INSTRUMENTACIÓN - II

ColorimetríaEspectrofotómetro

OBJETIVOS

•Conocer los fundamentos e importancia de la instrumentación (equipos ) en Bioquímica

•Conocer el funcionamiento y uso de la Centrífuga y el espectrofotómetro como equipos útiles en Bioquímica.

•Elaborar curvas o gráficos de calibración

Espectrofotometría

• Se basa en la medida de la luz absorbida por una solución mediante un espectrofotómetro.

• La luz utilizada es monocromática, seleccionada de acuerdo al soluto en estudio

• Reporta resultados como A o T Io = luz incidente c = concentración

I1 = luz transmitida l = distancia

A= Absorbancia (D.O.) =coeficiente de extinción C= concentración molar l= longitud de celda (cm)

En función de la naturaleza y de la concentración de la muestra

A= clLey de Lambert- Beer

Log Io/It = e.l.c log Io/It = A A = 2 – log%T

Principal limitación de ley: Concentración de soluto mayor de 0.01M

Absorbancia

• T se expresa en valores de 0 a 100%.• A o Densidad Optica se expresa en valores

semilogarítmicos de 0 a 2.• Aplicando la ley de Lambert – Beer, considerando que A y C

tienen relación lineal:

Fc = factor de calibraciónC = concentración solución conocida (patrón)A = Absorbancia de la solución conocida (pat.)

Fc = C/A

La absorbancia es reciproca de la transmitancia

Absorbancia contra concentración (comportamiento lineal)

% Transmitancia contra concentración (pendiente con signo negativo y comportamiento exponencial)

Concentración

Absorbancia

Concentración

% Transmitancia

Curva de calibración

Absorbancia

Concentración

A

Azul de metileno

Absorbancia

Longitud de onda (nm)

A

Max

660 nm

¿ABSORBANCIA?Muestra Problema

Conc. Prob = (A Prob)(Conc. Patrón)/A Patrón

Problema Patrón

A Problema = 0.458 A Patrón = 0.765 Conc. Patrón= 145mg% Conc. Problema= ?

Conc. Problema = (0.458)(145mg%) /0.765

Conc. Problema= 86.8 mg%

Ejemplo :

Conc. Prob = (A Prob)Fc

CURVA PATRÓN

0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0 2 4 6 8 10 12

Concentración mg/lt

AB

S

0

R

B

A

N

C

I

A

Interpolación

Absorbancia del problema

PARTE EXPERIMENTAL

Contenido Tubo Nº1 2 3 4 5

ml Azul metileno al (5 mg/ml) 2 4 6 8 10ml Agua destilada 8 6 4 2 0

Llevar a lectura en el espectrofotómetroLa longitud de onda de lectura será 540 nm

Preparar la siguiente batería de tubos

Concentración (mg/mL)

% T= Antilog(2-A) A FC= C/A

Factor calibración promedio

RESULTADOS

Estimar el factor de calibración promedio

Construir las graficas Concentración Vs Absorbancia y Concentración Vs transmitancia

Entregar el valor de las concentraciones desconocidas determinadas usando el factor de calibración y el método grafico

Conc. Con Fc Conc. De graficaDesconocido 1Desconocido 2

CUESTIONARIO

1. ¿Cual es la importancia de los instrumentos de laboratorio en análisis clínico?

2. ¿Para que es útil el factor de calibración y las curvas de calibración?3. ¿De que características de las soluciones hace uso el espectrofotómetro para

ayudar en la cuantificación de concentraciones de muestras desconocidas?