Interacción Antígeno-Anticuerpo

Precipitación en medio líquido

Cátedra de Inmunología-UBAComisión 5

Son glicoproteínas

Constituídas por dos cadenas pesadas (H) y dos cadenas livianas (L)

Las cadenas pesadas y las livianas son idénticas entre sí

Existen puentes S-S que unen las cadenas livianas a las pesadas y otros que unen a las cadenas pesadas entre sí.

La cadena liviana tiene un dominio constante y uno variable.

Cada cadena pesada tiene 3 ó 4 dominios constantes y uno variable.

Anticuerpos: generalidades

Clasificación de las inmunoglobulinas basada en las diferencias que presentan en la secuencia de aminoácidos en las regiones constantes de las cadenas pesadas.

Clases o isotipos

Cadenas pesadas

(H)γ μ δ α ε

Cadenas livianas (L)

Cada una de ellas puede asociarse a cualquiera de las cadenas pesadas

SubclasesExiste una subdivisión de las clases basada en pequeñas diferencias de las secuencias de aminoácidos en las regiones constantes de las cadenas pesadas. Por ejemplo para IgG: IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 y para IgA: IgA1 e IgA2

IgG :Propiedades y funciones biológicas

* Principal Ig en suero y en líquidos extravasculares* Transferencia placentaria* Activación del complemento por vía clásica (excepto IgG4)* Unión a receptores de Fc (IgG1 e IgG3)

* Fagocitos - opsonización* ADCC

IgG1, IgG2 e IgG4

IgG3

IgM: Propiedades y funciones biológicas

* Pentámero (en suero)* Dominio Extra (CH4)*Cadena J* Primera Ig sintetizada por el LB * Activa el complemento (vía clásica)* Ig de superficie de LB

Cadena J

bacteria

fagocito

Fc γ Receptor

IgA: Propiedades y funciones biológicas

◦ En suero está como monómero◦ En secreciones (sIgA) está como dímero ◦ Principal Ig secretoria (Inmunidad de mucosas)

Lágrimas, saliva, secreciones pulmonares y gástricas, leche y calostro◦ No activan complemento ◦ Se unen a receptores de Fc en algunas células◦ La IgA tiene un importante rol en la protección contra virus y bacterias ya que

impide su ingreso por formación de complejos inmunes de gran tamaño y bloqueo de los receptores (neutralización) .

cadenaJComponente secretorio

• IgE: Propiedades y funciones biológicas

– Ig sérica menos abundante– Se une a mastocitos y basófilos – Mediadora de Reacciones Alérgicas– Se encuentra elevada en infecciones parasitarias (Helmintos)– Se une a receptores de Fc en eosinófilos– No fija complemento

• IgD: Propiedades y funciones biológicas

Tail Piece

—Ig de superficie—No une complemento

Son variaciones interespecie (propias de cada especie) entre las clases y subclases de inmunoglobulinas originadas por diferencias en las regiones constantes de las cadenas pesadas.

Son variaciones intraespecie (propias de cada individuo) entre inmunoglobulinas de una misma clase y subclase de individuos diferentes de una misma especie.

Son diferencias que se encuentran en la región variable de los distintos Ac de un mismo individuo asociadas a las regiones hipervariables.

Variantes Isotípicas(isotipo)

Variantes Alotípicas(alotipo)

Variantes Idiotípicas(idiotipo)

•Cambio en la clase de Ig mayoritaria específica (switch de isotipo)

– Rta1o La IgM específica es la mayoritaria

– Rta2o – La mayoritaria es la IgG específica.

1o Inoculación

del Ag

2o Inoculación

del Ag

Ac totales

IgM específica

IgG específica

Dias post inmunización

T

ítu

lo d

e A

c

Cinética de la producción de AcAgs T-dependientes. Respuesta primaria y

secundaria

Respuesta primaria Respuesta secundaria

•Incremento en el título de Ac específicos en la repuesta 2° respecto de la 1°•Incremento en la afinidad de los Ac específicos

•La respuesta observada es más rápida en la respuesta 2° que en la 1°

Cinética de la producción de AcAgs T-independientes

1o Inoculación con el Ag

Dias post inmunización

Tít

ulo

de

Ac

IgM Ab•No hay variación de la clase de Ig: IgM

•No hay maduración de la afinidad

2o Inoculación

del Ag

Interacción Ag-Ac

La unión del epitope con el paratope es de tipo reversible y muy fuerte. Se lleva a cabo mediante:•fuerzas de Van der Waals,

•puentes de hidrógeno,

• fuerzas electrostáticas,

• fuerzas de repulsión hidrofóbica

El medio de reacción debe tener determinadas características necesarias para que ocurra la interacción Ag-Ac:

•Fuerza iónica cercana a la fisiológica ( 0.15 M)

•pH cercano a 7.4

•Tº cercana a 37ºC

Interacción Primaria

Interacción secundaria

Ocurre entre el paratope del Ac. y el epitope del Ag.

Es un fenómeno no visible a simple vista

Es un fenómeno macroscópico, visible a simple vista

Implica la formación de una red de varias moléculas de Ac interaccionando con varias moléculas de Ag cada una con varios epitopes reconocibles por esos Ac.

Interacción Ag-Ac

Interacción primaria

Ag + Ac AgAc

Afinidad: sumatoria de fuerzas de atracción y repulsión que operan entre un epitope y un paratope.

K= [Ag-Ac] [Ag] [Ac]

= K0=KAFINIDAD

Avidez: sumatoria de fuerzas de atracción y repulsión que operan en la interacción entre un antígeno y su anticuerpo. Depende de la afinidad y de la valencia del Ac

Si definimos como condición de equilibrio aquella donde el 50% de los sitios de combinación del Ac están ocupados por un Ag monovalente

Reacción cruzada

• Dos Ags diferentes que comparten epitopes en

común

Ag BAg A

Especificidad: capacidad de un Ac de reconocer a un antígeno dado dentro de un sistema complejo

Ag AAg C

• El Ag A y C poseen dos epitopes parecidos entre sí, aunque no iguales, que son reconocidos por algunos de los anticuerpos del suero anti A

Puede ocurrir entre:

Suero monoespecífico para un Ag: es aquel suero que en un sistema dado reconoce sólo a uno de los Ag de la mezcla. Es decir la monoespecificidad de un suero es dependiente del sistema considerado.

Suero monoespecífico para C

En este caso el suero no es monoespecífico para C

A

B

C

D

E

C

La respuesta inmune es policlonal

Proliferan distintos clones de LB que reconocen al Ag

Inmunógeno con epitopes distintos

Suero policlonal

En un suero policlonal hay distintas Ig, provenientes de diferentes clones, que reconocen distintos epitopes del inmunógeno o el mismo epitope pero con distintas afinidades

Tanto el Ac naranja como el azul (con distinta secuencia aminoacídica en las regiones variables) reconocen al epitope naranja aunque con distinta afinidad

Ac monoclonales: son Ig quimicamente homogéneas (idénticas secuencias aminoacídicas ) y que por lo tanto reconocen todas a un mismo epitope y con la misma afinidad. Es el resultado de una producción in vitro; en la naturaleza sólo aparecen Ig monoclonales como resultado de ciertas patologías.

Suero policlonal: es aquel constituído por una población heterogénea de Ig que reconocen a distintos epitopes del inmunógeno que les dio origen, o a un mismo epitope pero con distinta afinidad. Es el resultado de la respuesta inmune normal.

Ac

monoclonales

Suero monoespecífico

Ac monoclonales

Interacción Primaria

Interacción secundaria

Ocurre entre el paratope del Ac. y el epitope del Ag.

Es un fenómeno no visible a simple vista

Es un fenómeno macroscópico, visible a simple vista

Implica la formación de una red de varias moléculas de Ac interaccionando con varias moléculas de Ag cada una con varios epitopes reconocibles por esos Ac.

Interacción Ag-Ac

Interacción secundaria

Reacciones de Aglutinación

•*Cualitativas: -Ring test

-inhibición de la precipitación por Hp

•Cuantitativas: -Curva de precipitación

- Inhibición de la precipitación

Reacciones de Precipitación

Precipitación en medio líquido

Para que ocurra deben verificarse una serie de condiciones:• Ag al menos bivalente• Ac al menos bivalente• Concentración del Ag y del Ac en el orden de mg/ml• Fuerza iónica cercana a la fisiólogica• t° cercana a 37°C• pH cercano a 7.4• Tiempo

La precipitación es un fenómeno que ocurre como consecuencia de la interacción secundaria entre un Ag soluble (proteínas, polisacáridos, lipopolisacáridos) y sus Ac específicos.

Complejos solubles

Precipitado

El Ag debe comportarse como bivalente o polivalente frente al suero inmune utilizado para que así se forme la red que permite la precipitación. En otras palabras cada molécula antigénica debe tener al menos dos epitopes que puedan ser reconocidos por los distintos Ac del suero.

Hapteno (Hp):Sustancia que es incapaz de desencadenar una respuesta inmune por si misma, pero contra la cual pueden generarse Ac específicos si se inocula acoplada quimicamente a una proteína carrier.

OH

NO2

NO2

2,4 dinitrofenol

NO2

NO2

Proteína carrier

NO

2

NO

2

Hapteno

¿Qué valencia tienen los haptenos (Hp)?

Son monovalentes

Por sí solos no dan reacciones de interacción secundaria

Digestión pépsica y papaínica

Ring testPrueba cualitativa

Poco sensible

Útil para determinar en un suero la presencia de Ac específicos contra un Ag soluble, en forma rápida y sencilla

Solución del Ag

Suero

Curva de precipitación

• Prueba cuantitativa (mg/ml)• Tiene por objeto determinar la concentración de Ac específicos para un Ag

en especial.

-volumen constante de suero-concentraciones crecientes de Ag-buffer para llevar a volumen

Curva de precipitación en medio líquidoTécnica

-volumen constante de suero-concentraciones crecientes de Ag-buffer para llevar a volumen

Centrifugación

Disolución del precipitado

Medición espectrofotométrica

Incubación

DO

280 de

l pre

cipi

tado

redi

suel

to

mg de Ag agregado

Se extrae el sobrenadante

* si el Ag es proteico la absorbancia a 280 nm será debida al Ac y al Ag

Abs 280nm = Abs Ag + Abs Acdel tubo con más precipitado(zona de equivalencia)

Cuantificación de los Ac específicos

Controles1) Tubo con suero no inmune y el Ag2) Tubo con suero testigo anti-Ag y el Ag3) Tubo con el suero a evaluar pero sin antígeno

Pero la Abs a 280nm debida al Ag es conocida ya que se conoce la concentración de Ag que hay en cada tubo.

* si el Ag es un polisacárido la Abs a 280nm será solo a causa del Ac

-Abs 280 nm del tubo con

más precipitado(zona de

equivalencia)

=aAc.b.cAc

Inhibición de la precipitación por haptenos

Objetivo: Poner de manifiesto la interacción Ac-Hp

La inhibición de la precipitación por Hp también puede utilizarse para comparar las capacidades de inhibición de distintos Hp de estructuras relacionadas.

50

% de inhibición

µg de HpX1 x2 x3

Hp A

Hp B

Hp C

Los Ac que constituyen el suero en estudio presentan en promedio mayor afinidad por el HpA que por HpB o el HpC