intolerancias metabólicas al ejercicio : aproximación...
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Intolerancias Metabólicas al Ejercicio :
Aproximación diagnóstica
S. BIOQUIMICA CLÍNICA. i+12.
HOSPITAL UNIVERSITARIO 12 DE OCTUBRE. MADRID
U. 723
RUTAS METABÓLICAS Y EJERCICIO
Creatín-fosfato Creatina
ATP ADP +
Pi Ejercicio/ATPasa
ADP
AMP Adenilato quinasa
Mioadenilato
desaminasa
IMP
NH4+
Ciclo de los
nucleótidos
de purina Fumarato
Ciclo de
Krebs
Glucógeno Acidos grasos
ß-Oxidación
Glucogenolisis + Glucolisis aeróbica
Aspartato
Creatín quinasa
Cadena respiratoria
Glucolisis
Ejercicio y sustratos metabólicos • ISOMÉTRICO
• DINÁMICO.
Tipo de Ejercicio Intensidad VO2max Sustrato Comentario
Reposo 0 AGL (70%)
Submáximo
Baja < 50% Glucosa y AGL
Duración:
Glucosa
AGL
Media 50-70% Glucógeno,
Glucosa y AGL
Alta 70-80% Glucógeno
fatiga
Máximo 80-100% Glucosa
Glucolisis
Anaeróbica
• ALTERACIONES DE LA CADENA RESPIRATORIA MITOCONDRIAL
• ALTERACIONES DEL METABOLISMO PURÍNICO
– Déficit de mioadenilato desaminasa (AMPD1)
• ALTERACIONES DEL METABOLISMO LIPÍDICO
– Déficit de carnitina-palmitil transferasa II
– Deshidrogenasa de los acidos grasos de cadena muy larga forma adulta (Late-Onset VLCAD)
• ALTERACIONES DEL METABOLISMO GLUCÍDICO
– Déficit de miofosforilasa (Enf. McArdle) (Glucogenosis V)
– Déficit de fosfofructoquinasa (Enf. Tarui) (Glucogenosis VII)
– Otras Glucogenosis musculares (defectos de la glucolisis distal)
INTOLERANCIAS METABÓLICAS AL EJERCICIO
mtDNA
I
II
III
IV
V
C
Q
NÚCLEO
Componentes estructurales
de los complejos de la CRM
Otros factores involucrados
en la biogénesis de la CRM
MITOCONDRIA
Factores de ensamblaje
de la CRM
Estabilidad del mtDNA
CADENA RESPIRATORIA: CONTROL GENÉTICO DUAL ENFERMEDAD MITOCONDRIAL
GEN MITOCONDRIAL
GEN NUCLEAR
Herencia Materna
Multiples orgánulos por célula
Complementación
Heteroplasmia
Umbral
Redistribución aleatoria
Susceptibilidad del órgano final
INTOLERANCIA AL EJERCICIO
EN LAS ENFERMEDADES
MITOCONDRIALES
INTOLERANCIA AL EJERCICIO ES UNA QUEJA FRECUENTE EN PACIENTES CON ENCEFALOMIOPATIA MITOCONDRIAL, AUNQUE ES COMÚN QUE SE HALLE ENSOMBRECIDA POR OTROS FENOTIPOS MAS SEVEROS
•tRNAPhe (A606G)
•Deficiencia de CoQ
INTOLERANCIA AL EJERCICIO Y MITOCONDRIA
(N Engl J Med 1999;341:1037-44.)
INTOLERANCIA AL EJERCICIO
MUTACIONES ADNmt
NADH-UBIQUINONA REDUCTASA (COMPLEJO I)
ND1 inversión intragénica 7 pb
ND4 G11832A
ND2 W114X
UBIQUINOL-CITOCROMO C REDUCTASA (COMPLEJO III)
Cyt b:
G15615A, G15224A, G15762A, G15059A, del 24 pb, G14486A, G15168A, G15170A, G15084A, G15723A, G15761A, C15800T
CITOCROMO C OXIDASA (COMPLEJO IV)
COX I G5920A
COX III del 15-pb
COX II T7879C
tRNAs MITOCONDRIALES
tRNASer (UCN) (G7497A)
tRNASer (CUN) (G12334A)
tRNATyr (A5874G)
SOMÁTICAS CONFINADAS AL MÚSCULO ESQUELÉTICO
ADP ATP
Aspartato + GTP
NH3
GDP + Pi
CICLO DE LOS NUCLEÓTIDOS
DE PURINA
Adenilsuccinato liasa
AMP
Fumarato
ATPasa
Adenilato quinasa
Mioadenilato desaminasa
Adenilsuccinato sintetasa
DEFICIENCIA AMPD1
FUNCIÓN METABÓLICA
Adenilsuccinato
IMP
DÉFICIT DE MIOADENILATO DESAMINASA
• Mialgias, fatiga, dolor muscular y calambres moderados
• Mioglobinuria ocasional
• Asociada otras enferm. neuromusculares (50%)
• Asociada a “doble problema” • Inicio y diagnóstico: infancia, juventud y adultos
• Histoquímica MADA: ausencia de tinción
– Déficit de MADA: 2% biopsias musculares y 2% de controles sanos.
• Laboratorio:
– CK basal: aumento moderado en algunos casos
– PAEI: Curva de amonio plana
• Herencia autosómica recesiva
DÉFICIT DE MIOADENILATO DESAMINASA
GENÉTICA MOLECULAR
• Gen AMPD1:
– Codifica la isoenzima muscular de la AMP desaminasa (MADA)
– 16 exones (miniexón 2 con 12 bases)
• Mutación COMÚN:
– Mutación sin sentido Q12X en exón 2 (>95% de los pacientes)
– Frecuencia Alélica: 17% raza blanca
• Alelo Q12X +
• Otra mutacion Q156H identificada en una serie de pacientes caucásicos
• Q12X (c.34C>T) como factor protector cardiovascular
HETEROCIGOSIS Q12X EN CONTROLES
DÉFICIT DE MIOADENILATO DESAMINASA
FENOTIPO MUTACION Q12X (c.34C>T)
20 HOMOCIGOTOS Q12X
26/150 : 17,3%
HISTOQUÍMICA 20/1300: 1,6%
CRIBADO MOLECULAR MUTACION Q12X
15 Q12X
3 + R50X (PYGM)
4 DOBLE PROBLEMA Q12X +
1 + A3243G (ADNmt)
I.E. MODERADA
FENOTIPO I.E OSTEOMALACIA
FENOTIPO
MITOCONDRIAL (PEO)
1 Q12X + DEF. COMP III CRM
FENOTIPO
McARDLE
• Normal Respiratory chain activities • Normal mtDNA/nDNA ratio • Normal 15 frequent mutations and rearrangements of mtDNA
ACS
ESPACIO
INTERMEMBRANA
MEMBRANA INTERNA
MEMBRANA EXTERNA
CITOSOL
ACIL-CoA
ACIL-CoA
ACIL-CoA
AMP + PPi ATP + CoA AGCL
CPT II
ACIL-CARNITINA
ACIL-CARNITINA
CARNITINA
CARNITINA
CARNITINA
CARNITINA
CARNITINA
ACETIL-CARNITINA
ACETIL-CARNITINA
CICLO DE KREBS
MATRIZ
ß-OXIDACION
CoA CoA
ACETIL-CoA
CPT I
CATR
FUNCIÓN METABÓLICA CPT
CAT
Presentaciones clínicas deficiencia CPT II:
Neonatal Letal •Episodes of liver failure with hypoketotic hypoglycemia
•Cardiomyopathy
•Cardiac arrhythmias
•Seizures and coma after fasting or infection
•Facial abnormalities or structural malformations (e.g., cystic renal dysplasia, neuronal
migration defects)
•Onset within days after birth
Hepatocardiomuscular (infantil grave) •Liver failure
•Cardiomyopathy
•Seizures, hypoketotic hypoglycemia
•Peripheral myopathy
•Attacks of abdominal pain and headache
•Onset in the first year of life
Miopática del adulto •Recurrent attacks of myalgia accompanied by myoglobinuria precipitated by prolonged
exercise (especially after fasting), cold.)
DÉFICIT DE CPT II
FORMA ADULTA MUSCULAR
• Prevalencia estimada 1 : 300.000
• Crisis recurrentes de mialgias, calambres y rigidez muscular:
– ejercicio aeróbico de moderada intensidad y larga duración
– frio, infecciones, fiebre y estrés emocional
• No existe fenómeno de segunda entrada
• Mioglobinuria frecuente (70-80%) ------> fracaso renal
• Inicio: infancia y adolescencia
• Diagnóstico: 2ª-3ª decada
• Histología: Normal o en pocos casos aumento lípidos. No tinción
histoquímica.
• Laboratorio:
– CK basal: normal ; CK crisis: muy elevada.
– PAEI: curva de lactato y curva amonio normales
• Herencia autosómica recesiva
1. Espectrometía de masas en Tandem (MS/MS) de acilcarnitinas en suero/plasma
Sugestivo de defecto en β-oxidación mitocondrial: aumento de C2 a C18 acilcarnitinas especialmente de C16 y C18:1.
2. Actividad Enzimática CPT II
Actividad enzimática total CPT (CPT I y CPT II) palmitoyl-CoA + carnitine ↔ palmitoylcarnitine + CoA. •"radio isotope exchange assay”. •"isotope forward assay“ Actividad CPT II es la fracción no inhibida por malonyl-CoA.
0
50
100
150
200
250
300
350
400
Normal Déficit CPT
Diagnóstico Bioquímico del Déficit de CPT II
1 2 3 4 5
S113L
R124X
R151Q
P50H
178 ins T/del 25 pb
(L178fs)
Y628S
P604S
R631C
G549D Q550R
D553N
R503C F448L F383Y
413 delAG
(Q413fs)
Y479F
M214T
P227L
R161W
DÉFICIT DE CPT II
MUTACIONES GEN CPT2
Y120C 36_38 insGC
(Q36fs)
I502T
IVS3 + 5G > A
N146T
E174K E487K A515fs
D608H
50-80%
c.38delG (p.Gly13fs)
0
10
20
30
40
50
60
70
80
S113L Otros alelos
%
• INTOLERANCIA AL EJERCICIO
• DEPOSITOS DE GLUCOGENO
• NEGATIVIDAD PRUEBAS HISTOQUIMICAS, Y BIOQUIMICAS DE OTRAS I.E. MAS FRECUENTES
DATOS: 32 PACIENTES SELECIONADOS PARA PRUEBAS
ENZIMATICAS EN HOMOGENADO MUSCULAR
NO SE IDENTIFICO NINGÚN DEFICIT ENZIMÁTICO
PHK1, PFKM Y GLUCOGENOSIS DISTALES
AFECTACIÓN MIOPÁTICA
Enfermedad de McArdle
Función Miofosforilasa GLUCÓGENO
GLUCOSA-1P
GLUCOSA-6P
VÍA
ANAERÓBICA
PIRUVATO
GLUCOSA
ATP ADP GLUCOLISIS
VÍA AERÓBICA (CICLO DE KREBS)
6 CO2+ 6 H2O+ 38 ATP ÁC. LÁCTICO+ 4ATP
FOSFORILASA A
(ACTIVA)
FOSFORILASA B
(INACTIVA)
ENFERMEDAD DE McARDLE
DÉFICIT DE MIOFOSFORILASA (glucogenosis tipo V)
Prevalencia estimada: 1 / 100.000 Texas. ; España ≈ 1/ 170.000
•Mialgias, fatiga prematura y calambres por dos tipos de ejercicio:
– ejercicio breve de gran intensidad (isométrico)
– ejercicio aeróbico de intensidad moderada/alta y mayor duración
•Fenómeno Segunda entrada (Second Wind): readaptación
fisiológica y bioquímica muscular para utilización primordialmente de glucosa sanguínea, y ácidos grasos.
•Mioglobinuria (50%) •Inicio: infancia
•Diagnóstico: 2ª-3ª decada, >50 a (debilidad fija)
•Histología: PAS +; Histoquímica MPL: Ausencia de tinción
•Laboratorio:
– CK reposo: elevada
– PAEI: Curva de lactato plana •Herencia autosómica recesiva
Herramientas de diagnóstico
• Casos inicio tardío de la enfermedad (Engel, 1963; Felice, et al., 1992; Pourmand, et al., 1983; Wolfe, et al., 2000). • 3 casos con debut en el periodo neonatal de una forma infantil fatal (DiMauro and Hartlage, 1978; Milstein, et al., 1989; Miranda, et al., 1979). • 1 caso de muerte súbita (el-Schahawi, et al., 1997). • Doble problema:
i. MADA (Rubio, et al., 2000c; Tsujino, et al., 1995a), ii. alteraciones mitocondriales (Mancuso, et al., 2003; Rubio, et al.,
1998), iii. hipertermia maligna (Isaacs, et al., 1989), iv. miastenia gravis (Lucia, et al., 2007b).
Heterogeneidad clínica
1993, 1ª mutación → Ene 2012 >130 mutaciones PYGM.
Mutaciones terminadoras, cambio de aminoácido, deleciones,
inserciones, mutaciones y polimorfismos que afectan al corte y
empalme de exones
Heterogeneidad molecular
. Spanish consortium diagnostic flowchart
Screening PCR-RFLP;
Genotyping real-time PCR
+
Sequencing
E1, E14, E17, E18
Genotipado Mutaciones Frecuentes Int. Metab. Ejercicio. Discriminación Alélica ‘Real Time PCR’
HOMOCIGOTO
HETEROCIGOTO
WILD-TYPEs
p.R50X-PYGM-McArdle
C PCR HM HT
306 pb 250 pb
146 pb
104 pb
56 pb
PCR-RFLP Nla III
Gen ACE, codifica ECA. Polimorfismo I/D. Alelo I, ↓ act ECA.
Martinuzzi et al, 2003: Mayor incidencia alelo D gen ACE en pacientes mayor severidad fenotípica.
Gen AMPD1, codifica MADA. Mutación p.Q12X.
Martinuzzi el al, 2003. No asociación.
Gen ACTN3, codifica α-actinina-3. Polimorfismo p.R577X.
Gen PPARGC1A, Coactivador-1 α del receptor-γ activado por proliferadores de peroxisomas . Polimorfismo p.G482S.
Moduladores fenotípicos
Mutaciones “silentes” ???; efectos mRNA
1 2 3 4
W798R/ K609K
K215K (c.645G>A) (Exón 5)
• p.R50X + p. K215K (mRNA : 5%)
• W798R + p.K215K Una familia: – Probando: p.R50X+ p.K215K+ p.T488N (cDNA Sangre)
– HIJOS (gDNA sangre):
• 2 : p.K215K+ p.T488N (Heterocigosis)
• 1 : p.R50X (Heterocigosis)
EXON 5
PATOGENICA:
- Estabilidad del mRNA
- ESS?
- ESE?
WT => AAG
K215K=> AAA
WT => AAG
K215K=> AAA
Electroferograma del ADNc procedente del ARNm del gen PYGM obtenido a partir de sangre periférica, mostrando la retención del intrón 6 como consecuencia del cambio c.645G>A.
c.645G>A
p.K215K
Expresión PYGM mRNA/cDNA en células sanguíneas “PCR ILEGITIMA” ----Diagnostico molecular
EXON 16 EXON 18
cDNA musc: clon Del ex17 cDNA PYGM DE LINFOCITOS
Probando: del exon 17 + p.R50X
Hijo 1: p.R50X en heterocigosis
Hijo 2: deleción exón 17 en heterocigosis
cDNA Linfocitos: p.R50X
Heterocigosis
ADNc MÚSCULO
c.(1969+214)_(2177+369)del
HOMO
ADNc SANGRE
p.R50X WT p.R50X
(p.R50X + p.V657_G726del)
c.(1969+214)_(2177+369)del
HETEROCIGOSIS
39
PCR ILEGITIMA DEL GEN PYGM
NMD
SANGRE
NMD
MÚSCULO
Expresión de GPM
40
CONTROLES
PTC PTC
GPM
Músculo Sangre
55 KDc 42 KD
97 KD
CARACTERIZACION DE LAS ALTERACIONES PROTEÍCAS EN LA ENFERMEDAD DE McARDLE
MIOFOSFORILASA
α- TUBULINA
WESTERN BLOT MIOFOSFORILASA
CUANTIFICACIÓN TRANSCRITOS DEL GEN PYGM MEDIANTE PCR A TIEMPO REAL
Parece no existir relación entre los niveles de mensajeros y los niveles de proteína.
Análisis monodimensional
SERCA1
GPM
GS
α- Tubulina
Miosina
1. p.R50X + p.L5VfsX22
2. p.W798R HO
3. p.R50X HO
4. p.R50X + p.A660D
PACIENTES
104 KD
97 KD
84 KD
55 KD
217 KD
Análisis Bidimensional
44
CONTROL PACIENTE: p.W798R HOMOCIGOTO
Análisis Bidimensional - WB
C1
C2
p.W798R
p.R50X
06/12/2012 45
- GS-P
MPL GS SERCA1 α-Tubulina + GS SERCA1-P SERCA1
BN- Colocalizaciones
2D-PAGE-SDS: GS
47
CONTROL P21 P24
% G
S
0
20
40
60
80
TETRAMERODIMEROMONOMERO
A
B
CONTROL
PACIENTE 21
PACIENTE 24
T D M
1
2
3
p.R50X HOMO
p.R50X + p.R602W
CONTROL
GP
SERC
A1
GS
97 KD
a
104 KD
a
84 KD
a
1D-
BLU
E NATIV
E
3%
12 %
GP
1D
2D
2D
-PA
GE-SD
S
2A
2B
2C
90
ºC
3%
12%
1D- NATIVE
GP
SERCA1
GS
97 KDa
104 KDa
84 KDa
1D- BLUE NATIVE
3%
12 %
GP1D
2D
2D- PAGE-SDS
2A
2B
2C
90ºC
GS (84 KDa)
GS (84 KDa)
GS (84 KDa)
La ausencia de GPM en pacientes conlleva la desregulación de puntos clave en el control del metabolismo del músculo esquelético.
i. Una disminución de los niveles y del grado de fosforilación de SERCA1.
ii. Una reducción en la cantidad de GS activa, y un desplazamiento hacia su forma inactiva, lo que sugiere un efecto protector de sobrecarga de glucógeno en el músculo.
iii. Glucógeno sintasa (GS) y GPM parecen colocalizar en el músculo, de tal manera, que la ausencia de GP en los pacientes parece romper el equilibrio de los complejos que forman entre sí, desplazando la GS hacia complejos no activos.
INTRODUCCIÓN
CÉLULAS MADRE QUIMERA
RATONES PORTADORES p.R50X
Ratones portadores mutación p.R50X en el gen PYGM
Neo
Knock-in R50X (+Neo) HET
Knock-in R50X HET Knock-in R50X HET
25% WT, 50% Knock-in R50X HET, 25% Knock-in R50X HOM
Cre ubicua
R50X Mouse
• Período: 1998 – Enero 2011. •239 casos de origen Caucásico ( 102 mujeres) •Edad: 44±18 años (rango: 9 – 93) •Prevalencia ~1/167,000 •Alelos mutantes PYGM 99.6% de los casos •Existe heterogeneidad en la gravedad de los síntomas, pero hay cuatro características diagnósticas comunes:
i. 99.5% pacientes crisis aguda de intolerancia al ejercicio (con mioglobinuria recurrente en 50% de los casos)
ii. 58% pacientes inicia los síntomas en la primera década de vida iii. 86% pacientes experimentan el fenómeno ‘second wind’
repetidamente a lo largo de su vida iv. 99% pacientes tienen hiper-CK-emia basal (>200 U/L). v. Fracaso renal agudo: muy infrecuente (4%)
•Los pacientes físicamente activos tienen mayor probabilidad de mejora de su curso clínico (odds ratio: 232.3, 95%CI: 22.5 – 2324.4), y mejor capacidad cardiorespiratoria ( + 23% VO2peak , P=0.003).
REGISTRO NACIONAL DE ENFERMEDAD DE McARDLE (Hospital 12 de Octubre, Madrid; Hospital Val d’Hebron, Barcelona; and Hospital Meixoeiro, Vigo; Universidad Europea de Madrid )
PYGM (R50X, G205S, W798R)
CPT2 (S113L)
AMPD1 (Q12X)
LABORATORIO: CK basal HISTORIA CLÍNICA: Causantes IE, tipo ejercicio, Mb(o).; Second Wind
CRIBADO MUTACIONAL: PCR-RFLP o Discriminación Alélica (Genotipado)
ADN Sangre
Curva de Lactato PLANA Curva de Amonio PLANA Curvas en isquemia NORMALES/Acilcarnitinas suero
Caract. molecular
SI SECUENCIACIÓN PYGM Exones 1, 14 , 17 y 18
Caract. molecular
SI
ACTIVIDAD ENZIMÁTICA MPL, CPT II; CRMito
Biopsia muscular
Caract. molecular
SI
Caract. molecular
SI
ESTRATEGIA DIAGNÓSTICA
SECUENCIACIÓN PYGM o CPT2; Análisis de cDNA
ANATOMIA PATOLÓGICA Histología: Glucógeno, Lípidos, RRF/COX Histoquímica: MPL, PFK, MADA, VLCAD
Second Wind Objetivo
physiology
genetics animal model