interacción de la inmunoglobulinas g de pacientes con esclerosis … · 2018-07-13 · nuestros...

Di r ecci ó n:Di r ecci ó n: Biblioteca Central Dr. Luis F. Leloir, Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, Universidad de Buenos Aires. Intendente Güiraldes 2160 - C1428EGA - Tel. (++54 +11) 4789-9293

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Tesis Doctoral

Interacción de la inmunoglobulinas G deInteracción de la inmunoglobulinas G depacientes con Esclerosis Lateral Amiotróficapacientes con Esclerosis Lateral Amiotrófica

con la placa neuromuscular y su relacióncon la placa neuromuscular y su relacióncon los canales de calcio de tipo P/Qcon los canales de calcio de tipo P/Q

González, Laura Elisabeth

2012-03-27

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Cita tipo APA:

González, Laura Elisabeth. (2012-03-27). Interacción de la inmunoglobulinas G de pacientes conEsclerosis Lateral Amiotrófica con la placa neuromuscular y su relación con los canales decalcio de tipo P/Q. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires.

Cita tipo Chicago:

González, Laura Elisabeth. "Interacción de la inmunoglobulinas G de pacientes con EsclerosisLateral Amiotrófica con la placa neuromuscular y su relación con los canales de calcio de tipoP/Q". Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires. 2012-03-27.

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mailto:[email protected]

Universidad de Buenos Aires

Facultad de Ciencias Exactas y Naturales

Departamento de Fisiología y Biología Molecular

Interacción de las Inmunoglobulinas G de

pacientes con Esclerosis Lateral Amiotrófica con

la placa neuromuscular y su relación con los

canales de calcio de t ipo P/Q

Tesis presentada para optar al t ítulo de Doctor de la Universidad de

Buenos Aires en el área Ciencias Biológicas

Lic. Laura Elisabeth González

Director de Tesis: Dr. Osvaldo Daniel Uchitel.

Director Asistente: Dra. Mónica Lidia Kot ler.

Consejero de Estudios: Dr. Dante Agust ín Paz.

Lugar de t rabajo: Instituto de Fisiología, Biología Molecular y Neurociencia,

CONICET - UBA.

Buenos Aires, Marzo 2012.

I nteracción de las I nm unoglobulinas G de pacientes con Esclerosis Latera l

Am iot róf ica con la placa neurom uscula r y su re lación con los cana les de

ca lcio de t ipo P/ Q

La Esclerosis Lateral Am iot rófica (ELA) es una enfermedad neurodegenerat iva de

motoneuronas. Se encuent ra mayormente asociada a una forma esporádica de

et iología desconocida. Num erosas evidencias favorecen a la auto- inm unidad com o

uno de los potenciales cont r ibuyentes a esta patología.

Para estudiar los posibles ant ígenos que interactúan con las I gGs de

pacientes con ELA esporádica ( I gGs-ELA) , evaluam os su inmuno- react ividad hacia

la placa neuromuscular (PNM), comparando animales normales con aquellos

carentes de la subunidad formadora del poro del canal de calcio (Ca2+ ) de t ipo P/ Q

(CaV2.1) . Las I gGs-ELA m ost raron una importante react ividad hacia la PNM de

ratones CaV2.1+ / + e incrementaron la frecuencia de potenciales de placa m iniatura

(MEPPs) . Ambos parám etros dism inuyeron significat ivamente al evaluar tej ido de

anim ales CaV2.1 - / -. Ensayos de inm uno-precipitación y western blot indican que el

blanco de los ant icuerpos no sería el canal m ism o sino una proteína asociada.

Estudios de proteóm ica sugieren a la proteína BASP-1 (proteína ácida soluble de

cerebro-1) com o un candidato a evaluar en form a más detallada en fututos

ensayos.

Nuest ros resultados adicionan evidencias a favor de la auto- inmunidad como

uno de los posibles m ecanismos cont r ibuyentes a la patología de ELA. También

sugieren que los auto-ant icuerpos en el suero de una serie de pacientes interactúan

con proteínas cuya presencia en la PNM dism inuye cuando los canales de Ca2+ de

t ipo P/ Q se encuent ran ausentes.

Palabras clave: Esclerosis Lateral Am iot rófica, canales de calcio, auto-ant icuerpos,

placa neurom uscular, auto- inm unidad.

I nteract ion of I m m unoglobulins G fr om Am yot rophic Latera l Sclerosis

pat ients w ith the neurom uscular junct ion and it s re la t ionship w ith the

P/ Q- type ca lcium channels

Am yot rophic Lateral Sclerosis (ALS) is a m otoneuron neurodegenerat ive disease. I t

is pr imarily associated with a sporadic form of unknown et iology. Several pieces of

evidence favor auto- immunity as a potent ial cont r ibutor to this pathology.

To gain understanding concerning possible ant igens interact ing with I gGs

from sporadic ALS pat ients (ALS- I gGs) , we studied immuno- react ivity against the

neurom uscular junct ion (NMJ) of m ice with and without the pore- form ing subunit of

the P/ Q- type calcium (Ca2+ ) channel (CaV2.1) . ALS- I gGs showed a st rong react ivity

against NMJs of WT diaphragm s and increased the m iniature end-plate potent ial

(MEPP) frequency. Both parameters were significant ly dim inished when evaluat ing

t issue from CaV2.1 - / - animals. I mmuno-precipitat ion and western blot assays

indicate that ant ibody target would not be the channel it self but an associated

protein. Proteom ic studies suggest BASP-1 (brain acid soluble protein-1) as a

candidate to evaluate in m ore detail in future assays.

Our findings add further evidence support ing autoim m unity as one of the

possible m echanism s cont r ibut ing to ALS pathology. They also suggest that serum

auto-ant ibodies in a subset of ALS pat ients would interact with NMJ proteins down-

regulated when P/ Q- type Ca2+ channels are absent .

Keywords: Amyot rophic Lateral Sclerosis, calcium channels, auto-ant ibodies,

neurom uscular junct ion, autoim m unity.

T Å|á ÑtwÜxá

“Hay una fuerza motriz más poderosa que

el vapor, la electricidad y la energía atómica:

la voluntad”

Albert Einstein

“Pero, a pesar de todo, no cambiaría mi suerte por la de ningún médico

porteño. La gran ciudad no puede brindar la serenidad, la paz, el contento

que ofrece la cordillera. ¿Puede esta pálida mole de piedras ofrecerme algo

comparable a mis montañas, a mis picos coronados de nieves eternas, a mis

arroyos caudalosos, a mis pobres araucanos?”

Dr. Rodolfo Kössler

Agradecimientos

A m is padres y a m i herm ano, por haberm e enseñado que vale la pena

esforzarse y sacrificarse por lo que uno cree, por haberm e inculcado valores

tan im portantes com o la honest idad, la sinceridad y el respecto. Gracias Pa

por haber sido un Gran Hom bre que siem pre procuró por su fam ilia y sus

am igos. A pesar de tu ausencia m e reconforta saber que, de estar con

nosot ros ahora, te sent ir ías m uy orgulloso de tus hij os. Siem pre serás la luz

que ilum ina m i cam ino.

A m i Director, Osvaldo Uchitel, por haberm e recibido en su laborator io y

haberm e perm it ido llevar adelante esta tesis bajo su constante supervisión,

guía y apoyo.

A m i co-Directora, Mónica Kot ler, por seguir colaborando con m i desarrollo

profesional y hum ano; y por haber realizado un constante aporte de

conocim ientos y experiencia para concretar este t rabajo de tesis.

A Francisco Urbano, por su gran calidez hum ana y por haber sido una

fuente inagotable de conocim ientos, sent ido del humor, apoyo m oral y

consejos.

A Euge y Hernán Mart ín, Cari Weissm ann, Mariano Di Guilm i y Pauli Felm an,

por su invaluable am istad, que estoy segura va a durar toda la vida, y por

las incontables tardes de m ates y bizcochitos.

A m is am igos del alm a, por estar siem pre para com part ir m om entos buenos

y no tan buenos: Pau, Shir, Mart i, Maru, Vivi, Ro, Mart ín, Mariana, Lu, Vero,

Gus.

A la gente linda del labo con la cual tuve el pr ivilegio de com part ir estos

años, por haber hecho que fuera un placer para m í ir a t rabajar todos los

días: Cari, Euge, Lucas, FU, Marian, Pau, Hernán, Vero, Joaco, Bel, Car lota,

Mauricio, Ayelén, Nat i, Fernando, Augusto, Noelia, Dani, Roberto, Ram ona.

A Terry Snutch y su grupo (Esperanza, Kirk, Stuart , Karen, John, Lawrence,

Cynthia) , no solo por haberm e ayudado enorm em ente con algunos

resultados de esta tesis, sino por haber hecho m i estadía en Vancouver una

experiencia tan enriquecedora com o m em orable.

A las personas que han pasado por el labo y con las cuales tuve la suerte de

com part ir m uy agradables m om entos: Paula, Elisa, Andrés, Barbi, Yani,

I tat í, Eugecita, Karen, Antonella.

Al Dr. Reisin y su grupo de colaboradores en el Hospital Británico, por

haberm e provisto de las m uest ras de suero, pero m ás im portante, por la

incansable lucha que em prenden todos los días cont ra una enferm edad tan

devastadora y cruel com o es la Esclerosis Lateral Am iot rófica.

Al grupo de la Unidad de Proteóm ica y Bioquím ica Analít ica del I nst ituto

Pasteur de Montevideo (Carlos Cerveñansky, Rosario Durán y Analía Lim a) ,

por haberm e perm it ido realizar los experim entos de espect rom et ría de

m asa gracias a su colaboración.

A Rafa Pagani y Elisa Filevich, por haberm e ayudado enorm em ente con el

com ienzo de m is experim entos.

A todas las personas que desinteresadam ente colaboraron para poder llevar

adelante este t rabajo, ya sea con sus conocim ientos o con préstam o de

react ivos o equipos.

A Viviana Sánchez por haberm e ayudado con la purificación de

sinaptosom as.

Al CONI CET y a la ANPCyT, por haber aportado el financiam iento que m e

perm it ió desarrollar m is tareas de invest igación.

A la I BRO, SfN y EMBO, por haberm e posibilitado part icipar de cursos y

congresos que no solo representaron un crecim iento profesional sino

tam bién personal, donde pude conocer gente increíble y lugares

ext raordinarios.

A m i abuela Om a, por haber sido una inspiración en vida y seguir guiando

m i cam ino desde donde sea que esté. Gracias por haberm e t ransm it ido tu

am or por los libros y haberm e convert ido en una rat ita de biblioteca.

A m is dos solcitos, Pepa y Chiki, por alegrar cada día de m i existencia y

hacerm e recordar qué cosas son realm ente im portantes en la vida (esas

cosas que solem os olvidar con tanta frecuencia…).

A todos aquellos seres que m e inspiran día a día a ser una m ejor persona, y

m e ayudan a valorar las cosas sim ples y herm osas que nos ofrece la vida.

Índice

1 - Abrevia turas ….……………..…………………………………...……………………... 2

2 - I nt roducción ….…………………………………………………..…………………….

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2.1 - Esclerosis Lateral Amiotrófica ……………………………………………………... 5

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2.1.1 - Características clínicas y diagnóstico ………….……………………...

2.1.2 - Etiología …………………………………………………………………..

2.1.3 - Tratamiento ……………………………………………………………….

2.1.4 - Mecanismos auto-inmunes ………………….……….……………..…..

2.2 - Sistema motor ………………………………………………………………………..

2.2.1 - Médula espinal …………………………………………………………..

2.2.2 - Corteza cerebral …………………………………………………………

2.2.3 - Cerebelo y ganglios basales.…………………………………………...

2.3 - Unión neuromuscular.........................................................................................

2.3.1 - Estructura de la unión neuromuscular…………………………………

2.3.2 - Transmisión sináptica neuromuscular…………………………………

2.3.3 - Liberación espontánea de neurotransmisor…………………………..

2.4 - Canales de Ca2+ dependientes de voltaje …..…..….…………………………….

3 - Objet ivos …..……………………………………………………………………………...

30

4 - Mater ia les y Métodos ….…………………………………………………...…….

32

4.1 - Materiales …………………………………………………………………………..... 32

32 4.1.1 - Reactivos………………………………………………………………….

4.1.2 - Líneas de ratones………………………………………………………..

4.1.3 - Muestras de suero humano ….………………………………………...

4.2 - Métodos……………………………………………………………………………….

4.2.1 - Manejo de animales………………………………………….…………..

4.2.2 - Genotipado de ratones ……….…………………………………………

4.2.3 - Purificación de Inmunoglobulinas G……………………………………

4.2.4 - Ensayo de ELISA …..……………….……………………….…………..

4.2.5 - Registros intracelulares.……………………………….………………..

4.2.6 - Inmuno-fluorescencia de PNM…...........……...…………………….....

4.2.7 - Inmuno-fluorescencia de médula espinal, corteza cerebral y

cerebelo …………………………………………………………………………..

4.2.8 - Análisis de inmuno-fluorescencia y procesado de imágenes.………

4.2.9 - Preparación de sinaptosomas…………………………………………..

4.2.10 - Obtención de extractos totales de cerebelo y músculo..….………..

4.2.11 - Purificación de rafts….…………………………………………………

4.2.12 - Cultivo de células y transfección/inducción ….……….……………..

4.2.13 - Determinación de la concentración de proteínas……………………

4.2.14 - Ensayo de inmuno-precipitación ……….………………..…………..

4.2.15 - Electroforesis en gel de una dimensión y western blot …...….……

4.2.16 - Electroforesis en gel de dos dimensiones….………………………..

4.2.17 - Espectrometría de masa e identificación por mapeo peptídico…...

4.2.18 - Análisis estadístico ……………….……………………………………

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52 5 - Resultados .………………………………………………………………………………

5.1 - Los anticuerpos de ELA aumentan la actividad sináptica espontánea e

interactúan con la PNM de ratón …………………..…………….………………………

52

5.2 - Reactividad de las IgGs-ELA contra la PNM de los ratones CaV2.1-/- y

CaV2.2-/-......................................................................................................................

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75

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5.3 - Funcionalidad de las IgGs-ELA en la actividad espontánea de la PNM de los

ratones CaV2.1-/-……………………………………………………..……………………..

5.4 - Estudio de la inmuno-marcación de las IgGs-ELA en cerebelo, corteza

cerebral y médula espinal.………………………………………………………………...

5.5 - Correlación entre la modulación sináptica y la inmuno-reactividad tisular..…...

5.6 - Efecto de la deleción de CaV2.1 sobre la reactividad de las IgGs-ELA hacia el

sistema nervioso central……………………………………..……………………………

5.7 - Análisis de la interacción de las IgGs-ELA con la subunidad α1 del canal de

Ca2+ de tipo P/Q y otras proteínas presinápticas .………......…………..…..………...

5.8 - Análisis comparativo de la interacción de las IgGs-ELA con las proteínas

sinápticas de los ratones CaV2.1+/+ y CaV2.1-/-……………….…………………………

5.9 - Proteómica comparativa de las proteínas sinápticas de los ratones CaV2.1+/+

y CaV2.1-/-………………………………..………………………………………………….

5.10 - Interacción de las IgGs-ELA con la proteína BASP-1…….……….…………...

6 - Discusión .……………………………………………………………………….………..

6.1 - Placa neuromuscular………………………………...………………………………

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6.2 - Sistema nervioso central……………………………………..……………………..

6.2.1 - Médula espinal..…………………………………………………………….

6.2.2 - Cerebelo……………………………………………………………………..

6.2.3 - Corteza cerebral…………………………………………………………….

6.2.4 - Astrocitos…………………………………………………………………….

6.3 - Canales de Ca2+ de tipo P/Q y N………………………………...………..……….

6.4 - Otras proteínas presinápticas………………………….…………………………...

6.5 - Proteómica comparativa de la sinapsis CaV2.1+/+ y CaV2.1-/-…………………...

6.5.1 - Metabolismo energético........................................................................

6.5.2 - Citoesqueleto........................................................................................

6.5.3 - Señalización de Ca2+............................................................................

6.5.4 - Exocitosis..............................................................................................

6.5.5 - BASP-1.................................................................................................

6.6 - Perspectivas futuras…………………………………………………………………

6.7 - Conclusiones generales……………………………………………………………..

7 - Referencias Bibliográficas ........................................................................

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AAbbrreevviiaattuurraass

1 - Abreviaturas

2D-DI GE Two-dim ensional difference gel elect rophoresis (elect roforesis bidim ensional diferencial en gel)

ADN Ácido desoxi- r ibonucleico ALS Am yot rophic Lateral Sclerosis (Esclerosis Lateral

Am iot rófica) ARN Ácido r ibonucleico ATP Adenosina t r ifosfato BASP Brain acid soluble protein (proteína ácida soluble de

cerebro) BSA Bovine seroalbum in ( seroalbúm ina bovina) Ca2+ Calcio CAP Cytoskeleton-associated protein (proteína asociada al

citoesqueleto) CCDV Canal de Ca2+ dependiente de voltaje CE Cont rol enferm o CS Cont rol sano DMEM Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (m edio m odificado

Dulbecco’s Eagle’s) DTT Dit iot reitol EDTA Ethylenediam inetet raacet ic acid (ácido et ilendiam intet ra-

acét ico) ELA Esclerosis Lateral Am iot rófica FI TC Fluorescein isothiocyanate ( isot iocianato de fluoresceína) GFAP Glial fibr illary acidic protein (proteína glial fibr ilar acídica) HRP Horseradish peroxidase (peroxidasa de rábano) I gG I nm unoglobulina G/ I m m unoglobulin G I gGs-ELA I gGs de pacientes con ELA esporádica I TRAQ I sobaric pept ide tags for relat ive and absolute

quant ificat ion (m arcaje isobárico para cuant ificación relat iva y absoluta)

2

1 - Abreviaturas

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MALDI Matrix-assisted laser desorpt ion ionizat ion ( ionización por

desorción laser asist ida por m at r iz) MARCKS Myristoylated alanine- r ich C-kinase subst rate ( sust rato de

quinasa C r ico en alanina, m ir istoilado) MEPP Miniature end-plate potent ials (potenciales de placa

m iniatura) MS Mass spect rom et ry (espect rom etría de m asa) NAP Neuronal axonal m em brane protein (proteína neuronal

axonal de m em brana) NeuN Neuronal nuclei (ant ígeno neuronal nuclear) NMDA N-m et il-D-aspartato NMJ Neurom uscular junct ion (placa neurom uscular) OPD O-phenylenediam ine (o- fenilendiam ina) P Edad post -natal de anim ales (en días) p Probabilidad estadíst ica PBS Phosphate-buffered saline (buffer fosfato salino) PNM Placa neurom uscular RI PA Radio- im m uno-precipitat ion assay (ensayo de radio-

inm uno-precipitación) RN Ringer’s norm al solut ion ( solución normal de Ringer) SFB Suero fetal bovino SNARE Soluble N-ethylm aleim ide sensit ive factor at tachm ent

protein receptor ( receptor del factor de la proteína de fusión sensible a N-et ilm aleim ida soluble)

TME Tris-MgCl2-EGTA TMR Tet ram et ilrodam ina TOF Tim e of flight ( t iem po de vuelo) WT Wild- type ( salvaje)

IInnttrroodduucccciióónn

2 - Introducción

2 .1 - Esclerosis Latera l Am iot róf ica

La Esclerosis Lateral Am iot rófica (ELA) es una de las enferm edades de

m otoneurona m ás com unes en la edad adulta y desafortunadam ente, una

de las m ás devastadoras.

2.1.1 - Característ icas clínicas y diagnóst ico

La prim era descripción de ELA com o un síndrom e de pérdida m uscular

progresiva fue realizada por Charcot en 1874 (Rowland 2001) m ediante el

análisis de las característ icas clínicas y patológicas de la enferm edad. De

esta cont r ibución se desprende que uno de los rasgos m ás destacados de

ELA -y que en parte da or igen a su nom bre- es la degeneración del t racto

cort icoespinal com o resultado de la m uerte neuronal. Ot ra part icular idad de

esta enferm edad es que afecta m ayorm ente al subt ipo neuronal

responsable de llevar a cabo los m ovim ientos, las motoneuronas o neuronas

m otoras.

En térm inos generales, la m anifestación clínica de ELA se produce a

m ediados de la vida adulta, alrededor de los 45-60 años de edad. La

sintom atología incluye una serie de m anifestaciones que se presentan en

diferentes regiones del cuerpo según el sit io de iniciación de la

neurodegeneración, el grado de com prom iso del eje neural y el estadío de

la enferm edad. Al m om ento de realizar el diagnóst ico, el paciente debe

presentar síntom as que evidencien tanto com prom iso de las m otoneuronas

superiores (espast icidad, hiper- reflexia) com o de las infer iores

( fasciculaciones, hipotonía, debilidad y at rofia m uscular; Rowland 1998) . La

latencia ent re el inicio de los síntom as y el diagnóst ico se debe en gran

5

2 - Introducción

m edida al aum ento en la certeza de este últ im o al com probar el avance de

la enferm edad hacia regiones m ás distales.

Uno de los cr iter ios m ás am pliam ente ut ilizados para el diagnóst ico

de ELA es el establecido por la Federación Mundial de Neurología, conocido

com o el cr iter io de El Escorial (Brooks 1994) . En base a este cr iter io los

pacientes son diagnost icados y clasificados en diferentes categorías de

acuerdo a niveles crecientes de certeza (ELA sospechada, posible, probable

y definida) . En esta guía el diagnóst ico de ELA se define a part ir de signos

de com prom iso de m otoneuronas infer iores (por m edio de exám enes

clínicos y evaluaciones elect rofisiológicas o neuropatológicas) asociados a

evidencias clínicas de daño a m otoneuronas superiores. Tam bién resulta

necesario descartar (por análisis elect rofisiológicos, bioquím icos y

patológicos) la posibilidad de ocurrencia de ot ras enferm edades

neurológicas que puedan explicar la degeneración de las neuronas m otoras,

com o la at rofia m uscular progresiva, la neuropat ía m otora m ult ifocal o la

am iot rofía post -polio.

La patología presenta un desarrollo progresivo pero relat ivam ente

rápido y culm ina con la parálisis m uscular debida a la degeneración

m otoneuronal. En los Estados Unidos, su incidencia en la población es de

alrededor de 2 casos por cada 100.000 personas por año, y dada su alta

letalidad, su prevalencia es de 4-6 casos por cada 100.000 habitantes

(Mitchell y Borasio 2007) . Sin em bargo, estas cifras claram ente subest im an

el im pacto que puede llegar a tener la enferm edad, ya que se ha calculado

que el r iesgo de padecer ELA es de aproxim adam ente 1 en 400 (Johnson et

al. 2006) . En la m ayoría de los pacientes, el com prom iso de los m úsculos

respirator ios lleva al deceso del individuo afectado, con una supervivencia

6

2 - Introducción

m edia de ent re 2 y 5 años poster iores al diagnóst ico (William s y Windebank

1991) .

2.1.2 - Et iología

La sintom atología que se presenta en los pacientes con ELA se debe

principalm ente a la degeneración de las células de Betz residentes en la

corteza m otora pr im aria y las m otoneuronas infer iores del tallo cerebral y el

asta vent ral espinal (Bruijn et al. 2004) .

A nivel patológico, es frecuente observar en m uest ras de m édula

espinal provenientes de autopsias, la ocurrencia de at rofia m otoneuronal,

junto con un ensancham iento del pericarion y de los axones proxim ales.

Tam bién es posible detectar en el som a y axones de células en proceso de

degeneración la presencia de cuerpos de Bunina, esferoides y fibras de

m aterial ubiquit inado (Brown et al. 2000) .

Dado que la degeneración y m uerte de las m otoneuronas es tanto un

evento cent ral com o determ inante en cuanto al punto final de la

enferm edad, siem pre se ha hipotet izado que los m ecanism os responsables

de todo el proceso patológico de ELA deberían originarse en estas células.

Sin em bargo, estudios recientes han postulado que ot ros t ipos celulares,

adem ás de las m otoneuronas, podrían estar involucrados en el inicio de la

enferm edad (Di Giorgio et al. 2007; Nagai et al. 2007) . Dichos t rabajos

destacan el rol de las células gliales (y en part icular, de los ast rocitos) en el

proceso de degeneración m otoneuronal en ELA, sugir iendo una posible

cont r ibución de t ipos celulares no neuronales a la patología.

La m ayoría de los casos de ELA (90 % ) se presenta de una m anera

esporádica no asociada a una histor ia fam iliar de la enferm edad, y cuya

7

2 - Introducción

et iología perm anece hasta el m om ento desconocida. Sin em bargo, varios

m ecanism os han sido propuestos com o potenciales agentes cont r ibuyentes

a la patogénesis de ELA. Ent re ellos se puede m encionar el daño oxidat ivo

(Bowling et al. 1993; Niebroj -Dobosz et al. 2004) , la disfunción m itocondrial

(Menzies et al. 2002) , los m ecanism os auto- inm unes (Appel et al. 1993;

Pagani et al. 2006) , las anorm alidades en el citoesqueleto, el agregado de

neurofilam entos (Xu et al. 1993; Mendonca et al. 2005) , la alteración en el

t ransporte axonal y la excitotoxicidad por desregulación del t ransporte de

glutam ato (Rothstein et al. 1992; Bruijn et al. 2004; Van Den Bosch et al.

2006) . Es im portante destacar que los fenóm enos arr iba m encionados no

son m utuam ente excluyentes. De hecho, es cada vez más com ún la visión

de ELA no com o una patología de causa única, sino com o un síndrom e con

varios m ecanism os m oleculares potencialm ente cont r ibuyentes a la

neurodegeneración. Ot ro aspecto que podría aum entar esta com plej idad es

la existencia de factores de r iesgo am bientales y genét icos que se cree

juegan un papel im portante en la predisposición a la enferm edad (Sim pson

y Al-Chalabi 2006) .

El restante 10 % de los pacientes evidencia alguna form a fam iliar con

una clara herencia m endeliana que responde a m utaciones en una serie de

genes, siendo los m ás relevantes SOD1, FUS y TARDBP (Gros-Louis et al.

2006; Valdmanis et al. 2009) . Algunas de estas m utaciones se m anifiestan

fenot ípicam ente por un síndrom e que es clínicam ente indist inguible de la

form a esporádica de ELA, por lo que se cree que am bas variantes deben

com part ir hasta cierto punto m ecanism os patológicos.

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2 - Introducción

2.1.3 - Tratam iento

Si bien durante los últ im os años se han producido grandes avances sobre la

patofisiología de ELA -especialm ente en lo que respecta a las variantes

fam iliares- y se han ensayado num erosos protocolos clínicos en pacientes,

no existen actualm ente t ratam ientos efect ivos para detener o ret rasar

significat ivam ente la progresión de la enferm edad. La única droga aprobada

en los Estados Unidos para el t ratam iento de ELA es r iluzole, un inhibidor de

la liberación de glutam ato, cuyo efecto sobre el avance de la enferm edad es

tanto m odesto com o am pliam ente discut ido (Bensim on et al. 1994;

Lacom blez et al. 1996) .

2.1.4 - Mecanism os auto- inm unes

Existen num erosas evidencias que avalan la part icipación de los

m ecanism os auto- inm unes en la degeneración de las neuronas m otoras en

ELA. En prim era instancia, se han encont rado desórdenes auto- inm unes en

los pacientes con esta enferm edad (Appel et al. 1986) j unto con auto-

ant icuerpos sér icos cont ra gangliósidos (Pest ronk et al. 1989) ,

neurofilam entos (Courat ier et al. 1998) y los canales de Ca2+ dependientes

de voltaje (CCDVs; Sm ith et al. 1992) . Adicionalm ente, se han detectado en

m uest ras de los individuos afectados y en m odelos anim ales, infilt rados

espinales y cort icales de células inflam atorias (Appel et al. 1986; Engelhardt

y Appel 1990; Troost et al. 1990; Kawam ata et al. 1992; Engelhardt et al.

1993; Alexianu et al. 2001; McGeer y McGeer 2002) , así com o tam bién

depósitos de I gGs en el ret ículo endoplásm ico y en m icrotúbulos de

m otoneuronas (Engelhardt y Appel 1990; Engelhardt et al. 2005) . Sin

em bargo, la presencia y relevancia de tales auto-ant icuerpos ha sido y

9

2 - Introducción

sigue siendo m ot ivo de m ucha cont roversia (Drachm an y Kuncl 1989;

Drachm an et al. 1995; Arsac et al. 1996) .

Por ot ro lado, se sabe que la inoculación de cobayos con

hom ogenatos espinales de bovino lleva a la dest rucción de las

m otoneuronas superiores e infer iores (Engelhardt et al. 1990; Xu et al.

2009) , asem ejándose hasta cierto punto a la variante hum ana de ELA en lo

que respecta a la presencia de ant icuerpos en las motoneuronas y células

inflam atorias (Appel et al. 1991) . Tam bién se observó que la t ransferencia

pasiva de las I gGs provenientes de pacientes con ELA (Uchitel et al. 1992a)

o de anim ales previam ente inm unizados con las m otoneuronas bovinas

purificadas (Appel et al. 1991) , inducía una disfunción neurom uscular en

ratones inyectados. En este últ im o caso, los ant icuerpos hum anos pudieron

ser detectados en el som a de las neuronas m otoras y en los term inales

nerviosos (Fratantoni et al. 1996; Engelhardt et al. 2005) .

En lo que respecta a estudios in vit ro, se ha detectado la inducción de

apoptosis por parte de las I gGs-ELA en cult ivos de rodajas de m édula

espinal y en líneas celulares de m otoneuronas, presum iblem ente debido a

un increm ento en la concent ración int racelular de Ca2+ (Dem est re et al.

2005; Sm ith et al. 1994) . A nivel de la placa neurom uscular (PNM), se

observó que la pre- incubación de preparaciones de músculo con las I gGs-

ELA est im ulaba la act ividad sinápt ica espontánea y asincrónica (Uchitel et

al. 1988; Uchitel et al. 1992a; Pagani et al. 2006) , el influjo de Ca2+ (Mosier

et al. 1995) y la inducción de vías de señalización que llevaban a la

liberación de Ca2+ desde los depósitos int racelulares (Pagani et al. 2006) .

Este efecto m odulador sobre la liberación espontánea de acet ilcolina

10

2 - Introducción

tam bién ha sido detectado en ratones injectados int raper itonealm ente con

I gGs-ELA (Muchnik et al. 2002) .

2 .2 - Sistem a m otor

Los m ovim ientos, ya sean voluntarios o involuntarios, se producen por

pat rones espaciales y tem porales de cont racciones musculares orquestados

por el cerebro y la m édula espinal. Éstos involucran tanto los circuitos que

posibilitan los m ovim ientos reflejos elem entales com o aquellos que

organizan los pat rones int r icados de act ividad neural responsables de las

acciones m otoras voluntarias m ás com plicadas.

En últ im a instancia, todos los m ovim ientos producidos por la

m usculatura esquelét ica son inducidos por las m otoneuronas infer iores de la

m édula espinal y el tallo cerebral, que inervan directam ente dicha

m usculatura. Estas neuronas se encuent ran cont roladas en form a directa

por los circuitos locales dent ro de la m édula espinal y el tallo cerebral, que

coordinan los grupos individuales de m úsculos. Las neuronas m otoras

infer iores tam bién están sujetas a una regulación mayorm ente indirecta

llevada a cabo por las m otoneuronas superiores, que form an parte de los

circuitos cerebrales m ás altos responsables de la coordinación de secuencias

com plejas de m ovim iento (Grillner y Wallen 1985) . Ot ros circuitos de

regulación m otora especialm ente im portantes residen en los ganglios

basales y el cerebelo, los cuales m odulan a las m otoneuronas superiores y

así aseguran que los m ovim ientos se realicen con una im portante precisión

tem poral y espacial (DeLong y St r ick 1974) .

11

2 - Introducción

Los circuitos neurales responsables del cont rol del m ovim iento

pueden ser divididos en cuat ro sub-sistem as dist int ivos pero altam ente

interact ivos (Figura 2 .1 ) , cada uno de los cuales realiza una cont r ibución

part icular al cont rol m otor (Purves et al. 2004) .

2.2.1 - Médula espinal

El pr im ero de estos sub-sistem as está com puesto por el circuito local dent ro

de la m ateria gr is de la m édula espinal, junto con el circuito análogo

ubicado en el tallo cerebral.

La m édula espinal cont iene una región cent ral de sustancia gr is

form ada en su m ayoría por los cuerpos celulares de las neuronas que la

const ituyen, sum ada a una región perifér ica de sustancia blanca const ituida

por los axones. Los som as de las m otoneuronas residen en la parte vent ral

de la sustancia gr is, tam bién conocida com o asta vent ral (Figura 2 .2 ) .

Las células relevantes para el cont rol m otor son las m otoneuronas

infer iores ( las cuales envían sus axones desde el tallo cerebral y la m édula

espinal hacia m úsculos esquelét icos de la cabeza y el cuerpo,

respect ivam ente) y las neuronas del circuito local ( las cuales com prenden la

m ayor fuente de inputs sinápt icos para las m otoneuronas infer iores) .

Las neuronas m otoras que inervan los m úsculos individuales se

encuent ran agrupadas en núcleos m otores organizados en colum nas

longitudinales que abarcan varios segm entos espinales. Las m otoneuronas

que sinaptan con los m úsculos proxim ales se localizan m edialm ente en la

m édula espinal, m ient ras que las que inervan los m úsculos m ás distales se

ubican en las regiones progresivam ente m ás laterales.

12

2 - Introducción

13

Figura 2 .1 : Organización de las est ructuras neura le s involucradas en e l cont rol del m ovim iento. Los cuat ro sub-sistem as que se muest ran en el esquema (circuitos locales de la m édula espinal y el tallo cerebral, vías modulatorias descendientes, ganglios basales y cerebelo) realizan aportes esenciales y dist int ivos al cont rol de la act ividad motora. Reproducido de Purves et al. 2004.

Toda la inform ación para la generación del m ovim iento, ya sea reflejo

o voluntario, es en últ im a instancia t ransm it ida hacia el m úsculo a t ravés de

la act ividad de las neuronas m otoras infer iores. Por su parte, las neuronas

del circuito local reciben inputs sensoriales y proyecciones descendentes de

cent ros neurales de m ayor jerarquía. De esta m anera, el circuito por ellos

form ado provee la coordinación ent re diferentes grupos m usculares

necesaria para la generación de m ovim ientos organizados.

2 - Introducción

14

Figura 2 .2 : Est ructura interna de la m édula espina l . Sección t ransversa de la médula espinal de ratón (P56, t inción de Nissl) m ost rando las diferentes regiones que la componen como así también las motoneuronas infer iores (cabezas de flecha rojas) . I mágenes ext raídas de Allen Brain At las (www.brain-m ap.org) .

Desde el punto de vista m orfológico, m etabólico y molecular, las

m otoneuronas presentan una serie de característ icas que las diferencian del

m odelo clásico de neurona. En prim er lugar, las m otoneuronas son células

de gran tam año, con un diám et ro som át ico de ent re 50 y 60 μm , y procesos

axonales considerablem ente extensos, algunos de los cuales pueden llegar a

m edir hasta un m et ro en hum anos. Com o consecuencia de estas

part icular idades anatóm icas, se presum e que las m otoneuronas poseen una

elevada dem anda de energía acoplada a una alta tasa m etabólica, lo cual

requiere de una elevada act ividad m itocondrial para sat isfacer estos

requerim ientos (Shaw y Egget t 2000) .

Adem ás, debido a la extensa red axonal que las caracter iza, las

neuronas m otoras precisan de una est ructura citoesqueletar ia im portante,

2 - Introducción

hecho que se ve reflejado en su alto contenido de neurofilam entos

com parado con ot ros t ipos neuronales (William son et al. 1998) .

Ot ro aspecto im portante es la elevada expresión de una versión del

receptor de glutam ato altam ente perm eable a Ca2+ (Carr iedo et al. 1996) .

En consecuencia, las m otoneuronas resultan part icularm ente vulnerables a

la excitotoxicidad m ediada por glutam ato y su consecuente sobre-carga de

Ca2+ .

Por últ im o, las neuronas m otoras m uest ran t radicionalm ente una baja

expresión de proteínas buffer de Ca2+ presentes en el citoplasm a, com o

parvalbúm ina y calbindina (Alexianu et al. 1994) . Estas y ot ras

m acrom oléculas, junto con organelas com o el ret ículo endoplásm ico y la

m itocondria, form an parte del sistem a de regulación de Ca2+ que opera en

form a constante para m antener niveles int racelulares bajos de este ión. De

aquí se deduce que las m otoneuronas t ienen una capacidad de regulación

de Ca2+ m uy lim itada y son considerablem ente sensibles a cualquier proceso

que induzca una acum ulación excesiva de Ca2+ en la célula.

Se cree que todos estos factores cont r ibuyen a la alta y select iva

vulnerabilidad que presentan este t ipo de neuronas espinales a la injur ia

asociada a ELA, representando factores de r iesgo im portantes para los

procesos patológicos involucrados en esta enferm edad.

2.2.2 - Corteza cerebral

El segundo sub-sistem a m otor está const ituido por las neuronas m otoras

superiores que residen en el tallo y la corteza cerebral y cuyos axones

descienden para sinaptar sobre las neuronas del circuito local o, m ás

raram ente, sobre las m otoneuronas infer iores en form a directa.

15

2 - Introducción

La corteza es la parte m ás superficial del encéfalo y representa la

porción m ás grande de m ateria gr is del cerebro. Posee una organización

horizontal en capas ( lám inas) que cont ienen diferentes t ipos de neuronas.

El núm ero de capas y su organización difieren según la región del cerebro

que se t rate y de esta m anera dan lugar a la separación de la corteza en

áreas funcionales (Nolte 2001) . La m ayoría de estas regiones está

com puesta por hasta seis capas de células neuronales, part iendo de la m ás

superficial (capa I ) hacia la m ás interna (capa VI ) .

Las vías de las neuronas m otoras superiores que se or iginan en la

corteza cerebral son esenciales para la iniciación voluntar ia de los

m ovim ientos y para la coordinación de los pat rones com plejos en los

m ovim ientos avanzados. En part icular, las proyecciones descendentes de

las áreas cort icales del lóbulo frontal (corteza m otora pr im aria, corteza

prem otora lateral y m edial) son claves para la planificación, la iniciación y la

dirección de una secuencia de m ovim ientos voluntarios. Cada área proyecta

directam ente sobre la m édula espinal a t ravés del t racto cort icoespinal, e

indirectam ente por m edio de los sistem as m otores del tallo cerebral.

Las neuronas m otoras superiores ubicadas en el tallo cerebral son

responsables de la regulación del tono m uscular y de la or ientación de los

ojos, la cabeza y el cuerpo en base a la inform ación sensorial que reciben

(vest ibular, som át ica, audit iva y visual) . De esta m anera, su cont r ibución

resulta crít ica para los m ovim ientos básicos de m archa y para el cont rol de

la postura (Purves et al. 2004) .

La corteza de los hum anos y ot ros m am íferos se encuent ra

est ructurada en form a lam inar, con cada lám ina cort ical presentando una

serie de característ icas funcionales y anatóm icas dist int ivas. Las células

16

2 - Introducción

piram idales de la capa cort ical V de la corteza m otora pr im aria - tam bién

conocidas com o células de Betz- son las m otoneuronas superiores.

2.2.3 - Cerebelo y ganglios basales

Los restantes sub-sistem as involucrados en el cont rol m otor son circuitos

com plejos que no t ienen un acceso directo ni a las neuronas del circuito

local ni a las m otoneuronas infer iores. En su lugar, estas est ructuras

cont rolan el m ovim iento por regulación de la act ividad de las neuronas

m otoras superiores.

Antes de que una señal m otora descienda desde la corteza hacia el

tallo cerebral y la m édula espinal, varios cent ros cort icales y sub-cort icales

( incluyendo los ganglios basales y el cerebelo) han ejercido su influencia

sobre la corteza m otora para dar form a a esa señal descendiente final.

Tanto el cerebelo com o los ganglios basales llevan a cabo esta regulación a

t ravés del tálam o, afectando de esta m anera la act ividad de las vías

descendientes del t racto córt ico-bulbar y córt ico-espinal que se or iginan en

las áreas m otoras y pre-m otoras (Groenewegen 2003) .

El m ás grande de estos sub-sistem as es el cerebelo, el cual se

encuent ra ubicado sobre la cara dorsal de la protuberancia. El cerebelo

actúa a t ravés de vías eferentes hacia las m otoneuronas superiores

detectando la diferencia ent re las órdenes m otoras descendentes y la acción

m otora resultante, tam bién conocida com o “error m otor” . El cerebelo usa

esta inform ación sobre discrepancias para efectuar reducciones en t iem po

real y a largo plazo en estos errores m otores y de esta m anera m ejorar la

agudeza de los m ovim ientos.

17

2 - Introducción

El últ im o de los sub-sistem as m otores está com puesto por un grupo

de est ructuras, conocidas colect ivam ente com o ganglios basales, que se

encuent ran em bebidas en las zonas m ás profundas del cerebro anter ior.

Ent re estas regiones sub-cort icales se puede m encionar el est r iado, el globo

pálido, el núcleo sub- talám ico y la sustancia nigra. Los ganglios basales

suprim en los m ovim ientos no deseados y preparan a los circuitos de

m otoneuronas superiores para la iniciación de una acción m otora. Los

ganglios basales reciben inputs de todas las áreas cort icales y proyectan a

t ravés del tálam o a regiones de la corteza frontal relacionadas con la

planificación de los m ovim ientos (Purves et al. 2004) .

2 .3 - Unión neurom uscular

El axón de la neurona m otora se divide en la zona cercana al m úsculo y

em ite ent re 20 y 100 ram ificaciones, cada una de las cuales inerva una fibra

m uscular individual. El conjunto form ado por el term inal m otor y todas las

fibras m usculares por él contactadas se denom ina unidad m otora (Purves et

al. 2004) .

2.3.1 - Est ructura de la unión neurom uscular

La unión o PNM de vertebrados (Figura 2 .3 ) se encuent ra form ada por

regiones específicas de t res t ipos celulares dist int ivos: la neurona m otora

(com ponente pre-sinápt ico) , la fibra m uscular (com ponente post -sinápt ico)

y la célula de Schwann (Ogata 1988) . La principal característ ica de esta

est ructura es la alta especialización de las porciones sinápt icas de dichos

t ipos celulares, ya que cont ienen un gran núm ero de organelas y m oléculas,

18

2 - Introducción

19

Figura 2 .3 : Est ructura de la plac a neurom uscular de ver tebrados. En el esquema se muest ra un term inal motor inervando una fibra muscular. A la derecha se observa un term inal cortado en forma t ransversal. Cada placa neurom uscular consiste en el term inal nervioso presinápt ico desde donde se libera el neurot ransm isor (acet ilcolina) , la hendidura sinápt ica, el área post -sinápt ica en el músculo conteniendo el receptor de acet ilcolina y la envoltura de la célula de Schwann. I magen ext raída de Sanes y Lichtman 1999 y ht tp: / / www.biologycorner.com/ anatomy/ muscles/ notes_muscles.htm l.

que a su vez se encuent ran poco representadas en las regiones ext ra-

sinápt icas.

El term inal nervioso m otor se encuent ra especializado en el proceso

de liberación. El m ism o posee num erosas vesículas sinápt icas (de

aproxim adam ente 50 nm de diám et ro) conteniendo el neurot ransm isor,

acet ilcolina, junto con una alta densidad de m itocondrias, las cuales

proveen la energía necesaria para la síntesis y la liberación del

neurot ransm isor. El agrupam iento de las vesículas sinápt icas en la m itad del

term inal que está en contacto con la fibra m uscular refuerza la idea de

polar ización de esta est ructura. La m ayoría de las vesículas sinápt icas se

localizan en determ inadas regiones de la m em brana pre-sinápt ica conocidas

com o zonas act ivas, en las cuales las vesículas se fusionan con la

2 - Introducción

m em brana del term inal y liberan su contenido hacia la hendidura sinápt ica.

Por su parte, las porciones pre- term inales poseen un escaso núm ero de

vesículas y m itocondrias junto con una ausencia de zonas act ivas, pero se

encuent ran enriquecidas en m icrotúbulos y neurofilam entos (Yee et al.

1988) .

La m em brana post -sinápt ica se especializa en responder de una

m anera rápida y eficiente a la liberación del neurot ransm isor desde el

term inal nervioso. Por debajo del term inal sinápt ico la m em brana m uscular

posee ligeras depresiones e invaginaciones m ás m arcadas que com ponen

los pliegues post -sinápt icos, los cuales se ubican en form a directam ente

opuesta a las zonas act ivas y se adent ran en la fibra m uscular una distancia

de hasta 1 μm . En las crestas de dichos pliegues hay una alta concent ración

de receptores de acet ilcolina (m ás de 10.000 m oléculas/ μm 2) , la cual decae

en form a acentuada (a aproxim adam ente 10 m oléculas/ μm 2) en las

regiones ext ra-sinápt icas (Salpeter et al. 1988) . Desde su parte

citoplasm át ica el receptor de acet ilcolina se encuent ra asociado a un

com plejo aparato citoesqueletar io que genera y m ant iene dicha dist r ibución

diferencial.

La célula de Schwann que rodea al term inal m otor cum ple la función

de aislar lo del m edio ext racelular y proveer factores t róficos. Adem ás,

presenta característ icas m orfológicas y bioquím icas que la dist inguen del

ot ro t ipo de célula de Schwann reportado, el productor de la vaina de

m ielina que recubre el axón m otor desde el som a neuronal hasta la zona

pre- term inal (Mirsky y Jessen 1996) .

Ot ro com ponente im portante de la PNM es la denom inada lám ina

basal. Dicha est ructura se ext iende a lo largo del espacio ent re la fibra

20

2 - Introducción

m uscular y el term inal sinápt ico, y se proyecta hacia el inter ior de los

pliegues post -sinápt icos. De esta m anera, form a parte de una fracción

im portante de la hendidura sinápt ica presente en la PNM. Los com ponentes

m ayoritar ios de la lám ina basal del m úsculo son sim ilares a los encont rados

en la lám ina basal de ot ras zonas del cuerpo: colágeno I V, lam inina,

entact ina y proteoglicanos. Sin em bargo, las porciones sinápt icas y ext ra-

sinápt icas de la lám ina basal expresan isoform as part iculares. La lám ina

basal tam bién cont iene una isoform a de acet ilcolinesterasa ( la enzim a

responsable de la degradación del neurot ransm isor) anclada a colágeno,

glicoconjugados y proteínas de señalización com o agrina y neurregulina

(Sanes y Lichtm an 1999) .

Desde el punto de vista inm unológico, un aspecto im portante a tener

en cuenta es que la PNM es el único com ponente del sistem a m otor que se

encuent ra por fuera de la barrera hem ato-encefálica. De esta m anera, el

term inal m otor const ituye una est ructura part icularm ente vulnerable a la

acción del sistem a inm une y sus ant icuerpos, representando un blanco

tem prano en diversas enferm edades auto- inm unes (Lang y Vincent 2009) .

2.3.2 - Transm isión sinápt ica neurom uscular

La llegada del im pulso nervioso (potencial de acción) al term inal del axón

m otor genera un cam bio en el potencial de m em brana celular

(despolar ización) que induce la apertura de los CCDVs. La ent rada de Ca2+

al term inal a t ravés de estos canales inicia un proceso com plejo que culm ina

con la fusión de las vesículas sinápt icas a la m em brana celular y la poster ior

liberación de acet ilcolina hacia la hendidura sinápt ica (Purves et al. 2004) .

Este proceso se conoce con el nom bre de exocitosis.

21

2 - Introducción

Una vez liberado, el neurot ransm isor difunde a t ravés de la hendidura

sinápt ica e interactúa con el receptor de acet ilcolina en la m em brana post -

sinápt ica. Dicha interacción prom ueve el influjo de sodio a t ravés del

receptor y de esta m anera induce una despolar ización en la zona de la PNM

conocida com o potencial de placa evocado (Takeuchi y Takeuchi 1960) . Esta

despolar ización act iva a los canales de sodio dependientes de voltaje

presentes en la base de los pliegues post -sinápt icos de la fibra m uscular

(Flucher y Daniels 1989) e inicia una potencial de acción propagado que

culm ina en la cont racción del m úsculo (Aidley 1989) .

2.3.3 - Liberación espontánea de neurot ransm isor

En todas las sinapsis quím icas, la com unicación ent re células se encuent ra

m ediada por la liberación cont rolada de neurot ransm isor en respuesta a la

llegada de un potencial de acción. Sin em bargo, en ausencia de

est im ulación neuronal, la liberación de neurot ransm isor todavía puede

ocurr ir de m anera espontánea, com o fue dem ost rado por pr im era vez en

experim entos realizados en la PNM (Fat t y Katz 1952) .

Los potenciales de placa m iniatura (MEPPs) o “m inis” que se regist ran

en ausencia de im pulsos nerviosos, representan la fusión de una única

vesícula sinápt ica con el term inal presinápt ico, liberando de esta m anera

una cant idad de neurot ransm isor conocida com o cuanto. En la PNM, estas

respuestas pueden observarse com o una despolar ización de pequeña

am plitud en la fibra m uscular y con una frecuencia de unos pocos a varias

decenas de eventos por m inuto.

Se sabe que este proceso se encuent ra est recham ente regulado por

el nivel de Ca2+ citosólico, al igual que por el Ca2+ ext racelular (Hubbard et

22

2 - Introducción

al. 1968; Llano et al. 2000; Angleson y Betz 2001) , presentando una

dependencia a este ión práct icam ente lineal (Lou et al. 2005; Sun et al.

2007) . Por lo tanto, se deduce que un aum ento en la frecuencia de

liberación basal de acet ilcolina es un reflejo del increm ento en la

concent ración int racelular de Ca2+ . Esto tam bién im plica que cualquier

est ím ulo despolar izante que act ive a los canales de Ca2+ sensibles al

voltaje, com o una solución de alto potasio, prom overá la liberación

espontánea (Takeuchi y Takeuchi 1961) . Tam bién se ha encont rado que

este t ipo de liberación posee un com ponente independiente de Ca2+ (Katz et

al. 1996; Losavio y Muchnick 1997) .

En térm inos generales, evidencias recientes sugieren que la liberación

espontánea de neurot ransm isor jugaría un rol im portante en la m aduración

y estabilidad de las redes sinápt icas y en la regulación de la síntesis de

proteínas dendrít icas (Chung y Kavalali 2006; Wasser y Kavalali 2009) .

2 .4 - Canales de Ca 2 + dependientes de volta je

Los canales de Ca2+ dependientes de voltaje (CCDVs) com prenden una

fam ilia de proteínas t ransm em brana que cont rolan la ent rada de Ca2+ en

respuesta a una despolar ización de la m em brana plasm át ica y regulan

procesos com o la cont racción m uscular, la secreción vesicular, la

neurot ransm isión y la expresión génica (Cat terall 2000) . Cada canal está

form ado por un com plejo m ult im érico que incluye a las subunidades α1, β, γ y α2δ (Figura 2 .4 ; Ar ikkath y Cam pbell 2003; Cat terall et al. 2005) .

23

2 - Introducción

24

Figura 2 .4 : Topología de m em brana, interacción de s ubunidades y dom inios est ructura les de los CCDVs. Los CCDVs están com puestos por la subunidad α1 formadora del poro y las subunidades accesorias α2δ, β y γ. Los com ponentes α2δ y γ poseen dom inios t ransmembrana, m ient ras que la subunidad β es est r ictamente int racelular. Las t res subunidades accesorias interactúan directam ente con la subunidad α1, m ient ras que no se han reportado interacciones ent re las subunidades accesorias. Modificado de Arikkath y Campbell 2003.

La subunidad α1 es el polipépt ido m ás grande de los que com ponen el

canal de Ca2+ (190-250 kDa) y com prende est ructuras com o el poro de

conducción, los sensores de voltaje y el aparato de apertura, al igual que la

m ayoría de los sit ios conocidos de regulación de la act ividad por segundos

m ensajeros, drogas y toxinas. Por este m ot ivo, es la subunidad que

determ ina en m ayor m edida las propiedades biofísicas y farm acológicas del

canal (Dolphin 2009) . La subunidad α1 (Figura 2 .5 ) está form ada por

2 - Introducción

25

Figura 2 .5 : Est ructura de la subunidad α1 . En el diagrama se representan los cuat ro dom inios t ransmembrana homólogos ( I - I V) así como también los seis segmentos S que com ponen cada dom inio de la subunidad α1 (1-6) . Modificado de Cat terall et al. 2005.

alrededor de 2000 am inoácidos organizados en cuat ro dom inios hom ólogos

(dom inios I - I V) . Cada dom inio consiste en seis α hélices t ransm em brana

(S1 a S6) y un loop ent re los segm entos S5 y S6 asociado a la m em brana.

Los segm entos S1 a S4 conform an el m ódulo responsable de sensar el

voltaje, m ient ras que los segm entos S5, S6 y el loop ubicado ent re ellos

com ponen el poro propiam ente dicho. Los grandes segm entos int racelulares

del canal funcionan com o plataform a de señalización para la regulación de

la neurot ransm isión dependiente de Ca2+ (Cat terall y Few 2008) .

La subunidad β es una proteína hidrofílica de 50-65 kDa y es el único

com ponente del canal que es com pletam ente int racelular. Por su parte, el

com plejo α2δ es codificado por un único gen cuyo producto es clivado post -

t raduccionalm ente pero perm anece unido por puentes disulfuro dando lugar a la proteína m adura. Una tercera subunidad accesoria -conocida

com o γ- está com puesta por cuat ro segm entos t ransm em brana y está

2 - Introducción

presente tanto en m úsculo esquelét ico com o en corazón y cerebro (Cat terall

y Few 2008) .

Las subunidades accesorias t ienen una influencia importante en la

función del canal de Ca2+ (Dolphin 2003; Hofm ann et al. 1999) . La

subunidad β aum enta de m anera im portante la expresión de la subunidad α1

en la m em brana plasm át ica y m odifica la cinét ica del canal así com o

tam bién la dependencia de la act ivación e inact ivación con el voltaje

(Cat terall y Few 2008) . El com plejo α2δ tam bién increm enta la expresión de

la subunidad α1 en la m em brana, pero t iene efectos m enores y m enos

consistentes sobre la cinét ica y la dependencia de la apertura del canal con

el voltaje (Davies et al. 2007) . En térm inos generales la subunidad γ no

influencia la expresión del canal de Ca2+ en la m em brana, salvo en algunos

casos donde provoca una m arcada reducción en el número de m oléculas en

m em brana. El rol funcional de la subunidad γ no se encuent ra bien definido,

aunque se cree que part icipa en la m odulación de las propiedades biofísicas

del canal (Arikkath y Cam pbell 2003) .

A pesar de que las subunidades accesorias m odulan las propiedades

funcionales de los com plejos de canales de Ca2+ , la diversidad farm acológica

y fisiológica de estos canales se debe en m ayor m edida a la existencia de

m últ iples subunidades α1 (Cat terall y Few 2008) .

Una am plia serie de isoform as han sido reportadas para la subunidad

α1, las cuales provienen tanto de la t ranscripción de num erosos genes com o

del splicing alternat ivo de los m ism os. La com binación de estas diferentes

variantes posibilita la form ación de canales con diversas propiedades

biofísicas y farm acológicas, según se puede observar en la Tabla 2 .1 . Las

corr ientes L, P/ Q, N y R se clasifican com o corr ientes de alto voltaje de

26

2 - Introducción

Tabla 2.1 : Función farmacológica y fisiológica de los CCDVs *.

subunidad α1 corriente nomenclatura

antigua

bloqueantes localización función celular nomenclatura específicos

actual

α1S CaV1.1 músculo esquelético, túbulos transversos

acoplamiento excitación-contracción

α1C CaV1.2

miocitos cardíacos, miocitos del músculo liso,

células endócrinas, cuerpos neuronales, dendritas proximales

acoplamiento excitación-contracción, liberación

hormonal, regulación de la transcripción, integración

sináptica

α1D CaV1.3

cuerpos neuronales, dendritas proximales, células endócrinas,

miocitos del atrio cardíaco y células marcapaso, células de la cóclea

liberación hormonal, regulación de la transcripción, integración sináptica, marcapaso cardíaco,

audición, liberación de neurotransmisores de células

sensoriales

L

α1F CaV1.4

células bipolares y bastones retinales, médula espinal, glándula adrenal,

mastocitos

dihidropiridinas, fenilalquilaminas, benzotiacepinas

liberación de neurotransmisores de

fotorreceptores

P/Q α1A CaV2.1 terminales nerviosos y

dendritas, células neuroendócrinas

ω-Agatoxina IVA

liberación de neurotransmisores, transientes de Ca2+ dendrítico, liberación

hormonal

N α1B CaV2.2 terminales nerviosos y

dendritas, células neuroendócrinas

ω-Conotoxina GVIA

liberación del neurotransmisor, transientes de Ca2+ dendrítico,

liberación hormonal

R α1E CaV2.3 cuerpos celulares

neuronales y dendritas SNX-482 disparos repetitivos, transientes

de Ca2+ dendrítico

α1G CaV3.1 cuerpos neuronales y dendritas, miocitos del músculo liso y cardíaco

marcapasos, disparos repetitivos

α1H CaV3.2 cuerpos neuronales y dendritas, miocitos del músculo liso y cardíaco


T

α1I CaV3.3 cuerpos neuronales y

dendritas

Mibefradil


* Información ext raída de Brogden y Markham 1997, St rock y Diverse-Pierluissi 2004 y Cat t eral l et al . 2005.

act ivación -dado el requerim iento de est ím ulos despolar izantes fuertes para

la apertura del canal- m ient ras que las T se conocen com o corr ientes de

bajo voltaje de act ivación.

Tanto en la PNM de los m am íferos com o en las sinapsis del sistem a

nervioso cent ral, la liberación evocada de neurot ransm isores en respuesta

al influjo de Ca2+ se encuent ra m ediada principalm ente por los CCDVs de

t ipo P/ Q (Prot t i et al. 1991; Llinas et al. 1992; Uchitel et al. 1992b; Katz et

al. 1997; I wasaki y Takahashi 1998) . De esta m anera, las señales de Ca2+

27

2 - Introducción

28

generadas por los canales gat illan la t ransm isión sinápt ica a t ravés de un

cont rol de la fusión de vesículas con la m em brana plasm át ica de los

term inales nerviosos. Por ot ro lado, se ha encont rado que la act ividad de los

canales de t ipo N es crít ica para la t ransm isión sinápt ica durante los

estadíos m ás tem pranos del desarrollo y en anim ales que carecen de la

subunidad CaV2.1 (Rosato Sir i y Uchitel 1999; Urbano et al. 2003) . En lo

que respecta al canal de t ipo L, se ha sugerido que su presencia en la PNM

(Urbano y Uchitel 1999) podría m odular el reciclado rápido de las vesículas

conteniendo acet ilcolina (Perissinot t i et al. 2008) .

OObbjjeettiivvooss

3 - Objetivos

30

Nuest ra invest igación se encuent ra or ientada a dilucidar los m ecanism os de

acción de los ant icuerpos de ELA posit ivos ( I gGs-ELA) , es decir, las I gGs

capaces de unirse a la PNM e inducir una potenciación sinápt ica.

En el presente t rabajo se plantearon los siguientes objet ivos específicos:

• Determ inar si las I gGs-ELA t ienen la capacidad de interactuar con la PNM

del m úsculo diafragm a de ratón y m odular su frecuencia espontánea de

liberación de acet ilcolina.

• Estudiar la react ividad de las I gGs-ELA hacia ot ras est ructuras neurales

relevantes para la patología de la enferm edad, com o la m édula espinal,

la corteza cerebral y el cerebelo.

• Dilucidar el rol que juegan los canales de calcio en esta interacción, para

lo cual se procedió a:

o Evaluar la react ividad y funcionalidad de los ant icuerpos en un

m odelo de ausencia del canal de Ca2+ de t ipo P/ Q y ot ro de ausencia

del canal de t ipo N.

o Analizar posibles interacciones ent re las I gGs-ELA y el canal de t ipo

P/ Q, así com o tam bién con ot ras proteínas presentes en los

term inales sinápt icos.

o I nvest igar los posibles cam bios en la expresión de proteínas

sinápt icas en dicho m odelo de deleción del canal de Ca2+ de t ipo P/ Q.

MMaatteerriiaalleess yy MMééttooddooss

4 - Materiales y Métodos

4 .1 - Mater ia les

4.1.1 - React ivos

Todos los react ivos em pleados fueron de grado analít ico y adquir idos en

Sigm a-Aldrich (St . Louis, Missouri, USA) , salvo indicación cont rar ia. El

detalle de los ant icuerpos em pleados se m uest ra en la Tabla 4 .1 . Las

colum nas de agarosa-proteína G HiTrap fueron obtenidas de GE Healthcare

Bio-Sciences AB (Uppsala, Suiza) .

Para preparar todas las soluciones se ut ilizó agua ult rapura de calidad

m illi-Q, con una resistencia cercana a 18 MΩ.cm , obtenida a part ir de un

deionizador Barnstead (Therm o Scient ific, USA) . Las soluciones m adre de

las drogas fueron preparadas con agua para crom atografía iónica (Sigm a-

Aldr ich, USA) .

4.1.2 - Líneas de ratones

Para todos los experim entos, el tej ido fue ext raído de los anim ales

correspondientes a t res líneas m urinas diferentes: Swiss (m achos, P> 30) ,

línea carente de CaV2.1 sv129 (m achos y hem bras, P16-P23) y línea carente

de CaV2.2 C57BL/ 6 (m achos, P18) . Los anim ales de estas últ im as dos líneas

fueron donados por el Dr. Shin Hee-Sup, del I nst ituto Coreano de Ciencia y

Tecnología (Seul, República de Corea) . Los ratones de la línea Swiss fueron

adquir idos en el bioter io de la Facultad de Farm acia y Bioquím ica de la

Universidad de Buenos Aires.

32


Tabla 4.1 : Información sobre los anticuerpos empleados en este trabajo.

Especie Empresa/ Laboratorio Nº Dilución Ant icuerpo

product ora (país de orígen) cat álogo ut i l izada

Ant i-CaV2.1 conej o Laboratorio Dr. Snut ch

(Canadá) BC229 1:10.000

Ant i-GAD65/ 67 conej o Sigma (USA) G5163 1:500 Ant i-GFAP conej o Sigma (USA) G9269 1:500 Ant i-NeuN rat ón Mil l ipore (USA) MAB377 1:500 Ant i-sinaptof isina rat ón Sigma (USA) S5768 1:400 Ant i-sinaptotagmina I conej o Alomone (Israel) ANR-003 1:500

Ant i-sinaptobrevina II rat ón Laboratorio Dr. Jahn

(Alemania) CL69.1 1:500

Ant i-sint axina 1A conej o Synapt ic Systems

(Alemania) 110302 1:1.000

Ant i-IgGhumano-FITC cabra Cappel (Países Baj os) 1201-0081 1:2.000 Ant i-IgGconej o-TMR cabra Molecular Probes (USA) T2769 1:1000 Ant i-IgGrat ón-TMR cabra Sigma (USA) T5393 1:100

Ant i-IgGhumano-HRP cabra Sant a Cruz Biot echnology

(USA) sc-2453 1:1.000

Ant i-IgGrat ón-HRP burro Sant a Cruz Biot echnology

(USA) sc-2314 1:1.000

Ant i-IgGconej o-HRP cabra Sant a Cruz Biot echnology

(USA) sc-2004 1:1.000

4.1.3 - Muest ras de suero hum ano

Los pacientes fueron diagnost icados con ELA esporádica de acuerdo al

cr iter io de El Escorial (Brooks, 1994) . Todos los individuos part icipantes

dieron su consent im iento escrito para form ar parte del estudio y el

protocolo aplicado fue aprobado por la Junta de Revisión I nst itucional del

Hospital Br itánico de Buenos Aires.

La edad al m om ento del diagnóst ico se encont raba com prendida en el

rango de 59 a 76 años (prom edio: 64,6 años) , con una proporción de sexos

de 6: 2 (H: M) . Seis pacientes evidenciaron un com ienzo espinal de la

patología, m ient ras que el resto m ost ró un inicio bulbar. Todos los

parám etros clínicos evaluados en cada paciente con ELA (Escala Funcional,

Escala Norr is, Escala Ashworth, Escala MRC) presentaron valores sim ilares

33


(Tabla 4 .2 ) . La exclusión de form as genét icas de la enferm edad se basó en

la histor ia fam iliar de cada paciente.

Los cont roles enferm os (CE; n = 7; 4 m ujeres; edad prom edio: 56,0

años) com prendieron personas con el síndrom e m iasténico de Lam bert -

Eaton (un desorden auto- inm une contra CCDVs, CE1) , m iastenia gravis

(una enferm edad auto- inm une cont ra los receptores de acet ilcolina, CE2) ,

síndrom e de Charcot -Marie-Tooth (enferm edad de m otoneurona puram ente

genét ica que involucra la dest rucción de la vaina de m ielina, CE3) , form as

fam iliares de ELA (CE4-6) y neuropat ía m otora m ult ifocal con bloqueo de la

conducción (enferm edad auto- inm une cont ra la vaina de m ielina, CE7) .

Los cont roles sanos (CS; n = 3; 2 m ujeres; edad prom edio: 36,7

años) incluyeron sujetos sin ninguna evidencia de enferm edad neurológica.

Las m uest ras de sangre fueron colectadas al m om ento de realizar la

evaluación clínica. El suero fue separado por cent r ifugación y conservado a

-80 °C hasta su poster ior procesam iento.

4 .2 - Métodos

4.2.1 - Manejo de anim ales

Los ratones fueron t ratados de acuerdo a las guías nacionales para el t rato

hum ano de los anim ales de laborator io de la Universidad de Buenos Aires,

las cuales son com parables con las de los I nst itutos Nacionales de Salud

(NI H) de Estados Unidos. Se realizaron todos los esfuerzos posibles para

reducir el núm ero de anim ales ut ilizados, así com o tam bién su sufr im iento.

34


Tabla 4.2: Parámetros clínicos de los pacientes con ELA esporádica incluidos en el estudio.

Escalas

Pacient e Edad

(años) Sexo ELA CFV

EF1 MRC2 Norris3 Ashwort h4

Tiempo Tasa de

progresión5 progresión (meses)

ELA1 66 M D A 22 136 49 7 4,50 4 ELA2 70 F D N ND ND ND ND ND 12 ELA3 67 M D N 33 149,5 68 1 0,58 12 ELA4 62 M Pr A 32 174 82 7 0,44 18 ELA5 70 F D N 30 ND 66 5 0,33 30 ELA6 77 M Ps A 35 162 67 3 0,08 60 ELA7 59 M D N 31 154,5 80 5 0,50 18 ELA8 67 M D N 28 138 61 9 0,50 24

Abreviat uras M: mascul ino, F: femenino, D: def inido, Pr: probable, Ps: posible, CFV: capacidad de fuerza vit al , A: anormal, N: normal, EF: escala funcional (en inglés, ALSFR), ND: no disponible, MRC: escala para fuerza muscular. 1 Rango: 0 a 40 (normal) 2 Rango: 0 a 190 (normal) 3 Rango: 0 a 99 (normal) 4 Rango: 0 (normal) a 36

5 Calculada con los valores de EF de la siguient e manera: )(

40

mesest

EF

progresión

−

4.2.2 - Genot ipado de ratones

La determ inación del genot ipo de los anim ales se llevó a cabo m ediante la

técnica de PCR m ult iplex (Opt icon Cycler, MJ Research, USA) , part iendo de

m aterial colectado por biopsias. Las m uest ras de ADN fueron purificadas

con el kit DNeasy Tissue (Qiagen I nc., Valencia, California, USA) luego de la

digest ión del tej ido con proteinasa K (2 m g/ m L) durante 15 h a 56 °C.

A cont inuación se detalla la secuencia de los pr im ers ut ilizados:

CaV2.1 forward: 5´ -CCAGCTTGAGTGGCCGCAGCACACG-3´

CaV2.1+ / + reverse: 5´ -ATAATAAGTCACCTCTGGTTCTAAAG-3´

CaV2.1 - / - reverse: 5´ -CTGACTAGGGGAGGAGTAGAAG-3´

CaV2.2 forward: 5´ -TGGCACCTTATGCCTTGCACGGTGCCTGCG-3´

CaV2.2+ / + reverse: 5´ -GGTCGAGATGGCTTGCGGGACCCGTTGGGA-3´

CaV2.2 - / - reverse: 5´ -GCCTGCTTGCCGAATATCATGGTGGAAAAT-3´

35


El protocolo de am plificación em pleado fue el siguiente:

Genot ipado de CaV2.1:

• 95 °C 3 m in

• 95 °C 30 seg, 55 °C 30 seg, 72 °C 30 seg (35 ciclos)

• 72 °C 5 m in

Genot ipado de CaV2.2:

• 94 °C 2 m in

• 94 °C 20 seg, 58 °C 20 seg, 72 °C 40 seg (35 ciclos)

• 72 °C 7 m in

Los productos de PCR fueron separados m ediante una elect roforesis

en gel de agarosa (1 % p/ v) conteniendo brom uro de et idio (1 μg/ m L) . Las

bandas fueron analizadas de acuerdo a su tam año esperado: 240 pb para

CaV2.1+ / + , 390 pb para CaV2.1 - / -, 460 pb para CaV2.2+ / + y 580 pb para

CaV2.2 - / -. Para est im ar dicho tam año se em pleó el m arcador 1 kb Plus DNA

Ladder ( I nvit rogen, Carlsbad, California, USA) .

4.2.3 - Pur ificación de I nm unoglobulinas G

Todos los procedim ientos fueron realizados a 4 °C. Las m uest ras de suero

fueron cent r ifugadas a 12.000 g durante 10 m in y el sobrenadante se

som et ió a un fraccionam iento con sulfato de am onio hasta una

concent ración final de 50 % p/ v. La solución fue m antenida bajo agitación

durante 60 m in y luego cent r ifugada a 12.000 g durante 30 m in. El pellet

resultante se resuspendió en buffer fosfato de sodio 20 m M pH 7 y

36


posteriorm ente se dializó cont ra la m ism a solución durante 16 h em pleando

una m em brana de celulosa de 12 kDa de poro.

El aislam iento de las I gGs se llevó a cabo por m edio de una

crom atografía de afinidad con una colum na de Proteína G-agarosa y buffer

fosfato 20 m M com o agente de lavado. Los ant icuerpos fueron eluídos con

glicina 0,1 M pH 2,7 y la acidez neut ralizada con Tris-HCl 1 M pH 9. Las

fracciones aisladas fueron dializadas cont ra el buffer fosfato salino (PBS;

buffer fosfato de sodio 10 m M, NaCl 150 m M, KCl 3 m M) pH 7,4 durante 5 h.

La concent ración de las I gGs fue est im ada por el análisis de

absorbancia de los eluídos a 280 nm , teniendo en cuenta la absort iv idad

m olar de las I gGs hum anas.

El chequeo de las fracciones purificadas se realizó m ediante una

elect roforesis en gel de poliacr ilam ida en condiciones desnaturalizantes y

posterior t inción del gel con azul de Coom assie. Las alícuotas fueron

conservadas a -20 °C.

4.2.4 - Ensayo de ELI SA

Para la cuant ificación de las I gGs de las m uest ras de suero se ut ilizó un

ensayo de ELI SA sandwich (Bethyl Laborator ies, Montgom ery, Texas, USA) ,

siguiendo las recom endaciones del fabricante. Se ut ilizaron placas de 96

pocillos Maxisorp (Nunc, Roskilde, Dinam arca) y se realizó la cobertura con

el ant icuerpo de captura (ant i- I gGhum ano) durante 15 h a 4 º C. Las m uest ras

y el pat rón se diluyeron en Tris-HCl 50 m M pH 8, NaCl 140 m M, BSA 1%

p/ v y Tween-20 0,05 % v/ v. El ant icuerpo de detección (acoplado a

peroxidasa de rábano) fue ut ilizado a una dilución 1: 10.000 y com o sust rato

para la m edición de act ividad se em pleó o- fenilendiam ina (OPD) a una

37


concent ración de 0,5 m g/ m L, junto con H2O2 0,03 % v/ v. Luego de una

incubación a tem peratura am biente durante 30 m in, se realizó la lectura de

la absorbancia a 450 nm .

La est im ación de la concent ración de las I gGs se llevó a cabo -de

acuerdo a la sugerencia del proveedor- por ajuste de los datos a una curva

logíst ica de cuat ro parám etros, previa t ransform ación de las

concent raciones a escala logarítm ica, por m edio del software Sigm aPlot 10

(Systat Software I nc., Chicago, I llinois, USA) .

4.2.5 - Regist ros int racelulares

Los ratones fueron anestesiados con una sobredosis int raperitoneal de

t r ibrom oetanol 2 % (0,3 m L/ 10 g peso) , exsanguinados por la vena yugular

y eutanizados por decapitación. La disección del m úsculo diafragm a se llevó

a cabo en cajas de Pet r i cubiertas con Sylgard (Dow Corning, Midland,

Michigan, USA) conteniendo solución norm al de Ringer (RN; NaCl 137 m M,

KCl 5 m M, CaCl2 2 m M, MgSO4 1 m M, NaHCO3 12 m M, Na2HPO4 1 mM y

glucosa 11 m M, pH 7,2-7,4) , burbujeada cont inuam ente con O2 95 % / CO2

5 % .

Todos los procedim ientos fueron realizados a tem peratura am biente

(20-23 °C), salvo indicación cont rar ia. Algunos de estos experim entos

fueron realizados en colaboración con Lucas Vat t ino.

La preparación de nervio frénico-diafragm a fue colocada en una

cám ara de regist ro (volum en: 1 m L) e incubada con las I gGs purificadas de

pacientes o cont roles sanos durante 4 h en una atm ósfera hum idificada. Los

ant icuerpos fueron diluidos en RN hasta una concent ración final de 0,4

38


m g/ m L. Para testear el efecto de las inm unoglobulinas se ut ilizó en form a

aleator ia tanto el hem i-diafragm a derecho com o el izquierdo.

La frecuencia de MEPPs fue determ inada en ausencia de tet rodotoxina

(act ividad espontánea) , antes y después del período de incubación, por

m edio de regist ros int racelulares. Para ello se em plearon m icroelect rodos de

vidr io conteniendo KCl 3 M ( resistencia: 20-30 MΩ) y se realizaron regist ros

de 2-5 m in de duración, adquir idos de un m áxim o de 15 fibras por anim al,

em pleando al m enos 3 ratones por t ratam iento.

El procedim iento de adquisición se llevó a cabo de la m anera

descripta previam ente (Pagani et al. 2006) . Los datos fueron alm acenados

en un disco duro para su poster ior análisis usando el software apropiado

(Axoscope 9.0 y Clam pfit 9.0, Axon I nst rum ents, Foster City, California,

USA) . Para realizar las com paraciones de datos y confección de gráficos se

em pleó el software Sigm aPlot 10.0 integrado con Sigm aStat 3.5 (Systat

Software I nc., Chicago, I llinois, USA) .

4.2.6 - I nm uno- fluorescencia de PNM

La eutanización de los anim ales y la disección se llevó a cabo según lo

descripto anteriorm ente. Los m úsculos disecados se fij aron con

paraform aldehído 4 % p/ v a 4 °C, se perm eabilizaron con Tritón-X100 1 %

v/ v y se cr iopreservaron en sacarosa 30 % p/ v a 4 º C. Com o m edio de

inclusión se em pleó OCT4583 TissueTek (Sakura, Tokyo, Japón) y se

obtuvieron secciones de tej ido de 40 μm em pleando un cr ióstato (ETR2248,

Reichert -Jung, Bensheim , Alem ania) . Dichas secciones fueron m ontadas en

portaobjetos cubiertos de gelat ina y guardadas a -20 °C. Para reducir la

señal de fondo de las fibras m usculares, los preparados de m úsculo

39


diafragm a fueron cortados de m anera tangencial y en consecuencia, las

PNMs por lo general no m ost raron la form a t ipo pretzel que las caracter iza.

Los cortes de tej ido fueron perm eabilizados con Tr itón-X100 0,05 %

v/ v y poster iorm ente bloqueados con seroalbúm ina bovina (BSA) 3 % p/ v y

suero norm al de cabra 5 % v/ v, durante 30 m in. Al finalizar el bloqueo, se

incubaron las secciones con las I gGs purificadas de pacientes o individuos

cont roles, en las diluciones apropiadas (1: 10-1: 100) durante 16-20 h a 4

°C. Com o agente diluyente se ut ilizó PBS conteniend o BSA 3 % p/ v, suero

norm al de cabra 5 % v/ v, L- lisina 0,1 M y Tritón X-100 0,075 % v/ v. La

unión del ant icuerpo pr im ario se reveló ut ilizando un ant icuerpo ant i-

I gGhum ano acoplado a isot iocianato de fluoresceína (FI TC) en una dilución

1: 2.000. La co- t inción de los cortes con α-bungarotoxina (0,25 μg/ m L)

conjugada a tet ram et ilrodam ina (TMR) nos perm it ió ident ificar la PNM a

t ravés de su alta afinidad por el receptor post -sinápt ico de acet ilcolina.

Luego de exhaust ivos lavados con PBS, las secciones de m úsculo fueron

m ontadas en PBS: glicerol (1: 1) , cubiertas con cubreobjetos y selladas con

esm alte de uñas.

Para chequear las uniones no específicas y la auto- fluorescencia, se

incluyeron cont roles por om isión de α-bungarotoxina, ant icuerpos prim arios

(cont rol de isot ipo) o secundarios.

4.2.7 - I nm uno- fluorescencia de m édula espinal, corteza cerebral y cerebelo

Los ratones anestesiados con t r ibrom oetanol fueron perfundidos

t ranscardíacam ente con PBS seguido de una solución de paraform aldehído 4

% p/ v en sacarosa 4 % p/ v, luego de com probar la pérdida del reflejo

pupilar y plantar de las ext rem idades. Con posterior idad a la disección

40


com pleta del cerebro, cerebelo y m édula espinal, el tej ido fue fij ado

adicionalm ente en la m ism a solución durante 2-4 h a 4 º C. Los cortes de

50-150 μm se obtuvieron con un vibrátom o I ntegraslice 7550PSDS

(Cam pden I nst rum ents, Loughborough, Reino Unido) y se perm eabilizaron

con Tritón X-100 1 % v/ v durante 30 m in. La incubación con las I gGs

purificadas de los pacientes o los individuos cont roles (0,2 m g/ m L) se llevó

a cabo durante 16-20 h a 4 °C, ut ilizando com o agente diluyente PBS con

BSA 3 % p/ v, suero norm al de cabra 5 % v/ v, L- lisina 0,1 M y Tritón X-100

0,075 % v/ v. La unión del ant icuerpo pr im ario fue detectada em pleando un

secundario ant i- I gGhum ano acoplado a FI TC, en una dilución de 1: 2.000.

Para la inm uno-m arcación de la m édula espinal, se analizaron las

secciones lum bares y toráxicas debido al gran tam año de las células

residentes en estas regiones. Las m otoneuronas infer iores fueron

detectadas por su m orfología y localización en el asta vent ral. El área

cort ical m otora pr im aria fue ident ificada en las rodajas con ayuda de un

at las de cerebro de ratón (Paxinos y Franklin 2001) , m ient ras que las

m otoneuronas fueron reconocidas por su m orfología y tam año. Las

neuronas de Purkinje fueron ident ificadas dent ro de las secciones

cerebelares por su m orfología dist int iva. En todos los casos previos, se

ut ilizó una cont ra- t inción con ioduro de propidio (3 μM, 60 m in) para

facilitar la dist inción m orfológica de las diferentes poblaciones celulares. En

el caso del tej ido fij ado, el ioduro de propidio t iñe tanto el citoplasm a com o

el núcleo de las células debido a su afinidad general por los ácidos

nucleicos.

41


En form a análoga a lo descripto anter iorm ente, también se realizaron

co- t inciones de tej ido em pleando los m arcadores m encionados en la sección

Resultados y descriptos en la Tabla 4 .1 .

4.2.8 - Análisis de inm uno- fluorescencia y procesado de im ágenes

La m arcación inm uno- fluorescente se analizó con un m icroscopio confocal

FV300 (Olym pus Opt ical Co., Tokio, Japón) , equipado con un sistem a de

adquisición de im ágenes y el software Fluoview 3.3 (Olym pus Opt ical Co.,

Tokio, Japón) . Las secciones fueron escaneadas en form a secuencial con un

laser de argón (λ: 488 nm ) y helio-neón (λ: 543 nm ) , para reducir el

bleeding- through de las señales fluorescentes. Tanto la intensidad de los

láseres com o la configuración de cada fotom ult iplicador (voltaje, ganancia y

offset ) se m antuvieron constantes en cada experim ento.

Para el análisis de los cortes de PNM m ontados en portaobjetos, se

ut ilizó un objet ivo PlanApo 60x Olym pus de inm ersión en aceite (apertura

num érica: 1,4) , m ient ras que las rodajas fueron fotografiadas con un

objet ivo LUMplanFL 60x Olym pus de inm ersión en agua (apertura num érica:

0,9) o un UplanFL 20x Olym pus seco (apertura num érica: 0,5) .

Se procedió a colectar para cada canal un total de 10 planos

confocales a intervalos de 1 μm , los cuales fueron subsecuentem ente

analizados con el software I m ageJ 1.42 (Nat ional I nst itutes of Health,

Bethesda, Maryland, USA) . La cuant ificación de la intensidad de

fluorescencia se llevó a cabo por m edición del valor de gr is m edio de por lo

m enos 15 células o PNMs de 2-3 anim ales, luego de la sust racción de la

señal de fondo. Para el caso de las preparaciones de m úsculo, la región de

42


interés se eligió en base a la señal de α-bungarotoxina. Los valores m edios

de gr is se norm alizaron al cont rol de isot ipo.

4.2.9 - Preparación de sinaptosom as

La purificación de las fracciones crudas de m em brana y sinaptosom as se

llevó a cabo según el protocolo de Gray y Whit taker (1962) .

El cerebelo de ratón fue disgregado con un hom ogenizador de

vidr io- teflón t ipo Dounce, en solución fr ía de Tris-HCl 50 m M pH 7,4

conteniendo sacarosa 0,32 M y EDTA 10 μM ( relación g tej ido: m L sacarosa

1: 10) . Los hom ogenatos fueron cent r ifugados a 1.000 g durante 10 m in a 4

º C y el sobrenadante resultante se cent r ifugó a 17.000 g durante 55 m in a

4 º C. Los pellets fueron resuspendidos en buffer RI PA (Tris-HCl 50 m M pH

8,0, NaCl 150 m M, NP-40 1 % v/ v, SDS 0,1 % p/ v y deoxicolato de sodio

0,5 % p/ v) , suplem entado con los inhibidores de proteasas apropiados

(EDTA 10 μM, PMSF 2 m M, aprot inina 10 μg/ m L, leupept ina 100 μM y

pepstat ina 1 μg/ m L) y em pleados en los experim entos de inm uno-

precipitación. Este ext racto representó la fracción cruda de m em branas.

Alternat ivam ente, se cont inuó con la purificación de sinaptosom as. El

pellet de la últ im a cent r ifugación se resuspendió en solución de sacarosa

0,32 M y se sem bró en un gradiente discont inuo de sacarosa com puesto por

dos fases (1,2 M - 0,8 M) . El fraccionam iento se realizó por cent r ifugación a

112.500 g durante 2 h. Los sinaptosom as se colectaron de la interfase de

sacarosa 1,2 M - 0,8 M y se concent raron por cent r ifugación a 100.000 g

durante 60 m in, para luego liofilizarse. Las m uest ras fueron luego

preparadas para su separación por elect roforesis en dos dim ensiones.

43


4.2.10 - Obtención de ext ractos totales de cerebelo y m úsculo

Para la preparación del ext racto total de cerebelo, el tej ido fue disgregado

m ecánicam ente en presencia de buffer RI PA (suplem entado con inhibidores

de proteasas) , por m edio de un hom ogenizador t ipo Dounce.

Por su parte, el tej ido m uscular disecado de los m iem bros infer iores

fue pulverizado en presencia de N2 líquido ut ilizando un m ortero de

porcelana. El polvo resultante se solubilizó en buffer RI PA suplem entado con

inhibidores de proteasas.

En am bos casos, dada la alta viscosidad de la solución resultante, se

incluyó en el proceso de solubilización un paso ext ra de sonicado. Para ello

se em pleó un equipo Fisher Sonic Dism em brator m odelo 500 (Fisher

Scient ific, Loughborough, Reino Unido) , siguiendo un protocolo de 3 ciclos

de 5 segundos cada uno, a una intensidad de 20 % del m áxim o.

4.2.11 - Purificación de rafts

La obtención de las fracciones enriquecidas en proteínas de rafts se realizó

según el protocolo descripto en Maekawa et al. 1999.

Brevem ente, los ext ractos de cerebelo fueron obtenidos por

disgregación m ecánica en buffer TME (Tr is-HCl 10 m M pH 7,5, MgCl2 1 m M,

EGTA 1 m M) conteniendo Tritón-X100 2 % v/ v ( relación g tej ido: m L TME

1: 10) . A este hom ogenato se adicionó una alícuota de solución de sacarosa

2,4 M a fin de lograr una concent ración final de 0,8 M. La m uest ra se colocó

en el fondo de un gradiente discont inuo de sacarosa, seguido de una capa

de sacarosa 0,7 M (en TME) y ot ra de buffer TME. La separación se realizó

por cent r ifugación a 70.000 g durante 6 h a 4 °C. La banda ubicada en la

interfase ent re la capa de TME y sacarosa 0,7 M fue colectada y

44


resuspendida en buffer TME conteniendo Tritón-X100 1 % v/ v. Luego de

una cent r ifugación a 100.000 g durante 1 h a 4 °C, el pellet se guardó a -80

°C para su posterior solubilización con buffer RI PA suplem entado con

inhibidores de proteasas.

4.2.12 - Cult ivo de células y t ransfección/ inducción

Las células em brionar ias de r iñón hum ano HEK293 (pasajes: 18-26, núm ero

de catálogo ATCC: CRL-1573) fueron m antenidas por pasajes seriados en

botellas de cult ivo de 75 cm 2 de área. Las células fueron crecidas en m edio

Dulbecco’s Modified Eagle’s (DMEM) conteniendo L-glutam ina 4 m M, glucosa

4,5 g/ L, pir idoxina-HCl 4 m g/ L y piruvato de sodio 110 m L/ L, y

suplem entado con suero fetal bovino (SFB, Gibco, USA) 10 % v/ v

( inact ivado por calor) , en una estufa hum idificada m antenida a 37 °C y en

una atm ósfera com puesta por CO2 5 % y aire 95 % .

El subcult ivo de las células se realizó por incubación con t r ipsina-

EDTA (ácido et ilendiam intet ra-acét ico) 0,25 % p/ v seguida de una

inact ivación de la proteasa por adición de DMEM conteniendo SFB y

resem brando en botellas de cult ivo de 25 cm 2 de área. Para las

t ransfecciones se em plearon cult ivos con una confluencia del 50 % y se

ut ilizó la técnica de liposom as cat iónicos, con el react ivo Lipofectam ina 2000

( I nvit rogen, Carlsbad, California, USA) , siguiendo las inst rucciones del

proveedor.

La expresión del cDNA de la subunidad CaV2.1 hum ana, la β2a de rata

y la α2δ2 de rata se llevó a cabo en el vector pcDNA3.1Zeo(+ ) ( I nvit rogen,

Carlsbad, California, USA) . Treinta y seis horas luego de la t ransfección, se

45


procesaron las células para los experim entos de inm uno-precipitación o

western blot , según se indica m ás adelante.

La línea celular inducible T- rex 293 (pasajes: 9-12) , der ivada de la

HEK293, se ut ilizó com o un m odelo de expresión estable de las subunidades

del canal de Ca2+ de t ipo P/ Q. El cult ivo se realizó en form a esencialm ente

sim ilar al descr ipto previam ente, salvo por la adición al m edio de

am inoácidos no esenciales (1 % p/ v) , y 24 h previo a la inducción, de los

agentes de selección blast icidina (10 μg/ m L) , zeocina (200 μg/ m L) e

higrom icina B (150 μg/ m L) .

El vector ut ilizado en este caso fue el pcDNA5/ TO ( I nvit rogen,

Carlsbad, California, USA) , el cual cont iene un elem ento de respuesta a

tet raciclina que fue em pleado para dir igir la expresión del cDNA de la

subunidad CaV2.1 de rata. Las subunidades accesorias β2a y α2δ2 fueron

expresadas en el plásm ido pBudCE4.1 ( I nvit rogen, Carlsbad, California,

USA) . Las células fueron lisadas 48 h luego de la inducción con tet raciclina

(1,5 μg/ m L) . En am bos casos, la lisis se llevó a cabo en form a m ecánica

ut ilizando agujas de diám et ro interno decreciente (26-29 G) . La m ism a se

realizó en buffer conteniendo NP-40 (Tr is-HCl 50 m M pH 7,4, NP-40 0,5 %

v/ v, NaCl 150 m M y EDTA 50 m M) suplem entado con inhibidores de

proteasas para los ensayos de inm uno-precipitación o en buffer Laem m li

(Tr is-HCl 62,5 m M pH 6,8, SDS 2 % p/ v, azul de brom ofenol 0,01 % p/ v, β-

m ercaptoetanol 2 % v/ v y glicerol 10 % v/ v) para la elect roforesis seguida

de western blot .

46


4.2.13 - Determ inación de la concent ración de proteínas

En todos los casos, la solubilización de las proteínas fue seguida por una

cent r ifugación de 20 m in a 21.500 g para separar el m aterial no

resuspendido.

La m edición de la concent ración de proteínas se llevó a cabo según el

m étodo descr ipto por Bradford (1976) , ut ilizando seroalbúm ina bovina com o

proteína pat rón.

4.2.14 - Ensayo de inm uno-precipitación

Una cant idad de proteínas de ent re 100 y 250 μg se incubaron durante 16 h

con los ant icuerpos y 60 μl de bolitas de agarosa con proteína G (Santa

Cruz Biotechnology, Santa Cruz, California, USA) , en un agitador rotat ivo a

4º C. Las bolitas de agarosa se lavaron con un buffer de lisis conteniendo

NP-40 (Tris-HCl 50 m M pH 7,4, NP-40 0,5 % v/ v, NaCl 150 m M y EDTA 50

m M) y los com plejos proteicos que interactuaron con los ant icuerpos fueron

eluídos con buffer Laem m li.

Los inm uno-precipitados fueron analizados por elect roforesis en

condiciones desnaturalizantes seguida de western blot . Una alícuota del

lisado em pleado originalm ente para el ensayo se corr ió en paralelo para

chequear la presencia de las proteínas analizadas ( input ) . Alternat ivam ente,

la fracción de proteínas inm uno-precipitadas se separó por elect roforesis y

posteriorm ente se procedió a la t inción del gel con nit rato de plata,

ut ilizando un protocolo com pat ible con espect rom etría de m asa (Vorum )

ext raído de Mortz et al. 2001.

47


4.2.15 - Elect roforesis en gel de una dim ensión y western blot

Los western blots se llevaron a cabo de acuerdo a procedim ientos standard.

Los lisados celulares se resolvieron por elect roforesis en gel de

poliacr ilam ida (a un voltaje constante de 120 V) y se t ransfir ieron a

m em branas de nit rocelulosa (Am ersham Hybond ECL, GE Healthcare,

Piscataway, USA) , aplicando un voltaje constante de 100 V durante 60 m in.

Los sit ios de unión inespecífica fueron bloqueados con leche en polvo

descrem ada 2 % en PBST (PBS conteniendo Tween-20 0,2 % ) durante 90

m in a tem peratura am biente.

Las m em branas fueron incubadas durante 16 h a 4 °C con los

ant icuerpos pr im arios m encionados en la sección Resultados, seguido de

una incubación con los ant icuerpos secundarios correspondientes acoplados

a la peroxidasa de rábano. Todos los ant icuerpos fueron diluidos en PBST

conteniendo leche en polvo descrem ada 2 % . Las bandas inm unoreact ivas

fueron detectadas por em isión de quim iolum iniscencia ut ilizando el kit

I m m obilon Western (Millipore, Biller ica, Massachuset ts, USA) y el analizador

de im ágenes LAS-1000 plus (Fuj ifilm , Tokio, Japón) .

4.2.16 - Elect roforesis en gel de dos dim ensiones

Las m uest ras de sinaptosom as liofilizadas se resuspendieron en solución de

m uest ra para 2D (urea 7 M, t iourea 2 M, CHAPS 4 % ) y la concent ración

proteica se determ inó con el kit 2D-Quant (GE Healthcare, Piscataway,

USA) . La carga de las m uest ras en las t iras ut ilizadas en la pr im era

dim ensión ( I PG St r ips 3-10; GE Healthcare, Piscataway, USA) se realizó por

rehidratación pasiva durante toda la noche.

48


El isoelect roenfoque se llevó a cabo según el siguiente esquem a: 30

m in a un voltaje constante de 300 V, 30 m in a un gradiente de voltaje

300-1.000 V, 80 m in a un gradiente de voltaje 1.000-5.000 V, term inando

con un voltaje constante de 5.000 V hasta com pletar 2.000 V h.

Las t iras con m uest ras enfocadas se equilibraron en un buffer Tr is

(Tris-HCl 75 m M pH 8,8, urea 6 M, glicerol 29,3 % , SDS 2 % , azul de

brom ofenol 0,002 % ) conteniendo DTT 10 m g/ m L (para reducir los puentes

disulfuro) y subsiguientem ente, iodoacetam ida 25 m g/ m L (para alquilar

grupos t ioles) .

La segunda dim ensión se realizó en un gel de poliacr ilam ida 12,5 %

en condiciones de corr iente constante (10 m A por gel) . Al term inar la

corr ida, los geles fueron teñidos empleando el protocolo de Coom assie

coloidal.

4.2.17 - Espect rom etría de m asa e ident ificación por m apeo pept ídico

Las proteínas a ser ident ificadas fueron escindidas del gel y digeridas con

t r ipsina (10 m g/ m L en NH4HCO3 25 m M) a 37 °C durante toda la noche. Los

pépt idos resultantes fueron ext raídos del gel con acetonit r ilo 60 % en ácido

t r if luoroacét ico 0,2 % , concent rados con bom ba de vacío y desalados con

una m icro-colum na C18 de fase reversa (OMI X Pippete t ips, Varian) . La

elución de los pépt idos se realizó directam ente con la solución de m at r iz

(ácido α- ciano-4-hidroxi-cinam ínico en acetonit r ilo 60 % y ácido

t r ifluoroacét ico 0,2 % ) .

Los espect ros de m asa de la m ezcla de digest ión fueron adquir idos

con un equipo MALDI -TOF-TOF m odelo 4800 de Applied Biosystem s

(Carlsbad, California, USA) , en un t rabajo en colaboración con los Drs.

49


50

Carlos Cerveñansky, Rosario Durán y Analía Lim a (Unidad de Proteóm ica y

Bioquím ica Analít ica, I nst ituto Pasteur, Montevideo, Uruguay) . Para ello se

ut ilizó el espect róm etro de m asa en m odo reflector y se calibró

externam ente con pépt idos pat rones. Para la obtención de los espect ros de

MS/ MS se em pleó la herram ienta de disociación inducida por colisión.

Las proteínas fueron ident ificadas por búsqueda en la base de datos

NCBI nr con los valores de m / z y ut ilizando el program a MASCOT

(ht tp: / / www.m at r ixscience.com ) . Los parám et ros de búsqueda fueron los

siguientes:

• Tolerancia de m asa isotópica: 0,05 Da.

• Tolerancia de m asa fragm entada: 0,25 Da.

• Modificación fij a: carbam idom et ilación de cisteínas.

• Modificación var iable: oxidación de m et ioninas.

• Tolerancia de fragm entos t r ípt icos no encont rados: 1.

4.2.18 - Análisis estadíst ico

Los resultados se expresaron y graficaron com o valores de m edia ± error

standard de la m edia. Las diferencias ent re los grupos experim entales

fueron analizadas con el test no param ét r ico Mann-Whitney Rank Sum ,

m ient ras que el análisis de correlación ent re los datos se llevó a cabo con el

coeficiente de Spearm an. Para ello se em pleó el software Sigm aStat 3.5

(Systat Software I nc., Chicago, I llinois, USA) . Un valor de p m enor o igual a

0,05 fue considerado estadíst icam ente significat ivo.

RReessuullttaaddooss

5 - Resultados

5 .1 - Los ant icuerpos de ELA aum entan la act iv idad sinápt ica

espontánea e interactúan con la PNM de ra tón

En una prim era instancia determ inam os la concent ración de las I gGs en las

m uest ras de suero de pacientes con ELA por m edio de un ensayo de ELI SA

sandwich, ut ilizando un kit com ercial (Figura 5 .1 A ) . En form a paralela

analizam os las m uest ras provenientes de suero de los individuos norm ales

(CS) y de los pacientes con enferm edades neurológicas dist intas de ELA

esporádica (CE) , algunas de las cuales incluían form as hereditar ias de la

enferm edad (CE4-6) y ot ros desórdenes auto- inm unes (CE1-2 y CE7) .

Com o se observa en la Figura 5 .1 B , los valores de la cuant ificación de las

I gGs de los pacientes esporádicos m ost raron niveles dent ro del rango

encont rado para los individuos sanos (3,73-11,29 m g/ m L) , no

diferenciándose en form a significat iva de éstos (p> 0,05) . El m ism o pat rón,

aunque m as hom ogéneo, se pudo observar para el caso de los CE. La

agrupación de los datos según cada categoría tam poco reveló m ayores

diferencias, excepto en el caso de las m uest ras ELA6-8, que m ost raron una

concent ración de ant icuerpos significat ivam ente m ayor que las ELA1-5

(Figura 5 .1 B ; recuadro interno; p< 0,01) , aunque no resultó diferente a la

encont rada en los CS (p> 0,05) . La razón por la cual los datos de ELA fueron

com binados de esta m anera se com prenderá m as adelante.

Con el fin de estudiar si las I gGs-ELA purificadas de la serie de

pacientes incluidos en este estudio eran capaces de m odificar la frecuencia

de MEPPs, realizam os incubaciones de preparaciones de m úsculo diafragm a

de ratón con estos ant icuerpos. Poster iorm ente analizam os la tasa de

liberación espontánea de acet ilcolina por m edio de regist ros int racelulares

de las fibras m usculares.

52

5 - Resultados

53

Figura 5 .1 : Ensayo de ELI SA sandw ich pa ra la cuant if icación de las I gGs en e l suero hum ano. Se ut i l izó un kit comercial (Human IgG ELISA Quant it at ion Kit , Bethyl Laboratories, USA) para la det erminación de los niveles de ant icuerpo en cada muest ra de suero. La det ección se real izó mediant e la medición espect rofot omét rica de la act ividad de la enzima peroxidasa de rábano, empleando el sust rat o OPD (λabsorbancia: 450nm).

5 - Resultados

A) Gráf ico representat ivo de la curva de cal ibración ut i l izada para la est imación de la concent ración de las IgGs en cada muest ra. También se muest ra la ecuación del aj ust e de los dat os y los valores medios y errores de los parámet ros, al igual que la bondad de dicho aj ust e (R2). B) Gráf ico de barras most rando los valores obt enidos para t odas las muest ras. El recuadro int erno se elaboró a part ir de la combinación de t odos los dat os, además de separar las muest ras de ELA en dos grupos (ELA1-5 y ELA6-8). # p<0,01 vs ELA1-5. Los números en la part e inferior indican la cant idad t otal de datos promediados. Barras blancas = cont roles sanos (CS), barras grises = cont roles enfermos (CE), barras negras = pacient es con ELA.

Com o se puede observar en la Figura 5 .2 , cinco de las m uest ras de

ELA (63 % ) presentaron una clara tendencia a aum entar significat ivam ente

la frecuencia de potenciales m iniatura (p< 0,05 com parando frecuencia

inicial versus final) , part iendo de una condición basal de 30 MEPPs/ m in. Los

valores encont rados luego de 4 h de incubación con estas m uest ras fueron

ent re 2 y 5 veces m ayores a los iniciales.

Este efecto estuvo com pletam ente ausente en aquellos experim entos

donde se ut ilizó RN, o I gGs de los cont roles sanos o enferm os (p> 0,05

com parando la frecuencia inicial versus final) . Esta ausencia de efecto

tam bién fue observada en las t res m uest ras restantes de las I gGs-ELA

analizadas, las cuales fueron incapaces de aum entar la act ividad sinápt ica

espontánea por encim a de los niveles basales iniciales (p> 0,05 com parando

frecuencia inicial versus final) . Las diferencias observadas se hicieron m ás

m arcadas al agrupar los datos, especialm ente ent re ELA1-5 y ELA6-8

(Figura 5 .2 B ; recuadro interno) .

54

5 - Resultados

55

Figura 5 .2 : Regist ros de MEPPs de preparaciones de m úsculo dia fragm a de ra tón. Los músculos fueron incubados con RN o ant icuerpos purif icados de pacient es. A) Regist ros int racelulares representat ivos adquiridos ant es (t =0h) o después (t =4h) de la incubación. B) Cuant if icación de la f recuencia de MEPPs relat iva al comienzo del experiment o. * p<0,05 y ** p<0,001 comparando las f recuencias iniciales y f inales de MEPPs. El recuadro int erno muest ra la combinación de los datos (* p<0,01 vs CS, ** p<0,001 vs CS y # p<0,001 vs ELA1-5). El número dent ro de las barras indica la cant idad de PNMs est udiadas en cada condición experimental. Barra blanca = RN, barras gris claro = CS, barras gris oscuro = CE, barras negras = ELA.

5 - Resultados

Para obtener una m ejor com prensión de el/ los sit io/ s de acción de

estos ant icuerpos, llevam os a cabo un estudio de inm uno- fluorescencia

indirecta, em pleando las I gGs de pacientes con ELA o individuos cont roles

com o ant icuerpos pr im arios, adem ás de ut ilizar α-bungarotoxina acoplada a

tet ram et ilrodam ina com o un m arcador post -sinápt ico de la PNM.

I nteresantem ente, las m ism as m uest ras de los pacientes con ELA que

produjeron una potenciación sinápt ica, tam bién presentaron react ividad

cont ra la PNM de diafragm a de ratón (Figuras 5 .3 y 5 .4 ; p< 0,05

com parando ELA versus cont rol de isot ipo) . Las intensidades de

fluorescencia en estos casos resultaron ser ent re 3 y 22 veces m ayor a las

encont radas en los cont roles sanos (Figuras 5 .3 y 5 .4 ; p< 0,05

com parando ELA versus CS) . Com o se m uest ra en el recuadro de la Figura

5 .4 A , los datos agrupados tam bién m ost raron diferencias m arcadas.

Por ot ro lado, la inm unoreact ividad de las restantes I gGs-ELA no

resultó significat ivam ente diferente a la señal de fondo (Figura 5 .4 ;

p> 0,05 com parando ELA versus el cont rol de isot ipo) ni a los cont roles

sanos (p> 0,05 com parando ELA versus CS) , excepto cuando se

consideraron en conjunto. En este últ im o caso sí se observaron diferencias

estadíst icam ente significat ivas (p< 0,05 com parando ELA6-8 versus CS) .

56

5 - Resultados

57

Figura 5 .3 : I nm uno- f luorescencia de la PNM de ra tón . Las secciones (40 μm) de músculo diaf ragma de rat ón fueron incubadas con las IgGs purif icadas de los pacientes con ELA, CS o CE. La visual ización del ant icuerpo primario se real izó con un ant icuerpo secundario ant i-IgGhumano acoplado a FITC. Como marcador post -sinápt ico de la PNM se ut i l izó α-bungarotoxina conj ugada a TMR (RAch, recept or de acet i lcol ina). Se muest ran micrograf ías confocales represent at ivas del t ej ido inmuno-marcado. Las fot os en la úl t ima columna muest ran las imágenes superpuest as. Barra: 25 μm. Aumento = 600X.

Mient ras que la m ayoría de las m uest ras cont roles perm anecieron

dent ro de los niveles de unión no específicos (p> 0,05 com parando las

m uest ras cont roles versus el cont rol de isot ipo) , dos de los seis cont roles

enferm os evidenciaron resultados posit ivos en este ensayo de inm uno-

m arcación (Figura 5 .4 ; p< 0,01 CE1 y CE2 versus el cont rol de isot ipo o

CS) . Curiosam ente estos ant icuerpos fueron purificados del suero de los

5 - Resultados

58

Figura 5 .4 : Medición de la inm uno- f luorescencia de PNM de ra tón. Cuant if icación de la int ensidad de f luorescencia normalizada al cont rol de isot ipo. * p<0,05, ** p<0,01 y *** p<0,001 comparando con los CS. El recuadro int erno muest ra la combinación de los dat os (* p<0,05 vs CS, ** p<0,001 vs CS y # p<0,001 vs ELA1-5). El número dent ro de las barras indica la cant idad de PNMs est udiadas en cada condición experiment al (N=7 animales).

pacientes que padecían enferm edades auto- inm unes dir igidas cont ra los

com ponentes de la PNM, com o son el síndrom e m iasténico de Lam bert -

Eaton (CE1) y la m iastenia gravis (CE2) .

Un aspecto im portante que debe recalcarse es la falta de efecto

elect rofisiológico y unión a la PNM en todos los casos de ELA fam iliar

analizados (Figuras 5 .2 y 5 .4 ; CE4-6) . En este sent ido, todas las m uest ras

purificadas de los pacientes con la variante hereditar ia se com portaron de

form a esencialm ente sim ilar a los cont roles sanos (p> 0,05 com parando

CE4, CE5 o CE6 versus CS) .

5 - Resultados

5 .2 - React iv idad de las I gGs- ELA cont ra la PNM de los ra tones

CaV2 .1 - / - y Ca V2 .2 - / -

Existe una am plia variedad de evidencias que sugieren una asociación ent re

las I gGs-ELA y los CCVDs de t ipo P/ Q (Llinas et al. 1993; Sm ith et al. 1994;

Carter y Mynlieff 2003; Pagani et al. 2006) . Teniendo en cuenta estos

antecedentes, junto con la interacción específica que algunas I gGs-ELA

m ost raron hacia la PNM de ratón en el presente estudio, nos propusim os

evaluar si la ausencia de la subunidad α1 del canal de Ca2+ de t ipo P/ Q o N

podía m odificar la unión de los ant icuerpos de ELA a esta est ructura

neuronal.

Com o se m uest ra en la Figura 5 .5 , las I gGs-ELA no evidenciaron una

interacción apreciable hacia los m úsculos diafragm a de ratones carentes de

la subunidad α1 específica del canal de Ca2+ t ipo P/ Q (p< 0,001 com parando

los anim ales CaV2.1+ / + versus CaV2.1 - / -) . En estos casos, los valores de

intensidad de fluorescencia en los ratones carentes de la subunidad α1A no

resultaron estadíst icam ente diferentes de los obtenidos con los individuos

cont roles (Figura 5 .5 B ; p> 0,05 com parando ELA versus CS) . Esta m arcada

dism inución en la interacción de las I gGs-ELA tam bién puede apreciarse en

el recuadro de la Figura 5 .5 B , el cual m uest ra los datos organizados en

grupos.

En cont raste con estos resultados, los ant icuerpos de los CE que

m ost raron afinidad por la PNM de los ratones WT (Figura 5 .4 ; CE1 y CE2)

tam bién interactuaron con las secciones de m úsculo de los ratones CaV2.1 - / -

(Figura 5 .5 B ; p> 0,05 com parando los anim ales CaV2.1+ / + versus CaV2.1 - / -) .

59

5 - Resultados

60

Figura 5 .5 : I nm uno- f luorescencia de la PNM de los ra tones carentes del canal de Ca 2 + de t ipo P/ Q. Las secciones (40 μm) de músculo diaf ragma de los ratones CaV2.1-/ - o WT (P16-23) fueron expuestas a las IgGs purif icadas de los pacient es con ELA, CS o CE. La presencia de los ant icuerpos primarios se det erminó según lo especif icado ant eriorment e. A) Micrograf ías confocales represent at ivas de la PNM. Las fot os en la úl t ima columna muest ran las imágenes superpuest as. Barra: 25 μm. Aument o = 600X. B) Det erminación de la int ensidad de f luorescencia normalizada al cont rol de isot ipo. * p<0,05 y ** p<0,001 comparado con los músculo WT, respect ivament e. El número de PNMs anal izadas en cada condición experiment al varió ent re 16 y 30 (N=5 animales). El recuadro int erno muest ra la combinación de los datos (* p<0,001 vs CaV2.1+/ +).

5 - Resultados

Adicionalm ente, la diferencia en la react ividad m encionada

anteriorm ente no fue detectada al com parar los m úsculos de los ratones WT

y aquellos carentes del canal de Ca2+ de t ipo N (Figura 5 .6 ) . La interacción

de los ant icuerpos ELA con la PNM m ost ró sim ilares niveles para am bos

genot ipos (p> 0,05 com parando los anim ales CaV2.2+ / + versus CaV2.2 - / -) ,

salvo en el caso de las m uest ras ALS5 y ALS7 que exhibieron un pequeño

aum ento (p< 0,001 para ELA5 y p< 0,05 para ELA7, com parando los

anim ales CaV2.2+ / + versus CaV2.2 - / -) . La agrupación de los datos m ost ró un

increm ento discreto pero significat ivo en la fluorescencia de las m uest ras

ELA1-5 en el tej ido t ransgénico (Figura 5 .6 B ; recuadro interno; p< 0,05

com parando los anim ales WT versus CaV2.2 - / -) . Adicionalm ente, ninguno de

los CE que reaccionó cont ra los term inales de los anim ales WT m odificó su

nivel de unión en ausencia de la subunidad CaV2.2 (Figura 5 .6 B ; CE1 y

CE2; p> 0,05 com parando los anim ales WT versus CaV2.2 - / -) .

5 .3 - Funciona lidad de las I gGs- ELA en la act iv idad espontánea de la

PNM de los ra tones Ca V2 .1 - / -

Con el objet ivo de evaluar la relevancia funcional de la dism inución

encont rada en la interacción de las I gGs-ELA con la PNM de los ratones

CaV2.1 - / -, testeam os el efecto de los ant icuerpos en la act ividad sinápt ica

espontánea de los m úsculos de los ratones norm ales y carentes de la

subunidad form adora del poro. Desafortunadam ente, debido a la escasez de

m uest ra, no pudim os incluir en este estudio todas las I gGs-ELA ensayadas

previam ente.

61

5 - Resultados

62

Figura 5 .6 : I nm uno- f luorescencia de la PNM de los ra tones carentes del canal de Ca 2 + de t ipo N. Las secciones (40 μm) de músculo diaf ragma de los ratones CaV2.2-/ - o WT (P18) fueron incubadas con las IgGs purif icadas de los pacient es con ELA, CS o CE. La presencia de los ant icuerpos primarios se det erminó según lo especif icado ant eriorment e. A) Fotos represent at ivas de la PNM. Los paneles en la úl t ima columna muest ran las imágenes superpuest as. Barra: 25 μm. Aument o = 600X. B) Cuant if icación de la int ensidad de f luorescencia normalizada al cont rol de isot ipo. * p<0,05 y ** p<0,001 comparando con los músculos WT. El número de placas anal izadas en cada condición experiment al varió ent re 15 y 25 (N=4 animales). El recuadro int erno muest ra la combinación de los datos (* p<0,05 vs CaV2.2+/ +).

5 - Resultados

Luego de un período de incubación de 4 h, la m itad de las m uest ras

analizadas increm entaron significat ivam ente la liberación de acet ilcolina de

los term inales WT, llevando la frecuencia de act ividad espontánea a valores

ent re 40 y 60 veces m ayores a los iniciales (Tabla 5 .1 ; p< 0,001

com parando los anim ales CaV2.1+ / + versus CaV2.1 - / -) . A pesar de que los

preparados de m úsculo de los ratones de la línea sv129 resultaron ser m ás

sensibles al efecto de los ant icuerpos que los correspondientes a Swiss

(Figura 5 .2 B ) , es im portante destacar que am bos resultados están

esencialm ente en concordancia.

I nteresantem ente, aquellos ant icuerpos que prom ovieron un

increm ento en la tasa de liberación de neurot ransm isor en la PNM no fueron

capaces de aum entar la frecuencia de MEPPs por encim a de los valores

iniciales en los m úsculos de los ratones CaV2.1 - / - (Tabla 5 .1 ; p< 0,001

com parando los anim ales WT y CaV2.1 - / -) . Sin em bargo, todos los

preparados de los ratones nulos para la subunidad CaV2.1 retuvieron su

habilidad de responder a un est ím ulo despolar izante (KCl 15 m M)

increm entando significat ivam ente su frecuencia de act ividad espontánea

luego de un período de incubación de 10 m in (Tabla 5 .2 ; p< 0,001

com parando la frecuencia de KCl con la inicial y la de 4 h) .

63

5 - Resultados

Tabla 5.1 : Frecuencia de MEPPs normalizada al comienzo del experimento, luego de 4 h de incubación con las IgGs-ELA indicadas. Ent re parént esis se det al la el número de f ibras anal izadas (provenient es de 4 animales por genot ipo).

genot ipo

CaV2.1+/ + CaV2.1-/ -

0 h 4 h 0 h 4 h ELA2 1,00±0,09 (28) 45±11† (17) 1,00±0,09 (23) 0,79±0,07* (20) ELA5 1,00±0,09 (19) 59±8† (17) 1,00±0,08 (23) 0,73±0,07* (21) ELA7 1,00±0,07 (39) 0,70±0,05 ( 33) 1,0±0,1 (21) 0,78±0,09 (20)

Pac

ien

te

ELA8 1,0±0,4 (23) 0,54±0,07 (19) 1,0±0,1 (15) 1,0±0,2 (14)

† p<0,001 vs f recuencia inicial

* p<0,001 vs f recuencia de CaV2.1+/ + Tabla 5.2 : Frecuencia de MEPPs de músculo diaf ragma CaV2.1-/ - al comienzo del experiment o y luego de una incubación secuencial de 4 h con la IgG-ELA5 y 10 min con una solución de KCl 15 mM. Ent re parént esis se det al la el número de f ibras anal izadas (provenient es de 2 animales).

0 h 4 h KCl 15 mM

ELA5 1,00±0,08 (7) 0,9±0,1 (7) 69±14* (7)

* p<0,001 vs f recuencia inicial y 4 h

5 .4 - Estudio de la inm uno- m arcaci ón de las I gGs- ELA en cerebelo,

cor teza cerebra l y m édula espina l

Para caracter izar en m ayor detalle la react ividad de los ant icuerpos de ELA

ut ilizando ot ros sust ratos neuronales relevantes para la patofisiología de la

enferm edad, realizam os ensayos de inm uno- fluorescencia en cortes de

m édula espinal y corteza cerebral de ratones.

La gran m ayoría de los ant icuerpos de los pacientes con ELA

presentaron una afinidad significat iva hacia las est ructuras m otoneuronales

del asta vent ral, especialm ente hacia el citoplasm a celular (Figura 5 .7 ) .

Esto llevó a que los datos agrupados tam bién resultaran significat ivam ente

m ás elevados com parados con los CS (Figura 5 .7 B ; recuadro interno) .

64

5 - Resultados

Algunos ant icuerpos revelaron adem ás capacidad de unión a los

com ponentes nucleares, com o puede observarse para ELA5 (Figura 5 .7 A ) .

El pat rón obtenido en la m édula espinal, sin em bargo, no resultó

sim ilar al hallado en los cortes de m úsculo diafragm a, ya que tanto las

m uest ras que reaccionaron con la PNM com o las que no lo hicieron,

exhibieron interacción con las neuronas m otoras. Este resultado se ve

reflejado en la separación de los datos en estos dos grupos (Figura 5 .7 B ;

recuadro interno) . Sin em bargo, existe una tendencia significat iva de las

m uest ras ELA6-8 a presentar una m enor react ividad hacia las

m otoneuronas infer iores respecto de las ELA1-5, comportam iento que ya se

había apreciado en la PNM, con diferencias m as acentuadas.

En cuanto a los cont roles sanos, todas las m uest ras evaluadas

m ost raron niveles de inm unoreact ividad dent ro de los valores basales.

Por su parte, los ant icuerpos de cuat ro CE exhibieron diferencias respecto

de los CS, con valores ya sea por encim a (CE1, CE3 y CE7) o por debajo de

estos últ im os (CE2) , haciendo que los CE sean en form a colect iva

significat ivam ente m as elevados (Figura 5 .7 B ; recuadro interno) .

Al analizar la unión de los ant icuerpos a las rodajas conteniendo la

corteza m otora pr im aria de ratón, ninguna de las m uest ras de los pacientes

con ELA o los individuos cont roles exhibió una afinidad por el tej ido m ayor a

la unión no específica presente en el cont rol de isot ipo ( resultados no

m ost rados) .

65

5 - Resultados

66

Figura 5 .7 : I nm uno- f luorescencia de la m édula espin a l. Las secciones (150 μm) de médula espinal de los rat ones fueron incubadas con las IgGs purif icadas de los pacientes con ELA, CS o CE. La presencia de los ant icuerpos primarios fue revelada usando un secundario ant i-IgGhumano acoplado a FITC. A) Imágenes representat ivas de las mot oneuronas resident es en el asta vent ral de la médula espinal. Barra: 25 μm. Aument o = 600X. B) Cuant if icación de la int ensidad de f luorescencia en el soma de las mot oneuronas, normalizada al cont rol de isot ipo. * p<0,01 y ** p<0,001 comparando con los CS. El recuadro int erno muest ra la combinación de los dat os (* p<0,001 vs CS y # p<0,01 vs ELA1-5). El número dent ro de las barras indica la cant idad de células est udiadas en cada condición experiment al (N=5 animales). Barras blancas = CS, barras grises = CE, barras negras = ELA.

5 - Resultados

Un análisis sim ilar en los cortes de cerebelo reveló que la m ayoría de

las I gGs-ELA m ost raron afinidad por los ant ígenos presentes en las células

de Purkinje (Figura 5 .8 ; p< 0,05 com parando ELA versus el cont rol de

isot ipo) . Este pat rón dio lugar a que los datos de ELA agrupados (ya sea en

su totalidad o separados en ELA1-5 y ELA6-8) resultaran significat ivam ente

m ayores a los cont roles sanos (Figura 5 .8 B ; recuadro interno) . Por su

parte, el grupo ELA6-8 tam bién evidenció un aum ento considerable respecto

al ELA1-5. La m ayor parte de las m uest ras evidenciaron afinidad

principalm ente hacia los com ponentes som át icos de estas neuronas (Figura

5 .8 A ; ELA3 y ELA7) , m ient ras que ot ras m ost raron unión hacia ant ígenos

pr incipalm ente nucleares (ELA5) o cont ra am bos en diferente grado (ELA2 y

ELA8) . La inm unoreact ividad hacia las células residentes en las capas

m olecular y granular del cerebelo fue considerablemente m enor a la

encont rada hacia las neuronas de Purkinje, excepto para la m uest ra ELA5

donde se pudo apreciar una generalizada t inción de los núcleos celulares.

Adem ás, para el caso de ELA3 se observó una unión de los ant icuerpos

hacia com ponentes citoplasm át icos de las células de la capa m olecular y

granular.

67

5 - Resultados

68

Figura 5 .8 : I nm uno- f luorescencia de cerebelo. Los cort es (150 μm) de cerebelo de los ratones se incubaron con las IgGs purif icadas de los pacient es con ELA, CS o CE. La presencia de los ant icuerpos primarios fue revelada usando un ant icuerpo ant i-IgGhumano acoplado a FITC. A) Micrograf ías confocales represent at ivas de las neuronas de Purkinj e. M y G denot an las capas cerebelares molecular y granular, respect ivament e. Barra: 25 μm. Aument o = 600X. B) Det erminación de la int ensidad de f luorescencia en el soma de las células de Purkinj e, normalizada al cont rol de isot ipo. * p<0,05, ** p<0,01 y *** p<0,001 comparando con los CS. El recuadro int erno muest ra la combinación de los dat os (* p<0,001 vs CS y # p<0,001 vs ELA1-5). El número dent ro de las barras indica la cant idad de células est udiadas en cada condición experimental (N=7 animales). Barras blancas = CS, barras grises = CE, barras negras = ELA.

5 - Resultados

Por su parte, ninguno de los cont roles sanos reveló una unión

apreciable a las est ructuras cerebelares (Figura 5 .8 ; p> 0,05 com parando

los cont roles sanos versus el cont rol de isot ipo) , m ient ras que dos de las

m uest ras de CE (CE1 y CE7) interactuaron significat ivam ente con los

ant ígenos de esta est ructura. Para el caso de CE1, esta interacción se

produjo tanto hacia com ponentes nucleares com o citoplasm át icos (Figura

5 .8 A ) , m ient ras que CE7 evidenció afinidad m ayorm ente por estos últ im os

( resultado no m ost rado) .

Realizando un estudio m ás detallado sobre el t ipo celular hacia el cuál

los ant icuerpos estaban reaccionando, encont ram os que algunas de las

m uest ras presentaron afinidad por ast rocitos, tanto en la m édula espinal

(Figura 5 .9 A , ELA1) com o en cerebelo (Figura 5 .9 B , ELA1) . Esta

característ ica se hizo evidente por la elevada co- localización de la señal de

las I gGs-ELA con la del m arcador ast rocít ico GFAP (proteína glial fibr ilar

acídica) . Sin em bargo, la presencia de estos ant icuerpos ant i-ast rocitos no

fue un fenóm eno generalizado, com o se m uest ra en la Figura 5 .9 para el

caso de ELA2. En los cortes espinales tam bién pudo apreciarse unión de los

ant icuerpos de ELA a ot ros t ipos celulares.

69

5 - Resultados

70

Figura 5 .9 : I nm unoreact iv idad de I gGs- ELA hacia as t rocitos. Las rodaj as (50 μm) de t ej ido de rat ones CaV2.1+/ + (P18) fueron incubadas con las IgGs purif icadas de pacient es con ELA (primera columna) j unt o con un ant icuerpo específ ico cont ra una prot eína ast rocít ica, GFAP (segunda columna). La det ección de los ant icuerpos primarios se real izó con un secundario ant i-IgGhumano acoplado a FITC y un ant i-IgGconej o unido a TMR, respect ivament e. En la últ ima columna se muest ra la superposición de ambos canales. Barra: 20 μm. Aument o = 600X. A) Micrograf ías confocales represent at ivas de cort es de médula espinal lumbar, en la región correspondient e a la sust ancia blanca próxima a las neuronas motoras. B) Imágenes t omadas de secciones de cerebelo, en la zona de sust ancia blanca (SB) ubicada ent re dos capas de células granulares (G).

5 - Resultados

En lo que respecta a la inm unoreact ividad hacia neuronas del asta

vent ral, encont ram os que no todas las m otoneuronas m arcadas con el

ant icuerpo ant i-NeuN (una proteína neuronal nuclear) unieron I gGs de

pacientes con ELA (Figura 5 .1 0 A , células rojas en la últ im a colum na) . Sin

em bargo, la localización de estas m otoneuronas NeuN+ I gG-ELA- no m ost ró

ninguna preferencia por regiones vent ro-m ediales o vent ro- laterales

(Figura 5 .1 0 B ) , encont rándose a todo lo largo del eje m edio- lateral.

Tam bién pudo observarse que los ant icuerpos de pacientes t iñeron ot ros

t ipos celulares no neuronales de tam año relat ivam ente m enor (Figura

5 .1 0 A , células verdes en la últ im a colum na) .

Tam poco se encont ró ninguna dist r ibución preferencial de las células

NeuN+ I gG-ELA- en ot ras regiones espinales (com o la m édula toráxica) , ni

correlación de la intensidad de m arca de las I gGs hum anas con niveles de

expresión de proteínas buffers de Ca2+ com o parvalbúm ina o calbindina

( resultados no m ost rados) .

El m ism o t ipo de estudio realizado sobre cortes de cerebelo reveló

una m arca general de las I gGs-ELA hacia neuronas granulares (Figura

5 .1 1 , capa granular) , con diferentes grados de inm unoreact ividad ent re

m uest ras. En esta capa de la corteza cerebelar tam bién se observó una

t inción m uy evidente hacia células NeuN- (Figura 5 .1 1 , capa granular,

flechas) , que sin em bargo m ost raron una im portante expresión del

m arcador de neuronas GABAérgicas GAD65/ 67 (Figura 5 .1 2 , capa granular,

flechas) . Por su parte, la m arca de I gGs-ELA en la capa m olecular se

encont ró asociada tanto al som a de células NeuN+ (Figura 5 .1 1 , capa

m olecular) com o a procesos de neuronas GABAérgicas (Figura 5 .1 2 , capa

m olecular) .

71

5 - Resultados

72

Figura 5 .1 0 : I nm unoreact iv idad de I gGs- ELA hacia m otoneuronas infer iores. Las secciones (50 μm) de médula espinal lumbar de rat ones CaV2.1+/ + (P18) fueron incubadas con las IgGs purif icadas de pacient es con ELA j unt o con un ant icuerpo cont ra un marcador neuronal nuclear, NeuN. La det ección de los ant icuerpos primarios se l levó a cabo con un secundario ant i-IgGhumano acoplado a FITC y un ant i-IgGrat ón conj ugado con TMR, respect ivament e. A) Micrograf ías confocales representat ivas de la zona del ast a vent ral . En la úl t ima columna se muest ra la superposición de ambos canales. Barra: 20 μm. Aument o = 600X. B) Imágenes t omadas a menor aumento que en A correspondient e a t oda la región del ast a vent ral . En la misma se encuent ra delimit ado el borde de la sust ancia gris (l ínea punt eada) y se especif ica la orient ación del cort e (L = lat eral, V = vent ral). Se muest ra solament e la superposición de la señal de los canales verde y roj o. Barra: 50 μm. Aument o = 200X.

5 - Resultados

73

Figura 5 .1 1 : I nm uno- f luorescencia de I gGs- ELA y neu ronas cerebelares. Las rodaj as (50 μm) de t ej ido de rat ones CaV2.1+/ + (P18) fueron incubadas con las IgGs purif icadas de pacient es con ELA (primera columna) y con un ant icuerpo cont ra NeuN (segunda columna). La det ección de los ant icuerpos primarios se real izó con un secundario ant i-IgGhumano acoplado a FITC y un ant i-IgGrat ón unido a TMR, respect ivamente. En la últ ima columna se muest ra la superposición de ambos canales. En las micrograf ías correspondient es a la capa granular se señalan con f lechas aquel las células NeuN-negat ivas marcadas con las IgGs-ELA, mient ras que en los panales inferiores se denot an células doble posit ivas. Barras: 20 μm. Aument o = 600X.

5 - Resultados

74

Figura 5 .1 2 : I nm unoreact iv idad de I gGs- ELA hacia i nterneuronas cerebelares. Las secciones (50 μm) de cerebelo de los rat ones salvaj es (P18) fueron incubadas con las IgGs purif icadas de pacient es con ELA (primera columna) y con un ant icuerpo cont ra un marcador de neuronas GABAérgicas, GAD65/ 67 (segunda columna). La det ección de los ant icuerpos primarios se real izó con un secundario ant i-IgGhumano acoplado a FITC y un ant i-IgGconej o unido a TMR, respect ivament e. En la úl t ima columna se muest ra la superposición de los canales. En las fot os de la capa granular se marcan con f lechas aquel las int erneuronas GABAérgicas (GAD-posit ivas) con una señal signif icat iva de IgGs-ELA. Barra: 20 μm. Aument o = 600X.

5 - Resultados

5 .5 - Corre lación ent re la m odul ación sinápt ica y la inm uno-

react iv idad t isular

Realizando un estudio involucrando todos los parám etros analizados hasta

el m om ento se encont ró que exist ía una correlación significat iva ent re el

grado de unión de los ant icuerpos ELA a la PNM y tanto la frecuencia de

potenciales m iniatura (Figura 5 .1 3 A ) com o el grado de t inción de las

m otoneuronas espinales (Figura 5 .1 3 B ) . Esta correlación estuvo ausente al

realizar la com paración con la inm unoreact ividad en las neuronas de

Purkinje (Figura 5 .1 3 C ) . Por ot ro lado, no se encont ró relación al analizar

una posible asociación ent re la m odulación sinápt ica y la interacción de las

I gGs-ELA con el tej ido cerebelar (Figura 5 .1 3 E ) o espinal (Figura 5 .1 3 F ) .

Estos últ im os parám etros tam poco m ost raron un com portam iento sim ilar al

ser analizados por el test de correlación (Figura 5 .1 3 D ) .

5 .6 - Efecto de la deleción de Ca V2 .1 sobre la react iv idad de las

I gGs- ELA hacia e l sistem a nervioso cent ra l

Nuest ro próxim o paso consist ió en establecer si la interacción de los

ant icuerpos de ELA con las est ructuras neurales cent rales m encionadas

previam ente dependía de la presencia de la subunidad CaV2.1, com o había

sido apreciado en los experim entos con la PNM (Figura 5 .5 ) , o si se t rataba

de un fenóm eno solo presente en los term inales m otoneuronales.

75

5 - Resultados

76

Figura 5 .1 3 : Corre lación ent re la inm unoreact iv ida d y la inducción sinápt ica. En los gráf icos se muest ra la relación ent re la f recuencia de pot enciales miniat ura (MEPPs) y la int ensidad de f luorescencia en t odas las est ruct uras neuronales est udiadas. En el ext remo superior derecho de cada recuadro se det al la el valor del coef icient e de correlación de Spearman (r) j unt o con su signif icancia est adíst ica (p). El anál isis de correlación comprendió los datos de t odos los pacient es ELA, excepto en A donde se excluyó el punt o señalado con el ast erisco. En A y B (las únicas correlaciones signif icat ivas) se incluyó además el aj ust e l ineal de los datos (l ínea cort ada). Los dat os para la confección de los gráf icos fueron ext raidos de las Figuras 5.2B, 5.4, 5.7B y 5.8B.

5 - Resultados

La ausencia de la subunidad α1 que part icipa en la form ación del poro

del canal de Ca2+ de t ipo P/ Q no m odificó en form a apreciable los niveles de

inm uno-m arcación en las rodajas de tej ido espinal, com o puede observarse

en la Figura 5 .1 4 . La única excepción fue la m uest ra ELA6, la cual m ost ró

una m ayor interacción hacia las m otoneuronas infer iores de los anim ales

t ransgénicos (Figura 5 .1 4 B ) .

Por ot ro lado, si bien la intensidad de m arca obtenida en estos

ensayos es m enor en com paración con los experim entos realizados con la

línea Swiss (Figura 5 .7 ) , el grupo de las m uest ras que presentó

ant icuerpos cont ra com ponentes m otoneuronales en ambos casos es

esencialm ente idént ico.

Con respecto a los ensayos realizados en cerebelo, no se encont ró

una diferencia m arcada ent re los ratones salvajes y los carentes de la

subunidad CaV2.1 (Figura 5 .1 5 ) . Sin em bargo, sí se encont ró una

interacción con el anim al t ransgénico significat ivam ente m ayor para el caso

de la m uest ra ELA7 (Figura 5 .1 5 B ) , hecho que cont r ibuyó a que el grupo

no react ivo hacia la PNM m ost rara un ligero increm ento en su unión al som a

de las neuronas de Purkinje (Figura 5 .1 5 B ; recuadro interno) .

Adicionalm ente, los ant icuerpos purificados del CS3 evidenciaron un ligero

decrem ento en su unión al tej ido cerebelar de los anim ales CaV2.1 - / -

(Figura 5 .1 5 B ) .

77

5 - Resultados

78

Figura 5 .1 4 : I nm uno- f luorescencia de m édula espina l de los ra tones carentes del cana l de Ca 2 + t ipo P/ Q. Los cort es (150 μm) de la médula espinal de los rat ones CaV2.1-/ - o WT (P16-23) fueron incubados con las IgGs purif icadas de los pacient es con ELA, CS o CE. La det ección de los ant icuerpos primarios se real izó según lo descript o ant eriorment e. A) Imágenes representat ivas de las mot oneuronas resident es en el asta vent ral de la médula espinal. Barra: 25 μm. Aument o = 600X. B) Cuant if icación de la int ensidad de f luorescencia en el soma de las motoneuronas espinales, normal izada al cont rol de isot ipo. * p<0,01 comparado con WT. El número de células anal izadas en cada condición experiment al varió ent re 15 y 24 (N=4 animales). El recuadro int erno muest ra la combinación de los dat os.

5 - Resultados

79

Figura 5 .1 5 : I nm uno- f luorescencia de cerebelo de ra tones carentes del canal de Ca 2 + de t ipo P/ Q. Las rodaj as (150 μm) de cerebelo de los ratones CaV2.1-/ - o WT (P16-23) fueron incubadas con las IgGs purif icadas de los pacient es con ELA, CS o CE. La det ección de los ant icuerpos primarios se real izó según lo descript o ant eriormente. A) Micrograf ías confocales represent at ivas de las neuronas de Purkinj e. M y G denot an las capas cerebelares molecular y granular, respect ivament e. Barra: 25 μm. Aument o = 600X. B) Cuant if icación de la int ensidad de f luorescencia en el soma de las células de Purkinj e, normalizada al cont rol de isot ipo. * p<0,01 y ** p<0,001 comparado con WT. El número de células anal izadas en cada condición experimental varió ent re 15 y 39 (N=5 animales). El recuadro int erno muest ra la combinación de los datos (* p<0,05 vs CaV2.1+/ +).

5 - Resultados

Cabe destacar que en térm inos generales, el pat rón de unión

obtenido hacia el tej ido cerebelar de los anim ales salvajes fue sim ilar al

observado anter iorm ente en los ratones de la cepa Swiss (Figura 5 .8 ) . La

t inción observada con las m uest ras de ELA, sin em bargo, resultó m ás

hom ogénea en térm inos de intensidad, en cont raste con la m arcada

diferencia existente ent re las m uest ras react ivas hacia la PNM y las no

react ivas, encont rada en los pr im eros experim entos.

5 .7 - Análisis de la interacción de las I gGs- ELA con la subunidad α1

de l canal de Ca 2 + de t ipo P/ Q y ot ras proteínas presinápt icas

Dada la correlación sustancial encont rada ent re la expresión de la

subunidad α1 del canal de Ca2+ de t ipo P/ Q y tanto la unión com o la

m odulación sinápt ica ejercida por los ant icuerpos de ELA sobre la PNM,

decidim os evaluar una posible interacción directa de dichas I gGs con las

subunidades del canal de Ca2+ .

Para ello ut ilizam os la línea celular HEK293, un sistem a de expresión

heterólogo m uy ut ilizado en neurobiología (Thom as y Sm art 2005) .

Transfectam os las células con las subunidades CaV2.1, β2a y α2δ, y

analizam os los lisados celulares por western blot en búsqueda de

react ividad cont ra alguna banda que co-m igrara con la subunidad CaV2.1.

El análisis de las m em branas reveló que ninguna de las m uest ras

evaluadas m ost ró afinidad hacia la subunidad form adora del poro, al m enos

en las condiciones desnaturalizantes en las que se llevó a cabo el ensayo

(Figura 5 .1 6 A ) . Por su parte, com o m uest ra la Figura 5 .1 6 B , algunas de

las I gGs-ELA reaccionaron con una proteína desconocida cuyo peso

m olecular era en principio sim ilar al correspondiente para la subunidad α2δ

80

5 - Resultados

81

Figura 5 .1 6 : I nteracción de los an t icuerpos de ELA con e l canal P/ Q t ransfectado. Las células sobre-expresaron solo las subunidades accesorias (β2a y α2δ2, -) o el canal P/ Q int acto (CaV2.1, β2a y α2δ2, +). Las int eracciones con los ant icuerpos de ELA se evaluaron 36 h post -t ransfección. A) y B) West ern blot de los l isados de células HEK293 t ransfect adas (+, -) o no t ransfect adas (NT). Las membranas fueron incubadas con los ant icuerpos de los pacient es ELA (1:500) o con un ant icuerpo policlonal de conej o ant i-CaV2.1 (1:10.000) como cont rol de la expresión. En B se exhibe la misma membrana en una región de peso molecular diferent e a la most rada en A. C) Ensayo de inmuno-precipit ación de células HEK293 t ransfect adas, ut i l izando las IgGs-ELA o un ant icuerpo ant i-CaV2.1 como cont rol posit ivo. Una al ícuot a del l isado original (40 μg) fue corrida en el mismo gel para chequear la correct a expresión de la subunidad CaV2.1 (input ). También se anal izó en paralelo un cont rol negat ivo por omisión de los ant icuerpos (bol it as).

(m asa est im ada: 130 kDa) . Debido a que dicha banda tam bién fue

detectada en las células no t ransfectadas, se desest im ó su posterior

estudio.

Paralelam ente ut ilizam os una aproxim ación diferente para invest igar

la posibilidad de que los ant icuerpos de ELA interactuaran directa o

indirectam ente con el canal de Ca2+ , realizando ensayos de inm uno-

precipitación con los ext ractos de células t ransfectadas con las subunidades

de dicho canal.

5 - Resultados

A pesar de que la subunidad CaV2.1 pudo ser detectada fácilm ente en

los lisados originalm ente ut ilizados para el ensayo de inm uno-precipitación,

ninguna de las m uest ras testeadas m ost ró una interacción apreciable con el

canal de t ipo P/ Q (Figura 5 .1 6 C ) .

Adicionalm ente, em pleam os un sistem a alternat ivo de expresión del

canal de Ca2+ de t ipo P/ Q (Figura 5 .1 7 ) . En dichos experim entos se ut ilizó

una línea celular derivada de la HEK293 que expresaba este canal en form a

estable e inducible por tet raciclina ( línea T-Rex293) . Los resultados

encont rados fueron esencialm ente los m ism os que los observados con la

t ransfección t ransiente del canal (Figuras 5 .1 6 A y 5 .1 6 C) .

Em pleando el m ism o t ipo de ensayo, tam bién evaluam os varias

m uest ras en búsqueda de react ividad cont ra proteínas presentes en la pre-

sinapsis de un ext racto de sinaptosom as de cerebelo, tales com o

sinaptotagm ina I , sintaxina 1A, sinaptofisina y sinaptobrevina I I (Figura

5 .1 8 ) . En ninguno de los casos testeados pudim os detectar una interacción

ent re las I gGs-ELA analizadas y dichos com ponentes pre-sinápt icos, a pesar

de que estos últ im os resultaron ser fácilm ente detectables, ya sea en la

fracción proteica ut ilizada para el ensayo ( input ) y/ o en el cont rol posit ivo

del m ism o (Figura 5 .1 8 ; PRE) .

82

5 - Resultados

83

Figura 5 .1 7 : I nteracción de los ant icuerpos de ELA con e l cana l de Ca 2 + de t ipo P/ Q inducido. Las células sobre-expresaron solo las subunidades accesorias (β2a y α2δ2, -) o el canal P/ Q int acto (CaV2.1, β2a y α2δ2, +). Las int eracciones con los ant icuerpos de ELA se evaluaron 48 h post -inducción. A) West ern blot de los l isados de células T-rex293 expuestas (+) o no (-) al agent e inductor t et racicl ina durant e 48 h. Las membranas fueron incubadas con los ant icuerpos de pacient es con ELA (1:500) o con un ant icuerpo ant i-CaV2.1 (1:10.000) como cont rol de la expresión. B) Experiment os de inmuno-precipit ación de células T-rex293 inducidas (+) o no inducidas (-), ut i l izando las IgGs-ELA o un ant icuerpo ant i-CaV2.1 como cont rol posit ivo. Una f racción del l isado original (50 μg) fue procesada en el mismo gel para verif icar la correcta inducción de la subunidad CaV2.1 (input ). También se real izó un cont rol negat ivo por omisión de ant icuerpos (bol it as).

Figura 5 .1 8 : I nteracción de los ant icuerpos de ELA con proteínas presinápt icas. Los experiment os de inmuno-precipit ación con las IgGs-ELA se l levaron a cabo con prot eínas de la f racción cruda de membranas sinapt osomales purif icadas de cerebelo de rat ón (CaV2.1+/ +, P17). El análisis de los precipit ados se real izó por west ern blot , usando ant icuerpos cont ra varias prot eínas presinápt icas: sinaptot agmina I (1:500), sint axina 1A (1:1.000), sinapt of isina (1:400) y sinaptobrevina II (1:500). Una f racción del l isado inicial (40 μg) se corrió en paralelo (input ). Se incluyeron cont roles por omisión de ant icuerpos (bolit as) e inmuno-precipit ación con los ant icuerpos cont ra las propias prot eínas presinápt icas (PRE) a modo de cont rol posit ivo.

5 - Resultados

5 .8 - Análisis com parat ivo de la i nteracción de las I gGs- ELA con las

proteínas sinápt icas de los ra tones Ca V2 .1 + / + y Ca V2 .1 - / -

Con el objet ivo de realizar una com paración en la interacción de las I gGs-

ELA con las proteínas sinápt icas de los anim ales salvajes y aquellos

carentes de canales de Ca2+ de t ipo P/ Q, llevam os a cabo ensayos de

inm uno-precipitación. Los ext ractos em pleados en estos experim entos

com prendieron proteínas sinaptosom ales de la fracción cruda de m em brana,

purificadas a part ir de los anim ales CaV2.1+ / + o CaV2.1 - / -. El estudio se

cent ró pr incipalm ente en aquellas m uest ras de I gGs que habían presentado

una interacción select iva hacia los term inales de las m otoneuronas de los

ratones salvajes. Los com plejos que interactuaron con los ant icuerpos se

separaron por elect roforesis unidim ensional desnaturalizante y las bandas

proteicas se revelaron por t inción del gel con nit rato de plata.

Com o se puede observar en la Figura 5 .1 9 A , el pat rón de las

proteínas de ext ractos crudos de sinaptosom as cerebelares que se unieron

a las I gGs-ELA fue m uy sim ilar tanto ent re los genot ipos com o ent re las

m uest ras analizadas. En uno de los casos estudiados detectam os la

aparición de una banda diferencial de 61 kDa (Figura 5 .1 9 A ; aster isco en

ELA1) , pero por su alta inespecificidad se desest im ó su posterior estudio.

Tam bién se realizó el m ism o t ipo de estudio ut ilizando para el ensayo

proteínas provenientes de un ext racto total de cerebelo y aislando por

cent r ifugación aquellos com ponentes con afinidad hacia las I gGs-ELA. Com o

se aprecia en la Figura 5 .1 9 B , tam poco en este caso se pudo detectar el

reconocim iento por parte de los ant icuerpos de ELA de alguna proteína con

una expresión m enor en ratones CaV2.1 - / - respecto de los CaV2.1+ / + .

84

5 - Resultados

85

5 - Resultados

Figura 5 .1 9 : I nm uno- precipitación com parat iva de pr oteínas. de cerebelo as IgGs-ELA, eicas fueron

V V -prot eínas se separaron por cent rifugación y se eluyeron con buf fer Laemmli. Luego de la elect roforesis, el gel se t iñó con nit rat o de plat a, empleando un prot ocolo compat ible con espect romet ría de masa. Las cadenas pesadas (IgGCP) y l ivianas (IgGCL) de los ant icuerpos est án indicadas en el margen izquierdo. A la derecha de la f igura se muest ran los pesos moleculares de los pat rones. Una f racción de cada l isado inicial se corrió en paralelo (input ), así como t ambién el cont rol por omisión de ant icuerpos (bol it as). El ast erisco en (A) denot a una banda no específ ica (61 kDa) que no est uvo present e en t odos los experiment os.

Una aproxim ación experim ental alternat iva consist ió en llevar a cabo

una inm uno-precipitación a part ir de un ext racto total de proteínas

m usculares. El pat rón de react ividad obtenido en este caso fue m uy sim ilar

en todas las m uest ras analizadas, no detectándose ninguna interacción

presente en form a select iva en las I gGs-ELA con act ividad neuronal

potenciadora (Figura 5 .1 9 C ) .

5 .9 - Proteóm ica com parat iva de las proteínas sinápt icas de los

ra tones Ca V2 .1 + / + y Ca V2 .1 - / -

Con el propósito de estudiar cam bios globales en la expresión de las

proteínas sinápt icas en los ratones carentes de la subunidad CaV2.1, se

em prendió un abordaje que involucró el uso de técnicas de elect roforesis

m ult idim ensional acopladas a proteóm ica. Para ello, se purificaron los

sinaptosom as de cerebelo de los anim ales CaV2.1+ / + y CaV2.1 - / - m ediante

una cent r ifugación diferencial en gradiente discont inuo de sacarosa. Las

proteínas sinápt icas así aisladas se analizaron por m edio de una

elect roforesis bidim ensional que im plicó una prim era separación de la

m uest ra según su punto isoeléct r ico, seguida de un segundo

Las prot eínas provenient es de la f racción cruda de membranas de sinaptosomas (A) o de un ext ract o t ot al de cerebelo (B) o músculo (C) se precipit aron con lmediant e el uso de bolit as de agarosa unidas a prot eína G. Las f racciones protaisladas a part ir de rat ones Ca 2.1+/ + o Ca 2.1-/ - (P18-20). Los complej os IgGs

86

5 - Resultados

fraccionam iento de acuerdo al peso m olecular. La presencia de proteínas se

reveló por t inción con Coom assie coloidal.

Realizando la com paración ent re genot ipos del perfil proteico de los

sinaptosom as se pudo detectar que la m ayoría de las proteínas presentes

en la sinapsis se encont raron en niveles sim ilares cuando el canal de Ca2+

de t ipo P/ Q se hallaba ausente, com parando con los anim ales salvajes

(Figura 5 .2 0 ) .

No obstante, algunas proteínas m ost raron cam bios im portantes en

sus niveles sinápt icos en ratones CaV2.1 - / -, pudiéndose observar tanto

proteínas que se encont raron increm entadas (Figura 5 .2 0 ; círculos rojos)

com o dism inuidas (Figura 5 .2 0 ; círculos negros) en las m uest ras

t ransgénicas. Esta diferencia puede apreciarse m ás claram ente en la Figura

5 .2 1 , donde se grafica la cuant ificación de la densidad ópt ica de estas

proteínas diferenciales.

Con el objeto de proceder a la ident ificación de dichas proteínas

diferenciales, las m ism as fueron escindidas del gel y digeridas

exhaust ivam ente con t r ipsina. Cada m ezcla de pépt idos resultante de la

digest ión fue analizada por espect rom et ría de m asa ut ilizando un equipo del

t ipo MALDI -TOF-TOF. Para la ident ificación de cada m uest ra se ut ilizó tanto

la inform ación del m apeo pept ídico ( lista de picos de cada espect ro) com o

los datos de los fragm entos producto de la disociación inducida por colisión.

En la Figura 5 .2 2 se pueden observar los espect ros de m asa obtenidos

para aquellas proteínas que m ost raron una dism inución m arcada en los

anim ales CaV2.1 - / -, j unto con los picos em pleados para la fragm entación

87

5 - Resultados

88

5 - Resultados

89

Figura 5 .2 0 : Elect roforesis com parat iva. El anál isis de las muest ras de los sinapt osomas se real izó por elect roforesis en dos dimensiones. Las prot eínas (50 μg) se f raccionaron según su punt o isoeléct rico (en sent ido horizont al) y post eriorment e según su peso molecular (en sent ido vert ical). La det ección de las prot eínas se l levó a cabo por t inción con azul de Coomassie. En los ext remos derecho e inferior se muest ra el rango de peso molecular y pH anal izados, respect ivament e. Las prot eínas sinapt osomales se purif icaron a part ir de los ratones CaV2.1+/ + (A) o CaV2.1-/ - (B). Los círculos denot an aquellas prot eínas que most raron un aumento ( ) o una disminución ( ) en los ratones t ransgénicos respect o de los WT.

5 - Resultados

90

Figura 5 .2 1 : Cuant if icación de la intens idad de las proteínas diferencia les. Las prot eínas numeradas en los geles most rados en la Figura 5.20 fueron suj etas a un anál isis densit omét rico para est imar su int ensidad en cada genot ipo. El est udio de la densidad ópt ica se l levó a cabo con el programa ImageJ, analizando una región de int erés y post eriorment e sust rayendo la señal de fondo.

(Figura 5 .2 2 ; aster iscos) . Por su parte, la Tabla 5 .3 detalla los resultados

de las ident ificaciones de las ocho proteínas diferenciales, m ost rando

inform ación concerniente a cada m olécula encont rada y algunos de los

parám etros de dicha invest igación. Para el caso de la m uest ra núm ero 3, el

espect ro de m asa obtenido contenía pr incipalm ente los fragm entos producto

de la auto-digest ión de la t r ipsina, hecho que im posibilitó una ident ificación

estadíst icam ente significat iva de dicha proteína.

5 -

Re

su

lt

ad

os

91

79

9.0

16

42

.42

48

5.8

33

29

.2

Ma

ss (m

/z)

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

10

0

1940.9261

2211.1023

2751.2227

2225.1125

842.4973

1126.5492

806.0816

2083.0110

870.5336

1922.9180

1475.7595

2716.2078

3533.5569

2299.1833

1365.6359

2221.1301

2807.3093

1051.4902

1283.6509

2011.9606

1774.8854

1179.5771

950.4432

1622.8124

1713.7937

2564.1833

2408.0657

2869.3359

ma

sa (m

/z)

intensidad (% )

*

mu

estra 1

79

9.0

16

42

.42

48

5.8

33

29

.2

Ma

ss (m

/z)

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

10

0

p[

,]

1475.7581

2211.1111

1365.6394

1427.7858

1940.9335

2729.3911

3011.4128

1320.5793

1179.5945

1708.7515

1383.6700

842.5012

2225.1245

1109.4806

954.4537

1996.9685

2383.9678

1445.6700

1716.8466

832.2959

1193.6062

1838.9186

1037.5171

2075.9067

2285.9900

973.5167

1265.6296

1908.8195

1491.7417

2508.1199

905.4484

1118.5066

2399.0327

1329.6461

1605.7423

1390.6732

827.4060

2564.2107

1699.8264

1989.0021

2717.1121

2807.3325

2221.1477

2144.9714

1550.7148

1791.7639

1852.9011

1189.5988

3312.3430

2921.4033

3097.4478

ma

sa (m

/z)

intensidad (% )

*

*

mu

estra 2

79

9.0

16

42

.42

48

5.8

Ma

ss

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

10

0

1940.9438

2211.1250

842.5005

2239.1506

1923.9606

806.0964

1126.5605

2042.9990

1774.9148

881.2586

1051.4941

2300.1912

1282.6843

971.4418

1504.7051

1713.8020

1425.7507

1341.6863

2564.2322

2408.0852

2807.3359

1623.8231

1978.8988

2193.1326

mu

estra 3

intensidad (% )

ma

sa (m

/z)

5 - Resultados

92

Figura 5 .2 2 : Espect ros de m asa. Las prot eínas numeradas en la Figura 5.20 fueron escindidas del gel, digeridas con t r ipsina y los pépt idos result ant es fueron suj et os a una ident if icación por espect romet ría de masa. Para el lo se ut i l izó la t écnica de mapeo pept ídico empleando un espect rómet ro de masa del t ipo MALDI-TOF-TOF. Se muest ran en la f igura los espect ros de masa represent at ivos de las cinco prot eínas que present aron mayor expresión en los ratones salvaj es. Los números corresponden a los picos de masa de mayor int ensidad. Los ast eriscos indican los pépt idos ut i l izados para el anál isis de secuencia por medio de disociación inducida por col isión.

799.0 1642.4 2485.8

Mass (

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

1779.820

1

832

.3064

100

3.564

2

1940.957

6

162

8.954

2

2211.139

2

189

7.966

1

806

.4174

1826.913

1

230

7.081

1

2229.147

5

147

5.774

2

104

8.556

9

1560.813

6

110

6.549

4

1720.772

1

1312.697

4

192

2.955

7

208

3.039

3

1229.543

2

2565.236

8

238

3.997

1

881

.266

8

826

.4009

280

7.389

2

949

.4609

masa (m / z)

inte

nsi

da

d (

%)

*

* muest ra 4

799.0 1642.4 2485.8

Mass (

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100 133

7.662

6

194

0.987

9

2196.170

9221

1.167

5

842.5313

151

9.730

7

222

5.181

9

128

5.7173

1106

.572

8

192

3.993

7

118

1.6282

208

3.0652

806

.1155

135

9.645

9

871

.0464

2012.038

1

1025.557

3

256

5.263

9

229

9.248

8

280

8.407

2

171

4.871

2

1775.950

2

1427.819

5

masa (m / z)

inte

nsi

da

d (

%)

*

*

*

muest ra 5

5 - Resultados

Tabla 5.3: Resumen de la identificación proteica po r mapeo peptídico. La búsqueda en la base de dat os de NCBInr se real izó con el programa MASCOT.

muest ra prot eína ident if icada Especie PM

t eórico1,2 PM

experiment al cobert ura de

Score3 secuencia

1 Sust rat o de quinasa C rico en alanina, mirist oi lado (MARCKS)

Rat ón 30 kDa 90 kDa 160 (46) 10 %

2 Prot eína ácida soluble de cerebro-1 (BASP-1/ NAP-22/ CAP-23)

Rat ón 22 kDa 52 kDa 159 (49) 47 %

3 Muest ra no ident if icada - - 47 kDa - -

4 Gl iceraldehído-3-fosfat o deshidrogenasa

Rat ón 36 kDa 39 kDa 79 (54) 4 %

5 Cof i l ina-1 Rat ón 19 kDa 20 kDa 216 (54) 25 %

6 Secernina-1 Rat ón 46 kDa 57 kDa 177 (52) 29 %

7 Subunidad α de ATP sint et asa mit ocondrial

Rat ón 60 kDa 59 kDa 245 (53) 7 %

8 Calmodul ina Rat ón 17 kDa 16 kDa 171 (53) 19 %

1 PM: Peso molecular 2 Especie: Mus musculus (rat ón) 3 Los dat os est án expresados en relación al umbral a part ir del cual las ident if icaciones son signif icat ivas (número ent re parént esis).

5 .1 0 - I nteracción de las I gGs- ELA con la proteína BASP- 1

De todos los candidatos sugeridos por el análisis com parat ivo de

espect rom et ría de m asa, decidim os proseguir con el estudio m ás detallado

de la interacción de las I gGs-ELA con la proteína BASP-1. Para ello,

realizam os ensayos de inm uno-precipitación em pleando com o fuente de

proteínas ext ractos de cerebelo enriquecidos en rafts (Maekawa et al.

1999) .

Com o prim era aproxim ación, realizam os con algunas de las m uest ras

de ELA potenciadoras, un estudio com parat ivo ent re ext ractos proteicos de

ratones salvajes y CaV2.1 - / -. El pat rón de proteínas interactuantes con los

ant icuerpos puede apreciarse en la Figura 5 .2 3 A , donde no se observaron

diferencias apreciables ent re genot ipos, salvo la muest ra ELA4 que presentó

interacción con una proteína m ás representada en los ratones CaV2.1 - / -.

(Figura 5 .2 3 A , asterisco) . En part icular, no se advirt ió la presencia de

93

5 - Resultados

94

Figura 5 .2 3 : I nm uno- precipitación com parat iva de pr oteínas de rafts. Los ext ractos enriquecidos en prot eínas cerebelares de raf t s provenient es de rat ones CaV2.1-/ - (A) o CaV2.1+/ + (A y B) fueron incubados con las IgGs-ELA, y los complej os fueron aislados mediant e el uso de bolit as de agarosa conj ugadas a prot eína G. Para el experimento se ut i l izaron ratones de edad P16-20. Luego de la elect roforesis de los precipit ados, el gel (acri lamida 7,5 % v/ v) se t iñó con nit rat o de plat a, empleando un protocolo compat ible con espect romet ría de masa. La cadena pesada de los ant icuerpos (IgGCP) se indica en el margen izquierdo. A la derecha de la f igura se muest ran los pesos moleculares de los pat rones. El ast erisco en A denota una banda precipit ada con ELA4 enriquecida en la muest ra de ratones CaV2.1-/ -.

5 - Resultados

95

proteínas diferenciales en la zona de pesos m oleculares correspondientes a

los reportados para esta proteína, en las condiciones de nuest ro ensayo, es

decir la zona de 55-60 kDa (Maekawa et al. 1993; Maekawa et al. 1999) .

En un acercam iento alternat ivo, tam bién se llevó a cabo la

com paración de los pat rones de proteínas precipitadas con sueros que

presentaron o no afinidad hacia la PNM. En la Figura 5 .2 3 B se m uest ran

los resultados para las cuat ro m uest ras analizadas. Nuevam ente, en la zona

de pesos m oleculares donde se esperaba la presencia de BASP-1, no se

apreció u cción s l ct iva d t n de rafts co los sueros

m oduladores.

na intera e e e pro eí as n

DDiissccuussiióónn

6 - Discusión

6 .1 - Placa neurom uscular

En el presente t rabajo de tesis hem os detectado la existencia de una

subpoblación de pacientes con ELA esporádica, que representa un 63 % del

total de las m uest ras, cuya fracción de I gGs indujo un increm ento en la

liberación espontánea de acet ilcolina (Figura 5 .2 ) . Este efecto ha sido

postulado com o una consecuencia de un aum ento en la concent ración

int racelular de Ca2+ a nivel de los term inales sinápt icos, ocasionado por la

unión de las I gGs-ELA a la m em brana presinápt ica (Uchitel et al. 1988;

Uchitel et al. 1992a; Pagani et al. 2006) .

I nteresantem ente, la m ism a serie de pacientes cuyos ant icuerpos

produjeron dicha potenciación sinápt ica tam bién presentaron I gGs en suero

capaces de interactuar con la PNM de ratón (Figuras 5 .3 y 5 .4 ) . De hecho,

se pudo encont rar una correlación significat iva ent re estos parám etros,

com o se observa en la Figura 5 .1 3 A , sugir iendo de esta m anera una

asociación ent re la unión de los ant icuerpos al term inal m otor y su posterior

efecto funcional. Estos resultados refuerzan aquellos obtenidos por Pagani

et al. (2006) , donde los autores correlacionaron posit ivam ente la unión de

los ant icuerpos de ELA con los efectos elect rofisiológicos estudiados. De

esta m anera, es posible separar a los pacientes analizados en este estudio

en dos grupos, uno de los cuales podría presentar un com ponente auto-

inm une neurom uscular m ediando su neuropatología.

Existe una am plia serie de evidencias que sugieren un rol para el Ca2+

com o un im portante prom otor de disfunción y m uerte celular (Appel et al.

2001; Orrenius et al. 2003) . Adicionalm ente, las m otoneuronas espinales

son conocidas por su part icular vulnerabilidad a cualquier desbalance de

97

6 - Discusión

Ca2+ , dada la baja expresión de proteínas buffer de este ión (Alexianu et al.

1994) . Un increm ento en los niveles int racelulares de Ca2+ por encim a de

un cierto valor um bral podría disparar procesos deletéreos, tales com o la

act ivación de calpaínas, el plegam iento incorrecto de proteínas acoplado al

est rés del ret ículo endoplásm ico, la producción de especies react ivas del

oxígeno y la liberación de glutam ato (Orrenius et al. 2003; Sm aili et al.

2009) . La est im ulación de cada una de estas vías podría eventualm ente

llevar a la inducción de apoptosis. Por lo tanto, el aum ento en la

concent ración int racelular de Ca2+ provee una conexión clave para

relacionar las hipótesis previam ente propuestas para explicar la patología

de ELA. En este sent ido, num erosos reportes docum entando un aum ento en

el contenido de Ca2+ de las m otoneuronas y los term inales sinápt icos de los

ratones inoculados con las I gGs-ELA han provisto una im portante relación

ent re la sobre-carga de Ca2+ y esta patología (Engelhardt et al. 1995; Pullen

y Hum phreys 2000) .

La com paración ent re los niveles de react ividad de los ant icuerpos de

ELA hacia la PNM (Figura 5 .4 ) y su efecto potenciador sobre la tasa de

descarga espontánea (Figura 5 .2 ) indica que am bos fenóm enos m uest ran

un com portam iento sim ilar, a pesar de que sus rangos de increm ento

parecen ser m oderadam ente diferentes. Adem ás de las diferencias

int r ínsecas en la sensibilidad de las técnicas em pleadas, las discrepancias

podrían ser el resultado de la presencia en algunas m uest ras de dist intos

ant icuerpos capaces de interactuar con los term inales sinápt icos.

La presencia de niveles significat ivos de inm unoreact ividad en

algunos cont roles enferm os no fue com pletam ente inesperada (Figuras 5 .3

y 5 .4 ) , debido a que se sabía que estos individuos podían poseer

98

6 - Discusión

ant icuerpos dir igidos cont ra proteínas involucradas en la t ransm isión

sinápt ica (CCDVs en CE1 y el receptor de acet ilcolina en CE2) . En este

sent ido, estas m uest ras resultaron út iles com o cont roles posit ivos para la

técnica de inm uno- fluorescencia ut ilizada para detectar auto-ant icuerpos en

las m uest ras de los pacientes con ELA. Adem ás, cabe recalcar que si bien

algunos cont roles enferm os m ost raron afinidad por la PNM de ratón, en

ningún caso las I gGs de los cont roles increm entaron la act ividad sinápt ica

espontánea (Figura 5 .2 ) .

Ot ro aspecto im portante a tener en cuenta es la falta de unión a las

preparaciones de m úsculo de los ant icuerpos provenientes de pacientes

presentando la form a fam iliar de ELA (Figura 5 .4 ; CE4-6) , así com o

tam bién su incapacidad de increm entar la act ividad sinápt ica espontánea de

los term inales m otores (Figura 5 .2 B ) . Estos resultados enfat izan la

especificidad de nuest ros hallazgos con las inm unoglobulinas de individuos

con ELA esporádica, debido a que se sabe que la form a hereditar ia de esta

enferm edad es clínicam ente indist inguible de la variante esporádica.

6 .2 - Sistem a nervioso cent ra l

Para efectuar una caracterización adicional de la react ividad de las I gGs-ELA

hacia ot ros posibles sust ratos neuronales, llevam os a cabo experim entos de

inm uno-m arcación en rodajas de m édula espinal y corteza cerebral de

ratón. Estas est ructuras son los sit ios donde residen los som as de las

m otoneuronas infer iores y superiores, respect ivam ente. Am bos t ipos

celulares son im portantes efectores del m ovim iento. Tam bién se analizaron

cortes de cerebelo m urino, debido a que esta parte del cerebro está

involucrada en la coordinación de los m ovim ientos y se ha visto que los

99

6 - Discusión

ant icuerpos de ELA pueden m odular las corr ientes de Ca2+ de t ipo P/ Q en

neuronas de Purkinje (Llinas et al. 1993) , sugir iendo de esta m anera una

posible interacción con com ponentes cerebelares.

6.2.1 - Médula espinal

Llevando a cabo el análisis m encionado, hem os encont rado un am plio

pat rón de react ividad de las I gGs-ELA en el asta vent ral de la m édula

espinal (Figura 5 .7 ) , donde la gran m ayoría de las m uest ras analizadas

m ost ró afinidad hacia m otoneuronas infer iores y ot ros t ipos celulares de

m enor tam año. Realizando una co- t inción con un m arcador neuronal

específico (NeuN) encont ram os que no todas las m otoneuronas unieron

ant icuerpos de pacientes con ELA (Figura 5 .1 0 A ) . Esta heterogeneidad fue

una característ ica presente en la totalidad de las m uest ras analizadas. La

m arca predom inantem ente citoplasm át ica observada con el ant icuerpo ant i-

NeuN ha sido reportada con anter ior idad para esta est ructura neural (Mullen

et al. 1992; Kim et al. 2009) .

Adicionalm ente, estas células NeuN+ I gGs-ELA- no m ost raron ninguna

ubicación preferencial en los cortes, ya sea a lo largo del eje m edio- lateral

(Figura 5 .1 0 B ) , com o al analizar dist intas secciones espinales (m édula

toráxica y lum bar) . Estos últ im os resultados sugieren que los ant icuerpos de

ELA no estarían interactuando preferencialm ente con m otoneuronas que

inervan grupos part iculares de m úsculos, sean éstos distales/ proxim ales

(dist r ibuidos en dirección latero-m edial en la m édula) , o toráxicos/ de

ext rem idades infer iores. Tam poco se encont ró correlación ent re la unión de

las I gGs-ELA y los niveles de expresión de proteínas com o parvalbúm ina o

calbindina, sugir iendo que el ant ígeno presente en el som a neuronal no

100

6 - Discusión

estaría relacionado con la capacidad buffer de Ca2+ ( resultados no

m ost rados) .

Existen variados antecedentes que docum entan la react ividad de las

I gGs-ELA hacia los ant ígenos de las m otoneuronas infer iores. Dichos

reportes se valieron de técnicas elect rofisiológicas (Carter y Mynlieff 2003) ,

inm uno-histoquím icas (Kiernan y Hudson 1993; Greiner et al. 1996;

Schluep et al. 1998) y elect roforét icas (Brown et al. 1987; Niebroj -Dobosz

et al. 2006) . En el presente t rabajo, llevando a cabo un estudio de

correlación ent re varios de los parám etros m encionados previam ente, se

encont ró una asociación significat iva ent re la unión de las I gGs a la PNM y

su correspondiente interacción con las m otoneuronas espinales (Figura

5 .1 3 B) . Esta relación sugerir ía la posibilidad de que el ant ígeno presente en

la PNM que reacciona con las I gGs-ELA tam bién esté presente en el som a

de las m otoneuronas. Com o puede apreciarse en la Figura 5 .1 4 , la falta de

variación en la inm uno-m arcación de la m édula espinal ent re los ratones

CaV2.1+ / + y CaV2.1 - / - (a diferencia de lo que ocurre en la PNM) indicaría que,

o bien se t rata de ant ígenos diferentes, o bien es la m ism a m olécula pero su

presencia en el som a m otoneuronal es en principio independiente de la

expresión del canal P/ Q.

Resultaría de gran ut ilidad indagar en m ás detalle en futuras

aproxim aciones experim entales sobre la ident idad de este ant ígeno de

expresión heterogénea en el som a de m otoneuronas. De esta m anera se

podría dilucidar si guarda correlación con alguna característ ica fisiológica

dist int iva de este sub-grupo de neuronas m otoras, así com o tam bién su

relevancia en la patofisiología de ELA.

101

6 - Discusión

6.2.2 - Cerebelo

Existen extensos reportes indirectos de la interacción de los ant icuerpos de

ELA con com ponentes cerebelares. En un estudio hecho en células de

Purkinje disociadas en form a aguda, se detectó un aum ento en las

corr ientes de Ca2+ de t ipo P/ Q inducido por las I gGs-ELA (Llinas et al.

1993) . Asim ism o se ha visto que la fracción de inm uno-proteínas del suero

de pacientes con ELA dism inuye las corr ientes de Ca2+ de alto voltaje de

act ivación en células granulares en cult ivo (Zhainazarov et al. 1994) ,

sugir iendo un posible efecto dependiente del t ipo celular. A nivel de la

react ividad de las I gGs-ELA hacia est ructuras cerebelares, se ha detectado

la presencia de estos ant icuerpos en la capa m olecular y sustancia blanca

de cerebelo de ratones som et idos a un protocolo de t ransferencia pasiva

(Schluep et al. 1998) .

Estos reportes concuerdan con los resultados obtenidos en este

t rabajo, donde encont ram os una am plia react ividad de las I gGs-ELA hacia

células residentes en el cerebelo (Figura 5 .8 ) , donde hem os detectado una

im portante inm uno- t inción en el som a de las neuronas de Purkinje.

El análisis m ás detallado de la m arca en la capa granular reveló no

solo unión de I gGs-ELA a neuronas granulares NeuN+ (Figura 5 .1 1 ) sino

tam bién una im portante asociación a interneuronas GABAérgicas con

expresión de GAD65/ 67 (Figura 5 .1 2 ) . Éstas podrían t ratarse tanto de

células Lúgaro com o de neuronas de Golgi (Sillitoe y Joyner 2007) , aunque

por su ubicación alejada de la capa de Purkinje, es probable que se t rate de

estas últ im as.

En cuanto al estudio análogo de la capa m olecular, encont ram os una

im portante m arca asociada al citoplasm a de neuronas NeuN+ (Figura

102

6 - Discusión

5 .1 1 ) . Estas células m uy probablem ente se t raten de neuronas granulares

ya que se ha reportado que la m ayoría de las neuronas que expresan el

m arcador NeuN en la capa m olecular son células granulares localizadas

ectópicam ente (Mullen et al. 1992) . Por su parte, el m arcador GAD65/ 67 nos

perm it ió apreciar la intensa t inción de las dendritas pr incipales de las

neuronas de Purkinje (Figura 5 .1 2 ) .

Todos estos resultados sugieren que los ant icuerpos de ELA estarían

reaccionando con proteínas exclusivam ente presentes en el linaje neuronal,

aunque tendrían una dist r ibución bastante am plia dent ro de este grupo. Sin

em bargo, la ausencia de correlación ent re la inm uno- t inción de las neuronas

de Purkinje y los efectos y m arca en la PNM (Figuras 5 .1 3 C y 5 .1 3 E)

sum ada a la invariabilidad en la interacción de la m ayoría de las m uest ras

con las rodajas de cerebelo de los anim ales CaV2.1 - / - (Figura 5 .1 5 )

sugieren un rol m enos específico para estos ant icuerpos.

Los datos arr iba m encionados en relación al cerebelo (Figura 5 .1 5 ) y

la m édula espinal (Figura 5 .1 4 ) cont rastan significat ivam ente con los

cam bios observados en los ensayos de inm uno- fluorescencia desarrollados

en la PNM (Figura 5 .5 ) , y de esta m anera tam bién enfat izan la

especificidad de los resultados obtenidos en los term inales m otores. En este

sent ido, se podría especular que el ant ígeno que interactuaría con los

ant icuerpos de ELA en la PNM se expresaría select ivam ente en esta

est ructura, respecto de ot ras com o el cerebelo o el asta vent ral espinal. Sin

em bargo, no se puede excluir la posibilidad de que en el som a de las

m otoneuronas y las células de Purkinje haya una im portante expresión de

proteínas react ivas que enm ascaren la presencia del ant ígeno detectado en

la PNM. Adem ás, la presencia en el suero de ant icuerpos react ivos hacia el

103

6 - Discusión

sistem a nervioso cent ral podría ser consecuencia de la exposición del

contenido int racelular debido a la injur ia neuronal. Esta exposición

patológica est im ularía la producción de ant icuerpos cont ra com ponentes

propios del organism o (algunos de los cuales podrían ser ant ígenos

com unes a ot ros t ipos neuronales) y just ificarían la am plia dist r ibución de

react ividad encont rada hacia el sistem a nervioso cent ral. De esta m anera se

podría explicar la presencia de los ant icuerpos cont ra las est ructuras

nerviosas cent rales incluso en las m uest ras que no evidenciaron afinidad

hacia la PNM (ELA6-8) , teniendo en cuenta la degeneración m otoneuronal

característ ica de la enferm edad y presente en todos los pacientes, en m ayor

o m enor m edida.

6.2.3 - Corteza cerebral

Las m otoneuronas superiores residen en la capa V de la corteza m otora

pr im aria y están involucradas en el cont rol del m ovim iento por su influencia

sobre los circuitos locales en el tallo cerebral y la m édula espinal. Se sabe

que esta área representa un blanco tem prano durante el desarrollo de la

patología de ELA. Adicionalm ente, experim entos de inm uno-histoquím ica

han revelado la presencia de las I gGs en las células piram idales de los

pacientes con esta enferm edad (Engelhardt y Appel 1990) y en corteza de

ratones sujetos a un esquem a de t ransferencia pasiva (Schluep et al.

1998) , sugir iendo una posible interacción in vivo ent re los ant icuerpos y los

com ponentes m otoneuronales. Esta interacción se podría producir m ediante

m ecanism os act ivos que prom uevan la endocitosis de las I gGs-ELA en la

PNM y el posterior t ransporte axonal ret rógrado hacia est ructuras neurales

superiores (Fabian y Pet roff 1987; Fratantoni et al. 1996) .

104

6 - Discusión

En nuest ros ensayos no pudim os detectar la unión de las I gGs-ELA a

las rodajas de la corteza cerebral conteniendo la región m otora pr im aria, en

ninguna de las m uest ras analizadas (datos no m ost rados) . A pesar de que

estos resultados parecen ser cont rar ios a los ensayos m encionados

previam ente, no podem os excluir la posibilidad de que la interacción de los

ant icuerpos con las m otoneuronas sea dependiente de procesos act ivos

(com o los m encionados en el párrafo precedente) , los cuales se

encont rarían ausentes en el tej ido fij ado ut ilizado en este estudio. Por ot ro

lado, estos resultados avalan la especificidad de la interacción de los

ant icuerpos con la PNM y se encuent ran esencialm ente en concordancia con

los ensayos realizados en sinaptosomas cort icales (Thom as y Dunn 1997) .

En este estudio los autores no pudieron detectar cam bios en el influjo de

Ca2+ luego de la incubación con las I gGs-ELA.

6.2.4 - Ast rocitos

Los estudios de inm uno- t inción ut ilizando el m arcador GFAP revelaron que

algunas de la m uest ras de ELA contenían ant icuerpos cont ra com ponentes

ast rocít icos. En principio, la señal encont rada co- localizaría solo

parcialm ente con la correspondiente al m arcador citoesqueletar io, por lo

que no se t rataría del m arcador en sí. Estas I gGs fueron capaces de unirse a

la ast roglía tanto de m édula espinal (Figura 5 .9 A ) com o de cerebelo

(Figura 5 .9 B ) , por lo que sería una proteína expresada en el linaje

ast rocít ico en diversas regiones del sistem a nervioso. Sin em bargo, cabe

recalcar que este fenóm eno no estuvo presente en la totalidad de las

m uest ras analizadas, sugir iendo que no estaríam os frente a una

característ ica universal de la enferm edad.

105

6 - Discusión

Existen extensas evidencias que docum entan una posible disfunción

ast rocít ica en la patología de ELA. Ent re ellas se puede m encionar la

dism inución de la liberación de factores t róficos (Ekestern 2004) , el

com prom iso en la regulación de la concent ración ext racelular de K+ (Neusch

et al. 2007) , la deficiencia en la elim inación de glutam ato de la hendidura

sinápt ica (Shaw et al. 1994; Rothstein et al. 1995) y la acum ulación de

agregados de la proteína superóxido dism utasa en núcleos gliales de

pacientes con ELA (Forsberg et al. 2011) . A esto se sum a la presencia de

ast rocitos react ivos adyacentes a las m otoneuronas en proceso de

degeneración (Hirano 1996) . Adem ás, estudios recientes con m odelos

t ransgénicos de ELAf han revelado que la toxicidad hacia las m otoneuronas

podría derivarse de un daño ejercido sobre células gliales, m ás

precisam ente sobre los ast rocitos (Nagai et al. 2007; Di Giorgio et al.

2007) .

En relación con los resultados presentados en este t rabajo, Stenovec

y col. han encont rado recientem ente que las I gGs-ELA aum entaron la

m ovilidad de vesículas lisosom ales/ endosom ales m arcadas con el

com puesto Lysot racker , en cult ivos prim arios de ast rocitos de rata

(Stenovec et al. 2011) . Los autores asociaron estos datos a un posible

increm ento en la concent ración citosólica de Ca2+ por liberación desde

depósitos int racelulares. Ot ro grupo ha detectado la presencia select iva de

ant icuerpos de ELA en varias regiones del sistem a nervioso cent ral de

ratones, luego de un esquem a de t ransferencia pasiva de las I gGs hum anas

(Schluep et al. 1998) . La react ividad en este caso se vio asociada tanto a

neuronas com o a ast rocitos y se encont ró ausente en experim entos usando

m uest ras cont roles. Sin em bargo, los ast rocitos de cult ivos pr im arios m ixtos

106

6 - Discusión

de m édula espinal han m ost rado ser m enos suscept ibles que las

m otoneuronas a la m uerte celular apoptót ica inducida por exposición a las

I gGs-ELA (Dem est re et al. 2005) . Por tal m ot ivo se cree que el rol que

jugaría la ast roglía en la patogénesis de ELA estaría relacionado con la

generación de un am biente tóxico para las m otoneuronas.

Si bien la ident idad del ant ígeno ast rocít ico perm anece desconocida y

sería necesario profundizar el estudio para establecer la dist r ibución,

funcionalidad y relevancia de estos ant icuerpos, nuest ras evidencias

favorecen la hipótesis de que los ast rocitos jugarían un papel en la

degeneración de las neuronas m otoras en la patología de ELA.

6 .3 - Canales de Ca 2 + de t ipo P/ Q y N

Los CCDVs de t ipo P/ Q son los pr incipales m ediadores de la t ransm isión

sinápt ica en la PNM de los m am íferos (Uchitel et al. 1992b; Katz et al.

1997) . Por ot ro lado, existen num erosas evidencias que sugieren una

interacción ent re las I gGs-ELA y los canales de Ca2+ (Llinas et al. 1993;

Sm ith et al. 1994; Carter y Mynlieff 2003) . Teniendo en cuenta estos

antecedentes, nuest ro próxim o paso consist ió en analizar el efecto de la

ausencia de la subunidad CaV2.1 sobre la potenciación sinápt ica y la

react ividad de los ant icuerpos de ELA en la PNM, ut ilizando m úsculos

diafragm a de los anim ales carentes de esta subunidad.

Nuest ros resultados m ost raron que la ausencia de la subunidad

form adora del poro del canal de t ipo P/ Q produjo una dism inución

significat iva en la unión de las I gGs-ELA a la PNM de ratón (Figura 5 .5 ) ,

j unto con una com pleta supresión del efecto sobre la liberación espontánea

de acet ilcolina (Tabla 5 .1 ) . Esta inhibición de la acción de los ant icuerpos

107

6 - Discusión

no fue consecuencia del deter ioro de la preparación, ya que la m ism a fue

capaz de responder sat isfactor iam ente a un est ím ulo despolar izante (KCl 15

m M, 10 m in) , luego de varios lavados, increm entando su frecuencia de

act ividad espontánea (Tabla 5 .2 ) a niveles sim ilares a los de preparados

WT t ratados con las I gGs-ELA potenciadoras (Tabla 5 .1 ) .

Por lo tanto, los datos sugieren que los ant icuerpos de ELA

interactúan con la subunidad CaV2.1 m ism a o con una proteína cuya

expresión -o al m enos su localización en la PNM- se ve francam ente

dism inuida com o consecuencia de la deleción genét ica de esta subunidad

form adora del poro. Adicionalm ente, se deduce de los resultados que la

presencia de esta subunidad sería esencial para la m odulación sinápt ica

inducida por las I gGs-ELA. De hecho, se sabe que estos ratones carentes de

la subunidad CaV2.1 presentan alteraciones en el pat rón de expresión de

ot ros genes, adem ás de la subunidad m ism a (Piedras-Renteria et al. 2004) .

Por ot ro lado, existen reportes que sugieren que el influjo de Ca2+ a

t ravés del canal de t ipo P/ Q -y por lo tanto, su presencia y funcionalidad-

podría actuar com o un potente inductor de la t ranscripción. Este es el caso

de varias proteínas sinápt icas, ent re las que se puede m encionar la proteína

que form a parte del com plejo SNARE (soluble N-ethylm aleim ide sensit ive

factor at tachm ent protein receptor) , sintaxina 1A (Sut ton et al. 1999;

Barbado et al. 2009) .

Ot ro dato interesante a tener en cuenta es la relación que se ha

encont rado ent re la expresión del canal de Ca2+ de t ipo P/ Q y la

suscept ibilidad de diferentes m úsculos durante el desarrollo de ELA.

Mediante un análisis de m icroarreglos diseñado para el estudio del gen

Cacna1a de rata (que codifica para la subunidad α1A del canal P/ Q) , se ha

108

6 - Discusión

detectado un nivel de ARN m ensajero para CaV2.1 siete veces m ayor en un

m úsculo t ípicam ente esquelét ico (Tibialis anter ior) com parado con el

m úsculo ext raocular (Fischer et al. 2002) . Es sabido que durante la

progresión de la enferm edad este últ im o tej ido resulta ser relat ivam ente

poco vulnerable, reteniendo sus funciones hasta estadíos m uy avanzados de

la neurodegeneración (Leveille et al. 1982) . Adem ás, el m úsculo ext raocular

ha m ost rado resistencia a la acción de las I gGs-ELA en ensayos de

t ransferencia pasiva (Mosier et al. 2000) .

A pesar de los antecedentes arr iba m encionados, nuest ros

experim entos de inm uno-precipitación y western blot ut ilizando células

HEK293 t ransfectadas con las subunidades del canal de t ipo P/ Q no

sugieren una interacción directa de los ant icuerpos de ELA con el canal

m ism o (Figuras 5 .1 6 y 5 .1 7 ) , al m enos en las condiciones analizadas en

este estudio. Por ot ro lado, es im probable que ocurra una alteración en la

corr ientes de Ca2+ de t ipo P/ Q por efecto de las I gGs-ELA, ya que se ha

encont rado que los ant icuerpos de ELA no se unen a los canales m arcados

con 125I -ω-conotoxina MVI I C (Drachm an et al. 1995) , m ient ras que la

inhibición específica de estos canales por ω-agatoxina I VA no previene la

potenciación sinápt ica inducida por los ant icuerpos (Pagani et al. 2006) .

Todos estos resultados sugieren que la proteína que interactúa con

las I gGs-ELA necesitaría la expresión y/ o act ividad del canal de Ca2+ de t ipo

P/ Q para estar presente en la PNM de ratón. Tam bién se desprende de

estos datos que en ot ras est ructuras neuronales -com o el cerebelo y la

m édula espinal- su presencia sería en principio m enos dependiente de la

expresión del gen Cacna1a.

109

6 - Discusión

Un aspecto significat ivo que m erece ser m encionado es la ausencia

de cam bio en la unión de los ant icuerpos de los cont roles enferm os a la PNM

de los ratones CaV2.1 - / -, com parado con aquellos WT (Figura 5 .5 ) . Esta

invariabilidad en la inm uno- t inción adiciona relevancia a los resultados

encont rados para las I gGs-ELA, resaltando su especificidad hacia un subset

de pacientes y el hecho de que no se t rata de un fenóm eno generalizado.

Adem ás, se puede descartar que las diferencias encont radas en los

anim ales carentes del canal de t ipo P/ Q sean consecuencia del proceso de

deleción genét ica en sí, ya que en ot ro m odelo t ransgénico sim ilar ( los

ratones CaV2.2 - / -) no se detectaron dichas diferencias.

El hecho de que la m uest ra DC1 (un paciente con el síndrom e

m iasténico de Lam bert -Eaton) haya exhibido niveles de interacción

sim ilares con la PNM de los ratones CaV2.1+ / + y CaV2.1 - / - (Figura 5 .5 ) ,

podría parecer cont radictor io a pr im era vista dada la et iología propuesta

para esta patología. Sin em bargo, debería considerarse que la m uest ra

podría contener -adem ás de ant icuerpos cont ra el canal de t ipo P/ Q- I gGs

con afinidad hacia el canal de t ipo N (Takam ori et al. 1995; Motom ura et al.

1997) . Se sabe que este últ im o canal puede com pensar la falta del canal de

t ipo P/ Q, tanto a nivel funcional (Urbano et al. 2003) com o a nivel proteico

(Pagani et al. 2004) , y por lo tanto podría explicar la invar iabilidad

observada en los experim entos de inm uno- fluorescencia del m úsculo

diafragm a.

Por ot ro lado, se ha encont rado que la act ivación de los canales de

Ca2+ de t ipo N es relevante para la inducción de la act ividad sinápt ica

espontánea por los ant icuerpos de ELA (Pagani et al. 2006) . Sin em bargo,

este efecto no sería consecuencia de una interacción directa ent re los

110

6 - Discusión

ant icuerpos y el canal de Ca2+ , dado que la ausencia de la subunidad CaV2.2

no m odificó significat ivam ente la interacción de la m ayoría de las I gGs-ELA

con la PNM de ratón (Figura 5 .6 ) . Lo que es m ás, en anim ales CaV2.1 - / -,

donde se sabe que hay una com pensación funcional en la t ransm isión

neurom uscular por los canales de Ca2+ de t ipo N (Urbano et al. 2003) , al

igual que un increm ento en los niveles de la proteína (Pagani et al. 2004) ,

se pudieron detectar cam bios substanciales en la inm unoreact ividad de

algunas de las m uest ras de los pacientes con ELA (Figura 5 .5 ) . En su

conjunto, estos resultados no apoyarían la hipótesis de una interacción

directa ent re las ant icuerpos de ELA y el canal de Ca2+ de t ipo N, sino que

sugerir ían un efecto indirecto de las I gGs sobre la act ividad del canal, por

ejem plo a t ravés de una vía de señalización de segundos m ensajeros, com o

ha sido extensivam ente reportado (Lipscom be et al. 1989; Werz et al.

1993; Mart in et al. 2006) . De hecho, Pagani et al. (2006) detectaron un

requerim iento de la act ivación de fosfolipasa C, el receptor de r ianodina y el

receptor de inositol t r ifosfato, para que se produzca la potenciación

sinápt ica m ediada por las I gGs-ELA. En un t rabajo reciente tam bién se ha

reportado que los ant icuerpos de ELA inducen la m ovilización de los

depósitos int racelulares de Ca2+ desde el ret ículo endoplásm ico en ovocitos

de Xenopus laevis que sobre-expresan las subunidades del receptor de

NMDA (Texido et al. 2011) .

6 .4 - Ot ras proteínas presinápt icas

Num erosos reportes han docum entado la presencia de ant icuerpos hum anos

en el som a y los term inales m otoneuronales de los ratones inyectados con

las I gGs-ELA (Fratantoni et al. 1996; Engelhardt et al. 2005) . Estos

111

6 - Discusión

antecedentes nos llevaron a hipotet izar una posible interacción de los

ant icuerpos con com ponentes pre-sinápt icos. Para testear esta posibilidad

ut ilizam os ensayos de inm uno-precipitación con las I gGs-ELA para estudiar

su unión a var ias proteínas presinápt icas purificadas de ext ractos crudos de

m em brana de sinaptosom as de cerebelo. En estos experim entos

encont ram os que ninguna de las m uest ras ELA analizadas m ost ró afinidad

hacia las proteínas presentes en los term inales sinápt icos, tales com o

sinaptotagm ina I , sintaxina 1A, sinaptofisina y sinaptobrevina I I , a pesar de

que todas se pudieron detectar fácilm ente en el lisado original (Figura

5 .1 8 ) . Ot ros candidatos a testear en futuros experim entos incluyen

m oléculas de m at r iz ext racelular, receptores de neurot rofinas y proteínas

involucradas en la sinaptogénesis y guiado de axones, dado su rol

propuesto durante la neurodegeneración (Glas et al. 2007; Dawbarn y Allen

2003; Schm idt et al. 2009) .

Ot ro enfoque experim ental consist ió en estudiar de una m anera m ás

general las proteínas que interactuaban con las I gGs-ELA. Para ello

ut ilizam os la técnica de inm uno-precipitación para aislar aquellos com plejos

proteicos reconocidos por los ant icuerpos de ELA en diversas preparaciones.

En part icular, realizam os una com paración ent re los anim ales de genot ipo

CaV2.1+ / + y CaV2.1 - / - part iendo de ext ractos crudos de m em brana cerebelar,

proteínas totales de cerebelo, purificados de rafts o preparaciones de

m úsculo, ya sea focalizando el estudio en los sueros que m ost raron afinidad

hacia la PNM o com parando éstos con los no m oduladores.

En ninguna de las condiciones experim entales testeadas con

proteínas cerebelares pudim os encont rar alguna banda diferencial que

sugir iera la presencia de una proteína interactuante con niveles infer iores

112

6 - Discusión

en los ext ractos de los anim ales t ransgénicos (Figuras 5 .1 9 A , 5 .1 9 B y

5 .2 3 ) . En general, las diferencias detectadas correspondieron a proteínas

con una m ayor expresión en los anim ales CaV2.1 - / -, respecto de los salvajes.

Esto podría deberse a que el ant ígeno de la PNM -de estar presente en los

sinaptosom as de cerebelo- m uest re una afinidad poco estable o m enor

hacia las I gGs-ELA y de este m odo se im posibilite su pur ificación por

ensayos de precipitación.

En lo que respecta a la PNM (Figura 5 .1 9 C ) , se podría especular que

los resultados negat ivos obtenidos ut ilizando esta preparación derivan de la

probable pobre representación de proteínas pre-sinápt icas en el ext racto

final. Uno de los factores que cont r ibuye a esta situación puede ser la gran

desproporción de proteínas m usculares respecto de las presentes en el

term inal m otor. Lam entablem ente no se dispone actualm ente de ninguna

técnica análoga a la purificación de sinaptosom as del sistem a nervioso

cent ral que nos perm ita realizar un enriquecim iento select ivo en proteínas

pre-sinápt icas de la placa m otora.

6 .5 - Proteóm ica com parat iva de la sinapsis Ca V2 .1 + / + y Ca V2 .1 - / -

Existen escasos reportes donde se estudien cam bios en la expresión génica

com o consecuencia de la deleción de la subunidad CaV2.1. Se ha publicado

un solo t rabajo que analiza de m anera sistem át ica la expresión de los ARN

m ensajeros en el hipocam po por m edio de un ensayo de m icroarreglos

(Piedras-Renteria et al. 2004) .

Desafortunadam ente, en esta publicación los autores se cent raron

principalm ente en aquellas proteínas que aum entaban sus niveles de

m ensajeros en ausencia del canal. Adem ás, debido a todos los procesos

113

6 - Discusión

regulator ios que ocurren posteriorm ente a la t ranscripción de un gen, se

sabe que un cam bio en la cant idad de ARN m ensajero no necesariam ente se

t raduce en una m odificación en los niveles de la proteína que codifica. Ante

la falta de reportes a nivel proteico, decidim os em prender un estudio global

para detectar e ident ificar cam bios de expresión por m edio de técnicas de

proteóm ica, y cent rar dicho estudio en la sinapsis.

El análisis com parat ivo de am bos proteom as reveló que la m ayoría de

las proteínas presentes en los sinaptosom as de cerebelo m antuvo sus

niveles invariantes en respuesta a la deleción del gen Cacna1a, com o se

observa en la Figura 5 .2 0 . Sin em bargo, algunos com ponentes de la

m uest ra sí evidenciaron cam bios sustanciales en ausencia del canal de Ca2+

de t ipo P/ Q, los cuales se vieron reflejados en la cuant ificación de su

intensidad (Figura 5 .2 1 ) . Todas las proteínas diferenciales -con excepción

de la m uest ra núm ero 3- pudieron ser ident ificadas sat isfactor iam ente por

espect rom et ría de m asa y correspondieron a siete productos génicos

diferentes (Figura 5 .2 2 y Tabla 5 .3 ) .

Las proteínas que m ost raron niveles alterados en sinaptosom as de

ratones carentes del canal de Ca2+ de t ipo P/ Q incluyeron m oléculas

involucradas en el m etabolism o energét ico (gliceraldehído-3- fosfato

deshidrogenasa y ATP sintetasa m itocondrial) , la dinám ica citoesqueletar ia

(sust rato de quinasa C r ico en alanina m ir istoilado, cofilina-1 y proteína

ácida soluble de cerebro-1) , la señalización regulada por Ca2+ ( calm odulina)

y la exocitosis (secernina-1) .

La m odificación en los niveles de ciertas proteínas detectado en la

sinapsis de los ratones CaV2.1 - / - podría representar una act ivación de

m ecanism os com pensatorios ante la falta de esta im portante vía de ent rada

114

6 - Discusión

de Ca2+ en respuesta a la act ividad neuronal. Por ejem plo, las

dism inuciones observadas se podrían deber a que algunas proteínas

necesiten de la expresión y/ o act ividad del canal de Ca2+ de t ipo P/ Q para

expresarse y/ o estar presentes en los term inales sinápt icos. De hecho,

Piedras Rentería (2004) ha reportado m odificaciones en la cant idad de ARN

m ensajeros de num erosos genes en el hipocam po de estos anim ales

t ransgénicos.

Ot ro aspecto a tener en cuenta es el rol que se ha propuesto para el

Ca2+ que ingresa a las células por los CCDVs en la regulación de la

t ranscripción (Barbado et al. 2009) . Esta m odulación puede ser tanto

posit iva com o negat iva y provee una asociación interesante ent re la

act ividad neuronal y la expresión génica. Adem ás de la inducción

t ranscripcional inducida por el canal de t ipo P/ Q mencionada anter iorm ente,

se ha visto que el Ca2+ que ingresa a las células a t ravés del canal de t ipo L

cont rola la expresión del receptor de inositol t r ifosfato por m edio de la

act ivación de calcineurina (Genazzani et al. 1999) . Tam bién se ha reportado

que el canal de t ipo N puede est im ular la t ranscripción de la t irosina

hidroxilasa en neuronas sensoriales (Brosenitsch y Katz 2001) . Ot ros

procesos suscept ibles de ser regulados por cam bios en los niveles

int racelulares de Ca2+ son los m ecanism os post - t ranscr ipcionales que

cont rolan el splicing y la estabilidad de los ARN m ensajeros (Barbado et al.

2009) .

6.5.1 - Metabolism o energét ico

La gliceraldehído-3- fosfato deshidrogenasa es una enzim a tet ram érica que

cataliza una reacción crucial de la vía glucolít ica, llevando a la producción de

115

6 - Discusión

ATP. Adem ás de su rol en la glucólisis, se ha reportado que esta enzim a

está involucrada en m uchos ot ros procesos celulares com o la reparación del

ADN, la exportación de ARN de t ransferencia, el t ransporte y la fusión de

m em branas, la dinám ica citoesqueletar ia y la m uerte celular (Tristan et al.

2011) .

Con respecto a la relación ent re el Ca2+ y la energét ica m itocondrial,

se ha visto que en las neuronas, las m itocondrias se encuent ran

frecuentem ente agrupadas en los sit ios de alta act ividad de los canales del

ret ículo endoplásm ico que liberan Ca2+ ( receptor de r ianodina y receptor de

inositol t r ifosfato) . Se cree que la alta concent ración de Ca2+ en estos sit ios

de liberación induce la producción m itocondrial de ATP por m edio de la

act ivación de las deshidrogenasas del ciclo de Krebs (piruvato, α-

cetoglutarato e isocit rato deshidrogenasas) , las cuales son sensibles a Ca2+

(Clapham 2007) .

El aum ento observado en los niveles de la subunidad α de la ATPasa

podría ser consecuencia de una m enor act ivación de algunas enzim as del

ciclo de Krebs acoplada a la dism inución en los niveles de gliceraldehído-3-

fosfato deshidrogenasa, detectada en este t rabajo. De hecho, se sabe que

en los anim ales CaV2.1 - / - la corr iente de calcio total en neuronas cerebelares

está dism inuida ent re un 65 y 70 % (Jun et al. 1999) . Se podría especular

que para m antener la producción de ATP en estas condiciones sería

necesario increm entar la cant idad de la enzim a responsable de la síntesis de

ATP. No obstante, para saber si el cam bio detectado representa un

increm ento real en el núm ero de m oléculas de ATPasa sería im perioso

estudiar si este aum ento tam bién im plica a las ot ras subunidades que

com ponen la enzim a.

116

6 - Discusión

6.5.2 - Citoesqueleto

Tres de las proteínas que m ost raron cam bios significat ivos en sus niveles

sinápt icos están involucradas en la dinám ica citoesqueletar ia. MARCKS

actúa com o una proteína ent recruzadora de act ina F m odulada por proteína

quinasa C y el com plejo Ca2+ -calm odulina (Hartwig et al. 1992) m ient ras

que BASP-1 regula el citoesqueleto de act ina y el crecim iento de neuritas

(Frey et al. 2000) . Por su parte se ha propuesto que cofilina-1 cum ple

funciones en el desensam blado, la nucleación y la estabilización de los

filam entos de act ina dependiendo de la concent ración local que presente

(Andrianantoandro y Pollard 2006) .

El hecho de que varias proteínas que regulan el m ism o proceso hayan

m ost rado una dism inución en los anim ales que carecen del canal de Ca2+ de

t ipo P/ Q sugiere la ocurrencia de un desbalance en la dinám ica

citoesqueletar ia en este m odelo experim ental. Sin em bargo, no se ha

reportado que estos ratones tengan alguna alteración evidente en su

citoarquitectura en regiones com o el cerebelo o la PNM donde hay una alta

expresión del canal de Ca2+ ( Jun et al. 1999; Urbano et al. 2003; Miyazaki

et al. 2006) . Adem ás, com o las m oléculas que se encont raron alteradas

cum plen funciones diversas, resulta difícil predecir cuál sería el resultado

neto de la ausencia de este canal de Ca2+ sobre la est ructura

citoesqueletar ia. Por lo tanto, se podría especular que los cam bios en estas

proteínas se com pensarían m utuam ente, m inim izando el im pacto de las

m odificaciones sobre los filam entos de act ina.

117

6 - Discusión

6.5.3 - Señalización de Ca2+

Existen num erosas asociaciones ent re el canal de t ipo P/ Q y proteínas

sensoras de Ca2+ , ent re las que se destaca la calm odulina, una de las

m acrom oléculas que ha m ost rado un aum ento en sus niveles

sinaptosom ales en este t rabajo.

Se ha reportado que la calm odulina se une a un dom inio C- term inal

en la subunidad CaV2.1 e induce la inact ivación y la facilitación dependiente

de Ca2+ del canal (Lee et al. 1999; Lee et al. 2000) . Se cree que esta

regulación es im portante para los fenóm enos de plast icidad sinápt ica

dependientes de act ividad. I nteresantem ente, ot ra molécula im plicada en

estos m ecanism os regulator ios - la calm odulina quinasa I Iα- tam bién ha

m ost rado un increm ento significat ivo en sus niveles de ARN m ensajero en el

hipocam po de ratones CaV2.1 - / - (Piedras-Renteria et al. 2004) . Todos estos

antecedentes sugieren una posible inducción de varios com ponentes de la

vía involucrada en la regulación de la plast icidad sinápt ica en este m odelo

experim ental.

6.5.4 - Exocitosis

La secernina-1 es una proteína citosólica que est imula la exocitosis en los

m astocitos (Way et al. 2002) por m ecanism os que todavía no se conocen

con exact itud. Curiosam ente, la fusión de vesículas en este t ipo celular se

encuent ra m ediada por la m ism a m aquinaria exocitót ica que opera en las

neuronas y las células neuroendócrinas (Guo et al. 1998) . Adem ás,

experim entos de hibr idización in situ han revelado la presencia del ARN

m ensajero para esta proteína en varias regiones del sistem a nervioso, com o

el cerebelo, el hipocam po y la m édula espinal (Allen Brain At las; www.brain-

118

6 - Discusión

m ap.org) , datos que sugerir ían un rol en ot ros t ipos celulares.

Adicionalm ente, se sabe que la m aquinaria de liberación en las sinapsis

hipocam pales de los anim ales CaV2.1 - / - presenta una m ayor sensibilidad al

Ca2+ (Piedras-Renter ia et al. 2004) .

Suponiendo que secernina-1 tam bién desem peñe funciones

exocitót icas en células neuronales, se podría especular que esta m ayor

liberación en respuesta a la ent rada de Ca2+ se podría explicar en parte por

el aum ento en los niveles de esta proteína detectado en el presente estudio.

6.5.5 - BASP-1

La proteína ácida soluble de cerebro-1 (BASP-1/ NAP-22/ CAP-23) es una

m acrom olécula de m em brana que se encuent ra altam ente expresada en

neuronas en el adulto y se localiza en regiones sinápt icas tales com o la

m em brana presinápt ica y la m em brana vesicular (Maekawa et al. 1993; I ino

et al. 1999) . Está especialm ente enriquecida en los m icrodom inios

abundantes en colesterol conocidos com o rafts a los cuales se une por un

grupo m ir istoilo (Maekawa et al. 1999) y donde se cree que cum ple

funciones relacionadas con la organización de la m em brana, en part icular

con la m aduración de los filam entos de act ina. Además, se vio que la

expresión de BASP-1 aum enta cuando los axones se encuent ran en proceso

de elongación y su sobre-expresión en neuronas adultas prom ueve la

ram ificación axonal (Caroni 1997) . Un t rabajo publicado recientem ente

tam bién propone un rol para BASP-1 en la regulación de la endocitosis

debido a su interacción e inhibición de sinaptojanina-1, una fosfatasa clave

para el desprendim iento de las vesículas recubiertas de clat r ina (Takaichi et

al. 2012) . Ot ras funciones reportadas para esta proteína incluyen la

119

6 - Discusión

part icipación en procesos com o la regulación de la t ranscripción (Green et

al. 2009) , la apoptosis (Sanchez-Nino et al. 2010) y la form ación de canales

(Ost roum ova et al. 2011) .

La expresión de BASP-1 en el sistem a nervioso es bastante am plia,

destacándose en regiones del cerebro anter ior com o la corteza cerebral, la

form ación hipocam pal, el bulbo olfator io, los ganglios basales y el tálam o.

En el cerebelo la inm unoreact ividad de BASP-1 ha sido observada

principalm ente en las células granulares y en est ructuras que se cree son

los term inales de las fibras m usgosas ( I ino et al. 1999) . A nivel de la

m édula espinal se ha detectado claram ente la expresión del ARN m ensajero

en el som a de las grandes neuronas del asta vent ral (m otoneuronas

infer iores) , así com o tam bién la presencia de la proteína tanto en term inales

sinápt icos que rodean los som as de las m otoneuronas com o en la PNM ( I ino

y Maekawa 1999; Frey et al. 2000; I ino et al. 2004) .

Los ratones que t ienen genét icam ente delecionada la expresión de

BASP-1 presentan una alta tasa de m ortalidad post -natal, anom alías

severas en el sistem a nervioso y m alform aciones a nivel de la PNM (Frey et

al. 2000) . Todas estas evidencias indican que esta proteína está involucrada

en form a crít ica en procesos fisiológicos norm ales.

Una de las característ icas bioquím icas dist int ivas de BASP-1 (que

tam bién es com part ida por MARCKS) es su com portam iento anóm alo en

separaciones elect roforét icas, lo cual lleva a que el peso m olecular

observado difiera significat ivam ente del esperado y a que dependa del

porcentaje de acrilam ida ut ilizado (Maekawa et al. 1993) . Esto explicaría las

discrepancias encont radas en el peso m olecular al m om ento de realizar las

ident ificaciones por espect rom etría de m asa de estas dos proteínas.

120

6 - Discusión

De todos los productos génicos analizados com parat ivam ente ent re

anim ales CaV2.1+ / + y CaV2.1 - / -, BASP-1 se destaca com o uno de los

candidatos m ás interesantes a ser el ant ígeno reconocido por las I gGs-ELA,

por varias razones: 1) presenta una dism inución significat iva en sus niveles

en paralelo a la ausencia del canal de Ca2+ de t ipo P/ Q ( resultados del

presente t rabajo) , 2) se expresa en altos niveles tanto en term inales

sinápt icos de cerebelo com o en la PNM ( I ino et al. 1999; I ino y Maekawa

1999; Frey et al. 2000; I ino et al. 2004) , 3) su localización subcelular

incluye la m em brana presinápt ica y la m em brana vesicular (Maekawa et al.

1993; I ino et al. 1999) , y 4) está involucrada en la regulación de la

endocitosis vesicular (Takaichi et al. 2012) . Por lo tanto, BASP-1 es una de

las proteínas cuya interacción con los ant icuerpos de ELA será evaluada con

m ás detalle en futuros abordajes experim entales.

6 .6 - Perspect ivas futuras

La correlación encont rada ent re la ausencia del canal P/ Q y la falta de unión

y efecto de las I gGs-ELA sobre la PNM aporta una herram ienta im portante

para el direccionam iento de futuros estudios tendientes a dilucidar la

ident idad del ant ígeno de ELA. Sin em bargo, todavía restan realizar estudios

funcionales m ás detallados para clar ificar la relevancia funcional de la

deleción del canal de Ca2+ en el contexto de la patología. Por ejem plo, se

debería estudiar si los ratones CaV2.1 - / - son m enos suscept ibles que los

salvajes a la disfunción neurom uscular inducida por la t ransferencia pasiva

de las I gGs-ELA. Adem ás, se podría testear en experim entos in vit ro si los

preparados de m úsculo de estos ratones presentan un m enor influjo de Ca2+

121

6 - Discusión

o liberación desde depósitos int racelulares, en respuesta a la incubación con

los ant icuerpos de ELA.

Los estudios de proteóm ica de la sinapsis realizados en este t rabajo

sugieren com o un candidato interesante a ser el ant ígeno de ELA a la

proteína BASP-1. No obstante, resultaría im perioso llevar a cabo un análisis

m ás detallado a fin de establecer su posible interacción con las I gGs-ELA.

Por ejem plo, se podrían ut ilizar sistem as de expresión t ransiente para

enriquecer los lisados celulares en la proteína de interés y así favorecer su

detección en los ensayos de inm uno-precipitación.

Asim ism o, se debería evaluar la unión de las I gGs-ELA a cada una de

las ot ras m acrom oléculas que m ost raron una expresión dism inuida en

term inales de ratones CaV2.1 - / - (MARCKS, gliceraldehído-3- fosfato

deshidrogenasa, cofilina-1) . En este sent ido, tam bién representaría un

aporte valioso la validación de los resultados de proteóm ica em pleando

m etodologías alternat ivas y m ás sensibles, com o la de I TRAQ ( isobaric

pept ide tags for relat ive and absolute quant ificat ion) o 2D-DI GE ( two-

dim ensional difference gel elect rophoresis) . Estas técnicas perm it ir ían

adem ás am pliar la lista de proteínas candidato a ser evaluadas y facilitarían

el cam ino hacia una eventual ident ificación.

6 .7 - Conclusiones genera les

Los resultados m ost rados en este t rabajo aportan evidencias relevantes a

favor de la hipótesis de auto- inm unidad com o uno de los posibles

m ecanism os que cont r ibuyen a la patología de ELA. Tam bién sugieren por

pr im era vez que los auto-ant icuerpos en el suero de algunos pacientes se

unirían a una(s) proteína(s) cuya presencia en la PNM se encont raría

122

6 - Discusión

123

asociada a la expresión de la subunidad form adora del poro del canal de

Ca2+ de t ipo P/ Q (CaV2.1) , pero no a la del t ipo N (CaV2.2) . Adicionalm ente,

nuest ros datos indican que este ant ígeno se localizaría preferentem ente en

la PNM de ratón, a diferencia de lo que ocurre en el som a de las células de

Purkinje, m otoneuronas superiores e infer iores, donde su expresión sería

m enor y/ o m enos dependiente de la presencia de la subunidad CaV2.1.

Las evidencias aquí presentadas cont r ibuirán a establecer el valor de

las I gGs com o m arcadores biológicos en ELA, así com o tam bién su rol en el

desarrollo de la patología. Tam bién ayudarán en la ident ificación de los

ant ígenos potencialm ente relevantes para la et iología de la enferm edad y en

la or ientación de futuras invest igaciones hacia el descubrim iento e

im plem entación de t ratam ientos terapéut icos m ás efect ivos que los

em pleados en la actualidad.

Lic. Laura E. González

Dr. Osvaldo D. Uchitel Dra. Mónica L. Kot ler

RReeffeerreenncciiaass BBiibblliiooggrrááffiiccaass

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Parte de los resultados de esta tesis fueron incluidos en las siguientes

publicaciones:

o Gonzalez L. E. , Kot ler M. L., Vat t ino L. G., Cont i E., Reisin R. C., Mulatz

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La m ayoría de estos resultados tam bién fueron presentados en los

siguientes congresos:

41st Annual Meet ing of the Society for Neuroscience (Washington, DC,

USA, Noviem bre 12-16, 2011) “Analysis of am yot rophic lateral sclerosis

im m unoglobulins interact ion with pre-synapt ic proteins” L. E. González ,

M. L. Kot ler, K. J. Mulatz, R. C. Reisin, T. P. Snutch, O. D. Uchitel.

XXVI Congreso Anual de la Sociedad Argent ina de I nvest igación en

Neurociencia (Huerta Grande, Córdoba, Argent ina, Octubre 18-22, 2011)

“Analysis of am yot rophic lateral sclerosis im m unoglobulins interact ion

with pre-synapt ic proteins” L. E. González , M. L. Kot ler, K. J. Mulatz, R.

C. Reisin, T. P. Snutch, O. D. Uchitel.

40th Annual Meet ing of the Society for Neuroscience (San Diego,

California, USA, Noviem bre 13-17, 2010) “Am yot rophic Lateral Sclerosis

I m m unoglobulins-G interact with calcium channels?” L. E. González , L.

G. Vat t ino, M. L. Kot ler, R. C. Reisin, O. D. Uchitel.

I I Reunión Conjunta de Neurociencias ( I RCN) (Huerta Grande, Córdoba,

Argent ina, Octubre 8-10, 2010) “P/ Q- type calcium channel α1 subunit is

necessary for ALS- I gGs spontaneous synapt ic act ivit y m odulat ion on

m ouse neurom uscular junct ion” Vat t ino L. G., González L. E. , Kot ler M.

L., Reisin R. C., Uchitel O. D.

I Reunión Conjunta de Neurociencias ( I RCN) (Huerta Grande, Córdoba,

Argent ina, Sept iem bre 4-6, 2009) “Am yot rophic Lateral Sclerosis auto-

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ant ibodies and absence of P/ Q- type calcium channels” González L. ,

Kot ler M., Sanchez V., Reisin R., Uchitel O.

Gordon Research Conference - Phosphorylat ion and G-protein m ediated

signaling networks (Biddeford, Maine, USA, Junio 7-12, 2009)

“Am yot rophic Lateral Sclerosis auto-ant ibodies and absence of P/ Q- type

calcium channels” González L. , Kot ler M., Sanchez V., Reisin R., Uchitel

O.

3rd Annual Canadian Neuroscience Meet ing (Vancouver, Brit ish

Colum bia, Canadá, Mayo 24-27, 2009) “Am yot rophic Lateral Sclerosis

auto-ant ibodies and absence of P/ Q- type calcium channels” González

L. , Kot ler M., Sanchez V., Reisin R., Uchitel O.

I er Congreso I BRO/ LARC de Neurociencias de Am érica Lat ina, Caribe y

Península I bérica, XXI I I Congreso de la Sociedad Argent ina de

I nvest igación en Neurociencias (SAN) (Buzios, Río de Janeiro, Brasil,

Sept iem bre 1º -4, 2008) “Searching for auto-ant ibodies in Am yot rophic

Lateral Sclerosis” Gonzalez L. E. , Kot ler M. L., Sanchez V. N., Reisin R.

C., Uchitel O. D.

X Taller Argent ino de Neurociencias (Huerta Grande, Córdoba, Argent ina,

Abril 9-13, 2008) "Buscando auto-ant icuerpos en la Esclerosis Lateral

Am iot rófica" González L. , Kot ler M., Sanchez V., Reisin R., Uchitel O.

interacción de la inmunoglobulinas g de pacientes con esclerosis … · 2018-07-13 · nuestros...

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