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INSTITUTO POLITECNICO NACIONAL
ESCUELA NACIONAL DE MEDICINA Y HOMEOPATIA SECCION DE ESTUDIOS DE POSGRADO E INVESTIGACION
PROGRAMA INSTITUCIONAL DE BIOMEDICINA MOLECULAR
EVALUACION DE UNA VACUNA DE DNA CONTRA LA INFECCON PRODUCIDA
POR HSV-1
T E S I S
QUE PARA OBTENER EL GRADO DE MAESTRO EN CIENCIAS EN BIOMEDICINA MOLECULAR
PRESENTA
PATRICIA GABRIELA ZEPEDA LOPEZ
MEXICO, D.F. 2008
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El presente trabajo se llevo a cabo
En el laboratorio de biomedicina Molecular I
de la Escuela Nacional de Medicina y Homeopatía
Bajo la dirección del
Dr. Guillermo Pérez Ishiwara
Y en el laboratorio de Virología
del departamento de Microbiología
de la Escuela Nacional de Ciencias Biológicas
Bajo la dirección de la
Dra. Blanca Lilia Barrón Romero
Con apoyo económico de la CGPI y CONACYT.
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La sustentante fue becaria CONACYT
En el periodo agosto 2006-agosto 2007.
Y becaria PIFI
En los periodos enero 2005-diciembre 2007.
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AGRADECIMIENTOS
“CUANDO ALGUIEN EVOLUCIONA,
TAMBIÉN TODO EVOLUCIONA A SU ALREDEDOR”.
Infinitas gracias a mis profesores, por abrir este espacio de enseñanza y aprendizaje
en sus laboratorios. Al Dr. Guillermo Pérez, a la Dra. Blanca Lilia Barrón y al Dr. Julio
Cesar Carrero, por su confianza, su entrega y dedicación que me brindaron, para que
juntos culmináramos este proyecto de investigación con resultados muy favorables.
Agradezco a cada uno de mis sóndales por su tiempo y dedicación a la revisión de este
trabajo y sus enriquecedores comentarios.
A todos mis compañeros y Profesores del Posgrado de Biomedicina de laENMyH, por
dejarme crecer a su lado no solo como profesionista, si no como persona, por que en
su compañía aprendí de Biomedicina y de la Vida.
A todos los que forman parte del laboratorio de virologia de la ENCB, por compartir su
espacio, orientarme y apoyarme en todo momento durante este aprendizaje.
Mama te agradezco por sembrar en mi la semilla del éxito, estar conmigo en esta
etapa de mi crecimiento e impulsarme con tu amor a seguir evolucionando.
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A mis hermanas, por todos los momentos que hemos compartido y por ser parte de
vida.
A toda mi familia por su apoyo y cariño que siempre me han brindado.
A los amigos que he conocido en MJVC, GAP 99 y en mi andar por esta vida, con los
que he compartido los buenos y los malos momentos, gracias, por que indirectamente
estuvieron involucrados en este proyecto con su apoyo y entendimiento, ustedes
saben de mi cariño sincero.
Doy gracias a Dios por brindarme la oportunidad de vivir y colocarme en el camino de
la ciencia, por que a sido a través de ella que yo me pude conectar mas a su escencia.
Y como parte de un sano egoísmo, dedico esta tesis a quien se dio la oportunidad de
querer conocer más de la vida y experimentar con virus y ratones; y en ese andar
aprendió a evolucionar no solo como profesionista si no como persona. A la mujer que
gusto de verla evolucionar cada día: A MI MISMA.
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INDICE
I. INTRODUCCION. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .12
Generalidades. . . . . . . .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 12
Transmisión y epidemiología. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .13
Historia natural del herpes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 14
Taxonomia . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .15
Estructura del virion. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 16
Genoma viral. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .17
Mecanismo de infección. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 17
Ciclo replicativo. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .19
Glicoproteinas. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 21
Respuesta inmunológica . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 24
II. ANTECEDENTES. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 25
III. JUSTIFICACION . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . . . .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 28
IV. HIPOTESIS. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 29
V. OBJETIVO GENERAL. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .30
VI. OBJETIVOS PARTICULARES. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 30
VII. MATERIAL BIOLOGICO Y METODOLOGIA. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 31
Extracción del plásmido pcDNA-gH. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 31
Purificación del plásmido . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .32
Producción de células vero. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .32
Producción de HSV-1. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 32
Titulación del virus HSV-1. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 33
Estandarización del modelo animal de infección. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 34
Estandarización del esquema de inmunización. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .35
Análisis histopatológico. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .37
Ensayos de proliferación celular . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 38
Neutralización viral. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 38
VIII. RESULTADOS. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .39
IX. DISCUSIÓN. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .60
X. CONCLUSIONES. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .66
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XI. PERSPECTIVAS. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 67
XII. APENDICES. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 68
XIII. BIBLIOGRAFIA. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 75
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RESUMEN
La infección por el herpes simplex 1 (HSV-1), es una de las enfermedades virales mas frecuentes
a nivel mundial. Estos virus destacan por su capacidad para causar infecciones latentes y
recurrentes con complicaciones neurológicas las cuales se presentan en los grupos más
vulnerables como los lactantes y los adultos inmunodeprimidos.
La envoltura viral del HSV-1 presenta diversas glicoproteinas que participan en la infectividad
celular. La glicoproteína gH participa en la fusión de la membrana viral con la célula blanco, por lo
que juega un papel trascendente en la entrada del HSV-1 a la célula huésped. Esta proteína se
encuentra muy conservada y posee dominios homólogos entre los diferentes virus pertenecientes
a la familia herpesviridae. Además, por su posición en la membrana viral se le considera inductora
de una fuerte respuesta inmune. Conociendo estas propiedades biológicas en nuestro laboratorio
se construyó un plásmido pcDNA-gH recombinante que demostró tener la capacidad de bloquear
la infección herpética in vitro.
En el presente trabajo, se utilizó al plásmido pcDNA-gH como una vacuna de DNA para evaluar en
un modelo animal de infección su potencial vacunal. Los resultados mostraron que los animales
infectados y los de control de inmunización, desarrollaron una patología caracterizada por erosión
y ulceración en el sitio de inoculación, baja de peso, piloerección y daño neurológico manifestado
por parálisis de las patas traseras y xifosis. En contraste todos los animales inmunizados
presentaron remisión de las lesiones clínicas e histopatológicas, ausencia de signos neurológicos,
con estimulación de linfocitos y producción de anticuerpos neutralizantes contra el virus. Por lo
anterior estos resultados apoyan la propuesta de que el plasmido pcDNA-gH es un fuerte
candidato vacunal al permitir que el organismo recupere su función inmunológica, ya que la
infección herpética suprime la respuesta inmune.
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ABSTRACT
Infection with herpes simplex 1 (HSV-1), is one of the most common viral diseases worldwide.
These viruses are notable for their ability to cause latent infections and recurrent with
neurological complications which are presented in the most vulnerable groups such as infants and
immunocompromised adults.
The viral envelope of HSV-1 presents various glycoproteins involved in the infectivity of cells. The
glycoprotein gH involved in the fusion of the viral membrane with the target cell, which plays a
critical role in the entry of HSV-1 to the host cell. This protein is highly conserved domains and
has counterparts among different viruses belonging to the family herpesviridae. Moreover, his
position in the viral membrane is considered inducing a strong immune response. Knowing these
biological properties in our laboratory we built a recombinant plasmid pcDNA-gH who have
demonstrated the ability to block herpetic infection in vitro.
In the present study, we used the plasmid pcDNA-gH as a DNA vaccine to assess in an animal
model of infection potential vaccine. The results showed that infected animals and the control of
immunization, developed a disease characterized by erosion and ulceration at the site of
inoculation, weight loss, neurological damage and piloerección expressed by paralysis of the hind
legs and xifosis. In contrast all the immunized animals had remission of the clinical and
histopathological lesions, no neurological signs, lymphocyte stimulation and production of
neutralizing antibodies against the virus. In contrast all the immunized animals had remission of
the clinical and histopathological lesions, no neurological signs, lymphocyte stimulation and
production of neutralizing antibodies against the virus. Therefore these results support the
proposal that the plasmid pcDNA-gH is a strong candidate vaccine by allowing the body to regain
its immune function, as herpetic infection suppresses the immune response.
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I. INTRODUCCION
GENERALIDADES
El herpes es una enfermedad infecciosa viral, contagiosa y latente, que se caracteriza por
provocar lesiones a las superficies mucocutáneas, al sistema nervioso central y en ocasiones a
algunas vísceras. Dentro de las patologías asociadas como complicaciones de la infección están la
queratitis del ojo, la encefalitis, la meningitis, el eritema multiforme, las infecciones genitales y
una importante desmielinización de los axones neuronales sensitivos. Actualmente se sabe que
una de las principales etiologías de la parálisis facial se debe a la recurrencia por la infección de
herpes virus tipo 1 (VHS-1) (Mammette. 1992).
La expresión clínica de la infección zosteriforme se caracteriza por la aparición de pápulas,
que evolucionan a vesículas y a ulceras, hasta la formación de costras; son lesiones dolorosas y
pruriginosas, generalmente asociadas a fiebre (Field,H. 2001).
El diagnóstico del herpes se establece: i) al identificar las lesiones clínicas, ii) mediante el
aislamiento del virus, iii) por la detección de antígenos virales o la detección del genoma viral. El
tratamiento se basa en el control de la sintomatología y mediante quimioterapia antiviral (Field, H.
2001).
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TRANSMISION Y EPIDEMIOLOGIA
La transmisión de la infección se realiza a través del contacto directo, por contaminación
con saliva; por vía genital mediante contacto sexual y al momento del parto. La infección suele
ser localizada y es más frecuente en personas estresadas, ancianas ó inmunocomprometidas.
La infección por herpes simple es de las mas generalizadas, abarcando una elevada
proporción de la población mundial. En la ciudad de México, se demostró mediante un estudio
serológico que el 54.8% de los menores de 15 años tienen anticuerpos séricos neutralizantes,
como evidencia indirecta de que habían sufrido la infección. Dicho porcentaje vario de acuerdo
con la edad, en los recién nacidos el porcentaje se elevó al 66.1%, como consecuencia de la
presencia de anticuerpos maternos recibidos por vía placentaria; mientras que la proporción de
individuos seropositivos bajo hasta el 7.7 % en los bebes de 9 a 12 meses de edad. La
proporción de sujetos infectados se eleva rápidamente hasta llegar a más de 80% entre los
sujetos de 11 a 15 años de edad. De manera general se puede decir que aproximadamente un
80% de la población ha estado infectado en alguna etapa de su vida con HSV-1 y que el 40% de
ellos tiene herpes labial recurrente (Rocha, Gracia. y cols, 2002).
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HISTORIA NATURAL DEL HERPES
En la infección mucocútanea, la historia natural del herpes simple puede subdividirse en
tres fases denominadas, infección aguda o primaria, latencia y reactivación o recurrencia.
a) La primoinfección corresponde a la multiplicación inicial del virus en las células
epiteliales, donde la replicación viral es suficiente como para infectar las terminaciones nerviosas
sensoriales o autónomas. Al penetrar en la neurona, el virus es transportado intraaxonalmente
hasta los cuerpos de las neuronas ganglionares (Figura 1). Se desconoce el tiempo que transcurre
entre la inoculación del virus en los tejidos periféricos y su propagación hasta los ganglios, donde
se establece la etapa de latencia.
b) La latencia se establece con la llegada del virus a los ganglios sensitivos, el principal
sitio de establecimiento es el ganglio del trigémino. En esta etapa, los virus herpéticos son
excretados de forma intermitente, sin signos clínicos asociados. En el núcleo de neuronas con
infección latente aparecen abundantemente dos transcritos de RNA, vinculados con la latencia.
Figura 1: Esquema que muestra las fases de primoinfección, latencia y recurrencia en
la historia natural del herpes simple tipo 1. (Tomado de Wagner,Ed. 2003)
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c) La recurrencia se presenta ante factores muy variables y poco conocidos que
desencadenan la reactivación del virus, este desciende por el mismo axón hasta la piel,
generalmente hasta los márgenes muco-cutáneos de los labios, produciendo las lesiones
vesiculares recidivantes características del herpes labial (Fields, 1990).
TAXONOMIA
Los Herpesvirus constituyen un grupo grande y heterogéneo de virus con genoma de DNA. En
base a sus diversas propiedades biológicas y moleculares se reconocen tres subfamilias:
alphaherpesvirinae, betaherpesvirinae y gammaherpesvirinae.
Los Alphaherpesvirinae se caracterizan por un ciclo de replicación relativamente corto, de difusión
rápida a nivel de los cultivos celulares, destrucción de la célula infectada y capacidad de
establecer latencia primaria, a nivel de los ganglios sensitivos. Dentro de esta subfamilia se ubica
al virus Herpes simple tipo 1 y 2 (HSV1 y HSV2) y el virus de la Varicela Zoster (VZV).
La familia Betaherpesvirinae poseen una morfología típica, su genoma de DNA es grande, poseen
la capacidad de establecer infecciones virales persistentes y latentes, son especie específicos y
crecen muy lentamente en cultivos celulares; dentro de esta subfamilia podemos citar al
Citomegalovirus (CMV) y a los Herpesvirus humanos 6 y 7 (HHV6 y 7).
Los Gammaherpesvirinae se replican y permanecen en forma latente en los linfocitos, causando
linfomas, leucemias y trastornos linfoproliferativos. Como ejemplo de esta subfamilia podemos
citar al virus de Epstein-Barr (EBV) y HHV-8.
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Como se ha mencionado, existen dos serotipos de virus Herpes Simplex: Virus Herpes Simplex
tipo 1 (HSV1) y virus herpes simplex tipo 2 (HSV2). Su morfología, así como la forma de
organización del genoma son idénticas; poseen un 50% de similitud en secuencias y se distinguen
por su poder patógenico, por sus características epidemiológicas y por la localización de las
manifestaciones clínicas mucocutáneas habituales (Roizman, 2001).
ESTRUCTURA DEL VIRION
La partícula viral comprende: i) Un core que contiene DNA viral, el cual es bicatenario y lineal, de
peso molecular superior a 80 x 106 daltons y está enrollado alrededor de una capa proteica. ii)
Una cápside icosahédrica de 125 nm de diámetro constituida de 162 capsómeros. iii) Un
tegumento constituido por proteínas virales de estructura fibrilar que asegura la unión entre la
cápside y la envoltura. El grosor del tegumento es variable, afectando por tanto el tamaño del
virión, que llega a medir entre 150 y 200 nm. iv) Una envoltura o membrana que está constituida
de una doble capa lipídica derivada de las membranas celulares, que son adquiridas por el virus
en el momento de salir por gemación de las células infectadas. La envoltura contiene espículas de
alrededor de 8 nm de largo, formadas por proteínas y glicoproteínas virales, de las cuales algunas
son responsables de la fijación del virus a las células. La integridad de la envoltura es necesaria
para la infectividad viral y su naturaleza lipídica le da la posibilidad de ser degradable por los
agentes fisicoquímicos y ello confiere a los Herpesvirus de una gran fragilidad al ambiente
(Mammette. 1992).
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GENOMA VIRAL
Esta constituido por alrededor de 150.000 pares de bases. Contiene Secuencias repetitivas
terminales (TR), secuencias invertidas (IR), las cuales se encuentran flanqueando las regiones
únicas largas (UL), usualmente de un tamaño de 100 kb (Roizman, 2001).
El genoma del HSV-1 codifica para cerca de 100 genes y 75 proteínas, de las cuales solamente 37
son necesarias para el crecimiento viral en los cultivos celulares. Estos genes esenciales codifican
productos como: proteínas estructurales virales y proteínas de infección a células diana, proteínas
de expresión viral para la replicación del genoma y proteínas de empaquetamiento para nueva
progenie. Los restantes genes tienen funciones para el control de la expresión viral y
sobreponerse a la respuesta que el huésped manda contra la infección viral (Robert G, 1994).
MECANISO DE INFECCIÓN.
El proceso de entrada del virus a la célula se divide en dos partes:
1) La adhesión o unión a la célula, se lleva a cabo a través de la unión de la glicoproteína gC a su
receptor celular, por medio de moléculas de glicosaminoglicanos como el heparan sulfato.
Posteriormente, la glicoproteína gD se une a los mediadores de entrada para los herpesvirus
(Hve) para completar la unión del virus a la célula (Figura 2). El mediador HveA es un miembro de
la familia del factor de necrosis tumoral (TNF), mientras que el HveB y HveC pertenecen a la
superfamilia de las inmunoglobulinas y están muy relacionados con los receptores (Pvr) de los
poliovirus. Estos receptores participan en la infección de varios tipos de células, incluyendo las
células linfáticas (HveA) y neuronales (HveC). Además, la glicoproteina gD activa al complejo de
glicoproteinas gH-gL con la finalidad de lograr la fusión de la membrana viral con la célula (Carfi,
A. y cols. 2001).
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2) El segundo paso de la infección viral es la penetración de la célula. Este fenómeno se genera
por la fusión de la envoltura viral con la membrana celular. Las glicoproteínas que participan en
esta fase son: gB, gH y la gL (Fig 2). Después de entrar a la célula, el virus pierde su envoltura
para que posteriormente la nucleocápside se libere en el citoplasma para migrar y penetrar al
núcleo celular (Browne y cols. 1993).
Figura 2: Esquema que muestra la participación de las glicoproteinas. Las glicoproteinas
gC y gD, participan en la unión a los receptores celulares. Así como el complejo de las
glicoproteinas gH-gL y la gB, esta involucrado en la fusión de la membrana celular con la
membrana viral (Tomado de Wagner,Ed. 2003).
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CICLO REPLICATIVO
La transcripción viral es iniciada por una proteína activadora que es parte del tegumento de las
partículas HSV. Esta proteína se conoce como alpha-TIF ó como el activador-trans de los genes
alfa (VP16), la cual activa la transcripción de los genes inmediatos-tempranos virales, actuando
conjuntamente con algunos factores de transcripción celular, como el Oct-1 y el factor de
proliferación endógena. La presencia ó ausencia de factores, se cree que son críticos en
determinar cuando el HSV-1 expresa los genes líticos o cuando se establece una infección latente
(Roizman, 2001).
Los Herpesvirus codifican un número importante de proteínas implicadas en la síntesis del DNA
viral y en la formación de nuevos viriones. Su expresión genética está fuertemente regulada en el
tiempo y en la aparición de 3 tipos sucesivos de proteínas en las células. El primer grupo de
proteinas en expresarse son las proteínas muy precoces o muy tempranas (immediate early
antigens, IEA) encargadas de activar la transcripción de genes virales tempranos, aparecen al
inicio del ciclo de replicación y participan en la regulación génica viral (G. Carballal. 1992).
El HSV-1 codifica un total de 5 genes tempranos, designados como ICP (Infected Cell Proteins o
proteínas de células infectadas) 0, 4, 22, 27 y 47. De éstas, solamente la ICP4 y la ICP27 son
necesarias para la replicación viral. Estas proteínas son reguladores de transcripción de los genes
virales tempranos y tardíos. El ICP4 inhibe la expresión de los genes tempranos, lo que ayuda a
parar la actividad de los genes inmediatos-tempranos en las fases tardías de la infección viral
(Brehm y cols. 1990).
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El segundo grupo corresponde a las Proteínas precoces o tempranas (early antigens. EA), que
participan en la replicación y en la síntesis de DNA. Se destacan la presencia de enzimas que
actúan directamente en la replicación del DNA, como la DNA polimerasa y la DNA helicasa
(Roizman, 2001).
Finalmente las proteínas tardías (late antigens, LA) son proteínas de estructura, encargadas de
ensamblar la cápside y de expresar proteínas del tegumento. Se sintetizan después de que se ha
replicado el DNA.
La etapa final de maduración celular se realiza a nivel de la membrana, donde las cápsides
adquieren su envoltura, la cual esta constituida por una doble hoja fosfolipídica de origen celular
en la que son incluidas las glicoproteinas virales. La célula huésped libera así numerosas partículas
infecciosas. Durante el curso del ciclo de replicación, las proteínas virales bloquean la síntesis de
la célula huésped y provocan su muerte (Fields, 1990).
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GLICOPROTEINAS
La envoltura viral permite la expresión integral de 7 importantes glicoproteinas de superficie que
participan en la infectividad del herpes virus: gB, gC, gD, gE, gH, gI. Estas glicoproteinas son
capaces de conferir una identidad antigénica y biológica a cada herpes virus.
La glicoproteina gC permite el reconocimiento del receptor celular tipo heparan sulfato, pero no
es indispensable para la entrada del virus al huésped, la eliminación de los aminoácidos 33 y 123
reduce la afinidad hacia el heparán sulfato (Spears,P. 2004).
La glicoproteina gB posee dos regiones citoplasmáticas, la primera entre los aminoácidos 818 al
826, importante para el transporte de gB a través del retículo endoplásmico y por tanto para la
diseminación célula-célula, mientras que la segunda región en el sitio carboxilo terminal, no se
considera importante. (Heineman T, y cols. 2004)
La glicoproteina gD se caracteriza por su unión específica con receptores HVEM, nectina 1 y
nectina 2. HVEM se encuentra principalmente en linfocitos T, linfocitos B, y fibroblastos, mientras
que las nectinas se localiza en células de origen neuronal. Las células epiteliales expresan tanto
nectina 1, 2 y HEVM. Por lo anterior, gD es una proteína que recluta y activa proteínas para la
entrada del virus al huésped, permitiendo la unión de la membrana viral con la celular, a la vez
esta encargada de activar el complejo gH-gL, importante para la fusión membranal (Johnson,
Apear 2004).
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La glicoproteina gL se encuentra formando un complejo con la glicoproteina gH (figura 3), cuya
función propuesta, es ocultar la hélice hidrofóbica de gH para aumentar su solubilidad en agua y
evitar la agregación hidrofobica. Este complejo es importante por que se encarga de la fusión de
la membrana del virus con la célula blanco.
FIGURA 3: Modelo propuesto para el complejo gH-gL. Se muestra el extremo C terminal de
cada una de las proteínas señalado como COO-. Las líneas punteadas señalan los enlaces
existentes entre las cisteinas presentes en gH. La cola citoplasmática indica la región crítica para
la fusión de membranas, la región indicada como gH323 y gL 161 esquematizan el sitio de la
formación del dimero gH-gL. (Tomado de Peng, T. Ponce De Leon, 1998)
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La glicoproteina gH posee 838 aminoácidos, tiene una señal de anclaje que se ubica en los
primeros 18 residuos; cuenta con siete sitios de N-glicosilacion y 11 sitios de O-glicosilación. Los
residuos 804 al 824 constituyen la región transmembranal de naturaleza hidrofobica; entre los
aminoácidos 259 al 388 se encuentra el sitio de asociación con gL. Mientras que en los
aminoácidos 19 al 323, se ubican los sitios antigénicos reconocidos por anticuerpos monoclonales
(figura 2). Mutaciones en los aminoácidos 808 (alanina), 809 (serina) y 812 (glicina), generan la
perdida de la función de gH (Forrester y cols. 1991).
La región carboxilo y la cola citoplasmática de la glicoproteina gH juega un rol importante en la
fusión de membranas, tiene elementos estructurales y funcionales clásicos de proteínas de fusión
tipo I, organizados en repetidos de siete aminoácidos o heptapéptidos hasta formar una hélice
alfa que forma los péptidos de fusión. Las dos alfa hélices de gH se localiza en los aminoácidos
377 al 397 y del 513 al 531, y representan un domino critico para la función de gH. Si se deletan
o se mutan estos péptidos, la fusión entre la membrana celular y viral no se produce, por lo tanto
la infección decrece (T. Gianni y cols, 2005).
Se desconoce la existencia de receptores celulares para gH, los cuales podrían ser utilizados por la
glicoproteína viral dependiendo de su disponibilidad en la célula huésped. La glicoproteína E y la
glicoproteína I, codifican receptores para la fracción Fc de las inmunoglobulinas IgG, estas
glicoproteinas en conjunto con la gH evitan que la célula infectada sea destruida por lisis mediada
por anticuerpos (Lupi. O, 1994).
24
RESPUESTA INMUNOLOGICA
La respuesta serológica inmune del huésped ante la infección con HSV-1 depende de la célula
infectada. En el caso del herpes simple 1, las células principalmente infectadas son los
keratinocitos, donde los macrófagos y las células natural killer, así como la secreción de
interferones alfa y beta participan durante las primeras horas o días posteriores a la infección, con
la finalidad de restringir la replicación viral y limitar la dispersión inicial del virus (Asanuma y cols,
2002)
Al momento que ocurre la infección, las glicoproteinas virales actúan como antígenos que se
procesan por proteasas citoplasmáticas dando lugar a péptidos, para ser transportados al retículo
endotelial (RER), donde son acoplados al surco de moléculas de histocompatibilidad tipo MHC I.
Lo anterior con la finalidad que puedan ser reconocidos por los receptores de los linfocitos CD8+,
que contribuyen a la activación de linfocitos T citotóxicos (CTL). A su vez, los antígenos virales
son procesados por las células presentadoras de antígenos (APC´s), induciendo la expresión de
moléculas MHC-II reconocidas por los linfocitos CD4+, mediadores de la neutralización y de la
citólisis. También se incrementan citosinas β, linfocitos T cooperadores TH1 y TH2 y el interferón
alfa (Barcy, S y Corey, 2001). Se sabe que la respuesta de las células T CD8+ específica contra el
HSV es crucial para la eliminación del virus en las lesiones. El virión del HSV expresa genes
dirigidos a inhibir estas respuestas del hospedador; por ejemplo el gen US-12 codifica para una
proteína que se puede fijar a la proteína activadora-transportadora celular (transporter-activating
protein, TAP-1) y disminuir la capacidad que tiene de ligarse a péptidos de HSV y por tanto, al
complejo mayor de histocompatibilidad de clase I. Lo anterior permite disminuir la identificación
de las proteínas víricas por parte de las células T citotóxicas del hospedador. También las
proteínas virales ICP47 y la ICP0 son capaces de bloquear la respuesta inmune de las células
infectadas y evitar la respuesta de MHC I (Blaney y cols,2002).
25
II. ANTECEDENTES
Las vacunas constituyen un aliado importante en la lucha contra las enfermedades infecciosas,
como el herpes simple 1. Tradicionalmente las vacunas experimentales han incluido virus muertos
o atenuados, mezclas de proteínas virales con adyuvantes y mas recientemente el desarrollo de
algunos péptidos recombinantes con relevancia inmunogénica (Fletcher, 2001).
Las primeras vacunas consistieron en el empleo de virus vivos inactivados por calor. Por ejemplo
la vacuna denominada Lupidon, fue evaluada epidemiologicamente, encontrando que se prolonga
el intervalo en la presentación de las recurrencias en los sujetos vacunados, comparativamente
con aquellos no vacunados (Dundarov. S y cols, 1982).
La segunda generación de vacunas se caracterizó por el empleo de glicoproteinas virales
sintetizadas in vitro. En ese periodo, las glicoproteinas mas estudiadas fueron la gB y gD del HSV-
2 (Corey,L. Koelle,D. 2003). Se reportó en un estudio publicado por Udayasan y Kamaragu en el
2002, que los animales inmunizados con péptidos derivados de la glicoproteína gB2, asociados a
una proteína de choque térmico (hsp70), actúan como un potente inmunógeno, ya que se
presentaba un incremento de la respuesta inmune celular mediada por linfocitos CD8+. En otro
estudio, donde también se emplearon concentrados derivados de las glicoproteinas gB y gD de
HSV-2, se encontraron títulos altos de anticuerpos neutralizantes para HSV-2, pero sin la
reducción de las infecciones recurrentes (Corey.L, 1999).
Por otro lado, el uso de vacunas génicas o de DNA, están siendo ampliamente exploradas en el
combate de diversas enfermedades infecciosas, debido a que tienen una potente estimulación
inmunológica, tanto de la respuesta celular como la humoral con la disminución de los riesgos
asociados a emplear organismos o cepas atenuadas (Lupi.O. 2000).
26
De manera similar mediante el uso de métodos genéticos, se han construido mutantes virales de
las glicoproteinas del herpes simple. Una de las primeras mutantes virales evaluadas, ha sido la
deleción de los aminoácidos 696 de la gB y el aminoácido 302 de la gD, expresadas y
transfectadas en células CHO, observandose un incremento en la producción de anticuerpos
neutralizantes en los sujetos inmunizados con esta construcción (C.L Dekker y cols, 1992).
Otra variante de propuesta de vacuna génica, es una mutante viral a la que se les deletaron los
genes que codifican para las proteínas ICP27 e ICP28, fundamentales en la producción de la fase
de latencia. En la evaluación de este candidato vacunal se reportó un decremento de la
neurovirulencia en los ratones infectados, así como un incremento del reconocimiento de las
células infectadas por linfocitos CD8+ (Fletcher, 2001).
Como se comentó previamente, se propone que la entrada del virus a la célula, ocurre por la
acción de las glicoproteinas virales, de las cuales principalmente la glicoproteina gH, participa en
la fusión de la membrana viral con la célula blanco y permite la entrada del virus a la célula
huésped. Esta glicoproteína se encuentra muy conservada y posee dominios homólogos entre los
diferentes tipos de herpes virus.
Conociendo las propiedades de esta glicoproteína, en estudios previos, se construyó una mutante
del herpes simple 1, a la que se le deletaron las secuencias que codifican para la glicoproteína gH.
Al emplear esta mutante para infectar células Vero, se demostró que la progenie de estos virus,
puede producir viriones que salen de la célula infectada, pero que son incapaces de infectar a
otras células (Forrester y cols, 1992).
27
También se demostró que el efecto citopatico del HSV-1 en cultivos celulares puede ser
neutralizado mediante el empleo de anticuerpos MabLP11, capaces de reconocer a la glicoproteina
gH, lo que sugiere que gH juega un papel importante en la entrada del virus a la célula blanco
(Peng,T.M Ponce de Leon, 1998).
Teniendo en consideración estos estudios, en nuestros laboratorios se propuso la obtención de
una glicoproteína gH recombinante. Para ello, primeramente se amplificó por medio de la técnica
de PCR, el gen UL22 del HSV-1, el cual codifica para la glicoproteína gH. El fragmento,
posteriormente se clonó en el plásmido de expresión para procariotes (pET101-gH) y se subclonó
en el vector de expresión en eucariotes pcDNA 3.1(-). Con el plásmido obtenido (pcDNA-gH), se
transfectaron células Vero, detectando la presencia de la glicoproteína gH por medio de
inmunohistoquimica y Western Blot. De manera importante también se determinó que
anticuerpos especificos antigH (MabLP11), bloquearon la infección zosteriforme (Elizabeth Ortega,
2005).
28
III. JUSTIFICACION
La infección mucocútanea generada por el HSV-1 es una de las patologías más frecuentes de
nuestra sociedad, donde las principales complicaciones como encefalitis, parálisis facial o
queratitis, así como la recurrencia de la activación del virus, se presentan los grupos más
vulnerables, tales como los lactantes y los adultos inmunodeprimidos. Por lo anterior se hace
deseable una vacuna efectiva contra HSV-1 que logre disminuir la morbi-mortalidad producida
por la diseminación de la infección del herpes.
Un ideal de vacuna contra virus herpes simples 1, deberá inducir una respuesta inmunológica
capaz de prevenir la infección, incrementar la producción de células protectoras como los
linfocitos CD4, CD8 y linfocitos B neutralizantes, que además de mitigar las lesiones primarias, sea
capaz de prevenir la colonización de los ganglios y reducir la frecuencia o la severidad de las
recurrencias.
Por lo anteriormente comentado proponemos que el bloqueo de la glicoproteína gH puede ser una
estrategia eficaz para brindar protección hacia las infecciones herpéticas tipo zosteriforme y evitar
las complicaciones por la diseminación del herpes.
29
IV. HIPOTESIS
La construcción de un plásmido pcDNA-gH recombinante utilizado como vacuna de DNA, tiene la
propiedad de generar una respuesta inmune capaz de conferir protección contra la infección
herpetica zosteriforme tipo 1.
30
V. OBJETIVO GENERAL
El objetivo de la presente investigación tiene como finalidad evaluar la capacidad protectora que
induce el uso del plásmido pcDNA-gH recombinante de HSV-1 en un modelo animal, ante la
infección zosteriforme tipo 1.
VI. OBJETIVOS PARTICULARES
• Producir el plásmido pcDNA gH de calidad y pureza para emplearlo como vacuna
de DNA.
• Estandarizar el modelo de infección con HSV-1 en ratones Balb/C.
• Estandarizar el esquema de inmunización con el plásmido pcDNA-gH recombinante.
• Evaluar la respuesta inmune inducida y los hallazgos histopatológicos de los
organismos infectados e inmunizados con la infección zosteriforme.
31
VII. METODOLOGIA
EXTRACCION DEL PLASMIDO pcDNA-gH.
1.- Se prepararon células competentes frescas, en un cultivo con 5 ml de luria y una asada de
células DH5α (E.coli) en agitación de 8-16 h a 37°C. Al otro día, en un matraz de 125 ml con 40
ml de Luria, se adicionaron 400μl del cultivo, dejandolo incubar a 37°C hasta alcanzar una
densidad optica de 0.4. Posteriormente, se centrifugó durante 5 minutos a 3000 rpm a 4°C, la
pastilla obtenida sin el sobrenadante se resuspendió con 20 ml de CaCl2 (50 mM) incubando 20
minutos en hielo. Se centrifugó duránte 5 minutos a 3000 rpm y finalmente la pastilla se
resuspendió en 4 ml de CaCl2 frió, dejando en refrigeración.
2.- Para realizar la transformación se tomaron 150 μl de células competentes DH5α, se añadieron
3.4 ng de plasmido pcDNAgH o la mezcla de ligación, dejandola en hielo durante 30 minutos.
Posteriormente se calentó 90 segundos a 42°C y se colocó en hielo por 3 minutos. Se le adicionó
200 μl de medio luria y se agitó por 60 minutos a 37°C.
El contenido se espatuló en una caja petri, conteniendo Luria con ampicilina (50μg/ml). Como
control negativo, se utilizarón las células DH5α, sin el plásmido.
3.- La extracción del DNA de las células transformadas se realizó por la metodología de lisis
alcalina. Se colocó en un tubo eppendorf, 1.5 ml de cultivo, se centrifugó por 5 min a 1400 rpm a
4°C. Se separó el sobrenadante de la pastilla obtenida, resuspendiéndola en 100 μl de solución I,
se agitó y le adicionaron 200 μl de solución II, agitándolo 5 minutos en hielo, para finalmente
adicionarle 150 μl de solución III, incubando nuevamente por 5 minutos en hielo. Se centrifugó
por 5 minutos a 1400rpm a 4°C, al sobrenadante obtenido se le adicionó 1 ml de etanol 100%, y
se centrifugó nuevamente. Se decantó el alcohol y se dejó secar, finalmente a la pastilla obtenida
se le resuspendió en 30 μl de agua estéril.
4.- El plásmido obtenido se analizó por restricción enzimática en un gel de agarosa al 0.8%, con
las enzimas HindIII y XbaI, utilizando como marcador de tamaño molecular λ HindIII.
32
PURIFICACION DEL PLASMIDO
El plásmido recombinante de interés se purificó mediante el uso de columnas de afinidad. Para lo
anterior, se colocó un inoculo del cultivo de la cepa de interes en 5 ml de medio luria dejándolo
incubando toda la noche a 37°C. Posteriormente se inocularon 2 matraces con 500ml de medio
luria con 1 ml del cultivo y 1 ml de ampicilina incubando toda la noche a 37°C.
El cultivo obtenido se centrifugó a 600 rpm por 15 minutos a 4°C, la pastilla se resuspendió en 70
ml de regulador P1 y RNasa, adicionando 70 ml del regulador P2, para producir la lisis bacteriana,
se mezcló e incubó en hielo por 30 minutos para centrifugarlo a 700 rpm por 30 minutos.
El sobrenadante obtenido se filtró en jeringas con gasa, previo al paso por columnas con la
finalidad de remover los detritos celulares. Las columnas se equilibraron con 35 ml del regulador
QBT y se lavaron con regulador QC. El DNA obtenido se eluyó con 35 m de regulador QF.
Finalmente se le agregaron 12.3 ml de ispropanolol, para pecipitar el DNA y se centrifugó por 55
minutos a 4000 rpm. A la pastilla obtenida se le adicionaron 7 ml de etanol al 70% para
finalmente volverlo a centrifugar por 20 minutos. El DNA purificado se resuspendió en 500 μl de
agua bidestilada. Finalmente al plásmido pcDNA recombinante (pcDNA-gH) y el vector vació
(pcDNA 3.1-) purificados, se cuantificaron por espectrofotometría y se realizó el calculo de la
densidad óptica, con la finalidad de conocer la calidad y pureza de los plasmidos.
PRODUCCIÓN DE CÉLULAS VERO
Las células Vero fueron mantenidas en medio de crecimiento celular utilizando 10% de medio
mínimo esencial con sales de Earle, adicionandole 0.17% de bicarbonato de sodio y 10 % de
suero bovino de neonato. Se crecieron en botellas de vidrio para crecimiento celular y se
incubaron a 37°C en atmosfera húmeda con 5% de CO2, hasta lograr un 100% de confluencia.
PRODUCCIÓN DE HSV-1
Cuando las células Vero, crecieron hasta un 100% de confluencia, se les retiro el medio de
crecimiento celular, sustituyéndolo por medio de mantenimiento con solo 1% de suero.
Posteriormente, las células se infectaron con 50 μl de de suspensión viral de HSV-1, y se
incubaron a 37°C, hasta observar el efecto citopático en el 100% de la monocapa.
33
Durante la propagación y la cosecha del virus se utilizaron cultivos celulares libres de
contaminación vigilados por pruebas de esterilidad. Conforme se obtuvo cada cultivo con el efecto
citopático, el cultivo celular se congeló a -70°C, para finalmente por grupo de cosecha
descongelar y centrifugar 15 min, a 2500 rpm. El sobrenadante recuperado, previa prueba de
esterilidad, se envaso en tubos eppendorf (1.5ml) y se mantuvo a -70°C hasta su aplicación.
TITULACION DEL VIRUS HSV-1
La determinación cuantitativa de la actividad viral se calculo por el método de Sperman-Kärber,
expresado en dosis infectiva para cultivos de tejidos al 50% (DICT50), para lo cual se
prepararon diluciones 1:1000 del virus problema, utilizando como diluyente, medio de
mantenimiento.
Se procedió a colocar en una microplaca de 96 pozos 100 μl de medio de mantenimiento, 100 μl
de la dilución del virus por titular en diluciones subsecuentes desde 1 x10-1 hasta 1 x10-8,
desechando el sobrante. Finalmente, se colocaron 100 μl de suspensión celular (Figura 4). Se
incluyeron 2 testigos, el testigo positivo que fueron células infectadas con el virus sin diluir y el
testigo negativo que correspondió a las células sin infectar. Al concluir el proceso, la microplaca se
incubó a 37°C en atmosfera húmeda con 5% de CO2.
Figura 4: Esquema ilustrativo de la titulación viral. Se muestra el sentido en el que se
colocaron las diluciones del virus a titular, hasta el pozo 10 donde se descarta el sobrante de las
diluciones, en contrasentido se colocan en cada pozo sin diluir, la suspensión celular. El pozo 12
corresponde al testigo celular y el pozo 11 al testigo negativo.
1:1000
100µl
3) Virus
descartar
4) Células100 µl
Suspensión celular
Inc. 37ºC
34
El efecto de las diferentes diluciones del virus sobre la monocapa celular se observó diariamente
al microscopio, anotando el número total de pozos que presentan efecto citopático a las 72 h. Se
realizaron los cálculos para expresarlos en dosis infectivas para cultivos de tejidos al 50%
(DICT50).
ESTANDARIZACION DEL MODELO ANIMAL DE INFECCIÓN.
Para la estandarización del modelo animal de infección, se utilizaron 9 ratones de la cepa
Balb/C de 6 semanas de edad, clasificados en tres diferentes grupos, el primer grupo se infectó
con HSV-1 a dosis infectiva de 5 x104, el segundo grupo de ratones correspondió al control de
infección, debido a que se inocularon con medio de mantenimiento. El último grupo se mantuvo
sin manipular, correspondiendo al control sano.
El procedimiento de infección se realizó de acuerdo con el procedimiento descrito por Kurokawa
(Kurokawa, 1993), el cual consistió en depilar, el flanco izquierdo de cada ratón, utilizando un
depilador químico. Entre las 24 y 48 hrs posteriores, sobre la piel desnuda, se les produce una
escarificación, con un rastrillo sin filo, sitio donde se les infectó con 50 μl de HSV-1 a 1 x106
DICT50/ml.
Se observó y pesó diariamente a los animales infectados, registrando el desarrollo de la patología
encontrada, utilizando los criterios descritos por Kurokawa (Kurokawa,1993).
35
TABLA I: Grados de patología herpetica descritos por Kurokawa,1993.
PATOLOGIA GRADO
Sin lesión 0
Vesículas en región local 2
Erosión y/o ulceración en región local 4
Lesión zosteriforme leve: baja de peso,
piloerección.
6
Lesión zosteriforme moderada: encorvamiento,
parálisis de pata trasera cercana a la lesión.
8
Lesión zosteriforme severa: parálisis de ambas
patas traseras, movimientos y respiración
lenta, ojos entrecerrados.
10
muerte 12
Cuando los animales desarrollaron hasta un grado 10 de patología herpetica, se sacrificaron para
extraerles muestras de tejido cutáneo, tejido nervioso y el bazo, para estudiar los cambios
histopatológicos y la respuesta inmune producida ante la infección entre cada grupo. Los animales
previa eutanasia, se anestesiaron con una mezcla de éter-alcohol-cloroformo en relación 1:1:1, y
se les practico perfusión cardiaca para la obtención de suero.
36
ESTANDARIZACION DEL ESQUEMA DE INMUNIZACION.
Para el desarrollo del esquema de inmunización se utilizaron 30 ratones machos de la Cepa Balb/C
de 4 semanas de edad. Se clasificaron en 3 grupos control y 3 grupos de experimentación,
utilizando 5 ratones para cada grupo.
El primer grupo control se denominó control sano, debido a que se mantuvo sin manipular, el
segundo grupo correspondió al control positivo de infección, este se infectó con 50 μl de HSV-1
1x106 DICT50/ml, sin inmunización previa. El tercer grupo se le identificó como control de
inmunización, por que se le inmunizó vía intraauricular con 50 μl del plásmido pcDNA3.1 (-). La
dosis total de cada inmunización, se dividió a la mitad para ser inoculada vía intraauricular, en
cada oreja.
Los tres grupos de experimentación se inmunizaron con el plásmido pcDNA-gH purificado
previamente. Se seleccionaron dos vías de inmunización; la intraauricular y la intramuscular. Al
primer grupo de experimentación, identificado como i.e 25; se le inmunizó con 25 μl del plasmido
pcDNA-gH, vía intraauricular (i.e) en ambas orejas de cada animal. Al segundo grupo de
experimentación, nombrado i.e 50; se le inmunizó por la misma vía intraauricular, pero con 50 μl
del plasmido pcDNA-gH. Finalmente al tercer grupo de experimentación, etiquetado como i.m 50;
se le inmunizó con 50 μl del plásmido pcDNA-gH vía intramuscular en una sola aplicación.
A las cuatro semanas de vida de los ratones, se aplicó la primera dosis de inmunización con el
plasmido pcDNA-gH para los tres grupos de experimentación, así como para el grupo control de
inmunización pero con el plasmido pcDNA 3.1(-). La segunda dosis de inmunización se realizó 7
días despues utilizando las mismas vías, plasmidos y dosis. A los siete días posteriores de la
segunda inmunización, todos los ratones, excepto el grupo control sano o negativo, fueron
infectados siguiendo la misma metodología empleada para el desarrollo de la estandarizaron del
modelo animal de infección (figura 5).
37
FIGURA 5: Esquema de inmunización. Se dieron dos dosis de inmunizaciones, la primera a la
4ta semana de vida, la segunda a la 5ta semana, una semana posterior se les reto con el virus. Se
registraron diariamente los datos patológicos, de comportamiento y de peso durante la evolución
de la infección. Al día 14 se sacrificaron los animales, para obtener las muestras para estudios
histológicos e inmunológicos.
Es importante mencionar que previa inmunización e infección, se extrajo sangre de las arterias
ópticas de dos ratones de todos los grupos estudiados, para obtener los sueros y realizar su
análisis. En el periodo de la evolución de la patología herpetica, a cada ratón se le registro
diariamente el peso, se documento la conducta observada y el grado de patología desarrollada
(figura 5). Al día 14 postinfección, todos los animales se sacrificaron, para extraerles muestras de
tejido cutáneo, tejido nervioso y el bazo, para describir los cambios histológicos y la respuesta
inmune producida ante la infección. Los animales previa eutanasia, se anestesiaron con una
mezcla de éter-alcohol-cloroformo en relación 1:1:1, y se les practico perfusión cardiaca para la
obtención de suero.
ANÁLISIS HISTOPATOLOGICO
Para el estudio histopatológico, se obtuvieron los tejidos cutáneos del sitio de las lesiones, el
tejido nervioso y el bazo. Los tejidos se fijaron y almacenaron en tubos eppendorf, con solución
de paraformaldehido 4% y formol al 3.85%. Las muestras previa clasificación se incluyeron en
parafina y se obtuvieron cortes de 5mm de grosor, los cuales se desparafinaron sumergiendo las
laminillas en xilol (2 veces), alcohol absoluto (2 veces), alcohol al 70%, agua desionizada.
Enseguida los tejidos se contrastaron con hematoxilina y eosina, para su análisis a través del
microscopio óptico.
4 5 6Semanas de vida
Evaluación Histopatológicainmunológica
1era 2dainmunizaciones
Sacrificio
Días post infección1-14 día.
ValoraciónPatológica
ComportamientoPeso
14 día
RetoHSV-1
Tiempode
evolución
38
ENSAYOS DE PROLIFERACIÓN CELULAR.
Para la transformación blastoide, se extrajo el bazo del animal en condiciones estériles, y
se extrajeron los esplenocitos por perfusion, mediante el uso de una malla metálica, recibiéndolas
en 5 ml de medio RPMI suplementado. Todo lo perfundido, se colocó en un tubo de 15 ml, en
hielo y se centrifugó a 1200 rpm durante 5-10 min. El sobrenadante se descartó y el paquete
celular se resuspendió en 2 a 3 ml de solución hemolizante fría, por 3-5 min. Posteriormente se
agregaron 7 ml de medio suplementado y se volvió a centrifugar a 1200 rpm durante 5-10 min. El
sobrenadante se descarto y el paquete celular que se observó blanco y con pocas trazas de
eritrocitos, las células se resuspendieron en 2 ml de medio suplementado.
Se contaron las células en cámara de Neubauer y se ajustaron a 5 x 105 por 100 μl. Se
agregaron 100 μl de la suspensión célular a una placa de cultivo de 96 pozos por triplicado para
cada uno de los estímulos a ensayar. Se completo con 100 μl de medio solo o de medio con
concanavalina (1 a 2 μg/pozo) o con 5 x105 a 1x107/pozo de HSV-1. Las placas se incubaron a
37 oC, 5% CO2, 95% de humedad durante 48 h. Posteriormente se les agregó timidina tritiada en
20-50 μl de medio RPMI suplementado y se dejaron las placas en la incubadora por 18 h.
Las células se obtuvieron en un cosechador, dejando secar las tiras de fibra de vidrio en
un horno para ser leídas en un contador de centelleo beta.
NEUTRALIZACION VIRAL.
Para la neutralización del virus, se procedió a inactivar 100μl de suero de los animales en estudio,
por 1 h a 60°C. Por otro lado en microplacas de 96 pozos se colocaron 100 μl de medio de
mantenimiento, posteriormente cada uno de los sueros inactivados se anexaron por duplicado y
en diluciones seriadas 1:2 a 1:256, desechando el sobrante. Seguido se añadieron 5 TCID50/100 μl
de virus HSV-1, de un titulo de 106 TCID50, la mezcla fue incubada 37°C en atmosfera de CO2 al
5% e inoculada posteriormente sobre células Vero. Se observó diariamente al microscopio
registrando el efecto de las diferentes diluciones del virus sobre la monocapa celular.
39
(-)
5348pb
gH 2592 pb
A
VIII. RESULTADOS
Para cumplir con los objetivos planteados en la presente tesis se emplearon los plasmidos pcDNA-
gH, y el control negativo pcDNA 3.1(-) producidos Elizabeth Ortega en el 2005 durante su tesis
de maestría. Ambos plasmidos fueron transformados en bacterias DH5α y analizados por
restricción enzimática y electroforesis para verificar las construcciones contenidas (Figura 6). La
restricción enzimática se realizó por duplicado en el mismo gel de agarosa, observando la
aparición de dos bandas (carriles 2 y 3); la primera de ellas, de un tamaño aproximado de 5348
pb correspondiente al vector pcDNA 3.1(-) y la segunda banda de 2592 pb, tamaño esperado para
la glicoproteína gH (Figura 6).
A B
pb
6557
4331
2027
FIGURA 6: Restricción enzimática del plásmido pcDNA-gH. En A se muestra un esquema
del plásmido recombinante pcDNA-gH en donde se indican los tamaños del vector y del gen UL22
(gH) por separado. En B, se observa un gel de agarosa al 0.8% en TBE. En el carril 1, se observa
el marcador de tamaño molecular λ HindIII, en los carriles 2 y 3, se observan dos bandas, la
primera de un tamaño aproximado de 5348 pb que corresponde al vector y la segunda banda de
2592 pb correspondiente para la glicoproteína gH. El DNA fue restringido con las enzimas HindIII
y XbaI.
1 2 3
40
Una vez demostrada la presencia de los plásmidos en las células transformadas, se procedió a
extraerlos y purificarlos mediante columnas de afinidad, siguiendo la metodología para lisis
alcalina, con la finalidad de obtener plásmidos de alta pureza y concentración de calidad para uso
vacunal, obteniendo los resultados mostrados en la tabla II.
Tabla II: Datos de pureza y concentración de plasmidos pcDNA-gH y pcDNA 3.1 (-).
PLASMIDO DENSIDAD CONCETRACION
pcDNA gH 260/280= 1.63 3089.31 ng/μl
pcDNA 3.1(-) 260/280= 1.84 4107.28 ng/ μl
Se considera que la pureza óptima de un plásmido, se alcanza cuando presenta un conciente de
absorbancia 260/280nm entre 1.6 y 2.0. El plásmido pcDNA 3.1(-) mostró una densidad de 1.84 a
una concentración final de 4107.28 ng/μl, mientras que para el plásmido pcDNA-gH se obtuvo una
concentración de 3089.31 ng/μl y un conciente de absorbancia de 1.63 según la formula:
Concentración de DNA doble cadena (ng/μl)= absorbancia (260) * 50 (factor de
concentración)*dilución final.
Por lo tanto ambos plásmidos resultaron óptimos para su uso como vacunas de DNA.
De manera paralela, se crecieron células Vero con medio de mantenimiento celular, en incubación
a 37°C, como se muestra en la figura 7A, hasta observar la presencia de una monocapa célular
que cubrieron por completo la superficie de la botella para cultivo celular o hasta obtener el 100%
de confluencia. Cada subcultivo fue sometido a pruebas de esterilidad para vigilar que se
encontraran libres de contaminación.
Cuando las células Vero llegaron al 100% de confluencia, se les cambio el medio de
mantenimiento y se infectaron con la suspensión viral de HSV-1. Las células se incubaron a 37°C
durante 48 a 72 h hasta observar un efecto citopático en el 100% de la monocapa, caracterizado
por la formación de sincitios, granulación citoplasmática, células redondas y multinucleadas
(policariocitos), y desprendimiento de la monocapa celular. Como se observa en la figura 7B a las
48 h y en figura 7C a las 72 h, la perdida de la monocapa incremento al aumentar el tiempo de
incubación.
41
FIGURA 7: Efecto citopático de HSV-1 sobre las células Vero. En A se observan células
vero sin infectar confluentes al 100%. En B, células Vero infectadas donde se muestra el efecto
citopático a las 48 h y en C se muestra el efecto con desprendimiento de la monocapa a las 72h.
A
B C
42
Cada subcultivo que presentó efecto citopático y estuvo libre de contaminación, se conjunto en
grupos de 5-6 cultivos, hasta formar 3 grupos o cosechas virales. Se tomó una alícuota de cada
cosecha para realizar la determinación cuantitativa de la actividad viral por el método de
Sperman-Kärber, expresado en dosis infectiva para cultivos de tejidos al 50% (DICT50).
Obteniendo así el titulo viral mostrado en la tabla III.
Tabla III: Títulos virales (DICT50). (Método de Sperman-Kärber)
PRODUCCIÓN TITULO VIRAL (DICT50/ml)
Cosecha 1 1 x106.15
Cosecha 2 1 x106.95
Cosecha 3 1 x106
43
ESTANDARIZACION DEL MODELO ANIMAL DE INFECCIÓN.
El procedimiento de infección se realizó según lo señalado por Kurokawa (Kurokawa, 1993) a las
24h, posterior a la depilación química. Previamente a la infección con el HSV-1 o con medio de
mantenimiento, se verificó que la piel depilada de los ratones no presentara datos de inflamación
de la epidermis, con el objetivo de no confundir una dermatitis con la patología herpética.
La evolución de la patología herpética se presentó en un periodo de 12 a 14 días postinfección
empleando 50 μl de HSV-1 a 1 x106 DICT50/ml. Los tres ratones infectados con el virus,
presentaron entre el tercer y cuarto día, signos caracterizados por la presencia de pequeñas
vesículas, con erosión y ulceración en región local infectada. A estos signos se le asociaron, hacia
el sexto o séptimo día, leve perdida de peso y la aparición de piloerección. Posteriormente al
décimo día se evidenciaron signos de daño zosteriforme, caracterizados por parálisis de las patas
traseras, encorvamiento de la columna, lentitud de movimientos y de la respiración (bradicardia),
ojos entre cerrados y evidente perdida de peso (Figura 8 y figura 13).
FIGURA 8: Fotografías representativas que muestran distintos grados de lesiones
desarrollados en el modelo animal de infección. En A se observan vesículas en sitio de
infección, que corresponden a un grado 2. En B, se evidencia erosión y ulceración en región local,
así como piloerección, correspondientes a grado 4 a 6. Finalmente en C, se observa una patología
grado 8 a 10, caracterizada por evidente baja de peso, piloerección, desarrollo de parálisis de
ambas patas traseras, ojos entre cerrados y encorvamiento.
A B C
44
ESQUEMA DE INMUNIZACION
Las dosis y las vías de inmunización utilizadas para la evaluación del candidato vacunal pcDNA-gH,
se seleccionaron en base a estudios previamente realizados por P. Forg, 1998 y Donald L.
Lodmell, 2003 con el virus de la Rabia, demostraron que al inmunizar por vía intraauricular en
ambas orejas de los animales, se obtuvo una mayor estimulación de la repuesta humoral y celular
en comparación con la vía intramuscular.
Como se señaló en materiales y métodos las cepas de ratones Balb/C se clasificaron en 6 grupos,
3 grupos de control y 3 grupos de experimentación.
El control negativo (C-), correspondió al grupo control sano, caracterizado por que los ratones se
mantuvieron sin inmunizar y sin infectar. En su evolución, los animales mostraron ganancia de
peso hasta de 3 g en promedio en comparación con su peso inicial, sin evidencia de patología
herpética, como se observa en las tablas 2 y 3, y las figuras 9 y 13.
El control positivo (C+), se caracterizó por que estos ratones no se inmunizaron previamente y al
cumplir las seis semanas de edad, se les infectó con 50 μl de HSV-1 a 1 x106 DICT50/ml. El
registro diario de la patología, mostró pérdida evidente de peso apartir del sexto día postinfección,
presencia de ulceración, piloerección, parálisis de ambas patas traseras, encorvamiento, lentitud
de movimientos y ojos entrecerrados hacia el día 13. El comportamiento patogénico fue igual al
desarrollado durante el proceso de estandarización (Figuras 9 y 13).
El tercer grupo control, correspondió al grupo inmunizado con el vector plásmidico vació (3.1-).
Los ratones de este grupo fueron inmunizados a la 4ta y 5ta semanas de vida con 50 μl del
plasmido pcDNA 3.1 (-) vía intraauricular en ambas orejas y retados con 50 μl de HSV-1 a
1x10(6) DICT50/ml. En su evolución los animales de este grupo presentaron patología semejante
al grupo control positivo, evidenciando perdida de peso, erosión en el sitio de infección,
piloerección, parálisis de ambas extremidades traseras, encorvamiento, lentitud de movimientos y
ojos entrecerrados en los mismos días de evolución (Figuras 9 y 13).
45
El primer grupo de experimentación se inmunizó vía intraauricular con 25 μl del plásmido pcDNA-
gH en ambas orejas, (i.e 25) a la 4ta y 5ta semana de vida. Al cumplir la sexta semana de vida se
les reto con 50 μl de HSV-1 a 1 x106 DICT50/ml. El desarrollo de la patología mostró presencia de
ulceración y erosión en el sitio de infección al tercer día postinfección, perdida de peso hacia el
sexto día (apéndice I y II), presencia de piloerección aunque sin evidencia de parálisis, ni
encorvamiento o lentitud de movimientos. Sin embargo los animales recuperaron peso y movilidad
hacia el séptimo día postinfección a niveles similares al control negativo, como se aprecia en la
figura 13 y la figura 10.
El segundo grupo de experimentación también se inmunizó a la 4ta y 5ta semana de vida, vía
intraauricular pero con 50 μl del plásmido pcDNA-gH en ambas orejas, (i.e 50) y a la sexta
semana de vida se les reto con 50 μl de HSV-1 a 1 x106 DICT50/ml. Este grupo también mostró
desarrollo en la región local de erosión, ulceración y edema periférico de la lesión, piloerección,
pero sin presencia de daño neurológico. Hubo pérdida de peso hasta el séptimo día postinfección,
pero con rápida ganancia de este, en los días posteriores. Las lesiones cutáneas disminuyeron
hasta mostrar leve lesión inflamatoria en el sitio de infección hacia el décimo día (Figura 11,
apéndice I y II)
El ultimo grupo de experimentación correspondió al grupo inmunizado con 50 μl del plásmido
pcDNA-gH, vía intramuscular (i.m 50) a la 4ta y 5ta semana de vida, retándolos con las mismas
dosis infectiva del HSV-1, al cumplir la sexta semana de vida. Los ratones evolucionaron con
mínimo desarrollo de patología herpetica, caracterizada por la presencia de ulceración y edema en
sitio de infección, piloerección, ausencia de daño neurológico, disminución ligera de peso al
séptimo día, logrando una rápida recuperación de hasta 2.28 g en promedio por grupo (apéndice
I y II); de igual manera se observó remisión de la lesión hacia el 14avo día (Figura 12).
46
FIGURA 9: Fotografías que muestran la patología desarrollada para los grupos cotrol,
según escala de kurokawa (Kurokawa, 1993). La imagen A corresponde al control negativo.
B, al control positivo y C al control de inmunización. Las tablas de la izquierda resumen los grados
de patología zosteriforme de cada grupo.
Datos de patología zosteriforme
Días postinfección
grado: 0 Día 3
grado: 0 Día 7
grado: 0 Día 10.
Datos de patología zosteriforme
Días postinfección
grado: 4 Día 3
grado: 8 Día 7
grado: 10 Día 10.
Datos de patología zosteriforme
Días postinfección
Grado: 4 Día 3
Grado: 8 Día 7
Grado: 10 Día 10.
B
A
C
47
FIGURA 10: Fotografías representativas que muestran la patología desarrollada según
escala de kurokawa (Kurokawa, 1993), para el grupo inmunizado intraauricularmente
con 25 μg del plásmido pcDNA-gH. Se observa en la imagen mostrada en A la presencia de
ulcera y edema por la lesión herpética. En B, se muestra el comportamiento general del grupo. La
tabla de la izquierda resume el grado de patología zosteriforme para este grupo.
Datos de patología zosteriforme
Días postinfección
Grado: 4 Día 3
Grado:6 Día 7
Grado:2 Día 10.
B
A
48
FIGURA 11: Fotografías representativas que muestran la patología desarrollada según
escala de kurokawa (Kurokawa, 1993), para el grupo inmunizado intraauricularmente
con 50 μg del plásmido pcDNA-gH. Se aprecia en la imagen A, disminución de la lesión
herpética, así como un incremento en la actividad del grupo (B). La tabla de la izquierda resume
el grado de patología zosteriforme para este grupo.
Datos de patología zosteriforme
Días postinfección
Grado: 2 Día 3
Grado: 6 Día 7
Grado: 0 Día 10.
A
B
49
FIGURA 12: Fotografías representativas que muestran la patología desarrollada según
escala de kurokawa (Kurokawa, 1993), para el grupo inmunizado intramuscular con
50 μg del plásmido pcDNA-gH. Este grupo presento una disminución total de las lesiones
herpéticas (A) y la mayor actividad en su comportamiento como se muestra en la imagen B. La
tabla de la izquierda resume el grado de patología zosteriforme para este grupo.
Datos de patología zosteriforme
Días postinfección
Grado: 2 Día 3
Grado: 6 Día 7
Grado:0 Día 10.
A
B
50
FIGURA 13: Valoración de peso de los animales de los distintos grupos
experimentales. Se muestra el promedio de pérdida o ganancia en gramos de todos los grupos
evaluados. El grupo infectado con HSV-1 (control +) y el grupo inmunizado con el vector vació
(pcDNA 3.1-) presentaron perdida de peso evidente posterior al sexto día postinfección. El grupo
sano (Control -) registro ganancia de peso de hasta 3.7 gramos promedio. Los grupos
inmunizados con 50 μl del plásmido pcDNA-gH mostraron leve perdida de peso al sexto día
postinfección, evolucionando con rápida ganancia de este al 14avo día en comparación con el
grupo inmunizado con 25 μl de pcDNA-gH.
-3
-2
-1
0
1
2
3
4
5
0 5 10 15
tiempo (días)
peso
(g)
control +C.pcDNA 3.1(-)Control (-)i.e 25i.e 50i.m50
51
ANÁLISIS HISTOPATOLOGICO.
Para el estudio histopatológico, se analizaron y compararon muestras de tejidos provenientes de
piel, Bazo y cerebro de todos los animales sacrificados.
La primera microfotografía (Fig. 14A), corresponde al tejido cutáneo sano (representativa de los
animales correspondientes al control negativo), donde se puede observar la epidermis, folículos
pilosos, glándulas sebáceas, células adiposas y células musculares. Mientras que en la
microfotografía mostrada en B, correspondiente al tejido cutáneo de los animales inmunizados
con el plásmido pcDNA-gH e infectados posteriormente, se observó la presencia de células
linfocitarias debido a la formación de infiltrado inflamatorio (Figura 14B). En cambio cuando el
virus del herpes simple 1 se replica dentro de las células epidérmicas, las destruye dando lugar a
la aparición de vesículas, causadas por degeneración hidropica y necrosis. Por tal motivo en los
tejidos provenientes de los animales infectados con HSV-1, se observó evidencia microscópica de
lesión celular, manifestada por degeneración vacuolar y el estroma laxo (Figura 14C).
Figura 14: Análisis Histopatológico representativo de tejido cutáneo (10X). la imagen A
corresponde al tejido cutáneo del control negativo. La microfotografía en B muestra el proceso
inflamatorio desarrollado en los ratones previamente inmunizados con el plasmido pcDNA-gH.
Finalmente en la imagen de la microfotografía C, se aprecia la degeneración vacuolar y laxitud del
estroma, desarrollada por el tejido infectado con HSV-1.
A B C
52
El análisis histológico del bazo mostró que en los individuos sanos este órgano esta compuesto
por eritrocitos, células reticulares, células endoteliales, nódulos de tejido linfoide y sinusoides
esplénicos (Figura 15 A). De igual forma en el tejido del bazo de los animales previamente
inmunizados con el plásmido pcDNA-gH (Fig 15 B) se apreciaron características histológicas
semejantes al bazo sano. Sin embargo, en las microfotografías de los bazos infectados con el
virus, se observó la degeneración vacuolar, con perdida del tejido linfoide. (Figura 15 C).
FIGURA 15: Análisis Histológico del Bazo (40X). En A se muestra el tejido normal
del bazo correspondiente al control negativo, se aprecian los cúmulos linfáticos y sinosoides o
capilares esplenicos. En la imagen B correspondiente a los animales previamente inmunizados con
el plásmido pcDNA-gH, se observó un tejido bien estructurado caracterizado por nódulos de tejido
linfoide y capilares. La imagen en C pertenece al bazo de individuos infectados con HSV-1, donde
se aprecia la formación de abundantes vacuolas por degeneración de tejidos.
BA
C
53
El herpes virus 1 es capaz de infectar diferentes tipos celulares, como las células epiteliales y las
neuronas. Durante el proceso de patogénesis al SNC por el HSV-1 se desarrollan signos de
encefalopatía, destrucción neuronal, aumento de células microgliales producto de la respuesta
inmune local y el aumento en el número y tamaño de los astrocitos en respuesta a la pérdida de
neuronas (Wheater,2003).
En el estudio histopatológico del SNC de las muestras obtenidas de los individuos
infectados, se encontraron como se esperaba datos de degeneración vacuolizante (Figura 16 D),
así como datos de encefalopatía, con perdida en el número y la angulación de las neuronas, así
como un incremento en el número de astrocitos. Por su parte en las muestras de los tejidos del
SNC de los ratones inmunizados (Figura 16 B) con el plásmido pcDNA-gH, se apreció un leve
incremento de células linfocitarias, y la conservación de la corteza cerebral, manteniendo una
estructura muy semejante al tejido nervioso de los animales sanos (Figura 16 A).
54
FIGURA 16: Análisis Histológico de tejido cerebral (40X). La imagen en A pertenece al
tejido cerebral sano. La microfotografía en B perteneciente al SNC del grupo inmunizado con el
plasmido pcDNA-gH, evidencia la presencia de un leve proceso inflamatorio, con la conservación
del tejido neuronal. En los tejidos cerebrales infectados con HSV-1 sin protección, se aprecian
dos imágenes representativas de neuroinfección, la imagen en C con encefalopatía, perdida de la
angulación de las neuronas e incremento del proceso inflamatorio, y la imagen en D evidencia la
perdida del tejido cerebral, con degeneración vacuolar.
DC
A B
55
Para conocer la respuesta linfoproliferativa, los linfocitos provenientes de los bazos de cada
animal perteneciente a los distintos grupos fueron evaluados por incorporación de timidita tritiada
y cuantificados mediante un contador de centelleo. El total de células obtenidas para cada
estimulación, fue analizado, clasificado por grupo de estudio y finalmente graficado para su
interpretación. (Apéndice III).
Para valorar en primera instancia la respuesta mitogénica en general de los linfocitos, de los
distintos grupos experimentales, así como de los controles internos de proliferación se procedió a
agrupar los datos obtenidos ante la estimulación con Concanavalina A y sin estimulación
específica (Figura 17). Como era de esperarse en el gráfico de control de proliferación (Figura 17),
en todos los grupos de estudio, la respuesta proliferativa de linfocitos no se produce sin
estimulación. Mientras que en los individuos infectados con el virus, cuando los linfocitos, son
estimulados por el mitogeno concanavalina A, se evidenció una inmuosupresión, debido a que la
incorporación de timidita tritiada que muestra la capacidad proliferativa de los linocitos fue
significativamente menor al grupo control sano. En cambio la mayor capacidad mitogénica de los
linfocitos obtenidos por minuto se obtuvo en los individuos inmunizados intramuscularmente con
50 μl del plásmido pcDNA-gH, al obtener 139906.5 de linfocitos/min, seguido del grupo
inmunizado intraauricularmente con 25 μl del plasmido pcDNA-gH con 117040.6 de linfocitos/min.
Mientras que la respuesta celular fue menor en el grupo inmunizado vía intraauricular con 50 μl
del plásmido pcDNA-gH al obtenerse 55890.64 de linfocitos/min (Figura 17).
56
FIGURA 17: Respuesta de la proliferación celular por grupo de estudio al estimular
con el mitógeno Concanavalina A (*) y sin estimulación (°).
0
20000
40000
60000
80000
100000
120000
140000
160000
180000
cpm
* *
**
*
*
° ° ° ° ° °
C.(+) pc DNA3.1- C.(-) ie25 ie50 im50
57
También se valoró la respuesta mitogénica ante la estimulación con dos diferentes
concentraciones de HSV-1. Como se aprecia en la figura 18, ante la concentración a 5 x105 de
HSV-1, la mayor estimulación se presentó también en el grupo inmunizado intramuscularmente
con 50 μl del plásmido pcDNA-gH que el grupo inmunizado intraauricularmente con 25 μl del
plásmido pcDNA-gH y el grupo inmunizado intraauricularmente con 50 μl del plásmido pcDNA-gH.
La estimulación linfoproliferativa en los grupos inmunizados intraauricularmente con el plásmido
pcDNA-gH, estadisticamente mostró una mínima diferencia entre ambos grupos, pero
significativamente mayor al grupo control sano (Figura 18).
Mientras que con la estimulación producida con 1x107 de HSV-1, el grupo inmunizado vía
intraauricular con 50μl del plásmido pcDNA-gH presentó un mayor conteo celular que el grupo
inmunizados vía intramuscular con 50 μl del plásmido pcDNA-gH y que el grupo inmunizado con
25 μl del plásmido pcDNA-gH vía intraauricular. En ambas estimulaciones los animales infectados
con el herpes y sin protección evidencian una inmunosupresión (Figura 18).
58
-50
0
50
100
150
200
250
300
350
CPM
FIGURA 18: Respuesta celular por grupo al estimular con HSV-1 a diferentes concentraciones, 5 x105 y 1x107 .
C + C+ 3.1 3.1C - C- IE 25 IE 25 IE50IE50 IM 50IM 50
5 x105 1x107
59
NEUTRALIZACION VIRAL
Finalmente, la capacidad de producción de anticuerpos neutralizantes presente en los diferentes
grupos de estudios, se verificó por la presencia del efecto citopático en la monocapa celular en las
diferentes diluciones que se realizaron de los sueros de los individuos en estudio, como se
mencionó en materiales y métodos. Se ha reportado que existe protección cuando el efecto
citopático no está presente y hay protección parcial cuando el efecto citopático se presenta en
forma parcial en la monocapa.
En este trabajo se observó bajo el microscopio a las 72 h la presencia el efecto citopático en toda
la monocapa y en todas las muestras de los sueros provenientes de los tres grupos control. En
cambio el grupo inmunizados con 25 μg del plasmido pcDNA-gH vía intraauricular presentó efecto
citopático a partir de la dilución 1:2 y protección parcial hasta la dilución 1:4. Mientras que para
el grupo inmunizado con 50 μg del plasmido pcDNA-gH vía intraauricular, el efecto citopático del
virus se presentó desde la dilución 1:4, con protección parcial hasta la dilución 1:8, mismo efecto
se observó para el grupo inmunizado con 50 μg pcDNA-gH vía intramuscular. Por lo que se
presentó mayor producción de anticuerpos neutralizantes en estos grupos experimentales (datos
no mostrados).
60
IX. DISCUSION
Para iniciar la infección viral, el HSV-1 debe unirse primeramente a los receptores celulares lo que
da paso a la fusión entre las membranas viral y celular, permitiendo con ello la penetración del
virus hacia el interior de la célula. Por esta razón las glicoproteinas virales son las llaves
activadoras de la respuesta inmune mediadoras del ataque viral (Whitley,R. Roizman B. 2002).
Dos de las glicoproteinas más evaluadas y estudiadas como posibles candidatos vacunales han
sido las glicoproteinas gB y gD, debido a que demostraron producir altos títulos de anticuerpos
neutralizantes capaces de brindar protección contra la infección del HSV-2 en los animales
inmunizados (Corey.L, 1999). Por tal motivo, estas glicopoteinas se evaluaron mediante ensayos
clínicos en humanos por los laboratorios Glaxo-Smith Kline, en sus investigaciones publicaron la
obtención de un 43% de eficacia en la protección ante la infección herpética genital, pero sin
beneficio en la prevención contra la infección zosteriforme (Spruance, S.L., et al. 2000).
Otra glicoproteína esencial para la infección viral es la gH, debido a que intervienen en el proceso
de fusión de las membranas viral y celular para la penetración del virus a la célula. Esta
glicoproteína se encuentra muy conservada en los diferentes herpes virus (McGeoch,D. et al.
1991). Con la obtención de una glicoproteína gH recombinante de HSV-1, se demostró la
capacidad que tiene de generar protección contra la infección herpética in vitro (Ortega, E.
2005), lo que sugería que el bloqueo de la glicoproteína gH pudiera ser una eficaz estrategia para
brindar protección contra la infección herpética zosteriforme.
En nuestra evaluación mediante el empleo de la glicoproteína gH recombinante utilizado como
una vacuna de DNA, se encontró que en los animales inmunizados se presentaron al inicio
algunos datos patológicos de la primoinfección herpética en el sitio de inoculación, con una
61
disminución parcial en su peso, pero con posterior recuperación; además no se presentaron
complicaciones por la diseminación neurológica, en comparación con los animales infectados con
el HSV-1, quienes desarrollaron la patología caracterizada por la presencia de ulceras con edema
periférico de la lesión, piloerección, perdida de peso, parálisis de una o ambas patas traseras y
encorvamiento, lo que demuestra daño neurológico evidente.
Por otra parte mediante el análisis del estudio histopatológico de las muestras obtenidas del tejido
cutáneo de los animales inmunizados, se observaron datos de la formación de un proceso
inflamatorio sugerentes de lesión epitelial por el herpes, pero sin desarrollo de degeneración
hidropica, ni perdida de tejido por necrosis, ni laxitud del estroma, como se presentó en los
tejidos de los animales infectados. Por otro lado tampoco se evidenció daño en el bazo de los
animales inmunizados en comparación con el bazo de animales infectados. En el análisis
histopatológico del cerebro de los ratones inmunizados también se les encontró datos de un
proceso inflamatorio leve, pero sin la formación de las complicaciones neurológicas como lo es la
encefalopatía y el daño encontrado en los sujetos infectados con el virus.
Con los datos clínicos e histológicos anteriores se puede señalar que ante la inmunización con el
plasmido pcDNAgH, se produce una leve lesión epitelial inicial, pero con una notable disminución
en la intensidad del daño patológico, hasta su remisión.
Por otra parte en la capacidad protectora que pueda ofrecerse mediante el empleo de una vacuna
de DNA, la ruta de vacunación seleccionada es importante en la inducción de la respuesta
inmunológica (Lauterbach et al. 2004). La respuesta a las vacunas de DNA ha sido determinada
mediante diferentes rutas de inoculación, incluyendo intramuscular, intradérmica, intravenosa,
intraperitoneal, epidérmica mediante escarificación de la piel, oral, intranasal y vaginal. De todas
estas formas, las que han dado mejores resultados y más reproducibles son la inoculación
62
intramuscular y en los diferentes estratos de la piel mediante agujas hipodérmicas, asi como el
bombardeo de partículas mediante pistolas genéticas en piel y en mucosas. Otros métodos que se
encuentran en desarrollo consisten en la inoculación de DNA encapsulado en microesferas (Jones
et al., 1997).
Se asumió que el músculo estriado tiene la capacidad de tomar y expresar al DNA desnudo (Davis
H, et al. 1993) aunque, no es considerado el sitio especializado para la presentación de antígenos,
por contener pocas células especializadas en la presentación de antígenos (CPA), sin embargo la
respuesta citotoxica generada tras la inmunización con DNA intramuscular, se ha propuesto que
se presenta por estimulación de la medula ósea (Doe B, et al. 1996). En contraste la piel y las
mucosas son el sitio que fisiológicamente contienen mayor cantidad de células especializadas en
la presentación antigénica, como keratinocitos, macrófagos y células de Langerhans, por lo que la
transfección de DNA en las mucosas, puede ser una mejor alternativa para generar respuestas
inmunológicas protectoras (Condon, C. et al. 1996).
Estudios previos han demostrado que se presenta una fuerte respuesta tanto celular como
humoral mediante la inmunización intraauricular, debido a que esta estructura cuenta con una
doble capa de epidermis separada por cartílago (P Forg, et al. 1998).
Basados en los protocolos anteriores, decidimos además de evaluar la capacidad protectora del
plasmido pcDNA-gH ante la infección zosteriforme del HSV-1; evaluar la eficacia de la respuesta
inmunológica inducida por la vía intramuscular y por la vía intraauricular, al ser estos los sitios
ideales para la inmunización con vacunas de DNA.
Se ha reportado que las inyecciones intramusculares inducen la respuesta cooperadora tipo Th1
en la que activan células mediadoras de la respuesta inmune celular, generan anticuerpos que
63
pueden unirse al complemento como la IgG e inducen la producción de citocinas como IL-2 e
interferón gamma (IFN-γ), lo cual en conjunto, permite el control de infecciones bacterianas
intracelulares y las infecciones virales. Las bases de éste fenómeno no se han elucidado por
completo, pero hay dos factores que podrían tener una participación importante: i) la inyección
intramuscular deposita el DNA de manera extracelular teniendo así la posibilidad de que las
secuencias CpG interactúen con los correspondientes receptores de los linfocitos (TLR),
generando la producción de IL-12 e IFN-γ. Por su parte, el depósito del DNA directamente en el
citosol de las células de la epidermis y dermis, evitan la interacción del DNA con los receptores
membranales, la generación de IFN-γ y con ello la producción de las citocinas características de la
respuesta Th1. ii) El segundo factor podría ser el tipo y la localización de células presentadoras de
antígeno transfectadas tras la inoculación. Se ha observado que tras la inyección intramuscular, la
presentación del antígeno se lleva a cabo en el bazo principalmente, mientras que en el
bombardeo por partículas se produce en los ganglios linfáticos (Robinson & Torres, 1997).
Otra consideración que debe tomarse en cuenta para generar una respuesta inmune sostenida,
aparte de determinar la vía de inoculación, es la cantidad de DNA a inocular. Se sabe que la
administración de vacunas mediante agujas posee la ventaja de ser un método barato, aunque
requiere de 100 a 1000 veces más DNA que el bombardeo de partículas, para inducir una
respuesta inmune. Las cantidades de DNA necesario que se han reportado van de 10 a 100 μg
en inyecciones intramusculares en ratones (Robinson y Torres, 1997). En nuestro esquema de
inmunización, se evaluó la capacidad protectora y la respuesta inmune generada ante el empleo
de 25 μg y 50 μg de plásmido pcDNA-gH, encontrando que la mayor protección y estimulación
inmunológica se logró con la concentración mayor del plásmido.
Mediante los ensayos de proliferación celular, nuestros resultados muestran de manera primordial
una alta capacidad linfoproliferativa en los linfocitos del grupo inmunizado por la vía
64
intramuscular, significativamente mayor que la mostrada en los animales inmunizados por la vía
intraauricular. En lo referente a la respuesta humoral, la producción de anticuerpos neutralizantes
fue equivalente tanto en los animales inmunizados por la vía intramuscular como por la vía
intraauricular. De manera interesante nuestros resultados mostraron una evidente
inmunosupresión celular en los animales infectados con HSV-1, efecto que se revierte en los
individuos inmunizados con el plasmido pcDNA-gH inoculado por ambas vías.
Por la disposición que guarda la glicoproteína gH en la membrana viral se ha visto que constituye
un importante inductor de la respuesta inmunológica (Peng, T. 1998). Nuestros datos tanto de la
estimulación de la respuesta linfocitaria como de las manifestaciones clínicas se puede inferir que
la inmunización con la glicoproteína gH recombinante capacita al sistema inmunológico de forma
tal que evita que entre en un estado de inmunosupresión. De igual forma se ha estudiado que
ante la infección con HSV-1 se incrementan principalmente las interleucinas IL-6, IL-12, IL 15 y
IL-18, potenciando la respuesta de la actividad citotoxica protectora (Ahmad et al. 2000).
Probablemente en nuestro modelo, debido a una mayor acumulación en el organismo de esta
glicoproteína, se incrementé la producción de IL-12 y con ello de interferón (IFN) para que se
potencialize la actividad de células efectoras NK, lo que conduce a una mayor lisis de células
infectadas por el herpes (B. Alarcón et al. 1984)
Estadísticamente los casos a nivel mundial de herpes simple 1, continúan en incremento,
principalmente los casos de herpes neonatal, en los que de manera significa se desarrollan
complicaciones neurológicas tipo encefalitis, con una importante trascendencia en la morbilidad y
mortalidad (Whitley,R. Roizman B. 2002).
En nuestro estudio evaluamos de manera primordial la capacidad inmunoprolfilactica que la
vacuna de DNA con la glicoproteína gH desarrolla. Con los resultados de este trabajo podemos
65
sugerir que el plásmido pcDNA-gH brindó protección ante las complicaciones secundarias por la
diseminación del virus.
Finalmente cabe mencionar que el plasmido pcDNA-gH utilizado como una vacuna de DNA ofrece
la ventaja de lograr una respuesta inmunológica altamente protectora, es simple, rápida y poco
costosa en su fabricación, y no requiere mantenerse en bajas temperaturas para su conservación.
66
X. CONCLUSIONES
El plasmido pcDNA-gH utilizado como vacuna de DNA demostró ser capaz de mitigar las lesiones
primarias y ofrecer protección contra las complicaciones por la diseminación del herpes en los
animales inmunizados.
La vacuna logró estimular de manera especifica la producción de linfocitos y anticuerpos
neutralizantes, evitando la inmunosupresión que se estableció en los animales con la infección
zosteriforme.
La vía de inoculación que mostró tener un efecto de mayor protección contra la infección por
HSV-1, fue la inoculación intramuscular. Por la vía intraauricular, se encontró que la respuesta
protectora fue mejor con el empleo de 50 μg de pcDNA-gH.
Por lo anterior el plasmido pcDNA-gH es un fuerte candidato vacunal a emplear de manera
profiláctica con el objetivo de disminuir la morbi-mortalidad producida por la infección del herpes
simple 1.
67
XI. PERSPECTIVAS
Los fenómenos encontrados con nuestra evaluación señalan que el siguiente punto a estudiar es
el conocer la respuesta inmunológica generada específicamente por la inmunización con el
plásmido pcDNA-gH. Por lo que será de vital importancia conocer el tipo de respuesta celular
generada.
Seria importante determinar el esquema de inmunización ideal para nuestro candidato vacunal, es
decir evaluar las diferentes vías y métodos de inoculación, con dosis variables del plásmido
recombinante. Una de las características mas deseadas en cualquier vacuna es la generación de
una respuesta inmune duradera, por lo que otra consideración por determinar será la duraci´n de
la inmunidad, así el como evaluar si en los sujetos seropositivos, se podría prevenir la
presentación de las recurrencias y por lo tanto el daño neurológico ante una importante
inmunosupresión, como ocurre en los sujetos VIH positivos. Y entonces considerarla además de
un candidato vacunal para la profilaxia, como un posible agente terapéutico.
Por otro lado se tendrían que determinar, los estudios correspondientes para conocer la inocuidad
de la vacuna y sus posibles efectos secundarios en el organismo.
68
APENDICE I: Registro diario de peso total en gramos de cada ratón y grupo.
Pesos totales en gramos. Grupo: control negativo (sano) Día ratón
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
A B C D
20.4 19.9 16.8 18.5
20.8 20.3 17.2 18.9
21.3 20.6 17.8 19.3
21.8 20.8 18 19.9
22 21 18.720.1
22.221.418.920.3
22.421.619.120.6
22.521.819.520.9
22.321.919.921.1
22.62.9 20.321.2
22.8 22.1 20.9 21.3
23 22.5 21.3 21.5
23.222.521.521.8
23.422.321.922
23.522.622.122.3
Grupo: control positivo (infectado con HSV-1) A B C
21 19.7 19
20.8 20.3 19.8
21.2 20.9 20.2
21.8 21.3 20.5
22 21 20.1
21.920.920.3
21.620.220
21 19.519.7
20.818.819.4
20.317.519.3
19.7 17.4 19.3
19.5 17.2 19
19.317 18.9
19.516.518.8
19.216.218.3
Grupo: control de inmunización pcDNA 3.1(-). A B C D E
18 19.2 19.6 20 18.5
18.9 19.6 20 20.7 19.1
19.2 20 20.4 21.4 19.4
19.6 19.9 20.6 215 19.9
19.819.820.421.62.3
20 20.120.421.320.3
19.719.820.521.120
19.519.620.521.519.9
19.319.420.421.519.6
19.119.420.621 19.6
18.7 18.9 20 20.9 19.1
18.3 18.4 19.8 20.3 18.7
18 18.219.519.518.1
17.417.518.919 17.7
16.316.318.318.616.5
Grupo: inmunizado vía intraauricular (i.e) 25 μg pcDNA gH A B C D E
20.1 20 20.1 21.9 17.9
21.3 20.1 20.2 22 18.
21.9 20.8 20.7 22.4 18.6
22.1 21.4 21.2 22.8 19.2
22.321.621.423 19.7
21.821.421.322.820.1
22.221.721.723.120.3
22.421.421.523 20.9
22.121.521.422.920.7
21.921.321.222.820.5
21.7 21 20.9 22.5 20.3
21.5 21.1 20.7 22.3 20.6
21.320.920.521.920.7
21.121.720.221.420.5
20.920.920 21.520.3
Grupo: inmunizado vía intraauricular (i.e) 50 μg pcDNA gH A B C D E
21.2 19.2 21.3 21.3 20.1
22.3 19.8 22 21.5 20.5
22.9 20 22.5 21.8 20.7
23.4 20.7 23.1 22.4 21.2
23.620.623.422.821.4
23.521.323.223 21.7
23.621.923.522.921.5
23.822 23.422.821.9
24 22.823.322.922.3
24.322.523.622.521.9
23.9 22.7 23.6 22.3 21.9
23.7 22.9 23.3 22 21.7
23.522.922.922.221.3
23.821.223.322.521.5
24 22 23.422.921.9
Grupo: inmunizado vía intramuscular (i.m) 50 μg pc DNA gH A B C D E
21.3 20.1 21.3 18.5 22.2
21.5 20.5 21.5 18.9 22.5
21.8 20.8 21.7 19.3 22.7
22.3 21.2 22.4 19.8 23.4
22.921.422.820.323.2
23.421.723 20.723.5
23.621.522.921.123.4
23.521.922.820.923.3
23.322.322.920.723
23 21.822.520.522.7
23.2 21.7 22.3 20.9 22.9
23.6 21.5 22 21.1 23.1
23.821.622.221.523.3
24 21.922.521.823.5
24.222.122.922 23.6
69
APENDICE II: Promedio de pérdida o ganancia en gramos por grupos.
Pérdida o ganancia de peso en gramos, promedio por grupo. Control de infeccion
3.1 (-) Control sano
i.e 25 i.e 50 i.m 50
0.4 0.7 1.2
1.15 1.05 0.55 -0.1
-0.55 -1.45
-1.8 -2
-2.2 -2.35 -2.65
0.6 1.02 1.24 1.32 1.36 1.16 1.14 0.98 0.88 0.46 0.04 -0.4 -0.64 -1.86
0.350.85
1.2251.55
1.82.0252.275
2.42.6
2.8753.1253.35
3.53.725
0.380.881.34
1.61.48
1.81.841.721.541.281.241.061.180.92
0.60.961.541.741.922.062.162.442.342.26
2.11.941.842.22
0.3 0.58 1.14 1.44 1.78 1.82 1.8
1.76 1.42 1.52 1.58 1.8
2.06 2.28
70
APENDICE III: RESULTADOS DE LOS ENSAYOS DE PROLIFERACION CELULAR. Sin Estimular Con. A VHS-1 VHS-1 GRUPO: 5 x105 1x107 Ratón 1
194.8 13306.1 204.4 213.1 24.6 11255.5 149.7 213.1
69.6 10905.3 135 138.1Ratón 2
321.5 116240.6 425.9 231.864.6 103050.1 204 266.4
234.6 98443.5 229.5 198.2Ratón 3
371.6 87109 258.7 26230.8 108603 235.8 266.459.2 91457.2 285.5 220.2
Ratón 1
14.9 4834.6 85.2 133.118.5 7099.3 85.1 151.724.9 72.1 39.5 32
Ratón 2 22.4 24919.6 121.4 257.832.8 39139.9 26.7 55.289.3 355.3 58.1 47
Ratón 1 45.8 43112.8 80.9 255.732.8 229.2 35.9 45.639.5 38 26 26
Ratón 2 25.5 64726.5 14.8 21116.4 410.7 42 46.739.5 106.1 40.5 41
Ratón 3 17 16978.8 86.2 258.9
21.5 147.5 35.9 50.923.9 72.1 35.3 42
Ratón 4 26.6 43491.8 55.4 10613.3 242 12.3 61.529.1 87.1 15.6 30
Control negativo
Control positivo
pc DNA 3.1(-)
71
Ratón 1 280 7376.1 252.3 273.421.5 80962.3 190.7 243
303.2 76323.5 235 143.1Ratón 2
398.2 162012.6 495.1 219.416.4 178448.5 381.4 466.9
145.4 111505.8 437 285.3Ratón 3
373.7 1211899.8 332.2 1385.942 124960.6 213.2 248.3
65.4 99926.3 281.4 223.2Ratón 4
309.8 103563.7 343.9 34164.6 135310.5 236.8 402.286.2 96109.2 322.9 194.2
Ratón 1
47.9 72067.8 283.2 195.424.6 73816.3 257.3 19160.2 70572.9 220.1 183.2
Ratón 2 59.6 117225.4 562.1 878.536.9 132591.4 478.8 1196
306.3 64234 1410 504.5Ratón 3
78.8 134766.2 299.2 338.953.3 168837.5 170.2 425.5
294.9 150.1 309.4 263.2Ratón 4
45.8 179353.3 185.2 205.845.1 85673.9 112.8 191
214.9 48011.6 226.3 202.2Ratón 1
37.3 66763 221.4 18523.6 62721.5 219.4 248.3
26 52325.2 200 556.5Ratón 2
51.1 106747 363 258.931.8 115258.4 295.2 20897.6 134465 353 234.2
Ratón 3 36.2 168169.9 219.3 352.433.8 107251.2 278.8 34692.4 7869.6 334.3 277.3
Ratón 4 35.1 196592.7 654.7 511.526.7 189570.3 476.7 376.743.6 178382.9 521.2 239.2
Inmunizados intraauricularmentecon 25 μl del plasmido pcDNA-gH
Inmunizados intraauricularmente con 50 μl del plasmido pcDNA-gH
Inmunizados vía intramuscular con 50 μl del plasmido pcDNA-gH
72
RESULTADOS POR GRUPO Y ESTIMULACION. GRUPOS C. NEG I.E 25 IM 50 IE50 C.POS 3.1 (-) ESTIMULACION CON CONCANAVALINA A. Ratón 1 Ratón 2 Ratón 3 Ratón 4 ESTIMULACION CON HSV-1 5 x105 Ratón 1 Ratón 2 Ratón 3 Ratón 4 ESTIMULACION CON HSV-1 1x107 Ratón 1 Ratón 2 Ratón 3 Ratón 4 SIN ESTIMULACION. Ratón 1 Ratón 2 Ratón 3 Ratón 4
11822.3 54887.3 60603.2 101251.2 4002 14460 105911.4 150655.6 118823.5 104683.6 21471.6 21747.76
95723 478928.9 94430.23 72152.3 5732.8 111661.1 104683.6 104683.6 14606.96
163.33 226 213.6 259.6 69.93 47.6 286.466 437.86 337 816.9 68.73 32.43
260 275.6 277.46 253.53 52.46 301.2 816.96 174.76 27.76
188.1 219.8 329.9 342.5 105.6 109.1 232.1 323.86 233.7 859.6 120 99.56 249.5 619.1 325.23 189.86 117.26
312.4 859.66 199.66 65.83
96.33 201.56 28.96 142.3 19.4 39.36 206.9 186.6 60.16 134.2 48.16 27.13
153.86 160.3 54.13 44.23 20.8 153.53 134.26 101.93 23
73
APENDICE IV: REACTIVOS Cloruro de Calcio 50 mM Para 100 ml pesar 0.55 g de cloruro de Calcio y disolver en agua destilada. Esterilizar en autoclave a 120 lb durante 20 minutos. Medio LB
Para preparar un litro, pesar 20 gramos de medio LB y disolver en un litro de agua destilada. Esterilizar en autoclave a 120 lb durante 20 minutos.
Agar LB con ampicilina Para preparar un litro, pesar 20 gramos de medio LB y 15 gramos de Agar, disolver en un litro de agua. Esterilizar en autoclave a 120 lb durante 20 minutos. Cuando el medio se encuentre a una temperatura aproximada de 37 a 40°C se le agrega 1 ml de ampicilina y se vacía en placas petri de 10 cm de diámetro, las placas se dejan solidificar y se mantienen en refrigeración hasta su uso.
Ampicilina (50 mg/ml) Para preparar 10 ml, agregar 500 mg de ampicilina a 8 ml de agua, agitar y adicionar de 5 a 6 gotas de NaOH 1M hasta la disolución de la ampicilina, aforar a 10 ml. Filtrar con un filtro Whatman de 0.22 mm. Alicuotar y congelar hasta su uso. REGULADORES DE LISIS ALCALINA. Solución I
50 mM glucosa 25 mM Tris-Cl (pH 8.0) 10 mM EDTA (pH 8.0) La solución debe ser preparada y autoclaveada por 10 minutos a 10 lb/sq y conservarse a
4°C. Solución II 0.2 N NaOH (diluido de un stock 10N) 1% SDS Agua
74
Solución III
5M acetato de potasio 11.5 ml de ácido acético glacial (de un stock 5M) Agua
REGULADORES DE PURIFICACION DE DNA. Regulador P1 Disolver 6.06 g de Trizma base, 3.72 g de Na2EDTA.H2O en 800 ml de agua destilada, ajustar el pH a 8.0 con HCl. Ajustar el volumen a un litro con agua destilada. Adicionar 100mg de RNasa. Regulador P2 Disolver 8.0 g de NaOH en 950 ml de agua destilada, adicionar 50 ml de un “stock” de SDS 20%. Regulador P3 Disolver 294.5 g de acetato de sodio en 500 ml de agua destilada. Ajustar el pH a 5.5 con ácido acético glacial (aproximadamente 110 ml.). Ajustar el volumen a un litro con agua destilada. Regulador QBT Disolver 43.88 g de NaCl, 10.46 g de MOPS (libre de ácido) en 800 ml de agua destilada. Ajustar el pH a 7.0 con NaOH. Adicionar 150 ml de isopropanol puro y ajustar a un litro con agua destilada. Regulador QC Disolver 48.33 g de NaCl, 10.46 g de MOPS (libre de ácido) en 800 ml de agua destilada. Ajustar el pH a 7 con NaOH. Adicionar 150 ml de isopropanol puro y ajustar a un litro con agua destilada. Regulador QF
Disolver 73.05 g de NaCl y 6.06 g de Tris base en 800 ml de agua destilada y ajustar el pH
a 7.0 con NaOH. Ajustar el volumen a un litro con agua destilada.
75
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