de S(i) de todos los objetos y se utiliza como una me-dida del grado de separación de los grupos en-contrados Según Rousseeuw si 0,7 < CS ≤ 1, quiere decir que se ha encontrado una estructura fuerte Como resultado de dicho análisis se iden-tificaron cuatro grupos La figura 11 presenta el gráfico de la silueta de los grupos encontrados, donde el coeficiente de la silueta encontrado presenta un valor de 0 7461 Dicho valor indica que la estructura formada por las subclases en-contradas es razonable

En la figura 11 puede verse que algunos valo-res de la silueta encontrados son negativos Esto se debe a que se tomó la distancia euclídea como criterio de similitud en el algoritmo k-medias Aunque no es el criterio más apropiado, pues los bacilos no están uniformemente distribuidos en el espacio de descripción, proporciona una bue-na idea del número de grupos que pueden consti-tuir la clase formada por estos bacilos Cabe ano-tar que un criterio de similitud más apropiado, la distancia de Mahalanobis, fue el que se utilizó finalmente en la etapa de clasificación

Se han desarrollado diversas técnicas para hacer la edición de un sistema de referencia. Todas ellas básicamente evalúan la semejanza entre cada objeto del sistema con respecto al resto de objetos. Sin embargo, este criterio resulta inapropiado en este caso, porque una cantidad relativamente grande de muestras presenta esta forma no-característica. Por lo tanto se utilizó una técnica usada corrientemente en estadística para eliminar estos objetos, denominados en terminología anglosajona outliers. Para ello, se calcula la media y la desviación estándar de cada descriptor. Asumiendo que las muestras siguen una distribución normal, se tiene que el 99,7% de los objetos se encuentra dentro de un intervalo cuyos límites son tres desviaciones estándar por encima y por debajo de la media. Puesto que la forma de los bacilos que se desea eliminar se caracterizan por el bajo valor de excentricidad, compacidad y momentos, se rechazaron todos aquellos objetos cuyos descriptores eran inferiores a la media menos tres veces la desviación estándar. El tercer momento de Hu no fue considerado, puesto que este valor es cero para los objetos simétricos, lo cual constituye una característica propia de los bacilos. De esta manera, un bacilo cuya excentricidad, primer, segundo y undécimo momentos de Hu estén por debajo de este umbral fueron descartados. Por lo tanto, la cantidad de bacilos de muestra pasó de 1412 a 929.

II.4. Agrupamiento de bacilos Para la clasificación, se analizaron varios algoritmos de agrupamiento con objeto de poder determinar el número de grupos que mejor definían el conjunto de muestras de bacilos usado como referencia empleando los descriptores escogidos (tres primeros y onceavo momentos de Hu). Los métodos analizados fueron: adaptativo, distancias encadenadas (mapa de cadena), k-medias, secuencial, máxima distancia también conocida como máximo-mínimo y, Batchelor y Wilkinson, ISODATA y matriz de similitud (Cortijo, 2001). Estas técnicas resultan útiles cuando se trata de agrupar objetos sin información a priori, es decir, a partir de un conjunto de objetos no etiquetados. Cada algoritmo es controlado por diferentes parámetros y heurísticas, lo cual proporciona una gran flexibilidad en el proceso de clasificación. Dada su simplicidad se escogió finalmente el algoritmo k-medias para realizar el agrupamiento. En esta técnica el único parámetro a determinar, definido por el usuario, es el número de grupos a encontrar. Este algoritmo trata de agrupar los objetos con objeto de minimizar la suma de las distancias entre cada objeto y el centro del grupo al cual es asignado. Un problema que se suele presentar en este tipo de métodos consiste en la introducción de sesgo debido a la mala elección de los centroides iniciales y que se suele presentar cuando el número de muestras es alto. Ello puede producir que los centros de los agrupamientos encontrados no se correspondan al mínimo global sino a un mínimo local. Para evitarlo, se calcularon los centros varias veces, seleccionando aleatoriamente distintos objetos como centros iniciales y comparando los resultados obtenidos hasta encontrar un mínimo que se repitiera de manera consistente. En este caso, se aplicó el algoritmo k-medias para encontrar entre 3 y 10 agrupamientos. Con el fin de conseguir una mejor estimación del número de grupos que conforma el conjunto de referencia, se evaluaron la silueta y el coeficiente de silueta de los grupos encontrados. La silueta proporciona una representación gráfica acerca de cómo se encuentran separados los grupos obtenidos. El coeficiente de silueta S(i) proporciona una medida cuantitativa del grado de semejanza entre un objeto i con respecto a los demás objetos de su grupo, comparada con los objetos pertenecientes a los demás grupos (Rousseeuw, 1987). El valor de la silueta varía en un rango entre -1 cuando el objeto ha sido probablemente asignado a un grupo incorrecto y a 1 cuando el objeto se ajusta muy bien a los objetos de su grupo. El coeficiente de silueta fué definido por Rousseeuw (Rousseeuw, 1987), y viene dado por la siguiente expresión,

donde a(i) es la distancia media entre el objeto i y los demás objetos de su grupo y b(i) es la distancia promedio entre i y los objetos del segundo grupo más cercano. El promedio o coeficiente de silueta CS está dado por el promedio de S(i) de todos los objetos y se utiliza como una medida del grado de separación de los grupos

Figura 11

Figura 11. Gráfico de la silueta de los 4 grupos (subclases) encontrados de la clase bacilos. CS = 0,7461.

II.5. Modelos Gaussianos mixtos

Con el fin de caracterizar la clase bacilos se usó un modelo Gaussiano mixto Los modelos Gaus-


sianos mixtos son una aproximación no-paramé-trica para la estimación de la densidad de pro-babilidad de una clase basada en el uso de un modelo que mejor se ajuste a las muestras de la clase La hipótesis básica es que una combina-ción de varias funciones Gaussianas genera la distribución de la clase De esta manera, la clase es modelada como una mezcla de Gaussianas en el espacio de descripción Suponiendo que la cla-se bacilo sigue una distribución multimodal dada por (MacKay, 2003):

donde M es el número de grupos que forman la clase, x representa un bacilo de la muestra, p(Ωi) es la probabilidad a priori del grupo Ωi, donde

(6)

Dado el alto número de muestras, puede asumir-se que cada grupo Ωi sigue una función de den-sidad de probabilidad Gaussiana d-dimensional N(μi,Σi), siendo μi y σi su media y matriz de cova-rianza respectivamente, y d representa el núme-ro de descriptores, dado por:

(7)

Para determinar los parámetros del modelo se utilizó el algoritmo de Expectación-Maximiza-ción (EM) Los cuatro centroides encontrados mediante la aplicación del algoritmo k-medias anteriormente señalado, fueron empleados para inicializar este método

II.6. Clasificación

La identificación de los bacilos se realizó usando el clasificador Bayesiano de error mínimo, que puede ser expresado en términos de funciones discriminantes mediante (Cortijo, 2001; Duda et al., 2001):

(8)

donde p(x | Ωi) es la función de densidad de probabilidad de x suponiendo que pertenece al grupo Ωi gi(x) puede expresarse en forma loga-rítmica, con el objeto de convertir los productos en sumas, como:

(9)

Reemplazando p(x | Ωi) por una distribución Gaussiana N(μi,Σi) en la ecuación 9 se obtiene:

(10)

Puesto que el término −(d/2) log(2π) es cons-tante para todo el conjunto de funciones discri-minantes, puede descartarse Por lo tanto, esta ecuación puede reformularse como:

(11)

Sea Ωc el grupo asociado a la máxima función discriminante:

(12)

La regla de decisión asociada a la clase no-bacilo o clase de rechazo Ω0 está dada por:

(13)

encontrados. Según Rousseeuw si 0,7 < CS 1, quiere decir que se ha encontrado una estructura fuerte. Como resultado de dicho análisis se identificaron cuatro grupos. La fig. 11 presenta el gráfico de la silueta de los grupos encontrados, donde el coeficiente de la silueta encontrado presenta un valor de 0.7461. Dicho valor indica que la estructura formada por las subclases encontradas es razonable. En la figura 11 puede verse que algunos valores de la silueta encontrados son negativos. Esto se debe a que se tomó la distancia Euclídea como criterio de similitud en el algoritmo k-medias. Aunque no es el criterio más apropiado, pues los bacilos no están uniformemente distribuidos en el espacio de descripción, proporciona una buena idea del número de grupos que pueden constituir la clase formada por estos bacilos. Cabe anotar que un criterio de similitud más apropiado, la distancia de Mahalanobis, fué la que se utilizó finalmente en la etapa de clasificación. II.5. Modelos Gaussianos mixtos Con el fin de caracterizar la clase bacilos se usó un modelo Gaussiano mixto. Los modelos Gaussianos mixtos son una aproximación no-paramétrica para la estimación de la densidad de probabilidad de una clase basada en el uso de un modelo que mejor se ajuste a las muestras de la clase. La hipótesis básica es que una combinación de varias funciones Gaussianas genera la distribución de la clase. De esta manera, la clase es modelada como una mezcla de Gaussianas en el espacio de descripción. Suponiendo que la clase bacilo sigue una distribución multimodal dada por (MacKay, 2003):

donde M es el número de grupos que forman la clase, x representa un bacilo de la muestra, p( i) es la probabilidad a priori del grupo i, donde

Dado el alto número de muestras, puede asumirse que cada grupo i sigue una función de densidad de probabilidad Gaussiana d-dimensional N( i, i), siendo i y i su media y matriz de covarianza respectivamente, y d representa el número de descriptores, dado por:

Para determinar los parámetros del modelo se utilizó el algoritmo de Expectación-Maximización (EM). Los cuatro centroides encontrados mediante la aplicación del algoritmo k-medias anteriormente señalado, fueron empleados para inicializar este método. II.6. Clasificación La identificación de los bacilos se realizó usando el clasificador Bayesiano de error mínimo, que puede ser expresado en términos de funciones discriminantes mediante (Cortijo, 2001; Duda et al., 2001):

donde p(x | i) es la función de densidad de probabilidad de x suponiendo que pertenece al grupo i. gi(x) puede expresarse en forma logarítmica, con el objeto de convertir los productos en sumas, como:
















Reemplazando p(x | i) por una distribución Gaussiana N( i, i) en la ecuación 9 se obtiene:

Puesto que el término (d/2) log(2 ) es constante para todo el conjunto de funciones discriminantes, puede descartarse. Por lo tanto, esta ecuación puede reformularse como:

Sea c el grupo asociado a la máxima función discriminante:

La regla de decisión asociada a la clase no-bacilo o clase de rechazo o está dada por:

donde tc es el umbral asociado al grupo c. De esta manera los objetos por debajo de todos los umbrales de los grupos que forman la clase bacilos pueden rechazarse. Ahora, se hace necesario emplear un método estadístico que permita establecer los valores de umbral. II.7. Obtención del umbral Como se indicó antes, se puede definir un valor de umbral ti para cada grupo. Dichos umbrales se determinan siguiendo una metodología común empleada con este fin (Cortijo, 2001). Este umbral sirve para determinar los objetos que deben ser rechazados por no pertenecer a ninguno de los grupos de la clase bacilos. De esta forma, un objeto x se asigna a un grupo (x) = c, si:

es decir:

La parte izquierda de la ecuación, que formalmente podemos identificar con la distancia de Mahalanobis entre el objeto x y el grupo c, sigue una distribución 2 con d grados de libertad, siempre que se distribuye normalmente. Entonces, una simple consulta en los valores numéricos de la tabla 2 permiten determinar el valor que se

presenta en la forma cuadrática 1

cc

Tc xx por debajo del cual se tiene una determinada

probabilidad de puntos. Una vez conocido el valor de , el valor de umbral se determina como:






es decir:



cc








es decir:



cc








es decir:



cc








es decir:



cc








es decir:



cc








es decir:



cc




donde tc es el umbral asociado al grupo Ωc De esta manera los objetos por debajo de todos los umbrales de los grupos que forman la clase baci-los pueden rechazarse Ahora, se hace necesario emplear un método estadístico que permita esta-blecer los valores de umbral

II.7. Obtención del umbral

Como se indicó antes, se puede definir un valor de umbral ti para cada grupo Dichos umbrales se determinan siguiendo una metodología co-mún empleada con este fin (Cortijo, 2001) Este umbral sirve para determinar los objetos que de-ben ser rechazados por no pertenecer a ninguno de los grupos de la clase bacilos

De esta forma, un objeto x se asigna a un grupo ξ(x) = Ωc, si:

es decir:

La parte izquierda de la ecuación, que formal-mente podemos identificar con la distancia de Mahalanobis entre el objeto x y el grupo Ωc, si-gue una distribución χ2 con d grados de libertad, siempre que χ se distribuye normalmente

Entonces, una simple consulta en los valores numéricos de la tabla χ2 permite determinar el valor ν que se presenta en la forma cuadrática

( ) ( )∑−

m−m−1

cc

Tc xx por debajo del cual se tiene

una determinada probabilidad de puntos Una vez conocido el valor de ν, el valor de

umbral se determina como:

III. Resultados

En las figuras 4 y 6 se observa cómo la técnica de segmentación desarrollada permite extraer la mayor parte de bacilos presentes en una ima-

gen, eliminando la mayoría de detritus En algu-nas imágenes negativas todos los objetos fueron eliminados, haciendo innecesario el proceso de identificación para declararlas como negativas

La tabla Iv presenta los resultados de la eva-luación obtenidos para varios valores de ν La exactitud de un diagnóstico se expresa tradicio-nalmente en términos de sensibilidad y especifici-dad La sensibilidad es la probabilidad de asignar una prueba de diagnóstico como positiva cuando de hecho es positiva También se conoce como la fracción de verdaderos positivos El complemento de la sensibilidad es la especificidad, que corres-ponde a la tasa de falsos negativos






es decir:



cc








es decir:



cc



III. Resultados En las figuras 4 y 6 se observa como la técnica de segmentación desarrollada permite extraer la mayor parte de bacilos presentes en una imagen, eliminando la mayoría de detritus. En algunas imágenes negativas todos los objetos fueron eliminados, haciendo innecesario el proceso de identificación para declararlas como negativas. La tabla 3 presenta los resultados de la evaluación obtenidos para varios valores de . La exactitud de un diagnóstico se expresa tradicionalmente en términos de sensibilidad y especificidad. La sensibilidad es la probabilidad de asignar una prueba de diagnóstico como positiva cuando de hecho es positiva. También se conoce como la fracción de verdaderos positivos. El complemento de la sensibilidad es la especificidad, que corresponde a la tasa de falsos negativos. La tabla 4 presenta los resultados de sensibilidad y especificidad obtenidos, incluyendo los intervalos de confianza, correspondientes a los resultados presentados en la tabla 3. Especificidad y sensibilidad encontrados por imagen para varios valores de . La prueba fue hecha con 473 imágenes negativas y 169 positivas. A partir de los resultados presentados en la tabla 4, puede concluirse que la técnica desarrollada aparece como una solución factible para la evaluación de las muestras de esputo. El método proporciona una buena sensibilidad para una especificidad similar en comparación con la técnica propuesta por Veropoulos (Veropoulos et al., 1999), si bien las imágenes que aquí se procesan presentan un mayor grado de dificultad al haber sido capturadas sólo para aumentos medios (×250). Un procedimiento bien establecido para la evaluación de la exactitud del diagnóstico es el análisis de la curva de operación del receptor conocida como ROC, acrónimo de Receiver Operating Curve. Dicha metodología fué propuesta en los años 50 para analizar señales de radar en el contexto de la teoría de decisión. En los años 80, Swets y Pickett (Swets and Pickett, 1982) propusieron su uso para en el análisis de señales biomédicas y, en particular, en radiología. La figura 12 muestra la curva ROC correspondiente a los valores representados en la tabla 4. Esta curva proporciona una representación de la fracción de falsos positivos (1-especificidad) contra la fracción de verdaderos positivos (sensibilidad). La exactitud de la prueba aumenta a medida que la curva ROC se acerca al punto (0,1) correspondiente a la discriminación perfecta (sensibilidad del 100% y especificidad del 100 %). Como puede verse a partir de esta figura, el algoritmo demuestra ser relevante para la tarea fijada: la clasificación de esputo.

La viabilidad de este método en la rutina clínica se pudo verificar calculando la especificidad y sensibilidad obtenidas al evaluar la muestra de esputo de cada sujeto. Se tenían entre 8 y 100 imágenes por muestra. Para obtener el resultado de cada muestra se evaluó el conjunto de imágenes de cada una de ellas, sin considerar los resultados de las imágenes por separado. Normalmente, un examen se considera positivo cuando por lo menos una de las imágenes contiene más de dos bacilos. Las tablas 5 y 6 presentan los resultados obtenidos, considerando el número mínimo de bacilos encontrados para = 0,1. Como puede observarse, para el criterio de dos bacilos, se obtuvo una discriminación perfecta por muestra de esputo. IV. Conclusiones En muchas pruebas biológicas el análisis de muestras es tedioso, repetitivo y algunos casos peligroso para el personal clínico. Por otro lado, la cantidad de pruebas y muestras aumenta constantemente. Estos factores hacen necesaria la búsqueda de nuevos métodos para automatizar los protocolos de análisis con objeto de mejorar su eficacia, mejorar la seguridad del personal reduciendo al mínimo el contacto con las muestras y obteniendo resultados más exactos.

Tabla 1


Tabla 2


Tabla 3


Tabla 4


Tabla IvResultados obtenidos. 473 imágenes negativasy 169 positivas fueron empleadas en la prueba

La tabla v presenta los resultados de sensi-bilidad y especificidad obtenidos, incluyendo los intervalos de confianza, correspondientes a los resultados presentados en la tabla Iv

Tabla 1


Tabla 2


Tabla 3


Tabla 4


Tabla vEspecificidad y sensibilidad encontradas por

imagen para varios valores de ν.La prueba fue hecha con 473 imágenes

negativas y 169 positivas

Especificidad y sensibilidad encontrados por imagen para varios valores de ν La prueba fue he-cha con 473 imágenes negativas y 169 positivas

A partir de los resultados presentados en la tabla v, puede concluirse que la técnica desarro-llada aparece como una solución factible para la evaluación de las muestras de esputo El método proporciona una buena sensibilidad para una es-pecificidad similar en comparación con la técni-


ca propuesta por veropoulos (veropoulos et al., 1999), si bien las imágenes que aquí se procesan presentan un mayor grado de dificultad al ha-ber sido capturadas sólo para aumentos medios (×250)

Un procedimiento bien establecido para la evaluación de la exactitud del diagnóstico es el análisis de la curva de operación del receptor co-nocida como ROC, acrónimo de Receiver Opera-ting Curve Dicha metodología fue propuesta en los años cincuenta para analizar señales de radar en el contexto de la teoría de decisión En los años ochenta, Swets y Pickett (Swets y Pickett, 1982) propusieron su uso para en el análisis de señales biomédicas y, en particular, en radiolo-gía La figura 12 muestra la curva ROC corres-pondiente a los valores representados en la tabla v Esta curva proporciona una representación de la fracción de falsos positivos (1-especificidad) contra la fracción de verdaderos positivos (sen-sibilidad) La exactitud de la prueba aumenta a medida que la curva ROC se acerca al punto (0 1) correspondiente a la discriminación per-fecta (sensibilidad del 100% y especificidad del 100%) Como puede verse a partir de esta figura, el algoritmo demuestra ser relevante para la ta-rea fijada: la clasificación de esputo

imágenes por muestra Para obtener el resultado de cada muestra se evaluó el conjunto de imáge-nes de cada una de ellas, sin considerar los re-sultados de las imágenes por separado Normal-mente, un examen se considera positivo cuando por lo menos una de las imágenes contiene más de dos bacilos Las tablas vI y vII presentan los resultados obtenidos, considerando el número mínimo de bacilos encontrados para ν = 0.1 Como puede observarse, para el criterio de dos bacilos, se obtuvo una discriminación perfecta por muestra de esputo

Figura 12

Figura 12. Curva ROC de los resultados presentados en la tabla v.

La viabilidad de este método en la rutina clí-nica se pudo verificar calculando la especificidad y sensibilidad obtenidas al evaluar la muestra de esputo de cada sujeto Se tenían entre 8 y 100

Tabla vIResultados obtenidos para ν=0.1.

35 exámenes negativos y 7 positivosfueron empleados en la prueba

Tabla 5

Resultados obtenidos para =0.1. 35 examenes negativos y 7 positivos fueron empleados en la prueba.

Tabla 6

Especificidad y sensibilidad por muestra de esputo para = 0,1. Entre 8 y 100 imágenes de diversos campos microscópicos fueron tomados por muestra. El conjunto de datos está compuesto por 473 imágenes negativas de 35 sujetos y 169 positivas de 7 pacientes.

Tabla 5

Resultados obtenidos para =0.1. 35 examenes negativos y 7 positivos fueron empleados en la prueba.

Tabla 6

Especificidad y sensibilidad por muestra de esputo para = 0,1. Entre 8 y 100 imágenes de diversos campos microscópicos fueron tomados por muestra. El conjunto de datos está compuesto por 473 imágenes negativas de 35 sujetos y 169 positivas de 7 pacientes.

Tabla vIIEspecificidad y sensibilidad por muestra

de esputo para ν = 0.1

Entre 8 y 100 imágenes de diversos campos microscópicos fueron tomados por muestra El conjunto de datos está compuesto por 473 imágenes negativas de 35 sujetos y 169 positivas de 7 pacientes

IV. Conclusiones

En muchas pruebas biológicas el análisis de muestras es tedioso, repetitivo y en algunos ca-sos peligroso para el personal clínico Por otro lado, la cantidad de pruebas y muestras aumenta constantemente Estos factores hacen necesaria la búsqueda de nuevos métodos para automati-zar los protocolos de análisis con objeto de mejo-rar su eficacia, mejorar la seguridad del personal reduciendo al mínimo el contacto con las mues-tras y obteniendo resultados más exactos

En este capítulo se ha presentado una nue-va técnica para el análisis de imágenes de fluo-rescencia de esputos La técnica se basa en un


nuevo método de segmentación seguido por un procedimiento para la identificación

También se pudo dilucidar un problema re-lacionado con la aceptación o no de un objeto como bacilo cuando éste presenta su color típi-co, pero sin embargo posee una forma ovoide Se pudo verificar mediante la observación de estos objetos en varios planos focales mediante un mi-croscopio confocal, que en realidad se trata de cocobacilos, por lo tanto no pueden ser conside-rados como prototipos de bacilos y fueron des-cartados Asimismo, fue necesario editar el con-junto de bacilos de referencia suponiendo que la función de densidad de probabilidad de los baci-los alargados sigue una distribución Gaussiana

La técnica de segmentación desarrollada permite la eliminación de una gran cantidad de detritus, de manera que sólo los objetos cuyo co-lor es similar a los bacilos se conservan, permi-tiendo una gran reducción en el cálculo posterior y eliminando aquellos objetos cuya forma es muy similar a la del bacilo Mycobacterium tuberculosis pero que difieren en su color característico

Una de las etapas más importantes del sis-tema desarrollado consistió en el análisis de la forma de los bacilos Se propuso la utilización de cuatro momentos invariantes para su representa-ción Asimismo, se utilizó un modelo Gaussiano mixto para caracterizar la clase formada por los bacilos y la identificación se llevó a cabo median-te la teoría de decisión Bayesiana Los resultados obtenidos muestran que la técnica desarrollada proporciona un buen funcionamiento en térmi-nos de especificidad y sensibilidad, y por lo tanto es susceptible de ser utilizada en un sistema au-tomatizado de análisis de muestras

V. Referencias

Álvarez-Borrego, J , R Mourino, G Cristóbal y J Pech (2000) “Invariant optical color corre-lation for recognition of vibrio cholerae 01”, volumen 2847 de IEEE Int. Conf. on Pattern Recognition ICPR2000, 283-286, Barcelona, España

Canny, J (1986) “A computational approach to edge detection” IEEE Transactions on pat-tern analysis and machine intelligence, 8(6): 679-678

Cortijo, F (2001) “Reconocimiento de formas”, en http://www-etsi2 ugr es/depar/ccia/rf/www/

Cortijo, F (2001) “Técnicas supervisadas II: Aproximación paramétrica”, en: http://www-etsi2 ugr es/depar/ccia/rf/www/

Cortijo, F (2001) “Técnicas supervisadas II: Aproximación no paramétrica”, en: http://www-etsi2 ugr es/depar/ccia/rf/www/

Crncevik-Urek, M , A Stipic-Markovic, I Kar-dum-Skelin, J Stipic, v Crnek y R Urek (2002) “Induced sputum a method for cyto-logic analysis of bronchial specimens” Acta Clin. Croata, 41: 89-93

Demantova, P , D Sakamoto, S Ioshii y H Gam-ba (2001) “Segmentação automática de bac-térias para o método DEFT” En: Procee-dings of the II Latin American Congress on Biomedical Engineering, La Habana, Cuba

Duda, R O , P Hart y D Stork (2001) Pattern classification John Wiley & Sons, Nueva York

Rousseeuw, P (1987) “Silhouettes: A graphical aid to the interpretation and validation of cluster analysis” J. Comput. Appl. Math., 20: 53-85

Flusser, J (2000) “On the independence of ro-tation moment invariants” Pattern Recogni-tion, 33: 1405-1410

Flusser, J y T Suk (1998) “Degraded ima-ge analysis: An invariant approach” IEEE Trans. on Pattern Analysis and Machine Inte-lligence, 20(6): 590-603

Forero, M y G Cristóbal (2003) “Automatic identification techniques of tuberculosis bac-teria” En: SPIE Proc. Applications of Digital Image Processing XXVI, vol 5203, 71-81, San Diego CA, USA

Forero, M , E Sierra, J Álvarez-Borrego, J Pech, G Cristóbal, L Alcalá y M Desco (2001) “Automatic sputum color segmenta-tion for tuberculosis diagnosis” En: SPIE Proc. Algorithms and systems for Optical In-formation Processing, volume 4471, 251–261, San Diego CA, USA

Forero, M , F Sroubek, J Álvarez-Borrego, N Malpica, G Cristóbal, A Santos, L Alcalá, M Desco y L Cohen (2002) “Segmentation, autofocusing and signature extraction of tu-berculosis sputum images” En: SPIE Proc.


Photonic Devices and Algorithms for Com-puting, volumen 4788, 171-182, Seattle WA, USA

Forero, M , F Sroubek y G Cristóbal (2004) “Identification of tuberculosis bacteria ba-sed on shape and color” Real Time Imaging, 10(4): 251-262

Ginsberg, A (1998) “The tuberculosis epidemic: scientific challenges and opportunities” Pu-blic Health Rep., 113(2): 128-136

Ginsberg, Leon H (1998) Social work in rural communities Council on Social Work Edu-cation, ISBN 0872930610

Hu, M (1962) “visual pattern recognition by moment’s invariant” IRE Transaction on in-formation theory, (IT-8): 179-187

Liu, J , F Dazzo, O Glagoleva, B Yu y A Jain (2001) “Cmeias: A computer-aided system for the image analysis of bacterial morpho-types in microbial communities” Microbial Ecology, 41(3): 173-194

MacKay, D (2003) Information theory, inference, and learning algorithms Cambridge Univer-sity Press, Cambridge, Reino Unido

Sammouda, R , N Niki, H Nishitani, S Naka-mura y S Mori (1997) “Segmentation of spu-tum color image for lung cancer diagnosis” IEEE Int. Conf. on Image Processing, 1: 243-246

Sammouda, R , N Niki, H Nishitani y E Kyoka-ge (1998) “Segmentation of sputum color image for lung cancer diagnosis based on

neural network” IEICE transactions on in-formation and systems, E-81-D (8): 862-871

Swets, J y R Pickett (1982) Evaluation of diag-nostic systems: methods from signal detection theory Academic Press, Nueva York

veropoulos, K (2001) “Machine learning appro-aches to medical decision making” Tesis doctoral Department of Computer Science, University of Bristol

veropoulos, K , C Campbell, G Learmonth, B Knight y J Simpson (1998) “The automatic identification of tubercle bacilli using ima-ge processing and neural computing techni-ques” En: Proc. 8th International Conference on Artificial Neural Networks (ICANN’98), volume 2, 797-802, Skövde, Suecia

veropoulos, K , G Learmonth, C Campbell, B Knight y J Simpson (1999) “Automatic identification of tubercle bacilli in sputum A preliminary investigation” Analytical and Quantitative Cytology and Histology, 21(4): 277-281

voss, K , H Sube y C Braeuer (2001) “Affine point pattern matching” En: Radig, B y Florczyk, S (eds ) Pattern Recognition, Pro-ceedings 23rd DAGM-Symposium, volume 2191 of Lecture Notes in Computer Science, 155-162, Munich, Alemania Springer

Wilkinson, M (1996) Fluorescence Microscopy and Fluorescent Probes Plenum Press, Nueva York, NY, pp 261-266

capítulo 6Identificación específica de parásitos en peces mediante

correlación invariante con filtros compuestos

Emma Fajer ÁvilaJosué Álvarez Borrego

I. Introducción

La producción pesquera de la mayor parte de los recursos tradicionales más importantes a nivel mundial y regional no ha presentado incremen-tos sustanciales en los últimos años, mientras que los aumentos en los productos acuáticos ob-tenidos en la última década se han debido fun-damentalmente a la producción de la acuicultura (Álvarez-Lajonchere, 2005)

Entre las mayores producciones de peces en el año 2003 se encuentra el grupo de las tilapias con algo más de 2 millones de toneladas Méxi-co contribuyó con 15,778 toneladas Los peces marinos alcanzaron la cifra de 1’827,000, dentro de los cuales la familia Tetraodontidae tuvo una producción de 14, 602 toneladas por cultivo y 8, 009 por pesca (FAO, 2005) El botete diana, Sphoeroides annulatus, es un pez tetraodóntido, que habita la costa del Pacífico desde San Diego, California hasta el Perú (Thomson et al , 1987), el cual ha adquirido una gran importancia en la pesca artesanal de la costa noroeste de México por su alto valor comercial, y cuya tecnología de cultivo se está desarrollando en el CIAD, Uni-dad Mazatlán, México

Los parásitos son un componente ubicuita-rio de los peces que en la mayoría de los casos no ocasionan afectaciones graves en las pobla-ciones silvestres; sin embargo, en los sistemas de cultivo pueden convertirse en agentes causales de enfermedades, dando lugar a reducciones de la tasa de crecimiento y mortalidades (Scholz, 1999) Entre los parásitos de mayor impacto al cultivo de peces se encuentran los protozoarios y helmintos; y entre estos últimos son los mono-

geneos los responsables de pérdidas económicas importantes (Ernst et al , 2002; Ogawa, 2002)

Los protozoarios ciliados del género Tricho-dina son potencialmente patógenos a los peces; algunas especies de tricodínidos están asociadas con el debilitamiento del sistema inmune del pez y otras causan mortalidades (Lom, 1999) Especies particulares de Trichodina sp pueden ser altamente susceptibles a los contaminantes orgánicos (Marcogliense et al., 1998) en contras-te con la mayoría de las especies del género que incrementan sus niveles de infección en los sitios contaminados (Khan, 1991; Khan et al , 1994; Yeomans et al , 1997) El género Trichodina está compuesto por más de 170 especies; sin embargo a pesar de la riqueza de especies y su importan-cia económica, pocos esfuerzos se han dirigido a la identificación exacta de estos ciliados (Dob-berstein y Palm, 2000)

Los estadios larvarios de los peces son los más susceptibles al desarrollo de enfermedades protozoarias; dentro de las cuales se pueden se-ñalar a la tricodiniasis por su frecuencia y efecto negativo en la gran mayoría de los cultivos de peces Los cultivos de cíclidos son comúnmente afectados por tricodínidos causantes de brotes epidémicos y de pérdidas económicas importan-tes en el cultivo Por otro lado, los helmintos se encuentran entre los parásitos más comunes de los peces marinos; pero los estudios sobre su bio-diversidad son insuficientes debido al número inmenso de especies existentes y las dificultades para su identificación (Pérez-Ponce et al , 1999) Asimismo, los efectos negativos ocasionados por los helmintos sobre la acuicultura en las últimas décadas demandan el conocimiento de estas es-pecies patógenas (Kennedy, 1994)

130 Emma Fajer Ávila y Josué Álvarez Borrego

La parasitología sistemática ha realizado contribuciones significativas a la medicina tropi-cal y la salud pública, así como en estudios de biodiversidad y biología evolutiva La sistemáti-ca es la clave de la parasitología y otras discipli-nas asociadas; pero a pesar de ello es cada día menor el número de expertos en morfología de parásitos que están siendo entrenados y el núme-ro de sistemáticos activos disminuye anualmente (Brooks, 2000)

La identificación específica de parásitos usando datos morfológicos es lenta y laborio-sa, ya que requiere de preparaciones de calidad donde cada estructura taxonómicamente impor-tante pueda ser observada claramente para ser posteriormente medida y analizada con claves de identificación, comparada con las descripciones originales y consultada con expertos en el grupo taxonómico de que se trate

La utilización de métodos automatizados puede ser la respuesta a este problema Si se lo-grara hacer una lectura de las láminas en forma automática, los investigadores se verían releva-dos de la tediosa actividad de identificar y medir organismos, y ello redundaría en mayor eficien-cia para esta tarea En este sentido, los sistemas ópticos y digitales de reconocimiento empiezan a ser de interés para los taxónomos y biólogos, ya que permiten hacer más fácilmente mejores observaciones sobre la presencia de algún micro-organismo en el ambiente

Al mismo tiempo, y con la finalidad de con-tar con un método altamente eficaz que facilite el trabajo de técnicos que laboran en sanidad acuícola e investigadores que requieren del cono-cimiento de la especie de parásito a estudiar de forma rápida y segura, se ha desarrollado un algo-ritmo de reconocimiento de imágenes dentro de un procesado de correlación a color con filtros de fase compuestos invariantes a posición, rotación y escala para el reconocimiento de diferentes espe-cies del género Trichodina (Rodríguez-Santiago, 2002), parásitos de Oreochromis nilotica variedad rojo Stirling previamente estudiadas por métodos morfológicos De forma semejante, la técnica de correlación digital invariante usando la magnitud de la transformada de Fourier ha permitido la dis-criminación entre seis especies de helmintos del pez globo Sphoeroides annulatus (Álvarez-Borre-go y Fajer Ávila, 2006)

II. Generalidades sobre tricodínidos y helmintos parásitos de peces

II.1 Tricodínidos

La mayoría de los trabajos científicos sobre los tricodínidos están enfocados principalmente a su taxonomía, la cual se inició con el trabajo de Ehrenberg (1838) para Trichodina pediculus

Desde entonces se han identificado más de 200 especies, representantes de diez géneros para la familia Trichodinidae, el género más abundante es Trichodina y comprende más de 170 especies (Dobberstein y Palm, 2000)

Los registros sobre protozoarios parásitos y en específico sobre ciliados parásitos en Méxi-co están limitados al reporte de Trichodina sym-metrica en Sarotherodon hornorum y O. mos-sambicus en cultivo (Lázaro-Chávez, 1985) y T. wellborni en peces de la familia Cyprinidae por Herroz-Zamorano (1998)

II.2. Platelmintos

Los platelmintos o gusanos planos que parasitan peces agrupan a una gran cantidad de organis-mos de importancia en el cultivo de peces En México, Bravo et al. han estudiado desde 1950 los monogeneos parásitos de los peces marinos: éste es uno de los pocos grupos bien conocidos de platelmintos Los digeneos de peces marinos han sido estudiados desde 1930 por Sokoloff et al. y Lamothe et al., los cuales describieron más de 150 especies (Lamothe-Argumedo, 1983) Más de 2,500 especies de digeneos habitantes de peces marinos han sido registradas (Grabda, 1991) Hasta el presente se han reportado para México más de 240 especies de digeneos pará-sitos de peces (Lamothe-Argumedo et al , 1996; Fajer et al , 2004)

Todos los monogeneos son parásitos, princi-palmente de piel y branquias de peces, tanto de agua dulce como marinos; algunas pocas especies son endoparásitos especializados que habitan la cavidad nasal, el estómago y los uréteres (Paper-na, 1996) Los digeneos son también parásitos de vertebrados, tanto acuáticos como terrestres; los adultos viven en el intestino, conductos biliares y urinarios, y vasos sanguíneos de los peces (Grab-da, 1991)

131Identificación específica de parásitos en peces mediante correlación invariante con filtros compuestos

III. Efecto sobre los peces

El género Trichodina habita un amplio espectro de invertebrados acuáticos y vertebrados e infec-ta indistintamente tanto peces marinos como pe-ces de agua dulce, ocasionando tricodiniasis Los efectos negativos de esta enfermedad son varia-bles, dependiendo de la edad de los peces y su estado fisiológico Los estadios larvarios son los más afectados, cuyos signos clínicos consisten en incremento de la cantidad de moco de color blan-quecino, erosión de las aletas, letargia, anorexia, pérdida de escamas y tendencia a agruparse cer-ca de las entradas de agua Los peces presentan hiperemia de la piel y cuando están involucradas las branquias puede causar asfixia

Los monogeneos se alimentan del mucus de los peces, células epiteliales desprendidas y san-gre Estos parásitos, adheridos al cuerpo de los peces con sus ganchos, producen inflamación del tejido epitelial de la piel y las branquias Las es-pecies de monogeneos más grandes y peligrosas pertenecen a la familia Capsalidae, las cuales pa-rasitan la superficie del cuerpo de los peces ma-rinos, donde se encuentra Neobenedenia melleni, afectando a numerosas especies de peces mari-nos y causando enfermedad y mortalidades en el maricultivo de tilapia (Kaneko et al., 1988) El cultivo en jaulas del yellowtail, Seriola quinque-radiata y el amberjack S. dumerili es severamente afectado por el capsálido Benedenia seriola, que afecta la piel y aletas de estos peces y causa irri-tación de la epidermis, disminución del apetito y reducción del crecimiento (Ernst et al , 2002)

Por otro lado, los monogeneos diclidofóridos tales como Heterobothrium okamotoi son consi-derados los monogeneos de mayor impacto en el cultivo en jaulas del puffer tigre, Takifugus rubripes, en el oeste de Japón Estos parásitos succionan sangre y causan anemia en los peces (Ogawa, 2002)

Los digeneos intestinales adultos habi-tualmente no provocan enfermedades severas, aunque la intensidad de infestación sea alta; a diferencia de los extraintestinales, que son po-tencialmente patógenos (Paperna, 1996)

IV. Técnicas para la identificación de tricodínidos y platelmintos

Iv.1 Tricodínidos

El género Trichodina tiene el cuerpo presiona-do, en forma de disco, con una superficie oral levemente convexa Presenta como característica principal un anillo de dentículos que puede variar en número y forma Tiene una serie de cilios en el borde extremo de la membrana celular, cilia-tura entre el anillo denticulado, macronúcleo en forma redondeada o de herradura y micronúcleo poco visible, mide aproximadamente de 30-100 micrómetros y su tono es claro casi transparente (Lom y Dykova, 1992)

La identificación específica de los tricodínidos se basa en la morfología de los dentículos; los cua-les se hacen visibles con el empleo de la impreg-nación argéntica La aplicación de nitrato de plata por unos minutos al frotis del moco de la piel de los peces que contienen tricodínidos y su posterior contacto con la luz Uv o los rayos solares produce su oxidación, tornándose de color marrón; lo cual permite observar las estructuras esqueléticas del disco de fijación de este organismo

Muchas de las especies de tricodínidos des-critas previas al empleo de la impregnación ar-géntica de Klein y al establecimiento del criterio uniforme descrito por Lom en 1958 fueron inade-cuadas, debido a la dificultad que otras técnicas de tinción mostraban para observar claramente la morfología de los dentículos y a la inexistencia de un procedimiento uniforme para realizar las mediciones necesarias Lom (1958) detalló las características específicas que se usan como base para la taxonomía de tricodínidos y las medicio-nes a realizar de las estructuras esqueléticas, nu-cleares y filiares, aunque estos trabajos señalaron la forma de los dentículos como una caracterís-tica diagnóstica, no proporcionaron un método específico y constante de describir y comparar la forma del dentículo Las características propues-tas por este autor son suficientes al diferenciar entre especies ampliamente diferentes, pero esto no es suficiente para diferenciar entre especies de tricodínidos donde la forma de los dentículos exhibe solamente diferencias menores

Los intentos más recientes para mejorar el criterio para la descripción del disco adhesivo


fueron los de van As y Basson (1989) Ellos pro-pusieron un método para describir la forma de los dentículos mediante la construcción de líneas desde el centro del disco adhesivo al extremo de los dentículos, el cual provee los puntos de fija-ción de referencia que pueden ayudar en una des-cripción precisa de los elementos “denticulares” Este método requiere una fotografía aumentada o un dibujo, y también ha sido aplicada a espe-címenes ilustrados en la literatura Este sistema permite indudablemente descripciones precisas de los especímenes; pero se dirige más a compa-raciones entre individuos que poblaciones Este criterio introduce características adicionales, uti-lizando las medidas existentes y debe ser com-plementario al sistema de Lom (1958) y no una sustitución de éste (Basson y van As, 1994)

Lom y Dykova (1992) refirieron que la mor-fología del disco adhesivo es concluyente para la taxonomía Su estatus taxonómico está basado sobre la estructura de la ciliatura bucal, las ca-racterísticas del disco adhesivo y el número de sus constituyentes Datos suplementarios se pro-veen sobre la configuración del núcleo

Iv.2. Platelmintos

Los platelmintos son gusanos aplanados dorso-ventralmente, hermafroditas, cuya característica principal es la ausencia de un celoma o cavidad corporal, su sistema osmoregulador y excretor está compuesto de células en flama, protonefri-dio y una o dos vesículas (Cruz-Reyes y Camar-go-Camargo, 2001)

Estos gusanos planos se clasifican de acuerdo a la morfología de los adultos, tomando en cuenta principalmente el aparato reproductor Los carac-teres generales de valor taxonómico incluyen su morfología externa, órganos de fijación, aparato digestivo, sistema nervioso y aparato excretor (La-mothe-Argumedo, 1983)

Iv.2.1. Monogeneos

Para la identificación de los monogeneos, los or-ganismos deben aislarse vivos de la piel y/o bran-quias de los peces y conservarlos con las mismas características que en su estado vivo Para ello, primero se limpian del mucus y otras suciedades con agua marina filtrada; a continuación, se reco-

mienda aplanar algunos organismos entre cubre y portaobjetos en una gota de agua para facilitar la posterior observación de las escleritas (gan-chillos, hamuli, ganchos, etc ) mientras que otros se deben preservar sin aplanar para observar la anatomía de los órganos En este último caso se recomienda colocar a los monogeneos en agua hirviendo en el momento justo que se detenga el hervor; para ello se quita el vaso de precipi-tado de la flama y se adicionan los monogeneos, los cuales mueren extendidos Cuando el agua se enfríe se fijan en formalina (5-10%) hasta su tin-ción y montaje (Whittington, 2002)

Las tinciones comúnmente empleadas son carmín hidroclorhídrico o carmín de Semijon y el montaje se realiza en Bálsamo de Canadá

Para la ubicación de los monogeneos a nivel de familia y/o género se emplean el Systema Hel-minthum (Yamaguti, 1963) y las claves de Schell (1985); pero la identificación de las especies es una tarea difícil considerando el gran número de especies registradas; por lo que se requiere conocer los trabajos originales y los holotipos de las especies descritas para poder realizar las comparaciones correspondientes con el organis-mo a identificar

Iv.2.2. Digeneos

La colecta de los digeneos se realiza de peces vi-vos, o recién muertos, se limpian con agua marina filtrada y se fijan en formalina caliente al 4% (casi hirviendo) Después de una a dos semanas o an-tes de teñir los helmintos se transfieren a alcohol 70% (Scholz y Aguirre-Macedo, 2000) Las tin-ciones a emplear son las referidas anteriormente para monogeneos grandes

Para la identificación taxonómica de los di-geneos se utiliza la clave de Yamaguti (1971), los trabajos originales de las descripciones de cada especie y sus holotipos

V. Correlación óptica y digital

v.1. Sistemas ópticos coherentes

Una de las alternativas a los métodos tradicio-nales pueden ser los sistemas ópticos coherentes que se han desarrollado para la identificación de


diversos objetos a partir de su patrón de difrac-ción —proporcional al módulo cuadrado de la transformada de Fourier (TF) de la imagen— El patrón de difracción contiene toda la infor-mación de las frecuencias de los objetos a de-tectar En general, los sistemas de correlación óptica coherente son capaces de analizar, en tiempo real, grandes cantidades de información (Trimble et al , 1980) e identificar objetos y dis-criminar incluso entre objetos similares (Hes-ter y Casasent, 1980; Arsenault, 1986) Muchas de estas estrategias ópticas se desarrollaron en función exclusivamente de la forma del objeto a reconocer Sin embargo, para enfrentar el pro-blema de identificar objetos que difieren sólo en la distribución del color, se diseñó la estrategia basada en la información de forma y color para el reconocimiento de imágenes policromáticas a través de un sistema multicanal que se basa en la descomposición tricromática RGB, filtros holo-gráficos y correlación Esta técnica se ha utiliza-do con éxito para el reconocimiento de diversos objetos, tales como caracteres y figuras geomé-tricas (Yu y Chao, 1983; Bradiqué et al , 1987; Millán et al , 1989, 1992)

v.2. Reconocimiento multicanal de objetos policromáticos

La forma de los objetos policromáticos depen-de de la longitud de onda de la iluminación Por consecuencia, objetos con una distribución espa-cial de color diferente pueden parecer similares bajo una iluminación a cierta longitud de onda (Millán et al , 1989, 1992) El proceso de recono-cimiento multicanal para la identificación de ob-jetos policromáticos está basado en la descom-posición de la información de la forma y el color de las imágenes en tres canales monocromáticos donde el objeto es identificado separadamente Tres longitudes de onda λ1, λ2 y λ3 que cubren el espectro de la luz visible son seleccionadas para iluminar cada canal Para cada uno se efectúa el procedimiento de reconocimiento con la técnica de filtraje y sus respectivos resultados se obtienen sucesivamente en un correlacionador 4F clásico De esta manera, se obtienen las tres correlacio-nes de la imagen de entrada con el filtro bajo diferentes longitudes de onda y la información de distribución de color de los objetos puede ser

considerada (Ferreira et al , 1992; Corbalán et al, 1993; Millán et al , 1989, 1991, 1992, 1995)

v.3. Invariancia a posición, rotación y a escala

La invariancia a rotación se logra al introducir en el sistema un cambio de coordenadas carte-sianas a coordenadas polares Pech-Pacheco et al (1999) analizaron patrones de difracción de algunas especies de fitoplancton para determi-nar su utilidad en el procesamiento, incluso con imágenes fragmentadas o imágenes con basura inorgánica Los resultados mostraron que los patrones de difracción se pueden utilizar para la identificación de estas especies Pech-Pacheco et al (2000) identificaron algunas especies de diatomeas a partir del logaritmo del patrón de difracción de las mismas, obteniendo de esta ma-nera lo que se llama una correlación mediante filtraje cepstral

Castro-Longoria et al. (2001) reconocieron algunas especies de copépodos (Calanus pacifi-cus, Rhincalanus nasutus, Pleuromamma gracilis, Temora discaudata y Acartia tonsa) a nivel sexo al utilizar un nuevo algoritmo invariante a posición, escala y rotación Álvarez-Borrego y Castro-Longoria (2003) utilizaron un nuevo algoritmo matemático de correlación; pero sólo invariante a posición y a rotación para detectar especies de copépodos (Acartia discaudata, A. clausi, A. mar-galefi y A. tonsa) del mismo género

Castro-Longoria et al (2003) compararon tres metodologías distintas (taxonómica, sonda genética y correlación digital) para determinar la identificación de tres especies harpacticoidas crypticas y lograron el 93 3%, 86 6% y el 77 86% de confiabilidad en el reconocimiento para cada una de las tres especies analizadas mediante co-rrelaciones invariantes de fase extrema con fil-tros compuestos

v.4. Algoritmos de autoenfoque

Pech-Pacheco et al. (2001) presentan una metodo-logía automática que permite la toma de imágenes de especies fitoplanctónicas utilizando algoritmos de autoenfoque y fusión Esto es un inicio del de-sarrollo de nuevas plataformas computacionales que en el futuro servirán para realizar de manera automática y rápida el reconocimiento de las dife-


rentes especies de microorganismos marinos Re-cientes algoritmos de autoenfoque y fusión para imágenes a color de alta resolución pueden verse en Bueno Ibarra et al. (2005a y 2005b) y en los ca-pítulos nueve y diez de este libro También el de-sarrollo de una nueva plataforma computacional puede verse en uno de los capítulos de este libro

La correlación digital a color incrementa la capacidad de los filtros para el reconocimiento de patrones En este estudio el análisis de la in-formación tanto de la forma como del número de dentículos sería la variante metodológica que dará la posibilidad de identificar a los helmintos parásitos y tricodínidos de peces con eficiencia

El color del parásito depende de la tinción utilizada al preparar la muestra, así es que el co-lor introduce información adicional para la efec-tividad del reconocimiento La descomposición de un objeto policromático en tres canales mo-nocromáticos (RGB) permite realizar un reco-nocimiento independiente en cada uno de ellos, la multiplicación de estos resultados produce un alto nivel de certeza en la identificación del orga-nismo Los cambios de morfología, orientación y tamaño de este parásito son un problema que se tiene que resolver, para esto se necesita un sis-tema invariante a posición, escala y rotación La transformada de Escala, así como la transforma-da de Mellin y la transformada de Fourier se uti-lizan para poder tener un reconocimiento inde-pendiente de las escalas de estas características

VI. Materiales y métodos

El presente trabajo consta de dos etapas En la primera se llevó a cabo la colecta, el procesa-miento biológico del material y su determinación taxonómica por métodos morfológicos En la se-gunda etapa se realizó la toma de las imágenes de los parásitos identificados, su pre-procesamiento digital para la descomposición de las escenas en canales (RGB), la selección de imágenes para elaborar los filtros y hacer las correlaciones de cada imagen problema con los filtros de fase con invariancias de las imágenes de los organismos identificados y su análisis

vI.1. Colecta del material biológico

vI.1.1. Tricodínidos

Se colectaron alevines de Oreochromis nilotica variedad roja Stirling y variedad negra Egipcia de 20 días de edad, procedentes del Centro Piscí-cola de la SAGARPA ubicado en Chametla, Ro-sario, estado de Sinaloa, México (22° 50’N-106° 01’W ) Las tilapias fueron transportadas vivas al Laboratorio de Parasitología de la Unidad Mazatlán en Acuicultura y Manejo Ambiental, CIAD, A C , en bolsas de plástico (0 5 x 0 7 cm) con agua dulce oxigenada para la búsqueda de los protozoarios tricodínidos

Por otro lado, se capturaron 226 adultos de Sphoeroides annulatus (botete diana) de dos lo-calidades diferentes en el estado de Sinaloa, Mé-xico (Teacapán 22° 32’N-105° 44’W y Mazatlán 23° 11’N-106° 25’W) durante tres épocas de de-sove de esta especie de pez (1999, 2000 y 2001) en busca de helmintos parásitos

Los peces fueron anestesiados con 2-pheno-xy-etanol 0 75 ml/l y de cada una de las tilapias se realizó un raspado de la superficie de la piel y ale-tas, el cual se depositó en un portaobjetos limpio al que previamente se le había adicionado una gota de agua destilada Las muestras con trico-dínidos se dejaron secar al aire para su posterior tinción También de cada uno de los botetes se investigaron la piel, aletas y branquias en busca de helmintos ectoparásitos; así como intestino, sacos aéreos y vejiga urinaria por endoparásitos Todos los helmintos aislados se aplanaron entre cubre y portaobjetos y se fijaron en alcohol 70o

para su posterior procesamiento

vI.2. Tinciones realizadas

vI.2.1 Tricodínidos

Se utilizó la tinción argéntica de Klein para la ob-servación detallada de las estructuras de los dentí-culos, características del disco de fijación y núme-ro de sus constituyentes (Lom, 1958) y la tinción de Hematoxilina de Harris para la observación del aparato nuclear como información adicional, de acuerdo a la metodología reportada por We-llborn (1967) Se montaron con un cubreobjetos en bálsamo de Canadá, para ser observadas al mi-croscopio compuesto Leica DMLB 10


vI.2.2. Helmintos

Se empleó la técnica carmín de Semijon para la tinción de las estructuras requeridas para la identificación de estos monogeneos y helmintos parásitos (Rodríguez et al., 1987) y finalmente se montaron en Bálsamo de Canadá para su obser-vación microscópica

vII. Observación microscópica

A un aumento de 1000 x se observó cuidadosa-mente la morfología de los dentículos de cada uno de los tricodínidos: cuchilla y rayo, el grado de impregnación argéntica del centro del disco adhesivo y la presencia o ausencia de estructu-ras de quitina, etc También se observó el ángulo descrito por la espiral adoral Todas estas carac-terísticas se compararon con las descripciones de Lom y Dyková (1992) para ubicarlas taxonómi-camente de forma tentativa y a continuación se procedió a la revisión de los trabajos originales para la determinación de las especies, para lo cual también se realizaron las mediciones co-rrespondientes Seguidamente se observaron las láminas teñidas con hematoxilina de Harris, y se registró la forma y posición del macronúcleo y micronúcleo de cada especie

Para los platelmintos estudiados se proce-dió a la observación y dibujo en cámara lúcida de los órganos de fijación, escleritas, sistema digestivo, sistema excretor y reproductivo; los cuales se compararon con las claves de Yama-guti (1963), los trabajos de Lamothe-Argumedo (1965, 1967), y Whittington y Horton (1996) para monogeneos entre otros, mientras que para los digeneos se empleó Yamaguti (1971) y los traba-jos de Crowcroft (1950), Caballero et al , (1953); Fernández y Kohn, (1983); Bray y Cribb (1998);

vII.1. Morfometría realizada para la identificación de los tricodínidos y platelmintos parásitos

vII.1.1. Tricodínidos

A continuación se ilustran las mediciones a rea-lizar de las estructuras de valor taxonómico de acuerdo al procedimiento uniforme de Lom (1958) (figuras 1 y 2)

17

Figura 1

Figura 1. Método empleado para las mediciones a realizar propuestas por Lom (1958). N: partes del esqueleto del disco adhesivo: s: borde de la membrana, r: espinas radiales, nu: número de espinas radiales por dentículo, d: dentículo, dd: diámetro del anillo denticular: da: diámetro del disco adhesi-vo (Tomado de Lom y Dykova, 1992).

18

Figura 2

Figura 2. Metodología de las medidas de un dentículo de Tri-chodina. M: dentículo, t: longitud del rayo, c: ancho de la par-te central, b: longitud de la cuchilla I: longitud del dentículo (Tomado de Lom y Dykova, 1992).

Para los tricodínidos de mayor variabilidad intraespecífica se aplicó también la metodología van As y Basson (1989) Para ello se aumentó el tamaño de las imágenes y se construyeron líne-as desde el centro del disco adhesivo al extremo de los dentículos, para contar con los puntos de fijación de referencia que permitieran una de-scripción precisa de los elementos denticulares Esto permitió describir los ejes x y y que se ilu-


stran y su comparación con las especies revisadas y/o descritas por estos autores (figura 3)

19

Figura 3

Figura 3. Diagrama de la morfometría precisa de los elemen-tos denticulares. ab, ápice de la cuchilla; am, margen anterior de la cuchilla; ba, apófisis del rayo; ca, centro del disco ad-hesivo; cb, sección que conecta cuchilla y parte central; cc, sección que conecta la parte central y el rayo; cp, parte cónica central; cr, centro de la cresta; cs, círculo central; dc; punto de altura de la curva; dp, punto distal de la cuchilla; ds, su-perficie distal de la cuchilla; pm, margen posterior ( describe la curva) de la cuchilla; pp, proyección posterior; pr, punto del rayo; s, parte central; sa, sección del centro de la parte de arriba eje de las x; sb, sección de la parte central de la parte de abajo eje de la x; y, rayo; x, cuchilla ( Tomado de van As y Basson, 1989).

Las especies de tricodínidos seleccionadas para este estudio fueron Trichodina heterodenta-ta, T. centrostrigata, T. magna y T. nigra, identifica-das morfológicamente por Rodríguez-Santiago (2001), de acuerdo a la metodología descrita an-teriormente Los especímenes tipo están deposi-tados en la Colección de Parásitos de Peces del CIAD, A C , Unidad Mazatlán, Sinaloa, México (P00-57-01)

vII.1.2. Platelmintos

A continuación se esquematizan las principales estructuras cuya morfología y morfometría tiene que ser considerada para su identificación a ni-vel de especie (figuras 4 y 5)

Se seleccionaron seis especies de helmintos adultos de botete diana, Sphoeroides annnulatus, identificados por Fajer et al. (2004) por méto-dos morfológicos Las especies fueron: Hetero-bothrium ecuadori (He) y Neobenedenia melle-ni (Nm) monogeneas ectoparásitos de la piel y branquias respectivamente, y Lintonium vibex (Lv) y Phyllodistomum mirandai (Pm), endo-

20

Figura 4

Figura 4. Estructuras del monogenea capsálido Neobenedenia melleni (MacCallum, 1927) Yamaguti, 1963 (Tomado de Whit-tington, 2002). (a) vista ventral del animal adulto completo. Escala de barra: 500 µm. aa. Órgano de adhesión anterior; ah: hamulus anterior; as: escleritas accesorias; g: germarium; h: haptor; ho: ganchillos; m: válvula marginal; ic: cámara de fertilización interna; oo: ootipo; p: faringe; pe. pene; ph: ha-mulus posterior; t: testis; te: tendom; u: útero; vd: vasos defe-rentes; vf: folículos vitelinos; vr: reservorio viiitelino.

21

Figura 5

Figura 5. Esquema general de un digenea (Tomado de Lamo-the-Argumedo, 1983).


parásitos de los sacos aéreos y vejiga urinaria re-spectivamente, así como Bianium plicitum (Bm) y Homalometron longisinosum (Hl) del intesti-no Los especímenes tipos están depositados en CIAD, A C , Unidad Mazatlán, Sinaloa, México (He cat no MO1-373-38; Nm cat no M00-410-39; Lv cat no T00-10-04; Pm cat no T98-00-1; Bm cat no T00-102-12; Hl cat no T00-99-02, y en el Instituto de Biología, Universidad Nacio-nal Autónoma de México (UNAM) en la ciudad de México (He cat no 4287; Nm cat no 4286; Lv, cat no 4284; Pm cat no 4285; Bm cat no 4288; Hl cat no 4289)

vII.2. Toma y procesamiento de imágenes

vII.2.1 Tricodínidos

Por medio de una cámara de alta resolución (Sony CCDIRIS) conectada a un microscopio (LEICA DMLB10) y utilizando el programa Píxel view instalado en una computadora (Dell Dimensión 4100) se obtuvieron las imágenes de los parásitos, ),( yxf , las cuales fueron tomadas utilizando un objetivo de 100x Las imágenes tu-vieron un tamaño de píxeles de 256 x 256

vII.2.2. Helmintos

Para la toma de las imágenes de los helmintos se utilizó el mismo procedimiento descrito an-teriormente, con la diferencia de que como los organismos son de mayores dimensiones, se em-pleó un estereomicroscopio (Leica Microsystems Wetzlar, Germany) y las imágenes a color de los parásitos fueron grabadas a diferentes objetivos: 0 63, 1, 1 6, 2 5 ó 4x, de acuerdo a la talla de los organismos Estas fueron tomadas en vista ven-tral y de un tamaño de píxeles de 256 x 256

vII.2.3. Reconocimiento de tricodínidos en imágenes a color con filtro de fase con invariancias

Se llevó a cabo una simulación numérica para correlacionar el módulo al cuadrado de la trans-formada de Fourier (contenido de frecuencias) de las especies parásitas, con filtros sólo de fase, que son invariantes a posición, rotación y escala Se presenta en la figura 6 el método para obte-

ner los filtros compuestos de especies-específi-cas Debido a que los parásitos tienen diferentes morfologías, es necesario incluir esta informa-ción en los filtros En el primer paso (paso 1), se escogen todas las diferentes morfologías para una sola especie ( ),,1 yxf ( )yxf ,2 ,…, ( )yxfn , , y se obtiene el módulo al cuadrado de la transforma-da de Fourier (FFT) de cada una de las morfo-logías ( )2

1 , yx wwF , ( )2

2 , yx wwF , …, ( )2, yxn wwF (paso

2); después de esto, se suman todos los módulos al cuadrado para producir una simple imagen (paso 3) Esto provee, en una simple matriz, toda la información de frecuencias relacionadas a las diferentes morfologías de las especies que van a ser identificadas, además se obtiene la invarian-cia a la posición En los pasos 1-3 no es nece-sario utilizar una posición, escala u orientación uniforme para las imágenes; ya que el producto final será invariante a la posición, escala y a la orientación Se aplica un filtro parabólico en el paso 3 para que las frecuencias bajas sean ate-nuadas y las altas realzadas Este paso hacia las altas frecuencias ayudará a perfeccionar el reco-nocimiento de las especies “no conocidas” que van a ser identificadas

Ahora, se aplica un factor de escala r Este proceso es lo que diferencia a la transformada de Escala de la transformada de Mellin Después de estos pasos, el sistema de coordenadas cartesia-nas es mapeado a un sistema de coordenadas po-lares para obtener la invariancia a rotación (paso 4) En el paso 5 se lleva a cabo una interpola-ción bi-lineal de la conversión de los datos de la primera coordenada (Pech-Pacheco et al., 2003) Esto se hace para minimizar los errores de mues-treo o evitar fuga de información, lo cual pudiera afectar la identificación de las especies “no co-nocidas” Se aplica la transformada de Fourier para obtener la transformada de Escala De este resultado sólo será utilizada la información de fase (Horner y Gianino, 1984) Por tanto, la ima-gen resultante (paso 6) es el filtro compuesto de la especie-específica, el cual será utilizado en la correlación invariante con los datos que proven-gan de imágenes individuales de especimenes de tricodinas SPOF es el nombre utilizado para el fil-tro compuesto sólo de fase de especie-específica obtenido en el paso 6

Los pasos 3, 4, 5 y 6 de la figura 6 son nece-sarios para asegurar que la información que pro-


viene del módulo al cuadrado de la transforma-da de Fourier es invariante a rotación, a escala y a posición, obteniendo de esta manera un filtro que contenga estas invariancias Debido a que se

analizaron imágenes a color, se obtuvo un filtro compuesto de especie-específica para cada canal RGB La explicación para la figura 7 es exacta-mente como la de la figura 6

22

Figura 6

FFT

=lnr

Interpolación bi-lineal

r

2)w,F(w yx

Filtro parabólico

(1)

(3)(4)

(5)

(6)

(2)

FFT

2)w,(wF yx1

2)w,(wF yx2

2)w,(wF yxn

Suma ),(rF

vuSPOF ,

,expF

yxf ,1

yxf ,2

yxfn ,

Figura 6. Método para obtener los filtros compuestos de especie-específica. n,...,, fff 21 son las morfologías de las imágenes parásitas; FFT es la transformada de Fourier de cada imagen; ( ) ( ) ( )222

yxnyx2yx1 wwFwwFwwF ,,...,,,, son los módulos al cua-drado de la transformada de Fourier y yx ww , son las coordenadas en el plano de Fourier (contenido de frecuencias de la imagen); ( )2yx wwF , es la suma de todos los módulos al cuadrado; ( )θr,F es el plano polar y ( )θρ v,uSPOF es el filtro sólo de fase compuesto de especie-específica donde ρu y θv son las nuevas coordenadas.

23

Figura 7

Transformada rápida de Fourier

=lnr

Interpolación bi-lineal

Correlacióndigital

invariante

r

2)w,F(w yx

Filtro parabólico

Procedimiento normal de La imagen

Procedimiento de correlación

(1) (2) (3)

(4)

(5)

(6)

(7)

yxf , ,rF

,expF

vuSIPOF ,

vuSPOF ,

Figura 7. Correlación invariante a posición, rotación y escala. ( )yx,f es la especie no conocida a ser reconocida; ( )2yx wwF , es el módulo al cuadrado de la transformada de Fourier (módulo al cuadrado del contenido de frecuencias) de la imagen no conocida; ( )θr,F es el plano polar como en la figura 6 y SI

POF (uρ,νθ) es la información de fase de la especie no conocida con

la invariancia a posición, rotación y a escala.


Para discriminar entre especies parásitas, las imágenes de cada espécimen a ser identificado fueron transformadas como se indica en la figu-ra 7, la cual es idéntica a la figura 6 excepto que en el paso 1 sólo hay una imagen en la entrada En el paso 5, SIPOF es el nombre utilizado para la especie “no-conocida” que va a ser identificada (información sólo de fase) En el paso 6 se ob-serva el resultado que se obtuvo utilizando los pasos de la figura 6 En el Paso 7 de la figura 7 se obtiene una correlación invariante de fase extre-ma entre los parásitos que van a ser identificados con el filtro compuesto de especie-específica

El reconocimiento de especies particulares de parásitos es muy complejo El color puede ser una componente de discriminación importante, el cual necesita ser incluido para una identifi-cación exitosa Ya que el análisis fue sólo digi-tal, fue posible separar la imagen de color en 3 canales (RGB) utilizando una programación dig-ital Por tanto el procedimiento que se muestra en la figura 7 fue repetido para cada canal (R, G y B) En cada canal de color, los filtros compues-tos utilizados son comparados matemáticamen-te a la componente correspondiente del blanco a reconocer En general, los objetos que tienen una componente determinada ( )y,xA

iλ similar a la componente respectiva del blanco a reconocer,

( )y,xCiλ dará un máximo valor de correlación en

este canal ( iλ ) Sólo el blanco dará un máximo de correlación en todos los canales Por lo tanto, un objeto (especie “no conocida”) es detectado o identificado como el blanco (especie que está contenida en el filtro compuesto) si simultánea-mente produce un pico de correlación en los 3 canales

El resultado final será el producto de la co-rrelación obtenida en cada uno de los 3 canales Las correlaciones invariantes de fase extrema fueron llevadas a cabo por un algoritmo específi-camente desarrollado por los autores de este tra-bajo utilizando lenguaje MATLAB (Copyright 1984-2000, The Mathworks, Inc ) El algoritmo sigue fielmente los diferentes pasos que se mos-traron en las figuras 6 y 7

Los filtros compuestos de especie-específica fueron hechos seleccionando diferentes mor-fologías presentes en cada especie Para hacer cada filtro, fueron seleccionadas diez diferentes imágenes La figura 8 muestra el contenido de

información de frecuencias y se puede observar que el contenido de frecuencias cubre todos los posibles ángulos Por lo anterior se concluyó que diez imágenes son suficientes

vII.2.4. Reconocimiento de helmintos en imágenes a color con filtros compuestos

El procedimiento empleado es casi el mismo descrito para tricodínidos, con la diferencia de que en el paso 2 que se mostró en la figura 6 el módulo de la TF de la imagen no está elevado al cuadrado Como en el caso anterior, cada fil-tro compuesto tiene información de las especies específicas a reconocer donde existe un número de especímenes dado para la formación de cada filtro compuesto

Para discriminar Homalometron longisinosum (Hl) y Phyllodistomum mirandai (Pm) se seleccio-naron 4 imágenes de cada parásito para construir un filtro compuesto; mientras que para discrimi-nar Bianium plicitum (Bp), Heterobothrium ecua-dori (He), Neobenedenia melleni (Nm) y Linto-nium vibex (Lv) se seleccionaron 10 imágenes de cada organismo Con el objetivo de probar los fil-tros compuestos especie-específica se emplearon 193 imágenes, 9 para Hl, 31 para Bp, 48 para He, 46 para Lv, 46 para Nm y 13 para Pm

Las correlaciones digitales fueron realizadas con un algoritmo construido específicamente usando el programa MATLAB (Copyright 1984-2000, The Mathworks, Inc ) (Álvarez-Borrego y Fajer Ávila, 2006)

vIII. Resultados y discusión

vIII.1. Tricodínidos.

Las especies de tricodínidos que se utilizaron para este estudio se ilustran a continuación: T. heterodentata, T. centrostrigata, T. magna y T. ni-gra (figura 9)

Treinta y cinco imágenes de T. heterodenta-ta (Th), 31 imágenes de T. centrostrigata (Tc), 35 imágenes de T. magna (Tm) y 33 imágenes de T. nigra (Tn) fueron analizadas con filtros com-puestos invariantes de especie-específica

Las figuras 10 y 11 muestran los valores de correlación obtenidos para cada filtro compues-to invariante de especie-específica contra todas


24

Figura 8

FFT

FFT

FFT

FFT

f1 (x, y)

f2 (x, y)

f3 (x, y)

fn (x, y)

2

1 , yx wwF

2

2 , yx wwF

2

3 , yx wwF

2, yxn wwF

2

, yx wwF

Figura 8. Diagrama de flujo que representa los pasos para obtener la suma de los módulos al cuadrado de los contenidos de frecuencia de las diferentes morfologías para el filtro compuesto de especie-específica.

25

Figura 9

Figura 9. T. heterodentata (escala indica 30 micras), T. centros-trigata (escala indica 20 micras), T. magna (escala indica 30 micras) y T. nigra (escala indica 20 micras) identificadas por métodos morfológicos según Rodríguez-Santiago (2002).

las imágenes a identificar, las cuales son presen-tadas como dibujo de bloques y para cada una se presenta el promedio, el error estándar (SE) y dos veces el SE (2*SE)

Los valores de correlación están normaliza-dos Las figuras representan la correlación pro-medio para múltiples individuos de cada especie

Los resultados para T. heterodentata y para T. centrostrigata se muestran en la figura 10 Para ambas especies la figura muestra el producto de multiplicar los canales RGB En cada figura, el eje x muestra el filtro compuesto para cada especie-específica y el eje Y nos muestra la co-rrelación promedio invariante obtenida para las pruebas individuales de una especie dada Para T. heterodentata se obtuvo un valor promedio de 0 18 ± 0 05 (±1SE), cuando el filtro Th fue correlacionado con todas las cuatro especies de parásitos (figura 10a) Estos valores están sepa-


rados de los valores de correlación obtenidos para las otras especies a un nivel de confianza del 95% En la figura 10b se muestran los valores de correlación obtenidos para T. centrostrigata con el filtro Tc Se obtuvo un valor promedio de 0 12 ±0 04 (±1SE) Estos valores están comple-tamente separados de los valores que se obtuvie-ron para las otras especies de parásitos

La figura 11 muestra los resultados para T. magna y T. nigra Los valores de correlación para T. magna con el filtro Tm tuvieron un valor pro-medio de 0 18±0 05 (±1SE) (figura 11a) La correlación para T. nigra con el filtro Tn tuvo un promedio de 0 16±0 04 (±1SE) Estos valores también estuvieron separados de los valores pro-medio para las otras especies de parásitos

La diferencia del algoritmo propuesto en este trabajo, con aquellos que se han utilizado en el pasado, radica en el hecho de que la corre-lación invariante se ha realizado con filtros com-puestos de especie-específica, los cuales tienen información de la invariancia a posición, rota-ción y a escala; además, se ha llevado a cabo una correlación de fase extrema, la cual consiste en la correlación de los filtros de fase compuestos de especie-específica contra la información de fase que proviene de la imagen de los parásitos a ser reconocida El reconocimiento de un objeto depende del análisis de cada uno de los compo-nentes monocromáticos en los tres canales RGB, así que se multiplican el valor de correlación pro-medio obtenido en cada uno de los componentes monocromáticos y se obtuvo sólo un resultado

26

Figura 10

26

Figura 10

Figura 10. Resultados de correlación promedio para: a) Tri-chodina heterodentata (Th) y b) Trichodina centrostrigata (Tc). Los dibujos de cajas muestran la correlación promedio para el producto de los tres canales de color (RGB).

27

Figura 11

27

Figura 11

Figura 11. Resultados de correlación promedio para: a) Tri-chodine magna (Tm) y b) Trichodine nigra (Tn). Los dibujos de cajas muestran la correlación promedio para el producto de los tres canales de color (RGB).


Por lo tanto, para establecer el algoritmo ideal, primero debe realizarse un análisis del conteni-do de los canales monocromáticos del objeto a identificar

En este trabajo, los tres canales dieron infor-mación para la discriminación entre objetos Así, la eficiencia del sistema de correlación a través de los filtros compuestos de especie-específica para el reconocimiento de tricodinas está basada en la multiplicación del resultado de la correla-ción invariante de los tres canales Esto es debi-do al hecho de que los valores que coinciden en los tres canales (el cual da lugar al reconocimien-to de una especie) cuando se multiplican darán valores más grandes que los demás, y los valores más pequeños cuando se multiplican darán valo-res más pequeños

Un aspecto importante es que el sistema es confiable, si esto es considerado como la capa-cidad de una prueba o método para repetir una medición bajo condiciones similares con una mínima variación Cualquier observador —tan experto como pueda ser— obtendrá diferentes resultados cuando se enfrente, después de algún tiempo, a una misma escena; esto puede ser el re-sultado del cansancio o deberse a cualquier otra causa propia de la naturaleza humana La ven-taja de la correlación con filtros compuestos es que para un mínimo conjunto de imágenes será encontrado siempre el mismo resultado y esto no variará, independientemente del número de imágenes evaluadas Cuando se utiliza la corre-lación invariante a posición, rotación y a escala en la identificación de las tricodinas, el resultado siempre será el mismo, sin importar que algunos tricodínidos varíen en tamaño, posición o pue-dan estar rotados en el plano en el cual se toma la imagen Debido a la variabilidad morfológica que estos organismos presentan, fue necesario utilizar filtros compuestos de especie-específica, los cuales tienen la capacidad de tener la informa-ción de las diferencias morfológicas entre ellas El reconocimiento de una imagen se hace en 8 segundos en una Pentium III modelo 1700 y por supuesto que habrá reducción de tiempo en la medida que se utilice un procesador más avanza-do El filtro compuesto de especie-específica fue obtenido a través de diez diferentes imágenes Estas diez imágenes son sólo una muestra de un universo, y el contenido total de frecuencias es el

resultado de la suma del contenido de frecuen-cias de cada una de ellas, mostrándose así que la información de frecuencias cubre todos los án-gulos posibles (figura 8) La morfología de las es-pecies varía intra-específicamente y por lo tanto es muy difícil diferenciarlas, especialmente con respecto a los dentículos, ya que aún en la misma especie los dentículos varían considerablemente, debido a la distribución geográfica o al hospede-ro que ellos parasitan Algunos son de dentícu-los más angostos y otros son más gruesos, pero con los filtros compuestos de especie-específica sólo de fase que se utilizaron en este trabajo, los resultados indican que cuando el contenido de frecuencias de las especies a ser reconocidas es correlacionado con los filtros compuestos, el al-goritmo de reconocimiento trabaja satisfactoria-mente Además, esto es debido al hecho de que dentro de nuestro proceso de reconocimiento se ha utilizado un filtro parabólico, el cual realza los detalles finos del objeto a identificar, al ate-nuar las bajas frecuencias y realzar las altas

El uso de este sistema es simple y tiene míni-mos requerimientos de equipo de cómputo y de una cámara CCD de color El sistema de filtros compuestos de especie-específica es una herra-mienta de programación útil para la identifica-ción de protozoarios, independientemente de su forma, tamaño o posición

vIII.2. Platelmintos parásitos

Las seis especies de platelmintos parásitos de S. annulatus empleados en este estudio: Hete-robothrium ecuadori (He) y Neobenedenia me-lleni (Nm) monogeneas ectoparásitos de la piel y branquias respectivamente, y Lintonium vibex (Lv) y Phyllodistomum mirandai (Pm), endopa-rásitos de los sacos aéreos y vejiga urinaria res-pectivamente, y Bianium plicitum (Bm) y Ho-malometron longisinosum (Hl) del intestino se muestran en la figura 12

Los valores de correlación obtenidos para cada filtro compuesto especie-específico para todas las imágenes a identificar se encuentran en los gráficos de caja, así como la media, un error estándar (SE) y dos veces el error estándar (2 SE) (figuras 13-18) Los valores de correlación están normalizados Las gráficas representan la


correlación media para individuos múltiples de cada especie

Los resultados para Hl y para Bp se muestran en las figuras 13 y 14 Para ambas especies de helmintos la figura refleja el producto de la mul-tiplicación de los canales RGB; el eje x muestra el filtro compuesto específico para cada especie y el eje Y nos da el valor medio de la correlación invariante obtenida para pruebas individuales de una especie dada Para Homalometron longisi-nosum se obtuvo un valor medio de 0 75 ±0 12 (±1SE), cuando el filtro de Hl se correlacionó con las seis especies de parásitos (figura 13) Es-tos valores se separaron de los valores de corre-lación obtenidos para otras especies con 95% de confianza

En la figura 14 se muestran los valores de co-rrelación con el filtro Bp para Bianium plicitum,

con un valor medio de 0 43±0 08 (±1SE) Estos valores están completamente separados de los de las otras especies de parásitos

Las figuras 15 y 16 muestran los resultados para He y Lv Los valores de correlación para Heterobothrium ecuadori con el filtro He tuvie-ron un valor medio de 0 84 ±0 04 (±1SE) (figu-ra 15)

La correlación para Lintonium vibex con el filtro Lv tuvo una media de 0 51±0 04 (±1SE); cuyos valores están también separados de los va-lores medios obtenidos para las otras especies de parásitos

Los valores de correlación media obtenidos para Neobenedenia melleni con el filtro Nm y para Phyllodistomum mirandai con el filtro Pm

28

Figura 12

28

Figura 12

Figura 12. Monogeneas y digeneas parásitos empleados en este estudio: Heterobothrium ecuadori (He),Neobenedenia me-lleni (Nm), Lintonium vibex (Lv), Phyllodistomum mirandai (Pm), Bianium plicitum (Bm) y Homalometron longisinosum (Hl). Es-cala de las barras: Hl, Nm, He, Lv: 1mm; Bp, Pm: 0.5mm.

29

Figura 13

Figura 13. Correlación media de las imágenes de Homalome-tron longisinosum con relación a las seis especies de helmin-tos identificados.

30

Figura 14

Figura 14. Correlación media de las imágenes de Bianium pli-citum con relación a las especies de helmintos identificados.


fueron 0 53±0 09 (±1SE) y 0 67±0 16 (±1SE), respectivamente (figuras 17 y 18), los cuales tam-bién estuvieron separados de los valores medios obtenidos para otras especies

Los resultados obtenidos con las técnicas empleadas son muy buenos, considerando la complejidad de la morfología de los platelmintos parásitos Para construir y probar los filtros com-puestos especie-específicos se usaron diferentes números de imágenes de platelmintos, debido a que la morfología y el número de muestras son diferentes para cada especie La mejor vía es usar pocas imágenes (<10, en sentido práctico) debi-do a que con cada imagen adicionada se incre-menta el ruido en el proceso de identificación

Ix. Consideraciones

La utilización de este sistema es sencillo y tiene requerimientos mínimos de equipo de cómputo y de una cámara CCD a color

El sistema de filtros compuesto es una herra-mienta útil y novedosa para la identificación de tricodínidos independientemente de su forma, tamaño y posición

Este trabajo es solamente el primer paso para desarrollar un sistema automático que fa-cilite la identificación de parásitos a investigado-res y biólogos que no sean especialistas en taxo-

31

Figura 15

Figura 17. Correlación media de las imágenes de Neobene-denia melleni con relación a las especies de helmintos iden-tificados

Figura 15. Correlación media de las imágenes de Heterobo-thrium ecuadori con relación a las especies de helmintos identificados

32

Figura 16

Figura 16. Correlación media de las imágenes de Lintonium vibex con relación a las especies de helmintos identificados

33

Figura 17

34

Figura 18

Figura 18. Correlación media de las imágenes de Phyllodis-tomum mirandai con relación a las especies de helmintos identificados.


nomía; así como que permita procesar un gran número de muestras en corto tiempo El periodo de tiempo requerido para identificar una imagen en este sistema digital es menor a 8 segundos

En general se puede resumir que se ha de-sarrollado una metodología exitosa para la dis-criminación de tricodínidos y platelmintos Sin embargo, se requiere elaborar un catálogo de imágenes que debe incluir las imágenes digita-les de las principales especies de tricodínidos y platelmintos parásitos que permitan aplicar la técnica y continuar las investigaciones

x. Referencias

Álvarez-Borrego, Josué y Emma Josefina Fájer-Ávila (2006) “Identification of Platyhelmin-th parasites of the Wild Bullseye Pufferfish (Sphoeroides annulatus) using an invariant digital color correlation”. Revista de Biología Marina y Oceanografía, 41(1): 129-139

Álvarez-Borrego J y E Castro-Longoria (2003) “Discrimination between Acartia (Copepo-da: Calanoida) species using their diffrac-tion pattern in a position, rotation invariant digital correlation” Journal of Plankton Re-search, 25(2): 229-233

Álvarez-Lajonchere, L S (2005) “La escala pi-loto: etapa esencial que asegura el éxito de los planes comerciales” Panorama Acuícola, 10(3): 14-17

Arsenault, H H (1986) “Rotation invariant composite filters” En: Nonlineal Optics and Applications SPIE, vol 613

Basson, L y J G van As (1994) “Trichodinid actoparasites (Ciliophora: Peritrichida) of wild and cultured freshwater fishes in Taiwan, with notes on their origin” Systematic Para-sitology, 28: 197-222

Bray, R A y T H Cribb (1998) “Lepocreadiidae (Digenea) of Australian coastal fishes: new species of Opechona Loos, 1907, Lepotrema Ozaki, 1932 and Bianium Stunkard, 1930 and comments on other species reported for the first time or poorly known in Australian waters” Systematic Parasitology, 41: 123-148

Bradiqué, E , Y Komiya, N Ohyama, J Tsujiu-chi, T Honda (1987), “Color image corre-

lation” Optics Communications, 61(3): 181-186

Brooks, D (2000) “Parasite systematics in the 21st Century: Opportunities and obstacles” Memorias Institute Oswaldo Cruz, Río de Ja-neiro, 95: 99-107

Bueno, M A , J Álvarez-Borrego, L Acho y M C Chávez-Sánchez (2005a) “Fast Autofocus Algorithm for Automated Microscopes”. Optical Engineering, 44(6), junio

Bueno, M A , J Álvarez-Borrego, L Acho y M C Chávez-Sánchez (2005b) “Polychromatic image fusion algorithm and fusion metric for automatized microscopes” Optical Enginee-ring, 44 (9), 093201, septiembre 16

Caballero, E , M Bravo-Hollis y R G Grocott (1953) “Helmintos de la República de Pana-má vII Descripción de algunos trematodos de peces marinos” Anales del Instituto de Biología Universidad Nacional Autónoma de México, 24: 97-136

Castro-Longoria, E , J Álvarez-Borrego y J L Pech-Pacheco (2001) “Identification of spe-cies of calanoid copepods using a new inva-riant correlation algorithm” Crustaceana, 74 (10): 1029-1039

Castro-Longoria, E , J Álvarez-Borrego, A Rocha-Olivarez, S Gómez y v Kober (2003) “The power of a multidisciplinary approach: using morphological, molecular and digital methods in the study of harpacticoid cryptic species” Marine Ecology, 249: 297-303

Corbalán, M , M S Millán, M J Yzuel (1993) “Estudio de imágenes en color captadas por cámaras CCD para el reconocimiento de ob-jetos” Óptica Pura y Aplicada, 26: 649-655

Crowcroft, P (1950) “Note on Lintonium vibex (Linton, 1899) (Digenea-Trematoda)” Para-sitology, 3-4: 316-321

Cruz-Reyes, A y B Camargo-Camargo (2001) Glosario de términos en parasitología y cien-cias afines Plaza y valdés-unam, México, pp 374

Dobberstein R C y H W Palm (2000) “Tricho-dinids ciliates (Peritrichia: Trichodinidae) from the Bay of Kiel, with description of Tri-chodina claviformis sp n ” Folia Parasitologi-ca, 47: 81-90


Ehrenberg, C G (1838) “Die infusionthierchen als vollkon” Organismen Leipzig

Ernst, I , I D Whittington, S Corneillie y C Talbot (2002) “Monogenean parasites in sea-cage aquaculture” Austasia Aquaculture, 46-48

FAO (2005) FISHSTATAT Plus: Universal Soft-ware for Fishery Statistical Time Series, ver-sion 2 3 2005

Fájer-Ávila, E , J A Roque, G Aguilar y N Duncan (2004) “Patterns of occurrence of the platyhelminth parasites of the wild bullse-ye puffer (Sphoeroides annulatus) in Sinaloa, Mexico” J. of Parasitology, 90(3): 415-418

Fernández, B M M y A Kohn (1983) “Linto-nium vibex (Linton, 1900) (Trematoda, Fello-distomidae) parasitizing Stephanolepis hispi-dus (Pisces, Balistidae)”. Annals of Tropical Medicine Parasitology, 77 (5): 539-540

Ferreira, C , M S Millán, M J Yzuel y J Cam-pos (1992) “Experimental results in color pattern recognition by multichannnel mat-ched filtering” Optical Engineering, 31 (10): 2231-2238

Grabda, J (1991) Marine Fish Parasitology, PWN-Polish Scientific Publishers, Warszawa Ale-mania: 306pp

Hester, C F y D Casasent (1980) “Multivariant technique for multiclass pattern recogni-tion” Applied Optics, 19 (11): 1758-1761

Herroz-Zamorano, D A (1998) “Protozoos ci-liados ectoparásitos (piel y branquias) de peces de la Familia Cyprinidae cultivados en el Centro Acuícola Morelos de Zacapu, Michoacán” Tesis para obtener el título de Doctor en Ciencias (Biología), unam, Méxi-co, D F , 214 pp

Horner, J L y P D Gianino (1984) “Phase-only matched filtering” Applied Optics, 23 (6): 812-816

Kaneko, J J , R Yamada, J A Brock y R M Nakamura (1988) “Infection of tilapia Oreochromis mossambicus (Trewavas), by a marine monogenean Neobenedenia melleni (MacCallum, 1927) Yamaguti, 1963 in Ka-neohe Bay, Hawaii, USA and its treatment” J. Fish Dis., 11, 295-300

Kennedy, C R (1994) “Foreword” En: Pike, A W , Lewis, J W (eds ) Parasitic Diseases

of Fish. Samara Publishers, Tresaith, Dyfed, Reino Unido, pp 1-2

Khan, R A (1991) “Effect of oil-contaminated sediment on the longhorn sculpin (Myoxo-cephalus octodecemspinosus) following chro-nic exposure” Bull. Environ. Contam. Toxi-col., 47: 63-69

Khan R A , D E Barker, K Williams-Ryan y R G Hooper (1994) “Influence of crude oil and pulp and paper mill effluent on mixed infec-tions of Trichodina cottidarium and T. saintjo-hnsi (Ciliophora) parasitzing Myoxocephalus octodecemspinosus and M. scorpius” Can. J. Zool., 72: 247-251

Lamothe-Argumedo, R (1965) “Trematodos de peces II Presencia de los trematodos Bia-nium plicitum (Linton, 1928) Stundard, 1931 y Lecithochirum microstomum Chandler, 1935 en peces del Pacífico mexicano” Anales del Instituto de Biología Universidad Nacio-nal Autónoma de México, 36 (1-2): 147-157

Lamothe-Argumedo, R (1967) “Monogeneos de peces v Redescripción de Tagia ecuado-ri (Meserve, 1938) Sporoston, 1946”. Anales del Instituto de Biología Universidad Nacio-nal Autónoma de México, 38 (1): 21-42

Lamothe-Argumedo, R , L García-Prieto, D Osorio-Sarabia y G Pérez-Ponce (1996) Ca-tálogo de la Colección Nacional de Helmintos unam, México, 211 pp

Lamothe-Argumedo, R (1983) Introducción a la biología de los platelmintos Editorial ARG, pp 51-71

Lázaro-Chávez y E Mancilla (1985) “Análisis pa-tológico de las alteraciones producidas por ectoparásitos en reproductores de tilapia Sa-rotherodon hornorum (Trewavas) y Oreochro-mis mossambicus (Peters)” Rev. Lat. Acui , 25: 24-30

Lom, J (1958) “A contribution to the systematic and morphology of endoparasite trichodinids from amphibians, with a proposal of uniform specific characteristic” Journal of Protozoo-logy, 5: 251-263

Lom, J e I Dykova (1992) Protozoan Parasites of fishes, Amsterdam: Elsevier, 315 pp

Lom, J (1999) “Trichodinidae and other cilia-tes (Phylum Ciliophora)” En: P T K Woo (ed ), Fish and Disorders, vol 1 “Protozoan


and Metazoan Infections” CAB Internatio-nal, Wallingford, 808 pp

Marcogliense D J , J J Nagler y D G Cyr (1998) “Effects of exposure to contaminated sediments on the parasite fauna of American Plaice (Hippoglosoides platessoides)” Bull. Env. Contam. Toxicol., 61: 88-95

Millán, M S , J Campos, C Ferreira y M J Yzuel (1989) “Matched filter and phase only filter performance in colour image recogni-tion” Optics Communications, 73 (4): 277-284

Millán, M S , M J Yzuel, J Campos y C Fe-rreira (1991) “Strategies for the color cha-racter recognition by optical multichannel correlation” Proc. SPIE, 1507: 183-197

Millán, M S , N vila y M J Yzuel (1992) “Co-lour reserval films in multichannel optical correlators for olychromatic image recogni-tion” Pure Applied Optics, 1: 199-218

Millán, M S , M Corbalán, J Romero y M J Yzuel (1995) “Optical pattern recognition based on color vision models” Optics Letters, 20 (16): 1722-1724

Ogawa, K (2002) “Impact of diclidophorid mo-nogenean infections on fisheries in Japan” International Journal for Parasitology, 32: 373-380

Paperna, I (1996) Parasites infections and disea-ses of fish in Africa An update CIFA Technical paper, núm 31 Rome, FAO, 220 pp

Pech-Pacheco, J L , J Álvarez-Borrego, E Ore-llana-Cepeda y R Cortés-Altamirano (1999) “Diffraction patterns applicability in iden-tification of Ceratium species” Journal of Plankton Research, 21 (8): 1455-1474

Pech-Pacheco, J L , G Cristóbal-Pérez, J Álva-rez-Borrego y L Cohen (2000) “Power ceps-tral image analysis through the scale trans-form” The International Symposium on Optical Science and Technology, Algorithms and Systems for Optical Information Pro-cessing Iv, B Javidi y D Psaltis (eds ), Proc. SPIE, 4113: 68-79, San Diego, CA, USA

Pech-Pacheco, J L , G Cristóbal-Pérez, J Álva-rez-Borrego y L Cohen (2001) “Automatic system for phytoplanktonic algae identifica-tion” Limnetica, 20(1): 143-158

Pech-Pacheco, J L , J Álvarez-Borrego, G Cristóbal-Pérez y M Keil (2003) “Automa-tic object identification irrespective to geo-metric changes” Optical Engineering, 42(2): 551-559

Pérez-Ponce de León, G , L García-Prieto, B Mendoza-Garfias, G Pulido-Flores, C Aran-da-Cruz, v León-Regagnon y F García-var-gas (1999) Listados faunísticos de México IX. Biodiversidad de helmintos parásitos de peces marinos y estuarinos de la bahía de Chamela, Jalisco Universidad Autónoma de México, México, D F , 51 pp

Rodríguez-Santiago, M A (2002) “Identifica-ción de especies ectoparásitas del Género Trichodina (Ciliophora: Peritrichida) en Ti-lapia nilotica mediante correlación invarian-te con filtros compuestos” Tesis de Maestría en Ciencias, Centro de Investigación en Ali-mentación y Desarrollo, A C , Mazatlán, Si-naloa, México, 96 pp

Rodríguez, J , M Alonso, T Blandino, R Abreu y E Gómez (1987) Manual de técnicas para-sitológicas Ediciones ENPES, La Habana, Cuba: 103 pp

Schell, S C (1985) Handbook of trematodes of North America North of Mexico Moscow, Idaho University Press of Idaho

Scholz, T (1999) “Parasites in cultured and feral fish” Vet Parasitol., 84(3-4): 317-35

Scholz, T y Aguirre-Macedo, L (2000) “Meta-cercariae of trematodes parasitizing fres-hwater fish in Mexico: a reappraisal and me-thods of study” En: G Salgado-Maldonado, A N García-Aldrete y v M vidal-Martínez (eds ) Metazoan parasites in the Neotropics: a systematic and ecological perspective Edición conmemorativa del 70 aniversario del Insti-tuto de Biología, Universidad Nacional Au-tónoma de México, 101-115 pp

Trimble, J D , D Cassent, D Psaltis, F Caimi, M Carlotto y D Neft (1980) “Digital corre-lation by optical convolution/correlation” En: Real time signal processing III T. T. Tao Ed. Proc. SPIE, 214: 155-160

Thomson, D , L Findley e Y A Kerstich (1987) Reef fishes of the sea of Cortés. The Rocky-Shore Fishes of the Golf of California The University of Arizona Press, 301 pp


van As, J G y L Basson (1989) “A further con-tribution to the taxonomy of the Trichodini-dae (Ciliophora: Peritrichida) and a review of the taxonomic status of some fish ectopa-rasitic trichodinids” Systematic Parasitology, 14: 157-179

Wellborn, T L (1967) “Trichodina Ciliata: Ur-ceolarilidae of freshwater fishes of the Southeastern United States” Journal of Pro-tozoology, 14: 399-411

Whittington, I D y M A Horton (1996) “A revision of Neobenedenia Yamaguti, 1963 (Monogenea: Capsalidae) including a re-description of N melleni (MacCallum, 1927) Yamaguti, 1963” Journal of Natural History, 30: 1113-1156

Whittington, I (2002) Parasitology Section Hel-minths, Australia, 8: 1-8

Yamaguti, S (1963) Systema Helminthum IV. Mo-nogenea and Aspidocotylea InterScience Pu-blishers, Nueva York, USA, 699 pp

Yamaguti, S (1971) Synopsis of digenetic tremato-des of vertebrates, vols I-Iv, Keiguku Publis-hing Co , Tokyo, Japón, 1074 pp

Yeomans, W E , J C Chubb y R A Sweeting (1997) “Use of protozoan communities for pollution monitoring” Parassitologia, 39: 201-212

Yu, F T S y T H Chao (1983) “Color signal co-rrelation detection by matched spatial filte-ring” Appl. Phys. B. Photophys. Laser Chem. B., 32 (1)

capítulo 7 Algoritmo de correlación digital a color en histopatología

para la diagnósis de enfermedades en camarón

Maria Cristina Chávez SánchezJosué Álvarez Borrego

Vitaly KoberSelene Abad Rosales

I. Introducción

En los tiempos modernos ninguna otra industria primaria en el mundo ha tenido un consistente crecimiento anual en un periodo de dos décadas como la acuicultura De acuerdo a la FAO, la contribución de esta actividad al abastecimiento global de peces, crustáceos y moluscos se incre-mentó de 5 3 % del total de la producción por peso en 1970 a 29 2% en el 2002 El sector cre-ció a una tasa promedio de 8 9% comparado con 1 2 % de la pesca y 2 8% de incremento en la producción de carne terrestre en el mismo perio-do En esta actividad Asia continúa dominando y contribuye con 91 2% de la producción global total; China es el líder mundial, con 71 2% Áfri-ca también incrementó su producción en 25% en el periodo 1970-2000 En América Latina y el Caribe se ha experimentado una rápida expan-sión de la producción acuícola, la cual creció a razón de 15 5% anual durante los años noventa; la producción en la región creció 7 1% en 2001, totalizando casi 4,000 millones de dólares, lo que demuestra que las principales especies que se cultivan son de valor elevado (De Silva, 2000; FAO, 2004)

No obstante el desarrollo de la acuicultura en los últimos años, ésta se ha visto afectada fuerte-mente por enfermedades que se han convertido en uno de los mayores impedimentos y desafíos del desarrollo de la actividad, impactando tan-to el aspecto económico como social de diversos países Por lo anterior, tomar medidas con rela-ción a la salud de los organismos acuáticos bajo cultivo es un requerimiento importante para lo-grar un crecimiento sostenido de la acuicultura (Bernoth y Subasinghe, 2000)

Existen diversos métodos para el diagnóstico de enfermedades de los organismos acuáticos, los cuales dependen del tipo de patógeno, tales como técnicas de bacteriología, parasitología, in-munología, biología molecular, virología e histo-patología El diagnóstico de enfermedades por histopatología es una técnica muy útil porque es la única que se lleva a cabo para el reconocimien-to de cambios en las células, tejidos y órganos, así como para la identificación de patógenos presentes en los mismos Los especialistas en histopatología identifican estos cambios porque son característi-cos de cada enfermedad Sin embargo, el procesa-miento de las muestras de los organismos a obser-var bajo el microscopio tiene la desventaja de ser lento, y actualmente lo que se requiere es contar con técnicas rápidas y precisas Si cada enfermedad tiene características propias que pueden ser iden-tificados por un técnico para realizar la diagnosis, entonces es factible aplicar métodos automatiza-dos de identificación para que la histopatología sea una metodología de diagnóstico más rápida; tal es caso del uso de los sistemas digitales de correlación automatizada Si se logra hacer una lectura de las laminillas en forma automática, rápida y precisa, los especialistas serán releva-dos de la identificación de patógenos conocidos o de daños muy característicos y se dedicarán solamente a la búsqueda de nuevas patologías o nuevos patógenos, esto redundará en una mayor eficiencia para esta tarea Si esta técnica logra consolidarse, la metodología podría aplicarse en otros campos de la histopatología, así como en estudios epidemiológicos de cualquier organis-mo, incluyendo el humano

150 Maria Cristina Chávez Sánchez, Josué Álvarez Borrego, Vitaly Kober y Selene Abad Rosales

I.1. El problema de las enfermedades en la camaronicultura a nivel mundial

La camaronicultura ha sufrido devastadoras pér-didas en diversos países del mundo debido prin-cipalmente a las enfermedades de origen viral; esto ha ocasionando en varios países pérdidas millona-rias y, en consecuencia, efectos sociales y econó-micos devastadores (Chen, 1995; Winarno, 1995; Stern, 1995; Cadenas, 2001) Ejemplo de lo ante-rior se sintetiza en la tabla 1, en la que se indican las pérdidas ocasionadas solamente por el virus de la mancha blanca en diversos países productores de camarón Para reducir el impacto de dichas en-fermedades, una de las medidas que los países de-ben adoptar es desarrollar programas de salud que contemplen determinar qué enfermedades están presentes en sus poblaciones silvestres y cultivadas Es imperante también realizar estudios epidemio-lógicos y establecer zonas libres de enfermedades para lo cual deberán usarse todas las herramientas de diagnóstico disponibles

Tabla 1Pérdidas estimadas ocasionadas por el virus de

la mancha blanca en diversos países del mundo*

•RP China 1993 $250 millones USD•India 94/95 $17 6 millones* USD•Malasia 1995-1999 $25 millones USD•Bangladesh 1995 (ext ) $10 millones USD•Tailandia 1996 $210-250 millones USD

1997 $600 millones** USD•Sri Lanka 1998-1999 Rs 1 billones•Ecuador Abril-Agosto 99 $280 5 millones USD

2000 $400 millones USD•Panamá Principios de 99 $40 millones USD•México 1999

2000$ 44 8 millones USD$30 2 millones UDS

*Cortesía Dr Richard Arthur con excepción de los datos de México

**Incluye pérdidas debidas a YHv

I.2. La camaronicultura en México

México es un país privilegiado para el desarrollo del cultivo del camarón por varias razones: por las condiciones climáticas que permiten el cul-tivo comercial, porque cuenta con especies ade-cuadas para el cultivo y por tener como vecino al

consumidor más grande de camarón, los Estados Unidos (Álvarez et al., 2000) Actualmente, es la actividad acuícola más importante en el país La camaronicultura comercial empezó en 1988 con una producción de 551 tm (Contreras y Montero, 2000), para 1989 se produjeron 2,846 tm y para 1999 se incrementó a 29,120 tm, con un valor de 1,500 millones de pesos (Álvarez et al., 2000) La producción de camarón en 2003 fue de 67,000 toneladas, en el 2004 de 78,000 tm (Gutiérrez-venegas, 2005) y para 2005 se reportan cerca de las 90,000 toneladas

Al igual que en otros países, el cultivo del camarón en México ha sido afectado por diver-sas enfermedades; entre las de importancia para este cultivo se encuentran, principalmente, las de etiología bacteriana, fungal, y viral (Lightner, 1988, 1993, 1996; Brock y Lightner, 1990) Las más agresivas han sido las de origen viral En México se han identificado 6 distintos virus, pero realmente los únicos que han ocasionado serias pérdidas y trastornos han sido tres: la necrosis infecciosa del tejido hipodérmico y hematopoyé-tico (IHHNv, por sus siglas en inglés), el virus del síndrome de Taura (TSv, por sus siglas en in-glés) y el virus de la mancha blanca (WSSv, por sus siglas en inglés)

I.3. Las enfermedades virales más importantes en el cultivo del camarón en México

El IHHNv se reconoció por primera vez como enfermedad viral en 1981 en Hawaii, en un lote de reproductores importados de camarón azul Litopenaeus stylirostris de instalaciones de Cen-tro y Sudamérica (Lightner et al., 1983) Este virus no se había reportado para México Sin embargo, en 1987 y en los siguientes tres años este virus se introdujo y se dispersó con lotes de camarones que se movilizaron al norte del Golfo de California en el oeste de México (Lightner et al., 1992), desde entonces este virus ha ocasio-nado pérdidas tanto en camarón silvestre como cultivado y se considera que se encuentra amplia-mente distribuido en las poblaciones de camarón blanco en toda la costa oeste de México y conti-núa afectando a aquellas poblaciones estresadas y con sistema inmunológico suprimido

Posteriormente, a principios de 1995 se de-tectó el virus del síndrome de Taura en adul-

151Algoritmo de correlación digital a color en histopatología para la diagnósis de enfermedades en camarón

tos silvestres de L. vannamei colectados en alta mar en pesquerías del sur de México, frente a las costas de Chiapas cerca de la frontera con Guatemala En el estado de Sinaloa este virus se detectó en mayo de 1995, en la zona norte del estado y con 75% de prevalencia, dispersándose progresivamente a la zona centro y sur del es-tado Los registros de camarón por acuicultura en el estado de Sinaloa muestran que en 1996, debido al impacto de la enfermedad, la produc-ción decreció en 31 2% respecto a 1995 Una encuesta llevada a cabo en 1996 por el Instituto Nacional de la Pesca, cuando hizo su aparición el virus del Taura, señala que las granjas afectadas fueron 54% Actualmente se sigue presentando, pero aparentemente con menos agresividad que en sus inicios Se requiere hacer una evaluación del efecto que esta enfermedad ocasiona en las poblaciones silvestres y cultivadas de México

El virus del síndrome de la mancha blanca (WSSv) se detectó por primera vez en países asiáticos en 1992 (Chen, 1995; Flegel et al , 1995; Huang et al , 1995; Inouye et al , 1994; Kimura et al , 1996), causando las mayores pérdidas eco-nómicas registradas para la actividad acuícola en esa región del mundo En Norteamérica se diag-nosticó desde 1995 en camarones silvestres y de cultivo en los estados de Texas y Carolina del Sur en los Estados Unidos (Lightner et al , 1997) En México se detectó por primera vez a finales de 1999, en granjas ubicadas en el noroeste del país, asociado con altas mortalidades Actualmente también ha sido detectado en Europa (Rosenbe-rry, 2000) Esta enfermedad se dispersó en toda la costa del Pacífico y sigue ocasionando pérdi-das severas en la camaronicultura de México

Por los antecedentes descritos anteriormen-te, existe una necesidad imperante de establecer programas de sanidad acuícola y realizar estu-dios epidemiológicos con el fin de determinar la distribución geográfica de las enfermedades, identificar zonas libres del patógeno, conocer la prevalencia (número de organismos afectados con el paso del tiempo) y severidad (número de patógenos o daños patológicos en células y te-jidos) de la enfermedad en las zonas en la que se encuentra establecida, con el fin de establecer programas de control de la enfermedad a nivel granja, cuerpos de agua, región o país Como ya

se mencionó anteriormente, para llevar a cabo tales programas, se requiere que los métodos de diagnóstico sean rápidos, precisos y con alta es-pecificidad y sensibilidad

I.4. Métodos de diagnóstico de enfermedades en la camaronicultura

Para la diagnosis y la investigación de enferme-dades infecciosas en la camaronicultura se utili-zan diversas metodologías, las cuales dependen del tipo de patógeno que origina la enfermedad; tales como la serie de técnicas utilizadas en bac-teriología y diversas técnicas especiales para la determinación de hongos y diversos parásitos, las cuales han sido bien establecidas (Lightner, 1996) En el caso de las enfermedades virales, las técnicas más utilizadas actualmente para de-terminar la presencia/ausencia de virus de ca-marones son las técnicas de biología molecular basadas en el análisis de ADN como la de PCR, hibridación in situ, dot blot (Lightner, 1996), así como las técnicas basadas en detección inmu-nológica utilizando anticuerpos monoclonales (Poulos et al., 2001) A pesar de estas técnicas, rápidas y precisas, la histopatología —como ya se mencionó— sigue siendo la única herramien-ta útil para diagnosis e investigación que indica los cambios patológicos en las células, órganos y tejidos de los organismos, y que permite la iden-tificación de nuevos patógenos, difíciles de reco-nocer con otras técnicas

I.5. La histología

El objetivo de la histología es conocer y com-prender la microanatomía de las células, tejidos y órganos y correlacionar la estructura con la función Los métodos empleados en la histolo-gía son muy diversos pero están encuadrados en la microscopía óptica; una interpretación más detallada se basa en la microscopía electrónica, tanto en la de electrones como en la de barrido La histología usa varias técnicas auxiliares, tales como histoquímica y citoquímica, autorradiogra-fía, cultivo de órganos y tejidos, separación de células y organelos por centrifugación diferen-cial, técnicas microscópicas y microscopios espe-cializados (Ross et al., 1997)


I.6. La histopatología

Los organismos están sujetos a cambios cons-tantes en el medio ambiente La mayoría de los cambios exige un grado variable de adaptabili-dad celular La mayoría de estas adaptaciones se producen a nivel bioquímico y representan la regulación fina de una función metabólica Sin embargo, muchas adaptaciones se acompañan, además, de cambios estructurales visibles al mi-croscopio Muchos cambios entran dentro del crecimiento normal de una célula por lo que se les denominan cambios fisiológicos y se conside-ran normales, otros cambios se salen del inter-valo fisiológico normal y producen daño celular y/o alteración del funcionamiento de las células y a éstos se les conoce como cambios patológicos (Stevens et al., 2003) La histopatología es de suma importancia en medicina y se considera la base de la medicina sobre la cual se construyen las otras líneas de investigación patológica La interpretación de los síntomas que presentan los organismos, las señales que pueden provocar y las investigaciones a las cuales pueden estar su-jetos dependen de una apreciación precisa de lo que está pasando en los tejidos La histopato-logía proporciona el método más simple y fácil para determinar qué está pasando a nivel estruc-tural a niveles microscópicos y ultramicroscópi-cos (Wheater et al., 1985) Las investigaciones y diagnósticos realizados para determinar cambios patológicos se realizan analizando láminas his-tológicas bajo el microscopio óptico y éstas se obtienen siguiendo una serie de metodologías y técnicas histológicas

I.7. Técnicas de histología

Las técnicas de histología básica para conocer la microanatomía normal y patológica de las células, órganos y tejidos comprende una serie de pasos que tienen como fin lograr una lámina muy del-gada de tejido de aproximadamente 5 micras que se tiñen con hematoxilina-eosina para que pueda ser observada bajo el microscopio Sin embar-go, estas técnicas presentan varios problemas: a) para obtener la laminilla final se requiere seguir varios procesos tales como la fijación, deshidra-tación, embebido en parafina, corte y tinción de los tejidos, los cuales toman aproximadamente 3

días; b) cuando se trata de revisar unas cuantas laminillas, la determinación de la histología nor-mal o patológica es rápida cuando se tiene el en-trenamiento y la experiencia apropiadas y los re-sultados se pueden proporcionar en el mismo día en que se obtuvieron las laminillas Sin embargo, cuando se trata de diagnosticar una enfermedad en poblaciones, por ejemplo, de camarón en una granja o de estudios de epizootiología que con-templen varias granjas o regiones, es necesario analizar cientos de laminillas El problema está en que es necesario “barrer” cada una de ellas bajo el microscopio en la búsqueda de los pa-tógenos o de los cambios patológicos, lo cual es una tarea cansada que consume mucho tiempo y la mayoría de las ocasiones los resultados de-ben ser conocidos en el menor tiempo posible para poder tomar medidas preventivas o aplicar métodos de control adecuados antes de que sea demasiado tarde

Una manera de poder hacer que la histopa-tología sea más eficiente en términos de tiempo es mediante el uso del procesamiento de imá-genes digitales y sistemas automatizados Si se logra hacer una lectura de las laminillas en for-ma automática, rápida y precisa con alto grado de sensibilidad y especificidad, los investigado-res podrán ser relevados de la identificación de patógenos conocidos o de cambios patológicos bien identificados y esto redundará en una ma-yor eficiencia para esta tarea Por otro lado, en la tarea de buscar nuevos patógenos (patógenos emergentes) o daños patológicos no conocidos, éstos podrían ser identificados más fácilmente con el cúmulo de imágenes que serán almacena-das en la base de datos de la computadora y ser analizados más rápidamente en el monitor

I.8. Problemas a resolver para establecer un sistema automatizado de imágenes digitales

Una lámina histológica contiene una delgada capa de 3 a 5 micras de grosor que contiene te-jidos, órganos y células de algún organismo El método de procesamiento automatizado deberá contemplar las siguientes características, que son las mismas que toma en cuenta el especialista al observar y hacer un análisis de las láminas, ya sean para determinar la histología normal o pa-tológica:


a) Tomar en cuenta que lo que está observando es tridimensional

b) Grosor de los tejidos: normalmente la téc-nica de histología básica requiere de cortes de 5 micras de grosor, sin embargo, en oca-siones es necesario obtener laminillas de 3 micras de espesor, por ejemplo para orga-nismos muy pequeños y frágiles La metodo-logía deberá tomar en cuenta este problema para evitar errores

c) Las láminas histológicas son translúcidas a la luz del microscopio

d) El uso de los colorantes utilizados en la his-tología básica, la hematoxilina y la eosina so-lamente sirven para diferenciar característi-cas estructurales y no químicas; sin embargo, debido a las diferentes características quími-cas de las células, hay diferencias de afinidad por los colorantes y por lo tanto se presentan dos diferentes coloraciones (de tipo básico y ácido) conocidas como basófilas (azules) o eosinófilas (rosas) y éstas con diferentes tonalidades que indican qué tipo de célula, órgano o tejido estamos observando Lo an-terior da como resultado una lámina poli-cromática que tiene que tomar en cuenta el sistema

e) Las coloraciones pueden presentar diferen-tes tonalidades debido también al tiempo de uso de los colorantes, si éstos son reciente-mente preparados son más fuertes y mientras más hayan sido usados se van diluyendo y la diferenciación celular va perdiendo fuerza

f) Las células de cada tejido u órgano son com-pletamente diferentes no solamente en cuan-to a color sino en tamaño, forma y densidad

g) Las células pueden presentar diferentes for-mas de acuerdo al tipo de corte que se haga — transversal, longitudinal o tangencial— y por lo tanto, debido a que las células son tri-dimensionales, en el corte puede solamente verse la parte superior, media o inferior de la célula; o bien anterior, media o posterior, dependiendo de cómo se haga el corte

h) En una lámina histológica se presentan es-pacios en blanco (sin tejidos) que deben ser discriminados por el sistema

i) Debido a la gota de resina sintética que se pone encima del tejido y que queda entre el portaobjetos y el cubreobjetos, muchas veces

los tejidos quedan ondulados, por lo que en consecuencia el tejido no queda siempre en el mismo plano sobre el portaobjetos, dando en consecuencia la necesidad de enfocar de manera distinta el microscopio en diferentes campos de observación

j) Los diferentes patógenos pueden presentar diferentes estadios, formas, tamaños, colo-res, afectar diferentes células y mostrarse diferentes

II. Algoritmos de correlación digital aplicados al reconocimiento de cuerpos de inclusión de virus

II.1. Antecedentes sobre el reconocimiento de imágenes policromáticas

Se han desarrollado varias estrategias ópticas en función exclusivamente de la forma del objeto a reconocer Sin embargo, para enfrentar el pro-blema de identificar objetos que difieren sólo en la distribución del color, se diseñó la estrategia basada en la información de forma y color para el reconocimiento de imágenes policromáticas a través de un sistema multicanal que se basa en la descomposición tricromática en rojo, verde, azul (RGB, por sus siglas en inglés), filtros holográfi-cos y correlación Esta técnica se ha utilizado con éxito para el reconocimiento de diversos objetos, tales como caracteres y figuras geométricas (Yu y Chao, 1983; Bradiqué et al , 1987; Millán et al , 1989, 1992), pero no se había utilizado para iden-tificar organismos o partes de organismos

En los objetos policromáticos, la forma de-pende de la longitud de onda de la iluminación Por consecuencia, objetos con una distribución espacial de color diferente pueden parecer simi-lares bajo una iluminación a cierta longitud de onda (Millán et al , 1989, 1992) El proceso de reconocimiento multicanal para la identificación de objetos policromáticos está basado en la des-composición de la información de la forma y el color de las imágenes en tres canales monocro-máticos donde el objetivo es identificado separa-damente Tres longitudes de onda λ1, λ2 y λ3 que cubren el espectro de luz visible son selecciona-das para iluminar cada canal Para cada uno se efectúa el procedimiento de reconocimiento con la técnica de filtraje y sus respectivos resultados


se obtienen sucesivamente en un correlaciona-dor 4F clásico De esta manera se obtienen las tres correlaciones de la imagen de entrada con el filtro bajo diferentes longitudes de onda y la in-formación de la distribución de color de los obje-tos puede ser considerada (Ferreira et al , 1992; Millán et al , 1989, 1992)

Forero-vargas et al (2001) identificaron bac-terias de tuberculosis utilizando dos técnicas di-gitales: protocolos poco definidos y correlación sólo de fase En este trabajo observaron que la forma de la bacteria no es suficiente como rasgo característico para su identificación, ya que mu-chas especies de bacterias presentan la misma forma Por lo tanto, utilizaron la información del color de la imagen de la bacteria Forero-vargas et al. (2002) utilizaron dos métodos para la seg-mentación de imágenes de tuberculosis, utili-zando la información cromática y algoritmos de autoenfoque Más tarde, Cristóbal-Pérez et al (2003) presentaron una técnica de identificación automatizada para la tuberculosis Esta técnica esta basada en la utilización del conocimiento heurístico, el cual es obtenido del contorno de la forma del bacilo, así como el uso de la informa-ción de color (Más sobre tuberculosis puede ver-se en el capítulo 5 de este libro )

Álvarez-Borrego et al. (2002) evaluaron la utilidad de los sistemas ópticos de correlación de imágenes a color, con invariancias a posición, ro-tación y escala para el reconocimiento de Vibrio cholerae 01 Los resultados mostraron que es po-sible el reconocimiento de la bacteria a pesar de los cambios de tamaño, posición y rotación (Más sobre la bacteria del cólera puede verse en el ca-pítulo 4 de este libro ) Por otro lado, Fajer-Ávila y Álvarez-Borrego (2002), Álvarez-Borrego y Fájer-Ávila (2006) utilizaron la correlación inva-riante de los patrones de difracción de algunas especies de parásitos de peces (Heterobothrium ecuadori, Neobenedenia melleni, Lintonium vibex, Homalometron longisinosum, Bianium plicitum y Phyllodistomum mirandai) La información del color se convirtió en un factor muy importante para la discriminación entre las especies anali-zadas durante todo el proceso de identificación El reconocimiento de las imágenes a color inva-riantes a escala, posición y rotación, se realizó a través de la transformada a Escala (capítulo 6 de este libro)

II.2. Señales histopatológicas que identifican a IHHNV

De acuerdo a Lightner et al. (1983), para diag-nosticar al virus del IHHN mediante el análisis de láminas histológicas, es necesario demostrar la presencia de cuerpos de inclusión intranuclea-res prominentes del tipo Cowdry A Los cuer-pos de inclusión son eosinófilos rodeados por cromatina marginal y se observan en los núcleos hipertrofiados de células de tejidos ectodérmi-cos —branquias (figura 1), epidermis, epitelio hipodérmico de sistema digestivo anterior y pos-terior, cuerda nerviosa y ganglios nerviosos— y tejidos de origen mesodérmico —órgano hema-topoyético, glándula antenal, órgano linfoide, tejido conectivo y músculo estriado

Figura 1

Figura 1. Cuerpo de inclusión tipo Cowdry A característicos de IHHNv, el cual presenta un anillo de cromatina, un halo blanco y el cuerpo eosinófilo muchas veces brillante refringente en el centro.

Por lo anterior, los cuerpos de inclusión de tipo Cowdry A no son fáciles de identificar debido a que se encuentran en diversos tejidos, presen-tan diferentes formas y tonos de color ya que no siempre se presentan eosinófilos sino que van de eosinófilo brillante a púrpura oscuro, lo cual de-pende de la célula que invaden, de la madurez del cuerpo de inclusión de los tiempos de tinción y calidad de la tinción Una dificultad mayor que se presenta es que el virus IHHNv, al igual que el virus de la mancha blanca (WSSv, por sus siglas en inglés), también presenta cuerpos de inclusión tipo Cowdry A Muchos de los tonos de color eosinófilo en ambos patógenos son muy parecidos en ambos virus, razón por la cual en la metodología convencional es necesario diag-


Figuras 2 y 3

Figuras 2 y 3

nosticar con técnicas de hibridación in situ para determinar cuál de estos virus es, o si los dos se encuentran invadiendo al organismo

III. Avances en la aplicación de la correlación digital a color automatizada en la diagnosis histopatológica de IHHNV

Con el fin de probar si la metodología de correla-ción a color y procesamiento de imágenes podía ser usada para identificar cambios histopatológi-cos, se llevó a cabo un estudio previo en el que se usaron diapositivas con imágenes de tejidos de camarón con cuerpos de inclusión de IHHNv (Álvarez-Borrego y Chávez-Sánchez, 2001)

Métodos

Los camarones fueron capturados en una granja de Sinaloa, transportados al laboratorio y fueron fijados con la solución de Davidson durante un periodo de 48 horas; posteriormente los tejidos se cambiaron a alcohol al 50% y se procesaron histológicamente con la metodología convencio-nal descrita por Lightner (1996) De las láminas obtenidas se seleccionaron cuerpos de inclusión tipo Cowdry A característicos de este virus en epitelio cuticular, cordón nervioso, branquias, y tejido conectivo Se tomaron fotografías al mi-croscopio con un objetivo de 60x y con una cá-mara HP Photosmart digital se obtuvieron las diapositivas a trabajar De la imagen grabada en una computadora se obtiene la información de las frecuencias que forma la imagen, se aplica un filtro de fase que contiene la información sólo de fase del cambio patológico o del patógeno que se quiere identificar en el tejido En este caso fue-ron cuerpos de inclusión de IHHNv tipo Cow-dry A clásicos y se obtuvo la correlación en el plano de salida, dando un pico alto en el lugar “geográfico” donde se encuentra el patógeno en el tejido Se determinaron específicamente tres correlaciones para analizar las diapositivas obtenidas y los cuerpos de inclusión que iban a ser detectados El reconocimiento de los cuer-pos de inclusión se llevó a cabo descomponiendo la imagen del objeto a reconocer en tres canales monocromáticos (RGB) e identificando el obje-to independientemente en cada canal En este

trabajo no se consideró la correlación invariante a escala y rotación

Resultados y conclusión

Los cuerpos de inclusión fueron detectados cuando simultáneamente se produjeron picos de correlación máxima en los tres canales (figuras 2 y 3) Con este primer trabajo en tejidos de ca-marón se demostró el potencial de la técnica de diagnóstico no sólo para IHHNv, sino que puede ser utilizado para la identificación de otros virus y patógenos Se mostró también que los tiempos de identificación se pueden reducir a segundos pero que es necesaria mayor investigación para considerar aspectos como rotación, escala, color, morfología de los virus y el uso de diferentes cla-ses de filtros, dependiendo de la complejidad de los cuerpos de inclusión a reconocer

Figuras 2 y 3 que muestran dos microfotografías de tejido co-nectivo (a) y branquias de camarón (b) con los característi-cos cuerpos de inclusión tipo Cowdry A que fueron totalmen-te reconocidos por el sistema.


Referencias

Álvarez-Borrego, J y M Chávez-Sánchez (2001) “Detection of IHHN virus in shrimp tissue by digital color correlation” Aquaculture, 194: 1-9

Álvarez-Borrego, J y E J Fájer-Ávila (2006) “Identification of Platyhelminth parasites of the Wild Bullseye Pufferfish (Sphoeroides annulatus) using an invariant digital color correlation” Revista de Biología Marina y Oceanografía, 41(1): 129-139

Álvarez- Borrego, J , R Mouriño-Pérez, G Cristóbal-Pérez, J Pech-Pacheco (2002) “In-variant recognition of polychromatic images of Vibrio cholerae 01” Optical Engineering, 41(4): 827-833

Bernoth, E y R Subasinghe (2000) “Disease Control and health Management” En: In-ternational Conference on Aquaculture in the Third Millenium 20-25 February 2000 Central Grand Plaza Bangkok, Thailand Department of Fisheries of Thailand Net-work of Aquaculture Centers in Asia Pacific and Food Agriculture Organization of the Unites Nations, pp 145-153

Bradiqué, E , Y Komiya, N J Ohyama, T Hondo Tsujiuchi (1987) “Color image correlation” Optics Communications, 61 (3): 181-186

Brock, J y D v Lightner (1990) “Diseases of crustaceans Diseases caused by proliferative lesions and neoplasia” En: Kinne, O (ed ), Diseases of Marine Animals, Vol. III Biologis-che Anstalt Helgoland, Hamburgo, Alema-nia, 390-400 pp

Cadenas, R (2001) Descripción del manejo de los laboratorios productores de larvas de peneidos en Venezuela Reporte Técnico Primer Taller de Entrenamiento Regional Asistencia para el Manejo sanitario del Cultivo de Camarón en América Proyecto TCP/RLA/0071 (A) Organizado por la FAO 27-30 de agosto de 2001 Guayaquil, Ecuador

Chen, S (1995) “Currant status of shrimp aqua-culture in Taiwan” En: Browdy, C L , Hop-kins, J S (eds ), Swimming through trouble water. Proceeding of special session on shrimp farming, Aquaculture’95 World Aquaculture society, Baton Rouge, L A USA, pp 29-34

Contreras, F L y R A B Montero (2000) “Reporte de México” En: Trans-Boundary Aquatic Animal Pathogen Transfer and the Development of Harmonized Standards on Aquaculture Health Management. Report of the Joint APEC/FAO/NACA/SEMARNAP Workshop Puerto vallarta Jalisco, pp 69-87

Cristóbal, G , M Forero, M Desco, L Alcalá y Josué Álvarez-Borrego (2003) “Automa-tic identification techniques of tuberculosis bacteria”. The International Symposium on Optical Science and Technology, SPIE’s 48th Annual Meeting, San Diego Conven-tion Center, San Diego, CA, USA Appli-cations of Digital Image Processing xxvI (publicado, internacional), agosto 3-8 Clave (11479)

De Silva, S S (2000) “A Global perspective of aquaculture in the New Millenium” En: Book of Synopsis of the International Confe-rence on Aquaculture in the Third Millennium Department of Fisheries of Thailand, Net-work of Aquaculture Centres in Asia-Pacific and Food and Agriculture Organization of the United Nations Bangkok, Tailandia, pp 51-100

FAO (2004) The State of World Fisheries and Aquaculture FAO Fisheries Department, Food and Agriculture Organization of the United Nations, Roma, pp 153

Ferreira, C , M Millán, M Yzuel y J Campos (1992) “Experimental results in color pat-tern recognition by multichannel matched filtering” Optical Engineering, 31 (10): 2231-2238

Fájer-Ávila, E y J Álvarez-Borrego (2002) “In-variant digital color correlation for the iden-tification of Word parasites from bullseye pufferfish” SPIE, vol 4790 Applications of digital Image Processing xxv, pp 511-517

Flegel, T , D Fegan y S Sriurairatana (1995) “Environmental control of infectious disea-se in Thailand” En: Browdy, C L y J S Hopkins (eds ), Swimming through trouble water. Proceeding of special session on shrimp farming, Aquaculture’95 World Aquaculture society, Baton Rouge, L A USA, pp 65-79

Forero-vargas, M , E Sierra-Ballén, J Álvarez-Borrego, J Pech-Pacheco, G Cristóbal, L Alcalá y M Desco (2001) “Automatic spu-


tum color image segmentation for tubercu-losis diagnosis” SPIE, 4471-27: 251-261

Forero-vargas, M , F Sroubek, J Álvarez-Borre-go, N Malpica, G Cristóbal-Pérez, A San-tos, L Alcalá, M Desco y L Cohen (2002) “Segmentation, autofocusing and signature extraction of tuberculosis sputum images” The International Symposium on optical Science and Technology Seattle, Washing-ton 4788: 171-182 SPIE-The International Society for Optical Engineering

Gutiérrez-venegas, J L (2005) “La industria del cultivo del camarón en México Su historia, presente y proyección al futuro” Industria Acuícola, 1: 6-22

Huang, J , x L Song, J Yu y C H Yang (1995) “Baculoviral hypodermal and hematopoietic necrosis, study on the pathogen and patholo-gy of the shrimp explosive epidemic disease of shrimp” Mar. Fish. Res , 16: 1-10

Inouye, K , S Miwa, N Oseko, H Nakano, T Kimura, K Momoyama y M Hiraoka (1994) “Mass mortalities of cultured kuruma shrimp Penaeus japonicus in Japan in 1993: electron microscopic evidence of the causative virus” Fish. Pathol., 29: 149-158

Kimura, T , K Yamano, H Nakano, K Momo-yama, M Hiraoka y K Inouye (1996) “De-tection of penaeid rod-shaped DNA virus (PRDv) by PCR” Fish. Pathol., 31: 93-98

Lightner, D v , R M Redman y T Bell (1983) “Infectious hypodermal and hematopoietic necrosis (IHHN), a newly recognized virus disease of penaeid shrimp” Journal of Inver-tebrate Pathology, 42: 62: 70

Lightner, D (1988) “Diseases of cultured pe-naeid shrimp and prawns” En: Sinderman, C J y D v Lightner (eds ) “Disease Diag-nosis and Control in North American Mari-ne” Aquaculture Elsevier, Amsterdam, pp 8-127

Lightner, D (1993, 2ª e ) “Diseases of penaei shrimp” En: Mcvey, J P (ed ) CRC Hand-book of Mariculture: Crustacean Aquaculture, CRC Press, Boca Raton, FL, pp 393-486

Lightner, D , (ed ) (1996) A handbook of shrimp pathology and diagnostic procedures for disea-ses of cultured penaeid shrimp World Aqua-culture Society, Baton Rouge, LA, USA, 305 pp

Lightner, D v , B T Redman, L M Poulos y J L Numan (1997) “Status of the major virus diseases of concern to the shrimp farming industries of the Americas Know distribu-tion, host and available detection methods” En: D E Alston, B W Green y H C Cli-ford (eds ) IV Simposio Centroamericano de Acuacultura. Cultivo Sostenible de Camarón y Tilapia Abril 22-24 Tegucigalpa, Hondu-ras and the Latin American Chapter of the World Aquaculture Society, pp 36-48

Lightner, D v , R M Williams, T A Bell, R M Redman y L A Pérez (1992) “A collection of case histories documenting the introduction and spread of the virus IHHN in penaeid shrimp culture facilities in Northwestern Mexico” ICES. Mar. Sci. Sym., 194: 97-105

Millán, M , J Campos, C Ferreira y M J Yzuel (1989) “Matched filter and phase only filter performance in colour image recognition” Opt. Commun , 73 (4): 277-284

Millán, M , M Yzuel, J Campos y C Ferreira (1992) “Different strategies in optical recog-nition of polychromatic images” Appl. Opt , 31 (14): 2560-2567

Poulus, B , C Pantoja, D Bradley-Dunlop, J Aguilar y D Lightner (2001) “Development and application of monoclonal antibodies for the detection of white spot syndrome virus of penaeid shrimp” Dis. Aquat. Organ , 47(1): 13-23

Rosenberry, B (2000) “World Shrimp Farming 2000” Shrimp News International, San Die-go, CA

Ross, H M , J L Romrell e I G Kaye (1997, 3ª ed ) Histología. Texto y Atlas Color Editorial Médica Panamericana Bogotá, Buenos Ai-res, Caracas, Madrid, Sao Paulo, 817 pp

Stern, S (1995) “Swimming Through Troubled Waters in Shrimp Farming Ecuador Coun-try Review” En: Browdy, L C y S Hopkins (eds ) Swimming Through Troubled Water. Proceedings of the Special Session on Shrimp Farming World Aquaculture Society Baton Rouge Louisiana, USA, pp 35-39

Stevens, A , S J Lowe y B Young (2003, 4ª ed ) Wheater. Histopatología básica Elsevier Churchill Livingstone Madrid, España, pp 295


Wheater, R P , H G Burkitt, A Stevens y S J Lowe (1985) Basic Histopathology. A Colour Atlas and Text Churchill Livingston Edim-burgo, Londres, Melbourne y Nueva York, pp 217

Winarno, B (1995) “Shrimp Aquaculture in In-donesia” En: Browdy, L C y S Hopkins

(eds ) Swimming Through Troubled Water. Proceedings of the Special Session on Shrimp Farming World Aquaculture Society Baton Rouge Louisiana, USA, pp 24-28

Yu, F y T Chao (1983) “Color signal correlation detection by matched spatial filtering” Appl. Phys. B. Photophys. Laser Chem. B., 32 (1)

capítulo 8Sistemas adaptativos para el reconocimiento

de patrones biológicos

Vitaly KoberJosé Ángel González-FragaVíctor Hugo Díaz-Ramírez

Josué Álvarez-Borrego

I. Introducción

Con el fin de diseñar métodos de reconocimien-to efectivos de patrones complejos de imágenes en diferentes aplicaciones del procesamiento au-tomatizado y procesado de imágenes en tiempo real, se han propuesto diferentes tipos de filtros desde la introducción del filtro espacial de aco-plamiento (MSF) (vander Lugt, 1964), basados en la operación de correlación (Horner y Gia-nino, 1984; Casasent, 1984; Arsenault y Hsu, 1983; Mahalanobis et al., 1987; vijaya Kumar y Hassebrook, 1990; Yaroslavsky, 1993; Kober et al., 1994; Javidi y Wang, 1994; Kober y Campos, 1996; Kober y Ovseyevich, 2000; Kober y Choi, 2000; Billet y Singher, 2002; Jedynski y Chalasin-ska-Macukow, 2005; Moreno et al., 1998; Pech-Pacheco y Álvarez-Borrego, 1998 )

Incluso cuando los patrones u objetos pueden presentar distorsiones geométricas (desplaza-mientos, rotación, escalamiento, tomados por una cámara desde diferentes puntos de vista), diferen-cias en el contenido de la señal (textura, intensi-dad o contraste), y degradaciones por el ruido, ya sea dependiente de la señal o independiente, se deben reconocer o clasificar como el mismo obje-to Algunos ejemplos de estas aplicaciones son la visión por computadora y el procesado automá-tico de imágenes biológicas Para algunas de las aplicaciones más críticas, las técnicas ópticas o hí-bridas opto-digitales permiten un procesamiento de imágenes más rápido Tal es la razón del en-foque basado en filtros por correlación para esta área, estos filtros poseen buenos fundamentos matemáticos (Horner y Gianino, 1984) y pueden implementarse eficazmente de manera digital u opto-digital (Moreno et al., 1998)

Las siguientes propiedades son requisitos importantes en los sistemas para el reconoci-miento de patrones

La invariancia a las distorsiones de intensidad puede expresarse como la tolerancia a las distor-siones (Jain, 1989) producidas por los niveles de intensidad como el desenfoque, la iluminación no uniforme, degradaciones producidas por el ruido del sensor que generalmente ocasiona una ópti-ca imperfecta, dispositivos electrónicos (cáma-ras, microscopios, moduladores espaciales de luz, fuentes de iluminación, etc ) En ausencia de cier-ta información a priori sobre las distorsiones por los niveles de intensidad, los filtros correladores pueden producir un alto índice de falsas alarmas

La invariancia a las distorsiones geométricas es la tolerancia a los cambios geométricos en la forma de los objetos causada por aberracio-nes de los sistemas ópticos, o bien por las dis-crepancias entre las diferentes perspectivas de las imágenes o por las diferentes formas de un mismo objeto De hecho, cualquier objeto puede considerarse una versión distorsionada de otro Cuando es necesario clasificar diferentes objetos en clases arbitrarias, el sistema clasificador debe considerar como idénticos a todos los objetos de una clase Por ejemplo, las versiones rotadas, es-caladas y las diferentes formas y colores de un objeto pueden considerarse pertenecientes a la misma clase De modo que, un sistema de reco-nocimiento de patrones debe proporcionar la misma salida para todos los objetos que perte-necen a una clase En otras palabras, los objetos deben considerarse indistinguibles en un sistema de reconocimiento

La invariancia al desplazamiento es una de las dos propiedades que exige un sistema lineal

160 Vitaly Kober, José Ángel González-Fraga, Víctor Hugo Díaz-Ramírez y Josué Álvarez-Borrego

(la otra es el principio de superposición) En consecuencia, si un sistema de reconocimiento emplea un filtro lineal (por ejemplo, un filtro por correlación) el sistema será automáticamente invariante a los desplazamientos Esto significa que cuando el objeto a reconocer sufre un des-plazamiento en el espacio, el sistema proporcio-nará una salida desplazada por la distancia equi-valente y sin ningún otro cambio De este modo, simultáneamente se pueden detectar y clasificar múltiples objetos en una escena por medio de un filtro basado en la correlación Ésta es una de las principales razones por las que se sugiere el uso de filtros por correlación

En el reconocimiento de patrones, básica-mente se pueden distinguir dos tipos de tarea: la detección de un objeto y la estimación de su posición exacta (Yaroslavsky, 1993) Cuando se usan los filtros por correlación, estos problemas se pueden resolver en dos pasos Primero, la detección se lleva a cabo al buscar los picos de correlación en la salida del filtro, y las coordena-das de los picos corresponden a la estimación de la posición La calidad de ambos procedimien-tos está definida por la presencia de ruido en la escena analizada La capacidad de detección de los filtros por correlación se puede expresar cuantitativamente por medio de la probabilidad de detectar errores (falsas alarmas), la razón señal-ruido, capacidad de discriminación, la ra-zón pico-energía del plano de correlación, etc (vijaya Kumar y Hassebrook, 1990) Algunas de estas medidas se pueden mejorar en esencia al emplear un enfoque adaptativo en el diseño del filtro En concordancia con este concepto, se desea un filtro con un buen desempeño para una escena dada, es decir, con un conjunto de patrones fijo o un fondo a ser rechazado fijo, en lugar de un filtro con parámetros de desempeño promedio sobre un ensamble de imágenes Des-pués de que la tarea de detección se ha resuelto, debemos enfrentarnos a los pequeños errores de la estimación de la posición, los cuales se deben a las distorsiones del objeto generadas por el ruido La estimación de las coordenadas se en-cuentra en la vecindad de la posición real De tal manera que la posición del objeto sólo se puede caracterizar por medio de las variaciones de los errores de medición a lo largo de las coordena-das (Kober y Campos, 1996)

La capacidad de discriminación (DC) es uno de los criterios más importantes en el reconoci-miento de patrones La DC indica qué tan bien detecta y discrimina un filtro a diferentes clases de objetos Después de que Yaroslavsky (1993)

realizara un análisis teórico de métodos por co-rrelación, ideó un filtro por correlación con una probabilidad mínima de errores anormales de la localización (las falsas alarmas) y lo llamó el filtro óptimo (OF) Una característica importan-te del OF es su adaptividad a la escena en las aplicaciones de reconocimiento de patrones o de detección de objetos ya que considera en su respuesta a la frecuencia, el espectro de energía de los objetos no deseados en la escena observa-da o del fondo a rechazar El OF presenta una eficiencia de luz baja lo cual es una desventaja para su implementación óptica El filtro con la máxima eficiencia de luz es el filtro sólo de fase (POF) propuesto por Horner y Gianino (1984) La desventaja del POF es su pobre capacidad de discriminación para objetos con bajo contraste incrustado en un fondo complicado (Yaroslavs-ky, 1993) En la referencia Kober et al. (1994) se describe una aproximación del OF por medio de filtros sólo de fase con cuantización, estos filtros aproximados resultaron tener gran eficacia de luz y una capacidad de discriminación muy cer-cana al OF También se han propuesto filtros óp-timos en los casos donde el objeto que se desea reconocer se encuentra en presencia de ruido de fondo disjunto (Javidi y Wang, 1994) Otro mé-todo provechoso es la síntesis de filtros adaptati-vos al “enmascarar con ceros” los componentes espectrales del filtro correlador, los cuales mejo-ran su capacidad para discriminar entre objetos similares (Kober y Ovseyevich, 2000)

Se sabe que el filtro espacial acoplado (MSF) es sensible a pequeñas distorsiones del objeto causadas por las variaciones en la escala, la ro-tación o el punto de vista Uno de los primeros intentos para superar el problema de distorsión en el reconocimiento de patrones fueron las fun-ciones discriminantes sintéticas (SDF) (Casasent, 1984) Básicamente, el SDF utiliza un conjunto de imágenes de entrenamiento para sintetizar una plantilla que proporciona un valor predeter-minado en las salidas centrales de la correlación como respuesta a las imágenes de entrenamien-to La principal limitación de los filtros SDF es la

161Sistemas Adaptativos para el Reconocimiento de Patrones Biológicos

aparición de lóbulos laterales que se deben a la falta de todo el control en el plano de correlación; lo que da como resultado que los SDF posean una baja capacidad de discriminación Una solución parcial a este problema la sugirieron Mahalano-bis et al. (1987), quienes propusieron controlar todo el plano de correlación y producir picos de correlación delgados para una fácil detección del objeto, así como minimizar la energía de correla-ción promedio para suprimir la presencia de picos de correlación extraños Sin embargo, estos filtros tienen muy poca tolerancia al ruido de entrada

Estos filtros toman el control de las falsas alarmas de una manera indirecta, y finalmente, son más sensibles a las variaciones intraclase que otros filtros compuestos (Billet y Singher, 2002)

La ventaja de los sistemas ópticos, por enci-ma de las computadoras, es su habilidad inheren-te para procesar datos de una manera paralela Por ejemplo, el correlador óptico clásico permite realizar un filtrado en paralelo sobre una escena de la entrada que contiene múltiples patrones El reciente progreso en los moduladores espaciales de luz ópticos permite nuevas oportunidades para la creación de sistemas opto-digitales Los moduladores se pueden incorporar electrónica-mente, permitiendo cambios rápidos y flexibles en el objeto o en el filtro con muy útiles aplica-ciones de tiempo real Por otro lado, general-mente es más simple implementar un filtro por correlación con la ayuda de una computadora digital La computadora es más flexible, aunque en principio más lenta que un sistema óptico El consejo es que primero se realice la simulación y el análisis de un algoritmo de reconocimiento de patrones en una computadora Finalmente, para las aplicaciones que requieren resultados en tiempo real, se sugiere aprovechar la venta-ja de los sistemas ópticos para realizar procesos que consuman tiempo (como las correlaciones), considerando que tanto las operaciones de post-procesamiento como las operaciones punto a punto se realicen con una computadora

En este capítulo se consideran algunas aplica-ciones de nuevos filtros correladores adaptativos (González-Fraga et al., 2005 a y b) para procesar datos biológicos Los filtros por correlación dise-ñados son adaptativos a una escena de entrada de prueba que se construye con el objeto a re-conocer, objetos falsos y un fondo que se desea

rechazar Los filtros pueden suprimir los lóbulos laterales del fondo dado, así como los correspon-dientes a los objetos falsos En otras palabras, el filtro sugerido realiza un control directo sobre todo el plano de correlación Se consideran dos tipos de sistemas para la implementación de los filtros adaptativos; es decir, sistemas digitales ba-sados en los filtros SDF y sistemas opto-digitales basados en los correladores de transformación conjunta (Moreno et al., 1998) El desempeño de los filtros adaptativos en las escenas se compara con varios filtros por correlación en términos de la capacidad de la discriminación y de la robus-tez al ruido

II. Sistemas digitales adaptativos

La correlación se usa como una medida de simi-litud entre dos señales Podemos describir esta operación como una serie de multiplicaciones y sumas entre dos señales, donde la salida debe presentar un máximo que indique la posición en que más se asemejan las señales La teoría de se-ñales y sistemas está fuera del alcance de este trabajo, por lo que solamente se proporcionan las herramientas necesarias para realizar exito-samente un reconocimiento de patrones

Gracias a los teoremas de convolución-co-rrelación, la operación de correlación se puede llevar a cabo en el dominio de las frecuencias, es decir aplicando la transformada inversa de Fourier a la multiplicación de las transformadas del filtro y de la escena de prueba La figura 1 muestra un esquema general de un sistema di-gital para el reconocimiento de patrones por medio de la correlación con imágenes de en-trenamiento Una vez que se diseña el filtro, el proceso de reconocimiento se reduce a la multi-plicación punto a punto de las transformadas de Fourier del filtro y de la escena de prueba A la salida de esta operación se le aplica la transfor-mada inversa y, finalmente, se buscan los picos de correlación donde las coordenadas de éstos corresponden a la posición de los objetos

II.1. Funciones discriminantes sintéticas

El filtro espacial de acoplamiento (MSF) es el filtro correlador más básico que existe, su res-


puesta al impulso consiste en una versión de la imagen de referencia rotada 180˚. Aunque este filtro es capaz de detectar un objeto de referen-cia en una escena distorsionada por ruido adi-tivo Gaussiano, su capacidad de discriminación es pobre cuando la escena contiene objetos si-milares o los objetos presentan pequeñas distor-siones como la forma, el tamaño, la orientación, etcétera

Cuando las deformaciones del objeto que se desea reconocer no se pueden describir cla-ramente, entonces un conjunto de imágenes de entrenamiento es de gran ayuda para mejorar el reconocimiento; este conjunto de entrenamiento debe representar diferentes versiones distorsio-nadas del objeto a reconocer Usar un MSF para cada versión del objeto no es muy atractivo, sin embargo se puede usar un filtro SDF Un filtro SDF es una combinación lineal de MSF para di-ferentes patrones, donde los coeficientes de la combinación lineal se seleccionan de tal manera que satisfacen un conjunto de condiciones en el origen de la salida del filtro, lo cual requiere de un valor predeterminado para cada patrón usado en la síntesis del filtro

Problema de reconocimiento intraclase

Sean {ti(x,y), i=1,2,…,N} un conjunto de imá-genes de entrenamiento (linealmente indepen-diente) cada una con d píxeles La función h(x,y) del filtro SDF en el dominio espacial se puede

expresar como una combinación lineal del con-junto de imágenes de referencia, es decir,

(1)

donde {ai, i=1,2,…,N } son los coeficientes pon-derados, y éstos se seleccionan para satisfacer las siguientes condiciones:

(2)

Aquí el símbolo representa la correlación, y {ui, i=1,2,…,N} son los valores predeterminados en el origen de la salida de la correlación para cada imagen de entrenamiento

Sea R una matriz con N columnas y d ren-glones (número de píxeles en cada imagen de entrenamiento), donde la i-ésima columna está dada por la versión vector de ti(x,y) Sean a y u los vectores columna que representan a {ai} y {ui}, respectivamente Las ecuaciones (1) y (2) se pueden escribir en notación matriz-vector de la siguiente manera:

(3) h = aR

(4) u = R+h

donde el superíndice + significa el transpuesto conjugado Al sustituir la ecuación (3) en la (4) se obtiene

16

Figura 1. Esquema general del proceso de correlación con entrenamiento.

Conjunto de imágenes de entrenamiento

I1 I N

Imagen de prueba

. . .

Distribución 3D del Plano de correlación

1

Diseño del FiltroCorrelacionador

I2

Figura 1. Esquema general del proceso de correlación con entrenamiento.

∑=

=N

iii yxtayxh

1),(),(

ii uht =


(5) u = (R+R)a

El (i,j)-ésimo elemento de la matriz S=(R+R) es el valor en el origen de las correlaciones cruza-das entre las imágenes de entrenamiento ti(x,y) y tj(x,y) Si la matriz S es no singular, la solución del sistema de ecuaciones existe y está dado por

(6) a = (R+R)-1u

y el vector filtro es

(7) h = R(R+R)-1u

El filtro SDF con picos iguales en la salida de correlación se puede usar para el reconocimien-to de objetos intraclase con invarianza a distor-siones, es decir, la identificación de objetos dis-torsionados que pertenece a una clase verdadera de objetos Esto se puede hacer al fijar todos los elementos del vector u en la unidad, es decir,

(8) u = [11 1]T

Problema de reconocimiento multiclase

Supongamos que existen varias versiones distor-sionadas del objeto de referencia y varias clases de objetos a ser rechazados Por simplicidad, sólo se considera el problema para reconocer dos clases Entonces, se usan imágenes de en-trenamiento, se diseña un filtro para reconocer imágenes de una clase (denominada la clase ver-dadera) y para rechazar imágenes de otra clase (denominada la clase falsa)

Supóngase que hay M imágenes de entre-namiento de la clase falsa {pi(x,y), i=1,2,…,M}. De acuerdo con la técnica del SDF, la imagen compuesta h(x,y) es una combinación lineal de todas las imágenes de entrenamiento {t1(x,y),…, tN(x,y),p1(x,y),…, pM(x,y)} Ambos problemas, el reconocimiento intraclase y la discriminación in-traclase (es decir, la discriminación de los objetos de la clase verdadera contra los objetos de la clase falsa) se pueden resolver por medio de los filtros SDF Se puede especificar una salida del filtro {ui=1, i=1,2,…,N} para los objetos de la clase verdadera y otra {ui=0, i=N+1,N+2,…,N+M} para los objetos de la clase falsa, es decir,

(9) u = [1 100 0]T

Usando el filtro dado en la ecuación (7) para el reconocimiento de objetos, se espera que el pico central de la correlación se encuentre muy cercano a la unidad para los objetos de la clase verdadera y muy cercano a cero para los objetos de la clase falsa Obviamente, el procedimiento mencionado se puede extender fácilmente para discriminar cualquier número de clases Des-afortunadamente, este procedimiento simple no permite controlar por completo la salida de la correlación Es decir, el filtro sólo es capaz de controlar la salida de correlación en la ubicación de los picos de correlación cruzada De tal ma-nera que pueden aparecer lóbulos (picos falsos) en todo el plano de correlación

II.2. Diseño de filtros adaptativos SDF

Primero, definamos de manera general el pro-blema de reconocimiento de objetos a resolver

Se desea un filtro correlador que proporcio-ne un gran pico de correlación correspondiente al objeto de referencia y que al mismo tiempo elimine los posibles picos falsos correspondien-tes a objetos no deseados y al fondo En otras palabras, que proporcione una buena discrimi-nación del objeto de referencia y si es necesario que reduzca los niveles de la función de correla-ción en todos los picos falsos, excepto en el ori-gen del plano de correlación, donde las condicio-nes sobre el valor del pico se deben conocer

Conociendo el objeto de referencia, los ob-jetos falsos y el fondo que se desea rechazar, se puede realizar el reconocimiento con la ayuda de un algoritmo iterativo En cada iteración el algoritmo suprime el lóbulo o pico falso y de esta manera el valor de la discriminación irá en au-mento de manera monótona, hasta alcanzar un valor que ha sido establecido previamente

La capacidad de discriminación (DC) se de-fine formalmente como la habilidad de un filtro para distinguir un objeto de entre objetos dife-rentes (Yaroslavsky, 1993) Cuando un objeto se encuentra incrustado en un fondo, así como otros objetos falsos, entonces la DC se puede ex-presar de la siguiente manera:


(10)

donde CB es el valor máximo en el plano de co-rrelación sobre el área del fondo o de los objetos no deseados que se desean rechazar, y CT es el valor máximo en el plano de correlación sobre el área de la posición del objeto de referencia El área de la posición de los objetos se determina en la vecindad cercana de su posición actual En las simulaciones por computadora que se presen-tan, el área de la posición del objeto se seleccionó dentro de un círculo con centro en la posición ac-tual del objeto y con un área de aproximadamente de 13% del área del objeto (35 píxeles de radio) Cuando la DC arroja valores negativos significa que al probar el filtro el reconocimiento no tuvo éxito

El interés se enfoca en un filtro correlador que identifique a un objeto con un alto grado de discriminación incrustado en una escena compli-cada y ruidosa, como lo es un fondo del mundo real Los filtros convencionales propuestos ac-tualmente proporcionan un pobre desempeño en esta situación (Javidi y Wang, 1992) Con la ayuda de los filtros adaptativos SDF (A-SDF) se puede alcanzar un valor predeterminado de DC El algoritmo para el diseño del filtro requiere del conocimiento previo de la imagen de fondo De tal manera que buscamos al objeto que se encuentra en una posición desconocida dentro de la escena formada por el fondo y los objetos objeto El fondo se puede describir estocástica-mente, por ejemplo, se puede considerar como una realización de un proceso estocástico; o de-terminístico, como puede ser una fotografía La escena también puede contener objetos que no son de interés en posiciones desconocidas El al-goritmo propuesto para diseñar un filtro A-SDF se lista a continuación, aunque por simplicidad sólo se menciona un objeto a reconocer se pue-den incluir más objetos

Paso 1 Diseñar un filtro A-SDF como un filtro SDF convencional a partir del objeto de referencia

Paso 2 Realizar la correlación entre el fondo y el filtro A-SDF Paso 3 Calcular la DC usando la ecuación (10)

Paso 4 Si el valor de la DC es mayor o igual al valor deseado, entonces el procedimien-to de diseño termina; de lo contrario, continuar con el siguiente paso

Paso 5 Crear un nuevo objeto de rechazo a par-tir del fondo

Paso 6 Diseñar un nuevo filtro A-SDF usando el problema para reconocer dos clases (véase sección 2 1) Ir al paso 2

Profundicemos un poco en la descripción del al-goritmo para la síntesis del filtro adaptativo A-SDF En los pasos 1 y 2 se realiza una operación de correlación entre el fondo y un filtro SDF bá-sico, el cual es inicialmente entrenado con el ob-jeto de referencia; es decir, al iniciar el algoritmo sólo se tiene un conjunto de objetos, llamémosle la clase verdadera Para calcular la DC que indi-ca el paso 3, es necesario realizar la correlación entre el filtro y el objeto, así los parámetros CB es el valor máximo en la salida del paso 2 y CT es el valor máximo en la salida de la correlación entre el filtro y el objeto El paso 4 es un mecanismo de decisión para poder alcanzar la DC deseada por el usuario

Para crear los objetos de rechazo del paso 5 es necesario definir una región de soporte de los objetos involucrados en el filtro Si sólo se usa un objeto a reconocer, la región de soporte es la forma del objeto dilatada 7 píxeles Se pue-de definir como una función binaria con unos al interior del área dilatada del objeto y ceros fue-ra En el caso de que se use más de un objeto a reconocer, la región de soporte está dada por la forma dilatada de la unión de todos los objetos Continuando con la explicación del paso 5, el origen del nuevo objeto es la posición del lóbulo más grande en el plano de correlación y tendrá la forma de la región de soporte establecida y al interior, información correspondiente al fondo El objeto creado se añade al conjunto de objetos de la clase falsa Por último, en el paso 6 se usa la descripción del problema de reconocimiento para dos clases de la sección 2 1 para diseñar un nuevo filtro SDF, por lo que el filtro contiene una sola imagen de la clase verdadera y la clase fal-sa consiste de los objetos falsos creados a partir del fondo Este procedimiento es repetido hasta alcanzar un valor predeterminado en la DC La figura 2 muestra un diagrama de bloques de este procedimiento

5

necesario que reduzca los niveles de la función de correlación en todos los picos falsos excepto en el origen del plano de correlación, donde las condiciones sobre el valor del pico se deben conocer. Conociendo el objeto de referencia, los objetos falsos y el fondo que se desea rechazar, se puede realizar el reconocimiento con la ayuda de un algoritmo iterativo. En cada iteración el algoritmo suprime el lóbulo o pico falso y de esta manera el valor de la discriminación irá en aumento de manera monótona hasta alcanzar un valor que ha sido establecido previamente. La capacidad de discriminación (DC) se define formalmente como la habilidad de un filtro para distinguir un objeto de entre objetos diferentes (Yaroslavsky, 1993). Cuando un objeto se encuentra incrustado en un fondo así como otros objetos falsos, entonces la DC se puede expresar de la siguiente manera:

2

2

)0,0(

)0,0(1

T

B

C

CDC ,

(10)

donde CB es el valor máximo en el plano de correlación sobre el área del fondo o de los objetos no deseados que se desean rechazar, y CT es el valor máximo en el plano de correlación sobre el área de la posición del objeto de referencia. El área de la posición de los objetos se determina en la vecindad cercana de su posición actual. En las simulaciones por computadora que se presentan, el área de la posición del objeto se seleccionó dentro de un circulo con centro en la posición actual del objeto y con un área de aproximadamente el 13% del área del objeto (35 pixeles de radio). Cuando la DC arroja valores negativos significa que al probar el filtro el reconocimiento no tuvo éxito. El interés se enfoca en un filtro correlador que identifique a un objeto con un alto grado de discriminación incrustado en una escena complicada y ruidosa como lo es un fondo del mundo real. Los filtros convencionales propuestos actualmente proporcionan un pobre desempeño en esta situación (Javidi y Wang, 1992). Con la ayuda de los filtros adaptativos SDF (A-SDF) se puede alcanzar un valor predeterminado de DC. El algoritmo para el diseño del filtro requiere del conocimiento previo de la imagen de fondo. De tal manera que buscamos al objeto que se encuentra en una posición desconocida dentro de la escena formada por el fondo y los objetos objeto. El fondo se puede describir estocásticamente, por ejemplo, se puede considerar como una realización de un proceso estocástico; o determinístico, como puede ser una fotografía. La escena también puede contener objetos que no son de interés en posiciones desconocidas. El algoritmo propuesto para diseñar un filtro A-SDF se lista a continuación, aunque por simplicidad solo se menciona un objeto a reconocer se pueden incluir más objetos.

Paso 1. Diseñar un filtro A-SDF como un filtro SDF convencional a partir del objeto de referencia. Paso 2. Realizar la correlación entre el fondo y el filtro A-SDF. Paso 3. Calcular la DC usando la ecuación (10). Paso 4. Si el valor de la DC es mayor o igual al valor deseado, entonces el procedimiento de diseño

termina, de lo contrario continuar con el siguiente paso. Paso 5. Crear un nuevo objeto de rechazo a partir del fondo. Paso 6. Diseñar un nuevo filtro A-SDF usando el problema para reconocer dos clases (ver sección

2.1). Ir al paso 2.

Profundicemos un poco en la descripción del algoritmo para la síntesis del filtro adaptativo A-SDF. En los pasos 1 y 2 se realiza una operación de correlación entre el fondo y un filtro SDF básico, el cual es inicialmente entrenado con el objeto de referencia, es decir, al iniciar el algoritmo solo se tiene un conjunto de objetos, llamémosle la clase verdadera. Para calcular la DC que indica el paso 3, es necesario realizar la correlación entre el filtro y el objeto, así los parámetros CB es el valor máximo en la salida del paso 2 y CT es el valor máximo en la salida de la correlación entre el filtro y el objeto. El paso 4 es un mecanismo de decisión para poder alcanzar la DC deseada por el usuario. Para crear los objetos de rechazo del paso 5 es necesario definir una región de soporte de los objetos involucrados en el filtro. Si solo se usa un objeto a reconocer, la región de soporte es la forma del objeto dilatada 7 píxeles. Se puede definir como una función binaria con unos al interior del área dilatada del objeto y ceros fuera. En el caso de que se use más de un objeto a reconocer la región de soporte esta dada por la forma dilatada de la unión de todos los objetos. Continuando con la explicación del paso 5, el origen del nuevo objeto es la posición del lóbulo más grande en el plano de correlación y tendrá la forma de la región de soporte establecida y al interior, información correspondiente al fondo. El objeto creado se añade al conjunto


6

de objetos de la clase falsa. Por ultimo, en el paso 6 se usa la descripción del problema de reconocimiento para dos clases de la Sección 2.1 para diseñar un nuevo filtro SDF, por lo que, el filtro contiene una sola imagen de la clase verdadera y la clase falsa consiste de los objetos falsos creados a partir del fondo. Este procedimiento es repetido hasta alcanzar un valor predeterminado en la DC. La Figura 2 muestra un diagrama de bloques de este procedimiento. Como aclaración se debe notar que si se conocen otros objetos de rechazo, se pueden incluir directamente dentro de la clase falsa y usarse en el diseño del filtro adaptativo A-SDF. Al realizar el reconocimiento con una escena de prueba empleando el filtro, se espera que su desempeño sea muy similar al obtenido en el proceso de síntesis. 2.3. El Problema de Detección En esta sección se presentan algunos resultados obtenidos con los filtros adaptativos SDF por medio de simulaciones por computadora. Los resultados son comparados con aquellos que arrojan los filtros POF, OF, MACE y el convencional SDF. La función de transferencia del filtro POF convencional esta dada por (Horner y Gianino, 1984)

manera otra 0

0),( ,),(exp),(),(*

),(vuTifvui

vuTvuTvuH t

POF , (11)

donde T(u,v), t(u,v) son la transformada de Fourier y la distribución de la fase del objeto. El asterisco denota el complejo conjugado. La función de transferencia del OF se puede aproximar en el dominio de Fourier como (Yaroslavsky, 1993)

2 2

*

OFT ( u,v )H ( u,v )

T( u,v ) S( u,v )

(12)

donde S(u,v) es la transformada de Fourier de la escena de entrada. La característica notable de la aproximación del OF es su adaptividad a la escena debido a que su respuesta a la frecuencia toma en cuenta una estimación del espectro de energía del fondo que se desea rechazar. Otro filtro compuesto muy popular es el MACE (Mahalanobis et al., 1987) que pertenece a la familia de los filtros SDF. Este filtro pretende controlar la presencia de picos de correlación extraños al minimizar la energía de correlación promedio. Sin embargo, este filtro tienen menor tolerancia a las distorsiones geométricas y al ruido de entrada. Su función de transferencia en forma matriz-vector se representa por

uR)DR(RDH 111 . (13)

donde D es una matriz diagonal que contiene el valor promedio de las magnitudes al cuadrado de cada renglón de R. Es importante hacer la distinción de que el filtro SDF se diseña en el dominio espacial y el filtro MACE en el dominio de Fourier. Por lo que cada renglón de R corresponde a la transformada de Fourier de una imagen de entrenamiento en forma vectorial. El vector u cumple la misma función que en el filtro SDF, es decir representa los valores predeterminados en la salida central de la correlación para cada imagen de entrenamiento. Para ilustrar el diseño y el desempeño del filtro A-SDF en un problema de detección, el cual se define como “encontrar al objeto de referencia en una posición arbitraria dentro de la escena”, se usó el copépodo macho y el fondo que se muestran en la Figura 3. El tamaño de todas las imágenes usada en los experimentos que se muestran en esta sección es de 256×256 pixeles. El rango de la señal se encuentra en [0-255] (imágenes en escala de gris). El tamaño del pico en la salida de los filtros SDF y MSF dependen de la cantidad de energía que contengan los objetos. Para tratar de homogeneizar la cantidad de energía en todos los objetos involucrados se usa una región de soporte dilatada, de esta manera se espera que los picos de correlación de los objetos a reconocer presenten la misma altura. De aquí que, para mejorar el reconocimiento dentro del entrenamiento se construye un objeto modificado al usar un campo homogéneo con el promedio de la imagen de fondo. Este nuevo objeto a reconocer se vería como en la Figura 4(a) dentro de la región de soporte, la cual es la forma del objeto dilatada 7 pixeles.

Como aclaración, se debe notar que si se co-nocen otros objetos de rechazo, se pueden incluir directamente dentro de la clase falsa y usarse en el diseño del filtro adaptativo A-SDF Al reali-zar el reconocimiento con una escena de prueba empleando el filtro, se espera que su desempeño sea muy similar al obtenido en el proceso de sín-tesis

II.3. El problema de detección

En esta sección se presentan algunos resultados obtenidos con los filtros adaptativos SDF por medio de simulaciones por computadora Los resultados son comparados con aquéllos que arrojan los filtros POF, OF, MACE y el conven-cional SDF

La función de transferencia del filtro POF convencional esta dada por (Horner y Gianino, 1984)

(11)

donde T(u,v), Φt(u,v) son la transformada de Fourier y la distribución de la fase del objeto El asterisco denota el complejo conjugado La fun-ción de transferencia del OF se puede aproximar en el dominio de Fourier como (Yaroslavsky, 1993)

(12)

donde S(u,v) es la transformada de Fourier de la escena de entrada La característica notable de la aproximación del OF es su adaptividad a la escena debido a que su respuesta a la frecuencia toma en cuenta una estimación del espectro de energía del fondo que se desea rechazar

Otro filtro compuesto muy popular es el MACE (Mahalanobis et al., 1987) que pertenece a la familia de los filtros SDF Este filtro preten-de controlar la presencia de picos de correlación extraños al minimizar la energía de correlación promedio Sin embargo, este filtro tiene menor tolerancia a las distorsiones geométricas y al rui-do de entrada Su función de transferencia en forma matriz-vector se representa por

(13) H = D-1R(R+D-1R)-1u

donde D es una matriz diagonal que contiene el valor promedio de las magnitudes al cuadrado de cada renglón de R Es importante hacer la distinción de que el filtro SDF se diseña en el do-minio espacial y el filtro MACE en el dominio de Fourier Por lo que cada renglón de R correspon-de a la transformada de Fourier de una imagen de entrenamiento en forma vectorial El vector u cumple la misma función que en el filtro SDF, es decir representa los valores predeterminados en la salida central de la correlación para cada imagen de entrenamiento

Para ilustrar el diseño y el desempeño del filtro A-SDF en un problema de detección, el cual se define como “encontrar al objeto de re-ferencia en una posición arbitraria dentro de la escena”, se usó el copépodo macho y el fondo que se muestran en la figura 3 El tamaño de to-das las imágenes usadas en los experimentos que se muestran en esta sección es de 256×256 píxe-les El rango de la señal se encuentra en [0-255] (imágenes en escala de gris)

El tamaño del pico en la salida de los filtros SDF y MSF depende de la cantidad de energía que contengan los objetos Para tratar de homo-geneizar la cantidad de energía en todos los ob-jetos involucrados, se usa una región de soporte dilatada; de esta manera se espera que los picos

Figura 2. Diagrama de bloques del algoritmo para diseñar el A-SDF.

6

de objetos de la clase falsa. Por ultimo, en el paso 6 se usa la descripción del problema de reconocimiento para dos clases de la Sección 2.1 para diseñar un nuevo filtro SDF, por lo que, el filtro contiene una sola imagen de la clase verdadera y la clase falsa consiste de los objetos falsos creados a partir del fondo. Este procedimiento es repetido hasta alcanzar un valor predeterminado en la DC. La Figura 2 muestra un diagrama de bloques de este procedimiento. Como aclaración se debe notar que si se conocen otros objetos de rechazo, se pueden incluir directamente dentro de la clase falsa y usarse en el diseño del filtro adaptativo A-SDF. Al realizar el reconocimiento con una escena de prueba empleando el filtro, se espera que su desempeño sea muy similar al obtenido en el proceso de síntesis. 2.3. El Problema de Detección En esta sección se presentan algunos resultados obtenidos con los filtros adaptativos SDF por medio de simulaciones por computadora. Los resultados son comparados con aquellos que arrojan los filtros POF, OF, MACE y el convencional SDF. La función de transferencia del filtro POF convencional esta dada por (Horner y Gianino, 1984)

manera otra 0

0),( ,),(exp),(),(*

),(vuTifvui

vuTvuTvuH t

POF , (11)

donde T(u,v), t(u,v) son la transformada de Fourier y la distribución de la fase del objeto. El asterisco denota el complejo conjugado. La función de transferencia del OF se puede aproximar en el dominio de Fourier como (Yaroslavsky, 1993)

2 2

*

OFT ( u,v )H ( u,v )

T( u,v ) S( u,v )

(12)

donde S(u,v) es la transformada de Fourier de la escena de entrada. La característica notable de la aproximación del OF es su adaptividad a la escena debido a que su respuesta a la frecuencia toma en cuenta una estimación del espectro de energía del fondo que se desea rechazar. Otro filtro compuesto muy popular es el MACE (Mahalanobis et al., 1987) que pertenece a la familia de los filtros SDF. Este filtro pretende controlar la presencia de picos de correlación extraños al minimizar la energía de correlación promedio. Sin embargo, este filtro tienen menor tolerancia a las distorsiones geométricas y al ruido de entrada. Su función de transferencia en forma matriz-vector se representa por

uR)DR(RDH 111 . (13)

donde D es una matriz diagonal que contiene el valor promedio de las magnitudes al cuadrado de cada renglón de R. Es importante hacer la distinción de que el filtro SDF se diseña en el dominio espacial y el filtro MACE en el dominio de Fourier. Por lo que cada renglón de R corresponde a la transformada de Fourier de una imagen de entrenamiento en forma vectorial. El vector u cumple la misma función que en el filtro SDF, es decir representa los valores predeterminados en la salida central de la correlación para cada imagen de entrenamiento. Para ilustrar el diseño y el desempeño del filtro A-SDF en un problema de detección, el cual se define como “encontrar al objeto de referencia en una posición arbitraria dentro de la escena”, se usó el copépodo macho y el fondo que se muestran en la Figura 3. El tamaño de todas las imágenes usada en los experimentos que se muestran en esta sección es de 256×256 pixeles. El rango de la señal se encuentra en [0-255] (imágenes en escala de gris). El tamaño del pico en la salida de los filtros SDF y MSF dependen de la cantidad de energía que contengan los objetos. Para tratar de homogeneizar la cantidad de energía en todos los objetos involucrados se usa una región de soporte dilatada, de esta manera se espera que los picos de correlación de los objetos a reconocer presenten la misma altura. De aquí que, para mejorar el reconocimiento dentro del entrenamiento se construye un objeto modificado al usar un campo homogéneo con el promedio de la imagen de fondo. Este nuevo objeto a reconocer se vería como en la Figura 4(a) dentro de la región de soporte, la cual es la forma del objeto dilatada 7 pixeles.


21

(a) (b)

Figura 6. (a) Escena de prueba con un copépodo macho como el objeto a reconocer. (b) Distribución de la salida de correlación obtenida con la escena de prueba.

de correlación de los objetos a reconocer presen-ten la misma altura De aquí que, para mejorar el reconocimiento dentro del entrenamiento, se construya un objeto modificado al usar un cam-po homogéneo con el promedio de la imagen de fondo Este nuevo objeto a reconocer se vería como en la figura 4(a) dentro de la región de so-porte, la cual es la forma del objeto dilatada 7 píxeles

de la función DC se puede apreciar en la figura 5, en donde los valores negativos se reemplazaron por ceros Al probar el filtro con la escena de la figura 6(a) se obtuvo una DC igual a 0 944, mien-tras que en la etapa de optimización se alcanzó una DC igual a 0 991 Se realizaron 30 pruebas colocando al objeto en diferentes coordenadas en la escena y se calculó que el intervalo de confianza del 95% para la DC es 0 934±0 01 La figura 6 (b) muestra la distribución de la correlación obtenida con la escena de prueba (recuérdese que la posi-ción del pico indica la posición del objeto)

18

(a) (b)

Figura 3. (a) Copépodo macho como el objeto a reconocer. (b) Fondo.

Figura 3. (a) Copépodo macho como el objeto a reconocer. (b) Fondo.

19

(b) (b)

Figura 4. (a) El copépodo macho de la Figura 3 como nuevo objeto a reconocer. (b) Objeto de rechazo del fondo, generado durante el proceso iterativo.

Figura 4. (a) El copépodo macho de la figura 3 como nuevo objeto a reconocer. (b) Objeto de rechazo del fondo, genera-do durante el proceso iterativo.

Al iniciar la ejecución del algoritmo, la ite-ración 0 indicó una DC igual a -0 2354 (valores negativos indican que falló el reconocimiento), se fijó como meta alcanzar una DC igual a 0 996 En cada iteración el algoritmo selecciona de en-tre todos los lóbulos un pico que se suprimirá en la siguiente etapa para asegurar un comporta-miento monótonamente creciente de la función DC contra el número de iteraciones La figura 4(b) muestra un objeto de rechazo generado a partir del fondo El comportamiento creciente

20

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 200

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

0.8

0.9

1

Número de iteraciones

Cap

acid

ad d

e D

iscrim

inac

ión

Figura 5. Desempeño del filtro A-SDF en la etapa de diseño.

Figura 5. Desempeño del filtro A-SDF en la etapa de diseño.

21

(a) (b)



Como un segundo ejemplo, se mostrará que los filtros A-SDF tienen una mejor tolerancia a las distorsiones geométricas y al ruido que gene-ralmente se presentan en los sensores de los dis-positivos empleados para capturar las imágenes Se diseñó un filtro con dos objetos, el copépodo de la figura 3(a) y una versión rotada 10˚ en sen-


tido de las manecillas del reloj (objeto T5 de la escena de la figura 7) Tanto el filtro POF como el OF se diseñaron con el objeto T1 de la figura 7(a) y, como se podrá apreciar en los resultados de la tabla 1, estos filtros sólo pueden reconocer al objeto T1 que es el objeto para el cual están en-trenados El filtro SDF convencional y el MACE se diseñaron con los objetos T1 y T5 El filtro A-SDF también emplea los objetos T1 y T5 pero en-mascarados con la región de soporte y el campo homogéneo Al probar la escena de la figura 7, los resultados demostraron que los filtros adap-tativos A-SDF presentaron la mejor tolerancia a pequeñas distorsiones geométricas, ya que fue ca-paz de reconocer a todos los objetos en la escena Mientras que el filtro MACE sólo reconoció a los objetos con que fue entrenado y el filtro SDF con-vencional falló en todos los casos

La figura 7(b) muestra la escena de la figu-ra 7(a), pero distorsionada con ruido aditivo con media cero y desviación estándar 15 Se compa-raron varios filtros y los resultados se resumen en la tabla 2 Nuevamente, el filtro A-SDF de-mostró tener mejor tolerancia ya que los picos en la salidas de los otros filtros decaen más rápi-damente, dando como resultado una discrimina-ción más pobre

22

T1 T2

T3

T4

T5

(a) (b)

Figura 7. (a) Escena de prueba, T2 , T3 , T4 y T5 representan diferentes versiones del objeto T1 que es el mismo copépodo de la Figura 3(a), ver la Tabla 1 para más información. (b) La escena distorsionada con ruido aditivo de naturaleza Gausiana con media cero y desviación estándar 15.

Figura 7. (a) Escena de prueba, T2 , T

3 , T

4 y T

5 representan

diferentes versiones del objeto T1 que es el mismo copépo-

do de la figura 3(a), véase la tabla 1 para más información. (b) La escena distorsionada con ruido aditivo de naturaleza Gausiana con media cero y desviación estándar 15.

Tabla 1Desempeño de diferentes filtros para la escena de la figura 7(a)

Objeto Ángulo de rotación

Factor de escala

DCPOF OF SDF MACE A-SDF

T1 0 0 1 00 0 940 0 992 -0 149 0 933 0 948 T2 8 0 1 02 -4 476 -4 194 -0 904 -0 314 0 799 T3 -1 0 1 10 -0 052 -0 368 -0 236 -2 061 0 906 T4 12 0 0 95 -1 901 -4 733 -0 099 -0 731 0 880 T5 10 0 1 00 -2 945 -1 561 -0 497 0 957 0 945

Tabla 2Desempeño de diferentes filtros para la escena de la figura 7(a)

Con ruido aditivo de media cero y desviación estándar 15

Objeto Ángulo de rotación

Factor de escala

DCPOF OF SDF MACE A-SDF

T1 0 0 1 00 0 937 0 973 -0 139 0 860 0 948 T2 8 0 1 02 -3 548 -1 544 -0 891 -1 323 0 796 T3 -1 0 1 10 -0 076 -0 678 -0 226 -1 408 0 904 T4 12 0 0 95 -1 812 -3 741 -0 099 -1 396 0 880 T5 10 0 1 00 -3 161 -2 216 -0 493 0 928 0 944

II.4. El problema de clasificación

En el siguiente ejemplo se consideran como ob-jetos a reconocer los copépodos machos de la fi-gura 8(a) y las hembras de la figura 8(b) son ob-jetos de rechazo, así como también lo es el fondo mostrado en la figura 3(b) Para distinguir los machos de las hembras se diseña un filtro para cada género, considerando el opuesto como ob-jetos de rechazo


Tal como se indicó en la sección anterior, se usa una región de soporte correspondiente a la unión de las formas de los objetos involucrados para enmascarar los nuevos objetos a buscar y los objetos de rechazo que se crean a partir del fondo La figura 9 muestra cómo se verían estos nuevos objetos Obsérvese que los objetos ori-ginales se encuentran incrustados en un campo homogéneo, el cual se creó al promediar diez puntos del fondo y la forma que contiene al obje-to es la forma de la región de soporte indicada

La escena de prueba se muestra en la figu-ra 10, la cual contiene a todos los objetos de la figura 8 Al probar el filtro de los machos, se calcularon valores de discriminación de 0 915 y 0 925 para los machos M1 y M2, respectivamente El filtro de las hembras reportó que las discrimi-naciones fueron 0 899 y 0 879 para las hembras H1 y H2, respectivamente La figura 11 muestra los planos de correlación resultado de aplicar el filtro de los machos

25

M1

M2

H1

H2

Figura 10. Escena de prueba, los copépodos macho están marcados con la letra M.

Figura 10. Escena de prueba, los copépodos macho están marcados con la letra M.

26

(a) (b)

Figura 11. (a) Distribución de intensidad de la salida de correlación. (b) Distribución de intensidad después de aplicar un umbral del 50% del valor del pico más alto.

26

(a) (b)

Figura 11. (a) Distribución de intensidad de la salida de correlación. (b) Distribución de intensidad después de aplicar un umbral del 50% del valor del pico más alto.

Figura 11. (a) Distribución de intensidad de la salida de corre-lación. (b) Distribución de intensidad después de aplicar un umbral del 50% del valor del pico más alto.

23

(a) (b)

Figura 8. (a) Objetos modificados a reconocer (copépodos macho). (b) Objetos modificados a rechazar (copépodos hembra).

23

(a) (b)



24

(a) (b)


24

(a) (b)



El algoritmo usó 30 imágenes de rechazo del fondo para el filtro de los machos y 25 para el filtro de las hembras Para ambos filtros se al-canzó una DC de 0 996 Para eliminar los lóbulos laterales producidos por los objetos de rechazo (machos o hembras, según sea el caso), se incor-poraron 4 imágenes correspondientes a los obje-tos de rechazo pero desplazados a la izquierda, derecha, arriba y abajo Estas imágenes fueron centradas en las fronteras de tales objetos y en-mascaradas con la región de soporte y el campo homogéneo Lo anterior corresponde a una opti-mización de los objetos que se desean reconocer contra los objetos que se desean rechazar


III. Sistemas adaptativos híbridos opto-digitales

El reconocimiento de objetos en tiempo real nace de la necesidad de algunas aplicaciones en donde la velocidad de respuesta del sistema es crítica Un ejemplo es el caso de la industria, donde mayor velocidad se traduce en mayor pro-ducción Es bien conocido que los sistemas de procesamiento óptico no tienen rival en cuanto a velocidad de procesamiento se refiere, también es sabido que los sistemas de procesamiento di-gital tienen grandes ventajas, tal como la capa-cidad de programarse para simular fenómenos físicos Por tanto es atractivo pensar en una clase de sistemas de procesamiento que unan las ven-tajas de los sistemas digitales y de los ópticos, de esta forma sería posible implementar sistemas con gran velocidad de procesamiento y progra-mables, lo que permitiría hacer reconocimiento de patrones en tiempo real Esta clase de siste-mas existen y se les conoce como sistemas opto-digitales o sistemas híbridos El uso de sistemas opto-digitales para realizar reconocimiento de patrones en tiempo real se divide, principalmen-te, en dos distintos enfoques principales, uno es utilizando técnicas de correlación y el otro es uti-lizando redes neuronales o algoritmos evolutivos (Javidi y Horner, 1992) El reconocimiento de patrones utilizando redes neuronales y/o algo-ritmos evolutivos se hace con base en heurísti-cas, mientras que el reconocimiento de patrones usando técnicas de correlación se hace princi-

palmente con base en la teoría de los sistemas lineales (Willsky et al , 1983), se diseña un filtro lineal cuya respuesta al impulso produce como salida una función de correlación que es utili-zada para decidir si está o no el objeto que se desea reconocer de la escena Las principales ar-quitecturas para desarrollar esta tarea utilizando métodos opto-digitales basados en correlación son conocidas como correladores opto-digitales y son dos principales: correlador de transforma-ción conjunta (JTC, por sus siglas en inglés: Jo-int Transform Correlator) (Weaver y Goodman, 1966; Javidi y Horner, 1989) y el correlador 4F (vanderlugt, 1992) En el correlador 4f se diseña un filtro en el dominio de la frecuencia, mientras que en el correlador JTC el diseño del filtro es en el dominio espacial Una de las principales ven-tajas del correlador JTC sobre el correlador 4f es que es mucho menos sensible a desalineaciones físicas del sistema En esta sección nos enfocare-mos esencialmente en la arquitectura JTC

III.1. Correlador de transformación conjunta JTC

En esta arquitectura se colocan en el plano de entrada a través del modulador espacial de luz (MEL) la imagen de la escena y la imagen del objeto que se desea reconocer separadas por una distancia d± e iluminadas por un frente de onda plano de luz coherente (Klein y Furtak, 1985), tal como se muestra en la figura 12

27

Figura 12. Arquitectura JTC.

Figura 12. Arquitectura JTC.


El frente de onda modulado a la salida del MEL recorre una distancia f hasta llegar a la lente biconvexa, la que tiene como objetivo ge-nerar la transformada de Fourier de la imagen conjunta a una distancia f después de la lente (vanderlugt, 1992) (figura 12) La cámara 2 cap-tura la intensidad de la transformada conjunta, la que llamaremos el espectro conjunto (EC), en este momento el video switch intercambia la se-ñal de la cámara 1 con la cámara 2 para que la computadora ingrese la imagen del EC al MEL, así la cámara 2 capturará ahora el plano de co-rrelación entre la escena y el objeto de referen-cia Esto se puede ver más claramente en el si-guiente análisis

Sea ( )yxs , la imagen de entrada, es decir, la imagen que contiene a un conjunto de objetos (objetos deseados y/o objetos no deseados) de entre los cuales se tratará de determinar si está o no el objeto deseado (objetivo), y sea ),( yxt la imagen del objetivo, es decir, el objeto que se desea reconocer La imagen conjunta de entrada al MEL puede definirse como

( ) ( ),,,),( dyxtdyxsyxf ++−=

(14)

pero se sabe que, a una distancia f después de la lente se tiene ( )yxF , , la transformada de Fourier de ( )yxf , (vanderligt, 1992; Klein y Furtak, 1985) entonces la transformada de Fourier de la ec (14) es

(15)

La expresión de la ec (15) es capturada por la cámara 2, pero se sabe que una cámara de video es convertidor a intensidad, lo que origina que la cámara 2 entregue una imagen de la intensidad de F(m,ν), es decir F(m,ν)2 que a continuación se describe

(16)

donde { }, indica la operación del producto in-terno, y el superíndice {}* denota el complejo conjugado

Desarrollando un poco la ec (16) se obtiene

(17)

o también

(18)

donde el símbolo {}⋅ denota la operación de mul-tiplicación punto a punto Ahora, de la eq (18) se observa que hay tres factores con distinto valor de fase, en el origen o fase cero se encuentra la suma de las autocorrelaciones de S(m,ν) y T(m,ν) respectivamente, y en un desfasamiento d± so-bre la coordenada ν se encuentra la correlación cruzada de S(m,ν) y T(m,ν) los cuales son los tér-minos de interés Si se aplica la transformada in-versa de Fourier a la ec (18), obtendremos

(19)

donde también se puede ver claramente dónde están los términos de interés, los de correlación cruzada Uno de los problemas principales de esta arquitectura es su poca tolerancia al ruido, es decir, para situaciones donde los objetos es-tán incrustados sobre ruido o algún fondo que puede ser modelado como un proceso estocás-tico (modelo de objeto y ruido no traslapado) (Javidi y Wang, 1994; Javidi y Horner, 1994; Javidi y Wang, 1992), el JTC responde con una capacidad de discriminación DC muy baja, y en algunos casos se recibe un valor negativo, lo que quiere decir que es imposible detectar al objeto La DC es una medida de qué tan bien el filtro es capaz de detectar el objeto deseado y rechazar cualquier otro objeto no deseado, incluyendo el fondo (Kumar y Hassebrook, 1990; Díaz-Ramí-rez, et al., 2005), la DC se define como lo mues-tra la ec (10) Supongamos ahora que los objetos de la señal de entrada están incrustados sobre un fondo ( )yxb , , en este caso la nueva imagen con-junta de entrada al MEL puede escribirse como

8

tanto es atractivo pensar en una clase de sistemas de procesamiento que unan las ventajas de los sistemas digitales y de los sistemas ópticos, de esta forma seria posible implementar sistemas con gran velocidad de procesamiento y programables, lo que permitiría hacer reconocimiento de patrones en tiempo real. Esta clase de sistemas existen y se les conoce como sistemas opto-digitales o sistemas híbridos. El uso de sistemas opto-digitales para realizar reconocimiento de patrones en tiempo real se divide principalmente en dos distintos enfoques principales, uno es utilizando técnicas de correlación y el otro es utilizando redes neuronales o algoritmos evolutivos (Javidi y Horner, 1992). El reconocimiento de patrones utilizando redes neuronales y/o algoritmos evolutivos se hace en base a heurísticas mientras que el reconocimiento de patrones usando técnicas de correlación se hace principalmente en base de la teoría de los sistemas lineales (Willsky et al., 1983), se diseña un filtro lineal cuya respuesta al impulso produce como salida una función de correlación que es utilizada para decidir si está o no el objeto que se desea reconocer de la escena. Las principales arquitecturas para desarrollar esta tarea utilizando métodos opto-digitales basados en correlación son conocidas como correladores opto-digitales y son dos principales: correlador de transformación conjunta (JTC, por sus siglas en ingles Joint Transform Correlator) (Weaver y Goodman, 1966]; Javidi y Horner, 1989) y el correlador 4F (Vanderlugt, 1992). En el correlador 4f se diseña un filtro en el dominio de la frecuencia, mientras que en el correlador JTC el diseño del filtro es en el dominio espacial. Una de las principales ventajas del correlador JTC sobre el correlador 4f es que es mucho menos sensible a desalineaciones físicas del sistema, en esta sección nos enfocaremos esencialmente en la arquitectura JTC. 3.1 Correlador de Transformación Conjunta JTC En esta arquitectura se colocan en el plano de entrada a través del modulador espacial de luz (MEL) la imagen de la escena y la imagen del objeto que se desea reconocer separadas por una distancia d e iluminadas por un frente de onda plano de luz coherente (Klein y Furtak, 1985), tal como se muestra en la Figura (12). El frente de onda modulado a la salida del MEL recorre una distancia f hasta llegar a la lente biconvexa, la que tiene como objetivo generar la transformada de Fourier de la imagen conjunta a una distancia f después de la lente (Vanderlugt, 1992), Figura (12). La cámara 2 captura la intensidad de la transformada conjunta, la que llamaremos el espectro conjunto (EC), en este momento el video switch intercambia la señal de la cámara 1 con la cámara 2 para que la computadora ingrese la imagen del EC al MEL, así la cámara 2 capturará ahora el plano de correlación entre la escena y el objeto de referencia. Esto se puede ver más claramente en el siguiente análisis. Sea yxs , la imagen de entrada, es decir, la imagen que contiene a un conjunto de objetos (objetos deseados y/o objetos no deseados) de entre los cuales se tratará de determinar si está o no el objeto deseado (objetivo), y sea ),( yxt la imagen del objetivo, es decir, el objeto que se desea reconocer. La imagen conjunta de entrada al MEL puede definirse como ,,,),( dyxtdyxsyxf (14) pero se sabe que, a una distancia f después de la lente se tiene yxF , , la transformada de Fourier de

yxf , (Vanderligt, 1992; Klein y Furtak, 1985) entonces la transformada de Fourier de la ec.(14) es .exp,exp,, idTidSF (15) La expresión de la ec.(15) es capturada por la cámara 2, pero se sabe que una cámara de video es convertidor a intensidad, lo que origina que la cámara 2 entregue una imagen de la intensidad de ,F , es decir

2,F que a continuación se describe

,,,,,),( *2 FFFE (16)

donde , indica la operación del producto interno, y el superíndice * denota el complejo conjugado. Desarrollando un poco la ec.(16) se obtiene

9

,exp,exp,

,exp,exp,, **

2

idTidSidTidS

F (17)

o también

,2exp,,2exp,,

,,,,,,

*

*

**2

diTSdiTS

TTSSFE

(18)

donde el símbolo denota la operación de multiplicación punto a punto. Ahora, de la eq.(18) se observa que hay tres factores con distinto valor de fase, en el origen o fase cero se encuentra la suma de las autocorrelaciones de ,S y ,T respectivamente, y en un desfasamiento d sobre la coordenada

se encuentra la correlación cruzada de ,S y ,T los cuales son los términos de interés. Si se aplica la transformada inversa de Fourier a la ec.(18) obtendremos

,2,2,

2,2,

,,),(),(,

yxyx

yxyx

yxxxyxxx

dddyxtdyxs

dddyxtdyxs

ddyxtyxtddyxsyxsyxe

(19)

donde también se puede ver claramente donde están los términos de interés, los de correlación cruzada. Uno de los problemas principales de esta arquitectura es su poca tolerancia al ruido, es decir, para situaciones donde los objetos están incrustados sobre ruido o algún fondo que puede ser modelado como un proceso estocástico (modelo de objeto y ruido no traslapado) (Javidi y Wang, 1994; Javidi y Horner, 1994; Javidi y Wang, 1992), el JTC responde con una capacidad de discriminación DC muy baja, y en algunos casos se recibe un valor negativo, lo que quiere decir que es imposible detectar al objeto. La DC es una medida de que tan bien el filtro es capaz de detectar el objeto deseado y rechazar cualquier otro objeto no deseado incluyendo el fondo (Kumar y Hassebrook, 1990; Diaz-Ramirez, et al,. 2005), la DC se define como lo muestra la ec.(10). Supongamos ahora que los objetos de la señal de entrada están incrustados sobre un fondo

yxb , , en este caso la nueva imagen conjunta de entrada al MEL puede escribirse como

,,,,,~

dyxtdyxbdyxsyxf (20) donde

,,,,~

yxbyxwyxb (21) y donde w x, y es una función binaria definida como

01, dentro del area de los objetos

w x, y, otra parte

. (22)

De esta forma la intensidad del espectro conjunto de la ec.(20) se convierte en

8

tanto es atractivo pensar en una clase de sistemas de procesamiento que unan las ventajas de los sistemas digitales y de los sistemas ópticos, de esta forma seria posible implementar sistemas con gran velocidad de procesamiento y programables, lo que permitiría hacer reconocimiento de patrones en tiempo real. Esta clase de sistemas existen y se les conoce como sistemas opto-digitales o sistemas híbridos. El uso de sistemas opto-digitales para realizar reconocimiento de patrones en tiempo real se divide principalmente en dos distintos enfoques principales, uno es utilizando técnicas de correlación y el otro es utilizando redes neuronales o algoritmos evolutivos (Javidi y Horner, 1992). El reconocimiento de patrones utilizando redes neuronales y/o algoritmos evolutivos se hace en base a heurísticas mientras que el reconocimiento de patrones usando técnicas de correlación se hace principalmente en base de la teoría de los sistemas lineales (Willsky et al., 1983), se diseña un filtro lineal cuya respuesta al impulso produce como salida una función de correlación que es utilizada para decidir si está o no el objeto que se desea reconocer de la escena. Las principales arquitecturas para desarrollar esta tarea utilizando métodos opto-digitales basados en correlación son conocidas como correladores opto-digitales y son dos principales: correlador de transformación conjunta (JTC, por sus siglas en ingles Joint Transform Correlator) (Weaver y Goodman, 1966]; Javidi y Horner, 1989) y el correlador 4F (Vanderlugt, 1992). En el correlador 4f se diseña un filtro en el dominio de la frecuencia, mientras que en el correlador JTC el diseño del filtro es en el dominio espacial. Una de las principales ventajas del correlador JTC sobre el correlador 4f es que es mucho menos sensible a desalineaciones físicas del sistema, en esta sección nos enfocaremos esencialmente en la arquitectura JTC. 3.1 Correlador de Transformación Conjunta JTC En esta arquitectura se colocan en el plano de entrada a través del modulador espacial de luz (MEL) la imagen de la escena y la imagen del objeto que se desea reconocer separadas por una distancia d e iluminadas por un frente de onda plano de luz coherente (Klein y Furtak, 1985), tal como se muestra en la Figura (12). El frente de onda modulado a la salida del MEL recorre una distancia f hasta llegar a la lente biconvexa, la que tiene como objetivo generar la transformada de Fourier de la imagen conjunta a una distancia f después de la lente (Vanderlugt, 1992), Figura (12). La cámara 2 captura la intensidad de la transformada conjunta, la que llamaremos el espectro conjunto (EC), en este momento el video switch intercambia la señal de la cámara 1 con la cámara 2 para que la computadora ingrese la imagen del EC al MEL, así la cámara 2 capturará ahora el plano de correlación entre la escena y el objeto de referencia. Esto se puede ver más claramente en el siguiente análisis. Sea yxs , la imagen de entrada, es decir, la imagen que contiene a un conjunto de objetos (objetos deseados y/o objetos no deseados) de entre los cuales se tratará de determinar si está o no el objeto deseado (objetivo), y sea ),( yxt la imagen del objetivo, es decir, el objeto que se desea reconocer. La imagen conjunta de entrada al MEL puede definirse como ,,,),( dyxtdyxsyxf (14) pero se sabe que, a una distancia f después de la lente se tiene yxF , , la transformada de Fourier de

yxf , (Vanderligt, 1992; Klein y Furtak, 1985) entonces la transformada de Fourier de la ec.(14) es .exp,exp,, idTidSF (15) La expresión de la ec.(15) es capturada por la cámara 2, pero se sabe que una cámara de video es convertidor a intensidad, lo que origina que la cámara 2 entregue una imagen de la intensidad de ,F , es decir

2,F que a continuación se describe

,,,,,),( *2 FFFE (16)

donde , indica la operación del producto interno, y el superíndice * denota el complejo conjugado. Desarrollando un poco la ec.(16) se obtiene

9

,exp,exp,

,exp,exp,, **

2

idTidSidTidS

F (17)

o también

,2exp,,2exp,,

,,,,,,

*

*

**2

diTSdiTS

TTSSFE

(18)



,2,2,

2,2,

,,),(),(,

yxyx

yxyx

yxxxyxxx

dddyxtdyxs

dddyxtdyxs

ddyxtyxtddyxsyxsyxe

(19)



,,,,,~


,,,,~



w x, y, otra parte

. (22)


9

,exp,exp,

,exp,exp,, **

2

idTidSidTidS

F (17)

o también

,2exp,,2exp,,

,,,,,,

*

*

**2

diTSdiTS

TTSSFE

(18)



,2,2,

2,2,

,,),(),(,

yxyx

yxyx

yxxxyxxx

dddyxtdyxs

dddyxtdyxs

ddyxtyxtddyxsyxsyxe

(19)



,,,,,~


,,,,~



w x, y, otra parte

. (22)



(20)

donde

(21)

y donde ( )w x, y es una función binaria definida como

(22)

De esta forma la intensidad del espectro conjun-to de la ec (20) se convierte en

(23)

En la ec (23) se puede ver claramente que a di-ferencia de la ec (18) los términos con factor de fase exp(i2dν) y exp(–i2dν) no sólo contienen los elementos de correlación cruzada entre los objetos de entrada S(m,ν) y el objetivo T(m,ν), sino que también se ve alterada por las correla-ciones cruzadas del objetivo T(m,ν) con el fon-do B(m,ν) y la de los objetos de entrada S(m,ν) con el fondo B(m,ν), afectando severamente la medida de DC Para solucionar este problema se puede implementar un procedimiento iterativo para diseñar una imagen de referencia que sirva como la respuesta al impulso de un filtro lineal adaptativo de correlación que minimice conside-rablemente los efectos del fondo y de los objetos no deseados para así alcanzar un alto valor de DC deseado (Díaz-Ramírez et al , 2005)

III.2. Diseño de filtros adaptativos para la arquitectura JTC

Con base en el análisis anterior para el JTC se puede notar que es posible usar la teoría de los sistemas lineales para diseñar un filtro de corre-lación que pueda ser usado como imagen de re-ferencia en el JTC, ya que como se observa en las ecuaciones (18) y (19), a la salida del sistema se

obtiene la convolución de la imagen que contiene los objetos con la respuesta al impulso del filtro diseñado Es posible implementar un algoritmo de entrenamiento para diseñar un filtro adapta-tivo en el dominio espacial retomando las ideas descritas en la sección (2 2), e incorporando las características de los procesos físicos involucra-dos en el procesamiento óptico de imágenes, ta-les como funciones para corregir no-linealidades de la respuesta en amplitud de los MEL (Liu y Chao, 1989; Lu, y Saleh, 1990), funciones para corregir no linealidades introducidas por las cá-maras, limitaciones ópticas de rangos dinámi-cos en tonos de gris aceptados por los MEL En concreto, las características físicas propias de la arquitectura JTC De la sección anterior recor-demos que un filtro SDF básico queda definido por la ec (7) Donde R es una matriz Nxi donde cada una de las i columnas de R es una versión vectorizada de una imagen de entrenamiento con N numero de píxeles, C es un vector que contiene los valores deseados para el origen del pico de correlación, generalmente se usa 1 para objetos de la clase verdadera y 0 para objetos de la clase falsa, y el superíndice { }+ denota la transpuesta conjugada El diagrama a bloques del algoritmo para el diseño del filtro adaptativo se muestra en la figura 13, y funciona siguiendo los pasos que se describen a continuación: 1 Crear un filtro SDF básico entrenado sólo

para reconocer el objeto deseado, utilizando la ec (7)

2 Crear una imagen conjunta [ec (14)] del filtro SDF (creado en el paso anterior) y la imagen para rechazar (objetos no-deseados o el fon-do), y realizar la operación del JTC, ecuacio-nes (14-19)

3 Calcular la DC utilizando la ec (10) 4 Si el valor de la DC es mayor o igual a la de-

seada, entonces el procedimiento termina; si no, se continúa con el siguiente paso

5 Crear un nuevo objeto para ser rechazado tomando la información de la imagen para rechazar; el origen del nuevo objeto de re-chazo tiene como origen la posición del ló-bulo de intensidad máxima del plano de co-rrelación, utilizando como región de soporte la unión de todos los objetos, este nuevo ob-jeto es incluido en la clase falsa

( ) ( ) ( ) ( ),,,,,~

dyxtdyxbdyxsyxf ++−+−=

( ) ( ) ( ),,,,~

yxbyxwyxb ⋅=

( )01

, dentro del area de los objetosw x, y

, otra parte

=

10

.2exp,,,,,,

2exp,,,,,,

,,,,

~*

~**

*~*~*

2~

222

diBSBTST

diBSBTST

BTSF

(23) En la ec.(23) se puede ver claramente que a diferencia de la ec.(18) los términos con factor de fase

di2exp y di2exp no solo contienen los elementos de correlación cruzada entre los objetos de entrada ),(S y el objetivo ),(T , sino que también se ve alterada por las correlaciones cruzadas del

objetivo ),(T con el fondo ,~B y la de los objetos de entrada ),(S con el fondo ,

~B ,

afectando severamente la medida de DC. Para solucionar este problema se puede implementar un procedimiento iterativo para diseñar una imagen de referencia que sirva como la respuesta al impulso de un filtro lineal adaptativo de correlación que minimice considerablemente los efectos del fondo y de los objetos no deseados para así alcanzar un alto valor de DC deseado (Diaz-Ramirez, et al., 2005). 3.2 Diseño de filtros adaptativos para la arquitectura JTC En base al análisis anterior para el JTC se puede notar que es posible usar la teoría de los sistemas lineales para diseñar un filtro de correlación que pueda ser usado como imagen de referencia en el JTC, ya que como se observa en las ecuaciones (18) y (19), a la salida del sistema se obtiene la convolución de la imagen que contiene los objetos con la respuesta al impulso del filtro diseñado. Es posible implementar un algoritmo de entrenamiento para diseñar un filtro adaptativo en el dominio espacial retomando las ideas descritas en la sección (2.2), e incorporando las características de los procesos físicos involucrados en el procesamiento óptico de imágenes, tales como funciones para corregir no-linealidades de la respuesta en amplitud de los MEL’s (Liu y Chao, 1989; Lu, y Saleh, 1990), funciones para corregir no linealidades introducidas por las cámaras, limitaciones ópticas de rangos dinámicos en tonos de gris aceptados por los MEL’s. En concreto, las características físicas propias de la arquitectura JTC. De la sección anterior recordemos que un filtro SDF básico queda definido por la ec.(7). Donde R es una matriz Nxi donde cada una de las i columnas de R es una versión vectorizada de una imagen de entrenamiento con N numero de píxeles, C es un vector que contiene los valores deseados para el origen del pico de correlación, generalmente se usa 1 para objetos de la clase verdadera y 0 para objetos de la clase falsa, y el superíndice denota la transpuesta conjugada. El diagrama a bloques del algoritmo para el diseño del filtro adaptativo se muestra en la Figura 13, y funciona siguiendo los pasos que se describen a continuación:

1. Crear un filtro SDF básico entrenado solo para reconocer el objeto deseado, utilizando la ec.(7). 2. Crear una imagen conjunta [ec.(14)] del filtro SDF (creado en el paso anterior) y la imagen para

rechazar (objetos no-deseados o el fondo), y realizar la operación del JTC, ecuaciones (14-19). 3. Calcular la DC utilizando la ec.(10). 4. Si el valor de la DC es mayor o igual a la deseada entonces el procedimiento termina, si no, se

continúa con el siguiente paso. 5. Crear un nuevo objeto para ser rechazado tomando la información de la imagen para rechazar, el

origen del nuevo objeto de rechazo tiene como origen la posición del lóbulo de intensidad máxima del plano de correlación, utilizando como región de soporte la unión de todos los objetos, este nuevo objeto es incluido en la clase falsa.

6. Crear un nuevo filtro SDF utilizando la información de la clase verdadera y la clase falsa actualizadas. Ir al paso 2.

Implementación Opto-digital de los Filtros Adaptativos Una de las razones por las cuales es posible hacer reconocimiento de patrones en tiempo real usando la arquitectura JTC es debido a las características particulares de los moduladores espaciales de luz MES’s utilizados, uno de los moduladores mas usados en aplicaciones de tiempo real son las pantallas de cristal liquido tipo nematico torcido (TNLCD, por sus siglas en ingles Tweested Nematic Liquid Crystal Display) (Kim y Lee, 2005), este tipo de moduladores tienen las siguientes características:

1. Son eléctricamente controlados por medio de señales de video convencional.


6 Crear un nuevo filtro SDF utilizando la in-formación de la clase verdadera y la clase fal-sa actualizadas Ir al paso 2

Implementación opto-digital de los filtros adaptativos

Una de las razones por las cuales es posible hacer reconocimiento de patrones en tiempo real usan-do la arquitectura JTC es debido a las caracterís-ticas particulares de los moduladores espaciales de luz (MES) utilizados, uno de los moduladores más usados en aplicaciones de tiempo real son las pantallas de cristal líquido tipo nemático torcido (TNLCD, por sus siglas en ingles Twisted Nema-tic Liquid Crystal Display) (Kim y Lee, 2005), este tipo de moduladores tienen las siguientes carac-terísticas:1 Son eléctricamente controlados por medio

de señales de video convencional 2 Pueden operar en el régimen de modulación

de sólo amplitud o en el régimen de modula-ción de sólo fase cambiando únicamente la dirección del vector de polarización de la luz incidente (Kim y Lee, 2005)

3 Operan a la velocidad del video estándar 4 Manejan un rango dinámico de [0–255] ni-

veles de gris para modulación de amplitud, y en el rango de [0–p] aproximadamente en modulación de fase

Estas características de los MEL antes mencio-nadas, así como el tipo de datos que se obtienen en la respuesta al impulso como resultado del en-

trenamiento adaptativo presentado, originan un pequeño problema que hay que resolver antes de poder implementar el filtro en el procesador opto-digital; este problema es que la respuesta al impulso recibida, la mayoría de las veces con-tiene valores reales positivos y negativos (es una imagen bipolar), y como sabemos, los TNLCD sólo operan con valores positivos dentro del ran-go de [0–255] niveles de gris, esto trae por conse-cuencia que sea necesario transformar un poco la respuesta al impulso obtenida antes de aplicarla opto-digitalmente Existen algunos trabajos que muestran cómo hacer estas transformaciones acompañados de un post-procesamiento de ope-raciones punto por punto (Chavel y Refregier, 1996) Revisemos el siguiente análisis Sea h(x,y) la respuesta al impulso obtenida después del entrenamiento, la que podemos escribir de la si-guiente manera

(24)

donde

(25)

Sustituyendo ( )yxt , por ( )yxh , en la ec (19), ésta puede escribirse como

28

Figura 13. Diagrama a bloques del algoritmo para diseñar un filtro adaptativo basado en el correlador JTC.

Figura 13. Diagrama a bloques del algoritmo para diseñar un filtro adaptativo basado en el correlador JTC.

11

2. Pueden operar en el régimen de modulación de solo amplitud o en el régimen de modulación de solo fase cambiando únicamente la dirección del vector de polarización de la luz incidente (Kim y Lee, 2005).

3. Operan a la velocidad del video estándar. 4. Manejan un rango dinámico de 2550 niveles de gris para modulación de amplitud, y en el

rango de 0 aproximadamente en modulación de fase. Estas características de los MEL’s antes mencionadas, así como el tipo de datos que se obtienen en la respuesta al impulso como resultado del entrenamiento adaptativo presentado, originan un pequeño problema que hay que resolver antes de poder implementar el filtro en el procesador opto-digital, este problema es que la respuesta al impulso recibida, la mayoría de las veces contiene valores reales positivos y negativos (es una imagen bipolar), y como sabemos, los TNLCD solo operan con valores positivos dentro del rango de 2550 niveles de gris, esto trae por consecuencia que sea necesario transformar un poco la respuesta al impulso obtenida antes de aplicarla opto-digitalmente, existen algunos trabajos que muestran como hacer estas transformaciones acompañados de un post-procesamiento de operaciones punto por punto (Chavel y Refregier, 1996). Revisemos el siguiente análisis. Sea yxh , la respuesta al impulso obtenida después del entrenamiento, la que podemos escribir de la siguiente manera ,,,, yxhyxhyxh (24) donde

maneraotrayxhyxh

yxh

maneraotrayxhyxh

yxh

00,,

,

00,,

,. (25)

Sustituyendo yxt , por yxh , en la ec.(19), esta puede escribirse como

,2,2,2,2,

,,),(),(,

dyxhdyxsdyxhdyxs

yxhyxhyxsyxsyxe (26)

donde el símbolo denota la operación de correlación. Si capturáramos con una cámara la ec.(26) y nos concentráramos únicamente en uno de los términos de correlación cruzada podríamos escribir

,,,, 2yxhyxsyxc (27) sin pérdida de generalidad se ha ignorado el desplazamiento d2 ya que solo se está considerando uno de los términos de interés. Sustituyendo la ec.(24) en ec.(27) obtenemos

22

22

22

2

,,,,2

,,,,

,,,,2

,,,,

,,,,

yxhyxsyxhyxs

yxhyxsyxhyxs

yxhyxsyxhyxs

yxhyxsyxhyxs

yxhyxhyxsyxc

. (28)

11




maneraotrayxhyxh

yxh

maneraotrayxhyxh

yxh

00,,

,

00,,

,. (25)


,2,2,2,2,

,,),(),(,

dyxhdyxsdyxhdyxs




22

22

22

2

,,,,2

,,,,

,,,,2

,,,,

,,,,

yxhyxsyxhyxs

yxhyxsyxhyxs

yxhyxsyxhyxs

yxhyxsyxhyxs

yxhyxhyxsyxc

. (28)


(26)

donde el símbolo { }⊗ denota la operación de correlación Si capturáramos con una cámara la ec (26) y nos concentráramos únicamente en uno de los términos de correlación cruzada po-dríamos escribir

(27)

sin pérdida de generalidad se ha ignorado el des-plazamiento d2± ya que sólo se está consideran-do uno de los términos de interés Sustituyendo la ec (24) en ec (27) obtenemos

(28)

La ec (28) indica que se puede separar la res-puesta al impulso bipolar en dos imágenes

( )yxh ,+ y ( )yxh ,− , donde cada una tiene única-mente los valores positivos y negativos de ( )yxh , respectivamente, obtener los planos de corre-lación utilizando cada una de estas imágenes como imagen de referencia en el JTC y así ob-tener ( ) ( )2

,, yxhyxs +⊗ y ( ) ( )2,, yxhyxs −⊗ , después

realizar operaciones punto a punto para obtener ( ) ( )2

,, yxhyxs +⊗ y ( ) ( )2,, yxhyxs −⊗ , y hacer la

suma de términos tal como está descrito en la expresión

III.3. Resultados experimentales con sistemas híbridos

Consideremos la escena mostrada en la figura 14, la cual contiene cuatro partículas biológicas llamados copépodos que están incrustados sobre un fondo acuático, el objetivo es un copépodo hembra y los objetos no-deseados son tres co-pépodos machos

11




maneraotrayxhyxh

yxh

maneraotrayxhyxh

yxh

00,,

,

00,,

,. (25)


,2,2,2,2,

,,),(),(,

dyxhdyxsdyxhdyxs




22

22

22

2

,,,,2

,,,,

,,,,2

,,,,

,,,,

yxhyxsyxhyxs

yxhyxsyxhyxs

yxhyxsyxhyxs

yxhyxsyxhyxs

yxhyxhyxsyxc

. (28)

( ) ( ) ( ) ,,,, 2yxhyxsyxc ⊗=

11




maneraotrayxhyxh

yxh

maneraotrayxhyxh

yxh

00,,

,

00,,

,. (25)


,2,2,2,2,

,,),(),(,

dyxhdyxsdyxhdyxs




22

22

22

2

,,,,2

,,,,

,,,,2

,,,,

,,,,

yxhyxsyxhyxs

yxhyxsyxhyxs

yxhyxsyxhyxs

yxhyxsyxhyxs

yxhyxhyxsyxc

. (28)

29

Figura 14. Imagen de la escena compuesta por microorganismos biológicos

Figura 14. Imagen de la escena compuesta por microorganis-mos biológicos

Tabla 3Numero de iteraciones vs. Nivel de DC para rechazar cada uno de los objetos no deseados

Iteraciones DC de rechazoFondo

DC de rechazoMacho1

DC de rechazoMacho2

DC de rechazoMacho3

0 -0 02127 0 95707 0 96586 0 941081 0 82615 0 96706 0 96767 0 96042 0 87219 — — —3 0 89223 — — —4 0 90219 — — —

Se diseñó un filtro adaptativo para recono-cer al objetivo y rechazar a los tres objetos no-deseados y al fondo, el filtro se diseñó utilizando cuatro veces en forma secuencial el algoritmo descrito en la figura 13 para rechazar cada uno de los objetos no deseados hasta alcanzar una DC=0 9 para rechazar el fondo y DC=0 95 para rechazar los copépodos machos El resultado del entrenamiento puede verse en la tabla 3

La tabla 3 muestra que en las condiciones ini-ciales (filtro SDF inicial) el fondo tiene un nivel de DC negativo, mientras que para los organis-


mos biológicos no-deseados dos de ellos ya cum-plen con el nivel de DC; para rechazar el fondo fueron necesarias cuatro iteraciones, mientras que para los organismos biológicos sólo fue ne-cesaria una iteración La imagen de la respuesta al impulso obtenida se muestra en la figura 15

pués de aplicar el filtro adaptativo en un proce-sador JTC se muestra en la figura 17

En la figura 17 se puede observar que el pun-to blanco en la imagen del plano de correlación coincide correctamente con la localización del copépodo hembra Se concluye esta sección di-ciendo que el objetivo fue claramente detectado con el filtro adaptativo diseñado

Figura 17. Resultados ópticos. Arriba: imagen del plano de correlación obtenido con el filtro adaptativo diseñado. Abajo: imagen 3-D del plano de correlación obtenido con el filtro adaptativo, DC = 0.786

31

Figura 16. izquierda: Parte positiva del filtro. derecha: Parte negativa del filtro.

Figura 16. Izquierda: parte positiva del filtro. Derecha: parte negativa del filtro.

La figura 16 muestra la separación de la respuesta al impulso como se describe en la ec (24)

32

Figura 17. Resultados ópticos. Arriba: Imagen del plano de correlación obtenido con el filtro adaptativo diseñado. Abajo: Imagen 3-D del plano de correlación obtenido con el filtro adaptativo, DC = 0.786

30

Figura 15. Imagen del valor absoluto de la respuesta al impulso del filtro adaptativo

Figura 15. Imagen del valor absoluto de la respuesta al impul-so del filtro adaptativo

El nivel de DC recibido en una simulación por computadora hecha, utilizando la escena de la figura 14 y el filtro de la figura 15 fue de 0 8993 El filtro fue probado opto-digitalmente en un correlador JTC con las siguientes caracte-rísticas: láser He-Ne color rojo, con una longitud de onda de mm632 , MEL TNLCD con una re-solución de 800x600 píxeles y con 1 2 pulgadas de longitud de la diagonal del dispositivo, con-figurado en el régimen de modulación de sólo amplitud, cámara CCD monocromática con una resolución de 640x480 píxeles El resultado des-

IV. Conclusiones

El reconocimiento adaptativo de patrones conti-núa en un estado de rápida evolución Los filtros correladores son populares gracias a que pueden realizar las tareas de localización e identificación sin necesidad de segmentar o de preprocesar la escena a analizar En este capítulo se han pro-puesto tanto sistemas digitales como híbridos opto-digitales, diseñados con base en filtros adaptativos para mejorar el reconocimiento de objetos biológicos que pueden encontrarse en un fondo real Se demostró que los algoritmos de diseño de los filtros pueden ayudar a tomar el


control sobre todo el plano de correlación con pocas iteraciones para el entrenamiento Los sistemas digitales están basados en un entre-namiento iterativo de filtros SDF y, como con-secuencia, poseen los beneficios de tener una buena tolerancia a las distorsiones geométricas y al ruido aditivo Los sistemas híbridos además toman en cuenta las características reales de los dispositivos ópticos empleados Los sistemas di-gitales pueden implementarse fácilmente en una computadora, mientras que los sistemas híbridos pueden proporcionar resultados en tiempo real para realizar el reconocimiento de patrones Las simulaciones por computadora y los resultados experimentales demostraron que los filtros pro-puestos para el reconocimiento de datos biológi-cos poseen un desempeño muy bueno compara-do con aquellos filtros por correlación clásicos Los filtros recomendados poseen una buena adaptividad a la escena y una buena robustez al ruido de entrada

V. Referencias

Arsenault, H e Y Hsu (1983) “Rotation invariant discrimination between almost similar objects” Applied Optics, 22: 130-132

Billet, O y L Singher (2002) “Adaptive multiple filtering” Optical Engineering, 41(1): 55-68

Casasent, D 1984 “Unified synthetic discriminant function computational formulation”, Applied Optics, 23(10): 1620-1627

Díaz-Ramírez, v H , v Kober y J Álvarez-Bo-rrego (2005) “Real-time pattern recognition with adaptative correlation filters” SPIE

González-Fraga, J A , v Kober y J Álvarez-Borrego (2005) “Adaptive SDF filters for pattern recognition” Optical Engineering (aceptado)

González-Fraga, J A , v H Díaz-Ramírez, v Kober y J Álvarez-Borrego (2005) “Improving the discrimination capability with an adaptive synthetic discriminant function filter” Lecture Notes in Computer Science, 3523: 83-90

Horner, J L y P D Gianino (1984) “Phase-only matched filtering” Applied Optics, 23: 812-816

Jain, A K (1989) Fundamentals of digital image processing Prentice Hall, Nueva York

Javidi, B y J Wang (1992) “Limitation of the classic definition of the correlation signal-to-noise-ratio in optical pattern recognition with disjoint signal and scene noise” Applied Optics, 31: 6826

Javidi, B y Joseph L Horner (1989) “Single spatial light modulator joint transform correlator” Applied Optics, 25: 1027-1032

Javidi, B y J Wang (1994) “Design of filters to detect a noisy target in nonoverlapping bac-kground noise” Journal OSA (A), 11: 2604-2612

Javidi, B y J L Horner (1994) Real-Time Optical Information Processing Academic Press, San Diego

Jedynski, M , K Chalasinska-Macukow (2005) “Wavelet transform for preprocessing in an optical correlator with multilevel composi-te filter” Optical Engineering, 43(8): 1759-1766

Kim, H e Y H Lee (2005) “Unique measurement of the parameters of a twisted-nematic liquid-crystal display” Applied Optics, 44: 1642-1649

Klein, Miles v y Thomas E Furtak (1985, 2ª ed ) Optics John Wiley, Nueva York

Kober v y J Campos (1996) “Accuracy of location measurement of a noisy target in a nonoverlapping background” Journal OSA (A) 13: 1653-1666

Kober, v y T S Choi (2000) “Single-output multichannel pattern recognition with projection preprocessing” Optical Engineering, 39(8): 2153-2162

Kober, v e I A Ovseyevich (2000) “Phase-only filter with improved filter efficiency and correlation discrimination” Pattern Recognition and Image Analysis, 10(4): 514-519

Kober, v , L P Yaroslavsky, J Campos y M J Yzuel (1994) “Optimal filter approximation by means of a phase only filter with quantization” Optics Letters, 19(13): 978-980

Laude, v , P Chavel, y P Refregier (1996) “Implementation of arbitrary real-valued correlation filters for the shadow casting


incoherent correlator” Applied Optics, 35: 5267-5274

Liu, H K y T H Chao (1989) “Liquid crystal television spatial light modulators” Applied Optics, 28: 4772-4780

Lu, K y B E A Saleh (1990) “Theory and design of the liquid crystal Tv as an optical spatial phase modulator” Optical Engineering, 29: 240

Mahalanobis, A , B v K vijaya Kumar y D Casasent (1987) “Minimum average correlation filters” Applied Optics, 26: 3633-3640

Moreno, I , J Campos, M J Yzuel y v Kober (1998) “Implementation of bipolar real-valued input scenes in a real-time optical correlator: application to color pattern recognition” Optical Engineering, 37(1): 144-150

Pech-Pacheco, J L y J Álvarez-Borrego (1998) “Optical-digital system applied to the identification of five phytoplankton species” Marine Biology, 132(3): 357-365

vander Lugt, A B (1964) “Signal detection by complex filtering” IEEE Trans. Inf. Theory, 10(6): 139-135

vanderlugt (1992) Optical Signal Processing John Wiley, Nueva York

vijaya Kumar, B v K (1992) “Tutorial survey of composite filter designs for optical correlators” Applied Optics, 31(23): 4773-4801

vijaya Kumar, B v K y L Hassebrook (1990) “Performance measures for correlation filters” Applied Optics, 29(20): 2997-3006

Weaver, C S y J L Goodman (1966) “Techni-que for optically convolving two functions” Applied Optics, 5: 1248-1249

Willsky, Alan S , Alan Oppenheim y S Hamid Nawav (1983) Signals and systems, second edition Prentice Hall

Yaroslavsky, L P (1993) “The theory of optimal methods for localization of objects in pic-tures” En: E Wolf (ed ) Progress in Optics XXXII, Elsevier, pp 145-201

capítulo 9Sistema de adquisición de partículas biogénicas

Josué Álvarez BorregoMario Alonso Bueno Ibarra


I. Introducción

En el año 2001, Pech Pacheco et al. propusieron un modelo capaz de solucionar la problemática de adquisición, procesamiento e identificación de partículas biogénicas, en el cual se basa el desarrollo de la plataforma computacional que se describe en este capítulo Sin embargo, en la práctica este modelo no fue implementado como un sistema automático, por la carencia del equi-po necesario para cumplir la tarea, sólo fue po-sible implementar un sistema semi-automático No obstante, este modelo reunía los atributos funcionales para ser desarrollado tecnológica-mente

Bueno Ibarra (2005) diseñó e implementó un sistema completamente automatizado, esto tuvo como consecuencia que fuera posible co-nocer las limitaciones del modelo planteado anteriormente El modelo propuesto por Pech Pacheco et al. (2001) procesaba imágenes mo-nocromáticas de baja resolución, por lo tanto la problemática asociada a la eficiencia y al manejo de memoria de los procesos involucrados no era un aspecto evidente

Los algoritmos implementados por el mode-lo anterior en el procesamiento de las imágenes monocromáticas de baja resolución, funciona-ban con tiempos de procesamiento razonables, el costo de memoria no era alto, procesándose alrededor de 16 imágenes de 256 x 256 píxeles (64 Kb) cada una por evento, las cuales integra-ban varios campos capturados del microscopio; más adelante se describe el modelo planteado por Pech Pacheco et al. (2001) En el trabajo realizado por Bueno Ibarra (2005) se extendie-ron las capacidades planteadas y se rediseñó el

modelo propuesto, con el objetivo de procesar imágenes de color en alta resolución

I.1 Modelo base

El modelo planteado por Pech Pacheco et al. en el 2001 se muestra en la figura 1, en donde bási-camente se seguían los procesos plasmados en el diagrama por cada espécimen analizado bajo el microscopio

El proceso del modelo se inicia con la colo-cación de la muestra en el microscopio, continúa con la captura de un campo de la muestra, se le realiza cierto procesamiento de imágenes al cam-po, prosiguiendo con la integración de un mosai-co de campos, y se continúa así sucesivamente hasta formar un tamaño de mosaico deseado; después, el mosaico es nuevamente procesado y segmentado; a partir del mosaico segmentado, se realiza un preanálisis de las partículas encon-tradas, para posteriormente tratar de identificar cada partícula individualmente por algún algo-ritmo de identificación Una vez terminado este proceso, se continúa con el análisis de la siguien-te muestra

En el punto siguiente se detallan los proce-sos del modelo de la figura 1, explicando las ca-racterísticas de cada algoritmo que es integrado en cada proceso

I.1.1 Procesos involucrados en el modelo base

El análisis de partículas comienza con un grupo de especímenes que se desean identificar Éstos se encuentran preparados en muestras colocadas sobre laminillas de vidrio, que se colocarán en la

178 Josué Álvarez Borrego, Mario Alonso Bueno Ibarra y María Cristina Chávez Sánchez

platina del microscopio Este paso está marcado en el diagrama como inicio

La muestra es colocada en una posición pre-viamente seleccionada y se inicia con la adquisi-ción del primer campo (donde el campo es el área que se observa en el microscopio en un objetivo determinado, 10x, 40x, 60x, 100x, etc ) y así se con-tinúa barriendo la muestra hasta el i-ésimo cam-po, definido como iyxf ),( , de esta manera se va formando una matriz de campos NxM , llama-da mosaico, los cuales integran un área de análisis de la muestra y definida por NxMyxf ),( En la fi-gura 2 se muestra la integración del mosaico con la captura de varios campos, los cuales forman la imagen completa del área que se desea analizar

NxMyxf ),(

captura en la misma posición espacial ( , )x y va-rios campos a lo largo del eje Z; así, del proceso de autoenfoque es obtenida una imagen con la mejor información visual del campo capturado, dicha imagen está ubicada en el plano en Z de mejor enfoque

Una vez que se ha obtenido la imagen me-jor enfocada, se construye una imagen final del campo, por medio de la integración de un con-junto de imágenes capturadas a partir del plano de mejor enfoque Lo anterior es realizado me-diante unas técnicas llamadas de fusión, las cua-les proveen una detección robusta y con mayor información espacial de las partículas que serán analizadas

La ejecución del proceso de fusión se hace necesaria debido a que las partículas analizadas dentro de una muestra presentan una estructu-ra volumétrica, y el proceso de fusión construye una imagen final a partir de la información con-tenida en las imágenes obtenidas en diferentes planos focales, deslizando la platina en el eje Z hacia arriba y abajo del plano de mejor enfoque La técnica descrita es llamada técnica de fusión multifoco; así, la imagen final construida, llama-da imagen fusionada, es representada por

(1) [ ]*

1( , ) ( , )

Z

i Z if x y f x y= ∑

Figura 1

Inicio

Laminillai-ésima

Fin

Identificación a partir del mosaico

Análisisdel mosaico

Campoi-ésimo

Adquisicióndel campo

Procesamiento del campo

Procesamiento del mosaico

Almacenamientode imágenes

mosaico

Integracióndel mosaico

Figura 1. Modelo de adquisición, procesamiento e identificación automática de partículas biogénicas.

Figura 2

iyxf ),(

Figura 2. Formación del mosaico de campos capturados.

A cada campo iyxf ),( se le ejecuta un proceso de autoenfoque, ya que el microscopio

179Sistema de adquisición de partículas biogénicas

donde *( , )if x y es la imagen fusionada del cam-po i-ésimo y las imágenes [ ]( , )Z i

f x y son captu-radas a diferentes planos focales del plano de mejor enfoque En la figura 3 se muestra esta técnica, donde se tienen ocho imágenes captura-das a diferentes alturas en Z

En la primera etapa es aplicada la técnica de top-hat o la técnica de rolling ball (Russ, 1995), para llevar a cabo una corrección del fondo La operación de filtraje por top-hat, los píxeles cuyo valor exceda un umbral determinado son consi-derados ruido y serán reemplazados por el valor de la media o mediana de los píxeles vecinos, mientras que en la técnica de Rolling Ball con-sidera que los píxeles más obscuros son los que van a ser eliminadas de la imagen

En la segunda etapa se ejecuta la aplicación de un filtraje paso bajo en la imagen del mosaico resultante de la primera etapa; esto genera un suavizado en la imagen, produciendo que el his-tograma de ésta nos quede con una forma gau-siana, permitiendo la aplicación de una técnica de segmentación ejecutada en la tercera etapa

Por último, en la tercera etapa se aplica una técnica llamada técnica del triángulo, la cual ayu-

Figura 3

Figura 3. Las cuatro imágenes de la parte superior fueron capturadas hacia arriba del plano de enfoque, sobre el eje Z, mientras las imágenes de la parte inferior fueron capturadas hacia abajo del plano de enfoque, todas éstas forman la ima-gen fusionada.

Al aplicar la técnica de fusión se tiene una imagen final del campo *( , )if x y capturado con la información relevante de las imágenes que la forman Esta técnica de fusión permite traer a un solo plano información adicional de los diferen-tes campos capturados en diferentes Zs, por lo tanto la imagen fusionada presenta la mejor ca-lidad visual y de información, siendo ésta la que integre el mosaico de imágenes de la muestra

En la figura 4 se muestra la imagen final de los campos fusionados capturados y mostrados en la figura 3 Los procesos explicados anteriormen-te se llevan a cabo en los bloques de adquisición del campo y procesamiento del campo (figura 1) Continuando con el procesamiento del mosaico, el mosaico formado contiene una serie de anoma- lías y defectos debido a las diferencias de ilumi-nación y a las producidas por la misma técnica de fusión En la figura 5 se observa el mosaico que presenta campos iluminados con diferentes intensidades, esto trae como consecuencia el tener que realizar un procesamiento de mejora en el mosaico formado NxMyxf ),( En el bloque de procesamiento del mosaico del modelo, son llevadas acabo tres etapas: la primera, una co-rrección de fondo de la imagen del mosaico; la segunda, una mejora de la imagen y la tercera, una segmentación

Figura 4

Figura 4. Imagen final fusionada.

Figura 5

Figura 5. Mosaico con problemas de iluminación.


da a segmentar la imagen y así tener una nue-va información en donde realizar una detección adecuada de las partículas La técnica del trián-gulo consiste en la obtención de un valor de um-bralización T, localizado en la distancia media de la recta de los valores extremos del histograma en donde la recta perpendicular a esta recta sea de longitud mayor (figura 6) Así el valor T ob-tenido será utilizado como valor de referencia para realizar la segmentación En la figura 7 se muestra un ejemplo de la imagen resultante des-pués de haber aplicado la técnica del triángulo

partículas contenidas en la muestra por medio de diferentes técnicas, y en el segundo paso se llevará a cabo un proceso de etiquetado de partí-culas previamente detectadas y localizadas

Dentro de las técnicas para detectar partí-culas se mencionan las siguientes: aproximación elíptica, análisis de ejes principales mayor y menor, análisis de tamaños, etc , observe en la figura 8 cómo se lleva a cabo la detección de una partícu-la en un mosaico típico ya procesado, mediante las técnicas mencionadas anteriormente Una vez que ya han sido detectadas las partículas, se les registra la ubicación almacenando las coorde-nadas dentro del mosaico

Figura 6

T

Figura 6. Método del triángulo, para segmentación.

Figura 7

Figura 7. Mosaico segmentado, por el método del triángulo.

En el bloque de análisis del mosaico se rea-liza un análisis de la imagen del mosaico seg-mentado, con el objetivo de poder clasificar y detectar las partículas contenidas en la muestra El proceso de análisis se llevará a cabo por me-dio de la ejecución de dos pasos: el primer paso consistirá en detectar y localizar las diferentes

Figura 8

En la figura 9 se muestra un ejemplo donde se han detectado y registrado las localizaciones de las partículas, prosiguiendo con la etapa de etiquetado

Figura 8. Detección y localización de partículas del mosaico.

Figura 9

Figura 9. Etiquetado de las partículas, que fueron detectadas y localizadas.


Al momento de ejecutar esta etapa, se tiene almacenada la información de todas las partícu-las que son de interés Lo que prosigue a con-tinuación es realizar recortes de la imagen con todas aquellas partículas que previamente fue-ron marcadas como posibles candidatas de ser identificadas En la figura 10 se muestra el re-corte de partículas, los cuales serán utilizados en el proceso de identificación de partículas dentro del mosaico

imágenes transformadas, lo cual es llamado pro-ceso de correlación invariante; si la partícula es identificada, significa que el valor de correlación es muy cercano a uno, ya que los valores obtenidos son valores normalizados (valores entre 0 y 1)

Dentro de las técnicas de correlación inva-riante (IC) se han propuesto varias metodolo-gías (Álvarez-Borrego y Chávez-Sánchez, 2001; Álvarez-Borrego et al., 2002; Álvarez-Borrego y Castro-Longoria 2003), (Pech-Pacheco et al , 2001, 2003), y dentro de estas técnicas de IC, se utiliza la técnica de correlación de fase con filtros simples (SFPC) y la técnica de correlación de fase con filtros compuestos (CFPC)

Todas estas técnicas han demostrado que in-crementan la robustez en la identificación y el valor de discriminación entre partículas analiza-das; además, estas metodologías integran dentro de sus algoritmos transformaciones con inva-rianzas a escala, posición y rotación Como una observación adicional, estas técnicas han dado resultados altamente satisfactorios en la identifi-cación de algunas partículas biogénicas

Así, el modelo mencionado anteriormente sirvió como base para el planteamiento de un nuevo modelo, diseño y desarrollo de una nue-va plataforma computacional Sin embargo, se realizaron algunas adecuaciones importantes al modelo anterior para poder soportar los nuevos requerimientos de las tecnologías actuales refe-rentes a la captura y manejo de imágenes, tales como son el manejo de imágenes de color e imá-genes en alta resolución (imágenes mayores al mega-píxel)

En la siguiente sección se plasma y se explica ampliamente el modelo planteado, que cumple con los nuevos requerimientos y que soluciona algunos de los problemas encontrados en el pri-mer modelo

II. Desarrollo de una tecnología sistematizada computacional

En el desarrollo de esta nueva tecnología compu-tacional se formulan algunas propuestas impor-tantes, con el objetivo de expandir y optimizar el modelo anterior La primera propuesta fue la simplificación general del modelo Observemos la figura 11: básicamente se llevan a cabo dos

Figura 10

Figura 10. Recorte de todas las partículas que son candidatas para realizar una posible identificación.

Cuando las partículas ya han sido recorta-das, se prosigue a comparar cada una de ellas con filtros (imágenes) previamente creados de las partículas que se desea identificar El proce-so de identificación es ejecutado por el bloque identificación a partir del mosaico; en este bloque se ejecutan tres técnicas: la primera de ellas es obtener la muestra transformada con una inva-rianza de posición, la segunda técnica es obtener la muestra con invarianza de escala, o sea con in-variancias de tamaño, y por último, obtener la muestra con invarianza de rotación

En el proceso de identificación se realiza una comparación entre los filtros que previamente se almacenaron de las partículas que se desean iden-tificar; estos filtros no son otra cosa que muestras de partículas previamente transformadas con las técnicas mencionadas anteriormente De este modo, la muestra que se ha transformado se com-para con los valores de las imágenes transforma-das previamente contenidas en los filtros

Este proceso de comparación se lleva a cabo mediante la correlación entre los valores de las


procesos generales, el proceso de adquisición y el proceso de análisis Esta simplificación es im-portante porque se puede diseñar e implementar cada proceso por separado, trayendo una serie de ventajas y bondades que serán mencionadas conforme se vaya desarrollando esta sección

La tecnología computacional desarrollada se centra en la integración dentro de la plataforma de un proceso automático de adquisición de imá-genes El producto resultante de este proceso será una imagen final, la cual contenga la mejor calidad visual y de información espacial, misma que será utilizada por el proceso de análisis El proceso de análisis —como está definido en este contexto— no es parte integral del presente es-crito; sin embargo, se mencionan y describen al-gunos algoritmos utilizados anteriormente en la identificación de partículas que han dado resul-tados satisfactorios en la identificación de algu-nas partículas biogénicas

En la reorganización del modelo, se propo-nen tres modos de operación de la plataforma computacional, así como se proponen tres mo-dos de adquisición de campos en Z y dos modos de barrido (movimiento de la platina) en x/Y

Dentro de los modos de operación del siste-ma está el campo unitario, mosaico (proceso no distribuido) y mosaico (proceso distribuido) Con respecto a los modos de adquisición de los cam-pos en Z, se proponen los siguientes: Z unitaria, Z unitaria con autoenfoque y Z multifoco Por último, con respecto a los modos de barrido de la muestra en x/Y se propone: el barrido X/Y equi-distante y el barrido X/Y por definición de matriz

Toda esta reestructuración de procesos sur-ge por la necesidad de optimizar los recursos de cómputo, optimizar los tiempos de captura, operar con imágenes de alta resolución a color, tener la capacidad para la implementación y ex-perimentación de nuevos algoritmos y, por últi-mo, tener la capacidad de adquisición y análisis de imágenes bajo el microscopio por medio de un multiproceso distribuido

II.1. Modos de operación de la plataforma computacional

Cada uno de los modos de operación propuestos están diseñados para dar una solución a una pro-blemática real con respecto a la forma de adqui-

rir imágenes de partículas biogénicas a través del microscopio La forma en que se abordará cada uno de los modos de operación se hará mencio-nando: la forma de utilización, la problemática que puede ser solucionada con el modo de ope-ración respectivo y una explicación del diagrama respectivo, escribiendo algunos comentarios con respecto al modelo anterior, si hay algún punto de importancia

Campo unitario

Este modo de operación está diseñado para la captura de campos de manera individual El usuario se ubica dentro de la muestra y captura el campo deseado El modo de campo unitario es un proceso semi-automático de adquisición y análisis de campos Dentro de las bondades de este modo de operación, cabe mencionar las si-guientes: 1 Identificación individual de campos: el usuario captura y da un nombre único al cam-po seleccionado; 2 Análisis individual de cam-pos: el usuario captura los campos seleccionados y tiene la posibilidad de realizar un análisis in-dividual de cada campo, según sea su requeri-miento; 3 Puede formar una base de datos de campos por área de análisis, administrando el grupo de campos que está capturando, organi-zándolos en diferentes carpetas de trabajo; y 4 El usuario tiene la posibilidad de realizar un pro-ceso de mejoramiento individual de las imágenes capturadas de los campos, corriendo el subpro-ceso de procesamiento de campo para un campo en particular, mismo que podrá ser alimentado individualmente al proceso de análisis En resu-men, este modo de operación permite al usuario procesar un campo en particular según las ne-cesidades requeridas; controlando cada proceso y subproceso individualmente, el usuario decide que subproceso correr; por otro lado, todos los procesos seleccionados son ejecutados en el mis-mo equipo de trabajo

En la figura 11 se muestra el diagrama de pro-cesos del modo de operación de campo unitario La laminilla con la muestra es montada en el mi-croscopio, después el usuario decide qué campo capturar, esto se realiza mediante el control de la platina por medio del joystick de movimiento, ubicándose en una coordenada x/Y; la captura del campo será realizada de acuerdo a los pará-


metros de control del modo de adquisición en Z, de esta manera comenzará la captura automá-ticamente; posteriormente, el usuario decide el tipo de análisis que le será realizado al campo, previamente capturado, dentro del proceso de análisis Luego, el usuario podrá capturar otro campo de la misma muestra o, en su defecto, co-locar y alimentar otra laminilla con otra muestra Todos los campos capturados serán almacenados en sus respectivas carpetas en algún formato di-gital Por conveniencia, el formato de trabajo es BMP

Mosaico (proceso no distribuido)

Este modo de operación está diseñado para operar automáticamente El usuario solamente define dos puntos inicialmente de captura en la muestra, un punto superior izquierdo y el otro punto en la parte inferior derecha de la lámi-na Así, con estas dos coordenadas dentro de la muestra se define un área de adquisición de campos, los cuales serán capturados de acuerdo a los parámetros seleccionados de los modos de

adquisición, explicados más adelante Dentro de las bondades de este modo de adquisición está la factibilidad para procesar grandes volúmenes de información, sin cargar a la computadora con un gasto sumamente grande de memoria, como ocurría con el modelo propuesto por Pech Pa-checo et al (2001) al formar el mosaico En este modo se capturan los campos formando un mo-saico virtual, esto significa que el mosaico forma-do no es integrado físicamente en la memoria, como lo realizaba el modelo anterior El modelo de Pech Pacheco et al. (2001) unía cada campo para formar una matriz sumamente grande en memoria, a esta matriz se le llamaba mosaico; de ahí —como se ha mencionado— se procesaba el mosaico Sin embargo, en este modo —de igual forma que en el modelo anterior— se forma el mosaico, pero integrado en el medio de almace-namiento secundario y sólo se carga a memoria el campo que se esté procesando en ese momen-to; esto trae como consecuencia que se puedan procesar mosaicos de N x M campos de cualquier resolución y tamaño, sin tener que contar con una memoria de RAM muy grande, sólo la nece-

Figura 11

Laminillai-ésima

Campoi-ésimo

1, 2, …, n

PROCESO DE ADQUISICIÓN

InicioAdquisición del

Campo

ControlZ

ControlX/Y

Procesamiento de Campo

Corrección IluminaciónAutoenfoque

Fusión

Almacenamientodel

Campo(Formato Libre)

PROCESO DE ANÁLISIS

Identificacióndel

Campo

Localizaciónde

Partículas

Segmentacióndel

Campo

Fin

Figura 11. Diagrama de procesos del modo de Operación de Campo Unitario.


saria para poder procesar los campos individua-les que forman la matriz del mosaico El equipo utilizado en la experimentación y desarrollo de esta plataforma contiene 1 Gb de memoria, una cantidad de memoria que puede ser accesible en la actualidad

Sin embargo, la desventaja de este modo de operación es la necesidad de contar con medios de almacenamiento secundario muy grandes, alrededor de 100 a 150 Gb, para procesar una muestra Desventaja que ha sido solucionada con la aparición de los nuevos discos de almace-namiento secundario de hasta 450 Gb

En la figura 12 se muestra el diagrama de procesos del modo de operación de mosaico con proceso no distribuido En este modelo no se integra realmente el mosaico No es necesario realizar el subproceso de corrección de ilumi-nación, debido a que cada campo es procesado individualmente y por lo tanto hay un ahorro de tiempo Los subprocesos de autoenfoque y fu-sión corrigen la imagen final; así, la imagen que

fue obtenida puede entrar al proceso de análi-sis sin ningún problema, para continuar con la estrategia de análisis definida para la partícula biogénica que se está adquiriendo

Por último, una de las ventajas que tiene este modelo actual es la factibilidad de poder pro-gramar cómo se van a adquirir los campos de la muestra, tanto en x/Y como en Z, con el objeti-vo de tener una imagen final de mayor calidad

Mosaico (proceso distribuido)

Este modo de operación (figura 13) integra to-das las ventajas de los dos modos anteriores Por un lado, realiza el procesamiento de campos in-tegrando el mosaico virtual y por el otro, es un modo de procesamiento completamente auto-mático

Dicho modo es una de las mayores contribu-ciones desde la perspectiva de la aplicación de este trabajo El modo está diseñado para operar automáticamente y con procesos ejecutados en

Figura 12

Laminillai-ésima

Campoi-ésimo

1, 2, …, n

PROCESO DE ADQUISICIÓN

InicioAdquisición del

Campo

ControlZ

ControlX/Y


AutoenfoqueFusión

Almacenamiento deImágenesMosaico

(Formato IMC)


Identificacióna partir delMosaico

Localizacióny

Etiquetación

Segmentacióndel

Mosaico

Fin

MosaicoIntegración Lógica

Figura 12. Diagrama de procesos del modo de Operación de Mosaico (proceso no distribuido).


forma distribuida, lo cual significa que se pueden estar capturando campos desde el microscopio, mientras que en otra computadora se están pro-cesando los campos capturados, y en otra más se podrían estar analizando los mosaicos ya mejo-rados

Otra bondad de este modelo es la posibili-dad de adquirir muestras vía un alimentador de laminillas Es posible colocar todas las muestras que se desean analizar en el magazín del alimen-tador y, con la plataforma, podrían adquirirse una a una cada laminilla hasta producir todas las imágenes de cada laminilla En la actualidad sólo se puede procesar una laminilla a la vez, sin embargo en el diseño estructural del modo de operación está definido el poder integrar un con-trol de este tipo

La inicialización de este modo de opera-ción es sumamente sencilla, solamente se define el área de adquisición promedio que será ana-lizada de las muestras, vía la definición de dos puntos que conformará el área de análisis; pos-

teriormente se define de cuántas imágenes será integrado el mosaico virtual, prosiguiendo con la definición, si se desea, de una captura en Z para cada campo, con el propósito de ejecutar un pro-ceso automático de autoenfoque y fusión para cada campo que entrará al proceso de análisis

Otros parámetros adicionales son: la defini-ción del objetivo de captura y por último se rea-liza un proceso de inicialización de los límites de movimiento del microscopio para el movimiento en x/Y y el recorrido en Z, posteriormente se coloca la laminilla y automáticamente la plata-forma capturará las imágenes respectivas de la laminilla analizada

Desde de la perspectiva práctica del labora-torista encargado de procesar las muestras bajo el microscopio, este modelo es un avance signi-ficativo en la captura de imágenes Actualmente los encargados del área tardan mucho tiempo en revisar toda la laminilla y en muchas ocasiones se pueden escapar a la visión algunas áreas de interés

Figura 13

Laminillai-ésima

Campoi-ésimo

1, 2, …, n

PROCESO DE ADQUISICIÓNInicio

Adquisición del Campo

ControlZ

ControlX/Y


AutoenfoqueFusión

Almacenamiento deImágenesMosaico

(Formato IMC)


Fin

MosaicoIntegración Lógica

Banco de ImágenesMosaico

Distribuidas

Imageni-ésima

delBanco

Análisisdel Banco

Identificación apartir delBanco

Figura 13. Diagrama de procesos del modo de Operación de Mosaico (proceso distribuido).


Así, para que el lector tenga una idea de lo que implica la búsqueda de una partícula típica, imagine que el área de una cancha de balonces-to es una muestra típica de histología que va a ser analizada, en donde se anda buscando una pelota de ping pong (equivalente a la búsque-da de un patógeno o una patología x), lo único que se puede observar a la vez de la cancha es el área de una lupa de 12 cm de diámetro con la que se revisará la cancha (equivalente al objetivo x) Como puede suponer, simplemente recorrer toda la cancha sería ya un problema, revisarla es otro problema mayor; pero si se le agrega que la pelota de ping pong puede estar elevada en el aire y con la lupa sólo puede observar 5 cm de altura en cada posición que se revise, entonces se necesitaría que la lupa recorriera diferentes alturas desde el piso para visualizar otras alturas Ahora imagine que la pelota de ping pong puede estar en una altura entre los 0 metros y los 2 5 metros El problema de revisión es sumamente agotador En la actualidad, así es como el perso-nal de laboratorio realiza el proceso de revisión cuando se identifican en un campo las partículas buscadas Por ejemplo, células infectadas con bacterias, cuerpos de inclusión de virus, etc Sig-nificaría que la cancha hipotética de baloncesto está prácticamente saturada de pelotas de ping pong Conclusión: el paciente está infectado o el tejido presenta una incidencia muy alta de pató-genos

A continuación se plantea una pregunta, ¿qué pasaría si la infección está en sus inicios?, es decir sólo hay un número mínimo de pelotas de ping pong en nuestra cancha, ¿cómo identifi-caría el personal de laboratorio esas partículas? La respuesta es simple: con los métodos de bús-queda actuales hay que realizar una búsqueda minuciosa, y a veces las pocas pelotas de ping pong se pueden escapar a la búsqueda en la la-minilla

Por lo tanto, este desarrollo realiza toda esa búsqueda y captura de forma automática, lo que se traduce en un ahorro considerable de esfuerzo, y sobre todo es una herramienta que puede ayudar a los expertos a ser más producti-vos, significando la posibilidad de detectar más rápidamente posibles cambios patológicos o simplemente tener la capacidad de procesar más muestras

II.2. Modos de adquisición

Los modos de adquisición son los controles que contiene la plataforma para la captura de campos desde el microscopio para los movimientos en x/Y y Z, además controlan la forma de compor-tamiento de los servomotores del microscopio Otra función es la de controlar los subprocesos de autoenfoque y fusión sobre una nomenclatura de nombres de campos previamente creada; esto es: cuando se selecciona alguno de los modos de adquisición, los archivos de las imágenes captu-radas se guardarán con un nombre específico de acuerdo a una nomenclatura previamente dise-ñada Por ejemplo, si se utiliza el modo de adqui-sición 1Z (0 mm ), la nomenclatura utilizada será el nombre de archivo que el usuario proveyó con una terminación “_001”, el cual indica que sólo hay un campo en Z y es el número 001

Así, dentro de la plataforma desarrollada hay tres modos de adquisición para el movimiento en Z y dos modos de adquisición para el movimien-to en x/Y de la platina

Modos 1 Z (0 mm ) y 1 Z (autoenfoque por sistema)

Estos dos modos de adquisición capturan sólo una imagen del campo en donde esté ubicado en x/Y el microscopio en ese momento, el modo 1 Z (0

mm ) adquiere un solo campo ubicado en el foco, donde previamente el usuario busca manualmen-te el foco de la muestra

En el modo 1 Z (autoenfoque por sistema), se captura de forma similar que en el modo ante-rior sólo un campo, la diferencia estriba en que el sistema realiza una búsqueda de la altura en Z, donde se encuentre el foco; sin embargo, la platina debe ser colocada manualmente a una altura en Z de referencia, próxima al foco El al-goritmo de control del autoenfoque del sistema tiene un comportamiento similar a un autoen-foque por análisis de varianza, sin embargo no son proveídos los algoritmos en que se basan las rutinas de autoenfoque del microscopio Leica (es un sistema cerrado) En pruebas realizadas el algoritmo no es robusto, la ubicación en Z se perdió al buscar el foco y el tiempo de enfoque fue sumamente largo para una muestra simple bien contrastada


Estos dos modos de control son para operar capturas de muestras rápidamente Usualmente son seleccionados estos modos cuando se utili-za con el modo de operación de campo unitario, es decir cuando el usuario desea capturar una muestra que está observando en ese momento

Modo n Z (Multifoco)

Este modo es otra contribución importante, el modo n Z (Multifoco) está diseñado para asegu-rar dos aspectos importantes: el primer aspec-to asegura que la imagen mejor enfocada será la obtenida por el subproceso de autoenfoque, donde ésta va a contener la información más re-levante de la muestra y además la mejor calidad visual; el segundo aspecto es que se asegura que a la partícula analizada se le capturen todos los planos focales necesarios para obtener la infor-mación total necesaria para el análisis

Una de las bondades de este modo es que no se necesita una Z de referencia que tenga que ser alimentada cada vez que se captura un campo, sólo es necesario proveer los límites del recorrido en Z de la platina y el foco de la mues-tra inicial que se vaya analizar; sin embargo, cabe mencionar que el proveer el foco es sólo por ra-zones de eficiencia, realizándose sólo una vez en la inicialización del microscopio

En la figura 14 se muestra el diagrama de operación de este modo de adquisición La ba-rra azul indica el recorrido en Z de la platina, recorriendo desde las -12,000 mm (12 mm, par-te inferior hasta las +120 mm (parte superior), con 0 mm en el foco ZF inicial Por lo tanto, inicialmente se indican tres valores en el control interno del microscopio: el primer valor, el lími-te inferior de recorrido de la platina ZE (-12,000

mm ); el segundo valor, límite superior ZI (+120 mm ) y el tercer valor, el foco inicial de la muestra ZF (0 mm ), los valores inicializados son posiciones absolutas dentro del “hardware” del microscopio

La idea primordial en el diseño de este modo es que el microscopio hiciera un barrido fino en la región definida como región de captura fina (donde se encuentra la muestra), delimitada por CFI y CFE (en esta región el paso de cap-tura es proveído por el usuario en el orden de

*0.1 1.0ZD≤ ≤ mm , dependiendo de las caracte-rísticas de la partícula) El espesor de la región de captura fina CFR también es alimentado por el usuario, esto con el objetivo de controlar qué tantas imágenes van a ser capturadas a partir del grosor de esta región; un valor típico del tamaño de la región de captura fina es *2CF CF MR R G= + um , donde * 20CFR = um

Otro valor que también es suministrado por el usuario en ZN es el número de planos total

Figura 14

Figura 14. Modo de adquisición n Z (Multifoco).


en Z que desea capturar para un campo (valores típicos son 100 planos focales); sin embargo si el usuario provee un número menor de planos a capturar, el sistema ajusta al mínimo valor de planos que deben ser capturados, para asegurar la integridad del subproceso de autoenfoque y de fusión

Por último, el grosor promedio de la muestra analizada debe ser proveído por el usuario, esto para calcular todas las demás variables que debe utilizar el modo para adquirir imágenes en Z El grosor está representado por la variable MG

Una vez proveídas las variables mencionadas, las siguientes variables son calculadas: la primera es posición inicial en Z de la partícula, dada por

2M

OBJ ZGI F= + ; el límite donde termina el cuerpo de la

partícula calculado por OBJ OBJ ME I G= − ; el inicio de la región de captura fina, dada por *

CF OBJ CFI I R= + ; el final de la región de captura fina, *

CF OBJ CFE E R= − y por último el límite de captura en Z, calculado por 200Z ZL F= −

Dos regiones adicionales son barridas, las regiones 1 y 2, en las cuales también se realiza una captura de campos, sólo que el paso en Z es mayor que en la región fina Las ecuacio-nes que calculan estas regiones son

*CF

CFZ

RND

= ,

Región 1 Región 2 2Z CFN NN N −

= =

Modo X/Y

Una vez definidos los parámetros de control de Z, se capturan los planos focales; sin embargo, todo el proceso mencionado anteriormente es ejecutado para una sola posición en x/Y, es de-cir: si se van a capturar 100 campos en Z, será sólo para un punto en la muestra en x/Y, por lo tanto la plataforma integra otro modo de adqui-sición para el control de los desplazamientos en x/Y

Para este modo hay dos variantes: la primera es proveer los puntos iniciales ( , )I IX Y , ( , )F FX Y y el número de campos deseados que se quieren

capturar en x y Y, así el espaciamiento entre

x y Y estará calculado por .F IX Xx

Núm Campos X−

D =

y .F IY Yy

Núm Campos Y−

D = respectivamente; la otra variante del modo es decirle al sistema que

0x yD = D = , por lo tanto se capturarán el nú-mero de campos seleccionado, sólo que a par-tir de ( , )I IX Y , con la posibilidad de no llegar a capturar hasta el punto ( , )F FX Y En la figura 15 se muestran las variables referenciadas anterior-mente

Figura 15

II.3. Interfase de control

Básicamente, todo el control de lo mencionado anteriormente está integrado en una interfase que el usuario puede manipular En la figura 16 se muestra la interfase de control de la plataforma computacional

Cinco secciones están contenidas en la inter-fase: la primera sección es utilizada para la ini-cialización de la platina; la sección dos es para la selección del modo de adquisición para Z; la sec-ción tres controla el modo de adquisición para x/Y y el objetivo de captura; la sección cuatro es para la identificación de los campos en el medio de almacenamiento y la carpeta o directorio don-de serán almacenadas las imágenes; y por último, la sección cinco es para controlar manualmente la posición de la platina Brevemente se explica-rán los controles de la interfase para operar la adquisición de imágenes en los diferentes modos de operación mencionados anteriormente

Figura 15. Modo de adquisición en X/Y.


Sección 1

En la figura 17 se muestra la primera sección de control En esta sección se inicializa el micros-copio y platina Los botones de control son los siguientes: el botón de Inicializar Platina identi-fica el área de movimiento de la platina en x/Y; los botones Pos. Final y Pos. Origen son utilizados para identificar el área de análisis de la muestra; el botón Definir Foco es utilizado para identificar el foco de la muestra que se va a analizar; los botones Moverse al Foco y Mover Z Final son uti-lizados para mover la platina y revisar que las po-siciones previamente definidas estén bien identi-ficadas por el microscopio; por último, el botón Cargar nueva Muestra se utiliza para cuando se

ha terminado de capturar imágenes de la mues-tra anterior y se desea colocar otra muestra, así mediante este botón no se pierde la inicialización previamente realizada Este procedimiento sólo se realiza al inicio de un conjunto de capturas, desde un laminilla hasta n laminillas

En el caso de muestras con formas diferen-tes, hay que escribir de nuevo la posición final y la posición del origen

Sección 2

En la figura 18 se muestra la segunda sección de control En esta sección se controla el modo de

Figura 16

1

2

3

4

5

Figura 16. Interfase de control de la plataforma computacional.

Figura 17

Figura 17. Interfase de control, sección primera.


adquisición para Z Los tres modos de adqui-sición para Z descritos anteriormente pueden ser controlados desde esta sección, marcando cualquiera de las cajas de selección (check box-es) Donde está la leyenda 1 Z, serían respectiva-mente la adquisición de una imagen solamente en Z, Tomada en el Foco y la adquisición vía el Au-toenfoque del Sistema Sí no hay marca en las cajas de selección, como se muestra en la figura, la op-ción de nZ (Multifoco) es seleccionada, donde se muestran los cuatro parámetros explicados pre-viamente respecto a este modo de adquisición: uno es el grosor de la muestra MG ; el grosor de la región fina, tanto antes como después de la par-tícula, usualmente definida por * 20CFR = um ; el incremento en Z para la captura del siguiente plano focal *0.1 1.0ZD≤ ≤ y por último el número de planos que se desean capturar en todo el re-corrido de Z, la variable ZN Así, suministrando estos parámetros, el sistema calcula y despliega el grosor de la Región 1 y 2, el número de pla-nos mínimo que se capturarán, en el caso que no sean suficientes los suministrados por el usuario,

el número de planos que serán capturados en la región fina y en la región no fina (región 1 y 2)

Sección 3

En la figura 19 se muestra la tercera sección de la interfase En esta sección se controla el modo de adquisición en x/Y Para controlar x/Y con una separación 0x yD = D = , marcar el control Mosai-co con DELTA.X y DELTA.Y = 0, haciendo que la platina se comporte de acuerdo a lo mencio-nado, es decir captura una matriz de campos sin separación entre ellos Por otro lado, el control del número de campos que van a ser capturados en la matriz de campos, se inicializa por medio de los cuadros de texto Número de Campos en X y Número de Campos en Y

Dependiendo de la amplificación que se de-sea utilizar para el análisis de la muestra, se uti-lizan los botones 5x, 10x, 40x, 63x y 100x, sólo hay que presionar el botón correspondiente para seleccionar el objetivo respectivo para la adqui-sición de las imágenes

Figura 18

Figura 18. Interfase de control, sección segunda.

Figura 19

Figura 19. Interfase de control, sección tercera.


Cuando se inicializan los controles respecti-vos, el sistema responde mostrando el valor de

xD y yD , calculados de acuerdo al objetivo uti-lizado y a los puntos del área de barrido de la muestra, seleccionados en la sección 1

Sección 4

En la figura 20 se muestra la cuarta sección de control En esta sección se controla la forma en que se identifican los campos grabados en el medio de almacenamiento El usuario puede utilizar un prefijo para el nombre de la muestra y el sistema completará el nombre completo, de acuerdo a los parámetros seleccionados ante-riormente por el usuario

Otra información mostrada en la sección es la del directorio o carpeta que, por configu-ración, el sistema utiliza para la ubicación de todos los archivos capturados Por último, se muestra el tiempo utilizado en la captura, con el fin de calcular los tiempos para la alimentación de muestras adicionales Los otros controles no

Figura 20. Interfase de control, sección cuarta.

Figura 20

Figura 21

Figura 21. Interfase de control, sección quinta.

mencionados son utilizados para aplicaciones es-peciales no incluidas en este escrito

Sección 5

En la figura 21 se muestra la quinta sección de control En esta sección se controlan los movi-mientos de la platina por la asignación de coor-denadas, usualmente esta sección es para que el usuario se posicione en una partícula que previa-mente ya había sido identificada; así, proveyen-do las coordenadas en x, Y y Z, se puede ubicar en una localización en el espacio

El botón de Actualizar coordenadas es sólo para visualizar las coordenadas actuales de la platina y por consiguiente su ubicación, es sólo un botón de notificación de coordenadas El bo-tón de Capturar Muestra es utilizado para la cap-tura del campo actual de la muestra analizada Los otros controles no mencionados son utiliza-dos para aplicaciones especiales no incluidas en este escrito


III. Bibliografía

Álvarez-Borrego, Josué y María Cristina Chávez Sánchez (2001) “Detection of IHHN virus in shrimp tissue by digital color correlation”. Aquaculture, 194(1-2): 1-9

Álvarez-Borrego, J , R Mouriño Pérez, G Cris-tóbal Pérez y J Luis Pech Pacheco (2002) “Invariant recognition of polychromatic ima-ges of Vibrio cholerae 01”. Optical Enginee-ring, 41(4): 827-833

Álvarez-Borrego, J, y E Castro-Longoria (2003) “Discrimination between Acartia (Copepo-da: Calanoida) species using their diffrac-tion pattern in a position, rotation invariant digital correlation” Journal of Plankton Re-search, 25(2): 229-233

Bueno Ibarra, Mario Alonso (2005) “Desarro-llo de una Tecnología Sistematizada para la Adquisición de Partículas Biogénicas” Tesis de doctorado Escuela Superior de Ingenie-ría Mecánica y Eléctrica Unidad Culhuacán (ESIME), Instituto Politécnico Nacional (IPN), A030369, México, 2 de junio

Pech Pacheco, J L , Gabriel Cristóbal, J Álva-rez-Borrego y Cohen-León (2001) “Automa-tic System for Phytoplanktonic Algae Identi-fication”. Limnética, 20(1): 143-158

Pech Pacheco, J L , Josué Álvarez-Borrego, Ga-briel Cristóbal y Matthias Keil (2003) “Au-tomatic object identification irrespective to geometric changes” Optical Engineering, 42(2): 551-559

Russ, J C (1995, 2ª ed ) The Image Processing Handbook CRC Press, Inc , Boca Raton, Florida

capítulo 10Autoenfoque y fusión

Josué Álvarez BorregoMario Alonso Bueno Ibarra


I. Introducción

Una de las problemáticas asociadas a la captu-ra de imágenes en microscopía es la determina-ción de la imagen mejor enfocada de un grupo de imágenes tomadas en diferentes posiciones en Z Así, cuando se trata de obtener la imagen del espécimen de mejor calidad, es decir aquella que reúna las mejores características de infor-mación para su análisis, debe realizarse un pro-ceso de enfoque Este proceso consiste en mover manualmente la platina en la dirección Z, hacia arriba o hacia abajo, hasta encontrar la imagen con la mejor calidad visual Sin embargo, en este capítulo se propone un sistema automático de adquisición de imágenes, por lo que es necesa-rio que el sistema realice en primera instancia, el proceso de enfoque automáticamente Por lo tanto, para realizar este proceso es necesa-rio contar con algún algoritmo computacional o electrónico; este algoritmo es llamado algoritmo de autoenfoque (enfoque automático)

Se ha desarrollado previamente una varie-dad de metodologías para realizar el autoenfo-que (Groen et al., 1985; Krotkov, 1987; Firestone et al., 1991; Subbarao y Nikzad, 1993; Yeo et al., 1993; Bocker et al., 1996) Estos métodos utili-zan diferentes estrategias para obtener la ima-gen mejor enfocada de un conjunto de imágenes Dentro de estas estrategias tenemos las siguien-tes: el análisis de varianza global y varianza local en imágenes monocromáticas para medir el nivel de contraste (Pech et al., 2001); el uso de opera-dores que se basan en el cálculo de la primera y segunda derivada (gradientes), para medir el nivel de nitidez de las imágenes (Tenenbaum, 1970; Schlag et al., 1983; Krotkov, 1987; Bodde-

ke et al., 1994; Ellenberger y Young, 1998; Gon-zález y Woods, 2002); el análisis de varianza del gradiente de las imágenes (Pech-Pacheco y G Cristóbal, 2000) y el análisis del contenido de frecuencias espaciales de las imágenes (Brigham, 1988; Russ, 1995; González y Woods, 2002) To-das estas metodologías han probado ser efectivas para obtener la imagen mejor enfocada; sin em-bargo, estos algoritmos utilizan un tiempo consi-derable para obtener la imagen en foco cuando a las imágenes que se están analizando se les au-menta la resolución

En este capítulo se presenta una nueva me-todología computacional para realizar el proce-so automático de enfoque en imágenes de alta resolución, en un tiempo satisfactorio El algo-ritmo está basado en el análisis espectral de las imágenes, utilizando la transformada unidimen-sional de Fourier, para construir una medida de enfoque, y la correlación de Pearson, para obte-ner de esta medida de enfoque la imagen mejor enfocada

En las secciones de este capítulo se describi-rán los algoritmos que fueron incluidos para rea-lizar los experimentos computacionales, prove-yendo el análisis matemático respectivo de cada uno de ellos Por su relevancia se seleccionaron algunos de los algoritmos de las metodologías mencionadas anteriormente La estrategia uti-lizada para desarrollar este tema será explicar cómo está estructurado matemáticamente cada algoritmo y, posteriormente, realizar los experi-mentos computacionales con el objetivo de ob-tener como medida de calidad del algoritmo el tiempo de ejecución y el de la imagen obtenida

Sólo para situar al lector, este algoritmo está ubicado dentro del proceso automático de


adquisición de imágenes en el bloque de Proce-samiento de Campo, y es uno de los algoritmos medulares de este trabajo, ya que provee la ima-gen semifinal de mejor calidad visual y de infor-mación Otro aspecto importante es que este algoritmo provee la imagen inicial desde donde partirá el algoritmo de fusión para construir la imagen final, la cual es analizada y contiene la máxima cantidad de información que el sistema podrá utilizar

Por último, el diseño de este algoritmo es una de las contribuciones principales de nuestro gru-po de trabajo (Bueno-Ibarra et al. 2005a, 2005b), aportando material escrito sustentado matemáti-camente en el área de la ciencia básica respectiva y un desarrollo computacional integral, acorde a las técnicas y metodologías de las ciencias com-putacionales, en el área de la ciencia aplicada

II. Algoritmos de autoenfoque

En esta sección se describirán matemáticamente las metodologías utilizadas para realizar el pro-ceso de autoenfoque

Análisis de la varianza global (GBL vAR) El método utiliza la intensidad de la variación de los píxeles para construir una medida de enfoque, así la imagen de mayor variación en la intensidad de los píxeles o mayor contraste será la que presente el mejor enfoque

Diferenciación Se cuenta con tres algoritmos que utilizan operadores basados en la primera y segunda derivada: el primer algoritmo, llamado algoritmo de Tenengrad (SOB-TEN), desarrolla-do en los años setenta por Tenenbaum y basado en el cálculo de la primera derivada, por medio de la obtención de la magnitud del gradiente del operador de Sobel, es considerado como uno de los mejores algoritmos en su tiempo (Schlag et al., 1983; Krotkov, 1987); el segundo también pertenece al grupo de algoritmos que calculan la primera derivada y fue desarrollado por Bo-ddeke (BOD) en 1994, el método se basa en el cálculo de la magnitud del gradiente por medio de una máscara de convolución a lo largo del eje x de la imagen, este método es considera-do extremadamente simple y provee una medida de enfoque bien definida (Ellenberger y Young, 1998); por último, el algoritmo basado en el cál-

culo del operador Laplaciano (LAP) o sea la se-gunda derivada, donde se explota el análisis de las altas frecuencias debido a los bordes encon-trados dentro de las imágenes, presentado por Rosenfeld y Kak en 1982

Análisis de la varianza del gradiente Una es-trategia complementaria es el cálculo de la va-rianza de la magnitud de los gradientes, ésta in-crementa la discriminación entre imágenes y la robustez con respecto al ruido Dos algoritmos aprovechan esta estrategia: el primero, el cálculo de la varianza del algoritmo de Sobel-Tenenbaum (SOB-TEN vAR), descrito por Pech-Pacheco et al. (2001); con el segundo algoritmo, basado en el cálculo de la varianza del gradiente Laplacia-no (LAP vAR), se obtienen la misma robustez y tolerancia al ruido, también presentado por Pech-Pacheco et al. (2001)

Análisis espectral (P CORR) Dentro de esta estrategia, el presente trabajo propone un nuevo algoritmo de autoenfoque, basado en el análisis espectral de un conjunto de vectores distribui-dos de forma equidistante, dentro de la imagen analizada, obteniéndose la transformada unidi-mensional de Fourier de estos vectores Así, para formar una medida del enfoque se obtienen las transformadas de Fourier de los vectores de una imagen de referencia; usualmente es la prime-ra imagen capturada, ya que presenta el máxi-mo desenfoque Estos vectores transformados son comparados, por medio de la correlación de Pearson, con los vectores de las imágenes sub-secuentes La medida del enfoque se construye por medio del índice de correlación de Pearson, el cual indica el grado de similitud entre los vec-tores de las imágenes comparadas Por lo tanto, los vectores transformados de la imagen mejor enfocada presentarán altas frecuencias, mien-tras que la imagen de referencia contiene las fre-cuencias más bajas; así el coeficiente de Pearson tendrá el valor numérico más bajo, ya que son las imágenes que tienen menos similitud: una com-pletamente desenfocada y otra completamente enfocada De esta manera, si se utiliza como medida de enfoque la descorrelación, es decir el complemento de la correlación, la imagen mejor enfocada será aquella que presente una desco-rrelación más alta con respecto a la imagen de referencia (imagen más desenfocada de todo el conjunto de imágenes analizado) Una de las

195Autoenfoque y fusión

ventajas de este algoritmo es que no es necesa-rio procesar la imagen completa, sino sólo un conjunto de columnas (vectores) distribuidas a lo largo del eje x , haciendo de éste un algorit-mo sumamente rápido en tiempo de ejecución, adecuado para trabajar con imágenes de alta re-solución Un aspecto medular de este algoritmo es la explotación de la transformada de Fourier para obtener el análisis de frecuencias de cada imagen, así entre más altas frecuencias estén presentes en la imagen, mejor será el enfoque de la misma

II.1. varianza global (GBL vAR)

Antes de comenzar con la definición del algorit-mo de varianza global, es conveniente asentar algunas notaciones útiles, definiciones y funcio-nes que serán utilizadas: sea kffff ,,,, 321 las imágenes de una pila, conteniendo k imágenes capturadas por medio del CCD de tamaño NxM píxeles, de una muestra capturada a incrementos

zD en la dirección del eje Z del microscopio; sea ( )kyxf , la imagen digital capturada con píxeles

( )yx, de la k-ésima thk , dentro de la pila de imá-genes construida, donde Nx ,..,1= , My ,..,1= y

Kk ,,1= Sea Η el vector de números reales, don-

de ℜ∈Η con un número de elementos Λ , los cuales están ordenados ascendentemente con respecto a sus valores La función máxima del vector )ˆ(ΗMAX y la función mínimo )ˆ(ΗMIN pueden ser definidas respectivamente, como

(1)

(2)

La función de normalización de un vector dado )ˆ(ΗN , puede ser expresada como

(3)

donde [ ]1,0)ˆ( →ΗN es el vector resultante con valores normalizados; la función entero w de un número puede ser expresada como

(4)

donde Z representa el conjunto de número en-teros

En esta estrategia, la imagen mejor enfoca-da será aquella que presente una variación más pronunciada en la intensidad de los píxeles, así la imagen con mayor contraste será la imagen me-jor enfocada dentro de la pila de imágenes En este contexto, si se calcula la varianza global GVk de cada imagen fk, el valor GVk obtenido puede ser usado para construir una medida de enfoque, donde la imagen mejor enfocada fBF tendrá el va-lor GVk máximo o mayor calculado, así fBF puede ser obtenida por

(5)

donde kGVFM es un vector de valores GVk, calculados para cada imagen kf Así kGVFM puede ser obtenida mediante el cálculo de la varianza local LV(n,m)k de una ventana des-lizante de tamaño wx × wy para cada píxel (n,m) dentro de f(n,m)k , así wx y wy están de-finidos por wx = {2ξ1 + 1|ξ1∈Z+, 2ξ1 + 1 < N }, wy = {2ξ2 + 1|ξ2∈Z+, 2ξ2 + 1 < M }, donde Z+={t|t ∈ Z, t > 0 } y sean ξ1, ξ2 las variables utilizadas para definir el tamaño de la ventana deslizante La varianza local LV(n,m)k puede ser calculada para cada desplazamiento efectuado por la ventana deslizante al moverse a través de la imagen f(n,m)k, por lo tanto LV(n,m)k es cal-culada por

(6)

donde ( , )kLVP n m es el valor de la media de la intensidad de los píxeles de la ventana deslizante, centrada en ( )mn, , ( , )kLVP n m es expresada por

(7)

donde 2121 ,,, yyxx wwww son los valores que de-limitan los píxeles que estarán contenidos dentro de la ventana deslizante, calculados por la ec (6)

( ){ }1,,2,1,ˆ,)ˆ( 1 −Λ=Η∈≤=Η +Λ ihhhhMAX iii

( ){ }1,,2,1,ˆ,)ˆ( 11 −Λ=Η∈≤=Η + ihhhhMIN iii

( )

Λ=Η∈Η−Η

Η−=Η ,,2,1,ˆ

)ˆ()ˆ(

ˆ)ˆ( ih

MINMAXMINhN i

i

3

Sea ˆ el vector de números reales, donde ˆ con un número de elementos , los cuales están ordenados

ascendentemente con respecto a sus valores. La función máxima del vector )ˆ(MAX y la función mínimo

)ˆ(MIN pueden ser definidas respectivamente, como

1,,2,1,ˆ,)ˆ( 1 ihhhhMAX iii , (1)

1,,2,1,ˆ,)ˆ( 11 ihhhhMIN iii . (2)

La función de normalización de un vector dado )ˆ(N , puede ser expresada como

,,2,1,ˆ)ˆ()ˆ(

ˆ)ˆ( ih

MINMAXMINhN i

i , (3)

donde 1,0)ˆ(N es el vector resultante con valores normalizados; la función entero de un número puede ser expresada como

1,, , (4) donde representa el conjunto de número enteros. En esta estrategia, la imagen mejor enfocada será aquella que presente una variación más pronunciada en la intensidad de los pixeles, así la imagen con mayor contraste será la imagen mejor enfocada dentro de la pila de imágenes. En este contexto, si se calcula la varianza global kGV de cada imagen kf , el valor kGV obtenido, puede

ser usado para construir una medida de enfoque, donde la imagen mejor enfocada BFf tendrá el valor kGV

máximo o mayor calculado, así BFf puede ser obtenida por

BF k kf f donde MAX N GVFM , (5)

donde kGVFM es un vector de valores kGV , calculados para cada imagen kf . Así kGVFM puede ser obtenida,

mediante el cálculo de la varianza local kmnLV , de una ventana deslizante de tamaño yx para cada píxel

,n m dentro de kmnf , , así x y y están definidos por Nx 12,12 111 ,

My 12,12 222 , donde 0, y sean 21, las variables

( )( ){BF k kf f donde MAX N GVFM=

4

utilizadas para definir el tamaño de la ventana deslizante. La varianza local kmnLV , puede ser calculada para

cada desplazamiento efectuado por la ventana deslizante al moverse a través de la imagen kmnf , , por lo tanto

kmnLV , es calculada por

2 2

1 1

21, , ( , )( ) 1

x y

kk ki x j yx y

LV n m f i j LVP n m , (6)

donde ( , )kLVP n m es el valor de la media de la intensidad de los píxeles de la ventana deslizante, centrada en

mn, , ( , )kLVP n m es expresada por

2 2

1 1

1( , ) ,( )

x y

k ki x j yx y

LVP n m f i j , (7)

donde 2121 ,,, yyxx son los valores que delimitan los píxeles que estarán contenidos dentro de la ventana

deslizante, calculados por la Ec. (6) y Ec. (7). Sean 21x ,

22y las variables de control hasta donde

se puede desplazar la ventana deslizante, por lo tanto 2121 ,,, yyxx pueden ser calculadas por las siguientes ecuaciones

2212

2111

mynxmynx

, (8)

procesándose la ventana deslizante para cada píxel mn, , dentro de la imagen kmnf , , por lo tanto los píxeles

mn, utilizados a través de la imagen kmnf , , pueden ser calculados por las siguientes expresiones, respectivamente

1111 ),1(,,2,1 NNn , (9)

2222 ),1(,,2,1 MMm . (10) La medida de enfoque construida por medio de los valores obtenidos de la varianza global calculada por cada una de las k imágenes procesadas kGVFM , puede ser entonces expresada por la siguiente ecuación

F

I

F

I

n

np

m

mqkkk LVqpLVGVFM

2

21

,1)(

1, (11)

4




2 2

1 1

21, , ( , )( ) 1

x y

kk ki x j yx y




2 2

1 1

1( , ) ,( )

x y

k ki x j yx y

LVP n m f i j , (7)





2212

2111

mynxmynx

, (8)



1111 ),1(,,2,1 NNn , (9)


F

I

F

I

n

np

m

mqkkk LVqpLVGVFM

2

21

,1)(

1, (11)


y ec (7) Sean , las variables de

control hasta donde se puede desplazar la venta-na deslizante, por lo tanto, wx1, wx2, wy1, wy2, pue-den ser calculadas por las siguientes ecuaciones

(8)

procesándose la ventana deslizante para cada píxel ( )mn, , dentro de la imagen ( )kmnf , , por lo tanto los píxeles ( )mn, utilizados a través de la imagen ( )kmnf , , pueden ser calculados por las siguientes expresiones, respectivamente

(9)

(10)

La medida de enfoque construida por medio de los valores obtenidos de la varianza global calcu-lada por cada una de las k imágenes procesadas

kGVFM , puede ser entonces expresada por la siguiente ecuación

(11)

donde a1 a2 es la cantidad de ventanas deslizan-tes procesadas dentro ( )kmnf , , así a1, a2 son cal-culadas respectivamente, por

(12)

de la ec (9) y la ec (10) se obtienen los valores FIFI mmnn ,,, utilizados en la ec (11), así estos

valores pueden ser calculados por

(13)

y LVk es el valor de la media de todas las varian-zas locales de las ventanas procesadas dentro de la imagen ( )kmnf , , siendo LVk calculada por la ecuación

(14)

II.2. Tenenbaum (Sobel-Tenengrad) (SOB-TEN)

Este algoritmo utiliza el cálculo de la magnitud del gradiente del operador de Sobel para cons-truir una medida de enfoque La imagen mejor enfocada BFf dentro de la pila de imágenes, puede ser obtenida por la expresión

(15)

donde kSTFM es el vector normalizado de valo-res de las magnitudes máximas obtenidas por el método de Tenengrad, calculadas en cada ima-gen kf , kSTFM puede ser definido por

(16)

donde T es un valor de umbralización, ( )kmnS ,∇ es el valor de la magnitud del gradiente de Sobel y puede ser expresado por

(17)

donde kykx mnSmnS ),(,),( ∇∇ son los resultados obtenidos de la utilización de las máscaras de convolución de Sobel yx SS , respectivamente y definidas por

(18)

así kykx mnSmnS ),(,),( ∇∇ pueden ser expresadas respectivamente por las siguientes ecuaciones

(19)

II.3. Boddeke (BOD)

Este algoritmo es sumamente simple y utiliza el valor de la magnitud del gradiente, por medio de una máscara de convolución [ ]1 0 1xB = − aplicada a lo largo del eje x de la imagen pro-

5

donde 21 es la cantidad de ventanas deslizantes procesadas dentro kmnf , , así 21, son calculadas respectivamente, por

2211 22 MN , (12) de la Ec. (9) y la Ec. (10), se obtienen los valores FIFI mmnn ,,, utilizados en la Ec. (11), así estos valores pueden ser calculados por

,1,1

22

11

MmmNnn

FI

FI (13)

y kLV es el valor de la media de todas las varianzas locales de las ventanas procesadas dentro de la imagen

kmnf , , siendo kLV calculada por la ecuación

F

I

F

I

n

np

m

mqkk qpLVLV ,

)(1

21

. (14)

II.2 Tenenbaum (Sobel-Tenengrad) (SOB-TEN) Este algoritmo utiliza el cálculo de la magnitud del gradiente del operador de Sobel para construir una medida de enfoque. La imagen mejor enfocada BFf dentro de la pila de imágenes, puede ser obtenida por la expresión

BF k kf f donde MAX N STFM , (15)

donde kSTFM es el vector normalizado de valores de las magnitudes máximas obtenidas por el método de

Tenengrad, calculadas en cada imagen kf , kSTFM puede ser definido por

21 1

2 2

, ,N M

k k kn m

STFM S n m para S n m T , (16)

donde T es un valor de umbralización, kmnS , es el valor de la magnitud del gradiente de Sobel y puede ser expresado por

22 ),(),(, kykxk mnSmnSmnS , (17)

( )( ){BF k kf f donde MAX N STFM=

( ) ( )21 1

2 2, ,

N M

k k kn m

STFM S n m para S n m T− −

= =

= ∇ ∇ > ∑ ∑

( ) 22 ),(),(, kykxk mnSmnSmnS ∇+∇=∇

−−−=

−−−

=121

000121

101202101

yx SS

( ) [ ][ ]

( ) [ ][ ] k

ky

kkx

mnfmnfmnfmnfmnfmnf

mnS

mnfmnfmnfmnfmnfmnf

mnS

++++++−−−++−+−−+

=∇

+++++−+++−+−+−−−

=∇

)1,1()1,(2)1,1()1,1()1,(2)1,1(

,

)1,1(),1(2)1,1()1,1(),1(2)1,1(

,

4




2 2

1 1

21, , ( , )( ) 1

x y

kk ki x j yx y




2 2

1 1

1( , ) ,( )

x y

k ki x j yx y

LVP n m f i j , (7)





2212

2111

mynxmynx

, (8)



1111 ),1(,,2,1 NNn , (9)


F

I

F

I

n

np

m

mqkkk LVqpLVGVFM

2

21

,1)(

1, (11)

2212

2111

b+=wb+=wb−=wb−=w

mynxmynx

4




2 2

1 1

21, , ( , )( ) 1

x y

kk ki x j yx y




2 2

1 1

1( , ) ,( )

x y

k ki x j yx y

LVP n m f i j , (7)





2212

2111

mynxmynx

, (8)



1111 ),1(,,2,1 NNn , (9)


F

I

F

I

n

np

m

mqkkk LVqpLVGVFM

2

21

,1)(

1, (11)

5



,1,1

22

11

MmmNnn

FI

FI (13)



F

I

F

I

n

np

m

mqkk qpLVLV ,

)(1

21

. (14)





21 1

2 2

, ,N M

k k kn m




5



,1,1

22

11

MmmNnn

FI

FI (13)



F

I

F

I

n

np

m

mqkk qpLVLV ,

)(1

21

. (14)





21 1

2 2

, ,N M

k k kn m




4




2 2

1 1

21, , ( , )( ) 1

x y

kk ki x j yx y




2 2

1 1

1( , ) ,( )

x y

k ki x j yx y

LVP n m f i j , (7)





2212

2111

mynxmynx

, (8)



1111 ),1(,,2,1 NNn , (9)


F

I

F

I

n

np

m

mqkkk LVqpLVGVFM

2

21

,1)(

1, (11)

∈

4




2 2

1 1

21, , ( , )( ) 1

x y

kk ki x j yx y




2 2

1 1

1( , ) ,( )

x y

k ki x j yx y

LVP n m f i j , (7)





2212

2111

mynxmynx

, (8)



1111 ),1(,,2,1 NNn , (9)


F

I

F

I

n

np

m

mqkkk LVqpLVGVFM

2

21

,1)(

1, (11)

∈


(25)

donde ( )kmnL ,∇ es el valor absoluto del valor del gradiente y el valor ( ),

kL n m∇ puede ser ob-

tenido por la expresión siguiente

(26)

II.5. varianza de la magnitud del gradiente de Sobel-Tenengrad (SOB-TEN vAR)

Como se mencionó anteriormente, una estrate-gia complementaria es el cálculo de la varianza tanto de la magnitud del operador de Sobel-Tenengrad como de la magnitud del operador del Laplaciano, explicado en la sección anterior Así, de esta manera la imagen mejor enfocada fBF dentro de la pila, obtenida a partir de la varian-za de la magnitud del gradiente de Sobel-Tenen-grad, será aquella imagen con mayor varianza; en este sentido, se puede obtener a partir de la ecuación siguiente

(27)

donde kSTVFM es el vector de valores nor-malizados después de aplicar el algoritmo de Sobel-Tenengrad y calcular su varianza, definido anteriormente Por lo tanto kSTVFM puede ob-tenerse por

(28)

donde T es un valor de umbralización arbitrario; ( )kmnS ,∇ es el valor de la magnitud del gradien-

te de Sobel-Tenengrad expresado por la ec (17) y kmnS ),(∇ es la media del valor de la magnitud del gradiente de Sobel-Tenengrad, definida por

(29)

( )( ){BF k kf f donde MAX N LFM=

cesada Así, la imagen mejor enfocada fBF dentro de la pila de imágenes capturadas puede ser ob-tenida por la siguiente expresión

(20)

donde kBFM es un vector normalizado de valo-res obtenidos después de utilizar la máscara de convolución de Boddeke xB , calculada en cada imagen kf , por lo tanto kBFM puede ser obte-nido por

(21)

donde ( )kx mnB ,∇ es el valor de la magnitud del gradiente, obtenido después de aplicar xB en cada píxel ( )mn, a través de la imagen procesa-da, por lo tanto ( )kx mnB ,∇ puede ser obtenido por

(22)

II.4. Laplaciano (LAP)

Otro algoritmo basado en diferenciadores, por medio del cálculo de la segunda derivada, para analizar las altas frecuencias asociadas a los bordes que se encuentran dentro de la imagen procesada, es el cálculo del operador Laplacia-no Por lo tanto, la aplicación de este operador a cada imagen kf dentro de la pila de imágenes nos ayuda a encontrar la imagen mejor enfocada fBF Podemos obtener fBF por medio de la siguien-te expresión

(23)

donde kLFM es un vector normalizado de va-lores obtenidos después de aplicar el operador Laplaciano L con una máscara de convolución definida por

(24)

por lo tanto, kLFM puede ser calculado por

( )∑ ∑−

=

−

=

∇=1

2

1

2,

N

n

M

mkk mnLLFM

( )( ){BF k kf f donde MAX N STVFM=

( ) ( )21 1

2 2, ( , ) ,

N M

k kk kn m

STVFM S n m S n m para S n m T− −

= =

= ∇ − ∇ ∇ > ∑ ∑

( ) ( )21 1

2 2, ( , ) ,

N M

k kk kn m

STVFM S n m S n m para S n m T− −

= =

= ∇ − ∇ ∇ > ∑ ∑

( )( ) ( )∑ ∑−

=

−

=

∇−−

=∇1

2

1

2,

221),(

N

n

M

mkk mnS

MNmnS

( )( ){BF k kf f donde MAX N BFM=

( )[ ]∑ ∑−

= =

∇=1

2

2

1,

N

n

M

mkxk mnBBFM

( ) [ ]),1(),1(, mnfmnfmnB kx −−+=∇

−−−

−=

010141

010

61L

( ) [ ]( ))1,(),1()1,(),1(),(461, ++++−+−−=∇ mnfmnfmnfmnfmnfmnL k

( ) [ ]( ))1,(),1()1,(),1(),(461, ++++−+−−=∇ mnfmnfmnfmnfmnfmnL k


II.6. varianza de la magnitud del gradiente del Laplaciano (LAP vAR)

Continuando con la estrategia anterior, la ima-gen mejor enfocada fBF en la pila, basándose en la varianza de la magnitud del operador Lapla-ciano, será aquella con mayor varianza; en este contexto, podemos obtenerla a partir de la si-guiente expresión

(30)

donde kLPVFM es el vector de valores norma-lizados después de aplicar la magnitud del ope-rador Laplaciano y calcular su varianza Así

kLPVFM puede ser obtenido por medio de

(31)

donde ( )kmnL ,∇ es la magnitud del operador Laplaciano, expresado en la ec (26) y kmnL ),(∇es la media de la magnitud del operador Lapla-ciano, definida por

(32)

II.7. Correlación de Pearson y transformada de Fourier (P. CORR)

En esta sección se propone un nuevo algoritmo para obtener la imagen mejor enfocada fBF de un conjunto de imágenes obtenidas del micros-copio El algoritmo propuesto está basado en la obtención de la transformada de Fourier para realizar un análisis del contenido de frecuencias espaciales de las imágenes de la pila y por medio de la correlación de Pearson construir una medi-da de enfoque

Cuando se capturan imágenes por medio de un CCD, éstas están en función del dominio es-pacial, implicando que todas las operaciones rea-lizadas serán sobre el dominio espacial en lugar de sobre el dominio del tiempo Por lo tanto, es importante revisar algunas definiciones útiles: el par de integrales de la transformada de Fourier unidimensional para operar en el dominio espa-cial, son definidas por las siguientes ecuaciones

(33)

(34)

por lo tanto, en la ec (33), )( fH define la trans-formada de Fourier espacial unidimensional de

)(xh Típicamente )(xh es una función de una va-

riable del espacio y )( fH es una función asocia-da a una variable de la frecuencia espacial Así en la ec (34), )(xh define la transformada inver-sa de Fourier espacial unidimensional de )( fH

Por otro lado, el coeficiente lineal de co-rrelación es referido algunas veces como el co-eficiente de correlación, la correlación del pro-ducto de momentos de Pearson o simplemente la correlación de Pearson Así el coeficiente de correlación de Pearson r define una medida de la intensidad de asociación entre dos variables x y Y, el coeficiente r puede ser obtenido por medio de la siguiente expresión

(35)

donde h representa la cantidad de pares de datos analizados

El coeficiente de Pearson r nunca puede ser mayor de 1 0 o menor de –1 0 En este trabajo se utiliza r para obtener la intensidad de aso-ciación entre dos conjuntos de vectores extraídos de dos imágenes dadas, representadas por las va-riables x y Y De este modo es obtenida la co-rrelación de Pearson para construir una medida del enfoque

La obtención de un valor de r cercano a 0 0 implica que no existe una correlación entre las variables; mientras que si se obtiene un valor de r cercano a 1 0, implica que existe una fuerte co-rrelación entre las variables

( )( ){BF k kf f donde MAX N LPVFM=

( )[ ]∑ ∑−

=

−

=

∇−∇=1

2

21

2),(,

N

n

M

mkkk mnLmnLLPVFM

( )( ) ( )∑ ∑−

=

−

=

∇−−

=∇1

2

1

2,

221),(

N

n

M

mkk mnL

MNmnL

9

II.7 Correlación de Pearson y transformada de Fourier (P. CORR) En esta sección se propone un nuevo algoritmo para obtener la imagen mejor enfocada BFf de un conjunto de imágenes obtenidas del microscopio. El algoritmo propuesto está basado en la obtención de la transformada de Fourier para realizar un análisis del contenido de frecuencias espaciales de las imágenes de la pila y por medio de la correlación de Pearson construir una medida de enfoque. Cuando se capturan imágenes por medio de un CCD, éstas están en función del dominio espacial, implicando que todas las operaciones realizadas serán sobre el dominio espacial en lugar de sobre el dominio del tiempo. Por lo tanto es importante revisar algunas definiciones útiles: El par de integrales de la transformada de Fourier unidimensional para operar en el dominio espacial, son definidas por las siguientes ecuaciones

dxexhfH fxj2)()( (33)

dfefHxh fxj2)()( , (34)

por lo tanto, en la Ec. (33), )( fH define la transformada de Fourier espacial unidimensional de )(xh . Típicamente )(xh es una función de una variable del espacio y )( fH es una función asociada a una variable de la frecuencia espacial. Así en la Ec. (34), )(xh define la transformada inversa de Fourier espacial unidimensional de

)( fH . Por otro lado el coeficiente lineal de correlación es referido algunas veces como el coeficiente de correlación, la correlación del producto de momentos de Pearson o simplemente la correlación de Pearson. Así el coeficiente de correlación de Pearson r define una medida de la intensidad de asociación entre dos variables X y Y, el coeficiente r puede ser obtenido por medio de la siguiente expresión

22

22 Y

YX

X

YXXY

r (35)

donde representa la cantidad de pares de datos analizados. El coeficiente de Pearson r nunca puede ser mayor de 1.0 o menor de –1.0, en este trabajo se utiliza r para obtener la intensidad de asociación entre dos conjuntos de vectores extraídos de dos imágenes dadas, representadas por las variables X y Y. De este modo es obtenida la correlación de Pearson para construir una medida del enfoque. La obtención de un valor de r cercano a 0.0 implica que no existe una correlación entre las variables, mientras que si se obtiene un valor de r cercano a 1.0, implica que existe una fuerte correlación entre las variables.

9

II.7 Correlación de Pearson y transformada de Fourier (P. CORR) En esta sección se propone un nuevo algoritmo para obtener la imagen mejor enfocada BFf de un conjunto de imágenes obtenidas del microscopio. El algoritmo propuesto está basado en la obtención de la transformada de Fourier para realizar un análisis del contenido de frecuencias espaciales de las imágenes de la pila y por medio de la correlación de Pearson construir una medida de enfoque. Cuando se capturan imágenes por medio de un CCD, éstas están en función del dominio espacial, implicando que todas las operaciones realizadas serán sobre el dominio espacial en lugar de sobre el dominio del tiempo. Por lo tanto es importante revisar algunas definiciones útiles: El par de integrales de la transformada de Fourier unidimensional para operar en el dominio espacial, son definidas por las siguientes ecuaciones

dxexhfH fxj2)()( (33)

dfefHxh fxj2)()( , (34)

por lo tanto, en la Ec. (33), )( fH define la transformada de Fourier espacial unidimensional de )(xh . Típicamente )(xh es una función de una variable del espacio y )( fH es una función asociada a una variable de la frecuencia espacial. Así en la Ec. (34), )(xh define la transformada inversa de Fourier espacial unidimensional de

)( fH . Por otro lado el coeficiente lineal de correlación es referido algunas veces como el coeficiente de correlación, la correlación del producto de momentos de Pearson o simplemente la correlación de Pearson. Así el coeficiente de correlación de Pearson r define una medida de la intensidad de asociación entre dos variables X y Y, el coeficiente r puede ser obtenido por medio de la siguiente expresión

22

22 Y

YX

X

YXXY

r (35)

donde representa la cantidad de pares de datos analizados. El coeficiente de Pearson r nunca puede ser mayor de 1.0 o menor de –1.0, en este trabajo se utiliza r para obtener la intensidad de asociación entre dos conjuntos de vectores extraídos de dos imágenes dadas, representadas por las variables X y Y. De este modo es obtenida la correlación de Pearson para construir una medida del enfoque. La obtención de un valor de r cercano a 0.0 implica que no existe una correlación entre las variables, mientras que si se obtiene un valor de r cercano a 1.0, implica que existe una fuerte correlación entre las variables.


II.8. Algoritmo de autoenfoque por correlación de Pearson y Fourier

El proceso de la obtención de la imagen mejor enfocada inicia con la captura de imágenes del microcopio de la muestra analizada, con el ob-jetivo de construir una pila de imágenes El al-goritmo propuesto procesa una cantidad Q de vectores qV en cada imagen en la pila, así cada vector procesado será identificado por el su-bíndice Qq ,..,1= , estos vectores se encuentran espacialmente distribuidos en la imagen, a una distancia equidistante, de esta manera forman un patrón de barrido, en cada imagen analizada

( )kyxf , En la figura 1, D define la distancia entre los

vectores qV , el algoritmo no procesa toda la ima-gen, solamente procesa el patrón definido por los vectores qV , es decir la información necesa-ria para obtener una medida del enfoque de la imagen que está contenida en estos vectores

El número de vectores Q puede ser calcula-

do por la expresión 1+

D=

NQ , donde

DN de

acuerdo a la ec (4), el conjunto de los números enteros Los vectores qV pueden ser obtenidos por medio de las siguientes expresiones

(36)

Calculando el espectro de potencia de Fourier a cada vector qV , se obtiene 2

1 )( fH , 22 )( fH , ,

2)( fHq respectivamente, con estas magnitudes

conteniendo las altas y bajas frecuencias de los vectores qV , construimos un único vector kFSV , para cada imagen ( )kyxf , capturada La ecua-ción que construye el vector único para cada imagen, puede expresarse por la forma

(37)

donde denota la unión, encadenamiento o concatenación de vectores Este vector único

kFSV calculado para cada imagen dentro de la pila, es comparado por medio de la correlación de Pearson con el vector de la imagen de refe-rencia 1FSV , calculado usualmente de los vecto-

10

II.8 Algoritmo de autoenfoque por correlación de Pearson y Fourier El proceso de la obtención de la imagen mejor enfocada, inicia con la captura de imágenes del microcopio de la muestra analizada, con el objetivo de construir una pila de imágenes. El algoritmo propuesto, procesa una cantidad Q de vectores qV en cada imagen en la pila, así cada vector procesado será identificado por el subíndice Qq ,..,1 , estos vectores se encuentran espacialmente distribuidos en la imagen, a una distancia equidistante, de esta manera forman un patrón de barrido, en cada imagen analizada kyxf , . En la Fig. 1, define la distancia entre los vectores qV , el algoritmo no procesa toda la imagen, solamente procesa

el patrón definido por los vectores qV , es decir la información necesaria para obtener una medida del enfoque de la imagen que está contenida en estos vectores.

El número de vectores Q puede ser calculado por la expresión 1NQ , donde N

de acuerdo a la

Ec. (4), el conjunto de los números enteros. Los vectores qV pueden ser obtenidos por medio de las siguientes expresiones

kMyyfV ,..,,1 01 , kMyyfV ,..,,1 02 ,..., kMq yyqfV ,..,,11 0 . (36)


1 )( fH , 2

2 )( fH ,.., 2

)( fHq

respectivamente, con estas magnitudes conteniendo las altas y bajas frecuencias de los vectores qV , construimos un

único vector kFSV , para cada imagen kyxf , capturada. La ecuación que construye el vector único para cada imagen, puede expresarse por la forma

22 21 2( ) ( ) ,..., ( )k qk k k

FSV H f H f H f , (37)

donde denota la unión, encadenamiento o concatenación de vectores. Este vector único kFSV calculado para cada imagen dentro de la pila, es comparado por medio de la correlación de Pearson con el vector de la imagen de referencia 1FSV , calculado usualmente de los vectores qV de la primera imagen capturada 1, yxf , siendo ésta la imagen más fuera de foco o desenfocada. Así en este contexto, la imagen mejor enfocada comparada contra la primera imagen, el valor del coeficiente de correlación de Pearson r, será cercano a 0.0, significando que entre ambas imágenes no hay una correlación fuerte o la intensidad de asociación es mínima, es decir no se parecen. Por lo tanto, para obtener la imagen mejor enfocada BFf por medio del coeficiente de correlación de Pearson r, en

el contexto anterior BFf puede ser obtenida por

BF k kf f donde MIN N r , (38)

donde kr es el vector de valores normalizados de coeficientes r, calculados a partir de la comparación de cada imagen en la pila contra la primera imagen o imagen de referencia.

10

II.8 Algoritmo de autoenfoque por correlación de Pearson y Fourier El proceso de la obtención de la imagen mejor enfocada, inicia con la captura de imágenes del microcopio de la muestra analizada, con el objetivo de construir una pila de imágenes. El algoritmo propuesto, procesa una cantidad Q de vectores qV en cada imagen en la pila, así cada vector procesado será identificado por el subíndice Qq ,..,1 , estos vectores se encuentran espacialmente distribuidos en la imagen, a una distancia equidistante, de esta manera forman un patrón de barrido, en cada imagen analizada kyxf , . En la Fig. 1, define la distancia entre los vectores qV , el algoritmo no procesa toda la imagen, solamente procesa

el patrón definido por los vectores qV , es decir la información necesaria para obtener una medida del enfoque de la imagen que está contenida en estos vectores.

El número de vectores Q puede ser calculado por la expresión 1NQ , donde N

de acuerdo a la

Ec. (4), el conjunto de los números enteros. Los vectores qV pueden ser obtenidos por medio de las siguientes expresiones

kMyyfV ,..,,1 01 , kMyyfV ,..,,1 02 ,..., kMq yyqfV ,..,,11 0 . (36)


1 )( fH , 2

2 )( fH ,.., 2

)( fHq

respectivamente, con estas magnitudes conteniendo las altas y bajas frecuencias de los vectores qV , construimos un

único vector kFSV , para cada imagen kyxf , capturada. La ecuación que construye el vector único para cada imagen, puede expresarse por la forma

22 21 2( ) ( ) ,..., ( )k qk k k

FSV H f H f H f , (37)

donde denota la unión, encadenamiento o concatenación de vectores. Este vector único kFSV calculado para cada imagen dentro de la pila, es comparado por medio de la correlación de Pearson con el vector de la imagen de referencia 1FSV , calculado usualmente de los vectores qV de la primera imagen capturada 1, yxf , siendo ésta la imagen más fuera de foco o desenfocada. Así en este contexto, la imagen mejor enfocada comparada contra la primera imagen, el valor del coeficiente de correlación de Pearson r, será cercano a 0.0, significando que entre ambas imágenes no hay una correlación fuerte o la intensidad de asociación es mínima, es decir no se parecen. Por lo tanto, para obtener la imagen mejor enfocada BFf por medio del coeficiente de correlación de Pearson r, en

el contexto anterior BFf puede ser obtenida por

BF k kf f donde MIN N r , (38)

donde kr es el vector de valores normalizados de coeficientes r, calculados a partir de la comparación de cada imagen en la pila contra la primera imagen o imagen de referencia.

22 21 2( ) ( ) ,..., ( )k qk k k

FSV H f H f H f=

res qV de la primera imagen capturada ( )1, yxf , siendo ésta la imagen más fuera de foco o des-enfocada Así en este contexto, la imagen mejor enfocada comparada contra la primera imagen, el valor del coeficiente de correlación de Pear-son r, será cercano a 0 0, significando que entre ambas imágenes no hay una correlación fuerte o la intensidad de asociación es mínima, es decir: no se parecen

Por lo tanto, para obtener la imagen mejor enfocada fBF por medio del coeficiente de corre-lación de Pearson r, en el contexto anterior fBF puede ser obtenida por

(38)

donde kr es el vector de valores normalizados de coeficientes r, calculados a partir de la compara-ción de cada imagen en la pila contra la primera imagen o imagen de referencia

En la ec (35), 1FSVX = y kFSVY = de cada imagen, obteniéndose el cálculo de cada coefi-ciente de Pearson r de la imagen correspondiente

( )kyxf , , h será el tamaño de la longitud del vector x o Y Así en la figura 1 se muestra el patrón de barrido definido por los vectores qV , de acuerdo a la ec (36) Se puede controlar el espacio entre los vectores qV cambiando el valor de D, así haciendo D→1, más vectores qV serán procesados, mientras que si se hace D→ N, menos vectores qV son pro-cesados y el algoritmo será menos sensible para discriminar detalles de la muestra

( )( ){BF k kf f donde MIN N r=

31

Figura 1

Figura 1. Patrón de procesamiento definido por los vectores qV , espaciados a una distancia equidistante D.


En experimentos realizados en este trabajo se utilizan diferentes valores de D para obtener las gráficas respectivas, de la sensibilidad de cál-culo del algoritmo para obtener la imagen mejor enfocada Finalmente, en la figura 2 se muestra el diagrama general del proceso del algoritmo propuesto

III. Experimentos computacionales

Generalmente cuando se trata de enfocar ma-nualmente una muestra, varias imágenes cerca-nas al punto focal pueden ser candidatas para te-ner el valor de enfoque más alto; esto dependerá de varios aspectos externos, como por ejemplo, nuestra visión, los lentes del microscopio, ilumi-nación y la calidad de la muestra por si misma, pero al final, se termina seleccionando la imagen con mejor calidad visual El algoritmo propuesto reacciona de manera similar a la forma en que lo hacemos nosotros, en cuanto a que éste decide cuál imagen es mejor desplegar por medio de la revisión del valor del coeficiente de Pearson r

Los experimentos realizados fueron diseña-dos para probar dos aspectos del algoritmo: el primero, probar si el algoritmo obtiene la imagen mejor enfocada de un grupo de imágenes pre-viamente capturadas, y sí lo obtiene en campo claro, si éste funciona para imágenes de campo oscuro; el segundo, probar si el algoritmo pro-puesto tiene un tiempo de ejecución menor a los algoritmos citados en la literatura y previamente definidos en este escrito

Las características del equipo de cómputo donde se probó este algoritmo son las siguiente: una computadora personal con un microproce-sador Pentium 4 a 2 5 GHz , con 1 Gb de memo-ria y un disco duro de 80 Gb

III.1. Experimentos sobre la determinación de la imagen mejor enfocada

Para probar el algoritmo propuesto respecto a la obtención de la imagen mejor enfocada, se capturaron 101 imágenes monocromáticas de 512 x 512 píxeles de resolución, de una partícula previamente seleccionada (mostrada en la figura

32

Figura 2

Inicio delProceso

Se h

a pr

oces

ado

la p

ila

com

plet

amen

te

Se h

a pr

oces

ado

la p

ila

com

plet

amen

te

Construcción de laPila de

Imágenes

Definición del Patrón de Barrido

de los Vectores Vq

i = ki = k

i = ki = k

Procesamiento de la Imagen de Referencia

para obtenerel vector FSV1

Obtención de la Imagen siguiente en la Pila

f(x,y)k

Procesamiento de la Imagen f(x,y)k para obtener

los vectores FSVk

Determinación de la imagen capturada conel valor (1 – r) más alto.

(Valor de descorrelación)

Análisis del Siguiente

Campo

Cálculo del Coeficiente de Pearson r, a partir

de los vectores FSV1 y FSVk

Figura 2. Diagrama general del algoritmo de autoenfoque propuesto.


1) Por otro lado, se sabía que la imagen mejor enfocada estaba entre la imagen 33 y la imagen 40 Posteriormente ya capturadas las imágenes y creada la pila de imágenes a diferentes alturas focales, se corrió el algoritmo con diferentes dis-tancias entre los vectores qV , cambiando el valor de la variable D en un rango de 40 a 60 píxeles en incrementos de 5 píxeles, así cuando 60D = sólo se procesaron nueve vectores

Los resultados obtenidos de las imágenes en campo claro se muestran en la gráfica de la figura 3 Cuando D→ N, existen menos vectores procesa-dos, el algoritmo corre más rápido, sin embargo se va perdiendo sensibilidad para obtener la imagen mejor enfocada, la sensibilidad está determinada por el valor (1-r) obtenido de las correlaciones En este contexto, cuando hay un número sufi-ciente de vectores procesados se asegura que los valores obtenidos estén cercanos a 1 0 Por otro lado cuando 1D → , se procesan más vectores, ha-ciendo que el algoritmo sea más lento, al mismo tiempo el algoritmo es más sensible, discriminan-do mejor entre las imágenes analizadas Sin em-bargo, si hacemos el espacio entre los vectores qV más pequeño, se llega a un límite de sensibilidad, es decir no hay más ganancia en la sensibilidad; así se obtuvo que un valor para D entre 35 y 45 píxeles, proporciona curvas con picos arriba del 95%, como se aprecia en la figura

Con los resultados obtenidos, se define la región llamada región de mejor enfoque, la cual contiene las imágenes con el valor más alto de enfoque dentro de la pila Así las imágenes den-tro de esta región son determinadas por la regla heurística de discriminación, definida por 1 – rk > TBFR → 1 – rk > 0 95, la cual expresa que den-tro de esta región estarán aquellas imágenes que tengan un valor (1-r) mayor al valor de umbrali-zación TBFR > 0 95 Para comprobar visualmente los resultados numéricos se muestran las imá-genes que cumplieron con la regla heurística de discriminación anteriormente definida; así, en la figura 4 se muestran las imágenes contenidas en la región de mejor enfoque, donde claramen-te se observa que no hay una diferencia visual significativa; dentro de esta región se encuentra la imagen mejor enfocada, numéricamente es la número 36, sin embargo visualmente es difícil discriminar entre ellas y dependerá de la cali-dad visual de cada observador Por lo tanto, se puede afirmar que el algoritmo propuesto tiene un desempeño eficiente con respecto a la obten-ción de la imagen mejor enfocada y otorga un conjunto de imágenes de buena calidad visual y de información para extraerles las características relevantes para realizar el proceso de fusión

33

Figura 3

34

Figura 4

Figura 3. Gráfica que muestra el índice de la imagen mejor enfocada en campo claro, cuando la variable D toma valores en el rango de 40 a 60 píxeles.

Figura 4. Imágenes dentro de la región de mejor enfoque, conteniendo las mejores características visuales y de infor-mación; la imagen mejor enfocada obtenida numéricamente es la número 36.

Con respecto a los experimentos en campo oscuro, se realizaron con los mismos parámetros de los realizados en campo claro En la gráfica de la figura 5 se muestran los resultados obteni-dos de las imágenes en campo oscuro


Los resultados fueron similares a los obteni-dos en campo claro, obteniéndose varias imáge-nes dentro de la región de mejor enfoque; así, el algoritmo demostró que es posible utilizarlo tanto para imágenes de campo oscuro como de campo claro

De igual forma, para confirmar los resulta-dos obtenidos en campo oscuro en la figura 6 se muestran las imágenes de la región de mejor enfoque, donde previamente la mejor enfocada obtenida numéricamente es la número 45 Si se observan las imágenes de la figura, no se apre-cia una diferencia significativa, lo que demuestra que el algoritmo determinó la región de imáge-nes con mejores características visuales

III.2. Experimentos sobre el tiempo de ejecución

Una vez determinado que el algoritmo propuesto tenía la capacidad de encontrar la imagen mejor enfocada, se prosiguió a diseñar el experimento para medir el tiempo de ejecución del algoritmo contra los algoritmos previamente citados

Para medir la velocidad de procesamiento del algoritmo propuesto, se capturaron 4 pilas de 60 imágenes de una nueva partícula biológi-ca, tomadas a diferentes resoluciones, 522 x 387,

1044 x 775, 1566 x 1162 y 2088 x 1550 píxeles; así, las imágenes capturadas son de tamaños, 0 2, 0 8, 1 8 y 3 2 mega píxeles, respectivamente

La ventana deslizante utilizada por el al-goritmo de varianza global fue definida con un tamaño de 25 x 25 píxeles, para incrementar la sensibilidad del algoritmo; en este contexto, para controlar el tamaño de la ventana deslizante, las variables ξ1, ξ2 fueron ambas inicializadas con el valor de 12 cada una Finalmente, los vecto-res qV del algoritmo propuesto fueron espacia-dos con 35D = para tener un patrón de barrido equiparable al barrido de la ventana deslizante de la varianza global Ninguna otra variable fue inicializada, ni necesaria para obtener los resul-tados finales

Se ejecutó cada uno de los algoritmos des-critos con las pilas de imágenes capturadas a diferentes resoluciones, junto con el algoritmo propuesto, y se obtuvo como resultado la región de mejor enfoque, en donde se encontraron las imágenes de mejores características visuales

En la figura 7 se muestra la región de mejor enfoque determinada por los resultados de los algoritmos probados, éstos fueron consistentes en la determinación de la región de mejor en-foque con respecto a la resolución probada Se podría afirmar que estos algoritmos en general son invariantes a la resolución de las imágenes procesadas, es decir en cualquier resolución es obtenida la misma región de mejor enfoque Sin embargo, esta invarianza no es útil ya que una imagen con mayor resolución contiene mucha

35

Figura 5

Figura 5. Gráfica que muestra el índice de la imagen mejor en-focada en campo oscuro, cuando la variable D toma valores en el rango de 40 a 60 píxeles.

36

Figura 6

Figura 6. Imágenes dentro de la región de mejor enfoque, conteniendo las mejores características visuales y de infor-mación; la imagen mejor enfocada obtenida numéricamente es la número 45.


más información espacial necesaria para algún procesamiento adicional

Lo verdaderamente importante es el tiempo (tabla 1) que tarda cada algoritmo en determinar la región de mejor enfoque y, por consiguiente, la imagen mejor enfocada, ya que un algoritmo rápido en el procesamiento de imágenes de ma-yor resolución es mucho más útil que otro mu-cho más lento, para ser utilizado en aplicaciones de tiempo real

En la figura 8 se muestran los tiempos de ejecución en forma gráfica, observándose las tendencias de cada algoritmo conforme la reso-lución aumenta

37

Figura 7

Figura 7. Imágenes dentro de la región de mejor enfoque, obtenidas de los algoritmos propuestos; la imagen mejor enfocada se encuentra entre la 30 y 32.

38

Figura. 8

111 seg.

29

Tabla 1

Tabla 1Tiempo de ejecución de los algoritmos probados en el procesamiento de imágenes a diferentes

resoluciones y los índices de las imágenes de mejor enfoque obtenidas por éstos.

Figura 8. Gráfica de los tiempos de ejecución obtenidos de cada algoritmo probado.


IV. Algoritmo de fusión

Debido a que las partículas analizadas presen-tan una estructura volumétrica, la imagen me-jor enfocada sólo contiene un plano focal de la muestra con la mayor cantidad de información visual Sin embargo, los planos adicionales que integran la muestra contienen información adi-cional y muchas veces relevante para realizar un análisis más preciso de la partícula Es necesario adquirir esta información adicional, contenida en los diferentes planos focales de la muestra, mediante algún proceso especializado para for-mar una imagen final de mucha mejor calidad visual y de información El proceso de adquirir esta información de los distintos planos focales que integran la muestra es llamado fusión de imágenes, fusión multifoco o simplemente fusión

En esta sección se propone un sistema au-tomático de fusión de imágenes por medio de la ejecución de un algoritmo computacional, teniendo como objetivo recolectar la informa-ción relevante de los distintos planos focales de la partícula que se encuentran arriba y abajo del plano focal de la imagen mejor enfocada, en la dirección de eje Z del microscopio, para formar una imagen final bidimensional de la partícula, de mejor calidad visual y de información

Una variedad de metodologías publicadas en artículos científicos para realizar la fusión de imá-genes (Sharma y Pavel, 1996; Rockinger, 1996; Bloch y Maitre, 1997; Achalakul et al., 1999; Hill et al., 2002; Li et al., 2002; Forero et al., 2003; Pe-trovic, 2003; Zheng et al., 2004;) han sido previa-mente desarrolladas Estos métodos utilizan di-ferentes estrategias para obtener la fusión de un conjunto de imágenes capturadas previamente; dentro de estas estrategias tenemos las siguien-tes: la aplicación de la transformada “Wavelet”, el uso de la proporción de Laplace, el análisis de contraste o la aplicación de pirámides morfológi-cas; fusión por promedios; métodos Bayesianos; redes neuronales o lógica difusa Sin embargo, en este capítulo se propone el diseño de un algo-ritmo de fusión por medio una estrategia basada en el análisis de frecuencias de las imágenes que se fusionan; de esta forma, se propone un méto-do basado en la aplicación de la transformada de Fourier (Bueno-Ibarra et al., 2005b)

A diferencia del algoritmo de autoenfoque, cuya calidad se mide con respecto al tiempo de ejecución, comparado con los tiempos de ejecu-ción de otros algoritmos previamente desarro-llados, esta metodología será analizada con una métrica basada en un índice que mide la calidad del algoritmo para fusionar imágenes, analizan-do el contenido de información de la imagen final fusionada Este índice fue propuesto por Wang y Bovik en 2002 y posteriormente mejo-rado y ampliado por Piella y Heijmans en 2003 Estos índices o métricas desarrolladas por estos autores, sólo tienen la capacidad de medir la ca-lidad de fusión de la imagen final, a partir de dos imágenes fusionadas; sin embargo, el algoritmo propuesto en este trabajo es capaz de fusionar n imágenes en una imagen final, por lo tanto las métricas desarrolladas no son capaces de medir el desempeño del algoritmo propuesto, por lo que fue necesario desarrollar una métrica nueva a partir de las métricas propuestas por estos au-tores para poder medir la calidad de fusión del algoritmo propuesto

Así, en este capítulo se describe el algoritmo desarrollado incluyendo la métrica desarrollada para medir su rendimiento, y se muestran las di-ferencias en la calidad de la imagen fusionada con respecto a la imagen mejor enfocada

Con la finalidad de situar al lector, este algo-ritmo está ubicado en el bloque de Procesamien-to de Campo, dentro del proceso automático de adquisición de imágenes y es otro de los algorit-mos medulares de este trabajo, ya que provee la imagen final del proceso de adquisición, conte-niendo ésta la máxima cantidad de información que el sistema podrá utilizar para el análisis de partículas

Por último, el diseño de este algoritmo y de su métrica son otras de las contribuciones prin-cipales de este trabajo, aportando el material es-crito respectivo, en el área de la ciencia básica y un desarrollo computacional acorde a las técni-cas y metodologías de las ciencias computacio-nales y, por consiguiente, en el área de la ciencia aplicada

Iv.1. Algoritmo de fusión de imágenes

El desarrollo de esta sección está dividido en tres partes: en la primera, debido a la capacidad


del algoritmo propuesto para fusionar imágenes policromáticas o de color, se introduce al lector en los fundamentos sobre los espacios de color, como una base teórica utilizada por el algorit-mo propuesto; de este modo, se describen los espacios de color relevantes para resolver las transformaciones que es necesario realizar para generar la fusión; en la segunda parte se describe matemática y minuciosamente cada etapa ejecu-tada por el algoritmo propuesto, y por último se describen las métricas existentes desarrolladas por Wang, Bovik, Piella y Heijmans, continuan-do con la descripción matemática de la nueva métrica propuesta por este trabajo, para medir el rendimiento de fusión del algoritmo propuesto

Finalmente, en la sección 3 2 se describen los experimentos diseñados y ejecutados para pro-bar el algoritmo propuesto, mostrando gráfica y numéricamente los resultados obtenidos, contra los resultados obtenidos por otros algoritmos con respecto al nivel de fusión

Iv.1.1. Teoría y espacios de color

En la vida cotidiana, la sensación visual causada por la luz policromática (color) es mucho más rica que la causada por la luz acromática (sin co-lor) o monocromática (un color, usualmente ni-veles de grises); así, en la discusión general sobre la percepción del color usualmente se involucran tres parámetros: el matiz, la saturación y la clari-dad o brillantez

El matiz es un parámetro que nos ayuda a distinguir entre las diferentes longitudes de onda del espectro visible, por ejemplo: el rojo del ver-de, el azul del amarillo, etc Así, el matiz es lla-mado color La saturación es la cantidad de co-lor, de pigmentación, por ejemplo, un rojo está altamente saturado, mientras que el rosa está dé-bilmente saturado, el azul cielo esta débilmente saturado; así los colores pasteles contienen más blanco claro que los colores vívidos, los cuales están altamente saturados Por otra parte, la cla-ridad o brillantez se refiere a la percepción de luminosidad, es decir a la cantidad de luz refle-jada de un objeto o emitida por un objeto, como por ejemplo la luz emitida por un monitor, un foco o el sol

Sin embargo, tratar de describir un color con los parámetros anteriores era una operación su-mamente subjetiva, por lo tanto fue necesario para la descripción del color crear una medida estándar del mismo Fueron creadas una varie-dad de tablas estándar, como el pantone o los muestrarios de color impresos, para solucionar problemáticas de diversas índoles asociadas al color, como por ejemplo en las industrias de la fotografía, las artes gráficas, la televisión o la de la impresión, por mencionar algunas La com-putadora fue uno de los dispositivos que evolu-cionaron rápidamente con el advenimiento de la miniaturización electrónica; así, para el manejo del espectro visible para resolver alguna proble-mática, en particular por medio de estas compu-tadoras, fue necesario crear modelos de color que las máquinas fueran capaces de entender, manipular y medir

Así en 1931 una comisión internacional es-pecializada (C I E ) desarrolló una definición para la luz policromática (color), donde para ob-tener un color en particular éste era expresado por la mezcla de tres cantidades fijas o cantida-des primarias, inicialmente la C I E llamó a es-tas cantidades, x, Y y Z respectivamente, expre-sándolas en un diagrama relacionado al espectro visible, al cual llamó diagrama cromático (Pratt, 1991; Foley et al , 1995)

Posteriormente en la evolución de estos es-tándares, la C I E reemplazó estos nombres por Rojo (R), verde (G) y Azul (B), respectiva-mente, generando una representación numérica de color, llamado espacio de color RGB, así se desarrollaron una variedad de modelos distintos para solucionar problemáticas particulares

Algunos dispositivos digitales utilizan este espacio de color para representar mediante una matriz tridimensional, integrada por los canales R, G y B, las imágenes que capturan, como en el caso de las cámaras digitales CCD

En la figura 9 se muestra cómo una imagen digital de color ( )yxf RGB , está integrada por tres canales monocromáticos R, G y B, representados por las funciones ( ) ( ) ( ), , , , ,R G Bf x y f x y f x y , respectivamente

En este espacio, la información de color está completamente correlacionada por los canales RGB, es decir la combinación de los tres canales, forma el color final representado; debido a este


aspecto, el espacio de color RGB no es adecua-do para ser utilizado en la solución de algunos problemas Nikulin y Bebis (2004) desarrollaron algunas aplicaciones usando espacios de color di-ferentes al RGB para la aplicación de imágenes, en donde la aplicación manipulaba los modelos de color RGB y YIQ mediante la transformada “Wavelet”

efectos de saturación por ruido presente en la imagen original RGB La ventaja de este mode-lo, con respecto al modelo YUv, es que éste es un modelo compensado y escalado del modelo de color YUv; así respecto a los valores de satu-ración presentes en una imagen RGB, el modelo YUv integra esos valores completamente en el canal Y, mientras que el YIQ es un modelo op-cional derivado del YUv y presenta las mismas características de su antecesor (Devereux, 1987; ITU-R BT 601-5, 1995; ITU-R BT 470-6, 1998; ITU-R BT 709-4, 2000)

En dicho contexto, en este escrito se propo-ne la utilización del modelo de color YCbCr para obtener la imagen final fusionada del conjunto de imágenes de la región de mejor enfoque BFR La justificación de la utilización de un modelo de color, diferente al RGB, es que el algoritmo propuesto utiliza solamente la información de la intensidad de la imagen para realizar la fusión de imágenes

Por último, es necesario definir las ecuacio-nes de conversión entre el modelo RGB a YCb-Cr y de YCbCr a RGB, las ecuaciones ec (39) y ec (40) respectivamente, realizan las transforma-ciones mencionadas

Sea ( ),RGBf x y la imagen digital en RGB y ( )yxf YCbCr , la imagen digital representada en el

espacio de color YCbCr, con canales ( ),Rf x y , ( ),Gf x y , ( ),Bf x y y ( )yxf Y , , f Cb(x,y), f Cr(x,y)

respectivamente Así las transformaciones mencionadas pue-

den estar representadas por las siguientes expre-siones

(39)

(40)

Por último, se definen las funciones de conversión entre espacios de color utilizadas por el algorit-mo de fusión, así para convertir RGB YCbCr→ (ec 40), se define la función ( ){ },YCbCr RGBf x yΦ y para convertir YCbCr RGB→ (ec 39), se defi-ne la función ( ){ },RGB YCbCrf x yΦ expresadas en forma notacional, respectivamente por

39

Figura 9

Figura 9. Representación de la imagen de color digital ( )yxf RGB , , por medio de los canales RGB, integrados en

una matriz tridimensional ( ) ( ) ( ), , , , ,R G Bf x y f x y f x y , res-pectivamente.

Por lo tanto, es necesario buscar un modelo de color que integre la intensidad por un canal y el color por otro u otros canales, varios mo-delos o espacios de color se han diseñado para tal efecto, los principales son: el modelo YUv, el modelo YIQ y el modelo YCbCr Así estos modelos, utilizan el canal Y, para representar la intensidad y los canales adicionales para repre-sentar el color de la imagen de color digital RGB convertida

Por sus ventajas, el modelo de color YCbCr es un candidato ideal para resolver el problema En la captura de una imagen digital RGB, por medio de un dispositivo electrónico, como por ejemplo una cámara CCD, la imagen capturada contiene valores de saturación, es decir valores cercanos o iguales a 0 ó a 255, debido a factores de ruido Así la ventaja del modelo YCbCr, es que en la conversión de imágenes RGB, los va-lores resultantes caen en un rango de 16 a 235 para el canal Y y de 16 a 240 para los canales CbCr, aislando a la imagen convertida de los

15

En este espacio, la información de color está completamente correlacionada por los canales RGB, es decir la combinación de los tres canales, forma el color final representado, debido a este aspecto el espacio de color RGB no es adecuado para ser utilizado en la solución de algunos problemas. Nikulin y Bebis (2004) desarrollaron algunas aplicaciones usando espacios de color diferentes al RGB para la aplicación de imágenes, en donde la aplicación manipulaba los modelos de color RGB y YIQ mediante la transformada “Wavelet”.

Por lo tanto, es necesario buscar un modelo de color que integre la intensidad por un canal y el color por otro u otros canales, varios modelos o espacios de color se han diseñado para tal efecto, los principales son: el modelo YUV; modelo YIQ y el modelo YCbCr. Así estos modelos, utilizan el canal Y, para representar la intensidad y los canales adicionales para representar el color, de la imagen de color digital RGB convertida.

Por sus ventajas, el modelo de color YCbCr es un candidato ideal para resolver el problema. En la captura de una imagen digital RGB, por medio de un dispositivo electrónico, como por ejemplo una cámara CCD, la imagen capturada contiene valores de saturación, es decir valores cercanos o iguales a 0 ó a 255, debido a factores de ruido. Así la ventaja del modelo YCbCr, es que en la conversión de imágenes RGB, los valores resultantes caen en un rango de 16 a 235 para el canal Y y de 16 a 240 para los canales CbCr, aislando a la imagen convertida, de los efectos de saturación por ruido presente en la imagen original RGB. La ventaja de este modelo, con respecto al modelo YUV, es que este modelo, es un modelo compensado y escalado del modelo de color YUV, así respecto a los valores de saturación presentes en una imagen RGB, el modelo YUV integra esos valores completamente en el canal Y, mientras que el modelo YIQ es un modelo opcional derivado del modelo YUV, presentando las mismas características de su antecesor (Devereux, 1987; ITU-R BT.601-5, 1995; ITU-R BT.470-6, 1998; ITU-R BT.709-4, 2000). Siguiendo en este contexto, en este escrito se propone la utilización del modelo de color YCbCr para obtener la imagen final fusionada del conjunto de imágenes de la región de mejor enfoque BFR. La justificación de la utilización de un modelo de color, diferente al RGB, es que el algoritmo propuesto utiliza solamente la información de la intensidad de la imagen, para realizar la fusión de imágenes.

Por último, es necesario definir las ecuaciones de conversión entre el modelo RGB a YCbCr y de YCbCr a RGB, las ecuaciones Ec. (39) y Ec. (40) respectivamente, realizan las transformaciones mencionadas.

Sea ,RGBf x y la imagen digital en RGB y yxf YCbCr , la imagen digital representada en el espacio de color

YCbCr, con canales ,Rf x y , ,Gf x y , ,Bf x y y yxf Y , , yxf Cb , , yxf Cr , respectivamente. Así las transformaciones mencionadas pueden estar representadas por las siguientes expresiones

yxfyxfyxf

yxfCr

Cb

Y

RGB

,,,

001.0772.11714.0344.014.10009.01

, , (39)

yxfyxfyxf

yxfB

G

R

YCbCr

,,,

081.0419.05.05.0331.0169.0

144.0587.0299.0, . (40)

Por último, se definen las funciones de conversión entre espacios de color utilizadas por el algoritmo de fusión, así

para convertir RGB YCbCr (Ec. 40), se define la función ,YCbCr RGBf x y y para convertir


(41)

(42)

Iv.1.2 Diseño del algoritmo de fusión

De manera similar a la sección 1, se introduci-rán algunas notaciones y definiciones útiles: sea

1 2 3, , , , Wf f f f las imágenes de una pila WS , con-teniendo W imágenes policromáticas capturadas por medio del CCD, de tamaño NxM píxeles, de una muestra capturada a incrementos zD en la dirección del eje Z del microscopio; sea

1 2 3, , , , Kf f f f un subconjunto de WS contenien-do K imágenes policromáticas de la pila para ser fusionadas, este subconjunto es llamado la re-gión de mejor enfoque BFR y contiene las imá-genes con el mejor enfoque que hayan sido cap-turadas, incluyendo la imagen de mejor enfoque fBF, obtenida por algún algoritmo de autoenfo-que (véase sección 1); el subconjunto BFR puede ser construido seleccionando una cantidad x de imágenes, donde x será una cantidad igual de imágenes seleccionadas arriba y abajo de fBF en la dirección del eje Z, por lo tanto el algoritmo fusionará K = 2ξ + 1 imágenes, donde WK < y

fBF está ubicada dentro 1 2 3, , , , Kf f f f en la po-

sición 2 1K BFf f +

= con subíndice 2K de acuerdo

a la ec (4); ( )kRGB yxf , es la k-ésima imagen po-

licromática capturada dentro de BFR con píxe-

les ( )yx, , de esto modo ( ) WkRGB SBFRyxf ⊂∈, ,

donde 1,2,..,x N= , 1,2,..,y M= y 1,2, ,k K= Sean ( )k

R yxf , , ( )kG yxf , , ( )k

B yxf , los cana-les RGB respectivamente de ( )k

RGB yxf , con un rango por canal [ ]255,0 , donde R es el canal rojo, G es el canal verde y B es el canal azul, en el es-pacio de color RGB (sección 3 1 1)

El par de integrales usadas en este escrito de la transformada de Fourier bidimensional están expresadas en las siguientes ecuaciones

(43)

(44)

donde ( )vu, son la frecuencias espaciales y 1−=j En la ec (43) se define la transformada espacial de Fourier bidimensional de ),( yxF Típicamen-te, ),( yxF es una función con variables en el es-pacio y ),( vuℑ es una función con variables en la frecuencia espacial

Respectivamente en la ec (44), notacional-mente, la transformada de Fourier definida en la ec (43) puede ser escrita como operador de la siguiente forma

(45)

por lo tanto, la entrada ),( yxF puede ser re-cobrada por la transformada inversa de Fourier definida en la ec (44) y escrita en forma opera-cional por la siguiente expresión

(46)

Así una vez definidas las notaciones y funciones utilizadas por el algoritmo, se procede con el de-sarrollo del algoritmo de fusión propuesto; este algoritmo está basado en el análisis espectral de la imágenes que van a ser fusionadas El algorit-mo convierte las imágenes policromáticas RGB al espacio de color YCbCr, donde el color y la intensidad están perfectamente separadas

Primeramente se debe obtener ( ) { },YCbCr YCbCr

BF BFf x y f= Φ , la representación de la imagen mejor enfocada ( ),YCbCr

BFf x y en el espacio YCbCr, donde ( ),Y

BFf x y , ( ),CbBFf x y y

( ),CrBFf x y son los canales respectivos en el espa-

cio YCbCr Posteriormente, se obtienen las representa-

ciones en YCbCr en las imágenes 1 2 3, , , , Kf f f f por medio de la expresión

(47)

Posteriormente, se obtienen los respectivos ca-nales ( ),Y

kf x y , ( ),Cb

kf x y y ( ),Cr

kf x y de cada

imagen convertida Así, la imagen final fusionada ( )* ,RGBf x y

puede ser obtenida por

(48)

( ) ( ){ }, ,YCbCr YCbCr RGBf x y f x y= Φ

( ) ( ){ }, ,RGB RGB YCbCrf x y f x y= Φ

16

YCbCr RGB (Ec. 39), se define la función ,RGB YCbCrf x y expresadas en forma notacional,

respectivamente por

, ,YCbCr YCbCr RGBf x y f x y (41)

, ,RGB RGB YCbCrf x y f x y . (42)

IV.1.2 Diseño del algoritmo de fusión De manera similar a la sección 1, se introducirán algunas notaciones y definiciones útiles: sea 1 2 3, , , , Wf f f f las

imágenes de una pila WS , conteniendo W imágenes policromáticas capturadas por medio del CCD, de tamaño

NxM píxeles, de una muestra capturada a incrementos z en la dirección del eje Z del microscopio; sea

1 2 3, , , , Kf f f f un subconjunto de WS conteniendo K imágenes policromáticas de la pila, para ser fusionadas, este subconjunto es llamado, la región de mejor enfoque BFR y contiene las imágenes con el mejor enfoque que hayan sido capturadas, incluyendo la imagen de mejor enfoque BFf , obtenida por algún algoritmo de autoenfoque (ver sección 1); el subconjunto BFR puede ser construido seleccionando una cantidad de imágenes, donde será

una cantidad igual de imágenes seleccionadas arriba y abajo de BFf en la dirección del eje Z, por lo tanto el

algoritmo fusionará 12K imágenes, donde WK y BFf está ubicada dentro 1 2 3, , , , Kf f f f en la

posición 2 1K BFf f con subíndice 2

K de acuerdo a la Ec. (4); kRGB yxf , es la k-ésima imagen

policromática capturada dentro de BFR con píxeles yx, , de esto modo WkRGB SBFRyxf , , donde

1, 2,..,x N , 1,2,..,y M y 1, 2, ,k K .

Sean kR yxf , , k

G yxf , , kB yxf , los canales RGB respectivamente de k

RGB yxf , con un rango por

canal 255,0 , donde R es el canal rojo, G es el canal verde y B es el canal azul, en el espacio de color RGB (sección 3.1.1).

El par de integrales usadas en este escrito de la transformada de Fourier bidimensional están expresadas en las siguientes ecuaciones

dydxeeyxFvu jvyjux),(),( (43)

( , ) ( , ) jux jvyF x y u v e e du dv , (44)

donde vu, son la frecuencias espaciales y 1j . En la Ec. (43) se define la transformada espacial de Fourier bidimensional de ),( yxF . Típicamente, ),( yxF es una función con variables en el espacio y ),( vu es una función con variables en la frecuencia espacial.

Respectivamente en la Ec. (44), notacionalmente, la transformada de Fourier definida en la Ec. 43 puede ser escrita como operador de la siguiente forma

( ){ }( , ) ,u v F x yℑ = F

( ) { }1, ( , )F x y u v−= ℑF

( ) ( ){ }, , 1, 2, ,YCbCr YCbCrk k

f x y f x y para k K= Φ =

( ) ( ){ }* *, ,RGB RGB YCbCrf x y f x y= Φ


donde ( )* ,YCbCrf x y es la imagen fusionada ob-tenida en el espacio YCbCr, siendo ( )* ,YCbCrf x y obtenida por la ecuación

(49)

Así la imagen ( )* ,YCbCrf x y es el resultado de la unión de los canales ( )* ,Yf x y , ( ),Cb

BFf x y y ( ),Cr

BFf x y Donde ( ),CbBFf x y y ( ),Cr

BFf x y son los canales de color de la imagen mejor enfocada

( ),YCbCrBFf x y y ( )* ,Yf x y es la imagen fusionada

en el canal Y En este contexto, ( )* ,Yf x y es obtenida por medio de la magnitud de la trans-formada inversa de Fourier de ( )** ,Yf u v , así

( )* ,Yf x y es expresada por

(50)

Continuando con el algoritmo de fusión de imágenes, para encontrar ( )** ,Yf u v , obten-gamos las transformadas de Fourier de cada imagen dentro de la región BFR; de esta for-ma, las transformadas de Fourier serán re-presentadas por ( ) ( ){ }*** , ,Y Y

k kf u v f x y= F

Por lo tanto, ( )** ,Yf u v puede ser obtenida por me-dio de la expresión

(51)

para 1,2,..,u N= , 1,2,..,v M= , 1,2, , 1k K= − La ec (51) representa el núcleo del algorit-

mo propuesto, ( )*** ,Yk

f u v es la magnitud del coeficiente de Fourier del canal Y de la imagen k-ésima, en la frecuencia espacial ( ),u v Así lo que expresa la ec (51) es la obtención de los co-eficientes de Fourier con mayor magnitud, para cada coordenada ( ),u v de cada imagen que va a ser fusionada

Resumiendo: la matriz bidimensional forma-da ( )** ,Yf u v contiene los coeficientes de Fourier de mayor magnitud de las imágenes de la región BFR, es decir las características relevantes del conjunto de imágenes que van a ser fusionadas, formándose con este proceso la imagen fusiona-da final, en el espacio de frecuencias de Fourier Por lo tanto, la ec (50) obtiene el canal Y de la imagen final fusionada, tal como se expresa, para posteriormente formar la imagen final de color

fusionada, expresadas en la ec (49) y en RGB en la ec (48) En la figura 10 se muestra el diagrama de flujo del algoritmo de fusión propuesto

Iv.2. Métricas de fusión

La fusión de imágenes es un proceso que involu-cra la integración de varias de éstas, donde el re-sultado es una imagen compuesta con las mejo-res características visuales con respecto a las que la formaron Por lo tanto, ¿cómo se puede medir la calidad de la imagen formada o fusionada?

varias métricas se han definido para medir los resultados experimentales de la fusión de imágenes, cómo por ejemplo el error cuadrático medio MSE, ampliamente utilizado para estas comparaciones Wang y Bovik (2002) introduje-ron una nueva métrica de calidad para medir la fusión de dos imágenes, ésta fue posteriormente extendida por Piella y Heijmans

En este capítulo se propone una nueva mé-trica (Bueno-Ibarra et al., 2005b), basada en las métricas creadas por los autores previamente mencionados, para medir la fusión de varias imá-genes, en lugar de sólo dos imágenes

Iv.2.1. Métrica de Wang y Bovik

Esta métrica consiste en el desarrollo de un índice de calidad donde no es necesaria una imagen de referencia para medir la calidad de la imagen fu-sionada En este contexto, la conclusión a la que llegaron es que esta métrica funciona mucho me-jor que MSE, debido a la capacidad de la métrica para medir las distorsiones estructurales presen-tes en las imágenes, mientras que MSE es una medida altamente sensible y tiende a introducir errores de energía (Piella y Heijmans, 2003)

Iniciaremos con una breve introducción a la métrica de Wang y Bovik Dadas dos imágenes

( ),g x y y ( ),h x y de tamaño NxM píxeles; sean gMV , hMV los valores de las medias de las imá-

genes ( ),g x y y ( ),h x y respectivamente; sea gV la varianza de ( ),g x y y ghCOV la covarianza

entre ( ),g x y y ( ),h x y Por lo tanto, la media MV para cualquier

imagen ( ),I x y dada, puede ser calculada por

(52)

( ) ( ) ( ) ( ){ }* *, , , ,YCbCr Y Cb CrBF BFf x y f x y f x y f x y=

( ) ( ){ }* 1 **, ,Y Yf x y f u v−= F

( )( ) ( ) ( )( )

*** *** ***** 1

***1

, , ,,

,

Y Y YY k k k

Yk

f u v sí f u v f u vf u v

f u v para cualquier otro+

+

≥=

( )1 1

1 ,M N

q pMV I p q

MN = =

= ∑ ∑


Consecuentemente, gV y ghCOV pueden ser ex-presadas respectivamente por

(53)

(54)

Wang y Bovik definen a 0Q como el índice de calidad utilizado para cuantificar las distorsiones estructurales entre dos imágenes dadas ( ),g x y y ( ),h x y Así 0Q puede ser expresado por

(55)

donde ,g hV V son las desviaciones estándar de las imágenes ( ),g x y y ( ),h x y De hecho, el índice 0Q es una medida de similaridad entre

( ),g x y y ( ),h x y , donde 0Q toma valores entre 1 y -1

Tres componentes son reconocidos en la

ec (55): gh

g h

COVV V

es el coeficiente de corre-

lación entre las imágenes ( ),g x y y ( ),h x y

40

k = Kk = K

Inicio delAlgoritmo

Obtención de laImagen Mejor Enfocada

en el espacio YCbCr

Obtención de los canales respectivos en el espacio YCbCr de la Imagen Mejor Enfocada

Obtención de los límites donde el algoritmo será

ejecutado, imagen inicial y final a fusionar

Al salir del ciclo la FFT del canal Y de la imagen

fusionada final está representada por

,YCbCrBFf x y

,YBFf x y ,Cb

BFf x y,Cr

BFf x y

1k K

Obtener la FFT del canal Y de la primera imagen a fusionar, donde k=1

*** ,Yk

f u v,Y

kf x yF

Obtener la FFT del canal Y de la imagen k-ésima

a fusionar, k+1***

1,Y

kf u v

1,Y

kf x yF

** ,Yf u v

Analizar los coeficientes de las FFT de las

imágenes k y k+1 de acuerdo a la Ec. (6.13) y

obtener** ,Yf u v

k = Kk = K

Hacer k=k+1 y

*** ,Yk

f u v

** ,Yf u v

Obtener el canal Y de la imagen fusionada, por

medio de* ,Yf x y

1 ** ,Yf u vF

Obtener la imagen fusionada en el espacio YCbCr, por medio de la

Ec. (6.11)

* ,YCbCrf x y

Obtener la imagen fusionada en el espacio RGB, por medio de la

Ec. (6.10)

* ,RGBf x y

Fin del Algoritmo

Figura 10

Figura 10. Diagrama de flujo del algoritmo de fusión propuesto.

( )2

1 1

1 ,( ) 1

M Ng g

q pV g p q MV

MN = =

= − − ∑ ∑

( )( ) ( )( )1 1

1 , ,( ) 1

M Ngh g h

q pCOV g p q MV h p q MV

MN = =

= − − − ∑ ∑

( )( ) ( )( )1 1

1 , ,( ) 1

M Ngh g h

q pCOV g p q MV h p q MV

MN = =

= − − − ∑ ∑

0 2 22 2gh g h g h

g hg h g h

COV MV MV V VQV VV V MV MV

= ++


teniendo un dominio de [ ]1,1− ; 2 2

2 g h

g h

MV MV

MV MV

+

es una clase de promedio de la distorsión de la

iluminación teniendo un dominio de [ ]0,1 ; final-

mente, 2 g h

g hV V

V V

+

es una medida de la distor-

sión debido al contraste y tiene un dominio de

[ ]0,1 El máximo valor de 0Q posible de obtener es 1, cuando las imágenes ( ),g x y y ( ),h x y son idénticas

Debido a que las señales de imágenes son no estacionarias —un proceso estacionario es aquel cuyos momentos no son afectados por el des-plazamiento del origen en el espacio o tiempo (Pratt, 1991)—, es conveniente calcular 0Q sobre regiones locales y después combinar los resulta-dos obtenidos en uno final; de esta forma, los au-tores proponen la estrategia del uso de una venta-na deslizante, dicha ventana se desplaza un píxel a la vez en la dirección ,x y a lo largo de toda la imagen Por lo tanto, sea sw la ventana deslizante de tamaño x yw w× píxeles, para cada sw

El índice de calidad local 0Q entre dos imágenes ( ),g x y y ( ),h x y , es calculado por la ec (55), sobre los píxeles ( ),i j , donde ( ), si j w∈ , consecuentemente el índice de cali-dad ( ) ( ) ( )( )0 , , , , sQ g i j h i j i j w∈ entre ( ),g x y y ( ),h x y , expresado en forma notacional está dado por ( )0 , sQ g h w

Mientras que el índice global de calidad ( )0 ,Q g h , entre las imágenes ( ),g x y y ( ),h x y

puede ser obtenido por

(56)

donde T es la familia de todas las ventanas des-lizantes calculadas y Τ es la cardinalidad de T Así la ec (56) define la métrica creada por Wang y Bovik para dos imágenes dadas ( ),g x y y ( ),h x y

Iv.2.2. Métrica de Piella y Heijmans

Esta métrica utiliza el índice de calidad 0Q , ex-presado en la ec (55), para definir una nueva mé-trica, donde ésta cuantifica la calidad de la ima-

gen *f obtenida de la fusión de las imágenes ( ),g x y y ( ),h x y Piella y Heijmans definen tres

índices nuevos para medir la calidad de fusión de acuerdo al aprovechamiento de diferentes carac-terísticas, estos índices son: Q , WtQ y EQ

Índice de calidad Q

Sea ( )sg wϒ algún factor prominente sobre la imagen ( ),g x y en la ventana sw , donde éste debe reflejar alguna relevancia local de la ima-gen ( ),g x y dentro de la ventana sw , así el fac-tor prominente de la imagen se puede obtener por medio del cálculo de la medición del con-traste, varianza o entropía

Sean ( )sg wϒ y ( )sh wϒ los factores promi-nentes locales de las imágenes ( ),g x y y ( ),h x y dentro de la ventana sw ; ahora bien, calculando el peso local λg (ws) con dominio de valores [0,1], éste indica la relevancia relativa de la imagen

( ),g x y comparada con la imagen ( ),h x y den-tro de la ventana sw Así mientras más grande es λg (ws) más peso es dado a la imagen ( ),g x y En este contexto, λg (ws) puede ser calculado por la expresión siguiente

(57)

Continuando de la misma forma, el peso λg (ws) de la imagen ( ),h x y comparada con la imagen

( ),g x y , puede ser calculado por

(58)

Observe en este caso que λg (ws), entonces el ín-dice de fusión ( ), , *Q g h f es definido como

(59)

En este contexto, ( ), , *Q g h f está principalmente determinado por la similitud de *f con respecto a la imagen ( ),g x y cuando λg (ws) es más grande que

( ) ( )0 01, ,

s

sw

Q g h Q g h w∈Τ

=Τ ∑

21

IV.2.2 Métrica de Piella y Heijmans Esta métrica utiliza el índice de calidad 0Q , expresado en la Ec. (55), para definir una nueva métrica, donde ésta

cuantifica la calidad de la imagen *f obtenida, de la fusión de las imágenes ,g x y y ,h x y . Piella y Heijmans definen tres índices nuevos para medir la calidad de fusión de acuerdo al aprovechamiento de diferentes características, estos índices son: Q , WtQ y EQ .


Sea sg w algún factor prominente sobre la imagen ,g x y en la ventana sw , donde éste debe de reflejar

alguna relevancia local de la imagen ,g x y dentro de la ventana sw , así el factor prominente de la imagen se puede obtener por medio del cálculo de la medición del contraste, varianza o entropía.

Sean sg w y sh w los factores prominentes locales de las imágenes ,g x y y ,h x y dentro de la

ventana sw , ahora bien, calculando el peso local g sw con dominio de valores 0,1 , éste indica la relevancia

relativa de la imagen ,g x y comparada con la imagen ,h x y dentro de la ventana sw . Así mientras más

grande es g sw más peso es dado a la imagen ,g x y . En este contexto, g sw puede ser calculado por la expresión siguiente

sg s

s s

g ww

g w h w. (57)

Continuando de la misma forma, el peso h sw de la imagen ,h x y comparada con la imagen ,g x y , puede ser calculado por

sh s

s s

h ww

g w h w, (58)

Observe en este caso que 1g s h sw w , entonces el índice de fusión , , *Q g h f es definido como

0 01, , * , * , *

s

g s s h s sw

Q g h f w Q g f w w Q h f w . (59)

En este contexto, , , *Q g h f está principalmente determinado por la similitud de *f , con respecto a la imagen

,g x y cuando g sw es más grande que h sw y con respecto a la imagen ,h x y cuando h sw es

más grande que g sw , sin embargo las medidas de calidad diferentes obtenidas dentro de cada ventana sw , son

21










sg s

s s

g ww

g w h w. (57)


sh s

s s

h ww

g w h w, (58)


0 01, , * , * , *

s

g s s h s sw





21










sg s

s s

g ww

g w h w. (57)


sh s

s s

h ww

g w h w, (58)


0 01, , * , * , *

s

g s s h s sw





21










sg s

s s

g ww

g w h w. (57)


sh s

s s

h ww

g w h w, (58)


0 01, , * , * , *

s

g s s h s sw






λh (ws) y con respecto a la imagen ( ),h x y cuando λh (ws) es más grande que λg (ws) , sin embargo las medidas de calidad diferentes obtenidas dentro de cada ventana sw , son tratadas equitativamen-te, contraponiéndose al proceso de visión huma-na, donde éste le da una importancia mayor a las regiones de una imagen con características pro-minentes o relevantes (Piella y Heijmans, 2003) De esta forma el índice ( ), , *Q g h f es calculado para obtener una medida de calidad de fusión dando un tratamiento homogéneo a las ventanas deslizantes

Índice de calidad WtQ

Este índice está definido como una variante al ín-dice de calidad Q , donde la imagen con mayores factores prominentes es pesada más que aquella con menores factores prominentes, correspon-diendo a aquellas áreas donde son encontradas partes visualmente importantes relativas a la escena Por lo tanto, estas áreas son más rele-vantes cuando el índice de calidad es calculado sobre la imagen completa; así el factor promi-nente general ( ),ov

sg h wϒ dentro de la ventana sw entre la imagen ( ),g x y y la imagen ( ),h x y ,

está definido por

(60)

De esta forma, el índice de medida de calidad de fusión con peso ( ), , *WtQ g h f entre las imágenes

( ),g x y y ( ),h x y , está expresado por

(61)

donde ( ) ( )( ),

,s

ovs

s ovs

w

g h wc w

g h w∈Τ

ϒ=

ϒ∑ es el factor de peso

Índice de calidad EQ

Finalmente, Piella y Heijmans introdujeron una última modificación al índice de medida de ca-lidad de fusión WtQ para que tomara en cuenta algunos aspectos relativos a la visión humana, con respecto a la información de los bordes en-

contrados en la escena, así se obtuvo el índice de calidad de fusión EQ

En esta estrategia la información de los bordes (análisis de los gradientes) es utilizada por la ec (61) Sean ( ),eg x y , ( ),eh x y y *ef las imágenes de los bordes, correspondientes a las imágenes ( ),g x y , ( ),h x y y *f respectiva-mente, por lo tanto la combinación de los índi-ces ( ), , *WtQ g h f y ( ), , *e e e

WtQ g h f puede ser obtenida para obtener la medida de fusión de los bordes por medio de la expresión siguiente

(62)

donde a es un parámetro de contribución de bor-de, el cual expresa la contribución de los bordes de las imágenes originales contra las imágenes de bordes, éste toma valores entre 0 y 1 y selec-cionando el valor de a cercano a 1, más impor-tancia se le da a la contribución de las imágenes de los bordes El índice de calidad ( ), , *EQ g h f es llamado índice de calidad de fusión dependien-te de bordes

Todos los índices descritos anteriormente to-man valores entre -1 a 1; entre más cercano sea el resultado del índice a 1, la imagen final fusio-nada tiene una mayor calidad de composición de las imágenes originales

Iv.2.3. Métrica multi-imagen

Los índices de calidad de fusión ( ), , *Q g h f , ( ), , *WtQ g h f y ( ), , *EQ g h f propuestos por

Piella y Heijmans, sólo miden la calidad de fu-sión de dos imágenes dadas ( ),g x y y ( ),h x y Sin embargo, el algoritmo de fusión descrito en este capítulo tiene la capacidad de fusionar va-rias imágenes, por lo tanto es importante tener una medida de calidad de fusión para evaluar el rendimiento del algoritmo De esta manera, se propone extender los índices de medida de cali-dad de fusión propuestos por Piella y Heijmans, para que sean útiles para medir la calidad de fu-sión de un proceso de fusión multi-imágenes

Sean 1 2 3 1, ,, , , , K Kf f f f f→ las imágenes que

serán fusionadas; sean ( )1, , , *KQ f f, ( )1, , , *Wt KQ f f

y ( )1, , , *E KQ f f

los índices de calidad de fusión propuestos por este trabajo para medir la fusión del algoritmo de fusión multi-imágenes

( ) ( ) ( ){ }( ), ,ovs s sg h w MAX g w h wϒ = ϒ ϒ

22

tratadas equitativamente, contraponiéndose al proceso de visión humana, donde éste le da una importancia mayor a las regiones de una imagen con características prominentes o relevantes (Piella y Heijmans, 2003). De esta forma el índice , , *Q g h f es calculado para obtener una medida de calidad de fusión dando un tratamiento homogéneo a las ventanas deslizantes.


Este índice esta definido cómo una variante al índice de calidad Q , donde la imagen con mayores factores prominentes es pesada más que aquella con menores factores prominentes, correspondiendo a aquellas áreas donde son encontradas partes visualmente importantes relativas a la escena. Por lo tanto estas áreas son más relevantes cuando el índice de calidad es calculado sobre la imagen completa, así el factor prominente general

,ovsg h w dentro de la ventana sw entre la imagen ,g x y y la imagen ,h x y , está definido por

, ,ovs s sg h w MAX g w h w . (60)

De esta forma, el índice de medida de calidad de fusión con peso , , *WtQ g h f entre las imágenes ,g x y y

,h x y , esta expresado por

0 0, , * , * , *s

Wt s g s s h s sw

Q g h f c w w Q g f w w Q h f w , (61)

donde ,

,s

ovs

s ovs

w

g h wc w

g h w es el factor de peso.


Finalmente Piella y Heijmans introdujeron una última modificación al índice de medida de calidad de fusión WtQ para que tomara en cuenta algunos aspectos relativos a la visión humana, con respecto a la información de los bordes encontrados en la escena, así se obtuvo el índice de calidad de fusión EQ .

En esta estrategia la información de los bordes (análisis de los gradientes) es utilizada por la Ec. (61). Sean

,eg x y , ,eh x y y *ef las imágenes de los bordes, correspondientes a las imágenes ,g x y , ,h x y y

*f respectivamente, por lo tanto la combinación de los índices , , *WtQ g h f y , , *e e eWtQ g h f puede

ser obtenida para obtener la medida de fusión de los bordes por medio de la expresión siguiente

1, , * , , * , , *e e eE Wt WtQ g h f Q g h f Q g h f , (62)

22








0 0, , * , * , *s

Wt s g s s h s sw


donde ,

,s

ovs

s ovs

w

g h wc w









22








0 0, , * , * , *s

Wt s g s s h s sw


donde ,

,s

ovs

s ovs

w

g h wc w










Índice de calidad ( )1, , , *KQ f f para la fusión de varias imágenes

Sean ( ) ( ) ( )1 2, , ,s s K sf w f w f wϒ ϒ ϒ los fac-tores prominentes de las imágenes 1, ,Kf dentro de la ventana sw y sean λf1 (ws), λf2 (ws), , λfK (ws) los pesos locales descritos anteriormente, así es-tos pesos locales pueden calcularse por medio de la siguiente expresión

(63)

así, el índice de calidad ( ), , *Q g h f en esta nue-va métrica puede ser escrito como

(64)

Índice de calidad ( )1, , , *Wt KQ f f para la fusión de varias imágenes

Sean ( )1, ,ov

K sf wϒ los factores prominentes ge-

nerales dentro de la ventana sw entre las imá-genes 1, ,Kf

, como se describió anteriormente, por lo tanto ( )1, ,

ovK sf wϒ

se obtuvo por la ex-presión

(65)

así, la nueva métrica de fusión por peso ( )1, , , *Wt KQ f f

entre las imágenes 1, ,Kf , puede

ser obtenida por

(66)

donde ( ) ( )( )1, ,*

1, ,s

ovK s

s ovK s

w

f wc w

f w∈Τ

ϒ=

ϒ∑

es el factor de peso

Índice de calidad ( ), , *EQ g h f para la fusión de varias imágenes

Finalmente, sean 1 2 3 1, ,, , , ,e e e e eK Kf f f f f→ las imá-

genes de bordes correspondientes a las imágenes 1, ,Kf

, por lo tanto combinando ( )1, , , *Wt KQ f f y

( )1, , , *e eWt KQ f f

podemos obtener el nuevo ín-dice de medida de calidad de fusión de bordes

( )1, , , *E KQ f f, expresado por la ecuación

(67)

donde a es el parámetro de contribución del borde, definido en forma similar como se descri-be en la sección anterior correspondiente

Iv.3. Experimentos computacionales

Para probar el algoritmo de fusión, se captura-ron 60 imágenes del microscopio Las imágenes utilizadas fueron de una muestra real (Tricho-dina) tomadas con una cámara CCD de Leica, modelo DC 300, conectada directamente al mi-croscopio DMRxA2; la resolución de operación de las imágenes capturadas fue de 2088 x 1550 píxeles, sin ninguna corrección previa El equipo utilizado fue el mismo utilizado para el algorit-mo de autoenfoque, incluyendo un disco adicio-nal de 200 GBytes, para almacenar las imágenes capturadas de la muestra

Después de que las imágenes fueron captu-radas y procesadas por el algoritmo de autoen-foque, con el objetivo de obtener la imagen de mejor enfoque y determinar el área de mejor en-foque BFR, se incluyeron 16 imágenes para ser fusionadas

El algoritmo propuesto de fusión tomó cada imagen de la región BFR y construyó la imagen final de acuerdo a lo explicado en la sección Iv 1 2 La figura 11a-11p muestra las imágenes de la región BFR que fueron fusionadas; en la fi-gura 11h se muestra la imagen de mejor enfoque obtenida por el algoritmo de autoenfoque pro-puesto; y por último, en la figura 11q se muestra la imagen final fusionada por el algoritmo des-crito en la sección Iv 1 2, estas imágenes fueron tomadas con un incremento en Z de 0 5 mm

En la figura 12a se muestra la ampliación de una sección de la partícula de la imagen mejor enfocada En la figura 12b se muestra la misma sección de la partícula de la imagen obtenida por el algoritmo de fusión, con el objetivo de que se aprecie la diferencia entre la imagen de mejor enfoque contra la imagen fusionada Observe cómo los bordes de las estructuras mostradas son mucho más definidos en la imagen fusionada que los mostrados en la imagen mejor enfoca-da, esto se debe a que la imagen fusionada in-tegra detalles finos de las imágenes capturadas

23

donde es un parámetro de contribución de borde, el cual expresa la contribución de los bordes de las imágenes originales contra las imágenes de bordes, éste toma valores entre 0 y 1 y seleccionando el valor de cercano a 1, más importancia se le da a la contribución de las imágenes de los bordes. El índice de calidad , , *EQ g h f es llamado índice de calidad de fusión dependiente de bordes.

Todos los índices descritos anteriormente toman valores entre -1 a 1, entre más cercano sea el resultado del índice a 1, la imagen final fusionada tiene una mayor calidad de composición de las imágenes originales.

IV.2.3 Métrica multi-imagen Los índices de calidad de fusión , , *Q g h f , , , *WtQ g h f y , , *EQ g h f propuestos por Piella y

Heijmans, sólo miden la calidad de fusión de dos imágenes dadas ,g x y y ,h x y . Sin embargo, el algoritmo de fusión descrito en este capítulo, tiene la capacidad de fusionar varias imágenes, por lo tanto es importante tener una medida de calidad de fusión para evaluar el rendimiento del algoritmo, de esta manera se propone extender los índices de medida de calidad de fusión propuestos por Piella y Heijmans, para que sean útiles para medir la calidad de fusión de un proceso de fusión multi-imágenes.

Sean 1 2 3 1, ,, , , , K Kf f f f f las imágenes que serán fusionadas; sean 1, , , *KQ f f , 1, , , *Wt KQ f f y

1, , , *E KQ f f los índices de calidad de fusión propuestos por este trabajo para medir la fusión del algoritmo de

fusión multi-imágenes.

Índice de calidad 1, , , *KQ f f para la fusión de varias imágenes

Sean 1 2, , ,s s K sf w f w f w los factores prominentes de las imágenes 1, ,Kf dentro de la

ventana sw y sean 1 2

, , ,Kf s f s f sw w w los pesos locales descritos anteriormente, así estos pesos

locales pueden calcularse por medio de la siguiente expresión

1 2

1 2

1 1 1

, , ,K

s s K sf s f s f sK K K

p s p s p sp p p

f w f w f ww w w

f w f w f w, (63)

así, el índice de calidad , , *Q g h f en esta nueva métrica puede ser escrito como

1, , 01

1, * , *p

s

K

K f s p sw p

Q f f w Q f f w . (64)

Índice de calidad 1, , , *Wt KQ f f para la fusión de varias imágenes

Sean 1, ,ov

K sf w los factores prominentes generales dentro de la ventana sw entre las imágenes 1, ,Kf ,

como se describió anteriormente, por lo tanto 1, ,ov

K sf w se obtuvo por la expresión

( ) ( ) ( ) ( ){ }( )1, , 1 2, , ,ovK s s s K sf w MAX f w f w f wϒ = ϒ ϒ ϒ

24

1, , 1 2, , ,ovK s s s K sf w MAX f w f w f w , (65)

así, la nueva métrica de fusión por peso 1, , , *Wt KQ f f entre las imágenes 1, ,Kf , puede ser obtenida por

*1, , 0

1, * , *

p

s

K

Wt K s f s p sw p

Q f f c w w Q f f w , (66)

donde 1, ,*

1, ,s

ovK s

s ovK s

w

f wc w

f w es el factor de peso.

Índice de calidad , , *EQ g h f para la fusión de varias imágenes

Finalmente, sean 1 2 3 1, ,, , , ,e e e e eK Kf f f f f las imágenes de bordes correspondientes a las imágenes 1, ,Kf ,

por lo tanto combinando 1, , , *Wt KQ f f y 1, , , *e eWt KQ f f podemos obtener el nuevo índice de medida

de calidad de fusión de bordes 1, , , *E KQ f f , expresado por la ecuación

11, , 1, , 1, ,, * , * , *e e

E K Wt K Wt KQ f f Q f f Q f f , (67)

donde es el parámetro de contribución del borde, definido en forma similar como se describe en la sección anterior correspondiente. IV.3 Experimentos computacionales Para probar el algoritmo de fusión, se capturaron 60 imágenes del microscopio, las imágenes utilizadas fueron de una muestra real (Trichodina) tomadas con una cámara CCD de Leica, modelo DC 300, conectada directamente al microscopio DMRXA2; la resolución de operación de las imágenes capturadas, fue de 2088 x 1550 píxeles, sin ninguna corrección previa. El equipo utilizado fue el mismo utilizado para el algoritmo de autoenfoque, incluyendo un disco adicional de 200 GBytes, para almacenar las imágenes capturadas de la muestra.

Después de que las imágenes fueron capturadas y procesadas por el algoritmo de autoenfoque, con el objetivo de obtener la imagen de mejor enfoque y determinar el área de mejor enfoque BFR, se incluyeron 16 imágenes para se fusionadas.

El algoritmo propuesto de fusión, tomó cada imagen de la región BFR y construyó la imagen final de acuerdo a lo explicado en la sección IV.1.2. La Fig. 11a-11p, muestra las imágenes de la región BFR que fueron fusionadas, en la Fig. 11h se muestra la imagen de mejor enfoque obtenida en por el algoritmo de autoenfoque propuesto y por último en la Fig. 11q se muestra, la imagen final fusionada por el algoritmo descrito en la sección IV.1.2, estas imágenes fueron tomadas con un incremento en Z de 0.5 m .

23

donde es un parámetro de contribución de borde, el cual expresa la contribución de los bordes de las imágenes originales contra las imágenes de bordes, éste toma valores entre 0 y 1 y seleccionando el valor de cercano a 1, más importancia se le da a la contribución de las imágenes de los bordes. El índice de calidad , , *EQ g h f es llamado índice de calidad de fusión dependiente de bordes.

Todos los índices descritos anteriormente toman valores entre -1 a 1, entre más cercano sea el resultado del índice a 1, la imagen final fusionada tiene una mayor calidad de composición de las imágenes originales.

IV.2.3 Métrica multi-imagen Los índices de calidad de fusión , , *Q g h f , , , *WtQ g h f y , , *EQ g h f propuestos por Piella y

Heijmans, sólo miden la calidad de fusión de dos imágenes dadas ,g x y y ,h x y . Sin embargo, el algoritmo de fusión descrito en este capítulo, tiene la capacidad de fusionar varias imágenes, por lo tanto es importante tener una medida de calidad de fusión para evaluar el rendimiento del algoritmo, de esta manera se propone extender los índices de medida de calidad de fusión propuestos por Piella y Heijmans, para que sean útiles para medir la calidad de fusión de un proceso de fusión multi-imágenes.

Sean 1 2 3 1, ,, , , , K Kf f f f f las imágenes que serán fusionadas; sean 1, , , *KQ f f , 1, , , *Wt KQ f f y

1, , , *E KQ f f los índices de calidad de fusión propuestos por este trabajo para medir la fusión del algoritmo de

fusión multi-imágenes.

Índice de calidad 1, , , *KQ f f para la fusión de varias imágenes

Sean 1 2, , ,s s K sf w f w f w los factores prominentes de las imágenes 1, ,Kf dentro de la

ventana sw y sean 1 2

, , ,Kf s f s f sw w w los pesos locales descritos anteriormente, así estos pesos

locales pueden calcularse por medio de la siguiente expresión

1 2

1 2

1 1 1

, , ,K

s s K sf s f s f sK K K

p s p s p sp p p

f w f w f ww w w

f w f w f w, (63)

así, el índice de calidad , , *Q g h f en esta nueva métrica puede ser escrito como

1, , 01

1, * , *p

s

K

K f s p sw p

Q f f w Q f f w . (64)

Índice de calidad 1, , , *Wt KQ f f para la fusión de varias imágenes

Sean 1, ,ov

K sf w los factores prominentes generales dentro de la ventana sw entre las imágenes 1, ,Kf ,

como se describió anteriormente, por lo tanto 1, ,ov

K sf w se obtuvo por la expresión

24

1, , 1 2, , ,ovK s s s K sf w MAX f w f w f w , (65)

así, la nueva métrica de fusión por peso 1, , , *Wt KQ f f entre las imágenes 1, ,Kf , puede ser obtenida por

*1, , 0

1, * , *

p

s

K

Wt K s f s p sw p

Q f f c w w Q f f w , (66)

donde 1, ,*

1, ,s

ovK s

s ovK s

w

f wc w

f w es el factor de peso.

Índice de calidad , , *EQ g h f para la fusión de varias imágenes

Finalmente, sean 1 2 3 1, ,, , , ,e e e e eK Kf f f f f las imágenes de bordes correspondientes a las imágenes 1, ,Kf ,

por lo tanto combinando 1, , , *Wt KQ f f y 1, , , *e eWt KQ f f podemos obtener el nuevo índice de medida

de calidad de fusión de bordes 1, , , *E KQ f f , expresado por la ecuación

11, , 1, , 1, ,, * , * , *e e

E K Wt K Wt KQ f f Q f f Q f f , (67)

donde es el parámetro de contribución del borde, definido en forma similar como se describe en la sección anterior correspondiente. IV.3 Experimentos computacionales Para probar el algoritmo de fusión, se capturaron 60 imágenes del microscopio, las imágenes utilizadas fueron de una muestra real (Trichodina) tomadas con una cámara CCD de Leica, modelo DC 300, conectada directamente al microscopio DMRXA2; la resolución de operación de las imágenes capturadas, fue de 2088 x 1550 píxeles, sin ninguna corrección previa. El equipo utilizado fue el mismo utilizado para el algoritmo de autoenfoque, incluyendo un disco adicional de 200 GBytes, para almacenar las imágenes capturadas de la muestra.

Después de que las imágenes fueron capturadas y procesadas por el algoritmo de autoenfoque, con el objetivo de obtener la imagen de mejor enfoque y determinar el área de mejor enfoque BFR, se incluyeron 16 imágenes para se fusionadas.

El algoritmo propuesto de fusión, tomó cada imagen de la región BFR y construyó la imagen final de acuerdo a lo explicado en la sección IV.1.2. La Fig. 11a-11p, muestra las imágenes de la región BFR que fueron fusionadas, en la Fig. 11h se muestra la imagen de mejor enfoque obtenida en por el algoritmo de autoenfoque propuesto y por último en la Fig. 11q se muestra, la imagen final fusionada por el algoritmo descrito en la sección IV.1.2, estas imágenes fueron tomadas con un incremento en Z de 0.5 m .


en otros planos focales, mientras que la imagen mejor enfocada únicamente contiene caracterís-ticas de un solo plano focal

En la figura 13 se presenta otro ejemplo de una muestra de tejido de camarón, donde se aprecia claramente la diferencia entre la imagen mejor enfocada y la imagen obtenida por el algo-ritmo de fusión descrito en este capítulo

Para medir el rendimiento del algoritmo de fusión propuesto, se extendieron las métricas de medición de calidad de fusión desarrolladas y se describen unas nuevas métricas en este capítu-lo (Bueno-Ibarra et al., 2005b) Los resultados

42

Figura 12

41

Figura 11

Figura 11. (a-p) Imágenes que fueron fusionadas, con índices dentro de la pila 23 al 38, respectivamente, (h) imagen mejor enfocada obtenida por el algoritmo de autoenfoque, con índice dentro de la pila de 30 y (q) imagen final fusionada obtenida por el algoritmo propuesto de fusión de imágenes.

Figura 12. Diferencia entre la imagen mejor enfocada de una Trichodina (a) y la imagen final fusionada (b) obtenida por el algoritmo propuesto de fusión de imágenes.


obtenidos mostrados de la medición de calidad del algoritmo (tabla 2) muestran que el algoritmo propuesto incrementa la información de la imagen fusionada, observándose al mismo tiempo un in-cremento de la calidad visual Se utilizan tres índi-ces de medición para medir la calidad del algorit-mo propuesto, Q , WtQ y EQ Así el índice Q mide la capacidad del algoritmo para tomar ventaja de las características de las imágenes fusionadas en forma homogénea, los índices WtQ y EQ miden la capacidad del algoritmo para tomar ventaja de las características visuales y de la información de los bordes de las estructuras presentes en las imáge-nes, respectivamente; así estos índices toman en cuenta algunos aspectos de la visión humana Por lo tanto, las métricas propuestas son capaces de otorgar una muy buena noción del rendimiento del algoritmo analizado De acuerdo a Piella y Heijmans, valores obtenidos por los índices cerca-nos a 1 0 significan que la imagen fusionada final contiene un conjunto de características de alta ca-lidad de las imágenes que la integran, implicando el nivel de desempeño del algoritmo

V. Conclusiones

El algoritmo de autoenfoque propuesto ofrece un aumento significativo en la velocidad de eje-cución cuando se incrementa la resolución de operación de las imágenes analizadas y es equi-parable en los resultados obtenidos, con respec-to a los algoritmos citados anteriormente

Cabe mencionar que el algoritmo más sen-sible y eficiente para obtener la imagen en foco y con resultados similares a los obtenidos por el ojo humano, es el algoritmo de varianza global; sin embargo su costo de proceso es el más alto Este algoritmo presenta resultados similares al método de varianza global

El algoritmo presenta además una eficien-cia y robustez significativas, por la estructura de diseño, ya que la imagen de referencia siempre estará fuera foco, esto hace que el algoritmo siempre realice una comparación absoluta sobre cada muestra analizada, evitando que la platina se mueva en ambas direcciones (hacia arriba y abajo) para obtener la imagen mejor enfocada Así, este algoritmo presenta como ventaja la ob-tención de la imagen mejor enfocada en un solo movimiento

Por otro lado, el algoritmo puede procesar imágenes en diferentes condiciones o ambien-tes de iluminación, como por ejemplo imágenes capturadas en campo claro y oscuro, haciéndolo sumamente útil para procesar imágenes de par-tículas diferentes, sin cambiar sus parámetros de operación, permitiendo que el proceso de cap-tura sea realmente automático, sin intervención humana

Sin embargo, la imagen mejor enfocada ob-tenida por este algoritmo puede ser mejorada en calidad visual y de información contenida en el proceso de fusión; este proceso de autoenfoque es el punto de partida para obtener las imágenes que van a ser fusionadas

Generalmente, cuando enfocamos manual-mente una muestra en el microscopio, varias imágenes cercanas al punto de enfoque contie-nen información visual útil que no es incluida cuando se obtiene la imagen mejor enfocada; esta información integrada en una imagen final representaría la posibilidad de realizar un análi-sis mucho más preciso a la partícula, sin embar-go la necesidad de desarrollar un algoritmo que

Tabla 2

30

Tabla 2

Índice Resultado

La tabla muestra los resultados obtenidos de los diferentes índices de calidad, donde entre más cercano el valor del ín-dice a 1.0, significa mejor rendimiento del algoritmo para fu-

sionar imágenes.

Figura 13. Diferencia entre la imagen mejor enfocada de te-jido de camarón (a) y la imagen final fusionada (b) obtenida por el algoritmo propuesto de fusión de imágenes.

43

Figura 13


recopile e integre en una imagen final todas esas características visuales se hace imprescindible En este contexto, se describió un algoritmo nue-vo de fusión de imágenes que extrae las mejores características de las imágenes fusionadas para crear una imagen final Por otro lado, se desarro-lló un conjunto de métricas nuevas para medir el rendimiento y eficiencia del algoritmo que se propone

Por los resultados obtenidos, el algoritmo propuesto es robusto y tiene la capacidad de poder ser implementado en tiempo real ya que su consumo anda alrededor de 40 segundos por imagen fusionada en alta resolución (3 2 MPíxe-les) Al momento de la redacción del presente documento, este algoritmo ya operaba en el procesamiento de las imágenes capturadas, mos-trando un rendimiento similar a los experimen-tos realizados; así el algoritmo ha fusionado — hasta este momento— alrededor de unas 3,000 imágenes de muestras de tejido de camarón

Por último, este algoritmo viene a completar el proceso de adquisición automático de imáge-nes, integrando una plataforma computacional automática de captura para proveer imágenes de la máxima calidad visual y de información para ser analizadas posteriormente de acuerdo a alguna estrategia dependiente del tipo de par-tícula Como trabajo futuro, habría que imple-mentar nuevos algoritmos de fusión basados en otras herramientas más adecuadas que el análi-sis de frecuencias por Fourier; sin embargo este algoritmo, de la forma en que fue propuesto, presenta un diseño sumamente óptimo tanto en ejecución como en rendimiento, para resolver el tipo de problemáticas en microscopía como la información tridimensional de los cuerpos mi-croscópicos

VI. Bibliografía

Achalakul, Tiranee Haaland, D Peter y Stephen Taylor (1999) “Math Web: a concurrent ima-ge analysis tool suite for multispectral data fusion” Proc. SPIE, vol 3719, pp 351-358

Bloch, I y Henri Maitre (1997) Image Fusion International Science Foundation Workshop on Data Mining, Granada, España, abril

Bocker, W , W Rolf, W Muller y C Streffer (1996) “Investigations about autofocus al-gorithms for fluorescent-microscopy” En: SPIE Applications of digital image processing XIX, vol 2847, pp 445-456

Boddeke, F R , L J van vliet, H Netten e I T Young, (1994) “Autofocusing in microscopy based on the OTF and sampling” Bioima-ging, 2: 193-203

Brigham E , Oran (1988) The fast Fourier trans-form and its applications Prentice Hall, En-glewood Cliff, New Jersey 07632, pp 9-11

Bueno, Mario A , Josué Álvarez-Borrego, Leo-nardo Acho y María Cristína Chávez-Sán-chez (2005a) “Fast Autofocus Algorithm for Automatized Microscopes” Optical Enginee-ring, 44(6), junio

Bueno, Mario A , Josué Álvarez-Borrego, Leo-nardo Acho y María Cristína Chávez-Sán-chez (2005b) “Polychromatic image fusion algorithm and fusion metric for automati-zades microscopes” Optical Engineering, 44(9), 093201, septiembre 16

Devereux, v G (1987) “Limiting of YUv digital video signals” BBC Research Department Report BBC RD1987 22

Ellenberger, S L e I T Young (1998) “Micros-cope image acquisition” En: R Baldock y J Graham (ed ) Image processing and analy-sis Oxford University Press, Oxford, Reino Unido

Firestone, L K , K Cook, K Culp, N Talsania y K Preston (1991) “Comparisons of auto-focus methods for automated microscopy” Cytometry, 12: 195-206

Foley, James D , Andries van Dam, Steven K Feiner y John F Hughes (1995, 2ª ed ) Com-puter graphics Principles and Practice Addi-son Wesley, ISBN: 0-201-84840-6

Forero, Manuel G , Filip Sroubek, Jan Flusser, Rafael Redondo y Gabriel Cristóbal (2003) “Automatic screening and multifocus fusion methods for diatom identification” Applica-tions and Science of Neural networks, Fuzzy Systems and Evolutionary Computation VI, Proc SPIE vol 5200, pp 197-206, diciem-bre

González, R y R Woods (2002, 2ª ed ) Digital Image Processing Prentice Hall, USA, pp 125, 128,-130, 151-152


Groen, F , I T Young y G Ligthard (1985) “A comparisons of different focus functions for use in autofocus algorithms” Cytometry, 6: 81-91

Hill, Paul, Nishan Canagarajah y Dave Bull (2002) “Image Fusion using Complex Wave-lets” British Machine vision Conference, Book BMCv02, septiembre

ITU-R BT 601-5 (1995) Studio Encoding Para-meters of Digital Television for Standard 4:3 and Widescreen 16:9 Aspect Ratios

ITU-R BT 470-6 (1998) Conventional Television Systems

ITU-R BT 709-4 (2000) Parameters Values for HDTV Standards for Production and Interna-tional Programme Exchange

Krotkov, E , (1987) “Focusing” Int. J. Comp. Vi-sion, I: 223-237

Li, Shutao, James T Kwok y Yaonan Wang (2002) “Multifocus image fusion using ar-tificial neural” Pattern Recognition Letters, 23(8): 985-997, junio

Nikulin, vladimir y George Bebis (2004) “Mul-tiresolution image retrieval through fusion” Storage and Retrieval Methods and Applicati-ons for Multimedia, Proc SPIE vol 5307, pp 377-387, enero

Pech Pacheco, J L , y G Cristóbal (2000) “Dia-tom autofocusing in bright field microscopy: a comparative study” Proc. Int. Conf. on Pat-tern Recognition, Barcelona, IEEE Compu-ter Soc , Los Alamitos, CA, USA, vol 3, pp 318-321

Pech Pacheco, J L , Gabriel Cristóbal, J Álva-rez-Borrego y Cohen-León (2001) “Automa-tic System for Phytoplanktonic Algae Identi-fication” Limnética, 20(1): 143-158

Petrovic, vladimir (2003) “Multilevel image fu-sion” Proc. SPIE, vol 5099, pp 87-96, abril

Piella, G y Henk Heijmans (2003) “A new qua-lity metric for image fusion” International Conference on Image Processing, CWI, Ams-

terdam, Países Bajos, vol 3, pp III 173-176, vol 2, sep

Pratt, W K (1991, 2ª ed ) Digital image proces-sing Wiley Interscience Press, USA, pp 62-72

Rockinger, O (1996) “Pixel level fusion of image sequences using wavelet frames”, Proc. 16th Leeds Annual Statistical Research Workshop, Leeds University Press, pp 149-154

Russ, J C (1995, 2ª ed ) The Image Processing Handbook CRC Press, Inc , Boca Raton, Florida

Rosenfeld, A y A C Kak (1982, 2ª ed ) Digital Picture Processing, Academic Press, Nueva York, vol 1

Schlag, J F , A C Sanderson, C P Neuman y F C Wimberly (1983) “Implementation of automatic focusing algorithms for computer vision system camera control” Technical Re-port CMU-RI-TR-83-14, Robotics Institute, Carnegie Melon University

Sharma, Ravi K y Misha Pavel (1996) “Adaptive and statistical image fusion” Society for In-formation Display Digest, vol xxvII, pp 969-972, mayo

Subbarao, M y A Nikzad (1993) “Focusing te-chniques” Opt. Eng., 32(11): 2824-2836

Tenenbaum, J M (1970) “Accommodation in computer vision” Tesis doctoral Stanford University, USA

Wang, Z y A C Bovik (2002) “A universal ima-ge quality index” IEEE Signal Processing Letters, 9(3): 81-84, marzo

Yeo, T , S Ong, L Jayasooriah y R Sinniah (1993) “Autofocusing for tissue microscopy” Image and Vision Comp., 11(10): 629-639

Zheng, Yufeng, A Essock Edward y C Hansen Bruce (2004) “An advanced image fusion al-gorithm based on wavelet transform: incor-poration with PCA and morphological pro-cessing” Image Processing, Proc SPIE vol 5298, pp 177-187, mayo

capítulo 11 Inspección óptica automatizada de circuitos impresos

Jorge L. FloresGuillermo García Torales

Josué Álvarez Borrego

I. Introducción

No es difícil observar cómo la automatización de los procesos de producción industrial, desde prin-cipios del siglo xx a la fecha, ha venido liberando a los seres humanos de una gran cantidad de labo-res consideradas físicamente pesadas o peligrosas Sin embargo, un gran número de tareas conside-radas como labores físicamente livianas, tal como la inspección de partes — incluyendo la medición de parámetros importantes que determinan la ca-lidad de un producto—, sigue siendo una labor desarrollada principalmente por humanos Como resultado, estos procesos pueden sufrir de retra-sos y deficiencias en los estándares de calidad Lo anterior es debido a que los inspectores huma-nos sufren de fatiga por sobrecarga de trabajo y generalmente se ven inundados de documentos, gráficos y datos pendientes de ser procesados Además, la inspección humana puede ser incon-sistente, dependiendo del nivel de entrenamiento y/o de la habilidad del personal

El proceso de inspección implica principal-mente la adquisición de la información a través del órgano visual, el procesamiento de esta in-formación y la toma de decisión a través del ce-rebro Esto es realmente la función de un siste-ma automático de reconocimiento de patrones Debido al hecho de que el reconocimiento de patrones es una cualidad básica de seres huma-nos De ahí que el desarrollo de máquinas con habilidades como la detectar y reconocer carac-terísticas que definen un objeto, siga siendo uno de los retos más importantes que el ser humano se haya planteado Máquinas con estas capacida-des están pensadas para ayudar al ser humano en actividades consideradas peligrosas y/o tediosas

Dentro de la industria de manufactura se emplean sistemas ópticos de inspección automa-tizada (SOIA), estos sistemas se emplean para analizar la calidad de productos en las diferentes etapas del proceso de producción Los SOIA ge-neralmente incluirán los siguientes componentes o etapas: • La primera etapa incluye la generación de

un banco de los modelos o los patrones de los objetos por reconocer

• La segunda etapa incluye la adquisición de la imagen bajo prueba y el preprocesamien-to de la misma En el preprocesamiento se aplican filtros lineales a la imagen en general con el fin de mejorar el contraste, eliminar ruido, realzar bordes y también para tareas más específicas como la segmentación de ob-jetos que componen una imagen, etc (Gon-zález et al., 2004; Jain et al., 1998)

• La tercera etapa es la de extracción de rasgos o características que ayuden a identificar, clasificar y localizar el objeto de interés den-tro de una escena dada Las características o rasgos a analizar por el sistema dependen de las características del objeto, el sistema de adquisición de imágenes y de los algoritmos que se estén empleando

• La última etapa es la clasificación de los ob-jetos de acuerdo a los estándares de calidad En esta etapa se analiza si cada uno de los objetos identificados cumple con los criterios de aceptabilidad establecidos para un pro-ducto final dado

En este capítulo se describe un conjunto de téc-nicas de reconocimiento de objetos, basadas en filtros acoplados no lineales, que han mostrado su eficiencia en la solución de problemas rela-

218 Jorge L. Flores, Guillermo García Torales y Josué Álvarez Borrego

cionados con la extracción de rasgos viables para clasificar un objeto, i e posición, orientación, tamaño, etc En particular, nos enfocaremos al monitoreo de defectos en tarjetas de circuitos impresos

II. Pruebas de detección de fallas

La industria electrónica tiene un gran número de opciones a considerar cuando se diseñan las estrategias de prueba de ensambles en las tar-jetas de circuito impreso (PCBA, por sus siglas en inglés) La inspección óptica automatizada e inspección por rayos x automatizada (AOI y AxI, por sus siglas en inglés, respectivamente) Ambas técnicas se utilizan principalmente para detectar soldadura cortocircuitada, soldadura abierta, componentes defectuosos, componentes no existentes y componentes mal orientados o mal posicionados Aparte de estas dos técnicas no invasivas se realiza otro tipo de pruebas: son-das móviles sin contacto (FPT), pruebas sobre el circuito (ICT), esta última utiliza un equipo automático de prueba (ATE) que tiene la capaci-dad de probar eléctricamente cada componente de tarjeta (uno a la vez), mientras que está co-nectado a otros componentes En la tabla 1 se describe cada una de estas técnicas Podemos observar que cada prueba en particular tiene sus propias características de detección de fallas y rendimiento Por lo anterior, los usuarios tie-

nen que evaluar las ventajas y desventajas que presenta cada una de ellas, antes de determinar la estrategia de prueba óptima Para ello, los in-genieros de prueba tienen que hacer un balance de los costos de funcionamiento, la inversión de capital, productividad, la resolución del diagnós-tico, capacidad de retroalimentación del proceso y la fiabilidad del producto a largo plazo

III. Estándares de aceptabilidad

En esta sección definiremos algunos de los re-quisitos de aceptación para la manufactura de ensambles electrónicos Estos requisitos están definidos por el estándar IPC-A-610 emitido por “Association connecting electronic industries, IPC” (IPC, 2005) Este documento describe varias características de las tarjetas de circuitos impresos y/o ensambles relacionados a las con-diciones deseadas, las cuales exceden las carac-terísticas mínimas aceptables, señaladas por el estándar del producto final y refleja las diferen-tes condiciones que están fuera de control para ayudar a los evaluadores de procesos de la línea en determinar la necesidad de acción correctiva

III.1. Criterios de aceptabilidad para chips o circuitos integrados

Los criterios de aceptabilidad se dan en cuatro niveles: condición ideal, condición aceptable, así

Tabla 1Errores detectados por varios sistemas de prueba/inspección

X Pobre—Bueno ü Muy bueno

HVI API AOI AXI FPT MDA ICT FT

Soldadura cortocircuitada — — — ü — — — —Soldadura abierta X X — ü — — — —Fiabilidad de la soldadura X — X ü X X X XComponente equivocado X X ü X ü ü ü —Componente defectuoso X X X X — — ü üComponente no existente ü X ü ü ü ü ü —No orientado — X ü — ü ü ü —Fiabilidad funcional X X X X X X X —HVI: Inspección Visual Humana; API: Inspección automatizada de la soldadura; AOI: Inspección óptica automatizada; AXI: Inspección automatizada de rayos X; FPT: Prueba de vuelo; MDA: Analizador de defectos en la producción; ICT: Prueba en circuitos de entrada; FT: Prueba funcional.

219Inspección óptica automatizada de circuitos impresos

como condición de defecto y condición de indica-dor de proceso Estas condiciones se especifican para los diferentes componentes electrónicos

a) Chip con terminales cuadradas o rectangulares

La figura 1 ilustra la condición que mantendrá la integridad y confiabilidad de ensamble de un chip con terminales cuadradas o rectangulares El montaje de este tipo de componente se con-sidera aceptable si el desplazamiento lateral (A) es menor o igual al 50% del ancho del área de la terminación del componente (W) o 50% del ancho (véase figura 1a) De esta forma, se con-sidera condición de defecto si el desplazamiento lateral (A) es mayor al 50% del ancho del área de la terminación del componente (W) o 50% del ancho de la pista (P), el que sea menor (véase figura 1b)

terminales encasquilladas y los parámetros para determinar la condición de aceptabilidad, la cual mantendrá la integridad y confiabilidad del en-samble de este circuito integrado

8

a) b)

8

a) b)

Figura 1. Componentes con terminales cuadradas o rectangu-lares: (a) condición aceptable y (b) condición de defecto.

10

Figura 2

Figura 2. Componentes con terminaciones encasquilladas.

b) Circuitos integrados con terminales encasquilladas

El estándar de montaje de chips con termina-les encasquilladas establece que el criterio de aceptabilidad se cumple cuando el máximo des-plazamiento lateral (A) es el 50% del ancho del encastillado (W) Por otro lado, se considera un defecto cuando el máximo desplazamiento late-ral (A) excede el 50% del ancho del encastillado (W) La figura 2 ilustra un circuito integrado con

11

a) b) Figura 3

11

a) b) Figura 3

Figura 3. Circuitos integrados con terminales: (a) tipo Listón Plano, L y (b) Ala de Gaviota.

c) Circuitos integrados con terminales chips con terminales tipo Listón Plano, L y Ala de Gaviota

El estándar de montaje de chips con terminales tipo Listón Plano, L y Ala de Gaviota establece que el criterio de aceptabilidad se cumple cuan-do: El máximo desplazamiento lateral (A) no es mayor que 25% del ancho de la TDC (W) o 0 5 mm [0 02 pulg ], la dimensión más pequeña Esta configuración se ilustra en la figura 3a En la fi-gura 3b se observa el montaje de un chip en la condición de defecto puesto que el máximo des-plazamiento lateral (A) es mayor que 50% del ancho de la TDC (W) o 0 5 mm [0 02 pulg]

(a)

(b)


e) Componentes con terminaciones en el plano térmico inferior

Dispositivos electrónicos con un empaquetado tipo TO-220 son comúnmente usados en transis-tores, rectificadores de silicio, tiristores, etc El empaquetado TO-220 comúnmente tiene tres terminales, sin embargo se manufacturan de dos, cuatro, cinco o siete terminales Una carac-terística notable es una base metálica usada para montarlo sobre un disipador de calor En este tipo de dispositivos se considera que se cumple con los criterios de aceptabilidad cuando: la ter-minación en el plano térmico (A), el desplaza-miento lateral no es mayor de 25% del ancho de la terminación, esta condición se muestra en la figura 5; se considera condición de defecto si la terminación en el plano térmico (A), el despla-zamiento lateral es mayor de 25% del ancho de la terminación

Los criterios descritos anteriormente no pueden cubrir todas las posibles combinaciones de componentes y diseño de productos Sin em-bargo, cubren los casos más comunes y que servi-rán para ilustrar la viabilidad del uso de técnicas

d) Circuitos integrados con terminales redondas o aplanadas (acuñadas)

El estándar de montaje de chips con termina-les redondas o aplanadas (acuñadas) establece que el criterio de aceptabilidad se cumple cuan-do el máximo desplazamiento lateral (A) no es mayor que 50% del ancho o del diámetro de la terminal (W), ambas configuraciones se ilustran en la figura 4 Se considera un defecto cuando el máximo desplazamiento lateral (A) es mayor que 50% del ancho /diámetro (W)

de reconocimiento de objetos a fin de evaluar el montaje de componentes en PCBA

13

Figura 4

Figura 5. Componentes con terminaciones en el plano térmi-co inferior.

12

Figura 4. Circuitos integrados con terminales redondas o aplanadas (acuñadas).

IV. Sistema óptico de inspección automatizada

El arreglo experimental puede dividirse en tres fases: adquisición de las imágenes, análisis au-tomáticos de las imágenes adquiridas y la etapa de clasificación, como se muestra en la figura 6 En la fase de adquisición, la imagen es capturada por una cámara CCD La imagen digital es des-pués utilizada en la segunda etapa, donde aplica-mos técnicas de reconocimiento de objetos a fin de extraer los rasgos viables que puedan ser usa-dos para identificar y localizar los componentes dentro de la tarjeta PCBA La tercera es la etapa de clasificación de acuerdo a un conjunto de pa-rámetros previamente definidos: identificación, posición, etcétera

V. Hardware para la adquisición de imágenes

El arreglo experimental consiste de una cáma-ra CCD monocromática, modelo Sony xCD-Sx910, cuya resolución es de 1280 x 960 píxeles cuadrados La imagen es adquirida por una PC Pentium Iv vía una tarjeta de adquisición de imágenes NI-PCI 8252, la cual usa el bus de da-tos “Fire Wire” El sistema de iluminación con-siste de una lámpara tubular circular, esta confi-guración produce una iluminación uniforme del objeto, cuando se usa a la distancia adecuada La iluminación uniforme del área de inspección y evitar que la luz reflejada por puntos de solda-dura sature al detector son parámetros de diseño del sistema de iluminación


VI. Filtros acoplados

Existe un gran interés por usar correladores óp-ticos o digitales para el reconocimiento de ob-jetos Los correladores son intrínsecamente in-variantes al desplazamiento, lo que nos permite localizar patrones (tales como objetos en movi-miento) en escenas de entrada simplemente lo-calizando el pico de la correlación (Goodmam, 1995) De esta manera, no es necesario segmen-tar imágenes a priori a la correlación (Bow Sing-Tze, 2002; Bahram, 2002; Márquez et al., 2000), como se hace comúnmente con otros métodos

Existe gran variedad de algoritmos de correla-ción (correlador digital) y arreglos ópticos que han sido propuestos con el fin de identificar patrones u objetos en imágenes en tiempo real Entre las técnicas propuestas destacan los filtros acoplados y los filtros compuestos

El filtro acoplado (FA) es quizás el más am-pliamente conocido y está basado en una sola imagen del patrón a reconocer Desafortunada-mente, los FA no son los más óptimos para la mayoría de aplicaciones por el hecho que el pico de la correlación decrece rápidamente cuando el patrón a reconocer presenta cambios de escala, de iluminación y rotaciones (Flores et al., 2006)

La solución para resolver el problema que presentan los FA es usar un filtro por cada vista del objeto; por ejemplo, si el objeto a reconocer puede presentar varios tamaños, necesitamos un filtro por cada tamaño del objeto Sin embargo, esto nos lleva a usar y almacenar un gran número de filtros y ello vuelve a esta técnica impráctica Una solución alternativa es utilizar filtros com-puestos (FC) que se puedan optimizar a fin de hacerlos menos sensibles a cambios de escala, rotación e intensidad (De Bougrenet de la Toc-naye et al., 1997; Ahmed et al., 2004; Ahmed et al., 1995; González-Fraga et al., 2005; Díaz-Ra-mírez et al., 2005; García-Martínez et. al, 2000; García-Martínez et. al, 2003; Otón et. al, 2005; Kotzer et. al, 1992) Los filtros compuestos se derivan de un conjunto de imágenes represen-tativas del objeto que se conocen como imáge-nes de entrenamiento La selección apropiada,

14

Figura 5

Figura 6. Representación conceptual del sistema de inspección visual automatizado.

16

Figura 7

Figura 7. Esquema de iluminación.


el registro y el agrupamiento de estas imágenes de entrenamiento es un paso importante en el diseño de filtros compuestos

De manera general, la información incluida en un FC consiste de varias vistas de la imagen a reconocer bajo diferentes situaciones, por ejem-plo, diferentes ángulos de rotación, diferentes escalas de la imagen, cambios en la iluminación, algunas distorsiones, etc Este tipo de filtros toma en cuenta toda la información “morfológi-ca”, por así decirlo, del objeto que deseamos re-conocer dentro de una escena Las operaciones de correlación con este tipo de filtros proveen rasgos deseables en un sistema de reconocimien-to, por ejemplo, picos de correlación angostos, robustez al ruido, poco ruido de salida, etcétera

En este trabajo, definimos el filtro compues-to como una combinación lineal de filtros no li-neales Estos filtros están acoplados al objeto y su respuesta en frecuencia está dada por

(1)

donde H(w) es la transformada de Fourier del ob-jeto que deseamos reconocer, • es el módulo de H(w), i es el número imaginario 1− , φ es la fase y a es el valor que nos da la no linealidad en el filtro Cuando a es igual a la unidad tenemos un filtro clásico y cuando es igual a cero tenemos un filtro de fase Así que, para obtener un filtro no lineal debemos considerar el intervalo 0<a<1 El valor de 0 1 ha sido considerado como el valor óptimo, ya que ofrece una mejor respuesta a este tipo de filtros (Javidi et al , 2002)

De esta manera, la síntesis del filtro com-puesto a partir del filtro no lineal, matemática-mente, puede expresarse como

(2)donde ξm es el factor que hará que cambie el eje de la escala (eje de frecuencia) y nA son los coeficientes que permiten que la respuesta del FC sea del mismo valor cuando se diseña para reconocer objetos de diferente tamaño, y 1nA = cuando se trabaja con objetos que tienen un área similar Por tanto, los coeficientes nA permiten que la sensibilidad del filtro sea igual para to-dos los objetos La figura 8 ilustra el esquema

de operaciones computacionales para sintetizar un filtro compuesto no lineal En particular, se observa la síntesis de un filtro invariante a ro-tación, ya que considera las posibles posiciones angulares del objeto a identificar, ilustrado con la letra E

4

filtros proveen rasgos deseables en un sistema de reconocimiento, por ejemplo, picos de correlación angostos, robustez al ruido, poco ruido de salida, etc. En este trabajo, definimos el filtro compuesto como una combinación lineal de filtros no lineales. Estos filtros están acoplados al objeto y su respuesta en frecuencia está dada por

( ) exp ( )H H i, (1)

donde, H( ) es la transformada de Fourier del objeto que deseamos reconocer, es el módulo de H( ), i es el

número imaginario 1 , es la fase y es el valor que nos da la no linealidad en el filtro. Cuando es igual a la unidad tenemos un filtro clásico y cuando es igual a cero tenemos un filtro de fase. Así que, para obtener un filtro no lineal debemos de considerar el intervalo 10 . El valor de 0.1 ha sido considerado como el valor óptimo, ya que ofrece una mejor respuesta a este tipo de filtros (Javidi, B. et al., 2002). De esta manera, la síntesis del filtro compuesto a partir del filtro no lineal, matemáticamente, puede expresarse como

N

m

mmmn iwHAwH1

)**exp()( (2)

Donde m es el factor que hará que cambie el eje de la escala (eje de frecuencia) y nA son los coeficientes que permiten que la respuesta del FC, sea del mismo valor cuando se diseña para reconocer objetos de diferente tamaño y 1nA cuando se trabaja con objetos que tienen un área similar. Por tanto, los coeficientes nA permiten que la sensibilidad del filtro sea igual para todos los objetos. La figura 8 ilustra el esquema de operaciones computacionales para sintetizar un filtro compuesto no lineal. En particular, se observa la síntesis de un filtro invariante a rotación, ya que considera las posibles posiciones angulares del objeto a identificar, ilustrado con la letra E. Los FCs también pueden usarse para reconocer simultáneamente objetos diferentes. Este concepto se ilustra en la Fig. 9, donde las imágenes a reconocer son las letras E, F, P, R y éstas son las señales de entrada dentro de la estructura de filtro y como resultado tenemos un filtro de correlación fusionado. Los filtros compuestos “multiobjeto” tienen la capacidad de reconocer varios objetos a la vez, esto permite utilizar un sólo filtro para reconocer diferentes objetos en lugar de utilizar un filtro por cada objeto que deseamos reconocer dentro de una escena dada. Esto equivale a fusionar la información de los objetos en un solo algoritmo.

VII. Resultados experimentales y discusiones Dos experimentos han sido diseñados para evaluar el desempeño de los filtros de correlación considerando diferentes situaciones. En la sección VII.1 se diseñó un FC capaz de detectar 3 componentes diferentes y determinar cuál es su condición, es decir, de aceptación o de defecto. En la sección VII.2 analizamos el desempeño de filtros compuestos bajo diferentes condiciones de iluminación. VII.1 Filtros compuestos multiobjeto El primer caso que se analiza es determinar componentes dañados, componentes mal posicionados o mal orientados utilizando un FC multiobjeto. La serie de imágenes de entrenamiento se observan en la Fig. 10 y corresponden a un par de inductores de diferente tamaño y dos capacitores con terminales cuadrados, estos últimos orientados a 0o y 90o. En la figura 10, observamos que los diferentes objetos tienen tamaños diferentes, por lo que fue necesario utilizar diferentes pesos para los coeficientes nA , del FC dado por la Ec. (2). Para demostrar la factibilidad del filtro para identificar los componentes, lo aplicamos en las imágenes mostradas en la Fig. 11. La primera de estas imágenes

4

filtros proveen rasgos deseables en un sistema de reconocimiento, por ejemplo, picos de correlación angostos, robustez al ruido, poco ruido de salida, etc. En este trabajo, definimos el filtro compuesto como una combinación lineal de filtros no lineales. Estos filtros están acoplados al objeto y su respuesta en frecuencia está dada por

( ) exp ( )H H i, (1)

donde, H( ) es la transformada de Fourier del objeto que deseamos reconocer, es el módulo de H( ), i es el

número imaginario 1 , es la fase y es el valor que nos da la no linealidad en el filtro. Cuando es igual a la unidad tenemos un filtro clásico y cuando es igual a cero tenemos un filtro de fase. Así que, para obtener un filtro no lineal debemos de considerar el intervalo 10 . El valor de 0.1 ha sido considerado como el valor óptimo, ya que ofrece una mejor respuesta a este tipo de filtros (Javidi, B. et al., 2002). De esta manera, la síntesis del filtro compuesto a partir del filtro no lineal, matemáticamente, puede expresarse como

N

m

mmmn iwHAwH1

)**exp()( (2)

Donde m es el factor que hará que cambie el eje de la escala (eje de frecuencia) y nA son los coeficientes que permiten que la respuesta del FC, sea del mismo valor cuando se diseña para reconocer objetos de diferente tamaño y 1nA cuando se trabaja con objetos que tienen un área similar. Por tanto, los coeficientes nA permiten que la sensibilidad del filtro sea igual para todos los objetos. La figura 8 ilustra el esquema de operaciones computacionales para sintetizar un filtro compuesto no lineal. En particular, se observa la síntesis de un filtro invariante a rotación, ya que considera las posibles posiciones angulares del objeto a identificar, ilustrado con la letra E. Los FCs también pueden usarse para reconocer simultáneamente objetos diferentes. Este concepto se ilustra en la Fig. 9, donde las imágenes a reconocer son las letras E, F, P, R y éstas son las señales de entrada dentro de la estructura de filtro y como resultado tenemos un filtro de correlación fusionado. Los filtros compuestos “multiobjeto” tienen la capacidad de reconocer varios objetos a la vez, esto permite utilizar un sólo filtro para reconocer diferentes objetos en lugar de utilizar un filtro por cada objeto que deseamos reconocer dentro de una escena dada. Esto equivale a fusionar la información de los objetos en un solo algoritmo.

VII. Resultados experimentales y discusiones Dos experimentos han sido diseñados para evaluar el desempeño de los filtros de correlación considerando diferentes situaciones. En la sección VII.1 se diseñó un FC capaz de detectar 3 componentes diferentes y determinar cuál es su condición, es decir, de aceptación o de defecto. En la sección VII.2 analizamos el desempeño de filtros compuestos bajo diferentes condiciones de iluminación. VII.1 Filtros compuestos multiobjeto El primer caso que se analiza es determinar componentes dañados, componentes mal posicionados o mal orientados utilizando un FC multiobjeto. La serie de imágenes de entrenamiento se observan en la Fig. 10 y corresponden a un par de inductores de diferente tamaño y dos capacitores con terminales cuadrados, estos últimos orientados a 0o y 90o. En la figura 10, observamos que los diferentes objetos tienen tamaños diferentes, por lo que fue necesario utilizar diferentes pesos para los coeficientes nA , del FC dado por la Ec. (2). Para demostrar la factibilidad del filtro para identificar los componentes, lo aplicamos en las imágenes mostradas en la Fig. 11. La primera de estas imágenes

17

Figura 8

Los FC también pueden usarse para reco-nocer simultáneamente objetos diferentes Este concepto se ilustra en la figura 9, donde las imá-genes a reconocer son las letras E, F, P, R y éstas son las señales de entrada dentro de la estructu-ra de filtro y como resultado tenemos un filtro de correlación fusionado Los filtros compuestos “multiobjeto” tienen la capacidad de reconocer varios objetos a la vez, esto permite utilizar un solo filtro para reconocer diferentes objetos, en lugar de utilizar un filtro por cada objeto que deseamos reconocer dentro de una escena dada Esto equivale a fusionar la información de los objetos en un solo algoritmo

18

Figura 9

Figura 8. Diagrama esquemático para la síntesis de un filtro compuesto que considera variaciones de intensidad o posi-bles rotaciones del objeto a identificar.

Figura 9. Diagrama esquemático para la síntesis de un filtro compuesto multiobjeto.


VII. Resultados experimentales y discusiones

Dos experimentos han sido diseñados para eva-luar el desempeño de los filtros de correlación considerando diferentes situaciones En la sec-ción vII 1 se diseñó un FC capaz de detectar tres componentes diferentes y determinar cuál es su condición, es decir, de aceptación o de defecto En la sección vII 2 analizamos el desempeño de filtros compuestos bajo diferentes condiciones de iluminación

vII.1. Filtros compuestos multiobjeto

El primer caso que se analiza es determinar com-ponentes dañados, componentes mal posiciona-dos o mal orientados utilizando un FC multiob-jeto La serie de imágenes de entrenamiento se observan en la figura 10 y corresponden a un par de inductores de diferente tamaño y dos capa-citores con terminales cuadrados, estos últimos orientados a 0o y 90o En la figura 10 observamos que los diferentes objetos tienen tamaños distin-tos, por lo que fue necesario utilizar diferentes pesos para los coeficientes nA , del FC dado por la ec (2) Para demostrar la factibilidad del filtro para identificar los componentes, lo aplicamos en las imágenes mostradas en la figura 11 La primera de estas imágenes corresponde a una tarjeta PCBA que presenta a los componentes a identificar en condición de aceptable La se-gunda imagen corresponde a una tarjeta PCBA que presenta tres componentes en la condición de defecto, e g los dos inductores están daña-dos y uno de capacitores está mal orientado La correlación del FC con cada una de estas imá-genes se ilustra en la figura 12 Para el caso del PCBA mostrado en la figura 11a, observamos que la superficie de correlación presenta cua-tro máximos bien definidos, cuyas coordenadas dentro del plano de correlación definen la po-sición del componente dentro de la imagen En el caso de la correlación del FC con la imagen del PCBA, ilustrada en la figura 11b, en condi-ción de defecto, en el plano de la correlación en-contramos dos picos, el pico que corresponde al capacitor en condición de aceptación tiene una mayor amplitud (véase figura 12b) De tal forma que podemos utilizar un valor umbral para dis-cernir entre el pico que corresponde al elemento

en condición de defecto y aquel en condición de aceptación

Con este caso hemos mostrado la viabilidad del uso de filtros compuesto para identificar múltiples componentes en PCBA, encontrando que en el plano de correlación tenemos infor-mación suficiente para determinar la condición de aceptación o de defecto de los componentes identificados

19

Figura 10

Figura 10. Conjunto de imágenes utilizadas para diseñar el fil-tro compuesto multiobjeto: a) capacitor con terminales cua-dradas orientado a 90o, C1; b) capacitor con terminales cuadra-das orientadas a 180o, C2; c) bobina, L1; d) bobina, L2.

20

a) b)

Figura 11

20

a) b)

Figura 11

Figura 11. PCBA: a) todos sus componentes electrónicos es-tán en condición de aceptación, b) Tres componentes están en condición de defecto.


vII.2. Filtros compuestos invariantes a cambios de iluminación

El segundo caso que se analiza es determinar la robustez del FC a variaciones de iluminación, tanto espacial como temporal, i e el área de in-terés podría no estar uniformemente iluminada o presenta cambios de iluminación de una esce-na a otra La figura 13 ilustra las tres imágenes utilizadas para el diseño del filtro compuesto; estas imágenes corresponden a tres capacitores electrolíticos, dos de ellos orientados a 180o y el otro 90o con respecto a la vertical Los capacito-res que están alineados a 180° presentan diferen-te contraste, esto se podría deber a diferencias en la iluminación En la figura 14 se muestra la imagen bajo prueba que utilizaremos para pro-bar el filtro El formato de la imagen es RGB y

utilizaremos cada uno de estos canales para me-dir el desempeño del filtro a cambios de ilumi-nación, puesto que hay pequeñas diferencias de contraste de una canal a otro El resultado del filtro con cada uno de los canales se muestra en la figura 15 Observamos en el plano de la corre-lación resultados similares

21

a) b)

Figura 12

21

a) b)

Figura 12

Figura 12. Salidas de correlación: a) PCBA en condición de aceptación, observamos cuatro picos que corresponden a los componentes, b) PCBA con tres componentes en condición de defecto; el pico que presenta mayor amplitud corresponde al componente en condición de aceptación.

22

Figura 13

Figura 13. Conjunto de imágenes utilizadas para diseñar el filtro complejo, donde el objeto es un filtro electrónico y ro-taciones del objeto.

23

Figura 14

Figura 14. Imagen de prueba que puede presentar diferentes orientaciones y cambios de iluminación.

VIII. Discusiones y conclusiones

En este capítulo hemos revisado el concepto de filtros compuestos y los pasos para diseñar o en-trenar este tipo de filtros, ya sea para reconocer objetos con características diferentes u objetos similares pero que puedan estar girados, pre-sentar cambios de tamaño o simplemente cam-


bios de iluminación El diseño de estos filtros se realiza a partir de un conjunto de imágenes del objeto u objetos de interés

En tarjetas de circuitos impresos, analizamos la robustez de los filtros compuestos no lineales para discriminar entre componentes electróni-cos en condición de aceptación y en condición de defecto Demostramos que es factible iden-tificar componentes electrónicos, determinar la posición de su centro de masa y, a partir de esta información, es factible determinar si han sido ensamblados correctamente Además, fue posi-ble discriminar entre componentes en condición de aceptación y componente parcialmente daña-dos, es decir, en condición de defecto

En resumen, concluimos que los filtros com-puestos tienen capacidad para discriminar com-ponentes en condición de aceptable de los que presentan condición de defecto

Ix. Bibliografía

Ahmed, F y A Karim Mohammad (1995) “Fil-ter-feature-based rotation-invariant joint Fourier transform correlator” App. Opt., 34(32): 7556-7560

Ahmed, F , S Moskowitz Ira (2004) “Correla-tion-based watermarking method for im-age authentication applications” Opt. Eng., 43(8): 1-6

Association Connecting Electronics Industries, IPC (2005) Manual de Aceptabilidad de En-sambles Electrónicos, IPC-A-610D SP Ban-nockburn, EEUU

Bow, Sing-Tze (2002, 2ª ed ) Pattern recognition image preprocessing. Marcel Dekker Incor-porated, Nueva York, ISBN: 0824706595

De Bougrenet de la Tocnaye, J L , E Quémener e Y Pétillot (1997) “Composite versus mul-

Figura 15. Salidas de correlación: a) PCBA canal rojo, b) PCBA canal verde, c) PCBA canal azul. Observamos que la respuesta para los tres canales es prácticamente la misma.

24

a) b)

c) Figura 15


tichannel binary phase-only filtering” App. Opt., 36(26): 646-665

Díaz-Ramírez, v H , v Kober y J Álvarez-Bor-rego (2005) “Real-time pattern recognition with adaptative correlation filters”. En : A G Tescher (ed ) Applications of digital image processing XXVIII, SPIE Proc 5909

Flores, J L , G García-Torales y C Ponce Ávila (2006) “Correlation pattern recognition: op-timal parameters for quality standards con-trol of chocolate marshmallow candy” En: Andrew G Tescher (ed ) Applications of Di-gital Image Processing XXIX, Proc SPIE vol 6312

García-Martínez, P y H Arsenault Henri (2003) “Nonlinear radial-harmonic correlation using binary decomposition for scale-invariant pat-tern recognition” Opt. Com., 223: 273-282

García-Martínez, P , C Ferreira, J García y H Arsenault Henri (2000) “Nonlinear rotation-invariant pattern recognition by use of the optical morphological correlation” App. Opt., 39(5): 776-781

González-Fraga, J Á , v Kober y J Álvarez-Bo-rrego (2005) “Recognition of partially occlu-ded objects using correlation filters with trai-ning” En: A G Tescher (ed ) Applications of

digital image processing XXVIII, SPIE Proc 5909

González, Rafael C , E Woods Richard y L Eddins Steven (2004, 3ª ed ) Digital Image Processing Using Matlab Pearson Prentice Hall, ISBN: 0130085197

Goodman, J W (1995) Introduction to Fourier Optics McGraw Hill, Nueva York, ISBN: 0974707724

Jain, R , R Kasturi y B G Strunck (1998) Ma-chine vision. McGraw Hill, Nueva York, ISBN: 0070320187

Javidi, B (2002) Image recognition and classifi-cation: Algorithms, systems and Applications Marcel Dekker Incorporated, Nueva York, ISBN: 9780824707835

Kotzer, T , J Rosen y J Shamir (1992) “Phase extraction pattern recognition” App. Opt., 31(8): 1126-1137

Márquez, A , J Barbé, M J Yzuel y J Campos (2000) “Optical correlator as a tool for physi-cists and engineers training in signal proces-sing” SPIE Proc 3831, pp 297-306

Otón, J , P García-Martínez, I Moreno y Javier García (2005) “Phase joint transform se-quential correlator for nonlinear binary co-rrelations” Opt. Com., 245: 113-124

capítulo 12 Alineación del interferómetro de desplazamiento

vectorial utilizando filtros digitales

Guillermo García ToralesJorge Luis Flores Núñez

Josué Álvarez Borrego

I. Introducción

I.1 Antecedentes históricos

A través del tiempo, los interferómetros han sido una herramienta importante para obtener nuevo conocimiento científico y en el desarrollo de tec-nología Hoy en día, además de ser una técnica ampliamente probada, la interferometría conti-núa abriendo camino, apoyando como una téc-nica de medición y en la implementación de ex-perimentos en diversos campos de investigación, proporcionando mejores opciones de solución a los retos actuales, relacionados en particular con la caracterización y visualización de frentes de onda para análisis de superficies (Windecker et al., 1999) Desde 1980 la interferometría óptica se ha utilizado intensamente como un método eficiente para examinar y determinar la calidad de superficies, así como para efectuar investiga-ciones de las propiedades ópticas de materiales transparentes Las técnicas interferométricas utilizan las propiedades de la luz, ya sea para realizar mediciones extremadamente exactas de la planicidad y de los contornos de un objeto, o bien para determinar el grado de homogeneidad de materiales transparentes, o inclusive para me-dir distancias astronómicas, entre muchas otras aplicaciones

Son muy diversas las aplicaciones donde la interferometría se relaciona con nuestra vida diaria Se utiliza en la detección de microdespla-zamientos, la verificación de la planicidad de la superficie de los pistones de avión, la fabricación de rodamientos y cojinetes mecánicos, chips de computadoras, etc Esta técnica es particular-mente útil en la prueba y fabricación de elemen-

tos ópticos como espejos, prismas y lentes Los anteriores son sólo algunos ejemplos de los ele-mentos y servicios aplicados a los modernos de-sarrollos tecnológicos que tendrían un funciona-miento deficiente, o posiblemente no existirían, si sus superficies fueran rugosas o presentaran irregularidades en su forma y acabado

En contraste, la rapidez con que las técnicas interferométricas han adquirido su importancia en la industria nos indica lo inadecuado de otros sistemas para la caracterización de superficies Por ejemplo, los métodos que utilizan la disper-sión de la luz para sus mediciones dan informa-ción general de la rugosidad de la superficie, pero no de la distribución espacial o de las alturas y el tamaño de las irregularidades sobre la zona bajo estudio Tal es el caso de los microscopios ópti-cos, que resuelven detalles muy pequeños pero generalmente no pueden determinar la altura de los múltiples elementos que constituyen la ima-gen

La perfilometría es otra técnica de medi-ción de superficies muy utilizada Su operación se basa en un sensor mecánico, llamado estilete, controlado por un procesador electrónico que calcula las coordenadas en el espacio del objeto a medir En este sistema, el estilete se desliza a través de la superficie determinando la altura del perfil recorrido La gran desventaja del método consiste en ser una técnica intrusiva, ya que al ejercer presión sobre el objeto puede ocasionar deformación o leves ralladuras en la superficie, modificando el valor verdadero de la medición o en algunas ocasiones incluso dañando la mues-tra Además, debido a que sólo puede determi-nar porciones parciales de la muestra, requiere mayor tiempo de operación a fin de obtener la

228 Guillermo García Torales, Jorge Luis Flores Núñez y Josué Álvarez Borrego

información completa del área bajo análisis Por lo tanto, esta técnica no es recomendable para medir objetos donde la superficie pueda ser de-formada por la presión ejercida por el elemento sensor o donde las irregularidades a medir sean pequeñas comparadas con el tamaño del ele-mento sensor

En los últimos 30 años, algunas compañías de metrología óptica, como WYKO Corp., ITEK Corp., y ZYGO Corp , han incorporado a los sistemas interferométricos como dispositivos comerciales Un sistema interferométrico ofre-ce una excelente resolución En principio, y en condiciones ideales, mediante este método se pueden detectar irregularidades en superficies del orden de nanómetros, 10−9 m Además, ésta es una técnica no destructiva y no intrusiva, lo que significa que no tiene contacto físico con el obje-to bajo estudio y no modifica el valor de la medi-ción, ni las propiedades físicas del objeto La in-terferometría ofrece ventajas significativas para el estudio de los componentes y sistemas ópticos en los que la calidad de su funcionamiento esté en función del frente de onda, generado ya sea por la transmisión de la luz a través de materia-les dieléctricos, o bien por la luz reflejada de las superficies que componen esos sistemas La in-terferometría se utiliza en procesos industriales de control de calidad y ha propiciado un aumen-to en la productividad, la reducción del costo y un mayor rendimiento de muchos productos en diferentes ámbitos industriales, donde de mane-ra muy significativa se destaca la manufactura y las pruebas ópticas

El instrumento central de esta técnica se lla-ma interferómetro, el cual genera como resulta-do un interferograma, que consiste en un patrón luminoso formado por franjas oscuras y brillan-tes con la información codificada de la forma de la superficie Comúnmente, éstos representan el contorno o el perfil topográfico de los objetos bajo estudio Generalmente su interpretación requiere de un entrenamiento técnico y de mé-todos de análisis especializados Tal vez, ésta sea una de las razones por la que los interferómetros no son tan conocidos como los telescopios y los microscopios Sin embargo, el hecho de no ser tan populares no es razón para desconocer sus importantes contribuciones al desarrollo cientí-fico (vaughan, 1999)

En 1803 se realizó el experimento decisivo en la consolidación de la interferometría como una disciplina de las ciencias ópticas El físico Tomas Young demostró que un haz de luz mono-cromático, después de dividirse al pasar por un par de orificios, se combina en un mismo punto en el espacio formando un patrón de interferen-cia (Young, 1804) Mediante este experimento, Young confirmaría experimentalmente el com-portamiento ondulatorio del campo electromag-nético y la luz visible

El inicio de la interferometría como una apli-cación científica es determinado por el trabajo de A Michelson en el año de 1880 Michelson fue quien llamó a este instrumento interferómetro, y realizó uno de los primeros experimentos para determinar la velocidad de la luz a través del éter Paradójicamente, las consecuencias de esta frustrada demostración fueron la inexistencia del éter y la determinación del valor constante de la velocidad de la luz en el vacío, cuya repercusión ha sido fundamental en la consolidación de la teoría de la relatividad y la mecánica cuántica, fortaleciendo el concepto de dualidad de la luz, como onda y como partícula.

En el año de 1897, un nuevo tipo de interfe-rómetro fue desarrollado por los franceses Fabry y su colaborador Perot A diferencia del propues-to por Michelson, el interferómetro de Fabry-Perot produce franjas de interferencia más finas, que ofrecen directamente información sobre el espectro de frecuencias de la luz bajo estudio Este instrumento se utiliza ampliamente en es-pectroscopía de alta resolución reforzando, a su vez, el estudio de la distribución de la radiación electromagnética

El instrumento inventado y patentado en 1916 por F Twyman y A Green, una modifica-ción del interferómetro de Michelson, dio un nuevo empuje al desarrollo de la ciencia Este interferómetro ha sido desde entonces utilizado en pruebas a componentes y sistemas ópticos, perfeccionando la fabricación y aplicación de nuevos dispositivos que ahora consideramos tra-dicionales en laboratorios y talleres ópticos Los interferómetros antes mencionados son los pre-cursores de otros actualmente utilizados, como los de tipo Mach-Zehnder y Fizeau A estos in-terferómetros se les considera hoy en día como tradicionales

229Alineación del interferómetro de desplazamiento vectorial utilizando filtros digitales

Los interferómetros tradicionales han re-suelto exitosamente muchas dificultades de su época, pero actualmente están siendo rebasados por nuevas necesidades Los elementos y siste-mas que ahora se desarrollan tienden a mejorar el control de calidad, la reducción de costos, peso, espacio y tiempo de fabricación, práctica-mente en todas las líneas de desarrollo científico y tecnológico Resulta singular que para lograr estos objetivos se utilicen elementos ópticos con formas y superficies más elaboradas, que a su vez son más difíciles de probar y de fabricar Esta problemática requiere de la actualización de los nuevos métodos de medición, por lo que las téc-nicas interferométricas han tenido que adaptar-se a estas nuevas exigencias Los interferómetros de desplazamiento surgen como una opción ante este nuevo reto Una modificación al interferó-metro Mach-Zehnder (Bates, 1947) es consi-derada como uno de los primeros interferóme-tros de desplazamiento utilizado para medir la asfericidad de frentes de onda convergentes sin utilizar una referencia externa en la prueba de componentes con gran abertura

La aparición del láser en 1960, consolidó el desarrollo de los interferómetros de despla-zamiento (Grigull et al., 1967), extendiendo el panorama de la fabricación de nuevas tecnolo-gías Recientemente, esta técnica se ha utilizado en el estudio de las perturbaciones atmosféricas

(Rodier et al , 1989) Últimamente, se ha desa-rrollado el interferómetro de desplazamiento vectorial (García-Torales et al , 2001, 2006) Este instrumento posee la cualidad de poder hacer pruebas ópticas de superficies con y sin simetría de rotación, ya que incorpora en su diseño algu-nas de las ventajas tanto de los interferómetros tradicionales, como de los interferómetros de des-plazamiento más comunes El interferómetro de desplazamiento vectorial presenta una alternativa en el mejoramiento de los sistemas de fabricación y pruebas a sistemas ópticos modernos Sin em-bargo, uno de los principales retos consiste en lo-grar la alineación del sistema en forma eficiente En este trabajo se propone un método que puede optimizar el proceso de alineación automática del interferómetro de desplazamiento vectorial con la ventaja de que se puede extender esta técnica a otros interferómetros de desplazamiento (Mala-cara, 2007)

II. Interferómetro de desplazamiento vectorial

Muchos experimentos científicos utilizan la combinación de dos campos electromagnéticos derivados de una misma fuente El principio fundamental de la interferometría se explica por medio de la teoría de ondas electromagnéticas generadas por la misma fuente que cumplen con el principio de superposición; éstas interfieren entre sí, de la misma manera que lo harían dos ondas propagándose en el agua Según sea el caso, si la cresta de una onda coincide con el va-lle de la otra se produce interferencia destructiva y las ondas se cancelan Si la cresta de una onda coincide con la cresta de la otra, se tiene interfe-rencia constructiva, y las ondas se refuerzan au-mentando su amplitud La ecuación que deter-mina el patrón de intensidad generado a partir de la interferencia de dos ondas está dado por:

(1)

que corresponde a la irradiancia total I, en fun-ción de las irradiancias individuales de cada una de la ondas I1 e I2 que interfieren y del coseno del ángulo debido a la diferencia de fase relativa δ, de las dos ondas La figura 1 muestra un pa-trón de interferencia y el perfil cosenoidal de sus franjas La frecuencia óptica de la región visible es aproximadamente del orden de 1014 a 1015 Hertz o de 400 nm a 800 nm expresados en longi-tudes de onda Los detectores de radiación, en-tre ellos nuestros ojos, además de depender de la energía del haz de luz, detectan sólo el promedio de la intensidad y no la fase del campo eléctrico, por lo que es prácticamente imposible detectar en forma experimental las variaciones del cam-po Sin embargo, dos haces de luz no polarizada producen interferencia aunque ésta no siempre se pueda detectar, debido a que siempre es posi-ble determinar las componentes ortogonales de un campo eléctrico y éstas a su vez pueden ser comparadas con las componentes respectivas del otro campo eléctrico

II.1. Principio de operación del interferómetro de desplazamiento vectorial

La prueba y fabricación de elementos ópticos asféricos y carentes de simetría de rotación es

II. Interferómetro de desplazamiento vectorial Muchos experimentos científicos utilizan la combinación de dos campos electromagnéticos derivados de una misma fuente. El principio fundamental de la interferometría se explica por medio de la teoría de ondas electromagnéticas generadas por la misma fuente que cumplen con el principio de superposición, estas interfieren entre sí, de la misma manera que lo harían dos ondas propagándose en el agua. Según sea el caso, si la cresta de una onda coincide con el valle de la otra se produce interferencia destructiva y las ondas se cancelan. Si la cresta de una onda coincide con la cresta de la otra, se tiene interferencia constructiva, y las ondas se refuerzan aumentando su amplitud. La ecuación que determina el patrón de intensidad generado a partir de la interferencia de dos ondas está dado por:

1 2 1 22 cosI I I I I (1) que corresponde a la irradiancia total I, en función de las irradiancias individuales de cada una de la ondas I1 e I2 que interfieren y del coseno del ángulo debido a la diferencia de fase relativa , de las dos ondas. La figura 1 muestra un patrón de interferencia y el perfil cosenoidal de sus franjas. La frecuencia óptica de la región visible es aproximadamente del orden de 1014 a 1015 Hertz o de 400 nm a 800 nm expresados en longitudes de onda. Los detectores de radiación, entre ellos nuestros ojos, además de depender de la energía del haz de luz, detectan sólo el promedio de la intensidad y no la fase del campo eléctrico, por lo que es prácticamente imposible detectar en forma experimental las variaciones del campo. Sin embargo, dos haces de luz no polarizada producen interferencia aunque ésta no siempre se pueda detectar, debido a que siempre es posible determinar las componentes ortogonales de un campo eléctrico y estas a su vez pueden ser comparadas con las componentes respectivas del otro campo eléctrico. II.1 Principio de operación del Interferómetro de desplazamiento vectorial La prueba y fabricación de elementos ópticos asféricos y carentes de simetría de rotación es particularmente difícil debido a que las técnicas interferométricas comúnmente establecidas requieren de una superficie de referencia perfecta, generalmente plana o esférica. Dicha pieza ideal, es aún más difícil de construir ya que no es posible hacer elementos ópticos mejores de los que se pueden probar. La interferometría de desplazamiento presenta una ventaja fundamental respecto a los sistemas interferométricos convencionales: son sistemas autoreferenciados; es decir, no requieren de un elemento de calibración externo. En estos interferómetros de desplazamiento lateral, el frente de onda bajo prueba se superpone con una versión modificada, o desplazada, de sí mismo. La diferencia de caminos ópticos (DCO) se puede expresar como:

, ,W x y W x yx y m

x y (2)

La mayoría de los interferómetros de desplazamiento, dividen el frente de onda en dos partes de igual intensidad conservando sus aberraciones. Una parte del frente de onda continúa su propagación sin cambios, mientras que la otra parte se modifica en alguno de sus parámetros esenciales. Finalmente, ambos frentes de onda se hacen coincidir en la región de detección de tal forma que la superposición de ambos genere un patrón de intensidades interferométrico que contenga la información de la derivada del frente de onda en dos dimensiones. Un inconveniente de esta técnica respecto a la convencional, es que sus patrones interferométricos no representan directamente la forma real de la superficie bajo estudio. Los interferogramas generados por desplazamiento generalmente representan la derivada del frente de onda, por lo que se deben emplear métodos matemáticos de integración para la recuperación de la fase. Actualmente, los modernos y veloces sistemas de procesamiento de datos permiten que se utilicen algoritmos más eficientes, reduciendo considerablemente esta desventaja. La figura 2 muestra nuestro arreglo experimental del interferómetro de desplazamiento vectorial el cual está basado en la configuración interferométrica Mach-Zehnder. La luz que provine de una fuente de emisión láser se expande y filtra antes de iluminar el elemento óptico bajo prueba, es este caso una lente biconvexa, utilizada a su vez para colimar el frente de onda. El divisor de haz B1 separa el haz colimado en dos partes de igual intensidad, A y B. El frente de onda A es dirigido hacia el sistema de desplazamiento, mientras que el frente de onda B pasa a través del sistema de compensación. Ambos haces conservan sus estados de polarización. La superposición de los frentes de onda A y B, se realiza mediante la acción del divisor de haz B2, el cual genera un


particularmente difícil debido a que las técnicas interferométricas comúnmente establecidas re-quieren de una superficie de referencia perfec-ta, generalmente plana o esférica Dicha pieza ideal es aún más difícil de construir ya que no es posible hacer elementos ópticos mejores de los que se pueden probar La interferometría de desplazamiento presenta una ventaja funda-mental respecto a los sistemas interferométricos convencionales: son sistemas auto-referenciados; es decir, no requieren de un elemento de calibra-ción externo

En estos interferómetros de desplazamiento lateral, el frente de onda bajo prueba se super-pone con una versión modificada, o desplazada, de sí mismo La diferencia de caminos ópticos (DCO) se puede expresar como:

(2)

La mayoría de los interferómetros de desplaza-miento divide el frente de onda en dos partes de igual intensidad, conservando sus aberracio-nes Una parte del frente de onda continúa su propagación sin cambios, mientras que la otra parte se modifica en alguno de sus parámetros esenciales Finalmente, ambos frentes de onda se hacen coincidir en la región de detección de tal forma que la superposición de ambos genere un patrón de intensidades interferométrico que contenga la información de la derivada del fren-te de onda en dos dimensiones Un inconvenien-te de esta técnica respecto a la convencional es que sus patrones interferométricos no represen-tan directamente la forma real de la superficie bajo estudio Los interferogramas generados por desplazamiento generalmente representan la de-rivada del frente de onda, por lo que se deben emplear métodos matemáticos de integración para la recuperación de la fase Actualmente, los modernos y veloces sistemas de procesamiento de datos permiten que se utilicen algoritmos más eficientes, reduciendo considerablemente esta desventaja

La figura 2 muestra nuestro arreglo expe-rimental del interferómetro de desplazamiento vectorial, el cual está basado en la configuración interferométrica Mach-Zehnder La luz que pro-vine de una fuente de emisión láser se expande y filtra antes de iluminar el elemento óptico bajo prueba, en este caso una lente biconvexa, uti-lizada a su vez para colimar el frente de onda El divisor de haz B1 separa el haz colimado en dos partes de igual intensidad, A y B El frente de onda A es dirigido hacia el sistema de des-plazamiento, mientras que el frente de onda B pasa a través del sistema de compensación Am-bos haces conservan sus estados de polarización La superposición de los frentes de onda A y B, se realiza mediante la acción del divisor de haz B2, el cual genera un patrón de intensidad mo-dulado El sistema de adquisición de imágenes contiene la lente de enfoque y una cámara CCD, con la cual se graba el interferograma para pro-cesamiento posterior

La figura 3a ilustra el sistema de coordena-das de los frentes de onda original y desplazado, para desplazamientos a lo largo de las direccio-nes Δx y Δy, respectivamente El patrón de in-terferencia es observado únicamente dentro del

Figura 1.

Figura 1.

II. Interferómetro de desplazamiento vectorial Muchos experimentos científicos utilizan la combinación de dos campos electromagnéticos derivados de una misma fuente. El principio fundamental de la interferometría se explica por medio de la teoría de ondas electromagnéticas generadas por la misma fuente que cumplen con el principio de superposición, estas interfieren entre sí, de la misma manera que lo harían dos ondas propagándose en el agua. Según sea el caso, si la cresta de una onda coincide con el valle de la otra se produce interferencia destructiva y las ondas se cancelan. Si la cresta de una onda coincide con la cresta de la otra, se tiene interferencia constructiva, y las ondas se refuerzan aumentando su amplitud. La ecuación que determina el patrón de intensidad generado a partir de la interferencia de dos ondas está dado por:

1 2 1 22 cosI I I I I (1) que corresponde a la irradiancia total I, en función de las irradiancias individuales de cada una de la ondas I1 e I2 que interfieren y del coseno del ángulo debido a la diferencia de fase relativa , de las dos ondas. La figura 1 muestra un patrón de interferencia y el perfil cosenoidal de sus franjas. La frecuencia óptica de la región visible es aproximadamente del orden de 1014 a 1015 Hertz o de 400 nm a 800 nm expresados en longitudes de onda. Los detectores de radiación, entre ellos nuestros ojos, además de depender de la energía del haz de luz, detectan sólo el promedio de la intensidad y no la fase del campo eléctrico, por lo que es prácticamente imposible detectar en forma experimental las variaciones del campo. Sin embargo, dos haces de luz no polarizada producen interferencia aunque ésta no siempre se pueda detectar, debido a que siempre es posible determinar las componentes ortogonales de un campo eléctrico y estas a su vez pueden ser comparadas con las componentes respectivas del otro campo eléctrico. II.1 Principio de operación del Interferómetro de desplazamiento vectorial La prueba y fabricación de elementos ópticos asféricos y carentes de simetría de rotación es particularmente difícil debido a que las técnicas interferométricas comúnmente establecidas requieren de una superficie de referencia perfecta, generalmente plana o esférica. Dicha pieza ideal, es aún más difícil de construir ya que no es posible hacer elementos ópticos mejores de los que se pueden probar. La interferometría de desplazamiento presenta una ventaja fundamental respecto a los sistemas interferométricos convencionales: son sistemas autoreferenciados; es decir, no requieren de un elemento de calibración externo. En estos interferómetros de desplazamiento lateral, el frente de onda bajo prueba se superpone con una versión modificada, o desplazada, de sí mismo. La diferencia de caminos ópticos (DCO) se puede expresar como:

, ,W x y W x yx y m

x y (2)

La mayoría de los interferómetros de desplazamiento, dividen el frente de onda en dos partes de igual intensidad conservando sus aberraciones. Una parte del frente de onda continúa su propagación sin cambios, mientras que la otra parte se modifica en alguno de sus parámetros esenciales. Finalmente, ambos frentes de onda se hacen coincidir en la región de detección de tal forma que la superposición de ambos genere un patrón de intensidades interferométrico que contenga la información de la derivada del frente de onda en dos dimensiones. Un inconveniente de esta técnica respecto a la convencional, es que sus patrones interferométricos no representan directamente la forma real de la superficie bajo estudio. Los interferogramas generados por desplazamiento generalmente representan la derivada del frente de onda, por lo que se deben emplear métodos matemáticos de integración para la recuperación de la fase. Actualmente, los modernos y veloces sistemas de procesamiento de datos permiten que se utilicen algoritmos más eficientes, reduciendo considerablemente esta desventaja. La figura 2 muestra nuestro arreglo experimental del interferómetro de desplazamiento vectorial el cual está basado en la configuración interferométrica Mach-Zehnder. La luz que provine de una fuente de emisión láser se expande y filtra antes de iluminar el elemento óptico bajo prueba, es este caso una lente biconvexa, utilizada a su vez para colimar el frente de onda. El divisor de haz B1 separa el haz colimado en dos partes de igual intensidad, A y B. El frente de onda A es dirigido hacia el sistema de desplazamiento, mientras que el frente de onda B pasa a través del sistema de compensación. Ambos haces conservan sus estados de polarización. La superposición de los frentes de onda A y B, se realiza mediante la acción del divisor de haz B2, el cual genera un

Figura 1. La irradiancia de las franjas de interferencia como una función de la diferencia de fase d en radianes (a) Perfil cosenoidal. (b) Patrón de intensidad interferométrico.


área en la que ambos frentes de onda se super-ponen Debido a la rotación de los prismas, el origen de coordenadas del frente de onda des-plazado se traslada del punto origen Cu(0,0), al punto desplazado Cd(Δx, Δy) Este desplaza-miento está definido por la magnitud del vector ⟩ y su dirección por el ángulo θ

El sistema de desplazamiento y compensa-ción están compuestos por un par de prismas idénticos montados individuamente en montu-ras rotatorias (García-Torales et al , 2002), éstos se muestran en la figura 3b Este tipo de montu-ras permite una variación angular continua de 0º a 360º Cada sistema de prismas utiliza un par de prismas idénticos colocados perpendicularmen-te a la dirección de los frentes de onda A y B Las dos posiciones principales de los prismas se han definido para fijar los límites de desviación máximos y mínimos de los sistemas de despla-zamiento y compensación El caso de mínima desviación se presenta cuando la base menor del primer prisma se alinea con la base mayor del se-gundo prisma La desviación es máxima cuando las bases menores de ambos prismas se encuen-tran alineadas La posición inicial de los sistemas de desplazamiento y de compensación es la que genera la mínima desviación Cada uno de los prismas del sistema de desplazamiento se puede rotar de manera independiente para determinar la magnitud y la dirección del desplazamiento del frente de onda A Esta rotación puede reali-zarse en forma automática o bien, manualmente por un operador La selección del tamaño del

Figura 2.

Plano de detección

Cámara CCD

Sistema de desplazamiento

Lente bajo prueba Sistema de compensación

Dirección de propagación del frente de onda A

Dirección de propagación del frente de onda B

w1 w2

Figura 2. Arreglo experimental del interferómetro de desplazamiento vectorial utilizado para determinar por transmisión la forma del frente de onda proveniente de una lente positiva.

(a) (b)

Figura 3.

Frente de onda desplazamiento

Frente de onda original

(a) (b)

Figura 3.



(a) (b)

Figura 3.



Figura 3. (a) Frente de onda original y desplazado en la salida del interferómetro de desplazamiento vectorial (b) Prismas de Risley: El ángulo relativo entre los prismas determina el ángulo de desviación y por lo tanto la posición del frente de onda. El frente de onda puede ser desplazado continuamente en forma circular si se rota uno de los prismas 360 grados mientras el otro prisma permanece estacionario.

(a)

(b)


área de traslape, la orientación e inclinación del frente de onda desplazado se obtienen mediante la rotación w1 y w2 de cada prisma Debido a la interdependencia que existe entre cantidades las rotaciones de los prismas la modificación de los desplazamientos Δx, Δy corresponde a modificar los valores del vector ⟩, el ángulo θ

II.2. Alineación interferométrica utilizando filtros digitales

La correcta calibración de un sistema interfe-rométrico depende en gran medida de la ali-neación de sus componentes ópticos, y se debe realizar de manera sistemática antes de realizar mediciones y pruebas ópticas En este proceso se requiere de un cuarto oscuro, láseres estabiliza-dos, un sistema de filtraje espacial así como me-canismos y monturas con ajustes micrométricos Los ajustes manuales requieren de tiempo y ha-bilidades propias de la experiencia del operador En el laboratorio, durante el proceso de calibra-ción, todavía es común utilizar un trozo de papel blanco con un pequeño orificio para auxiliarse al realizar la alineación elemento por elemento, lo cual requiere de ciertas habilidades y experiencia en el trabajo experimental En muchos casos, los elementos ópticos se colocan dentro de compar-timientos estrechos y sellados con la finalidad de reducir la incidencia de luz ambiental, así como evitar reflexiones espurias generadas por las di-ferentes superficies de los mismos elementos óp-ticos del sistema

Por otra parte, el desarrollo actual de los programas y sistemas de cómputo, a la par con el progreso de los sistemas de detección de imá-genes, han facilitado la interpretación automá-tica de los interferogramas Una gran cantidad de datos se capturan mediante un dispositivo de detección, usualmente una cámara CCD, para ser almacenados y procesados por un sistema electrónico computacional Hoy en día, existe una enorme diversidad de software para el análi-sis de interferogramas, los cuales presentan grá-ficamente información estadística del terminado de la superficie bajo estudio, prácticamente en tiempo real La inclusión de una cámara CCD y otros elementos electrónicos son de uso habitual en los sistemas interferométricos Utilizando las ventajas de tener las imágenes electrónicamen-

te almacenadas, se pueden aplicar programas de cómputo que obtengan información sobre el estado de calibración del sistema Los interfero-gramas proporcionan información codificada en forma de franjas del frente de onda de interés Idealmente, cuando un sistema interferométrico está calibrado, la diferencia de caminos ópticos es cero y no se genera un interferograma La calibración ideal es muy complicada de obtener debido a las imperfecciones de los elementos, las tolerancias de los componentes mecánicos y la sensibilidad intrínseca de los interferómetros a las variaciones térmicas, por lo que, en forma práctica, generalmente se obtienen interferogra-mas con un número mínimo de franjas

Cuando se produce la interferencia de dos frentes de ondas planas cuya única diferencia es debida al ángulo de inclinación entre ambas, se generan patrones de intensidad con franjas rec-tas orientadas, ya sea vertical u horizontalmente o con un grado de inclinación en cualquier direc-ción Esta imagen de franjas puede aprovecharse para indicar el grado de alineación del sistema Una opción para determinar la alineación auto-mática del sistema mediante técnicas computa-cionales es determinar la dirección y el número de franjas aplicando filtros digitales con técnicas de correlación, que a continuación se describen

III. Reconocimiento de patrones utilizando técnicas de correlación

El reconocimiento de formas y patrones engloba todos aquellos métodos mediante los cuales es posible detectar la presencia de una determinada imagen, denominada imagen de referencia, den-tro de otra imagen o escena En el caso en que la imagen de referencia se encuentre presente en la escena, se obtendrá una salida que indique la existencia de la imagen y con algunos métodos, además, se podrá determinar su posición dentro de la escena Esta técnica ha ido adquiriendo en los últimos años una relevancia especial dentro del campo del procesado de imágenes debido principalmente a la constante y progresiva auto-matización de los procesos industriales, así como al desarrollo de nuevas líneas de innovación tec-nológica, tales como la inteligencia artificial, la visión por computadora y la teledetección


Existe una gran variedad de técnicas aso-ciadas al reconocimiento de patrones y al trata-miento de imágenes, y en función de los elemen-tos que utilizan podemos clasificarlas en técnicas ópticas, digitales e híbridas El primer tipo, como su propio nombre indica, utiliza un conjunto de elementos ópticos para realizar el procesado, lo que garantiza una alta velocidad de procesa-do, pero plantea problemas debido a su limita-da flexibilidad respecto al tamaño finito de sus elementos Por el contrario, las técnicas digitales basan su funcionamiento fundamentalmente en algoritmos de reconocimiento ejecutados en una computadora, aunque con un costo de tiempo computacional Una opción es trabajar con téc-nicas híbridas, las cuales intentan aprovechar las ventajas de cada uno de ambos métodos y al mis-mo tiempo minimizar los efectos de sus inconve-nientes Las técnicas ópticas presentan una serie de inconvenientes, por ejemplo, que únicamente se puede utilizar para detectar formas del mis-mo tamaño e idéntica orientación lo cual hace complicada su utilización, aunque existen méto-dos que resuelven estas dificultades (Harvey et al , 1997; Casasent et al , 1978; Hsu et al , 1982; vanderlugt, 1968 Las técnicas computacionales son más versátiles y ofrecen nuevas alternativas de solución a una gran variedad de problemas actuales (Flores et al , 2006; Pech-Pacheco et al , 1998; Bueno et al , 2005: Díaz-Ramírez et al , 2006)

III.1. Fundamentos de la correlación óptica

La trasformada de Fourier (TF) es la herramien-ta matemática clave en el procesamiento de se-ñales ópticas (Goodman, 1996) A pesar de que ésta apareció a principios de 1800, su aplicación en el procesamiento de señales cobró auge a par-tir de principios de 1950 La correlación es una de las propiedades más útiles de la TF aplicada al procesamiento de señales La correlación en-tre dos funciones se puede expresar como:

(3)

A partir de esta expresión, se puede observar como la correlación se obtiene al desplazar la función g* (conjugada de g), multiplicar su va-lor en cada punto r´ por el valor de la función f

en dicho punto y realizar la suma para todos los puntos considerados Los diferentes sumandos serán no nulos sólo si al desplazar la función g* a un punto cualquiera r´ existe una zona común entre ambas funciones Cuanto mayor sea el pa-recido, mayor será su contribución al total de la suma En este caso, tanto f como g representan imágenes, que son descritas mediante las fun-ciones bidimensionales, f(x; y) y g(x; y) Puesto que el concepto clásico de imagen va asociado a una distribución bidimensional de valores de transmisión, estas dos funciones tomarán única-mente valores reales, y serán, por tanto, funcio-nes reales En este caso, g*(x; y) = g(x; y), esto significa que tanto mayor será el valor de la co-rrelación cuanto mayor sea la similitud entre las funciones f(x; y) y g(x; y) trasladada Así pues, la correlación resulta a priori un buen mecanismo para reconocer un objeto determinado dentro de una escena formada por varios elementos Otra de las propiedades matemáticas asociada a esta operación es el denominado Teorema de Convo-lución, el cual permite obtener la correlación de dos funciones f(x; y) y g(x; y) a partir del producto en el espacio complejo de sus transformadas de Fourier respectivas, F(u; v) y G(u; v),

(4)

Por lo tanto, es posible realizar este producto en el espacio de Fourier, y posteriormente aplicar la transformada inversa, obtener el valor de f(x; y) g(x; y) sin necesidad de realizar la integral refle-jada en la expresión 3

El reconocimiento de patrones por medio de la correlación es una subrama del reconocimien-to estadístico de patrones basada en la selección de una imagen de referencia, para después de-terminar el grado de similitud entre la señal de referencia y el objeto bajo prueba El grado de similitud entre las señales es una simple estadís-tica cuyas decisiones se basan en el conocimiento que se tenga sobre el objeto

Por medio de la correlación se podría deter-minar a qué clase pertenece un objeto, o mejor aún, podríamos tener un sistema correlador con invariancias que identifique al objeto sin impor-tar el punto de vista en que se observa al objeto (puede presentar desplazamientos laterales, ro-taciones, escalamientos, cambios de iluminación,

( ) ( )( ) ( ) ( )' * ´nR

f r g r f r g r r dr⊗ = −∫

( ) ( ){ } ),(),(,, vuGvuFyxgyxf =⊗ℑ


etc ) Frecuentemente es deseable discriminar entre diferentes clases de objetos que difieren sutilmente de la clase de interés, es decir entre objetos parecidos Finalmente, el objeto se pue-de encontrar incrustado (o rodeado) por ruido, cuyas características estadísticas pueden ser simi-lares a la clase de interés Estas consideraciones se pueden tener en cuenta para el diseño de las señales de referencia Los algoritmos de correla-ción diseñan o crean señales de referencia tales que su correlación con el objeto produce esta-dísticas con la información de estas cuestiones (ruido o degradaciones en la señal observada)

Una de las fortalezas principales del reco-nocimiento de patrones por medio de la corre-lación CPR (por sus siglas en inglés: correlation pattern recognition), es la robustez inherente que resulta de evaluar la señal completa en un mismo tiempo, es decir no se requiere de ningún tipo de preprocesamiento En contraste con otras técni-cas que extraen información en partes para lue-go comparar las relaciones entre los elementos, el CPR es menos sensitivo a pequeños valores de correspondencia y obstrucciones, debido a que se compara toda la imagen de entrada contra la plantilla (imagen de referencia) Además de que se pueden detectar varios objetos en para-lelo dentro de la escena de entrada La correla-ción se puede implementar tanto en el dominio temporal (dominio espacial para las imágenes) o en el dominio de la frecuencia Este método para implementar la correlación en el dominio de las frecuencias es la razón por la que se usa la frase de “filtros de correlación” Gracias al re-curso del algoritmo de la transformada rápida de Fourier (FFT) y a los procesadores digitales de altas velocidades, hoy en día la correlación entre imágenes se puede usar efectivamente en imple-mentaciones digitales

El primer filtro utilizado en un montaje de correlación óptica fue el denominado filtro adaptado clásico o “matched filter” (MF) (van-derLugt, 1964) A partir de una imagen, repre-sentada por una función bidimensional g(x; y), el MF se define como:

(5)

donde ),( vuG es la amplitud y φ(u; v) la fase de la transformada de Fourier de la imagen de refe-

rencia Aunque el MF se comporta de forma óp-tima en cuanto a relación señal a ruido (SNR), no sucede lo mismo cuando se le aplican otros criterios, como cambios de escala o rotación, por ejemplo Esto ha provocado que desde su apa-rición se hayan propuesto diferentes tipos de filtros encaminados todos ellos a optimizar los resultados finales del proceso de correlación

Una de las modificaciones al filtro clásico es el denominado filtro sólo de fase (Phase Only Filter, POF), introducido en 1984 (Horner y Gia-nino, 1984), y definido como:

(6)

La principal diferencia de este filtro con respec-to al MF es que, en este caso, el filtro se gene-ra incorporando únicamente información de la fase de la transformada de Fourier de la imagen a detectar, manteniendo la amplitud constante e igual a la unidad (Oppenheim, 1981)

Este filtro de correlación presenta la ven-taja de ser más discriminante, las correlaciones presentan una menor base y el valor del pico de correlación es mayor Esto hace que su caracte-rística más destacable sea la optimización de la eficiencia, lo cual equivale a decir que toda la luz incidente se transmite al plano de correlación Por el contrario, el filtro de fase es más sensible a distorsiones y a ruido que el MF Otra modifi-cación al MF es el filtro inverso (IF) (Awwal et al., 1990; Kumar et al , 1990), definido en forma similar al POF sólo que en este caso la transfor-mada de Fourier de la imagen a detectar se divi-de por su amplitud al cuadrado,

(7)

El problema principal que presenta este filtro es la aparición de singularidades en los puntos en que la amplitud de la transformada se anula Se han propuesto diversos métodos para solventar esta dificultad (Mu et al , 1988) De los tres fil-tros, éste es el que presenta mayor capacidad de discriminación y su comportamiento es óptimo respecto a PCE, o peak-to-correlation energy, un

Por medio de la correlación se podría determinar a qué clase pertenece un objeto, o mejor aún, podríamos tener un sistema correlador con invariancias que identifique al objeto sin importar el punto de vista en que se observa al objeto (puede presentar desplazamientos laterales, rotaciones, escalamientos, cambios de iluminación, etc.). Frecuentemente es deseable discriminar entre diferentes clases de objetos que difieren sutilmente de la clase de interés, es decir entre objetos parecidos. Finalmente, el objeto se puede encontrar incrustado (o rodeado) por ruido, cuyas características estadísticas pueden ser similares a la clase de interés. Estas consideraciones se pueden tener en cuenta para el diseño de las señales de referencia. Los algoritmos de correlación diseñan o crean señales de referencia tales que su correlación con el objeto produce estadísticas con la información de estas cuestiones (ruido o degradaciones en la señal observada). Una de las fortalezas principales del reconocimiento de patrones por medio de la correlación CPR, (por sus siglas en inglés: correlation pattern recognition), es la robustez inherente que resulta de evaluar la señal completa en un mismo tiempo, es decir no se requiere de ningún tipo de preprocesamiento. En contraste con otras técnicas que extraen información en partes para luego comparar las relaciones entre los elementos, el CPR es menos sensitivo a pequeños valores de correspondencia y obstrucciones, debido a que se compara toda la imagen de entrada contra la plantilla (imagen de referencia). Además de que se pueden detectar varios objetos en paralelo dentro de la escena de entrada. La correlación se puede implementar tanto en el dominio temporal (dominio espacial para las imágenes) o en el dominio de la frecuencia. Este método para implementar la correlación en el dominio de las frecuencias es la razón por la que se usa la frase de “filtros de correlación”. Gracias al recurso del algoritmo de la transformada rápida de Fourier (FFT) y a los procesadores digitales de altas velocidades, hoy en día la correlación entre imágenes se puede usar efectivamente en implementaciones digitales. El primer filtro utilizado en un montaje de correlación óptica fue el denominado filtro adaptado clásico o “matched filter” (MF) (A. VanderLugt,, 1964). A partir de una imagen, representada por una función bidimensional g(x; y), el MF se define como:

),(),(),(*),( vuievuGvuGvuHMF , (5) donde ),( vuG es la amplitud y (u; v) la fase de la transformada de Fourier de la imagen de referencia. Aunque el MF se comporta de forma óptima en cuanto a relación señal a ruido (SNR), no sucede lo mismo cuando se le aplican otros criterios, como cambios de escala o rotación por ejemplo. Esto ha provocado que desde su aparición se hayan propuesto diferentes tipos de filtros encaminados todos ellos a optimizar los resultados finales del proceso de correlación. Una de las modificaciones al filtro clásico es el denominado filtro sólo de fase (Phase Only Filter, POF), introducido en 1984 (J. L. Horner, 1984), y definido como:

),(

),(),(*),( vuie

vuGvuGvuHPOF (6)

La principal diferencia de este filtro con respecto al MF es que en este caso, el filtro se genera incorporando únicamente información de la fase de la transformada de Fourier de la imagen a detectar, manteniendo la amplitud constante e igual a la unidad (A. V. Oppenheim, 1981). Este filtro de correlación presenta la ventaja de ser más discriminante, las correlaciones presentan una menor base, y el valor del pico de correlación es mayor. Esto hace que su característica más destacable sea la optimización de la eficiencia, lo cual equivale a decir que toda la luz incidente se transmite al plano de correlación. Por el contrario, el filtro de fase es más sensible a distorsiones y a ruido que el MF. Otra modificación al MF es el filtro inverso (IF) (A. A. S. Awwal et al, 1990 B. Kumar et al., 1990), definido en forma similar al POF sólo que en este caso la transformada de Fourier de la imagen a detectar se divide por su amplitud al cuadrado,

),(),(),(*),(

),(

2 vuGe

vuGvuGvuHPOF

vui

(7)



),(

),(),(*),( vuie

vuGvuGvuHPOF (6)


),(),(),(*),(

),(

2 vuGe

vuGvuGvuHPOF

vui

(7)



),(

),(),(*),( vuie

vuGvuGvuHPOF (6)


),(),(),(*),(

),(

2 vuGe

vuGvuGvuHPOF

vui

(7)


parámetro utilizado para medir la definición del pico de correlación, y para el cual el filtro inver-so presenta un valor teórico igual a la unidad, lo que equivale a decir que toda la energía que atraviesa el filtro se concentra en el pico de co-rrelación En cuanto a aspectos a mejorar, este es un filtro muy sensible a la presencia de ruido en la escena y presenta una eficiencia óptica in-ferior a la de los dos filtros anteriores Los tres filtros descritos se comportan de forma óptima únicamente con respecto a uno de los criterios de calidad anteriormente mencionados: así, el MF es óptimo respecto a SNR, mientras que el POF lo es en cuanto a eficiencia, y el IF, respecto a PCE Sin embargo, los resultados de cada uno de ellos en los dos otros parámetros presentan valores bastante pobres Esto sugiere la posibi-lidad de diseñar filtros que tal vez no se com-porten de forma óptima respecto a ninguno de los tres parámetros, pero cuyos resultados en el conjunto de los tres sean aceptables

IV. Resultados

En una primera etapa, se implementaron los tres filtros descritos en párrafos anteriores, el filtro clásico MF, sólo de fase POF e Inverso IF con la finalidad de determinar cuando el interferó-metro de desplazamiento vectorial se encuentre alineado en función de una imagen interferomé-trica de referencia Antes de aplicar los filtros a interferogramas reales, se utilizaron interfero-gramas simulados con la finalidad de determinar las características de discriminación de cada uno de estos filtros a los cambios de fase La imagen de referencia corresponde a un interferograma con un número mínimo de franjas rectas en una dirección determinada por el operador Los pa-trones bajo estudio son estructuras periódicas muy similares, como se puede observar en la fi-gura 4, donde las imágenes muestran sólo una versión desplazada de la imagen de referencia

La figura 4 muestra los interferogramas gene-rados de forma sintética, los cuales se comparan de forma sucesiva contra la imagen de referencia (figura 4a) La variación entre interferogramas se consigue incrementando el valor de su fase de manera sucesiva Inicialmente con pequeños cambios de un grado, 2 grados y 3 grados, como

se muestran en las figuras 4b, 3c, y 3d, respec-tivamente Estas imágenes corresponderían a pequeñas desalineaciones del sistema interfero-métrico Es complicado identificar a simple vista estos pequeños desplazamientos, esto sugiere la aplicación de técnicas independientes a la apre-ciación subjetiva En este caso es de utilidad apli-car los filtros y observar cuál de ellos ofrece una mejor discriminación a estos cambios

(a) (b) (c) (d)

(e) (f) (g) (h)

Figura 4.

Figura 4. Interferogramas simulados con pequeños cambios de fase respecto de la imagen de referencia que se muestra en (a). (b) variación de fase de un grado (c) 2 grados y (d) 3 grados. No hay un desplazamiento de franjas apreciable. La imagen que se muestra en (e) es una vez más la imagen de referencia ahora comparada con interferogramas cuyas va-riaciones de fase son (f) 30 grados, (g) 90 grados y (h) 180 grados donde claramente se observa un desplazamiento de franjas.

A partir de la figura de referencia 4e, la cual es idéntica a la figura 4a, en las figuras 4f, 4g y 4h se muestran las variaciones respecto del despla-zamiento de fase de 30, 90 y 180 grados, respec-tivamente Es notorio que las figuras con mayor desplazamiento de fase muestran con claridad el desplazamiento de franjas, el cual está directa-mente relacionado con la inclinación del frente de onda bajo estudio por la falta de calibración del sistema de desplazamiento, o bien a la com-pleta desalineación del sistema interferométrico La información de estos desplazamientos de la franjas puede ayudar a ajustar la posición exacta de los prismas, facilitando la calibración del in-terferómetro de desplazamiento vectorial

La figura 5 muestra las gráficas de las varia-ciones de amplitud respecto del desplazamiento de franjas Inicialmente, se obtuvieron los valo-res normalizados del pico de las amplitudes rela-


tivas debido al cambio de fase aplicando los tres filtros (clásico MF, sólo de fase POF e Inverso IF), donde, en todos los casos el valor cuando no hay desplazamiento es la unidad, este es el caso de la correlación de la imagen de referencia con-sigo misma o autocorrelación Los filtros POF e IF tienden a disminuir a medida que aumenta el ángulo relativo de desplazamiento, como era de esperarse, ya que la posición de las franjas cada

vez se desplaza más y por lo tanto el pico de co-rrelación tiende a disminuir Sin embargo esto no se observa en el filtro clásico donde a partir aproximadamente de los 30 grados, el pico de correlación vuelve a incrementarse de manera paulatina hasta que en los 180 grados, el pico de correlación alcanza un máximo indicando la similitud exacta entre el interferograma de refe-rencia y el interferograma desplazado

Amplitud máxima del pico de correlación

(a) Cambio de fase relativo, en grados


(b) Cambio de fase relativo, en grados


(c) Cambio de fase relativo, en grados

Figura 5.

Figura 5. Gráficas de las variaciones de la amplitud máxima normalizada del pico de correlación respecto del cambio de fase utilizando el filtro (a) MF, (b) POF y (c) IF.


La figura 5a muestra, además, que el filtro clásico es más sensible a las variaciones de fase correspondientes a los primeros 30 grados ya que la pendiente de la recta disminuye rápidamente debido a las grandes diferencias entre las ampli-tudes de cada imagen de correlación Después de los 30 grados, el filtro no puede discriminar adecuadamente y en los 180 grados simplemente no logra detectar la diferencia entre los interfe-rogramas

Las figuras 5b y 5c muestran problemas de discriminación a pequeños cambios de fase, pe-queños desplazamientos de franjas, pero mejora su operación a medida que la diferencia entre los patrones interferométricos aumenta El filtro de fase es el que presenta menos ambigüedades a cambios pequeños de desplazamiento

La figura 6 presenta los resultados de aplicar los tres filtros antes descritos a tres imágenes de patrones de intensidad experimentalmente obte-nidas del interferómetro de desplazamiento vec-

torial, tomando como referencia el interferogra-ma de ubicado en la primera columna en la parte superior izquierda (figura 6a) La respuesta de cada uno de los filtros MF, POF e IF respecto de la referencia se muestran por columnas 6(b), 6(c), y 6(d), respectivamente En donde el filtro inverso tiene la mejor discriminación a la orien-tación de las franjas

La figura 7 presenta los resultados de aplicar una vez más estos filtros (MF, POF e IF), a inter-ferogramas experimentales con diferente densi-dad de franjas manteniendo la misma dirección de desplazamiento La imagen superior izquier-da es la imagen de referencia y se compara con las otras dos Los resultados gráficos cuando se utilizan los filtros MF, POF e IF se muestran en los incisos (b), (c) y (d) respectivamente Nin-guno de los tres filtros logra una discriminación perfecta, sin embargo el filtro de fase presenta modificaciones no sólo en la amplitud del pico de correlación, sino además, que existe un des-

(a) (b) (c) (d)

(a) (b) (c) (d)

(a) (b) (c) (d)

Figura 6.

Figura 6. Interferogramas experimentales con diferentes direcciones de franjas. La imagen superior izquierda es la imagen de referencia y se compara con las otras dos, en medio e inferior. Los resultados gráficos cuando se utilizan los filtros MF, POF e IF en cada caso se muestran en los incisos (b), (c) y (d) respectivamente. En todos los casos el filtro inverso realiza la mejor discri-minación cuando se trata de patrones con diferencias claras.


plazamiento en el pico en dirección del desplaza-miento de las franjas, dado la escala de la gráfica no es apreciable

La figura 8 muestra con más claridad las variaciones de posición y amplitud del pico de correlación cuando se utiliza sólo el filtro POF El filtro sólo de fase modifica la posición de la frecuencia espacial en el espectro de correlación pero no tiene efecto en la magnitud del pico de correlación Este filtro se aplica a las imágenes desplazadas de tal forma que la información del cambio de fase sea proporcional al despla-zamiento espacial del patrón de correlación En La figura 8a, se presentan los gráficos de auto-correlación de la señal de referencia, en forma tridimensional, donde se observa que los picos de correlación en dirección vertical y horizontal se interceptan en la coordenada correspondien-te al valor del pico de correlación La figura 8b presenta el perfil bidimensional considerando la dirección del desplazamiento de franjas, en

este caso nulo La figura 8c presenta la vista tri-dimensional de la correlación con una imagen desplazada 30 grados En este caso, el pico de correlación no coincide con el máximo local que se reubica en una nueva coordenada a lo largo de la dirección del desplazamiento de franjas El perfil bidimensional que se muestra en la figura 8d hace evidente la diferencia de ubicación en-tre el pico de correlación y máximo local, en este caso hacia la izquierda, que es directamente pro-porcional al valor del cambio de fase

V. Conclusiones

Hemos presentado una descripción general para la alineación del interferómetro de desplaza-miento vectorial utilizando tres filtros de correla-ción (clásico MF, sólo de fase POF e Inverso IF) Los filtros POF e IF mostraron un buen nivel de discriminación cuando se analizan interferogra-

(a) (b) (c) (d)

(a) (b) (c) (d)

(a) (b) (c) (d)

Figura 7.

Figura 7. Interferogramas experimentales con diferente densidad de franjas manteniendo la misma dirección. La imagen supe-rior izquierda es la imagen de referencia y se compara con las otras dos. Los resultados gráficos cuando se utilizan los filtros MF, POF e IF en cada caso se muestran en los incisos (b), (c) y (d) respectivamente. En todos los casos no se logra la discrimi-nación perfecta, sin embargo el pico máximo de correlación disminuye como se observa en la figura 5.


Figura 8. (a) Imagen tridimensional del resultado de la autocorrelación de la imagen de referencia. (b) Perfil bidimensional cen-trado en la coordenada del máximo de amplitud del pico de correlación. (c) Imagen tridimensional del resultado de la correla-ción con una imagen desplazada 30 grados respecto de la imagen de referencia. (b) Perfil bidimensional con un desplazamiento a la izquierda indicando el desplazamiento de la fase en el patrón de interferencia. Note que el pico máximo de correlación se mantiene en las mismas coordenadas.

(a) (b)

(c) (d) Figura 8.

0 200 400 600 800 1000 12000

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

0.8

0.9

1

0 200 400 600 800 1000 12000

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

0.8

0.9

1

Am

plitu

d no

rmal

izad

a de

l pic

o de

cor

rela

ción

Am

plitu

d no

rmal

izad

a de

l pic

o de

cor

rela

ción

Am

plitu

d no

rmal

izad

a de

l pic

o de

cor

rela

ción

Am

plitu

d no

rmal

izad

a de

l pic

o de

cor

rela

ción

Coordenadas espaciales en dirección del desplazamiento de franjas

Coordenadas espaciales en dirección del desplazamiento de franjas

Coordenadas espaciales en el plano

Coordenadas espaciales en el plano

mas cuyas franjas tiene diferentes direcciones Sin embargo, no son una buena opción cuando la detección se basa sólo en la amplitud del pico de correlación

Los filtros de fase mostraron una buena dis-criminación a las diferencias de fase (cambio de posición de las franjas del patrón de intensida-des interferométricas) Existe un corrimiento del máximo local del pico de correlación propor-cional al cambio de fase que determina el des-plazamiento de franjas en el interferograma La utilización de POF en combinación con el MF

incrementa la resolución para la alineación por medio del sistema de prismas de Risley del in-terferómetro de desplazamiento vectorial cuan-do se introducen pequeños cambios de fase

Los filtros de correlación presentan la ven-taja de ser de fácil implementación en sistemas automáticos Actualmente, se esta trabajando en la automatización del sistema de rotación del interferómetro donde los filtros de correlación se pueden aplicar mejorando la detección de la desalineación y facilitando la calibración general del interferómetro de desplazamiento vectorial

VI. Bibliografía y referencias

Awwal, A A S , M A Karim y S R Jahan (1990) “Improved correlation discrimination using an amplitude modulated phase-only filter” Appl. Opt., 29: 233-236

Bates, W J (1947) “A wave front shearing inter-ferometer” Proc Phys Soc , 59: 940-950

Bueno, Mario A , Josué Álvarez-Borrego, Leo-nardo Acho y María Cristina Chávez-Sán-chez (2005) “Polychromatic image fusion algorithm and fusion metric for automatized microscopes” Optical Engineering, 44(9): 093201, septiembre

Casasent, D y T Luu (1978) “Phase error model for simple Fourier transform lenses” Appl. Opt., 17: 1701-1708

Díaz-Ramírez, víctor H , vitaly Kober y Josué Álvarez-Borrego (2006) “Pattern recognition with an adaptive joint transform correlator” Appl. Opt., 45 (23): 529-594

Flores, Jorge L , G García-Torales y Cristina Ponce Ávila (2006) “Correlation pattern recognition: optimal parameters for quality standards control of chocolate marshmallow candy” En: Andrew G Tescher (ed ) Appli-cations of Digital Image Processing XXIX, Proc SPIE, vol 6312

García-Torales G , G Páez y M Strojnik (2001) “Simulations and experimental results with a vectorial shearing interferometer” Opt. Eng., 40(5): 767-773

García-Torales G , G Páez y M Strojnik, J villa, J L Flores, y A González Álvarez (2006) “Experimental intensity patterns-obtained from a 2D shearing interferometer with adaptable sensitivity” Opt. Comm., 257: 16-26

García-Torales G , M Strojnik y G Páez (2002) “Risley prism to control wavefront tilt and displacement in a vectorial shearing interfe-rometer” Appl. Opt., 41: 1380-1384

Goodman, W (1999, 2ª ed ) Introduction to Fourier Optics McGraw-Hill

Grigull, U y H Rottenkolber (1967) “Two-beam interferometer using a laser” J. Opt. Soc. Am., 57(2): 149-155

Harvey, J E y R v Shack (1978) “Aberrations of diffracted wave fields” Appl. Opt., 17: 3003-3009

Horner, J L y P D Gianino (1984) “Phase-only matched filtering” Appl Opt., 23: 812-816

Hsu, Y N y H H Arsenault (1982) “Aberra-tions of diffracted wave fields” Appl. Opt., 21: 4016-4019

Kumar, B v K v y L Hassebrook (1990) “Per-formance measures for correlation filters” Appl. Opt., 29: 2997-3006

Malacara, D (1992) “Radial, rotational, and re-versal shear interferometers” En: Malaca-ra, D (ed ) Optical Shop Testing John Wiley and Sons, Inc , cap v

Mu, G G , x M Wang y Z Q Wang (1988) “Amplitude compensated matched filtering” Appl. Opt., 27: 3461-3463

Oppenheim, A v y J S Lim (1981) “The im-portance of phase in signals” Proc. IEEE, 69: 529-541

Pech-Pacheco, J L y J Álvarez-Borrego (1998) “Optical-digital system applied to the identi-fication of five phytoplankton species” Mari-ne Biology, 132: 357-365, Springer-verlag

Roddier, C , F Roddier y J Roddier (1989) “Compact rotational shearing interferome-ter for astronomical applications” Opt. Eng., 28(1): 66-70

vanderlugt, A B (1964) “Signal Detection By Complex Spatial Filtering” IEEE Trans. In-form. Theory, IT-10, 139-145

vanderlugt, A (1968) Optical signal processing John Wiley and Sons, Inc

vaughan, J M (1999) “Interferometry, atoms and light scattering: one hundred years of optics” J. Opt.A: Pure Appl., 1: 750-768

Windecker, R y H J Tiziani “Optical roughness measurements using extended white-light in-terferometry” Opt. Eng., 38 (6): 1081-1087

Young, Thomas (1804) “Experimental Demons-tration of the General Law of the Interferen-ce of Light” Philosophical Transactions of the Royal Society of London, vol 94

Dr. Jorge Cristian Gallardo EscárateUniversidad Católica del Norte, Facultad de Ciencias del Mar, Departamento de Biología Marina, Larrondo 1281, Casilla 117, Coquimbo Chile

Dr. Miguel Ángel del Río PortillaCentro de Investigación Científica y de Educa-ción Superior de Ensenada, División de Ocea-nología, Departamento de Acuicultura, km 107 Carretera Tijuana-Ensenada, Ensenada, Baja California, México C P 22860

Dr. José Luis Pech PachecoCompañía Solex, Calle Sisones, Nave 58, Polígo-no “El Cascajal”, Pinto, España C P 28320

M en C Roberto Cortés AltamiranoInstituto de Ciencias del Mar y Limnología, Uni-versidad Nacional Autónoma de México, Uni-dad Mazatlán, Apartado Postal 811, Mazatlán Sinaloa, México C P 82240

Dr. Vitaly KoberCentro de Investigación Científica y de Educa-ción Superior de Ensenada, División de Física Aplicada, Departamento de Ciencias Computa-cionales, km 107 Carretera Tijuana-Ensenada, Ensenada Baja California, México C P 22860

Dr. José Ángel González FragaFacultad de Ciencias de la UABC, Ensenada Baja California, km 103 Carretera Tijuana-Ensenada, Ensenada Baja California, México C P 22700

Los autores

Dr. Víctor Hugo Díaz RamírezCentro de Investigación Científica y de Educa-ción Superior de Ensenada, División de Física Aplicada, Departamento de Ciencias Computa-cionales, km 107 Carretera Tijuana-Ensenada, Ensenada Baja California, México C P 22860

Dra. Rosa Reyna Mouriño PérezCentro de Investigación Científica y de Educa-ción Superior de Ensenada, División de Biolo-gía Experimental y Aplicada, Departamento de Microbiología, km 107 Carretera Tijuana-En-senada, Ensenada Baja California, México C P 22860

Dra. Ernestina Castro LongoriaCentro de Investigación Científica y de Educa-ción Superior de Ensenada, División de Biolo-gía Experimental y Aplicada, Departamento de Microbiología, km 107 Carretera Tijuana-En-senada, Ensenada Baja California, México C P 22860

Dr. Mario Alonso Bueno IbarraCITEDI-IPN, 2498 Roll Drive #757, Otay Mesa, San Diego, California

Dr. Gabriel CristóbalInstituto de Óptica Daza de valdés, Serrano 121, 28006 Madrid, España

Dr. Manuel G. ForeroInstituto de Óptica Daza de valdés, Serrano 121, 28006 Madrid, España

242 Los autores

Dra. Emma Josefina Fájer ÁvilaCentro de Investigación en Alimentación y De-sarrollo, A C , Unidad Mazatlán en Acuicultura y Manejo Ambiental, Avenida Sábalo Cerritos S/N, Apdo Postal 711, Mazatlán, Sinaloa, Méxi-co C P 82010

Dr. Guillermo García ToralesUnidad de Metrología Óptica y Electrónica, Centro Universitario de Ciencias Exactas e In-genierías (CUCEI), Universidad de Guadalaja-ra, Av Revolución 1500, Modulo O Planta Baja Puerta Sur Col Universitaria, Guadalajara Ja-lisco, México C P 44840

Dr. Jorge Luis Flores NúñezUnidad de Metrología Óptica y Electrónica, Centro Universitario de Ciencias Exactas e In-genierías (CUCEI), Universidad de Guadalaja-ra, Av Revolución 1500, Modulo O Planta Baja Puerta Sur Col Universitaria, Guadalajara Ja-lisco, México C P 44840

M. en C. Selene Abad RosalesCentro de Investigación en Alimentación y De-sarrollo, A C , Unidad Mazatlán en Acuicultura y Manejo Ambiental, Avenida Sábalo Cerritos S/N, Apdo Postal 711, Mazatlán, Sinaloa, Méxi-co C P 82010

Dra. María Cristina Chávez SánchezCentro de Investigación en Alimentación y De-sarrollo, A C , Unidad Mazatlán en Acuicultura y Manejo Ambiental, Avenida Sábalo Cerritos S/N, Apdo Postal 711, Mazatlán, Sinaloa, Méxi-co C P 82010

Dr. Josué Álvarez BorregoCentro de Investigación Científica y de Educa-ción Superior de Ensenada, Dirección de Físi-ca Aplicada, Departamento de Óptica, km 107 Carretera Tijuana-Ensenada, Ensenada, Baja California, México C P 22860

Introducción a la IdentificaciónAutomática de Organismos yEstructuras Microscópicas y

Macroscópicasse terminó de imprimir en abril de 2008en los talleres de Ediciones de la Noche

Guadalajara, Jalisco.El tiraje fue de 1000 ejemplares

[email protected]

introducción a la identificación -...

Documents