intercambio genético en...

Intercambio genético en procariotas

� Recombinación genética: transformación, transducción, conjugación.

� Plásmidos: tipos, episoma.� Transposones y secuencias de inserción

Lic en Biología Molecular-2015

Objetivos

� Diferenciar entre transferencia génica horizontal y vertical� Comparar los mecanismos de recombinación genética en

bacterias� Entender de que manera a través de la recombinación

genética se cumple la selección natural� Describir funciones de plásmidos, SI y transposones

Flujo de la información genética en células procari otas

Tomado de : Tortora, G,J.,Funke, B.R., Case, C. L. Introducción a la Microbiología. 9ª ed.

El genoma procariota evoluciona por :

� Mutación

� Rearreglos internos del ADN

� Adquisición de ADN de otras células por transferencia horizontal (recombinación)

Intercambio genético en procariotas

Tomado de Brock. Microbiología de los microorganismos. 12° edición

Destinos del DNA introducido en la célula receptora :

� degradado por enzimas de restricción

� autorreplicarse (solo si posee su propio origen de replicación: plásmido)

� recombinarse con el cromosoma de la célula receptora u hospedadora

Recombinación

Intercambio físico de DNA entre elementos genéticos. Implica ruptura física y posterior unión de hebras de ADN de forma tal que intercambian el contenido de ADN resultando en dos “nuevas”hebras.

Sólo ocurre en zonas con alta homología

Permite reparar cromosomas dañados durante la replicación (mantenimiento de información)

Se da en sitios específicos de las moléculas de ADN involucradas: secuencias homologas apareamiento

Recombinación homóloga: entre secuencias homólogas de dos fuentes diferentes

Mecanismo:- Helicasa y endonucleasa (Rec BCD)

- Proteína de unión a cadena sencilla (SSB)

- Rec A (invasión de cadena, región monocatenaria, forma un complejo)

- Heterodúplex cada cadena procede de un ADN diferente

- Uniones de Holliday

- Resolvasa (RecG y RuvC)

Tomado de Tomado de BrockBrock. Microbiolog. Microbiologíía de los microorganismos. 12a de los microorganismos. 12°° ediciedicióónn

La recombinación genética en procariotas sólo se produce luego de la transferencia de fragmentos de DNA homólogos desde un cromosoma donador a una célula receptora, mediante transformación, transducción o conjugación

Detección de la Recombinación

Células receptoras que carezcan de alguna características seleccionable (auxótrofas) que los recombinantes ganarán

La tasa de retromutación para la característica seleccionada sea baja porque los revertientestambién formaran colonias

Dobles mutantes: cepas con dos mutaciones diferentes, es poco probable que se produzcan dos retromutaciones en una misma célula.

Mutantes de desplazamiento del marco de lectura (reversión baja)

Células fenotípicamente diferentes a sus progenitores

Intercambio genético

� Unidireccional: de donante a receptor� Puede ser entre especies distintas

� Mecanismos:

1. Transformación2. Transducción3. Conjugación

Transformación bacterianaproceso de transferencia genética por el cual fragmentos de DNA son incorporados en una célula receptora y se lleva a cabo un cambio genético

Competencia en la transformación

Célula competente:

célula capaz de aceptar DNA y transformarseDeterminadas cepas o especies pueden transformar

- Proteínas especificas de competencia: proteína de unión al DNA asociada a la membrana, una autolisina de la pared y varias nucleasas.- Bacillus subtilis: percepción del quórum: un sistema regulador que depende de la densidad celular. Secretan un péptido que en altas concentraciones induce la competencia- Algunos procariotas son competentes de forma natural y fácilmente transformables: Bacillus, Streptococcus.

Obtención de células competentes en E.coli:tratadas con iones calcio y luego enfriadas

Electroporación: usa breves pulsos eléctricos para introducir DNA

electroporador

Mecanismo de la transformación en procariotas


Células competentes fijan hasta 100 veces mas DNA. Fragmentos transformantes son pequeños (S. pneumoniae une sólo 10 moléculas de ADN de 10-15 kpb)

Alta concentración de ADN satura el sistema

competenciaSolo 1 de cada 100 ó 300 fragmentos de DNA son captados.

Proteína de unión de DNAAutolisinaNucleasaProteína especifica de competencia: protecciónRec AIntegración de DNA

Experimento de Griffith: demostración de la transformación genética

Cepas S Cepas R

Las bacterias vivas no capsuladas fueron transforma das por las bacteriasmuertas encapsuladas que adquieren la capacidad de formar cápsula

por lo tanto causar enfermedadDNA

Bacteriófago lítico

Util para el estudio de los mecanismos de transformación y recombinación: pequeño tamaño de los fagos, permite el aislamiento de una población homogénea de moléculas de DNA.Transformación convencional: fragmentos de ADN al azar

Se puede transformar utilizando DNA plasmídico????? Las bacterias se transforman muy poco ya que el plásmido debe mantenerse de doble cadena y circular para poder replicarse.

TransfecciónVirus Ensayo de

calvas

DNAdeterminar

TransfecciónEs el proceso por el que las bacterias pueden transformarse con DNA obtenido de un bacteriófago

Transducción

Es frecuente en Escherichia, Pseudomonas, Salmonella,Staphylococcus

Transferencia de genes bacterianos a través de un bacteriófago. El bacteriófago transductor no es infeccioso

Bacteriófago

Bacteriófagos: Ciclo lítico o lisogénico

Tomado de Brock. Microbiología de los microorganism os. 12° edición

Transducción: un virus bacteriano transfiere el DNA de unacélula bacteriana a otra

Transducción generalizada:

Cualquier fragmento de DNA del hospedador es empaquetado en el interior del virión maduro en lugar del genoma vírico .

Transducción especializada:

El DNA de una región especifica del genoma del hospedador se integra en el genoma del virus. Sólo en virus atemperados.

Transducción generalizada: pueden formarse partículas del virus con DNA del hospedador


Partículasdefectivas

Frecuencia

Para 1 marcador

1/106

Relación fago /bacteriabaja

Mecanismo de transducción generalizada en P1

Transducción generalizada:-Cualquier segmento del donador-Infección lítica- Eficiencia de la transducción; baja

Transducción especializada

Tomado de Brock. Microbiología de los microorganism os. 10° edición

-Partículas transductoras: selectivogrupo restringido y especifico de genes del hospedador. -Eficiencia de la transducción: alta-Ej: transducción de genes de galactosa en E. coli conteniendo un fago lambda como profago

Transducción especializada fago λ (atemperado)

Para que un virión λ sea viable hay un límite de la cantidad de DNA fági co que puedesustituir con DNA del hospedador

El virión debe retener DNA para codificar cubierta proteica, proteínas para lisis, lisogenia

Lisogenia

Valor selectivo

2- Conversión fágica: es la alteración fenotípica de una célula hospedadora que puede exhibir nuevas propiedades o cambios genéticos. Ej:

-Salmonella anatum: cambio en la estructura de un polisacárido de la pared celular por lisogenia del bacteriofago ε15

-Corynebacterium diphteriae: sólo las cepas lisogénicas son productoras de toxina

1- Inmunidad: la célula lisogénicaes inmune a la reinfección por

otro fago del mismo tipo

3-Transducción especializadaGenes selectivos

Supervivenciaen la naturaleza

Plásmidoselementos genéticos extracromosomales

Características generales:DNA bicatenario, superenrollado y circular

Se replican independientementeNo tienen forma extracelularPortan genes no esencialesMenos del 5% del tamaño del DNA cromosómicoTamaño: 1 a 100 kpbNº de copias: 1-3; 100

Replicación:Gram negativos: Igual al cromosoma: ori R, bidireccional, theta

Gram positivos: mecanismo del circulo rodante. Intermediario monocatenario. Cebador proteico 5’.


Incompatibilidad:

� Varios plásmidos en una bacteria, todos genéticamente distintos

� Los del mismo grupo se excluyen (Grupo Inc) para replicarse en la misma célula, (genes del plásmido que lo controlan)

� Coexisten con los de otros grupos

Curación:Eliminación de plásmidos de la célula bacteriana. � Tratamiento con productos químicos (acridina)� Efecto de la dilución: inhibición de la replicación del plásmido� Plásmidos de resistencia se pierden si no hay antibióticos

EpisomasPlásmidos que se integran al cromosoma bacteriano y la replicación bajo control del cromosoma bacteriano

Tipos de plásmidos

� Plásmidos que confieren propiedades metabólicas especiales, degradar contaminantes tóxicos

� Contienen genes para: control de replicación incompatibilidad, transferencia de inserción (células Hfr)

� Plásmidos que codifican toxinas y otras características de virulencia

Ej: factor antigénico de colonización, hemolisina, enterotoxina de E. coli enteropatógenas� Plásmidos que producen bacteriocinas:

Ej: Colicinas de E. coli: forma canales en la m. celular, incapacidad de generar energía. Nucleasas de E.coli: E2 y E3Nisina A conservante en Industria alimentaria (Gram+)

Puede ser transferido entre cepas de Escherichia, K lebsiella, ProteusSalmonella, Shigella

Plásmidos conjugativos


Plásmido F- DNA circular- Genes que regulan su replicación- Elementos transponibles: secuencias de inserción- Región tra: transferencia, apareamiento y síntesis del pelo sexual.

Características esencialesEl plásmido conjugativo utiliza el mecanismo de conjugación para:1-transferir copias de si mismos 2-transferir el cromosoma de la célula donadora, cuando se integra como un episoma.

ConjugaciónUna célula donadora que contiene el plásmido conjugativo (F+) transfiere DNA a una célula aceptora que no lo contiene (F-) . Implica el contacto entre células bacterianas (apareamiento). Codificado por un plásmido.

Pelos sexuales

� Presentes solo en células donadoras

� Forma un contacto especifico con un receptor en la célula receptora(apareamiento especifico)

� Se retrae, desensamblando sus unidades

� Atracción entre las dos célulasLas células siguen en contacto por proteínas de unión

� El DNA se transfiere de la célula donadora a la receptora a través de esa conexión conjugativa


Transferencia de DNA plasmídico por conjugación


Eficiente, rápida

100 kpb en 5 min

Síntesis de ADN por replicación de círculo rodanteno por semiconservativa normal

Conjugación: transferencia de genes cromosómicos

Formación de cepas Hfr y movilización cromosómica por conjugación

Puede movilizar al cromosoma bacteriano durante la conjugación

El plásmido F es un episoma que se integra en el cromosoma de E. coli

Las células que poseen un plásmido F: F+Las células que poseen un plásmido F integrado en el cromosoma: Hfr

Conjugación :: Hfr + F -

Transferencia de genes cromosómicos

Replicación por mecanismo de circulo rodante del DNA plasmídico y del cromosoma

Hfr altas tasas de recombinación genética entre genes cromosómicos del donador y del aceptor

Integración del plásmido F en el cromosoma bacteria no


Secuencias de inserción (IS): elementos móviles presentes en el cromosoma de E. coli y el plásmido F que proporcionan regiones de

homología de secuencia que conducen a su integración.

Transferencia de DNA cromosómico por conjugación


Las cepas Hfr no convierten las F- en F+ o Hfr porqueraramente se transfiere el plásmido completo.

El cruce Hfr x F-genera el Hfr original (retiene una copia del plásmido integrado) y un F- con un genotipo nuevo.

Detección de la conjugación


En la conjugación a diferencia de la transformación y transducción las células donadoras como receptoras son viablesSe usan auxótrofos

Acoplamiento interrumpido de genes

� La transferencia de cromosomadesde Hfr a F- es alrededor de 100 minutos para transferir el cromosoma entero.

� El proceso de conjugación puedeser interrumpido usando unamezcladora

� A diferentes tiempos se puededeterminar la proporción de células F- que han recibido un marcador dado

� Esta técnica puede ser usadapara mapear el cromosomacircular de E. coli (orden)

Genes cerca del origen de transferencia Entran primero en la célula receptora y

están presentes en mayor % de recombinantes

.

Células F+: contienen el factor F en el citoplasma y pueden transferir F con alta eficiencia a células F- durante la conjugación.

Células Hfr: tienen el F integrado dentro del cromosoma bacteriano y no en el citoplasma.

Celulas F’: plásmidos F previamente integrados en el cromosoma que al escindirse capturan algunos genes cromosómicos identificables.

Permite la conjugación de un grupo restringido de genes a alta frecuencia. Similitud a transducción especializada.

Resumen de la conjugación

Células F- : no contienen el plásmido F y no pueden transferir DNA por conjugación. Ellos son recipientes de DNA transferido desde F+, F´ ó

Hfr por conjugación.

DNA móvil : elementos genéticos transponibles

� Siempre insertos en otra molécula de DNA

� Movimiento al azar

� No poseen su propio oriR

� Se replican como parte de otra molécula de DNA: cromosoma, plásmido o virus

� Proceso Transposición mediante recombinación especifica (transposasa)

� Secuencias invertidas cortas

Segmentos de DNA capaces de mudarse de una localizac ión a otraProducen: inserciones, delecciones, cambio de expres ión

Tipos de Elementos Transponibles

Secuencias de Inserción (IS): Elementos que portan sólo genes de transposición. Segmentos cortos, sencillos. Transposasa y repeticiones invertidas en los extremos. Se encuentran en el cromosoma o plásmidos.

TransposasaABCDEFG GFEDCBA

Transposones (Tn): Elementos que portan otros genes además de los de transposición. Mas grandes. Transposasa y repeticion es invertidas en los extremos. Incluyen genes de resistencia a antibióti cos

Bacteriófago Mu :

Genoma vírico completo contenido dentro de un transposón.

Se inserta aleatoriamente en el genoma del hospedador.Tras la inducción Mu se replica transponiéndose.Es un transposón con capacidad de encapsidar su ADN en una estructura viral.

Los elementos transponibles se integran por recombinación sitio específica

La transposasa realiza cortes escalonados en el ADN diana generando extremos de simple hebra y cataliza la integración.

La inserción de un elemento transponible genera duplicación de la secuencia diana

El ADN de simple hebra es reparado por la maquinaria celular

Mecanismo de transposición: conservativo o replicativo

La transposasa inserta el transposón (lila) en el sit io diana (azul) del receptor. La secuencia diana se duplica.

En la conservativa, el DNA donador se queda con el corte en la doble cadena en la ubicación previa del transposón.

En la replicativa, el DNA donador y el receptor con tienen una copia del transposón

Mecanismo de transposición: replicativo

Mutagénesis por transposonesCuando un transposón se inserta en el interior de un gen, ese

gen sufre una mutación

Las mutaciones auxótrofas debida a inserción de tran sposones (R a ATM)son útiles en genética bacteriana

Permite determinar si un nutriente es indispensable

Conclusiones…

� La recombinación genética contribuye a la diversidad genética de la población Evolución

� La transferencia génica vertical: los genes pasan de un microorganismo a su descendencia

� Transferencia génica horizontal: los genes pasan a otros microorganismos de la misma generación (no descendiente)

� Mecanismos de transferencia de información genética• Transformación• Transducción• Conjugación

Muchas gracias …

bacteriana

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