instituto politÉcnico nacional estudio de los
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INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL SECRETARÍA DE INVESTIGACIÓN Y POSGRADO ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLÓGICAS
SECCIÓN DE ESTUDIOS DE POSTGRADO E INVESTIGACIÓN
“ESTUDIO DE LOS POLIMORFISMOS PvuII Y XbaI DEL GEN RECEPTOR DE ESTROGENOS ALFA Y SU ASOCIACIÓN CON LA
DENSIDAD MAMARIA”
TESIS QUE PARA OBTENER EL GRADO DE DOCTOR EN CIENCIAS QUIMICOBIOLÓGICAS PRESENTA:
SARA VEGA GARCIA
DIRECTORAS DE TESIS:
DRA. ELBA REYES MALDONADO DRA. LOURDES BASURTO ACEVEDO
MÈXICO D.F. 2010
El presente trabajo se realizó en la Unidad de Investigación de Enfermedades
Endocrinas del Hospital de Especialidades del Centro Médico Nacional Siglo XXI,
Instituto Mexicano del Seguro Social y en el Departamento de Morfología de la
Escuela Nacional de Ciencias Biológicas del Instituto Politécnico Nacional, bajo la
dirección de la Dra. Elba Reyes Maldonado y de la Dra. Lourdes Basurto
Acevedo.
i
INDICE Índice i
Índice de tablas y figuras ii
Abreviaturas iii
Resumen iv
Abstract v
I Introducción 1
I.1 Antecedentes 2
I.2 Justificación 2
I.3 Planteamiento del problema 11
I.4 Hipótesis 11
I.5 Objetivo general 11
II Material y métodos 13
II.1 Diseño del estudio 13
II.2 Lugar de investigación 13
II.3 Variables de estudio 13
II.4 Tamaño de muestra 14
II.5 Descripción general del estudio 14
II.6 Análisis estadístico 17
III Resultado 18
IV Discusión 24
V Conclusiones 28
VI Bibliografía 29
VII Anexos 35
ii
ÍNDICE DE TABLAS Y FIGURAS Figura 1 Anatomía de la glándula mamaria
2
Figura 2 Estructura del receptor de estrógenos
6
Figura 3 Vía clásica de transducción de señales de los estrógenos 7
Figura 4
Imagen de la integridad del DNA en gel de agarosa 21
Figura 5
Imagen de la amplificación del producto de PCR en gel de agarosa
21
Figura 6
Imagen de restricción de polimorfismos del gen del receptor de estrógenos alfa en gel de agarosa
22
Tabla 1
Características de la población de estudio 18
Tabla 2
Diagnóstico mastográfico 19
Tabla 3 Distribución de la población estudiada por estado menopáusico
19
Tabla 4 Comparación de las características del grupo de mujeres premenopáusicas y postmenopásicas.
20
Tabla 5 Prevalencia de la densidad mamaria por estado menopáusico
20
Tabla 6 Distribución de la población analizada por variables alélicas 23 Tabla 7 Distribución de las variantes alélicas para Pvull de acuerdo a
las características mastográficas.
23
Tabla 8 Análisis de regresión múltiple
24
iii
ABREVIATURAS
AF1. Función de la activación 1
AF2. Función de la activación 2
BRCA 1. Gen de susceptibilidad de cáncer de mama 1 (humano)
BRCA 2. Gen de susceptibilidad de cáncer de mama 2 (humano)
CAD. Diagnóstico asistido por computadora
EDTA. Ácido etilen-diamino-tetraético
ERE. Elementos de respuesta a estrógenos
ESR1. Gen del receptor de estrógenos alfa
ESR2. Gen del receptor de estrógenos beta
IMC. Índice de masa corporal
pb. Pares de bases
PCR. Reacción en cadena de la polimerasa
RE. Receptor de estrógenos
SERM. Modulador selectivo del receptor de estrógenos
SHBG. Globulina de unión a hormonas sexuales
iv
RESUMEN
El cáncer de mama es una enfermedad maligna que se caracteriza por una proliferación acelerada, desordenada y no controlada de las células pertenecientes a dicho tejido. Su desarrollo se ha asociado con diversos factores como antecedentes genéticos, densidad mamaria aumentada, estimulación estrógenica permanente y otros. El propósito de este trabajo fue estudiar los polimorfismos PvuII y XbaI del gen del receptor de estrógenos alfa y la densidad mamaria, considerada como un factor independiente de riesgo para cáncer de mama. Para ello se incluyeron 225 mujeres con edad de 40 años o más que acudieron a realizarse su mastografía de rutina y que no presentaran síntomas o signos evidentes de cáncer de mama. Se les tomó una muestra de sangre para la determinación de los polimofismos, así como una revisión clínica, donde se obtuvieron sus medidas antropométricas (peso, talla, índice de masa corporal y otros). La proporción de mujeres que presentaron mama no densa (53.2%) fue similar a las que presentaron mama densa (46.8%). La distribución de los genotipos de ambos polimorfismos fue similar en los dos grupos de densidad mamaria. Al evaluar el efecto de factores como la edad, peso e IMC, se encontró que eran determinantes de la densidad mamaria. La influencia del polimorfismo XbaI fue significativa sobre la densidad mamaria, mientras que el polimorfismo PvuII señaló significado limítrofe. En conclusión, aunque en este estudio se observó cierta relación entre los polimorfismos PvuII y XbaI con la densidad mamaria, los resultados de este estudio nos indican que el clínico tiene a su alcance otros elementos más fáciles de medir como el IMC que son determinantes sobre la densidad mamaria.
v
ABSTRACT
Breast cancer is a milignant disease characterized by a accelerated, disordered
and uncontrolled proliferation belonging to the tissue cells. Its development has
been associated with several factors such as genetic factors, increased breast
density, stimulation permanent estrogenic and others.
Objective:The aim of this work was to studied the PvuII and XbaI polymorphisms
of estrogen receptor alpha gene and breast density, regarded as an independent
breast cancer risk factor. Design: Cross-sectional study.
In this study was included 22 women aged 40 years or more who attended perform
their routine mastography and not submit symptoms or obvious signs of breast
cancer. Took them blood for the determination of the polymorphisms by PCR-
RFLP, as well as a review clinical, where its anthopometric measures (wight,
height, body mass index and others) were obtained. Results:The proportion of
patients with mama no dense (53.2 %) was similar to that presented dense breast
(46.8 %). This distribution of genotypes of both polymorphisms was similar in both
groups of breast density. To assess the effect of factors such as age, weight and
BMI, were found to determinants of breast density. Xba polymorphism influence
was significant on breast density, while PvuII polymorphism noted bordering
meaning.
Conclusion: Although some relationship between PvuII and XbaI polymorphisms
with breast density, observed in this study was not indicate that the clinican has
reach other easier to measure as the BMI elements that are determinants on
breast density.
1
I INTRODUCCIÓN I.1 ANTECEDENTES El cáncer de mama es una enfermedad curable, siempre y cuando su
detección y diagnóstico se realicen oportunamente. Esta enfermedad maligna se
caracteriza por una proliferación acelerada, desordenada y no controlada de las
células pertenecientes a cualquiera de los distintos tejidos de la glándula mamaria,
estas forman una masa celular que invade los tejidos vecinos y metastatiza a
órganos distantes del cuerpo (1).
Las mamas son órganos pares glandulares especializados en la secreción
de leche. Están constituidos por tejido adiposo, conectivo subcutáneo así como
piel, que envuelve a las glándulas mamarias propiamente dichas (2).
Cada glándula está formada por 15 a 20 lóbulos, que se dividen en lobulillos
formados por pequeños racimos rodeados de alveolos cuya cara interior está
tapizada de células secretoras. Los alveolos desembocan en un conjunto
galactóforo menor, estos conductos galactóforos menores se unen para formar
conductos mayores, que desembocan en conductos terminales. El número de
conductos galactóforos terminales es también de 15 a 20, los cuales convergen en
la areola y forman debajo de ella unas dilataciones llamadas senos galactóforos,
que sirven como pequeños depósitos de leche.
Todos estos elementos glandulares están embebidos en una trama
compuesta de tejidos conectivo firme y adiposo (figura 1), que se conoce como
estroma mamario (3).
2
Figura 1. Anatomía de la glándula mamaria.
Como en otros tipos de cáncer, en el de mama existen factores que actúan solos o
en conjunto y favorecer el desarrollo de esta neoplasia. Pueden estar presentes
durante periodos largos, aunque algunos de estos factores muestran riesgos
relativos menores.
Los factores de riesgo más estudiados son (4-7):
- Edad avanzada
- Inicio de la menarca a edad temprana
- Edad avanzada al momento del primer parto o ser nulípara
- Antecedentes personales de cáncer de mama o de enfermedad benigna de
mama
- Madre o hermana con cáncer de mama
- Uso de terapia de remplazo hormonal
- Consumo de bebidas alcohólicas
- Ser de raza blanca
- Alteraciones genéticas (BRCA1 y BRCA2 en cáncer hereditario de
mama/ovario)
- Densidad mamaria aumentada en una mastografía.
3
En pacientes con densidad mamaria aumentada en la mastografía, existe un
alto riesgo de desarrollar cáncer de mama, sobre todo en aquellas que reciben
terapia de remplazo hormonal (8).
La densidad mamaria es una determinación que se hace para conocer la
proporción de tejido denso en la mama, se realiza a través de la mastografía o
mamografía, este es un estudio radiográfico de las glándulas mamarias que
permite visualizar la totalidad de las mismas e incluye sus detalles estructurales;
este estudio constituye el estándar de oro disponible actualmente para efectuar
campañas de escrutinio en mujeres asintomáticas, ya que ha demostrado ser la
mejor opción para lograr a través de un diagnóstico temprano, la reducción de la
mortalidad por cáncer de mama en nuestro país (9).
La mastografía permite observar la apariencia radiográfica de la mama, la cual
varía de acuerdo a su composición; la grasa, al ser radiolúcida, aparece obscura en
el mamograma, mientras que el tejido epitelial y conectivo son radiodensos, por lo
que aparecen claros en el mismo, lo que se considera “mamográficamente denso”.
La mama es uno de los órganos considerados “diana” de las hormonas
esteroides por el nivel de receptores encontrados, a través de estos se pueden
regular otros receptores, hormonas y proteínas específicas.
El estrógeno, una hormona esteroide, tiene un papel esencial en el desarrollo y
mantenimiento de las características sexuales femeninas. Este juega un papel
crucial en la patogénesis y progresión del cáncer de mama (10-12).
Los efectos biológicos del estrógeno, tales como estimulación del crecimiento y
diferenciación del tejido mamario normal, está mediado primariamente a través de
la unión de alta afinidad con el receptor de estrógenos (RE) (13-15).
4
Hasta ahora se han descritos dos RE funcionales, denominados RE y RE , los
cuales son codificados por genes diferentes. El gen RE humano (también
nombrado ESR1) está localizado en el cromosoma 6q25. Comprende 8 exones
separados por 7 regiones intrónicas y abarca más de 140 kb (16-17). El gen ER
(ESR2) está localizado en el cromosoma 14q23-24.1 y está compuesto de 8
exones (18-19). El RE fue clonado por Green y col., en 1986 (20), mientras que el
ER fue clonado por Kuiper y col., en 1996 (21). Ambos receptores funcionan como
factores de transcripción cuando están unidos a sus respectivos ligandos, que en
general, comparten características estructurales y funcionales comunes.
El modelo estructural de los RE está conformado por una cadena peptídica simple,
en la cual se distinguen segmentos o dominios relacionados con las diferentes
funciones de la molécula (22) (figura 2). La manera de esquematizarlos es variable.
Algunos describen una simple división tripartita, según la cual hay un dominio N-
terminal, sede de la función de activación constitutiva –AF-1-; uno central, para la
fijación al DNA y el C-terminal, con función de activación dependiente del ligando
AF-2. Otros dividen a los receptores en regiones funcionales (23):
1. Una región AB o aminoterminal, que tiene variaciones entre los miembros de la
superfamilia y entre los RE y . Estos últimos conservan apenas un 15% de
homología en esta región, que contiene la función de activación transcripcional
AF-1, esta puede modificarse o faltar en el RE . La AF-1 está activa
constitutivamente, puede estimular la transcripción de genes sin necesidad de
ligarse a hormonas, puede ser autónoma de la AF-2 (24-25) y es activada por
moduladores específicos de los RE, o SERM (26). Sin embargo, en la mayoría
de los ambientes celulares se requiere de una acción sinérgica de AF-1 y AF-2
para activar totalmente los RE; la intervención de cada una varía en los distintos
contextos celulares, y se requieren varias regiones de AF-1 para la activación
dependiente de estradiol o antiestrógenos del RE (27).
2. La región C, la de más homología estructural entre los miembros de la
superfamilia y entre los dos RE, contiene el dominio de fijación al DNA, por lo
5
que es necesaria para la activación transcripcional, controlando la especificidad
del gen a regular por la acción del complejo ligando-receptor. La especificidad
de unión de éste con los llamados elementos de respuesta a estrógenos (ERE)
del DNA, depende de una parte de la región C que posee dos estructuras
químicas conocidas como “dedos de zinc”, las cuales contienen varias cisteínas.
Estas estructuras son componentes esenciales del RE, al faltar no hay unión
con el DNA, ni in vivo ni in vitro. Además, la región C del RE contiene
secuencias de aminoácidos que participan en la dimerización, aunque varias
localizaciones de la molécula participan en este hecho. La región C también
puede unirse a la proteína de choque térmico hsp90 (28) e influir en la
localización nuclear del receptor.
3. La región D funciona a manera de bisagra, como un puente flexible capaz de
unir el dominio de fijación al ligando con el de fijación al DNA. Influye en la
migración del RE al núcleo después de su síntesis en el citoplasma, y en la
permanencia intranuclear mientras conserva su estado nativo, no unido a
hormona.
4. La región E tiene el dominio de fijación al ligando, por lo que es determinante de
la especificidad hormonal del receptor, responsable de su dimerización;
contiene el factor de activación AF-2 (que actúa solamente previa unión a
hormona), a ella se fija la hsp90 e interactúa con las proteínas correguladoras.
5. La región F, ubicada al extremo carboxiterminal, aunque no es absolutamente
necesaria para la respuesta transcripcional, modula la transcripción de genes
por estrógenos y puede afectar la actividad, tanto de AF-1 como de AF-2.
6
Figura 2. Estructura del receptor de estrógenos.
Existen diversos mecanismos a través de los cuales los estrógenos inducen
cambios celulares. Los estrógenos en el interior de las células se unen a sus
receptores específicos (figura 3), y establecen el complejo estrógeno-receptor, al
suceder esto se separan de las proteínas de choque térmico asociadas al receptor
estrogénico, las cuales lo estabilizan en su estado inactivo y lo ayudan a plegarse
en una configuración apropiada, esta le otorga protección contra la degradación por
las proteasas celulares y así resguardar su actividad biológica (29). Posteriormente
el RE experimenta un cambio de configuración alostérica, lo cual lo convierte en
una forma activa capaz de interactuar con el sistema de transcripción de los genes
(30). Esto permite la interacción de los sitios específicos de unión al DNA del
receptor, con las secuencias específicas del mismo, que se encuentran en las
regiones reguladoras de los genes diana de los estrógenos (13-14). Posteriormente
se inicia la transcripción a través de la RNA polimerasa y la formación del RNA
mensajero, que migra al citoplasma, donde se realiza la traducción en los
ribosomas (31).
7
Figura 3. Vía clásica de transducción de señales de los estrógenos. Cuando el estrógeno se
une a su receptor, éste se disocia de las proteínas en el citoplasma, entonces el complejo
estrógeno-receptor se traslada al núcleo, donde se une al DNA e inicia la transcripción. Gruber y col.
NEJM 2002; 346:340-352.
Para la activación eficiente de los genes, los receptores estrogénicos deben
acoplarse con otros factores de transcripción para formar complejos multiméricos
estables que induzcan a la RNA polimerasa a iniciar la transcripción génica. Las
proteínas correguladoras están intercaladas entre el receptor estrogénico activado
y la maquinaria transcripcional, por lo tanto, funcionan como intermediarias de las
señales entre el receptor y la transcripción general (32). Estas modulan la
capacidad transcripcional del receptor estrogénico y pueden incrementarla
(coactivadores), disminuirla (correpresores) o funcionar como cointegradoras
8
celulares para otras proteínas, que modifican a su vez la transcripción (33), de esta
manera y de acuerdo con el contenido intracelular de las proteínas reguladoras,
tipos y densidad de los receptores y, los cambios conformacionales del receptor
estrogénico, llevados a cabo por los estrógenos, se modulan varias respuestas en
diversos tejidos, lo cual explica la inducción de mensajes heterogéneos, ya sea
como agonistas o como antagonistas.
La revisión genética del locus del gen RE ha revelado la existencia de diversos
sitios polimórficos que son de gran interés por su asociación potencial con el
cáncer de mama y otras enfermedades hormono-dependientes (34-38). Los
polimorfismos estudiados con mayor frecuencia son los de un solo nucleótido PvuII
(también conocido como c454-397 T C, IVS1-397 T/C, o rs2234693; donde el alelo
T y C a menudo son denominados como el alelo p y P, respectivamente) y XbaI
(también conocido como c.454-351A G, IVS1-351 A/G o rs9340799; donde el
alelo A y G a menudo son descritos como el alelo x y X, respectivamente), ambos
localizados en el intrón 1 del RE (39-40). El espacio entre estos dos polimorfismos
es de solo 45 pb y por lo tanto, PvuII y XbaI están en fuerte desequilibrio de unión
(41). En diferentes estudios, estos polimorfismos se han asociado con diversas
condiciones patológicas tales como el cáncer de mama y próstata, osteoporosis,
enfermedad de Alzheimer y enfermedades cardiovasculares (42-48).
La asociación de estos polimorfismos y el riesgo de enfermedad, incluyendo el
cáncer de mama ha sido objeto de gran interés, sin embargo los resultados no han
sido consistentes, por lo que consideramos importante estudiar estos polimorfismos
en relación con la densidad mamaria, ya que diversos estudios epidemiológicos
han sugerido que la densidad mamaria elevada incrementa el riesgo de desarrollar
cáncer de mama en una magnitud que varía de 4 a 6 veces (49-51).
Aparentemente este incremento en el riesgo de presentar cáncer de mama es
independiente de otros factores tradicionalmente asociados a este tipo de cáncer.
Casi un tercio (30%) de los cánceres de mama pueden ser asociados a una
densidad mamaria mayor a 50% (52).
9
El mecanismo por el cual la densidad mamaria se asocia a un incremento en el
riesgo de desarrollar cáncer de mama no es claro; sin embargo, se considera que
representa al tejido con actividad proliferante, lo cual es un factor de riesgo, ya que
al haber más tejido glandular existen mayor cantidad de células con potencial para
transformarse en malignas, aunque no se conocen aún exactamente los
mecanismos o determinantes genéticos asociados con la densidad mamaria (53).
Se ha sugerido que la densidad mamaria representa una exposición acumulativa a
estrógenos (54). También, que existe una relación entre los niveles de estrógenos
endógenos, andrógenos, progesterona, prolactina y globulina trasportadora de
hormonas sexuales (SHBG) y la densidad mamográfica entre mujeres
posmenopáusicas, por lo que se ha señalado que en este grupo de mujeres, la
densidad mamaria se relaciona con la concentración de hormonas sexuales
circulantes (55-56). Existe evidencia de que el uso de hormonas exógenas
incrementa la densidad mamográfica (57-61). También se sabe que la densidad
mamaria varía inversamente con la edad, ya que las mujeres jóvenes presentan
glándulas más densas, lo cual se ha asociado con que los estrógenos juegan un
papel esencial en el desarrollo, control del crecimiento y diferenciación de la
glándula mamaria normal. Por otra parte, se ha documentado que los estrógenos
endógenos pueden ser mitogénicos y participar en el inicio y progresión del Ca de
mama y otros cánceres ginecológicos (62).
En 2005, Van Duijnhoven y colaboradores, analizaron la relación entre la densidad
mamaria y los polimorfismos PvuII y XbaI (63), incluyeron 620 mujeres caucásicas
de 49 a 68 años de edad, encontraron que los alelos p y x están asociados con una
mayor densidad mastográfica, lo que sugiere que estos polimorfismos pueden tener
un papel en la variación de la densidad mastográfica y por lo tanto, en el riesgo del
Ca de mama, y que aunque cada polimorfismo por sí mismo sólo tiene un efecto
modesto, cuando se combinan pueden jugar un papel importante, porque es
probable que muchos genes y exposiciones actúen conjuntamente en el desarrollo
10
del tejido denso en la mama, y por lo tanto, sobre el riesgo de desarrollar Ca de
mama. Es importante señalar que en este estudio utilizaron la densidad mamaria
como fenotipo intermediario de Ca de mama, lo cual se puede considerar como una
aproximación del efecto de los factores genéticos en el riesgo para este
padecimiento. Aunque cabe señalar que en los diversos estudios realizados sobre
dichos polimorfismos y su asociación con el riesgo de cáncer de mama, los
resultados han diferido al considerar poblaciones de diferente origen étnico (64),
por lo que consideramos importante estudiar esta asociación en nuestra población,
porque aunque se tiene como antecedente un estudio realizado por Murillo y col.,
(65), en 2005, donde se estudiaron 87 mujeres mexicanas con el objetivo de
conocer la influencia del gen ER , no se demostró la relación entre las variantes
alélicas del genotipo del ER y la densidad mamaria, lo cual puede ser atribuible al
tamaño de la muestra utilizada, por lo que es necesario considerar un tamaño de
muestra mayor y por lo tanto, nos invita a realizar un estudio con el cual podamos
aportar información en mujeres mexicanas y cuyos resultados obtenidos puedan
ser comparables con los de otras poblaciones.
11
1.2 JUSTIFICACIÓN
Los estrógenos juegan un papel esencial en el desarrollo, control del crecimiento y
diferenciación de la glándula mamaria y pueden participar en el inicio y la
progresión del cáncer de mama y, debido a que su acción esta mediada por sus
receptores, se han realizado diversos estudios buscando la relación entre la
presencia de los polimorfismos PvuII y XbaI en el gen del receptor de estrógenos
alfa con el riesgo de desarrollar cáncer de mama, cuyos resultados han sido
contradictorios.
Se considera a la densidad mamaria incrementada como un factor de riesgo fuerte
para cáncer de mama, por lo que es interesante determinar si este factor de riesgo
se asocia con los polimorfismos antes mencionados en nuestra población.
1.3 PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA
¿Existe asociación entre los polimorfismos PvuII y XbaI en el gen del receptor de
estrógenos y la densidad mamaria?
1.4 HIPÓTESIS
Los polimorfismos PvuII y XbaI en el gen del receptor de estrógenos están
asociados con la densidad mamaria.
1.5 OBJETIVO GENERAL
Determinar la asociación entre los polimorfismos PvuII y XbaI en el gen del receptor
de estrógenos alfa y la densidad mamaria.
12
OBJETIVOS ESPECÍFICOS
1. Estudiar una población de mujeres asintomáticas para cáncer de mama por
medio de mastografía digital, clasificándolas en mujeres con mama densa y
mama no densa.
2. Determinar la presencia los polimorfismos PvuII y XbaI en el gen del
receptor de estrógenos alfa en la población a estudiar.
3. Determinar la frecuencia de polimorfismos PvuII y XbaI en el gen del
receptor de estrógenos alfa en ambos grupos (mujeres con mama densa y
mama no densa).
4. Comparar la proporción de los polimorfismos PvuII y XbaI en el gen del
receptor de estrógenos alfa entre las mujeres con mama densa y las
mujeres con mama no densa.
13
II. MATERIAL Y MÉTODOS
II.1 Diseño del estudio: transversal comparativo
Universo de trabajo: mujeres sin signos o síntomas evidentes de cáncer de
mama que se realicen su mastografía de tamizaje en el Departamento de
Radiología e Imagen del Hospital de Especialidades CMN SXXI, IMSS.
Criterios de selección:
Inclusión:
- Mujeres de 40 años o más con estudio mastográfico de tamizaje realizado
en el Hospital de Especialidades del CMN SXXI y que acepten participar en
el estudio (firmando la carta de consentimiento informado).
Exclusión:
- Mujeres con diagnóstico previo de cáncer de mama.
- Mujeres embarazadas.
- Mujeres que no acepten participar en el estudio.
II.2 Variables de estudio:
Independiente: Polimorfismos PvuII y XbaI en el gen del receptor de estrógenos
alfa.
Dependiente: Diagnóstico mastográfico de mama densa o mama no densa.
De confusión: Edad, índice de masa corporal, inicio de la menarca, estado
menopáusico, edad de la menopausia, edad de la primera gestación, número de
gestas, periodo de lactancia, historia familiar de cáncer de mama, uso de
14
anticonceptivos, utilización de terapia hormonal de reemplazo y consumo de
tabaco.
II.3 Tamaño de la muestra:
Se calculó con la siguiente fórmula para estudios sobre poblaciones en dos grupos:
2
n = z 2 1 (1- 1) - z 1 (1- 1) + 2 (1- 2)
1 - 2
n = 107
Donde:
n = tamaño necesario en cada grupo
Z = 1.96
Z
c = % de polimorfismos en el grupo control
t = % de polimorfismos en el grupo de riesgo (71)
II.4 Descripción general del estudio
Se estudiaron 225 mujeres que acudieron al Departamento de Radiología e Imagen
del Hospital de Especialidades del CMN SXXI a realizarse su mastografía de
tamizaje y que aceptaron participar en el proyecto firmando la carta de
consentimiento informado (anexo 1).
El diagnóstico mastográfico se clasificó en mama densa y mama no densa.
Posteriormente, en el laboratorio se les tomó una muestra de sangre periférica para
la obtención de DNA y la determinación posterior de los polimorfismos.
15
A las participantes se les tomaron sus medidas antropométricas, así mismo se les
realizó una entrevista para la recolección de datos clínicos (anexo 2).
PROCEDIMIENTOS
A) En el Departamento de Radiología e imagen:
a) Se realizó la mastografía digital de tamizaje por personal especializado
(médicos radiólogos), utilizando un equipo de mastografía digital de General
Electric modelo Senographe 2000 D.
b) De cada mama, se tomaron proyecciones craneocaudales y oblicuo medio
laterales.
c) Se evaluó la densidad mamaria por los radiólogos asignando el resultado en
dos categorías: mama densa y mama no densa.
d) También se evaluaron las imágenes aplicando el sistema CAD (diagnóstico
asistido por computadora)
e) Se recrearon las imágenes mediante su impresión utilizando un equipo
Drystar 4500 M, con la película Dry Medial Film de 8 x 10 pulgadas,
obteniendo 4 filmes (mínimo) por paciente.
B) En el Laboratorio:
a) Se extrajeron 5 mL de sangre periférica de la vena antecubital de cada
participante, colectándolos en un tubo conteniendo EDTA como
anticoagulante.
b) Se aisló el DNA a partir de los leucocitos de sangre periférica utilizando el kit
GFX Genomic Blood DNA Purification (Amersham Biosciences, NJ, USA)
siguiendo las indicaciones del fabricante.
c) Se cuantificó el DNA obtenido utilizando un espectrofotómetro ND-1000,
NanoDrop.
d) Se determinó la integridad del DNA, utilizando geles de agarosa al 1.5%
teñidos con bromuro de etidio y TBE como amortiguador. La visulización del
desplazamiento se realizó en un transiluminador Gel Doc 2000 de Bio-Rad.
16
e) Se realizó la PCR, utilizando la siguiente pareja de iniciadores: 5´ -CTG CCA
CCC TAT CTG TAT CTT TTC CTA TTC TCC- 3´ y 5´ - TCT TTC TCT GCC
ACC CTG GCG TCG ATT ATC TGA- 3´, con las siguientes condiciones de
amplificación: 5 minutos a 94°C, 35 ciclos de 1 minuto a 94°C, 1 minuto a
62°C, 4 minutos a 72°C y 7 minutos a 72°C.
f) Se verificó el producto obtenido por electroforesis utilizando geles de
agarosa al 1.5%.
g) Se obtuvieron los fragmentos de restricción polimórfica, sometiendo el
producto de 1.3 kb que corresponde a una parte del intrón 1 y del exón 2 del
gen ER a restricción enzimática con las endonucleasas PvuII y XbaI
(Roche Diagnostic Corporation, Mannhein, Germany).
h) Se visualizaron los fragmentos a través de electroforesis en geles de
agarosa al 1.5% teñidos con bromuro de etidio. Los polimorfismos PvuII y
XbaI se genotipificaron como PP, Pp, pp y XX, Xx, xx, respectivamente, las
letras mayúsculas representan la ausencia de restricción y las minúsculas
representan la presencia del sitio de restricción.
i) Se realizó secuenciación automatizada, purificando el producto obtenido de
PCR utilizando el kit High pure PCR product purification (Roche), para
secuenciar y comprobar los polimorfismos detectados.
II.5 Análisis estadístico
Los datos obtenidos se recolectaron en una hoja diseñada para tal fin
(Anexo 2), se ordenaron por distribución de frecuencias, los datos se presentaron y
organizaron en tablas y graficas. A cada variable se le realizaron las medidas de
dispersión, media o mediana dependiendo del tipo de distribución.
Se calculó el coeficiente de correlación entre los polimorfismos y la densidad
mamaria utilizando la prueba de rho de Spearman.
17
Para determinar si la proporción de los polimorfismos PvuII y XbaI eran diferentes
entre las mujeres con mama densa y no densa, se utilizó la prueba chi cuadrada
para muestras independientes.
ASPECTOS ÉTICOS
Este estudio no implicó riesgos adicionales, ya que la mastografía que se realizó es
la que se indica a las mujeres a partir de 40 años de edad. El único riesgo fue el
mínimo que se espera en la venopunción para la toma de muestra.
Los procedimientos que se llevaron a cabo están de acuerdo con las normas
éticas, el Reglamento de la Ley General de Salud en Materia de Investigación para
la Salud y con la Declaración de Helsinki de 1975 y sus enmiendas, así como los
códigos y normas internacionales vigentes para las buenas prácticas de
investigación clínica.
Este protocolo fue autorizado por el Comité Local de Investigación en Salud del
Hospital de Especialidades del CMN SXXI, IMSS.
Las participantes estuvieron informadas del objetivo del estudio y firmaron una
carta de consentimiento informado (anexo 1).
18
III. RESULTADOS.
Se estudió una población de 250 mujeres con un rango de edad de 40 a 68 años
que acudieron a la Unidad de Radiología e Imagen del Hospital de Especialidades
del Centro Médico siglo XXI, para la realización de su mastografía de escrutinio. Se
les elaboró su historia clínica completa y los datos obtenidos como edad, talla,
peso, índice de masa corporal (IMC) índice cadera cintura (ICC), inicio de la
menarca, número de embarazos, edad de la primera gestación, si lactaron o no,
tabaquismo, uso de terapia hormonal de reemplazo, se muestran en la tabla 1.
Para el estudio se empleó un mastógrafo digital General Electric modelo
Senographe 2000 D, la mastografía obtenida fue evaluada por los médicos
radiólogos de la Unidad, así como por CAD (diagnóstico asistido por computadora)
y clasificada en las categorías de mama densa y mama no densa (tabla 2). En esta
tabla se muestra que el porcentaje obtenido de ambos grupos es muy parecido.
Tabla 1. Características clínicas y demográficas en la población de estudio.
Variable (n= 250)
Media ± DE Variable Frecuencia %
Edad (años)
Talla (cm)
Peso (Kg)
IMC (cm)
ICC (cm)
Inicio menarca
(años)
Embarazos a
Término
Edad Primera
Gestación (años)
49.33 ± 5.8
1.53 ± 0.04
69.15 ± 11.9
29.1 3 ± 4.76
0.85 ± 0.06
12.39 ± 1.43
2.06 ± 1.41
23.23 ± 5.86
Lactancia No Si
Terapia Hormonal
No Si
Tabaquismo Nunca
Con antecedente Si actualmente
57 176
192 37
160 21 44
24.5 75.5 83.8 16.2 71.11 9.33 19.56
19
Tabla 2. Clasificación de la población analizada por densidad mamaria
Densidad mamaria Frecuencia Porcentaje
Mama no densa 133 53.2
Mama densa 117 46.8
Total 250 100.0
De un total de 250 pacientes que ingresaron al estudio, 25 no lo completaron por lo
que se eliminaron del mismo.
Posteriormente se conformaron 2 grupos de acuerdo a su estado menopáusico,
distribuyéndose de la siguiente forma: 110 mujeres fueron premenopáusicas y 115
mujeres posmenopáusicas (tabla 3), es decir, ambos grupos fueron muy
semejantes.
Tabla 3. Distribución de la población estudiada por estado menopáusico
Estado menopáusico n %
Premenopausia 110 48.9
Postmenopausia 115 51.1
Total 225 100.0
Posteriormente se clasificaron por estado menopáusico (Tabla 4) respecto a
variables como índice de masa corporal, índice cadera-cintura y los valores
obtenidos en la determinación de estradiol, obteniendo un ICC más alto en las
mujeres posmenopáusicas y también en ese grupo se presentó el nivel
significativamente más bajo de estradiol.
20
Tabla 4. Comparación de las características del grupo de mujeres premenopáusicas
y postmenopásicas.
Premenopáusica
(n=110)
Postmenopáusicas (n=115)
Variable
Media
DE
Media
DE
P
IMC (cm) 28.31 4.5 29.9 4.8 0.39
ICC (cm) 0.85 0.64 0.84 0.63 0.74
Estradiol
(pg/mL)
96.06 91.5 39.31 59.4 0.02*
* Existe diferencia significativa p≤ 0.05
En la tabla 5 se presenta la distribución de la población por densidad mamaria y
estado menopáusico, donde se observa que hay un ligero predominio de mujeres
posmenopáusicas con mama densa.
Tabla 5. Prevalencia de la densidad mamaria por estado menopáusico
Mama Densa Mama No Densa
Estado
menopáusico
Frecuencia % Frecuencia %
Premenopáusicas 57 48.1 56 52.7
Postmenopáusicas 62 51.9 50 47.2
Total 119 100 106 100
Determinación de Polimorfismos
A partir de las muestras sanguínea se realizó la extracción del DNA,
posteriormente se comprobó la integridad de éste, mediante electroforésis en geles
de agarosa al 1.5% teñidos con bromuro de etidio. En la figura 4 se muestra una
21
imagen representativa de un gel de agarosa al 1.5% donde se determinó la
integridad del DNA obtenido.
Figura 4. Imagen representativa del análisis de integridad del DNA obtenido. Imagen de un gel de agarosa al 1.5% en el que se observa el marcador de pares de bases (100 pb) en el primer carril y DNA íntegro de las pacientes en estudio en los carriles subsecuentes.
Resultados de PCR
Con la siguiente pareja de iniciadores: 5’ CTG CCA CCC TAT CTG TAT CTT TTC
CTA TTC TCC 3’ y 5’TCT TTC TCT GCC ACC CTG GCG TCG ATT ATC TGA 3’
diseñados de una región entre el intrón 1 y el exón 2 del gen ER , se obtuvo el
fragmento de 1.3 kb del DNA genómico, el cual se amplificó mediante PCR.
Se corrieron los productos obtenidos de la reacción en un gel de agarosa al 1.5%
y se verificaron los productos amplificados. En la figura 5 se muestra una imagen
representativa de los productos amplificados obtenidos.
22
Figura 5. Imagen representativa de los productos amplificados por PCR. Imagen de un gel de agarosa al 1.5% teñido con bromuro de etidio, en el cual se observa en el primer carril el marcador
de pares de bases y en los carriles subsecuentes el amplicón del producto de PCR del gen ER de los diferentes pacientes en estudio.
Los fragmentos de PCR se sometieron a digestión con las enzimas de restricción
PvuII y XbaI (Roche Diagnostic Corporation, Mannhein, Germany) y se separaron
en un gel de agarosa al 1.5%, se tiñeron con bromuro de etidio y posteriormente se
visualizaron en un documentador de imágenes. En la figura 6 se muestra una
imagen representativa del patrón de bandas obtenido para el polimorfismos PvuII.
Figura 6. Imagen representativa del patrón de bandas obtenido para el polimorfismo Pvull. Imagen de un gel de agarosa al 1.5% teñida con bromuro de etidio, en el que podemos observar en el primer carril el marcador de peso molecular, en el carril 2 variante alélica pp, carril 3 la variante alélica PP, carril 4 la Pp que corresponden al polimorfismo Pvull.
23
La ausencia del sitio de restricción PvuII se designó como P que corresponde a un
fragmento de 1.3 kb; el sitio de restricción se designó como p formando un patrón
de bandas de dos fragmentos, uno de 0.85 kb y otro de 0.45 kb. La ausencia del
sitio de restricción de XbaI se indica con X, que corresponde como en el caso de P
a un fragmento de 1.3 kb, el sitio de restricción XbaI se señala con x formando un
patrón de dos fragmentos, uno de 0.9 kb y otro de 0.4 kb. Esto generó tres
genotipos para PvuII, definidos por las variantes alélicas: PP, Pp y pp, y tres para el
genotipo XbaI: XX, Xx y xx.
Se identificaron los polimorfismos de 225 muestras, los resultados obtenidos se
presentan en la tabla 6. En dicha tabla se muestra que los fenotipos más
frecuentes para Pvull fueron los alelos heterocigoto Pp con 37.4% y el homocigoto
pp con 53.3%, mientras que para el genotipo Xbal las más frecuentes fueron los
alelos heterocigoto Xx con 32.5% y el homocigoto xx con 60%.
Tabla 6. Distribución de la población analizada por las variantes alélicas
GENOTIPO n %
PP 21 9.3
Pp 84 37.4
pp 120 53.3
Total 225 100.0
XX 17 7.5
Xx 73 32.5
xx 135 60
Total 225 100.0
En la tabla 7 se presentan las variantes alélicas para Pvull de acuerdo a las
características de la densidad mamaria. Se observo que la variante pp es la que
24
presenta una frecuencia ligeramente mayor en las mujeres con mama densa, pero
sin valor significativo.
Tabla 7. Distribución de las variantes alélicas para Pvull de acuerdo a las
características mastográficas
GENOTIPO MAMA NO DENSA MAMA DENSA
PP 9.0 9.4
Pp 41.0 36.5
pp 50.0 54.1
Total 100.0 100.0
En la tabla 8 se presentan las variantes alélicas para Xbal de acuerdo a las
características de la densidad mamaria. Se observo que la variante xx se presente
prácticamente con la misma frecuencia entre las mujeres con mama densa y no
densa.
Tabla 8. Distribución de las variantes alélicas para Xbal de acuerdo a las
características mastográficas
GENOTIPO MAMA NO DENSA MAMA DENSA
XX 7.0 8.3
Xx 34.0 31.0
xx 59.0 60.7
Total 100.0 100.0
Para evaluar el efecto de los diferentes factores como la edad, IMC, número de
embarazos, lactancia y estado reproductivo sobre la densidad mastográfica, se
25
realizó un análisis de regresión múltiple y se encontró que la edad, el peso y el IMC
eran factores determinantes de la densidad mamaria en este grupo de pacientes.
La influencia del polimorfismo XbaII también fue significativa sobre la densidad
mamaria, mientras que el polimorfismo PvuII el modelo señaló un significado
limítrofe (tabla 8).
Tabla 8. Análisis de regresión múltiple
VARIABLE sig
Polimorfismo PvuII -1.843 0.067
Polimorfismo XbaI 2.377 0.019
Edad -2.032 0.044
IMC -2.066 0.041
Peso 2.642 0.009
Edad de la primera gestación -1.564 0.120
Número de gestaciones 0.044 0.801
Lactancia -0.796 0.427
Estado menopáusico 0.034 0.973
Variable dependiente: Densidad mamaria, R=0.361.
26
IV DISCUSION
La densidad mamaria se reconoce actualmente como un factor de riesgo
independiente para el desarrollo de cáncer de mama, y se ha integrado dentro de
los modelos de predicción de riesgo para el desarrollo de esta patología. Por otra
parte, la relación entre el cáncer de mama y la exposición a estrógenos ya ha sido
documentada (54,66). Por lo anterior, en este trabajo se buscó estudiar la relación
entre la densidad mamaria y los polimorfismos del receptor de estrógenos alfa
PvuII y XbaI, estas variantes se han implicado con alteraciones de la trascripción
en problemas oncológicos mamarios. Los resultados del presente estudio nos
sugieren una asociación discreta entre estos polimorfismos con la densidad
mamaria, así mismo se encontró una asociación significativa entre la edad, IMC y
peso con la densidad mamaria.
En estudios previos (38-40) se ha señalado la relación de los polimorfismos PvuII y
XbaI del gen del receptor de estrógenos alfa con el cáncer de mama, por lo que
este estudio pretendía incluir un enfoque más preventivo buscando la relación entre
los polimorfismos mencionados y la densidad mamaria en mujeres sin patología
manifiesta. En un estudio realizado por Van Duijnhovon y cols (63), se encontró
una relación significativa entre las variantes alélicas pp y xx con la densidad
mamaria, sin embargo las características étnicas de la población en dicho trabajo
eran diferentes a las de la población mexicana. De igual forma se realizó un
trabajo previo en mujeres mexicanas por Murillo y cols (65), en las que no se
demostró la asociación entre los polimorfismo PVuII y XbaI con la densidad
mamaria, debido probablemente al tamaño de muestra que fue muy reducido. Por
lo anterior, era necesario realizar un estudio más amplio y con criterios de
restricción adecuados que permitieran profundizar más en la relación entre los
polimorfismos y densidad mamaria y el cáncer de mama. Así, los resultados
obtenidos en este trabajo, permiten poner en evidencia la relación con la densidad
mamaria, tal como ya ha sido descrito, además de proporcionar información de la
que no se dispone sobre los estos polimorfismos en el ER alfa en cuanto a su
27
frecuencia en población mexicana, esto puede ser de relevancia ya que en
numerosos trabajos (67-69) se ha identificado su relación con otros problemas
prioritarios de salud como son la osteoporosis y enfermedad cardiovascular.
Existen otros factores, tales como son la edad, peso, IMC, estado reproductivo,
entre otros, relacionados con la densidad mamaria. En la población estudiada se
encontró un IMC elevado y tendencia al sobrepeso y a la obesidad, lo que es una
variable que como se muestra en la tabla 8 influyó en los resultados. Otra variable
fue la edad, sin embargo, aunque se esperaría que el grupo de mujeres de menor
edad presentara una mayor frecuencia de mama densa, no se encontró diferencia
significativa.
Otras variables a analizar en el trabajo fueron la exposición estrogénica y la etapa
reproductiva de las pacientes. Conforme el tiempo transcurre y la menopausia se
presenta, la mama exhibe cambios importantes en su constitución, observando en
general una disminución de la densidad mamaria en la etapa posmenopáusica. No
obstante en este trabajo se encontró que la frecuencia de mama densa fue similar
entre mujeres pre y posmenopáusicas. Un factor que pudo influir fue el IMC, ya
que en la población estudiada no se identificó el incremento del peso que
generalmente se observa en la etapa posmenopáusica y como se sabe, este factor
es determinante sobre la densidad mamaria. Si bien, se debe tener en cuenta, que
la mama es heterogénea en sí misma y varía en cada mujer. También, como se
esperaba, el estradiol fue menor en las mujeres posmenopáusicas, aunque cabe
mencionar que algunas de ellas se encontraban bajo terapia estrogénica
sustitutiva.
Como se mencionó y hasta donde se conoce, este estudio es el primero en
mujeres mexicanas que nos indica la prevalencia de polimorfismos del ER alfa, no
obstante, en comparación con otras poblaciones se pudo observar variabilidad en
los resultados. De la misma forma entre los muy escasos trabajos que analizan la
relación entre los polimorfismos con la densidad mamaria existe también
28
variabilidad. Se ha sugerido además que tanto los polimorfismos PvuII y XbaI,
como algunos otros, participan modestamente en el riesgo para el desarrollo de
cáncer de mama. No obstante, los resultados de nuestro trabajo sugieren una
influencia discreta de dichos polimorfismos sobre la densidad mamaria.
Se considera una fortaleza de este estudio, en comparación a los otros 2
publicados (63,65), que las mujeres presentaban un rango estrecho de edad y no
manifestaban patología mamaria previa. Sin embargo, a pesar de que en este
estudio se cumplió con el tamaño de muestra calculado, quizá es necesario realizar
otro con un mayor número de pacientes para corroborar el grado de influencia de
los polimorfismos. En caso de confirmarse la asociación, sería de gran relevancia
para identificar tempranamente a las pacientes con un posible riesgo de malignidad
mamaria.
En este estudio también se considero el efecto de otros factores que influyen sobre
la densidad mamaria utilizando un modelo de regresión múltiple. Se corroboró, que
además de la influencia de los polimorfismos del ER alfa, en particular del XbaI,
que otras variables ya identificadas como el peso, IMC y edad, también participan
en la determinación la densidad mamaria. Llamó la atención que en este estudio,
otros factores asociados a la densidad mamaria ya conocidos como el tiempo de
lactancia, periodo gestacional, ventana estrogénica, edad de la primera gestación,
no tuvieron influencia relevante o fue limítrofe. Por otra parte, se ha sugerido que
es probable que la influencia de factores adicionales, aun no identificados, tanto
genéticos como ambientales, pudieran tener mayor peso sobre la densidad
mamaria.
Indudablemente, la densidad mamaria es un factor relacionado con el cáncer
mamario y una observación que se puede desprender de este trabajo es que esta
determinación es un recurso accesible en la mayoría de los niveles de atención a
las pacientes. Aun más, algunos factores que influyen tanto sobre la densidad
mamaria como en el riesgo de cáncer, tales como el peso y el IMC, se encuentran
asequibles en cualquier consultorio médico.
29
V CONCLUSIONES
1. Existe una asociación entre la presencia de los polimorfismos en el gen
receptor de estrógenos, particularmente del XbaI, con la densidad mamaria,
sin embargo, su relevancia puede ser mínima, debido al peso de otras
variables sobre la densidad mamaria.
2. Los resultados de este estudio, por lo anterior sugieren una la relación de los
polimorfismos PvuII y XbaI con la densidad mamaria, sin embargo, no debe
subestimarse que otros factores que se encuentran al alcance del clínico y
son más fáciles de medir como el IMC, son determinantes importantes de la
densidad mamaria.
30
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ANEXO 1
HOSPITAL DE ESPECIALIDADES DEL CMN SXXI UNIDAD DE INVESTIGACIÓN DE ENFERMEDADES ENDÓCRINAS
HOJA DE CONSENTIMIENTO INFORMADO
Por medio de la presente, yo ______________________________ doy mi autorización para participar en el estudio de investigación titulado “Estudio de los polimorfismos PvuII y XbaI del receptor de estrógenos alfa y su asociación con la mama densa como factor de riesgo para el cáncer de mama”, registrado ante el Comité Local de Investigación, el objetivo del estudio es determinar la relación de los polimorfismos PvuII y XbaI del gen mencionado con la mama densa, considerada como factor de riesgo para cáncer de mama. Se me ha explicado que mi participación consistirá en la toma de muestra sanguínea para la determinación de la presencia de dichos polimorfismos mediante técnicas de biología molecular, así como proporcionar la información solicitada en la hoja de recolección de datos. Mi participación es voluntaria, en caso de negarme, dicha decisión no repercutirá en lo absoluto en mi atención en el hospital. Declaro que se me ha informado ampliamente sobre los posibles riesgos, inconvenientes, molestias y beneficios derivados de mi participación en el estudio, la cual no implica ningún riesgo, a excepción del mínimo que se espera de la toma de muestra sanguínea, firmo de conformidad.
El investigador responsable se ha comprometido a darme información oportuna sobre cualquier procedimiento alternativo adecuado que pudiera ser ventajoso para mi tratamiento, así como a responder cualquier pregunta y aclarar cualquier duda que le plantee acerca de los procedimientos que se llevarán a cabo, los riesgos, beneficios o cualquier otro asunto relacionado con la investigación o con mi tratamiento.
Entiendo que conservo el derecho de retirarme del estudio en cualquier momento en que lo considere conveniente, sin que ello afecte la atención médica que recibo en el Instituto.
El investigador responsable me ha dado seguridad de que no se me identificará en las presentaciones o publicaciones que deriven de este estudio y de que los datos relacionados con mi privacidad serán manejados en forma confidencial. También se ha comprometido a proporcionarme la información actualizada que se obtenga durante el estudio, aunque esta pudiera cambiar de parecer respecto a mi permanencia en el mismo.
_________________________________________________
Nombre y firma de la participante
______________________________
Investigadores Responsables
__________________________________
Testigo
Fecha
Los números telefónicos a los cuales puedo comunicarme en caso de emergencia, dudas o preguntas
relacionadas con el estudio son: 56276900 Ext. 21479.
38
ANEXO 2
HOSPITAL DE ESPECIALIDADES DEL CMN SXXI UNIDAD DE INVESTIGACIÓN DE ENFERMEDADES ENDÓCRINAS
HOJA DE RECOLECCIÓN DE DATOS Protocolo: “Estudio de los polimorfismos PvuII y XbaI del receptor de estrógenos alfa y su relación con la mama densa como factor de riesgo para cáncer de mama” Nombre de la paciente: _______________________________________________ No. Afiliación: ______________________________________________________ Dirección: _________________________________________________________ Teléfono: __________________________________________________________ Edad: ___________________________ Talla: ___________________________ Peso: ___________________________ IMC: ____________________________ Edad de inicio de la menarquia: _____ Paridad: Nulípara _____ Número de hijos _____ Edad a la primera gestación: _____ Número de gestaciones: _____ Lactancia si _____ Número de eventos: _____ no _____ Estado Menopáusico: Premenopausia _____
Postmenopausia _____ Edad de inicio de la menopausia _____
Utilización de terapia hormonal de reemplazo: no ____ si _____ Tipo ____________________
Duración ________________ Historia familiar de Ca de mama: no ____
si _____ Parentesco _______________ Uso previo de anticonceptivos orales: no _____ si ______ Fuma: No _____ Si ______ Antecedente___ Actual ___ Tiempo _______________ Diagnóstico de la mamografía ______________________________________________________ Revisión clínica de mama _______________________________________________________ Padecimiento mamario previo no _____
si _____ Diagnostico establecido por histopatología _________________________________________ Otros _______________________________________________________________________ Polimorfismos: PvuII: PP_____ Pp _____ pp _____
XbaI: XX _____ Xx _____ xx _____