instituto politÉcnco nacional
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INSTITUTO POLITÉCNCO NACIONAL
CENTRO DE DESARROLLO DE PRODUCTOS BIÓTICOS
“RECUBRIMIENTOS BIODEGRADABLES PARA EL
CONTROL DE MICROORGANISMOS PATÓGENOS Y CONSERVACIÓN DE LA CALIDAD DE FRUTOS DE
JITOMATE (Lycopersicon esculentum L.)”
T E S I S
QUE PARA OBTENER EL GRADO DE
DOCTOR EN CIENCIAS
EN
DESARROLLO DE PRODUCTOS BIÓTICOS
PRESENTA
ALUMNA:
MARGARITA DE LORENA RAMOS GARCÍA
DIRECTORES DE TESIS:
DRA. SILVIA BAUTISTA BAÑOS
DR. IRAN ÁLIA TEJACAL
YAUTEPEC, MORELOS, J UNIO 2012
Este trabajo se realizó en el laboratorio de Fitopatología Postcosecha del
departamento de Interacciones Planta-Insecto del CEPROBI-IPN, bajo la
dirección de la Dra. Silvia Bautista Baños y el Dr. Irán Alia Tejacal.
Para la realización de los estudios se contó con el apoyo económico de
CONACyT (No. becario, 202396) y del Programa Institucional de Formación
de Investigadores de la Secretaría de investigación y Posgrado (SIP) del IPN.
DEDICADA
A mi hija María Ximena
Por ser el aliciente que me inspiró cada día a seguir adelante, por soportar
mis ausencias y disfrutar nuestro poco tiempo juntas, por darme tanto
cariño y ternura y sobre todo por ser la niña más hermosa, lista y
maravillosa que alguien pudiera llegar a tener.
TE AMO!!! Ximenita
y todo el tiempo estoy pensando en ti y por ti mi amor voy a seguir
adelante para nunca te falte nada y para que siempre estés orgullosa de mí.
A mi cantante favorito
El que siempre me hace reír y hace que me sienta maravillosa con sus
halagos, por ser paciente y compartir mi tiempo con su hermanita. Te
dedico mi esfuerzo Vale y estoy completamente agradecida con tu apoyo y
tu cariño. Te amo.
A ti cariño
Por ser un excelente esposo y padre, por que con tu amor y compañía he
podido salir adelante y tener otro logro en nuestra vida.
A ti, que me apoyaste, me cuidaste, me escuchaste, me consolaste y me
ayudaste, solo quiero recordarte lo orgullosa que estoy de ti y lo importante
que eres en mi vida
Gracias mi amor por quererme tanto, aunque sabes? ni con otro corazón te
alcanzaría para amarme como yo TE AMO!!
AGRADECIMIENTOS
Dra. Silvia Bautista
No me alcanzarían las palabas para expresarle lo agradecida que estoy con
usted por su amistad, apoyo, ánimo y su compañía en las diferentes etapas
de mi carrera y mi vida.
He aprendido de usted un mar de conocimiento que dudo mucho que lo
hubiera podido aprender en otro lugar. Permítame decirle que es usted una
gran investigadora y profesionista de la cual le quiero aprender su empeño
para realizar las cosas y su ánimo para seguir adelante en sus proyectos a
pesar de las adversidades.
Gracias a usted he podido realizar uno de mis mas grandes anhelos
dándome el estimulo necesario para poder lograrlo y ayudándome a cruzar
con firmeza mi camino de la superación.
Es usted una persona que considero parte de mi familia y la estimación que
le tengo es muy grande y solo puedo decirle…
GRACIAS
Lic. Raúl Orozco
Gracias por toda la ayuda que me has brindado, gracias por ser una persona
tan agradable y amable, pero sobre todo por darme tu mas sincera amistad
y afecto, te agradezco infinitamente todas tus compañías y atinados
consejos que han mejorado y simplificado muchos aspectos de mi vida.
A mi comité tutoral
Dr. Miguel Velázquez, Dra. Rosalía González, Dra. Elsa Ventura, Dra. Laura Barrera Necha
Por tomarse el tiempo y la dedicación de fortalecer mi trabajo, por darme
parte de sus consejos, y aportaciones, ya que sin ellos este trabajo no seria
el mismo
Dr. Irán Alia
Gracias por ser parte de este proyecto, ya que usted fue una pieza clave,
para esta investigación, gracias por el tiempo invertido y por sus
aportaciones y sus consejos
A mi familia
A mis padres que siempre han estado con migo y toman mis logros como
suyos. Gracias a ellos yo he llegado hasta donde estoy gracias a sus
consejos, cariño y principalmente a su apoyo. Gracias por querer y
preocuparse tanto por mis hijos. Y principalmente gracias por guiarme
hacia el camino de la superación, ya que su ejemplo es un aliciente para
llegar cada día más lejos.
Los AMO.
A mis sobrinos y hermanas, les agradezco el que me apoyaran tanto con
mis hijos, gracias por quererlos como si fueran suyos
y gracias por ser parte de mi familia.
A mi amiga Mónica Hernández
Por darme tu amistad y por apoyarme tanto en mi investigación, gracias a ti
pude terminar a tiempo mis experimentos.
Durante el tiempo hemos tenido altos y bajos, pero nació una bonita
amistad y no creo que eso se acabe nunca TQM
A Carolina, Estrella, Mitzu y Olguita
Gracias amigas por sus aportaciones en mi trabajo, gracias por ser parte de
este proyecto y por haber trabajado juntas.
A mi amigo Emanuel
Que siempre ha estado con migo apoyándome en todo, por ser tan paciente
y atento con migo.
Gracias por toda la información que me proporcionaste que hizo más
confortable mi estancia en el centro.
Y aunque me vaya del centro siempre te voy a llevar en mi corazón.
Dr. Javier Solorza
Le agradezco infinitamente sus aportaciones y enseñanzas que fueron
vitales para la realización de mi trabajo, es un gran investigador y un
excelente profesor
Un agradecimiento especial a la empresa Sistemas Agrícolas Avanzados
S.A de C. V. por proporcionar el material vegetal para la realización de
este trabajo.
Dra. Elsa Bosquez
Le agradezco todo el conocimiento que compartió con migo, le agradezco
su tiempo, su trabajo, sus consejos su trato y todas las consideraciones que
tuvo con migo.
Dr. Terres y Dr. Hernández
Por ayudarme en mi investigación y por todas sus asesorías, que sin duda
fortalecieron por completo mi trabajo
Dra. Zavala
Le agradezco todas las consideraciones que me tuvo, gracias por cuidarme
a mi y a Ximena y por darme un gran apoyo en mi estancia fuera del
CEPROBI. Gracias y que Dios la Bendiga!!
A mi amigo Delfino
Por ser una gran persona, por darme su amistad y por estar siempre a mi
lado.
Estoy muy agradecida con la vida que me dio la oportunidad de estar aquí,
y llenar todos los aspectos de mi vida PROFESIONISTA, ESPOSA y
MADRE!!
1
ÍNDICE
RESUMEN ..........................................................................................................................9
ABSTRACT ......................................................................................................................10
Capítulo I...........................................................................................................................11
Recubrimientos comestibles adicionados de compuestos antimicrobianos para proteger frutos de
jitomate. ............................................................................................................................11
Capítulo I. Recubrimientos comestibles adicionados de compuestos antimicrobianos para proteger
frutos de jitomate................................................................................................................12
Resumen ............................................................................................................................ 12
1. Introducción................................................................................................................ 13
2. Propiedades específicas de los recubrimientos a base de lípidos, proteínas y polisacáridos
aplicados en frutas y hortalizas. ........................................................................................... 14
2.1 Recubrimientos a base de lípidos. ............................................................................... 15
2.2 Recubrimientos a base de proteínas. ............................................................................ 16
2.3 Recubrimientos a base de polisacáridos. ...................................................................... 17
3. El quitosano como recubrimiento filmogénico con actividad antimicrobiana ....................... 18
3.1 Aplicación del quitosano como recubrimiento. ............................................................ 21
4. Incorporación de aditivos en los recubrimientos ............................................................... 22
4.1 Aceites esenciales ...................................................................................................... 23
4.1.2 Aceites esenciales y su actividad en bacterias que afectan la ...................................... 25
salud humana. ................................................................................................................. 25
4.1.3 Aplicación de aceites esenciales en recubrimientos comestibles. ................................ 27
5. Aplicación de la combinación quitosano + aceites esenciales, y su efecto en el control de
microorganismos. ............................................................................................................... 28
6. Cera de abeja y ácido oleico compuestos con propiedades funcionales................................ 28
7. Conclusión ..................................................................................................................... 29
8. Referencias bibliográficas ...............................................................................................29
Capítulo II .........................................................................................................................43
Evaluación de la actividad antifungica de recubrimientos comestibles en Rhizopus stolonifer en
frutos de jitomate ...............................................................................................................43
2
Capítulo 2. Evaluación de la actividad antifungica de recubrimientos comestibles en Rhizopus
stolonifer en frutos de jitomate ............................................................................................44
Resumen ............................................................................................................................ 44
1. Introducción................................................................................................................ 45
2. Materiales y métodos ................................................................................................... 47
2.1 Obtención de Rhizopus stolonifer............................................................................... 47
2.2 Obtención del jitomate ............................................................................................... 47
2.3 Formulación del recubrimiento ................................................................................... 48
2.4 Preparación de los recubrimientos ............................................................................... 49
2.5 Extracción del aceite esencial de limón y tomillo ......................................................... 50
2.6 Aplicación de los tratamientos .................................................................................... 50
2.7 Procesamiento de muestras de Microscopia Electrónica de Barrido (MEB).................... 51
2.8 Variables Evaluadas................................................................................................... 51
2.9 Análisis estadístico .................................................................................................... 52
3. Resultados ...................................................................................................................... 53
4. Discusión ....................................................................................................................... 64
5. Conclusiones .................................................................................................................. 67
6. Referencias bibliograficas................................................................................................ 67
Capítulo III ........................................................................................................................74
Evaluación de la actividad antibacterial de recubrimientos comestibles sobre Escherichia coli en
frutos de jitomate ...............................................................................................................74
Capítulo 3. Evaluación de la actividad antibacterial de recubrimientos comestibles sobre
Escherichia coli en frutos de jitomate ..................................................................................75
Resumen ............................................................................................................................ 75
1. Introducción................................................................................................................ 76
2. Materiales y métodos ................................................................................................... 79
2.1 Obtención y activación de la cepa Escherichia coli DH5α ......................................... 79
2.2 Obtención de la dilución óptima de Escherichia coli DH5α..................................... 79
2.3 Formulación del recubrimiento ................................................................................... 80
2.4 Aplicación in vitro de los tratamientos en Escherichia coli DH5α ................................. 81
2.5 Inoculación de Escherichia coli DH5α sobre frutos de jitomate a nivel de laboratorio y
semicomercial................................................................................................................. 82
2.6 Procesamiento de muestras en Microscopia Electrónica de Barrido (MEB). ................... 83
2.7 Análisis Estadístico. ................................................................................................... 84
3
3. Resultados .................................................................................................................. 84
4. Discusión.................................................................................................................... 92
5. Conclusiones............................................................................................................... 94
6. Referencias bibliograficas ............................................................................................ 94
Capitulo IV ...................................................................................................................... 103
Aplicación de recubrimientos comestibles en frutos de jitomate y su impacto sobre los atributos de
calidad ............................................................................................................................. 103
Capitulo 4. Aplicación de recubrimientos comestibles en frutos de jitomate y su impacto sobre los
atributos de calidad........................................................................................................... 104
Resumen ...........................................................................................................................104
1. Introducción...............................................................................................................105
2. Materiales y métodos ..................................................................................................108
2.1 Formulación del recubrimiento ..................................................................................108
2.2 Aplicación de los recubrimientos sobre frutos de jitomate ...........................................108
2.3 Variables evaluadas.............................................................................................109
2.4 Análisis Estadístico...................................................................................................111
3. Resultados .................................................................................................................111
3.1 Evaluación de la firmeza, SST y pérdida de peso en jitomates tratados con recubrimientos
comestibles ....................................................................................................................111
3.2 Evaluación de color en frutos de jitomate tratados con recubrimientos comestibles .......116
3.3 Evaluación de la producción de CO2 y etileno en frutos de jitomate tratados con
recubrimientos comestibles .............................................................................................122
4. Discusión...................................................................................................................126
5. Conclusiones..............................................................................................................130
6. Referencias bibliograficas ...........................................................................................130
Capitulo V ....................................................................................................................... 137
Propiedades mecánicas y de permeabilidad al agua de películas comestibles elaboradas con
quitosano y adicionadas con compuestos antimicrobianos. ................................................. 137
Capitulo 5. Propiedades mecánicas y de permeabilidad al agua de películas comestibles elaboradas
con quitosano y adicionadas con compuestos antimicrobianos. ........................................... 138
Resumen ...........................................................................................................................138
1. Introducción...............................................................................................................138
2. Materiales y métodos ..................................................................................................140
2.1 Preparación de las formulaciones ...............................................................................140
4
2.2 Formación de películas .............................................................................................140
2.3 Acondicionamiento de las cámaras .......................................................................141
2.4 Evaluación del grosor de la película .....................................................................141
2.5 Determinación de la permeabilidad del vapor de agua .................................................142
2.6 Determinación de las propiedades mecánicas..............................................................143
3. Resultados y Discusión ...............................................................................................144
4. Conclusiones..............................................................................................................145
5. Referencias bibliograficas ...........................................................................................146
CONCLUSIONES ........................................................................................................... 149
PERSPECTIVAS ............................................................................................................. 150
ANEXOS ........................................................................................................................ 151
5
ÍNDICE DE CUADROS
Cuadro 1. Efecto de diferentes concentraciones de quitosano en el control de varios hongos
postcosecha importantes en la producción hortofrutícola. .......................................................... 20
Cuadro 2. Efecto del quitosano como inhibidor de colonias de bacterias patógenas en humanos. . 21
Cuadro 3. Aceites esenciales con efecto fungicida contra algunas especies de hongos postcosecha
importantes en la producción hortofrutícola.............................................................................. 24
Cuadro 4. Efecto de aceites esenciales contra bacterias patógenas de humanos. ......................... 26
Cuadro 5. Tratamientos evaluados ........................................................................................... 48
Cuadro 6. Desarrollo in vitro de Rhizopus stolonifer en diferentes cubiertas a base de quitosano
incubado por 48 h a 20 °C ....................................................................................................... 54
Cuadro 7. Efecto curativo y preventivo de diferentes cubiertas a base de quitosano probadas en tres
estados de madurez de frutos de jitomate, inoculados con Rhizopus stolonifer y almacenados a
temperatura controlada y ambiente (10 ± 2 y 25 ± 2°C, respectivamente). .................................. 59
Cuadro 8. Efecto de diferentes cubiertas a base de quitosano y estados de madurez en frutos de
jitomate inoculados con Rhizopus stolonifer, y almacenados a temperatura controlada y ambiente
(10 ± 2 y 25 ± 2°C) a un nivel semicomercial. .......................................................................... 63
Cuadro 9. Diluciones decimales de Escherichia coli DH5α (cultivo “over night”)....................... 80
Cuadro 10. Número de colonia de Escherichia coli DH5α en medio Mac Conkey cubierto con
diferentes formulaciones a base de quitosano e incubadas durante 48 h. ..................................... 85
Cuadro 11. Efecto de diferentes cubiertas a base de quitosano en frutos de jitomate con tres estados
de madurez inoculados con Escherichia coli DH5α y almacenados a dos temperaturas, a nivel de
laboratorio. ............................................................................................................................ 89
Cuadro 12. Efecto de diferentes cubiertas a base de quitosano en frutos de jitomate con tres estados
de madurez inoculados con Escherichia coli DH5α y almacenados a dos temperaturas a nivel
semicomercial. ....................................................................................................................... 91
Cuadro 13.Valores de firmeza de frutos de jitomates tratados con recubrimientos a base de
quitosano adicionados con compuestos antimicrobianos y almacenados durante 3 semanas. .......112
Cuadro 14. Valores de SST de frutos de jitomates tratados con recubrimientos a base de quitosano
adicionados con compuestos antimicrobianos y almacenados durante 3 semanas. ......................113
Cuadro 15. Porcentaje de pérdida de peso de frutos de jitomates tratados con recubrimientos a base
de quitosano adicionados con compuestos antimicrobianos y almacenados durante 3 semanas....115
6
Cuadro 16. Valores de luminosidad (L*) de frutos de jitomates tratados con recubrimientos a base
de quitosano adicionados con compuestos antimicrobianos y almacenados durante 3 semanas....117
Cuadro 17. Valores de cromaticidad (C*) de frutos de jitomate tratados con recubrimientos a base
de quitosano adicionados con compuestos antimicrobianos y almacenados durante 3 semanas....119
Cuadro 18. Valores de matiz (H*) de frutos de jitomates tratados con recubrimientos a base de
quitosano adicionados con compuestos antimicrobianos y almacenados durante 3 semanas. .......121
Cuadro 19. Valores de CO2 de frutos de jitomates tratados con recubrimientos a base de quitosano
adicionados con compuestos antimicrobianos y almacenados durante 3 semanas. ......................124
Cuadro 20. Valores de etileno de frutos de jitomates tratados con recubrimientos a base de
quitosano adicionados con compuestos antimicrobianos y almacenados durante 3 semanas. .......125
Cuadro 21. Propiedades mecánicas y de permeabilidad al vapor de agua de películas a base de
quitosano. .............................................................................................................................145
7
ÍNDICE DE FIGURAS
Figura 1. Frutos de jitomate en tres diferentes estados de madurez: a) veteado, b) naranja y c) rojo.
............................................................................................................................................. 48
Figura 2. Preparación de los recubrimientos comestibles. a) adición del quitosano, b) adición del
ácido oleico y glicerol, c) homogenización durante 5m., d) recubrimiento terminado. ................. 49
Figura 3. Escala del índice de severidad de Rhizopus stolonifer en los frutos de jitomate: 1) 0, 2)1-
25, 3) 26-50, 4) 51-75, 5) 76-100. ............................................................................................ 52
Figura 4. Crecimiento in vitro de Rhizopus stolonifer sobre diferentes cubiertas, incluyendo el
control. .................................................................................................................................. 55
Figura 5. MEB del micelio de Rhizopus stolonifer evaluado en diferentes cubiertas: a) quitosano
1% + cera de abeja 0.1% + aceite esencial de limón 0.1%, b) quitosano 1% + ácido oleico 1% +
aceite esencial de limón 0.1%, c) quitosano 1% + cera de abeja 0.1%, d) quitosano 1% + ácido
oleico 1%, e) PDA, f) PDA (esporangióforo). ........................................................................... 56
Figura 6. Incidencia de frutos de jitomate con tres estados de madurez e inoculados con Rhizopus
stolonifer. a) frutos tratados de manera curativa almacenados a temperatura controlada b) frutos
tratados de manera curativa almacenados a temperatura ambiente c) frutos tratados de manera
preventiva almacenados a temperatura controlada d) frutos tratados de manera preventiva
almacenados a temperatura ambiente. ...................................................................................... 57
Figura 7. Índice de severidad de frutos de jitomate veteados inoculados con Rhizopus stolonifer de
manera preventiva /curativa y almacenados a 25 ± 2 y 10 ±2 °C ............................................... 61
Figura 8. Índice de severidad de frutos de jitomate naranja inoculados con Rhizopus stolonifer de
manera preventiva /curativa y almacenados a 25 ± 2 y 10 ± 2 °C .............................................. 61
Figura 9. Índice de severidad de frutos de jitomate rojos inoculados con Rhizopus stolonifer de
manera preventiva /curativa y almacenados a 25 ± 2 y 10 ± 2 °C .............................................. 62
Figura 10. Índice de severidad en los tres estados de madurez de los frutos de jitomate (veteado,
naranja y rojo) inoculados con Rhizopus stolonifer y almacenados a 25 ± 2 y 10 ± 2 °C. ........... 64
Figura 11. Formación de las cubiertas en los experimentos in vitro e inoculación de E. coli DH5α82
Figura 12. Aplicación de las cubiertas e inoculación de E. coli DH5α en frutos de jitomate a nivel
de laboratorio. ........................................................................................................................ 82
Figura 13. Aplicación de las cubiertas e inoculación de E. coli DH5α en frutos de jitomate a nivel
semi-comercial. ...................................................................................................................... 83
Figura 14. Evaluación del desarrollo de E. coli DH5α en frutos de jitomate. ............................... 83
8
Figura 15. Número de UFC desarrolladas en diferentes cubiertas e incubadas por 48 h: a)
quitosano 1% + cera de abeja 0.1% + aceite esencial de limón 0.1% b) quitosano 1% + cera de
abeja 0.1% + aceite esencial de tomillo 0.1% c) quitosano 1% + ácido oleico 1% + aceite esencial
de limón 0.1% d) quitosano 1% + ácido oleico 1% + aceite esencial de tomillo 0.1% e) quitosano
1% + cera de abeja 0.1% f) quitosano 1% + ácido oleico 1% y g) Medio Mac Conkey. ............... 86
Figura 16. Muestras de MEB de Escherichia coli DH5α inoculada en diferentes cubiertas: a)
quitosano 1% + cera de abeja 0.1% + aceite esencial de limón 0.1% b) quitosano 1% + ácido oleico
1% + aceite esencial de limón 0.1% c) quitosano 1% + cera de abeja 0.1% d) quitosano 1% + ácido
oleico 1% e) MacConkey. ....................................................................................................... 87
Figura 17. Colonias de Escherichia coli DH5α aisladas de frutos de jitomate naranjas almacenados
a 10 ± 2 °C y cubiertos con las diferentes formulaciones: a) quitosano 1% + cera de abeja 0.1% +
aceite esencial de limón 0.1% b) quitosano 1% + ácido oleico 1% + aceite esencial de limón 0.1%
c) quitosano 1% + cera de abeja 0.1% d) quitosano 1% + ácido oleico 1% e) Agua. .................... 89
Figura 18. Crecimiento de E. coli aislado de frutos de jitomate de tres estados de madurez cubiertos
con dos recubrimientos : verdes a) quitosano 1% + cera de abeja 0.1% b) quitosano 1% + cera de
abeja 0.1% + aceite esencial de limón 01% c) Agua; Naranjas d) quitosano 1% + cera de abeja
0.1% e) quitosano 1% + cera de abeja 0.1% + aceite esencial de limón 0.1% f) Agua; Rojos g)
quitosano 1% + cera de abeja 0.1% h) quitosano 1% + cera de abeja 0.1% + aceite esencial de
limón 0.1% i) Agua. ............................................................................................................... 90
Figura 19. Lavado en hipoclorito de sodio, b) inmersión en las cubiertas, c) secado, d)
almacenamiento. ...................................................................................................................109
Figura 20. Evaluación de firmeza en frutos de jitomate en el texturometro ...............................109
Figura 21. Formación de las películas sobre la placa ................................................................141
Figura 22. Cámara de acondicionamiento ................................................................................141
Figura 23. Diagrama de flujo de la determinación de permeabilidad total de vapor de agua. .......143
9
RESUMEN
La aplicación de cubiertas comestibles es una tecnología que permite extender la vida útil
de frutas y vegetales frescos debido a que reduce sus procesos metabólicos, y la posibilidad
de ataque de microorganismos. Las cubiertas a base de quitosano y otros agentes
antimicrobianos han dado buenos resultados cuando se han aplicado en frutos. Se
evaluaron cubiertas a base de quitosano + ácido oleico/cera de abeja + aceite esencial de
limón sobre frutos de jitomate, con la finalidad de controlar los patógenos Rhizopus
stolonifer y Escherichia coli y que además la cubierta prolongue la vida de anaquel del
fruto sin modificar sus atributos de calidad. Los experimentos se llevaron a cabo de manera
in vitro y directamente sobre los frutos de jitomate en tres estados de madurez (verde,
naranja y rojo) y fueron almacenados a temperatura controlada y temperatura ambiente (10
± 2 y 25 ± 2 ºC, respectivamente), las evaluaciones se llevaron a cabo a nivel de
laboratorio y semi-comercial. Con respecto a las evaluaciones in vitro, las cubiertas
adicionadas con aceite esencial de limón controlaron completamente el desarrollo del
hongo R. stolonifer y en las imágenes de Microscopia Electrónica de Barrido, se observó
una distorsión en el crecimiento del micelio. Sin embargo, en los frutos de jitomate solo la
cubierta de quitosano + ácido oleico + aceite esencial de limón disminuyó el porcentaje de
infección del hongo en los frutos que se almacenaron a temperatura ambiente. Las
cubiertas adicionadas con cera de abeja controlaron satisfactoriamente e l desarrollo de E.
coli de manera in vitro e in situ, en las imágenes de MEB no se observó crecimiento de la
bacteria. La cubierta de quitosano + ácido oleico + aceite esencial de limón disminuyó la
pérdida de peso en frutos de jitomate al término del almacenamiento. Los frutos rojos de
jitomate cubiertos o no, mostraron valores mayores de CO2 y etileno comparado con los
verdes, así como los frutos almacenados a 25 ºC al final del almacenamiento tuvieron
mayor contenido de CO2 que los almacenados a temperatura controlada. Se determinaron
las propiedades mecánicas y de permeabilidad de vapor de agua en cubiertas a base de
quitosano + ácido oleico/cera de abeja + aceite esencial de limón. El ácido oleico y la cera
de abeja son compuestos lipídicos que no solo mejoran las propiedades de las películas, si
no que además, presentan efecto antibacterial y en el caso del ácido oleico, disminuye la
pérdida de peso de los frutos de jitomate sin modificar sus atributos de calidad.
10
ABSTRACT
The application of edible coatings or films is a technology that allows extending the shelf
life of fresh fruits and vegetables because it reduces their metabolic processes and the
possibility of attack by microorganisms. Coating based on chitosan and other antimicrobial
agents have given good results when applied to fruits. Coating based on chitosan + oleic
acid/beeswax + lime essential oil were evaluated on tomato fruits in order to control the
pathogens Rhizopus stolonifer and Escherichia coli. Additionally, the coatigs also prolong
the shelf life of fruit without changing their quality attributes. The experiments were
carried out in vitro and directly on tomato fruits at three stages of maturity (green, orange
and red) and were stored at a controlled temperature and room temperature (10 ± 2 y 25 ±
2 0C, respectively). Evaluations were conducted at the laboratory and semi-commercial
level. With respect to the in vitro assessments, coatings with lime essential oil added
completely controlled development of the fungus R. stolonifer and Scanning Electron
Microscopy (SEM) images showed distortion in mycelial growth. However, in the tomato
fruits only the chitosan + oleic acid + lime essential oil cover decreased the fungal
infection percentage in fruits stored at room temperature. Coatings with beeswax added
successfully controlled the development of E. coli in vitro and in situ as the SEM images
showed no bacterial growth. The chitosan + oleic acid + lime essential oil cover decreased
weight loss in tomato fruits at the end of storage. The red tomato fruits (covered or not)
showed higher CO2 and ethylene values compared with the green ones, and fruits stored at
25 0C at the end of storage had higher Co2 content than those stored at the controlled
temperature. Mechanical properties and water vapor permeability in coatings based on
chitosan + oleic acid/beeswax + lime essential oil were determined. Oleic acid and
beeswax are lipid compounds which not only improve the properties of the films, but also
exhibit an antibacterial effect. In the case of oleic acid, it reduces the weight loss of tomato
fruits without changing their quality attributes.
11
Capítulo I
Recubrimientos comestibles adicionados
de compuestos antimicrobianos para
proteger frutos de jitomate.
12
Recubrimientos comestibles adicionados de compuestos antimicrobianos
para proteger frutos de jitomate.
Resumen
En general los frutos de jitomate son altamente perecederos y susceptibles a daños durante
su almacenamiento y empacado, esto favorece la incidencia de enfermedades las cuales
limitan notablemente la calidad del producto. Se ha utilizado un gran número de
productos químicos para contrarrestar estos problemas, sin embargo, esto ha traído consigo
efectos nocivos a la salud humana y al ambiente e incluso resistencia de los
microorganismos. Una alternativa viable para estos problemas, es utilizar productos de
origen biológico con efecto antimicrobiano que sean amigables con el ambiente, tal es el
caso de los recubrimientos comestibles. Los recubrimientos son matrices co ntinuas
formuladas a base de lípidos, proteínas o carbohidratos o mezclas de estos componentes,
que les confieren diferentes propiedades fisicoquímicas. Un carbohidrato utilizado para la
formulación de los recubrimientos comestibles es el quitosano, el cua l reduce el
crecimiento de hongos y bacterias. Los recubrimientos pueden servir como vehículos para
un amplia gama de aditivos, incluyendo compuestos antimicrobianos, con la finalidad de
proporcionarles mayores atributos como es el control de microorganismos. Entre los
aditivos naturales están los aceites esenciales. Se tiene amplia evidencia de que los aceites
esenciales extraídos de diferentes plantas presentan inhibición contra hongos y bacterias.
La cera de abeja y ácido oleico, son productos con efecto antimicrobial que generalmente
se adicionan a los recubrimientos para proporcionarles a estos mejor elasticidad, sin
embargo, son pocos los estudios que reportan sus funciones antimicrobiales en frutos. Al
formular recubrimientos comestibles con quitosano y adicionar a las formulaciones
productos como los aceites esenciales, cera de abeja y ácido oleico, se evita el desarrollo
de microorganismos, se prolonga la vida de anaquel del producto, y mantiene sus
propiedades sensoriales.
13
1. Introducción
Para prolongar la vida postcosecha de los productos hortofrutícolas se han implementado
diferentes tecnologías, entre ellas el almacenamiento a temperaturas bajas, la utilización de
empaques plásticos para crear atmósferas modificadas, la aplicación de tratamientos
hidrotérmicos, irradiación y formulaciones que contienen agentes biológicos, entre otras
(Quezada et al., 2003). Todas ellas a su vez ejercen cierto control en la incidencia de
microorganismos patógenos. Se ha reportado que durante el manejo postcosecha de los
productos vegetales se pueden estimar pérdidas hasta del 40% del total cosechado, estas
pérdidas varían entre productos, áreas de producción y época del año (Aular, 2006). De las
principales razones que generan estas pérdidas está la incidencia de enfermedades causadas
principalmente por hongos de diversos géneros. Por otro lado, los productos contaminados
por bacterias patógenas, pueden causar enfermedades graves a los humanos ocasionando
hasta la muerte si no son tratados a tiempo. Generalmente, en el caso de los hongos, éstos
no aparecen durante el crecimiento de las plantas, es más, algunos permanecen en estado
latente hasta la maduración del producto hortícola y otros se adquieren durante la cosecha,
el transporte y/o el manejo del producto (Ogden et al., 2005; Beverlya et al., 2008). En
relación a la incidencia de bacterias, son muy factibles de contaminar el producto durante
la etapa precosecha principalmente por aguas contaminadas, o bien durante la
manipulación de los productos hortícolas.
El jitomate es una de las especies hortícolas de gran importancia tanto económica como
social en nuestro país por ser un generador importante de empleos y divisas, además de ser
considerado como el segundo producto hortícola más consumido a nivel mundial. México
es el principal exportador de jitomate, comercializando 1, 136, 300 toneladas de las cuales
el mayor volumen se destina a Estados Unidos (FAOSTAT, 2009). Sin embargo, el
jitomate muchas veces no puede ser comercializado satisfactoriamente debido que sufre
daños que ocasionan la disminución de su calidad. Las pérdidas postcosecha del jitomate
son hasta del 50% en países industrializados, y estas pérdidas se atribuyen a una acelerada
actividad respiratoria, su sensibilidad a la deshidratación, la acción del etileno, pudriciones
causadas por microorganismos y daños mecánicos y fis iológicos (Artés, 1999). En Nueva
York, se han reportado pérdidas postcosecha de jitomate hasta de un 80% a causa del
14
ataque de Rhizopus stolonifer y Alternaria alternata (Ceponis and Butterfield, 1979). En
Morelos R. stolonifer durante la etapa de postcosecha ha sido el más predominante hasta
con un 50% de infección (datos no publicados). El deterioro de los frutos durante el
almacenamiento ocasiona una de las mayores pérdidas económicas en el sector agrícola, ya
que el tiempo que tarda el fruto almacenado desde su cosecha hasta el consumidor puede
ser de varias semanas (Liu et al., 2007; Musse et al., 2009).
Una alternativa con potencial viable para la conservación de frutas y vegetales frescos es la
utilización de recubrimientos comestibles multicomponentes, los cuales pueden elaborarse
con ingredientes básicos adecuados al producto para brindarle la protección de barrera
deseada y además, conferir la propiedad de “activo” incorporando aditivos específicos
(antioxidantes, colorantes, antimicrobianos, etc.) para reforzar su funcionalidad, que en el
caso que se expone seria el de evitar el crecimiento de microorganismos patógenos en la
superficie de los productos vegetales (Nussinovitch y Lurie, 1995; Cagri et al., 2004;
Martin-Belloso et al., 2005).
2. Propiedades específicas de los recubrimientos a base de lípidos,
proteínas y polisacáridos aplicados en frutas y hortalizas.
La película o cubierta comestible consiste en una capa delgada que se pre-forma o forma
directamente sobre la superficie de los productos vegetales como una envoltura protectora
(Del-Valle et al., 2005; Bravin et al., 2006). Se elaboran a partir de una gran variedad de
proteínas, polisacáridos y lípidos ya sea como componentes únicos o combinados, con la
finalidad de mejorar sus propiedades de barrera y mecánicas (Kester y Fennema, 1986). El
mecanismo por el cual los recubrimientos conservan la calidad de frutas y vegetales es
debido a que crean una barrera física a los gases, produciendo una atmósfera modificada
alrededor ya que reducen la disponibilidad de O2 e incrementan la concentración de CO2
(Avena-Bustillos et al., 1997; González-Aguilar et al., 2005).
15
2.1 Recubrimientos a base de lípidos.
Los recubrimientos a base de lípidos son muy eficientes para reducir la deshidratación de
los productos, debido a su baja polaridad presentan una escasa permeabilidad al vapor de
agua (Kester y Fennema, 1986). La pérdida de humedad en frutas y vegetales fr escos
disminuye la firmeza y el peso de los productos afectando su calidad y como consecuencia
ocurren pérdidas económicas durante su comercialización (Avena-Bustillos et al., 1994).
Estos recubrimientos presentan algunas limitaciones tales como, propiedades mecánicas
pobres y en ocasiones mala apariencia (García et al., 2000); es por eso que los lípidos son
mezclados con otras sustancias como polisacáridos, ya que estas combinaciones
proporcionan al recubrimiento mayor estabilidad (Koelsch, 1994; Martín-Belloso et al.,
2005).
García et al. (2000), reportaron que al mezclar aceite de girasol (Helianthus annus L.) y
almidón de maíz (Zea mays L.) con glicerol y sorbitol como plastificante, obtuvieron un
recubrimiento, con buenas propiedades mecánicas para adherirse a la zanahoria (Daucus
carota L.) y redujeron la pérdida de vapor de agua tres veces mas por encima del control.
Por su parte, McHugh y Senesi (2000), realizaron una mezcla de puré de manzana (Pyrus
Malus L.) con lípidos (ácidos grasos, alcoholes grasos, ceras y aceite vegetal), con glicerol
como plastificante, para elaborar un recubrimiento y aplicarlo en trozos de manzana. Como
los recubrimientos a base de puré de manzana demostraron tener excelentes propiedades de
barrera al O2, pero deficientes propiedades de barrera a la humedad, la adición de lípidos
garantizó mejores propiedades de barrera al agua (McHugh et al., 1996). El resultado que
obtuvieron fue una buena adherencia del recubrimiento, reducción en la oxidación de los
trozos de manzana y poca pérdida de humedad, de igual forma se mantuvo el sabor y el
aroma del fruto, concluyendo que a medida que se incrementó la concentración de lípidos
se redujo la pérdida de humedad.
Pérez-Gago et al. (2003), desarrollaron un recubrimiento mezclando hidroxipropil
metilcelulosa con glicerol y ácido esteárico para aplicarlo en frutos de mandarina (Citrus
16
reticulata B.). La pérdida de humedad de las mandarinas cubiertas y almacenadas a 20 °C,
disminuyó significativamente a medida que la cantidad de lípidos aumentó. Los resultados
mostraron que el recubrimiento con mayor cantidad de lípidos (60 %) disminuyó hasta en
47 % la pérdida de humedad en comparación con el control. Sin embargo, estos resultados
también sugirieron utilizar bajas temperaturas de almacenamiento junto con la aplicación
del recubrimiento para extender la vida de anaquel de la mandarina. Actualmente la
mayoría de los recubrimiento son adicionados con glicerol (Rojas Graü et al., 2007;
Raybaudi-Massilia et al., 2008), utilizándolo como plastificante.
2.2 Recubrimientos a base de proteínas.
Los recubrimientos hechos a base de proteínas presentan mejores propiedades de barrera a
los gases, sin embargo, la resistencia que presenta al vapor de agua es menor debido a su
naturaleza hidrofílica (Pérez-Gago y Krochta, 2002). Gontard et al. (1996), elaboraron
películas a base de gluten, acido acético y glicerol consiguiendo una permeabilidad baja al
CO2 y O2 en comparación con el control, por lo que recomiendan su uso para frutas y
vegetales. Tanada-Palmu y Grosso (2005), formularon un recubrimiento a base de gluten,
etanol, hidróxido de amonio, y glicerol y lo aplicaron en fresa (Fragaria vesca L.).
Además de lo mencionado anteriormente este recubrimiento logró mantener el sabor de las
fresas por más tiempo (5 d.) en comparación con el control, sin embargo, sus propiedades
de barrera al agua no fueron buenas. A esta misma formulación se le adicionó cera de
abeja, acido esteárico y acido palmítico, reduciendo la pérdida de peso en las fresas hasta
en 50% en comparación con el recubrimiento sin lípidos. Peréz-Gago et al. (2005),
elaboraron un recubrimiento con proteína de suero de leche, hidroxipropil metilcelulosa,
cera de abeja y carnauba, para cubrir trozos de fresa, logrando una reducción en el
oscurecimiento enzimático. Los autores atribuyen este efecto a la alta propiedad de barrera
al oxígeno que presentan las proteínas. Estos mismos autores elaboraron otro
recubrimiento con proteína de suero de leche, cera de abeja y acido ascórbico o cisteína,
obteniendo la misma reducción en el oscurecimiento enzimático en trozos de manzana
(Pérez-Gago et al. 2006). Monedero et al. (2009), elaboraron películas a base de proteína
17
de soya (Glycine max M.), acido oleico y glicerol, para en un futuro hacer las pruebas en
frutos, obteniendo una permeabilidad selectiva al O2. Además, adicionaron lípidos y
lograron disminuir la pérdida de agua hasta en 50% en comparación con las películas no
adicionadas.
2.3 Recubrimientos a base de polisacáridos.
Los recubrimientos hechos a base de polisacáridos han sido los más ut ilizados para
recubrir frutos esto, es debido a sus propiedades mecánicas de adherencia y flexibilidad en
la superficie de los productos hortofrutícolas. Meza (2006), formuló un recubrimiento
utilizando tres diferentes polisacáridos; almidón de maíz, goma guar y pectina de bajo
metoxilo. Al incrementar la concentración de almidón de maíz, se mejoró la adherencia y
la flexibilidad del recubrimiento en la superficie de frutos como pera (Pyrus communis L.),
limón (Citrus limon L.) y aguacate (Persea americana M.). Sin embargo, las
concentraciones de almidón de maíz del 2% o mayores ocasionaron frutos aparentemente
deshidratados y opacos, además de ser recubrimientos quebradizos y fibrosos.
La goma guar y la pectina de bajo metoxilo (menor cantidad de grupos metil ester),
mostraron buena viscosidad y adherencia aun en concentraciones altas. Varios autores
atribuyen otros efectos a los recubrimientos a base de polisacáridos, por ejemplo, Viña et
al. (2007), recubrieron coles de Bruselas (Brassica oleracea L.) con una mezcla de
almidón de maíz, hidróxido de sodio y glicerol, conservando algunos atributos de calidad
del producto, tales como, firmeza y color. Además, la pérdida de peso fue menor en
comparación con el control. Ribeiro et al. (2007), realizaron una mezcla de almidón, ácido
cítrico y sorbitol para cubrir frutos de fresa y retardar su senescencia, los recubrimientos a
base de polisacáridos mostraron mejores propiedades de barrera a los gases que el control.
Oms-Oliu et al. (2008), formularon un recubrimiento a base de alginato, pectina y goma de
gelana, obteniendo un incremento en la resistencia de pérdida de agua y reducción en la
producción de etileno en peras cortadas.
18
En frutos de mango, Sothornvit y Rodsamran (2008), probaron una película elaborada con
pulpa de mango del cual analizaron sus propiedades de barrera y mecánicas. Los mangos
cubiertos totalmente con el recubrimiento redujeron la pérdida de peso en 5 y 10% a
temperaturas de almacenamiento de 30 y 5 º C respectivamente. Dicha película mostró
altos valores de permeabilidad al vapor de agua y un valor intermedio de permeabilidad al
oxígeno, adicionalmente, los frutos cubiertos con esta película mostraron una mejor textura
que los no cubiertos; respecto a sus propiedades mecánicas ellos reportaron que la película
de este material tuvo una mayor elongación e índice de elasticidad en comparación con
otras hechas de almidón de frutas y plastificadas con glicerol.
3. El quitosano como recubrimiento filmogénico con actividad
antimicrobiana
El quitosano es un polisacárido que se obtiene del exoesqueleto de crustáceos mediante la
desacetilación parcial de la quitina (Freepons, 1991). Su actividad fungicida ha sido
reportada en varios estudios, mostrando inhibición en el crecimiento de los hongos
causantes de enfermedades postcosecha (Cuadro 1), pudiéndose manifestar esta inhibición
en el crecimiento micelial y esporulación o en ambos estados de desarrollo.
Se ha mencionado que el efecto fungicida del quitosano esta en función de la
concentración utilizada, el peso molecular y grado de desacetilación del mismo. El
quitosano se adhiere a la membrana plasmática de los hongos gracias a las interacciones
electrostáticas entre las cargas positivas del quitosano y a las cargas negativas de los
fosfolípidos formadores de membrana (El Ghaout et al., 1992a), una vez adherido a la
membrana, causa una filtración a través de ella hasta llegar al citosol; el quitosano utiliza
energía para atravesar la membrana, sin embargo este proceso no involucra al proceso de
endocitosis.
Los hongos normalmente mantienen en su citosol niveles muy bajos de Ca2+, esto es
gracias a la barrera que forma la membrana plasmática, la cual posee reguladores
19
herméticos que impiden el paso libre de gradientes de Ca2+, en este proceso también se
involucra al mecanismo homeostático, donde dentro del citosol se regula la concentración
de Ca2+, enviando fuera de la célula al exceso de Ca2+, o los almacena en organelos de la
propia célula. Por lo tanto al introducirse el quitosano al interior del citosol se transforma
drásticamente el mecanismo homeostático, ya que al formar canales en la membrana
permite el paso libre de gradientes de calcio, ocasionando una inestabilidad en la célula e
incluso hasta su muerte. Sin embargo no todos los hongos presentan la misma
sensibilidad al quitosano y esto puede ser debido a la composición de fosfolípidos de
membrana y particularmente a la naturaleza de sus cargas (cargas neutras). Por mencionar
a los hongos resistentes al quitosano están los entomopatogenos y nematofagos, sin
embargo estos hongos no ocasionan daños en cultivos agrícolas (Palma-Guerrero et al.,
2008, 2009, 2010). Al igual que en los hongos, el efecto bactericida del quitosano ha sido
reportado en diferentes estudios (Cuadro 2).
20
Cuadro 1. Efecto de diferentes concentraciones de quitosano en el control de varios
hongos postcosecha importantes en la producción hortofrutícola.
Patógeno Concentración
de quitosano
Resultados Referencias
Alternaria alternata
2 y 2.5 %
6.0 mg mL-1
Inhibición micelial Sánchez-Domínguez et al.,2007
El Ghaouth et al., 1992c
2%
0.2%
2.5 y 3%
1.5%
6.0 mg mL-1
Inhibición micelial
Baja esporulación
Inhibición micelial
Hernández-Lauzardo et al.,
2008
Hernández, 2002
Bautista-Baños et al., 2004
El Ghaouth et al., 1992a
Colletotrichum
gloeosporioides
2.5 y 3 %
3%
6.0 mg mL-1
Inhibición micelial y
esporulación
Control del crecimiento
micelial
Bautista-Baños et al., 2003
El Ghaouth et al., 1992a
Fusarium
oxisporium
1.5, 2.5 y 3%
1.5%
Inhibición micelial
Baja esporulacuón
Bautista-Baños et al., 2004
El Ghaouth et al., 1992b
Botrytis cinerea 50 mg L-1
60 mg mL-1
Inhibición del micelio Ben-Shalom et al., 2003
El Ghaouth et al., 1992c
Penicillium
digitatum
2.5 y 3 %
1.5 %
Inhibición micelial El Ghaout et al., 1992a
Bautista-Baños et al., 2004
21
Cuadro 2. Efecto del quitosano como inhibidor de colonias de bacterias patógenas en
humanos.
Patógeno
Concentración
de quitosano Resultados Referencias
Escherichia coli
100 mg L-1 Inhibición de la colonia Nan et al., 2006
10 mg L-1 “ Lim y Hudson, 2004
0,25 µg mL-1 “ Qi et al., 2004
0.0075 %
“ Simpson et al., 1997
Listeria monocytogenes
1 % “ Beverlya et al., 2008
1 % “ Ponce et al., 2008
1% “ Belalia et al., 2008
2 %
“ Ye et al., 2008
Salmonella
typhimurium 1 % “ Belalia et al., 2008
Salmonella enterica 1 % “ Su et al., 2007
3.1 Aplicación del quitosano como recubrimiento.
El quitosano es un compuesto que presenta características biofuncionales, por lo que
podría ser una alternativa viable para sustituir los métodos de control de microorganismos
tradicionales además, puede utilizarse sin problemas para elaborar recubrimientos
comestibles (González-Aguilar et al., 2005). Los recubrimientos con quitosano forman una
cubierta en la superficie de los frutos, el cual actúa como una barrera mecánica para
proteger al fruto de infecciones causadas por hongos, ayudando así a disminuir las
enfermedades causadas durante el almacenamiento por Rizophus stolonifer (Ehrenb:Fr),
Botrytis cinerea Pers:Fr, y Alternaria alternata (Fr.:Fr.) Keissl entre otras (Hernández,
22
2002; El Gaouth et al., 1992c; Meng et al., 2008; Sánchez, 2008). A la fecha, se han
desarrollados diferentes recubrimientos comestibles con quitosano, los cuales han
proporcionado al producto características importantes.
El Gaouth et al. (1992b), elaboraron cubiertas con quitosano a 15mg mL-1 e inhibieron el
crecimiento de B. cinerea y R. stolonifer en fresa, los signos de infección de estos hongos
aparecieron 5 días después de ser almacenados a 13 ºC, mientras que en el control estos
síntomas fueron visibles al primer día. Al final del almacenamiento se redujo hasta en un
60% más la infección en fresas tratadas con quitosano. Por su parte Romanazzi et al.
(2002), reportaron una actividad fungicida significativa del quitosano cuando se aplicó
como recubrimiento en frutos de uva (Vitis vinifera L.) y fresa contra B. cinerea. Jiang et
al. (2005), reportaron que las cubiertas de quitosano a una concentración de 2%, lograron
inhibir la aparición de microorganismos en frutos de litchi (Litchi chinensis Sonn.) al final
de la evaluación (12 h de incubación), sin embargo, al aumentar la concentración de
quitosano no aumentaron significativamente los efectos benéficos del quitosano en el
control de microorganismos. Chien et al. (2007), mostraron que al aplicar quitosano al 2 %
como recubrimiento para frutos de mango al término del almacenamiento no hubo
presencia de ningún microorganismo patógeno. Aunque en la investigación realizada por
Robson et al. (2008), no se señala el género y la especie de los patógenos controlados, se
observó que la aplicación de cubiertas de agar con quitosano y acido acético, en ajos
(Allium sativum L.), hubo 20 % menos infección que en los no tratados.
4. Incorporación de aditivos en los recubrimientos
Los recubrimiento se pueden utilizar como vehículos de otros ingredientes los cuales
pueden proporcionar al producto vegetal funciones más especificas como una actividad
antimicrobiana, La adición de agentes antimicrobianos en los recubrimientos comestibles
evita o reduce el crecimiento de microorganismos en su superficie (Rodríguez et al., 2005).
Sin embargo, se ha observado que se requiere de aplicaciones pequeñas para que sus
atributos de calidad no se vean afectados (Min y Krochta, 2005). Dentro de los agentes
23
antimicrobianos incorporados a los recubrimientos vegetales pueden considerarse a los
aceites esenciales (Asis y Pessoa, 2004; Rodríguez et al., 2005; Rojas, 2006).
4.1 Aceites esenciales
Los aceites esenciales se encuentran en abundancia en el reino vegetal y se pueden
localizar en diferentes partes de la planta por ejemplo: en hojas como albahaca (Ocimun
basilicum L.), mejorana (Origanum majorana L.), menta (Mentha rotundifolia L.), romero
(Rosmarinus officinalis L.), salvia (Salvia officinalis L.), en raíces de cálamo (Acorus
calamos L.), valeriana (Valeriana officinalis L.), en la corteza de canela (Cinnamomum
zeylanicum Nees.), cedro (Cedrela odorata L.), sándalo (Santalum album Linn.), en flores
como el jazmín (Jasminum officinale L.) y en la rosa (Rosa sp.). En cáscara de algunas
frutas como el limón, mandarina, naranja (Citrus sinensis L.) y en frutos de anís
(Pimpinella anisum L.), cardamomo (Elettaria cardamomum L.), eneldo (Anethum
graveolens L.) e hinojo (Foeniculum vulgare Miller.) (Ronquillo, 2007).
Los aceites esenciales son una mezcla de componentes volátiles, producto del metabolismo
secundario de las plantas. Las esencias son mezclas complejas en cuya composición se
encuentran los hidrocarburos como terpenos, alcoholes, ésteres, aldehídos y compuestos
fenólicos, los cuales son los responsables del aroma que caracteriza a los aceites esenciales
(Templeton, 1969). La actividad antifúngica de los aceites esenciales se asocia al contenido
de fenoles monoterpenos especialmente en tomillo (Thymus vulgari L.), orégano
(Origanum vulgare L.) y clavo (Eugenia caryophyllata Thunb). Su mecanismo de acción
se asocia con la capacidad de interactuar con la membrana del patógeno y su modo de
acción parece estar estrechamente relacionado con la solubilidad de cada compuesto
(Ronquillo, 2007).
24
4.1.1 Aceites esenciales y su actividad fungicida en hongos postcosecha .
Los aceites esenciales han mostrado una actividad fungicida contra patógenos postcosecha
en un gran número de hongos (Daferera et al., 2000). Actualmente, se han reportado varias
investigaciones en donde se demuestra la actividad fungicida de los aceites esenciales
(Cuadro3).
Cuadro 3. Aceites esenciales con efecto fungicida contra algunas especies de hongos
postcosecha importantes en la producción hortofrutícola.
Patógeno Aceite Concentración Resultados Referencia
Alternaria citri Thymus vulgaris L.
250 mg L-1 Inhibición micelial
Arras y Usai, 2001
Botrytis cinerea Cymbopogon
Martini Rox.
Syzygium
aromaticum L.
T. Vulgaris L.;
C. sinensis L.
7800 mg L-1
Inhibición de la
germinación
Wilson, 1997
Penicillium digitatum
Poncirus trifoliata L.
250, 275, 246 mg L-1
Inhibición micelial
Arras y Usai, 2001; Caccioni et al., 1998
P. italicum
P. citrinum Anethum graveolens L.
6 mg L-1
Aspergillus flavus
Citrus aurantifolia
Christm.
Mentha viridis L.
300 mg mL-1 Inhibición micelial
Mishra y Dubey, 1994
Penicillium chrysogenum
Rosmarinus oficinales L.
300 mg mL-1 Retarda el crecimiento
Yang y Clausen, 2007
25
Colletotrichum gloeosporioides
Cinnamomum zeylanicum
Zyzygium aromaticum
50-250 mg mL-1 Inhibición del crecimiento micelial y
germinación de esporas
Barrera et al., 2008
4.1.2 Aceites esenciales y su actividad en bacterias que afectan la
salud humana.
La actividad bactericida de los aceites esenciales ha sido reportada por varios autores
(Cuadro. 4). Esta actividad podría estar relacionada a la respectiva composición de aceites
volátiles de cada planta, a la configuración estructural de los componentes constituyentes
de los aceites, a sus grupos funcionales y a posibles interacciones sinérgicas entre sus
componentes (Dorman y Deans, 2000). La hidrofobicidad de los aceites esenciales les
permite incorporarse a los lípidos de la membrana bacteriana, ocasionando trastornos en su
estructura y permeabilidad, dando lugar a la fuga de iones y otros compuestos (Bosquez-
Molina et al., 2009).
26
Cuadro 4. Efecto de aceites esenciales contra bacterias patógenas de humanos.
Patógeno Aceite Concentración Resultados Referencia
Listeria
monocytogenes
Syzygium aromaticum L.
10000 mg L¯¹
Inhibición
del crecimiento
Mytle et al., 2008
Redujo el desarrollo
Smith-Palmer et al., 2001
Thymus vulgaris L.
Cinnamomun zeylanicum Blume.
1000 mg L¯¹ Inactivó a la bacteria
Yuste y Fung, 2002
Escherichia coli
Coriandrum sativum L. 8 mg L¯¹ Inhibió el crecimiento
Lo Cantore et al., 2004
Camellia sinensis L.
20000 mg L¯¹
Inhibición del
crecimiento
Hammer et al.,
1999
Origanum vulgare L.
Aniba rosaeodora Ducke.
Coriandrum sativum L.
Cymbopogon martini Rox.
Mentha viridis L.
Mentha spicata L.
Salvia officinalis L. Origanum majorana L.
Thymus vulgaris L. 300 mg L¯¹
Salmonella sp Citrus cinensis L. 1250 mg L¯¹
Inhibición en su
crecimiento
O' Bryan et al.,
2008
S. enteritidis
Syzygium aromaticum L.
750 mg L¯¹
Detuvo el desarrollo
Smith-Palmer et al., 1998
Cinnamomun zeylanicum
Blume.
Thymus vulgaris L.
27
4.1.3 Aplicación de aceites esenciales en recubrimientos comestibles .
En la actualidad, varios autores han utilizado los aceites esenciales como aditivos en las
formulaciones de sus recubrimientos. La incorporación de agentes antimicrobiales como es
el caso de los aceites esenciales (anís, cardamo y tomillo) en películas, cubiertas o
empaques, se ha probado en varios productos alimenticios como carne y productos de
panadería, inhibiendo el desarrollo de hongos, bacterias y levaduras (Cagri et al., 2004).
Plotto et al. (2003), adicionaron aceite de tomillo (10000 mg L-1) al recubrimiento,
obteniendo en frutos de tomate una significativa inhibición en el crecimiento de B. cinerea.
En otras investigaciones, concentraciones por arriba de 0.06% de aceite de tomillo
redujeron el desarrollo de R. stolonifer en frutos de papaya, reportándose que a medida que
aumentaban la concentración disminuía la severidad de la infección del hongo. En el caso
de bacterias, el uso de aceites esenciales también ha sido benéfico para el control de estos
microorganismos. Rojas-Grau et al. (2007), reportaron que el recubrimiento a base de puré
de manzana alginato, glicerol y aceite esencial de orégano en trozos de mango, disminuyó
el desarrollo de Listeria innocua, hasta un 50% más que en los no tratados. Raybaudi-
Massilia et al. (2008), al incorporar recubrimientos a base de alginato, glicerol, acido
málico y aceites esenciales de canela y limón, en trozos de melón, inhibieron el
crecimiento de Salmonella enterica, además de conservar el producto fresco con buenos
parámetros de calidad.
S. pollorum Piper nigrum L. 18 mg L¯¹
Inhibición de
su crecimiento
Dorman y Deans, 2000
28
5. Aplicación de la combinación quitosano + aceites esenciales, y su efecto
en el control de microorganismos.
En estudios realizados por Ponce et al. (2008), se demostró el efecto inhibitorio de
cubiertas comestibles con quitosano y romero (Rosmarinus officinalis L.) al 1%, sobre el
crecimiento de L. monocytogenes en la superficie de calabazas (Cucurbita moschata
Dutch). Asimismo, este recubrimiento logró inhibir el halo de crecimiento de esta bacteria
5 mm más que el resto de otras cubiertas probadas (quitosano y olivo (Olea europea L) y
quitosano y chile (Capsicum annum L.)). Otra combinación que demostró buenos
resultados fue la reportada por Pranoto et al. (2005), estos autores realizaron un
recubrimiento a base de quitosano y aceite de ajo, los resultados se mostraron favorables
debido a que este recubrimiento controló el crecimiento de los microorganismos
Staphylococcus aureus, L. monocytogenes y Bacillus cereus. Por otro lado, Alvarado et al.
(2011), Inhibieron el desarrollo de R. stolonifer en su totalidad al adicionar quitosano (10
mg mL-1) y aceite esencial de canela, clavo, o tomillo a una concentración de 0.3 mg mL-1.
6. Cera de abeja y ácido oleico compuestos con propiedades funcionales
La cera de abeja es una materia sólida a temperatura ambiente segregada por las glándulas
cereras de las abejas en estado líquido, la cual en contacto con el a ire forma escamas que el
insecto recoge con sus patas y la lleva a su boca para masticarla antes de usarla en la
construcción del panal. Está compuesta principalmente por hidroxicarbonos, alcoholes,
ésteres, ácidos grasos y compuestos no identificados (Tulloch, 1970). Es utilizada
principalmente en la industria cosmética y farmacéutica para la elaboración de cremas que
brindan ayuda para controlar bacterias que afectan la piel. Recientes investigaciones in
vitro han demostrado el efecto biocida in vitro de la cera de abeja sobre bacterias
patógenas para el humano como lo es Staphylococcus aureus, inhibiendo notablemente su
crecimiento (Al-Waili, 2005). En general los derivados de las abejas como la miel, el
propoleo, la jalea real y la cera presentan actividad antimicrobial y este efecto se atribuye a
la cantidad de flavonoides y compuestos fenólicos que los componen (Wahdan, 1998). A
diferencia de la cera de abeja el efecto antimicrobial de la miel esta bien documentado
29
sobre bacterias como Staphylococus aureus, Salmonella enteritidis, Listeria monicytogenes
y E. coli (Estrada et al., 2005).
El ácido oléico es un ácido graso monoinsaturado de la serie omega 9 típico de los aceites
vegetales y se encuentra presente en diversos alimentos como el aceite de o liva y el
aguacate, cuyo beneficio radica en favorecer la circulación sanguínea, por lo tanto el riesgo
de sufrir enfermedades vasculares disminuye. El aceite de oliva comprende hasta un 80%
de ácido oléico. Se ha evaluado el efecto antimicrobial del aceite de oliva en diversas
enfermedades en humanos. El aceite de oliva virgen es capaz de destruir bacterias como
Helicobacter pylori, la bacteria responsable de la mayoría de las úlceras de estomago
(Romero et al, 2007), de muchas gastritis crónicas, e incluso cáncer de estomago. De igual
manera inhibe el desarrollo in vitro de Staphylococcus aureus y Candida albicans a una
concentración del 33% v/v en medio de cultivo con agar (Al-Waili, 2005). Vargas et al.
(2006), realizaron un experimento donde demostraron con un recubrimiento a base de
quitosano y ácido oleico, la reducción de la incidencia de microorganismos hasta en un
80% al término de la evaluación en frutos de fresa en comparación con los frutos no
tratados.
7. Conclusión
Las cubiertas comestibles son una tecnología que permite extender la vida útil de los
productos hortofrutícolas retrasando sus procesos metabólicos, evitando su rápida
transpiración y manteniendo sus propiedades sensoriales. Además pueden ser mezclados
con compuestos antimicrobianos y así inhibir el crecimiento de patógenos.
8. Referencias bibliográficas
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43
Capítulo II
Evaluación de la actividad antifungica de
recubrimientos comestibles en Rhizopus
stolonifer en frutos de jitomate
44
Evaluación de la actividad antifungica de recubrimientos comestibles en
Rhizopus stolonifer en frutos de jitomate
Resumen
Los frutos de jitomate son altamente perecederos y susceptibles a sufrir daños mecánicos
durante su manejo postcosecha y su almacenamiento. Estas condiciones favorecen la
aparición de hongos fitopatógenos causantes de pudriciones en los frutos como R.
stolonifer, estas pudriciones limitan la conservación del fruto y su vida de anaquel y
calidad disminuyen. Para contrarrestar a este patógeno, se han utilizado diversos fungicidas
sintéticos, sin embargo, el uso indiscriminado de estos productos ocasiona efectos
perjudiciales en la salud humana así como resistencia de la enfermedad. El uso de cubiertas
en vegetales, es una tecnología que permite extender su vida útil al reducir los procesos
metabólicos. Un carbohidrato utilizado para la formulación de los recubrimientos
comestibles es el quitosano, el cual reduce el crecimiento de hongos en productos
hortofrutícola. Las cubiertas sirven también como vehículos para aditivos, incluyendo
compuestos antimicrobianos. Entre los aditivos naturales que se han exper imentado están
el ácido oleico y los aceites esenciales extraídos de diferentes especies de plantas. En esta
investigación varias formulaciones a base de quitosano 1% + cera de abeja + aceite
esencial de limón/tomillo 0.1% y quitosano 1% + ácido oleico 1% + aceite esencial de
limón/ tomillo 0.01%, fueron probados in vitro y directamente en frutos de jitomate con
tres estados de madurez a nivel de laboratorio y semi-comercial para controlar a R.
stolonifer. En los experimentos in vitro las cubiertas de quitosano 1% + cera de abeja +
aceite esencial de limón 0.1% y quitosano 1% + ácido oleico 1% + aceite esencial de limón
0.01% presentaron una inhibición del crecimiento micelial en 100%, mientras que las de de
quitosano 1% + cera de abeja + aceite esencial de tomillo 0.1% y quitosano 1% + ácido
oleico 1% + aceite esencial de tomillo 0.01%, solo redujeron su esporulación (5.4x105 y
19.6x105, respectivamente) comparado con el control (50x105). En estudios a nivel de
laboratorio y semi comercial la formulaciones que controlaron mejor al hongo a
temperatura de 10 ± 2 °C fue quitosano 1% + ácido oleico 1% (13 %), mientras que a la
temperatura de 25 ± 2 °C la formulación que controló de manera más efectiva al hongo fue
quitosano 1 % + ácido oleico 1 % + aceite esencial de limón 0.1% (13 %). Las cubiertas
45
adicionadas con aceite esencial de limón, controlan completamente el desarrollo de R.
stolonifer a nivel in vitro. La utilización de cubiertas comestibles a base de quitosano 1% +
ácido oleico 1% a 10 ± 2°C y quitosano 1% + ácido oleico 1% + aceite esencial de limón
0.1% a 25 ± 2°C es una alternativa amigable con el medio ambiente para controlar el
desarrollo del hongo R. stolonifer, el cual, afecta la calidad y comercialización de los frutos
de jitomate.
1. Introducción
Las pudriciones que se presentan en el fruto de jitomate durante su almacenamiento son
causadas principalmente por Botrytis cinerea, Alternaria alternata y Rhizopus stolonifer.
Este último hongo comúnmente ocasiona enfermedades postcosecha en muchas frutas y
vegetales, su rango de crecimiento oscila entre los 10 y 33 °C, motivo por el cual se
encuentra distribuido en casi todo el planeta. Es un organismo saprófito que sobrevive en
residuos orgánicos de frutas y vegetales. La característica mas importante para identificar a
R. stolonifer son sus esporangiosporas y su micelio algodonoso aéreo (Hernández-
Lauzardo et al., 2006,). Su rápido crecimiento le permite colonizar la superficie de los
frutos en un corto periodo de tiempo. Para poder alimentarse el hongo segrega enzimas
pécticas las cuales degradan las pectinas de la pared celular causando una pudrición
blanda, la cual causa grandes pérdidas económicas. El micelio es la forma mas infectiva
del hongo al contener mayor cantidad de enzimas causantes de la maceración celular
(Velázquez-del Valle et al., 2005, 2008; Bautista-Baños et al., 2008).
El tipo de control mas común para este microorganismo es el uso de fungicidas químicos
(Dicloran, Fludioxonil, Iprodione y Tebuconazole) (Velazquez-del Valle et al., 2008;
Bautista-Baños y Bravo-Luna, 2004). El Rovral® (Iprodione) se ha aplicado en jitomate
controlando en 50% la pudrición causada por este microorganismo (Abdel-Mallek, 1995).
Sin embargo, en los últimos años los fungicidas químicos han demostrado ser un riesgo de
contaminación para el medio ambiente, además de perjudicar a los consumidores debido a
que en ocasiones las frutas y vegetales presentan residuos de estas sustancias toxicas y
sobre todo causan resistencia en las cepas del hongo.
46
Se han probado métodos alternativos naturales para controlar este patógeno como el
quitosano. Este compuesto es un polisacárido que se obtiene del exoesqueleto de
crustáceos mediante la desacetilación parcial de la quitina (Freepons, 1991), y e n varios
estudios, se ha mostrado que controla el crecimiento de hongos causantes de enfermedades
postcosecha (Bautista-Baños et al., 2003; Bautista-Baños et al., 2004; Sánchez-Domínguez
et al., 2007). García-Rincón et al. (2010), mostraron que el quitosano inhibió el desarrollo
de R. stolonifer hasta en 65%. Por otro lado Alvarado (2009), obtuvo una inhibición del
crecimiento micelial, de la esporulación y la germinación de las esporas de R. stolonifer al
aplicar quitosano a una concentración de 10 mg mL-1).
Los aceites esenciales de limón y tomillo han sido caracterizados dentro de los compuestos
antifúngicos, ya que presentan inhibición en un gran número de hongos tales como
Penicillium digitatum, B. cinérea, A. citri y R. stolonifer (Caccioni et al., 1998; Dafetera et
al., 2000; Arras y Usai, 2001; Bosquez-Molina et al., 2010). Bozquez-Molina et al. (2010),
evaluaron ambos aceites a una concentración del 0.1% obteniendo una inhibición total en
el crecimiento de R. stolonifer. El acido oleico es otro compuesto que se ha utilizado en la
industria, para controlar el desarrollo de microorganismos principalmente bacterias
patógenas (Greenway y Dyke, 1979; Tantaoui-Elaraki and Errifi, 1994; Romero et al,
2007; Al-Waili, 2005. Sin embargo son pocos los estudios que evalúan su efecto fungicida.
Vargas et al. (2006), realizaron un experimento donde demostraron la inhibición del
desarrollo de microrganismos al aplicar un recubrimiento a base de quitosano 1% y ácido
oleico (1, 2 y 4%), hasta en un 80% comparado con los frutos no tratados.
En los últimos tiempos se han introducido cubiertas comestibles a base de quitosano como
una tecnología que permite prolongar la vida postcosecha de los productos hortofrutícolas,
utilizándose para crear una atmosfera modificada directamente en el fruto, produciendo
una barrera que impide la pérdida de agua y el intercambio frecuente de gases. La cubierta
se adhiere adecuadamente al fruto para poder proporcionar todos estos beneficios. Además,
se puede adicionar a las cubiertas compuestos como el ácido oleico y los aceites esenciales
para que inhiban el desarrollo de hongos y así se prolongue la vida de anaquel de los
47
productos. Estas cubiertas de origen biológico son biodegradables y presentan un mínimo
impacto negativo en la salud humana. El objetivo de esta investigación fue evaluar el
efecto fungicida de recubrimiento a base de quitosano 1% + cera de abeja 0.1% /ácido
oleico 1% + aceite esenciales de limón 0.1% / tomillo 0.1% sobre el desarrollo de R.
stolonifer in vitro e in situ.
2. Materiales y métodos
2.1 Obtención de Rhizopus stolonifer
La cepa de R. stolonifer se obtuvo a partir de frutos de jitomate infectados provenientes del
municipio de Yautepec, Morelos. Los frutos fueron llevados al laboratorio donde se tomó
una porción de micelio del hongo con ayuda de una aguja de disección, la cual se depositó
en cajas petri con medio PDA (Papa, Dextrosa y Agar) y se purificó. Una vez que se
observaron los esporangios o esporangiosporas del hongo se mantuvo la cepa en una
incubadora a 20 ºC para su futura utilización. La identificación del hongo se hizo con el
apoyo del manual de Barnett y Hunter (1972).
Para mantener la patogenicidad se inoculó el hongo a frutos de jitomate y se colocó en
cámaras húmedas durante dos días, se aisló y de multiplicó en cajas Petri con medio PDA
por 4 días.
2.2 Obtención del jitomate
Los frutos de la var. 'Cuahutemoc' fueron donados por productores de jitomate bajo
cubierta del municipio de Yautepec, Morelos. Dichos frutos se seleccionaron
uniformemente en color, tamaño, forma y ausencia de daño por enfermedades microbianas
y se cosecharon en tres estados de madurez (veteado, naranja y rojo) Figura 1.
48
Figura 1. Frutos de jitomate en tres diferentes estados de madurez: a) veteado, b) naranja y
c) rojo.
2.3 Formulación del recubrimiento
Para los experimentos in vitro se aplicaron las formulaciones del siguiente cuadro:
Cuadro 5. Tratamientos evaluados
T1 T2 T3 T4 T5 T6 T7
Quitosano 1 % 1 % 1 % 1 % 1 % 1 % PDA*
Cera de abeja 0.1 % 0.1 % 0.1 %
Ácido oleico 1% 1% 1 %
Glicerol 0.3 % 0.3 % 0.3 % 0.3 % 0.3 % 0.3 %
Aceite esencial de limón 0.1 % 0.1 %
Aceite esencial de tomillo 0.1 % 0.1%
Ácido acético 98.5 % 98.5 % 97.6 % 97.6 % 98.6 % 97.7 %
*Medio de cultivo a base de Papa, Dextrosa y Agar.
a b c
49
En los experimentos in situ a nivel de laboratorio se utilizaron las formulaciones 1, 3, 5 y 6
antes mencionadas y para los experimentos a nivel semicomercial la 3 y 6 (se
seleccionaron los recubrimientos que mostraron un mejor efecto). Se lavaron los frutos con
agua como control.
2.4 Preparación de los recubrimientos
Se colocó el ácido acético en agitación sobre una parrilla a una temperatura de 70 °C
durante 1 min. Después se adicionó el quitosano y una vez homogenizado por completo se
incorporó el ácido oleico ó la cera de abeja, (la cual se dejó en agitación durante 10 min o
hasta que se incorporó completamente a la solución); por último, se agregó el glicerol y se
agitó por 1 min. Se utilizó un homogenizador de aspas ”Virtis” a 13,500 RPM durante 4
min (Figura 2a,b,c y d). Para el caso de los recubrimientos adicionados con aceites
esenciales se llevó a cabo el mismo procedimiento solo que después de la homogenización
se agregó el aceite esencial de limón o tomillo y se homogenizó por 1 min. Los
recubrimientos obtenidos se almacenaron a temperatura ambiente hasta por un mes.
Figura 2. Preparación de los recubrimientos comestibles. a) adición del quitosano, b)
adición del ácido oleico y glicerol, c) homogenización durante 5m., d) recubrimiento
terminado.
a b c d
50
2.5 Extracción del aceite esencial de limón y tomillo
La destilación de los aceites esenciales se realizó siguiendo la metodología de Bosquez-
Molina et al. (2010). Se obtuvieron 5 kg de la cáscara de limón mexicano y se mezcló con
agua en una proporción de un 60 y 40 %, respectivamente. Se calentó a 60 °C por 2 h,
utilizando un destilador por arrastre de vapor. Para el caso del tomillo, se desprendieron las
hojas del resto de la planta y se mezclaron con agua en una proporción de un 40 y 60%
respectivamente y se utilizaron las condiciones mencionadas anteriormente.
2.6 Aplicación de los tratamientos
2.6.1 Experimentos in vitro
En cajas petri con medio PDA se colocaron 0.5 mL del recubrimiento. El recubrimiento se
distribuyó completamente por toda la caja y se dejó secar dentro de una campana de flujo
laminar. Una vez seco el recubrimiento, se tomó una porción de micelio de R. stolonifer y
se colocó en el centro de la caja Petri sin dañar la superficie.
2.6.2 Aplicación de los recubrimientos sobre frutos de jitomate a nivel de laboratorio
y semi comercial
Una vez seleccionados los frutos se lavaron con agua corriente y se sumergieron en
hipoclorito de sodio al 3% durante 10 min, se enjuagaron con agua destilada estéril y se
dejaron secar. En esta investigación se evaluaron los recubrimientos de manera curativa
(después de inocular el fruto) y preventiva (antes de inocular el fruto). A cada fruto se le
hicieron tres heridas y posteriormente se sumergieron en las diferentes formulaciones
durante 30 s y se dejaron secar, una vez secos se les asperjó una solución de esporas de R.
stolonifer de 1 x 105esporas mL-1 (preventivo). Se realizaron tres heridas a los frutos y se
asperjó una solución de esporas de R. stolonifer de 1 x 105esporas mL-1, los frutos se
51
dejaron reposar durante dos h y posteriormente se sumergieron en las diferentes
formulaciones (curativo). Los frutos se almacenaron a temperatura ambiente (25° C) y
controlada (10° C).
2.7 Procesamiento de muestras de Microscopia Electrónica de Barrido
(MEB)
El procesamiento de las muestras se llevó a cabo en el Instituto Mexicano del Petróleo con
el apoyo del Dr. Eduardo Terres Rojas. Las muestras se analizaron siguiendo la
metodología de Perea-Flores et al. (2011), las muestras in vitro fueron montadas en talones
de aluminio con cintas adhesivas de doble cara de carbono haciéndose observaciones
directas en el Microscopio Electrónico de Barrido Ambiental (Philips) XL- 30 el cual
trabajó en un rango de presión de 2.0 – 3.3 torr utilizando un detector de electrones
secundarios gaseosos para la formación de la imagen.
2.8 Variables Evaluadas
2.8.1 Crecimiento micelial
El crecimiento micelial del hongo R. stolonifer se midió en mm con la ayuda de un Vernier
manual (Pretul) en las diferentes cubiertas evaluadas incluyendo el control. Es tas
mediciones se realizaron 48 h después de la inoculación.
2.8.2 Esporulación
Las esporas de cada caja se diluyeron en 10 mL de agua destilada esteril, se tomó una gota
de esta solución (0.035mL) y se colocó en una cámara de Neubauer para contabilizarlas.
Para determinar la concentración de esporas se sumaron todas las esporas de cada uno de
los campos de la cámara (A+B+C+D+E x 10,000). Posteriormente se realizó una regla de
tres para obtener la cantidad de esporas por mL.
52
2.8.3 Incidencia de Rhizopus stolonifer
La incidencia o porcentaje de infección se evaluó al término del almacenamiento de los
frutos de jitomate y se determinó mediante la siguiente fórmula.
INCIDENCIA = Número de frutos infectados x 100/ Número de frutos tratados
2.8.4 Índice de severidad
El índice de severidad de los frutos se determinó mediante superficie afectada:
Figura 3. Escala del índice de severidad de Rhizopus stolonifer en los frutos de
jitomate: 1) 0, 2)1-25, 3) 26-50, 4) 51-75, 5) 76-100.
2.9 Análisis estadístico
Para los estudios in vitro, se utilizó un diseño completamente al azar, se utilizaron seis
cajas Petri por tratamiento con dos repeticiones. Se realizó un análisis de varianza con un
método de comparación de medias de Tukey (P≤ 0.05). Para los estudios in situ se utilizó
una ANOVA de dos vías con un arreglo de los datos factorial. Para los experimentos a
53
nivel de laboratorio se utilizaron 15 frutos por tratamiento, mientras que para el
semicomercial se utilizaron 120 frutos con dos repeticiones. Los experimentos se hicieron
por duplicado. Los valores en cero se transformaron sumándoles 1 y obteniendo la raíz
cuadrada.
3. Resultados
En los estudios in vitro, en general los aceites esenciales redujeron significativamente (P <
0.05) el desarrollo de R. stolonifer en comparación con el resto de los tratamientos. El
mejor efecto de las cubiertas, se observó con las formulaciones de quitosano 1% + cera de
abeja 0.1% + aceite esencial de limón 0.1% y quitosano 1% + ácido oleico 1% + aceite
esencial de limón 0.1%, las cuales inhibieron completamente el crecimiento del hongo
(Figura 4), mientras que en las formulaciones adicionadas con aceite esencial de tomillo se
redujó la esporulación (Cuadro 6). Las cajas Petri inoculadas en medio PDA, tuvieron un
crecimiento uniforme y constante. En los estudios de MEB se observó que en las cajas
Petri con quitosano 1% + cera de abeja 0.1% + aceite esencial de limón 0.1% así como en
las que contenían quitosano 1% + ácido oleico 1% + aceite esencial de limón 0.1% el
micelio de R. stolonifer creció distorsionado y sin formación de estructuras de
reproducción (Figura 5 a, b), contrario a lo ocurrido en el control donde se observó micelio
y esporangióforos bien desarrollados (Figura 6 e, f).
54
Cuadro 6. Desarrollo in vitro de Rhizopus stolonifer en diferentes cubiertas a base de
quitosano incubado por 48 h a 20 °C
Letras diferentes en la misma columna representan diferencias estadísticas (P < 0.05). Para
el análisis estadístico en general a todos los datos se les sumo un 1, sin embargo, los datos
de esporulación se transformaron usando raíz cuadrada.
Cubiertas
Rhizopus stolonifer
Crecimiento micelial
(mm)
P < 0.001
Esporulación1
(esporas ml-1)
P < 0.001
1. Quitosano 1% + cera de
abeja 0.1% + aceite
esencial de limón 0.1%
0 a* 0 a*
2. Quitosano 1% + cera de
abeja 0.1% + aceite
esencial de tomillo 0.1%
47 bc 5.4 x 105 b
3. Quitosano 1% + ácido
oleico 1% + aceite esencial
de limón 0.1%
0 a 0 a
4. Quitosano 1% + ácido
oleico 1% + aceite esencial
de tomillo 0.1%
47 bc 19.6 x 105 c
5. Quitosano 1% + cera de
abeja 0.1%
45 b 40 x 105 d
6. Quitosano 1% + ácido
oleico
50 cd 50 x 105 e
7. PDA 51 d 50 x 105 e
55
Figura 4. Crecimiento in vitro de Rhizopus stolonifer sobre diferentes cubiertas,
incluyendo el control.
56
Figura 5. MEB del micelio de Rhizopus stolonifer evaluado en diferentes cubiertas: a)
quitosano 1% + cera de abeja 0.1% + aceite esencial de limón 0.1%, b) quitosano 1%
+ ácido oleico 1% + aceite esencial de limón 0.1%, c) quitosano 1% + cera de abeja
0.1%, d) quitosano 1% + ácido oleico 1%, e) PDA, f) PDA (esporangióforo).
57
En los frutos que se evaluaron a nivel de laboratorio, el experimento que mostró un control
más efectivo sobre R. stolonifer fue el preventivo (cuando se aplicó la cubierta antes de
inocular el hongo), en el estado de madurez veteado y en ambas temperaturas. La menor
incidencia de la enfermedad se observó en los frutos que fueron cubiertos con la
formulación de quitosano + ácido oleico, con 13% de infección durante un
almacenamiento de 48 h a 10 ± 2 °C (Figura 6c). En los frutos que se almacenaron a
temperatura ambiente, los que mostraron un porcentaje de infección menor comparados
con el resto de los tratamientos, fueron los tratados con la formulación de quitosano 1% +
ácido oleico 1% + aceite esencial de limón 0.1% y quitosano 1% + cera de abeja 0.1% +
aceite esencial de limón 0.1% (13 y 20 %, respectivamente), mientras que el control tuvo
una infección del 40% (Figura 6d). Los tratamientos aplicados de manera curativa no
mostraron diferencas estadísticas significativas (Figura 6a,b).
Figura 6. Incidencia de frutos de jitomate con tres estados de madurez e inoculados
con Rhizopus stolonifer. a) frutos tratados de manera curativa almacenados a
temperatura controlada b) frutos tratados de manera curativa almacenados a
10 ± 2 °C
10 ± 2 °C
25 ± 2 °C
25 ± 2 °C
58
temperatura ambiente c) frutos tratados de manera preventiva almacenados a
temperatura controlada d) frutos tratados de manera preventiva almacenados a
temperatura ambiente.
En el análisis de la interacción de los factores aplicados en el estudio de incidencia del
hongo R. stolonifer tales como tratamientos, estados de madurez y temperaturas de
almacenamiento, se obtuvo que los recubrimientos probados de forma curativa (después de
la inoculación del hongo) no mostraron diferencias estadísticas significativas al ser
evaluados, mientras que en los estados de madurez se observó que los frutos veteados
presentaron una menor infección (Cuadro 7). En el experimento preventivo sobresalió la
cubierta de quitosano 1% + ácido oleico 1% a 10 ± 2 °C del resto de los tratamientos con
diferencias significativas (33%). Mientras que el estado de madurez veteado tuvo el
porcentaje de infección mas bajo.
59
Cuadro 7. Efecto curativo y preventivo de diferentes cubiertas a base de quitosano
probadas en tres estados de madurez de frutos de jitomate, inoculados con Rhizopus
stolonifer y almacenados a temperatura controlada y ambiente (10 ± 2 y 25 ± 2°C,
respectivamente).
12 °C 25 °C Efecto
Nivel
Infección
(%)
Infección
(%)
Curativo
Cubiertas NS NS
1. Quitosano 1% + cera de abeja 0.1% + aceite esencial de limón 0.1% 64.0a 84.0a
2. Quitosano 1% + ácido oleico 1% + aceite esencial de limón 0.1% 70.6a 90.6a
3. Quitosano 1% + cera de abeja 0.1% 63.0a 90.0a
4. Quitosano 1% + ácido oleico 1% 66.3a 88.6a
5. Agua 68.6a 88.0a
Estado de
madurez P < 0.009 NS
Veteado 59.2a 88.6a
Naranja 69.0b 89.0a
Rojo 71.4b 87.6a
Interacción Cubierta x
Estado de madurez P < 0.028 P < 0.004
Preventivo Cubiertas P < 0.001 P < 0.008
1. Quitosano 1% + cera de abeja
0.1% + aceite esencial de limón 0.1% 68.0b 55.0a
2. 1% + ácido oleico 1% + aceite esencial de limón 0.1% 55.0b 42.0a
3. Quitosano 1% + cera de abeja
0.1% 53.0b 51.0a
4. Quitosano 1% + ácido oleico 1% 33.0a 51.0a
5. Agua 91.0c 62.0b
Estado de
madurez P < 0.050 P < 0.001
60
Veteado 53.0a 29.2a
Naranja 69.2b 47.8b
Rojo 58.4a 79.8c
Interacción Cubiertas x
Estado de madurez P < 0.032 P < 0.019
Letras diferentes en la misma columna representan diferencias estadísticas (P < 0.05)
En relación al índice de severidad de R. stolonifer en los tratamientos preventivos, los
frutos cubiertos con quitosano 1% + ácido oleico 1% y almacenados a 25 ± 2 °C mostraron
un índice de severidad menor (1.2) comparado con el resto de las formulaciones. Los frutos
verdes almacenados a 10 ± 2 °C y cubiertos con las diferentes formulaciones, no mostraron
diferencias estadisticas entre ellos (1.2a, 1.3a, 1.6a), sin embargo todos fueron diferentes al
control (3b). (Figura 7 a). Las cubiertas aplicadas de manera preventiva en frutos veteados,
mostraron in índice de severidad mucho menor que el resto de las evaluaciones.
Los frutos naranja almacenados a temperatura ambiente y cubiertos con quitosano 1% +
ácido oleico 1% y quitosano 1% + ácido oleico 1% + aceite de limón 0.1% fueron los que
mostraron un índice de severidad menor (1.6 y 1.9, respectivamente) comparado con el
resto de las formulaciones aplicadas (Figura 8a), mientras que ha temperatura controlada
los frutos que tuvieron una menor severidad fueron los cubiertos con quitosano 1% + cera
de abeja 0.1% + aceite de limón 0.1% y quitosano 1% + ácido ole ico 1%, con valores de
1.6 y 1.8, respectivamente (Figura 8b), comparado con el control (3.4).
El aceite esencial de limón en los frutos rojos, controló el desarrollo del hongo
significativamente (P ≤ 0.05) comparado con el resto de los tratamientos (Figura 9a-d).
61
Figura 7. Índice de severidad de frutos de jitomate veteados inoculados con Rhizopus
stolonifer de manera preventiva /curativa y almacenados a 25 ± 2 y 10 ±2 °C
Figura 8. Índice de severidad de frutos de jitomate naranja inoculados con Rhizopus
stolonifer de manera preventiva /curativa y almacenados a 25 ± 2 y 10 ± 2 °C
10 ± 2 °C
25 ± 2 °C
10 ± 2 °C
25 ± 2 °C
62
Figura 9. Índice de severidad de frutos de jitomate rojos inoculados con Rhizopus
stolonifer de manera preventiva /curativa y almacenados a 25 ± 2 y 10 ± 2 °C
En los estudios a nivel semi comercial podemos observar similitud con los resultados
obtenidos en el laboratorio. Los frutos almacenados a temperatura controlada y cubiertos
con quitosano 1% + ácido oleico 1% mostraron un porcentaje de infección menor (44.6%)
que la cubierta de quitosano 1% + ácido oleico 1% + aceite esencial de limón 0.1% y el
control (59 y 63%, respectivamente) (Cuadro 8). En frutos almacenados a temperatura
ambiente la cubierta de quitosano 1% + ácido oleico 1% + aceite de limón 0.1% disminuyó
la incidencia de R. stolonifer (37.8%) comparado con el resto de los tratamientos, sin
embargo no hubo diferencias significativas entre ellos.
25 ± 2 °C
10 ± 2 °C
63
Cuadro 8. Efecto de diferentes cubiertas a base de quitosano y estados de madurez
en frutos de jitomate inoculados con Rhizopus stolonifer, y almacenados a
temperatura controlada y ambiente (10 ± 2 y 25 ± 2°C) a un nivel semicomercial.
Medias con letras diferentes en la misma columna representan diferencias estadísticas (P <
0.05)
En relación al índice de severidad de frutos almacenados a temperatura ambiente, no se
observaron diferencias estadísticas entre las cubiertas de quitosano 1% + ácido oleico y
quitosano 1% + ácido oleico 1% + aceite esencial de limón 0.1% en los tres estados de
madurez (Figura 10). Los frutos tratados con el control mostraron los valores de severidad
más altos (hasta 4.5).
10 ± 2 °C 25 ± 2 °C
Efectos
Nivel
Infección (%)
Infección (%)
Preventivo P < 0.001
Cubiertas
1. Quitosano 1% + ácido oleico 1%
+ aceite esencial de limón0.1% 59b* 37.8a*
2. Quitosano 1% + ácido oleico 1% 44.6a 53a
3. Agua 63b 58a
Estado de
Madurez P < 0.001 P < 0.001
Veteado 49b* 19a*
Naranja 28.6a 74.6b
Rojo 89c 55c
Interacción
Cubiertas x Estado de
Madurez NS NS
64
Figura 10. Índice de severidad en los tres estados de madurez de los frutos de jitomate
(veteado, naranja y rojo) inoculados con Rhizopus stolonifer y almacenados a 25 ± 2
y 10 ± 2 °C.
4. Discusión
Se corroboró el efecto fungicida del aceite esencial de limón en el control de R. stolonifer
en los estudios in vitro. Al adicionar este compuesto a la formulación de las cubiertas, no
se observó desarrollo del micelio inoculado y no se observaron alteraciones o cambios en
la apariencia del micelio, sin embargo, en las imágenes de MEB sí se observaron
alteraciones. Por ejemplo, el micelio se mostró distorsionado, hinchado y sin estructuras de
reproducción (Figura 5a). Estos datos concuerdan con lo reportado por Bosquez-Molina et
al. (2010), donde evaluaron el efecto del aceite esencial de limón al 0.1% sobre R.
stolonifer, mostrando una inhibición total del hongo. Por otro lado Viuda-Martos et al.
(2008), evaluaron el efecto del aceite esencial de limón al 0.94% y reportaron una
inhibición en el crecimiento de otros hongos patógenos tales como, Aspergillus niger, A.
flavus, Penicillium verrucosum y P. Chrysogenum.
El aceite esencial esta compuesto por un gran número de compuestos de los que destaca el
D-Limoneno por ser el más abundante, además es el compuesto al que se le atribuye el
efecto antimicrobiano (Bosquez-Molina et al., 2010; Bezic et al., 2005; Viuda-Martos et
al., 2008). El D-Limoneno se ha encontrado en otras especies vegetales y se ha utilizado
para evitar el desarrollo de microorganismos, Alma et al. (2004), Reportaron el efecto del
10 ≤ 2 °C
°C 25 ≤ 2 °C
°C
65
D-Limoneno para controlar Escherichia coli in vitro al utilizar aceite esencial de Pistacia
vera a una concentración de 4 μL/caja. Rasooli et al. (2002), inhibieron el desarrollo de E.
coli, Staphylococcus aureus, Streptococcus faecalis, Pseudomonas aeruginosa, Candida
albicans y Sacharomyces cerevisiae utilizando aceite esencial de Myrtus communis (10
μL), el cual es rico en D-Limoneno. Otra especie vegetal que contiene D-Limoneno es
Satureja cuneifolia, de la cual su aceite esencial ha controlado el desarrollo de E. coli, S.
aureus y C. albicans cuando se utiliza en concentraciones entre 10 y 20 μL (Bezic et al.,
2005). El carácter hidrofóbico del aceite esencial, le permite incorporarse a los lípidos de
la membrana celular perturbando su estructura y su permeabilidad, dando lugar a una fuga
de iones y otros contenidos celulares vitales. De igual forma puede afectar las proteínas
embebidas en la membrana citoplasmática del hongo al deformar la interacción lípido-
proteína e inhibir la síntesis de enzimas como la ATPasa, se disminuye la producción de
energía e impide la producción del micelio, hasta ocasionar finalmente la muerte del hongo
(Lee and Beynen, 2004; Leite et al., 2005; Ronquillo, 2007; Bejarano y Centeno., 2009).
En las evaluaciones in situ, se realizó la inoculación del hongo antes de aplicar los
tratamientos (manera curativa), sin embargo, esto permitió que R. stolonifer colonizará el
fruto y una vez dentro, las cubiertas no pudieron controlar su desarrollo. R. stolonifer es
un hongo saprofito, crece y se desarrolla sobre tejido muerto, por lo tanto al hacer heridas
en los frutos se garantizó la entrada del hongo en el fruto (Bautista-Baños et al., 2008).
Cuando las esporangiosporas germinan dentro del fruto se produce el micelio, este a su vez
segrega enzimas pécticas, las cuales degradan la lámina media de la pared celular de las
células y así las invade y se alimenta de ellas. Una vez que se inicia la lesión el hongo
invade todo el fruto creando contaminación a los frutos maduros cercanos afectándolos en
su totalidad (Agrios, 1978).
En los experimentos de manera preventiva se observó control de las cubiertas sobre el
desarrollo del hongo. La cubierta elaboradas con quitosano1% + ácido oleico 1%, redujo el
porcentaje de infección (13%) en los frutos veteados inoculados con R. stolonifer y
almacenados a 10 ± 2 °C. Esto concuerda por lo reportado por Vargas et al. (2006), donde
aplicaron una cubierta de quitosano 1% y ácido oleico 1% en fresas y controlaron el
desarrollo de microrganismos en mas de un 60%, comparado con los frutos no tratados en
66
donde no hubo control. Por otro lado Walters et al. (2005), no observaron un efecto
inhibitorio del ácido oleico a 1000μM sobre Rhizoctonia solani. El ácido oleico es un ácido
graso de gran importancia por sus efectos benéficos en la salud humana, sin embargo son
pocos los autores que han reportado trabajos sobre la sensibilidad de los hongos a estos
ácidos (Hellgren y Vicent, 1972), sin embargo, su efecto se ha estudiado en otros
microorganismos. Bhattacharjee et al. (2005), evaluaron aceite esencial de Cestrum
nocturnum, el cual es rico es ácidos grasos dentro de los que destaca el ácido oleico y
mostraron que dicho aceite a una concentración de 1000 ppm inhbibe el desarrollo
Staphylococcus aureus y Pseudomonas aeruginosa. A diferencia de los anterior Outtara et
al. (1997), no observaron efecto inhibitorio al aplicar ácido oleico a 2500 μg mL-1 sobre
Carnobacterium piscícola, Lactobacillus curvatus y L. sake. Del mismo modo Fay y Farias
(1975), no obsevaron efecto inhibitorio del acido oleico en concentrariones de 1 a 4%
sobre E. coli. Tantaoui-Elaraki y Errifi (1994), evaluaron el efecto antifúngico de ácidos
grasos sobre Zygorhynchus sp y Aspergillus niger, siendo el ácido laurico el que tuvo un
efecto inhibitorio mayor contra ambos hongos. Otros investigaciones concluyeron que los
ácidos grasos causan disturbios principalmente en la membrana celular de hongos y
bacterias inhibiendo o retrasando su crecimiento (Greenway and Dyke, 1979; Beuchat and
Golden, 1989). Existen en el mercado productos comerciales elaborados con base de
ácidos grasos los cuales son recomendados para controlar hongos postcosecha tales como
Botrytis cinerea, Penicillium sp. y Fusarium oxysporum, se dice que su modo de acción es
directamente en la membrana celular (inhibición actividad enzimática) e inhibe la
respiración celular (Anonimo, 2000).
Los frutos veteados que fueron cubiertos con quitosano 1% + acido oleico 1% + aceite de
limón 0.1% y almacenados a temperatura ambiente (25 ± 2 °C) tuvieron un porcentaje de
infección menor (13%) que el resto de las cubiertas y el control. Vu et al. (2011),
evaluaron cubiertas de quitosano + limoneno y al igual que en este estudio, no observaron
inhibición de microorganimos en fresa cuando se almacenaron a temperaturas menores de
10 ºC. Por otro lado Mishra and Dubey (1994), reportan la inhibición de Aspergillus flavus
hasta en un 80% al utilizar aceite esencial de Citrus aurantifolia a 25 ºC. Se ha evaluado la
efectivadidad de otros aceites esenciales a temperatura ambiente, tal es el caso de
Origanum compactum y Thymus glandulosos a 100ppm, los cuales inhibieron al 100% el
desarrollo de Botrytis cinérea cuado se almacenó a 24 ºC (Bouchra et al. 2003). Los aceites
67
esenciales son compuestos volátiles con poca residualidad en el ambiente es por eso
importante que se combinen con otros compuestos para alargar su permanencia en los
frutos. Se ha observado el efecto sinérgico entre los aceites esenciales y los ácidos grasos,
por ejemplo el aceite esencial de manzanilla en asociación con el ácido oleico, láurico o
propiónico provocó un efecto sinérgico sobre Zygorhynchus sp. (Tantaoui-Elaraki and
Errifi, 1994).
5. Conclusiones
Las cubiertas adicionadas con aceite esencial de limón, inhibieron por completo el
desarrollo del hongo a nivel in vitro
Las cubiertas a base de quitosano 1% + acido oleico 1%, parcialmente controlaron el
desarrollo y severidad del hongo R. stolonifer, en frutos de jitomate veteados cuando se
almacenaron a temperatura controlada (10 ± 2 °C).
Las cubiertas a base de quitosano 1% + acido oleico 1% + aceite esencial de limón 0.1% ,
controlaron el desarrollo y severidad de la infección de R. stolonifer, en frutos de jitomate
veteados cuando se almacenan a temperatura ambiente (25 ± 2 °C).
6. Referencias bibliograficas
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74
Capítulo III
Evaluación de la actividad antibacterial
de recubrimientos comestibles sobre
Escherichia coli en frutos de jitomate
75
Evaluación de la actividad antibacterial de recubrimientos comestibles
sobre Escherichia coli en frutos de jitomate
Resumen
En la actualidad existe una demanda creciente por el consumo de vegetales frescos entre
las que se encuentra el jitomate. A pesar de las medidas preventivas con las que se cuenta
en el cultivo de jitomate, se pueden llegar a contaminar con bacterias patógenas, esto
genera serios problemas en la salud pública y en el caso de los productos de exportación,
rechazos que dañan severamente la economía de las empresas. Se han implementado
sanitizantes para disminuir la presencia de la bacteria, sin embargo, estos productos no
protegen a los frutos de futuras infecciones. La cubierta comestible es una capa delgada
que se forma directamente sobre la superficie del fruto y permite que se extienda su vida
útil al reducir los procesos metabólicos vitales, pero además funciona como vehículo para
adicionar compuestos antimicrobianos, los cuales protegen al fruto de invasiones
patógenas. En esta investigación se evaluaron diferentes cubiertas a base de quitosano y se
adicionaron con cera de abeja, ácido oleico y aceites esenciales (limón y tomillo) a nivel in
vitro e in situ (laboratorio y semicomercial). En general las cubiertas que contenían cera de
abeja fueron las que controlaron satisfactoriamente el desarrollo de Escherichia coli DH5α.
En los estudios in vitro se inhibió en 100% el desarrollo de E. coli DH5α en las cubiertas
con cera de abeja. En los frutos almacenados a 10 ± 2 °C y cubiertos con quitosano 1% +
cera de abeja 0.1% y en la de quitosano 1% + cera de abeja 0.1% + aceite esencial de
limón 0.1% se observó un escaso crecimiento del patógeno en los frutos naranja y rojo (3,
10 y 24 y 17 UFC, respectivamente) comparado con el control (600 UFC). En frutos
almacenados a 25 ± 2 °C se observó un crecimiento pobre de la bacteria en frutos verdes y
naranjas (1 y 0 UFC, respectivamente) cuando se cubrió con quitosano 1% + cera de abeja
0.1% + aceite esencial de limón 0.1%, mientras que la cubierta quitosano 1% + cera de
abeja 0.1% controló en desarrollo en los frutos verdes, naranjas y rojos (20, 2, 9 UFC,
respectivamente). Las cubiertas elaboradas con quitosano y cera de abeja disminuyeron el
desarrollo de Escherichia coli DH5α in vitro y directamente en los frutos de jitomate.
76
1. Introducción
Las frutas y hortalizas son productos esenciales en la dieta del ser humano, por lo
beneficios nutricionales que estas aportan (Klaiber et al., 2005), sin embargo, estos
productos pueden ser vehículo para la transmisión de bacterias, las cuales pueden causar
enfermedades en los humanos. En los últimos años se ha reportado un aumento en el
número de brotes de enfermedades transmitidas por alimentos contaminados por Lysteria
monocitogenes, Salmonella sp., y Escherichia coli, por lo tanto, ha aumentado la
preocupación de que las frutas y vegetales frescos sean una fuente creciente de infecciones
(Sivapalasingam et al., 2004).
El Centro de Control de Enfermedades (CDC, por sus siglas en ingles) estima que cada
año se enferman cerca de 76 millones de personas en Estados Unidos por consumir
alimentos contaminados con bacterias patógenas, 325 mil son hospitalizadas y 5 mil
mueren. Asímismo, se estima que 12 % de estas enfermedades están relacionadas con el
consumo de frutas y vegetales frescos (K lonsky, 2006). Se ha reportado el rápido
crecimiento de las bacterias sobre frutas o vegetales y la capacidad que tienen para
sobrevivir en condiciones ácidas (Conner y Kotrola, 1995). Por ejemplo, en jícama, papaya
y sandía almacenada a temperatura ambiente se incrementó la población de bacterias en 2
log10 después de seis horas (Fernández et al.,1989)
Escherichia coli es una bacteria patógena que forma parte de la familia Enterobacteriaceae,
y esta integrada por bacilos Gram-negativos móviles, aerobios o anaerobios facultativos.
Es un organismo de rápido crecimiento y una amplia distribución, se han aislado de frutas,
verduras de hoja verde, col, apio, pepino, rábanos, germinados y tomates debido a que
estos productos proporcionan los nutrientes necesarios para su crecimiento (Beuchat,
1996). Escherichia coli puede aparecer durante el desarrollo de las plantas, por contacto
con estiércol (heces de humanos u otros aminales), por regar con agua contaminada, por
insectos, en la cosecha, durante su manejo postcoseha y transporte (Ogden et al., 2005;
Beverlya et al., 2008; Inatsu et al., 2010; Keeratipibul et al., 2011). Se ha demostrado que
la cepa de E. coli O157:H7 es la mas agresiva causando diarrea, diarrea con sangre y
síndrome urémico hemolítico en las personas que la consumen.
77
Para contrarrestar la aparición de Escherichia coli, se han evaluado una gama de
sanitizantes tales como, hipoclorito de sodio (Zhuang et al., 1995), agua electrolizada (Park
et al., 2008) e hipoclorito de sodio acidificado ( Inatsu et al., 2005, 2010) y se han obtenido
resultados prometedores, sin embargo, estos productos no protegen al los productos de
futuras infecciones. El quitosano es un compuesto que presenta características
biofuncionales, por lo que podría ser una alternativa viable para sustituir los métodos de
control tradicionales, ha controlado el desarrollo de bacterias patógenas, como
Escherichia coli (Simpson et al., 1997; Qi et al., 2004; Lim et al., 2004; Nan et al., 2006)
la ventaja de este, es que forma una capa en la superficie de los frutos y el efecto dura por
un tiempo prolongado, por lo tanto es un producto que puede ser utilizado para elaborar
cubiertas (Gonzalez-Aguilar, 2005). Las cubiertas pueden adicionarse con otros
compuestos antibacteriales naturales como es el caso de la cera de abeja y los aceites
esenciales.
La cera de abeja y la miel son productos naturales que contienen flavonoides, antioxidantes
y otros compuestos con propiedades antimicrobiales (All-Waili, 2005). Los productos
derivados de las abejas se han utilizado desde hace sigloes en la medicina popular
(Guisalberti 1979; Miorin et al., 2003). Actualmente se utiliza principalmente en la
industria cosmética y farmacéutica como vehículo para la elaboración de cremas (Carbajal
et al., 1998), y se ha reportado el efecto que presenta la cera de abeja para controlar
bacterias patógenas, tal es el caso de Staphylococcus aureus (All-Waili, 2005). Se ha
utilizado la cera de abeja en combinación con otros compuestos tales como, goma laca,
acidos grasos, cera de candelilla y cera de carnauba para formular cubiertas vegetales, y se
ha mejorado el aspecto de los frutos y evitado la perdida exesiva de peso y agua
(Hagenmaier y Bakrl, 1997; Martínez-Jávega y Coquerella, 2000; Han et al., 2006), sin
embargo son escasos los estudios que reportan el efecto antimicrobial de la cera de abeja
en productos hortofrutícolas.
Otros compuestos utilizados son los aceites esenciales, estos compuestos volátiles se
caracterizan por su fuerte olor y están compuestos por metabolitos secundarios de las
plantas, se extraen generalmente por hidrodestilación, principalmente de plantas
aromaticas y pueden ser sintetizados por todos los órganos de la planta (flores, hojas,
78
tallos, raíces, frutos) además juegan un papel importante en la naturaleza al proteger a las
plantas del ataque de virus, hongos y bacterias (Bakkali et al., 2008). Los aceites
esenciales ha sido objeto de estudio para controlar el crecimiento de bacterias patógenas
para el humano. Oussalah et al. (2007), reportaron la inhibición del crecimiento in vitro de
E. coli al incorporar aceite esencial de canela, oregano y tomillo en concentraciones
menores de 0.4%. Por otro lado Hammer et al. (1999), mostró que el aceite esencial de
tomillo al 0.3% inhibe el desarrollo in vitro de la bacteria anterior. Smith-Palmer et al.
(1998), mediante un estudio in vitro, probaron varios aceites esenciales entre ellos el de
tomillo a una concentración del 0.05% sobre E. coli, obteniendo una inhibición completa
de su desarrollo. Aceites esenciales de otras especies tales como oregano, clavo y pimienta
del mismo modo han mostrado que reducen el crecimiento in vitro de E. coli al utilizar
concentracions de 15μL por caja (Dorman and Deans, 2000).
Otras investigaciones relacionadas con el patógeno antes mencionado, muestran como el
aceite esencial obtenido de plantas de limón a una concentración de 1μg mL-1 inhibió
completamente su desarrollo (Saikia et al., 2005). Así como, Moreira et al. (2005),
mostraron la inhibición in vitro de E. coli al adicionar 1.7 mL/100 mL de aceite esencial de
limón. Otros autores han demostrado el efecto antimicrobial que proporcionan los aceites
esenciales de limón para controlar el desarrollo de bacterias patógenas. Subba et al.
(1967), determinaron que el aceite esencial de limón tiene un efecto antibacterial contra
Salmonella. Así mismo O´Bryan et al. (2008), mostraron el efecto antibacterial del D-
limoneno 1% contra este mismo patógeno. Fisher y Phillips (2006), evaluaron el aceite
esencial de limón al 1% contra E. coli, observando un efecto inhibitorio sobre su
desarrollo.
Las cubiertas comestibles son una tecnología que no solo permite extender la vida útil de
los productos hortofrutícolas reduciendo sus procesos metabólicos vitales, sino que además
puede servir como vehículo para compuestos antibacterianos tales como la cera de abeja y
los aceites esenciales. El objetivo de este trabajo fue evaluar el efecto bactericida de
diferentes cubiertas a base de quitosano sobre E. coli DH5α inoculada en jitomates con tres
estados de madurez, almacenados a 10 ± 2 ºC y 25 ± 2 °C.
79
2. Materiales y métodos
La obtención e índice de madurez de los frutos de jitomate se ha explicado en el capítulo
anterior inciso 2.2.
2.1 Obtención y activación de la cepa Escherichia coli DH5α
Se utilizó la cepa de E. coli DH5α, la cual fue donada por la Universidad Politécnica del
Estado de Morelos. La cepa se retiró del congelador (Freezer -70 °C) y se dejó
temperatura ambiente (27 °C) para su descongelación. Una vez descongelada la cepa, se
tomó una porción de esta con una asa bacteriológica previamente esterilizada y se realizó
una técnica de estriado sobre medio de cultivo MacConkey. Transcurridas 48 h del
estriado se tomó una porción de la bacteria y se colocó dentro de un tubo de ensaye que
contenía 5 mL de caldo LT (Lauril triptosa) y se dejó en agitación por 24 h a 225 RPM.
2.2 Obtención de la dilución óptima de Escherichia coli DH5α
Del cultivo de E. coli DH5α se tomaron 100 μL y se colocaron en 900 μL de caldo Lauril
Triptosa (LT). De la solución anterior se tomaron 100 μL y se diluyeron en 900 μL de
caldo, este procedimiento se repitió 10 veces (Cuadro 9). Para determinar la concentración
de las células se utilizó un espectrofotómetro la lectura de las absorbancias fue de 600 nm
y se utilizó caldo LT como blanco. El objetivo de realizar estas diluciones fue para
encontrar la dilución ideal para evaluar las cubiertas.
80
Cuadro 9. Diluciones decimales de Escherichia coli DH5α (cultivo “over night”).
Número Diluciones decimales Absorbancias Número de UFC/PLACA*
1 1-10 0.289 INCONTABLES
2 1-100 0.153 INCONTABLES
3 1-1000 0.073 INCONTABLES
4 1-10000 0.045 INCONTABLES
5 1-100000 0.028 120
6 1-1000000 0.025 64
7 1-10000000 0.017 4
8 1-100000000 0.014 1
9 1-1000000000 0.002 0
10 1-10000000000 0.001 0
* Los valores reportados son el promedio de los datos
2.3 Formulación del recubrimiento
Las formulaciones aplicadas in vitro se describen en el capítulo anterior inciso 2.3. Para los
experimentos in situ a nivel de laboratorio se utilizaron las formulaciones 1) quitosano 1%
+ cera de abeja 0.1% + glicerol 0.3% + aceite esencial de limón 0.1% + acido acético 1%;
3) quitosano 1% + ácido oleico 1 % + glicerol 0.3% aceite esencial de limón 0.1% + ácido
acético 1 % ; 5) quitosano 1% + cera de abeja 0.1% + glicerol 0.3% + ácido acético 1%; 6)
quitosano 1% + ácido oleico 1% + glicerol 0.3% + ácido acético 1%; 7) PDA. Para los
experimentos a nivel semicomercial se utilizaron las formulaciones 1 y 5, las cuales
mostraron un mejor efecto contra el pátogeno. Se lavaron los frutos con agua como control.
81
La elaboración del recubrimiento se explicó en el capítulo anterior inciso 2.4.
2.4 Aplicación in vitro de los tratamientos en Escherichia coli DH5α
Se tomó una porción de la bacteria de un cultivo “over night” con una asa bacteriológica y
se depositó en tubos de ensaye con caldo LT para obtener una dilución de 1-100000
(1x105).
Se colocó 1.0 mL de las cubiertas sobre cajas petri de 100 x 15 con medio MacConkey. Se
distribuyó uniformemente por toda la caja y se dejó secar. Una vez seco se tomaron 100µL
de la dilución y se colocó sobre el recubrimiento y se esparció completamente por toda la
caja. Se inocularon cajas con medio MacConkey como control, 48 h después se contó el
número de colonias de la bacteria (UFC) (Figura 11).
82
Figura 11. Formación de las cubiertas en los experimentos in vitro e inoculación de E.
coli DH5α
2.5 Inoculación de Escherichia coli DH5α sobre frutos de jitomate a nivel
de laboratorio y semicomercial
Los frutos de jitomate se sumergieron en las diferentes formulaciones de las cubiertas
durante 30 s y se dejaron secar a temperatura ambiente. Posteriormente se agregó a cada
fruto una gota (35 μL) de inoculo de E. coli DH5α de una concentración de 1 x 105 y se
esparció con un triángulo dispersor por toda una cara el fruto (Figura 12). Los frutos se
almacenaron a dos temperaturas (10 ± 2 y 25 ± 2 °C) durante 48 h. Los frutos evaluados en
el experimento semicomercial fueron asperjados también con una solución de la bacteria
de 1 x 105 (Figura 13).
Una vez trascurrido el periodo de incubación, los frutos fueron lavados en vasos que
contenían 10 mL de agua destilada estéril. Se tomaron 100 μL de esta solución y se inoculó
en cajas Petri con medio de cultivo Mac Conkey (Figura 14), se almacenaron las cajas en
una incubadora a 25 °C durante 48 h. Se evaluó el número de UFC desarrolladas.
Figura 12. Aplicación de las cubiertas e inoculación de E. coli DH5α en frutos de
jitomate a nivel de laboratorio.
83
Figura 13. Aplicación de las cubiertas e inoculación de E. coli DH5α en frutos de
jitomate a nivel semi-comercial.
Figura 14. Evaluación del desarrollo de E. coli DH5α en frutos de jitomate.
2.6 Procesamiento de muestras en Microscopia Electrónica de Barrido (MEB).
El procesamiento de las muestras se realizó en el IBT-UNAM con la Dra. Guadalupe
Zavala y la observación en el microscopio TESCAN VEGA 3 LMU se realizó con el Ing.
Carlos Segovia de MicraIngeniería
Las cubiertas inoculadas con E. coli DH5α se fijaron con glutaraldehido al 8%, y
posteriormente se fijaron con tetraóxido de osmio al 2%, a partir de entonces las muestras
se lavaron con 0.16M de bufer cacodilato y se deshidrataron en soluciones de etanol.
Finalmente se secaron al aire libre y se cubrieron con pulverizaciones de oro, para mejorar
84
la conductividad de la superficie del microscopio Electrónico de barrido TESCAN VEGA
3 LMU.
2.7 Análisis Estadístico.
El diseño de los experimentos fue completamente al azar. Para los estudios in vitro se
utilizaron seis cajas por tratamiento con dos repeticiones. En los tratamientos a nivel de
laboratorio fueron 15 frutos por tratamiento, mientras que para el experimento
semicomercial, se utilizaron 120 frutos por tratamiento, con dos repeticiones. En todos los
datos se uso un análisis de varianza con un método de comparación de medias de Tukey
(P≤ 0.05). En los análisis donde había datos con valor cero, se hizo una transformación
sumándole uno y sacándole raíz cuadrada.
3. Resultados
Los resultados observados en los experimentos in vitro mostraron diferencias estadísticas
significativas (P < 0.05) entre los tratamientos aplicados (Cuadro 10). Las cubiertas
formuladas con quitosano 1% + cera de abeja 0.1% + aceite esencial de limón 0.1%,
quitosano 1% + cera de abeja 0.1% + aceite esencial de tomillo 0.1% y quitosano 1% +
cera de abeja 0.1%, inhibieron en su totalidad el desarrollo de E. coli DH5α (Figura 15 a, b
y g), mientras que en el resto de los recubrimientos se observó la aparición de colonias
(300 - 200 UFC) al igual que el control (211 UFC). En las imágenes de MEB se observa
que en la superficie de las cubiertas formuladas con quitosano + cera de abeja + aceite
esencial de limón y quitosano + cera de abeja, no hubo presencia de la bacteria, a
diferencia de las cubiertas adicionadas con quitosano + acido oleico + aceite esencial de
limón, cera de abeja + acido oleico y el control (medio MacConkey) en donde se observa
abundante desarrollo de E. coli DH5α (Figura 16).
85
Cuadro 10. Número de colonia de Escherichia coli DH5α en medio Mac Conkey
cubierto con diferentes formulaciones a base de quitosano e incubadas durante 48 h.
*Medias con la misma letra no presentan diferencias significativas por Tukey (P <
0.05). Los Valores de P son en base a una transformación de raíz cuadrada.
Cubiertas
Escherichia coli DH5α
UFC /caja
P< 0.001
1.Quitosano 1% + cera de abeja 0.1% +
aceite esencial de limón 0.1%
0 a*
2. Quitosano 1% + cera de abeja 0.1% +
aceite esencial de tomillo 0.1%
0 a
3. Quitosano 1% + ácido oleico 1% + aceite
esencial de limón 0.1%
300 c
4. Quitosano 1% + ácido oleico 1% + aceite
esencial de tomillo 0.1%
300 c
5. Quitosano 1% + Cera de abeja 0.1% 0 a
6. Quitosano 1% + ácido oleico 1% 200 b
7. Medio Mac Conkey 211 b
86
Figura 15. Número de UFC desarrolladas en diferentes cubiertas e incubadas por 48
h: a) quitosano 1% + cera de abeja 0.1% + aceite esencial de limón 0.1% b) quitosano
1% + cera de abeja 0.1% + aceite esencial de tomillo 0.1% c) quitosano 1% + ácido
oleico 1% + aceite esencial de limón 0.1% d) quitosano 1% + ácido oleico 1% + aceite
esencial de tomillo 0.1% e) quitosano 1% + cera de abeja 0.1% f) quitosano 1% +
ácido oleico 1% y g) Medio Mac Conkey.
87
Figura 16. Muestras de MEB de Escherichia coli DH5α inoculada en diferentes
cubiertas: a) quitosano 1% + cera de abeja 0.1% + aceite esencial de limón 0.1% b) quitosano 1% + ácido oleico 1% + aceite esencial de limón 0.1% c) quitosano 1% +
cera de abeja 0.1% d) quitosano 1% + ácido oleico 1% e) MacConkey.
88
Los tratamientos con las diferentes formulaciones aplicadas a base de quitosano y
evaluados a nivel de laboratorio mostraron diferencias significativas (P< 0.05) entre ellos.
Las cubiertas aplicadas disminuyeron el desarrollo de E. coli DH5α comparado con el
control (agua). Los mejores resultados de los frutos almacenados a 10 ± 2 ° C se
observaron en la cubierta de quitosano 1% + cera de abeja 01% y en la de quitosano 1% +
cera de abeja 0.1% + aceite esencial de limón 0.1% en los frutos naranja y rojo (3, 10, 24 y
17 UFC, respectivamente) (Cuadro 11) en donde el crecimiento de la bacteria fue mucho
menor que en el control (600 UFC) (Figura 17). En ambas cubiertas con cera de abeja no
se observaron diferencias estadísticas (P< 0.05). La cubierta de quitosano 1% + ácido
oleico 1% + aceite esencial de limón 0.1% aplicada a los frutos verdes, mostró un número
de UFC menor (71 UFC) que el resto de los tratamientos, sin embargo, no se detectaron
difrencias significativas.
Del mismo modo en los frutos almacenados a 25 ± 2 °C, las cubiertas con cera de abeja
fueron las más efectivas para controlar el desarrollo de E. coli DH5α . La cubierta de
quitosano 1% + cera de abeja 0.1% + aceite esencial de limón 0.1% inhibió casi
totalmente el crecimiento de E. coli DH5α en los frutos verdes y naranjas (1 y 0 UFC,
respectivamente) mientras que en la cubierta de quitosano 1% + cera de abeja 0.1% se
mostró un desarrollo escaso de la bacteria en los tres estados de madurez (verde = 20,
naranja = 2, rojo = 9).
89
Cuadro 11. Efecto de diferentes cubiertas a base de quitosano en frutos de jitomate
con tres estados de madurez inoculados con Escherichia coli DH5α y almacenados a
dos temperaturas, a nivel de laboratorio.
Cubiertas
Estado de Madurez
Veteado Naranja Rojo
UFC / Caja
P < 0.001
UFC / Caja
P < 0.001
UFC / caja
P < 0.001
12°C 1. Quitosano 1% + cera de abeja 0.1% + aceite esencial de limón 0.1%
125*a 24*a 17*a
3. Quitosano 1% + ácido oleico 1% + aceite esencial de limón 0.1%
71 a 470 bc 113 b
5. Quitosano 1% + cera de abeja 0.1% 168 a 3 a 10 a
6. Quitosano 1% + ácido oleico 1% 152 a 381 b 45 ab
7. Agua 600 b 600 c 600 c
25°C
1. Quitosano 1% + cera de abeja 0.1%
+ aceite esencial de limón 0.1%
1 a 0 a 231 b
3. Quitosano 1% + ácido oleico 1% + aceite esencial de limón 0.1%
171 b 212 b 66 ab
5. Quitosano 1% + cera de abeja 0.1% 20 a 2 a 9 a
6. Quitosano 1% + ácido oleico 1% 200 b 450 c 208 b
7. Agua 600 c 600 c 600 c
*Medias con la misma letra no presentan diferencias significativas (P< 0.05). Los Valores
de P son en base a una transformación de raíz cuadrada.
Figura 17. Colonias de Escherichia coli DH5α aisladas de frutos de jitomate naranjas
almacenados a 10 ± 2 °C y cubiertos con las diferentes formulaciones: a) quitosano
1% + cera de abeja 0.1% + aceite esencial de limón 0.1% b) quitosano 1% + ácido
oleico 1% + aceite esencial de limón 0.1% c) quitosano 1% + cera de abeja 0.1% d)
quitosano 1% + ácido oleico 1% e) Agua.
90
En los experimentos realizados a nivel semi-comercial las cubiertas formuladas con
quitosano + cera de abeja + aceite esencial de limón y quitosano + cera de abeja evaluadas
en ambas temperaturas, controlaron en forma el desarrollo de E. coli DH5α, inhibiendo su
crecimiento y evitando su aparición en el medio de cultivo en ambas temperaturas de
almacenamiento (Figura 18 a, b, d, e, g y h) notándose clara diferencia sobre el control que
tuvo una carga bacteriana hasta de 600 UFC (Cuadro 12).
Figura 18. Crecimiento de E. coli aislado de frutos de jitomate de tres estados de
madurez cubiertos con dos recubrimientos : verdes a) quitosano 1% + cera de abeja
0.1% b) quitosano 1% + cera de abeja 0.1% + aceite esencial de limón 01% c) Agua;
Naranjas d) quitosano 1% + cera de abeja 0.1% e) quitosano 1% + cera de abeja
0.1% + aceite esencial de limón 0.1% f) Agua; Rojos g) quitosano 1% + cera de abeja
0.1% h) quitosano 1% + cera de abeja 0.1% + aceite esencial de limón 0.1% i) Agua.
91
Cuadro 12. Efecto de diferentes cubiertas a base de quitosano en frutos de jitomate
con tres estados de madurez inoculados con Escherichia coli DH5α y almacenados a
dos temperaturas a nivel semicomercial.
Cubiertas
Estados de Madurez
Veteado Naranja Rojo
UFC / caja
P <0.001
UFC / caja
P <0.001
UFC / caja
P <0.001
12°C
1. Quitosano 1% +
cera de abaja 0.1%
+ aceite esencial de
limón 0.1%
0*a 0*a 0*a
5. Quitosano 1% +
cera de abeja
0.2 a 0.2 a 0.2 a
Agua 80 b 51 b 288 b
25°C
1. Quitosano 1% +
cera de abeja 0.1%
+ aceite esencial de
limón 0.1%
0 a 0 a 0 a
5. Quitosano 1% +
cera d abeja
0 a 0 a 0 a
Agua 80 b 600 b 448 b
*Medias con la misma letra no presentan diferencias significativas (P < 0.05). Los Valores
de P son en base a una transformación de raíz cuadrada.
92
4. Discusión
De acuerdo con los resultados obtenidos en esta investigación la cera de abeja es un
compuesto que controla el desarrollo de E. coli DH5α. La cera de abeja esta constituida
principalmente por lípidos (lo cual le da excelentes propiedades de barrera), esteres de
ácidos grasos y compuestos no identificados. La cera de abeja presenta un olor muy
parecido a la miel y esto se debe a que tienen algunos compuestos similares como los
flavonoides (All-Waili, 2005).
Los resultados in vitro mostraron que las cubiertas que contenían en su formulación cera de
abeja inhibieron por completo el crecimiento de la bacteria 48 h después de la inoculación,
a diferencia del resto de los tratamientos, así como en los frutos evaluados a nivel de
laboratorio, y semi-comercial los mejores resultados se observaron en aquellos que se
cubrieron con cera de abeja. La primer hipótesis sugiere que el efecto antimicrobiano de la
cera de abeja es debido a que forma una barrera sobre el fruto y esto no permite a la
bacteria tomar los nutrientes necesarios para alimentarse del medio. La cera de abeja esta
constituida principalmente por lípidos (lo cual le da excelentes propiedades de barrera
(Tullok, 1969), además se ha observado que la cera de abeja presenta cristales otorrombios
los cuales proporcionan mejor compactación de los mismos formando asociaciones densas
con un espacio minimo para la difusión de las moléculas (Martin-Polo, 1992; Llanos,
2007), lo cual impidiria en este caso el paso de la bacteria.
La cera de abeja también esta constituida por flavonoides (All-Waili, 2005) y pudieran ser
estos los compuestos que les brinda este efecto antimicrobiano ya que tienen acción contra
bacterias Gram positivas y Gram negativas tales como S. aureus y E. coli (Cowan, 1999;
All-Waili, 2005). Esta bien documentado el modo de acción de los flavonoides contra
patógenos, su uso esta dirigido a matar directamente las células de los microorganismos
(Lopes, 1998) causando alteraciones en la fluidez de la membrana del patógeno (Tsuchiya
et al., 2000) e inhibiendo la energía de su metabolismo (Haraguchi et al., 1998). También
se ha observado que los flavonoides inhiben la síntesis de los ácidos nucleicos. Mori et al.
(1987), demostraron la inhibición del DNA y RNA en presencia de flavonoides así como
una afectación en la síntesis de proteínas y lípidos. Los productos derivados de las abejas
tales como la miel, el propóleo y la jalea real contienen flavonoides como la Quercetina y
93
el Kaempferol (Ayala y Macay, 2010), los cuales para el caso especifico de E. coli DH5α
muestran un efecto bactericida. Ohemeng et al. (1993), encontraron que el DNA es
inhibido por la presencia de estos flavoniodes. Colorado et al. (2007), mostraron que el
kaempferol presentó una concentración mínima inhibitoria de 512μg mL-1 contra E. coli.
Plaper et al. (2003), observaron que la quercetina inhibió la actividad de la enzima
ATPasa, lo cual impide que la bacteria se reproduzca adecuadamente e impide la
formación de las colonias, esto explica porque el crecimiento de las colonia de E. coli
DH5α en todas las evaluaciones fue baja con la presencia de la cera de abeja.
Otros compuestos presentes en la composición de la cera de abeja y a los cuales se les
puede atribuir un efecto antimicrobiano son los esteres de ácidos grasos (Bogdanov, 2004).
Existen investigaciones que han descubierto que los esteres de ácidos grasos presentan
características antibacterianas, principalmene con bacterias Gram-negativas como E. coli
(Otto et al., 2008; Berger-Nell et al., 1989). Se ha evaluado el efecto del ácido
hidroxicarboxilico contra bacterías e incluso hay en el mercado patentes de dicho
compuesto que prometen inhibir el desarrollo del patógeno (Otto et al, 2008). A pesar de
los trabajos mostrados no se conoce el mecanismo de acción de los esteres sobre las
bacterias.
En general las cubiertas adicionadas con ácido oleico no mostraron una inhibición de la
bacteria en ninguno de los experimentos, esto concuerda por lo reportado por Conner y
Kotrola (1995), donde mencionan que estos patógenos son resistentes a los ácidos grasos.
Con respecto a las temperaturas de almacenamiento (10 y 25 °C) no se observó una clara
diferencia en el crecimiento de la bacteria. Algunos microorganismos son sensibles a
temperaturas controladas y eso reduce su desarrollo, sin embargo, no es el caso de la
bacteria en estudio. Varios autores mencionan la sobrevivencia de E. coli a bajas
temperaturas, Castro et al. (2004), almacenaron a E. coli a una temperatura de 4 °C. Abdul-
Raoufy et al. (1993), no obtuvieron disminución significativa en la concentración de la
bacteria cuando se inoculó en carne y se almacenó a 5 °C durante 72 h al igual que
McIngvale et al. (2000), donde conservaron la cepa de dicha bacteria a 5 y 12°C sin
efectos negativos aparentes.
94
5. Conclusiones
La cera de abeja presentó un efecto inhibitorio contra el desarrollo in vitro de la bacteria E.
coli DH5α.
La utilización de cubiertas comestibles de quitosano + cera de abeja y quitosano + cera de
abeja + aceite esencial de limón en frutos de jitomate disminuyeron el desarrollo de E. coli
DH5α.
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103
Capitulo IV
Aplicación de recubrimientos comestibles
en frutos de jitomate y su impacto sobre
los atributos de calidad
104
Aplicación de recubrimientos comestibles en frutos de jitomate y su
impacto sobre los atributos de calidad
Resumen
El jitomate es una de las hortalizas más populares utilizadas en la gastronomía de muchos
países y es muy importante por la derrama económica que genera. En México, es sin duda
la principal hortaliza que se exporta como producto en fresco a países como Estados
Unidos y Canadá, y su calidad es un factor fundamental para que los frutos puedan
comercializarse satisfactoriamente, sin embargo, un inadecuado manejo postcosecha
provoca daños físicos y desordenes fisiológicos. Los criterios de calidad más importantes
que necesita tener el jitomate son color, tamaño, apariencia, sabor y una larga vida de
anaquel. Durante el manejo postcosecha a los frutos se les aplica ceras sintéticas, de origen
mineral y de origen químico así que la tendencia es restringir el uso de estas ceras y buscar
nuevas posibilidades naturales y orgánicas. Los recubrimientos comestibles son una
tecnología que prolonga la vida postcosecha de los productos hortofrutícolas al reducir sus
procesos metabólicos vitales y puede utilizarse para sustituir las ceras sintéticas. El
quitosano, la cera de abeja, ácido oleico y aceite esencial de limón, son compuestos que
pueden utilizarse para formular los recubrimientos y así brindar a los frutos una mayor vida
de anaquel sin modificar sus atributos de calidad. En esta investigación se evaluaro n dos
recubrimientos comestibles uno a base de quitosano 1% + ácido oleico 1% + aceite
esencial de limón 0.1% y el segundo a base de quitosano 1% + cera de abeja 0.1% + aceite
esencial de limón 0.1%, en frutos de jitomate cosechados en dos estados de madurez y
almacenados a temperatura controlada (10 ± 2 °C) y temperatura ambiente (25 ± 2 °C)
durante cuatro semanas. Las variables evaluadas fueron firmeza, SST, pérdida de peso,
color y producción de CO2 y etileno. Los resultados mostraron que los frutos veteados
mostraron firmeza mayor al término del almacenamiento (9.84 N) así como los
almacenados a 10 ± 2 °C (8.59 N), en los SST no hubo diferencias significativas entre los
tratamientos evaluados. La pérdida de peso fue menor en los frutos que se cubrieron con
quitosano 1% + ácido oleico 1% + aceite esencial de limón 0.1% (7.19%) y en los
almacenados a 10 ± 2°C (5.16%). Los frutos tratados con el recubrimiento de quitosano
1% + cera de abeja 0.1% + aceite esencial de limón 0.1% no tuvieron modificaciones en e l
105
desarrollo de color comparado con los frutos del control. Los frutos veteados y los
almacenados a 10 ± 2 °C tuvieron menor respiración (14.32 mL kg-1 h-1 y 14.39 mL kg-1 h-
1, respectivamente) que los frutos cosechados rojos y almacenados a temperatura ambiente
(25 ± 2). Los frutos cosechados en estado de madurez verde produjeron mayor cantidad de
etileno (21.48 μL kg-1 h-1) al final de la evaluación. Los frutos vetados cubiertos con
quitosano 1% + ácido oleico 1% + aceite esencial de limón, y almacenados a temperatura
controlada mantuvieron su calidad alargando su vida postcosecha.
1. Introducción
El jitomate es considerado dentro de las hortalizas más importantes en todo el mundo, por
su alta demanda de consumo, por las divisas que aporta y la elevada derrama economía que
genera (Santiago et al., 1998). Actualmente, México es el país que exporta la mayor
cantidad de toneladas de jitomate en todo el mundo (1,042,730 ton) seguido de España
(938,596 ton) siendo su U.S.A. su principal comprador (FAOSTAT, 2009). Este fruto
puede consumirse en fresco o procesado ya sea en salsa, pasta, puré, jugo, frutas enlatadas
etc. Por lo tanto, la calidad de los frutos de jitomate depende de su destino final. La mayor
parte del jitomate que se comercializa para mercado de exportación es para consumo en
fresco y es cosechado en el estado de madurez fisiológica verde (veteado) y completa su
maduración fuera de la planta. Para mercado local la producción es cosechada en un estado
de madurez naranja o rojo según sea el punto de venta (Zambrano et al., 1995). En ambos
casos de comercialización, la calidad del jitomate se puede ver afectada por inadecuado
manejo postcosecha del fruto ocasionando daños físicos y sometiendo al fruto a cambios
bruscos de temperatura, este último ocasiona un rápido deterioro en la fisiología del fruto,
ya que al ser un fruto climatérico es sensible a cambios de temperatura (Ramírez et al.,
2004), y por lo tanto, hay un incremento significativo en la producción de etileno, evento
que desencadena una serie de reacciones bioquímicas, que origina que el producto llegue
mas rápido a la senescencia (Zambrano et al., 1995).
La calidad del tomate indica que el fruto debe estar bien formado, con color uniforme, de
apariencia lisa sin grietas de crecimiento sin quemadura de sol, daño por insectos o
mecánicos y ser firme al tacto. El manejo postcosecha del jitomate se inicia con el
106
acondicionamiento de la fruta, eliminando todo tipo de material extraño del producto;
posteriormente se selecciona el fruto, esta actividad consiste en separar los frutos aptos
para el consumo de aquellos que no lo son, por presentar heridas, golpes o pudriciones;
después de esta actividad se clasifica el fruto de acuerdo a varias características, tales
como, tamaño, forma y color.
El encerado es una técnica de conservación muy utilizada, con este método se genera una
barrera de protección entre el producto y el medio ambiente para evitar que el fruto respire
de una manera acelerada, y que el proceso de senescencia ocurra a menor velocidad por la
presencia del etileno. El etileno es considerado una fitohormona, debido a su capacidad de
ser fisiológicamente activo en promover cambios en los procesos fisiológicos de los frutos
como la maduración, y esto permite que ocurra la degradación de la pectina y la clorofila y
la transformación de almidon a azucares, se reduce la acidez y se pierde astringencia
(Nieto, 1999; Lers et al., 1998). Además las ceras se utilizan con el propósito de dar mayor
brillo y mejor apariencia al producto para e l consumidor y disminuir la invasión de
patógenos. Las ceras utilizadas durante este proceso son de origen mineral y de origen
químico así que la tendencia es restringir el uso de estas ceras y buscar nuevas
posibilidades naturales y orgánicas (Reina et al., 1998).
Los recubrimientos comestibles son una tecnología desarrollada últimamente para
prolongar la vida postcosecha de los productos hortofrutícolas, que puede utilizarse
sustituyendo el uso de ceras sintéticas. Estos recubrimientos forman una capa
directamente sobre el fruto como una envoltura protectora (del-Valle et al., 2005; Bravin et
al., 2006). El mecanismo por el cual conserva las frutas es debido a que crean una barrera
física a los gases, produciendo una atmósfera modificada alrededor reduc iendo la
disponibilidad de O2 e incrementando la concentración de CO2 (Avena-Bustillos et al.,
1997; González-Aguilar et al., 2005). Geraldine et al. (2008), evaluaron la respiración de
ajos mínimamente procesados en cubiertas a base de agar, quitosano y ácido acético.
Obtuvieron que la tasa de respiración de los ajos tratados, se redujo casi a la mitad (30 mg
CO2 h-1 kg-1) comparada con los ajos que no fueron cubiertos (55 mg CO2 h-1 kg-1). Por
otro lado, Valverde et al. (2005), evaluaron cubiertas de aloe vera sobre uvas y se observó
la disminución de la tasa de respiración (13 mg CO2 h-1 kg-1), comparado con el control (19
mg CO2 h-1 kg-1 ). Así como El Ghaouth et al. (1992a), reportaron una tasa de respiración
107
en frutos de jitomate cubiertos con quitosano de 12 mg CO2 h-1 kg-1, valores menores
comparados con los frutos no cubiertos (17 mg CO2 h-1 kg-1).
Los recubrimientos se elaboran a partir de una gran variedad de proteínas, polisacáridos y
lípidos ya sea como componentes únicos o combinados, con la finalidad de desarrollarlas
con mejores propiedades de barrera y mecánicas (Kester y Fennema, 1986). Un
componente frecuentemente utilizado para cubrir vegetales es el quitosano, este es un
polisacárido que se obtiene del exoesqueleto de crustáceos mediante la desacetilación
parcial de la quitina (Freepons, 1991). El quitosano es un compuesto que presenta
características biofuncionales y puede utilizarse sin problemas para elaborar
recubrimientos comestibles por su alta capacidad de cohesión que le permite formar
películas continuas (González-Aguilar, 2005). Los recubrimientos con quitosano forman
una cubierta en la superficie de los frutos, la cual actúa como una barrera mecánica que
protege al fruto del deterioro causado por enfermedades durante el almacenamiento por
diferentes patógenos (Hernández, 2002; El Gaouth et al., 1992b; Meng et al., 2008;
Sánchez, 2008), además forma una atmosfera modificada sobre el fruto regulando el
intercambio de gases (O2 y CO2) entre el fruto y el exterior, lo que reduce la respiración
(Meng et al., 2008).
Una de las propiedades mas importantes de los lípidos es su hidrofobicidad, y esta
propiedad se debe a principalmente a los ácidos grasos que los contienen. El ácido oleico
es un ácido graso monoinsaturado y es una de las grasas naturales más comunes (Murray et
al., 2001; Stryer et al., 2003; Murphy, 2005). Se encuentra presente en muchos alimentos
tales como el aceite de oliva, aguacate, semillas de girasol etc., cuya utilidad ha sido
brindar beneficios en el sistema sanguíneo reduciendo el riesgo de sufrir enfermedades
cardiovasculares. Además, se ha utilizado para controlar algunos hongos y bacterias
patógenas como es el caso de Aspergillus niger, Zigorhynchus sp y Sthaphylococcus
aureus (Hellgren y Vicent, 1972; Greenway, D. and Dyke, K. 1979; Tantaoui-Elaraki and
Errifi, 1994).
Tanto el ácido oleico como la cera de abeja son utilizados para la elaboración de
recubrimientos, son compuestos lipídicos que además de proporcionar brillo, presentan
excelentes propiedades de barrera al vapor de agua, reduciendo la transpiración y la
deshidratación gracias a sus características hidrofóbicas, sin embargo, presentan poca
108
capacidad para formar recubrimientos debido a que carecen de una integridad estructural
en su forma libre, es por ello que requieren de una matriz estructural de proteína o
polisacárido (Pastor, 2010).
El objetivo de este trabajo fue evaluar el efecto de dos recubrimientos, el primero a base
de quitosano 1% +ácido oleico 1% + aceite esencial de limón 0.1% y el segundo a base
de quitosano 1% + cera de abeja 0.1% +aceite esencial de limón 0.1%, sobre atributos de
calidad y su respuesta fisiológica.
2. Materiales y métodos
Los frutos evaluados fueron de la variedad 'Cuauhtémoc'. La obtención de los frutos e
índice de madurez, se ha explicado en el capitulo II inciso 2.2.
2.1 Formulación del recubrimiento
Las formulaciones utilizadas para elaborar los recubrimientos fueron las siguientes: 1)
quitosano 1% + ácido oleico 1% + aceite esencial de limón 0.1% y 2) quitosano 1% + cera
de abeja 0.1% + aceite esencial de limón 0.1%. Ambas formulaciones se disolvieron en
ácido acético al 1% y se utilizó glicerol (0.3%) como plastificante. Los frutos control se
sumergieron en agua corriente.
La elaboración del recubrimiento se detalla en el capitulo II inciso 2.4.
2.2 Aplicación de los recubrimientos sobre frutos de jitomate
Los frutos se lavaron con agua corriente y se sumergieron en hipoclorito de sodio al 3%
durante 10 min, se enjuagaron con agua destilada estéril y se dejaron secar, posteriormente
se sumergieron en las diferentes formulaciones durante 30 s y se dejaron secar, una vez
109
secos se almacenaron a temperatura ambiente (25 ± 2° C) y controlada (10 ± 2° C) (Figura
19).
Figura 19. Lavado en hipoclorito de sodio, b) inmersión en las cubiertas, c) secado, d)
almacenamiento.
2.3 Variables evaluadas
2.3.1 Determinación de firmeza y sólidos solubles totales (SST)
Para determinar la firmeza se utilizó un texturometro Chatillon DFE METEK® con punta
de cono. El fruto se colocó en la platina y se ejerció presión con la ayuda de la palanca
sobre la parte ecuatorial del fruto con epidermis y se evaluó por dos lados del fruto (Figura
20). Los valores de firmeza se registraron en Newtons (N). En el mismo lugar donde se
evalúo la firmeza, se extrajo una gota de jugo del fruto y se depositó sobre el sensor de un
refractómetro (ATAGO N, con escala de 1 - 32%) para determinar la cantidad de sólidos
solubles totales presentes en el jitomate, se realizó una calibración con agua destilada antes
de cada medición.
Figura 20. Evaluación de firmeza en frutos de jitomate en el texturometro
a b d c
110
2.3.2 Pérdida de peso
Los frutos se pesaron cada semana en una balanza CS200 Compact Scale (OHAUS) .El
porcentaje de pérdida de peso (%PP) se determinó mediante la siguiente formula:
%PP= Peso inicial-Peso final/Peso inicial x 100.
2.3.3 Color
El color de los frutos se determinó cada semana con la ayuda de un espectofotómetro X-
rite MD. SP64 que registra los valores de L*, a*, b*. Las mediciones se realizaron en
cuatro lados del fruto de la parte ecuatorial del fruto. Los valores de color se reportaron en
coordenadas Luminosidad (L*), ángulo de matiz (tan-1 b*/a*) y cromaticidad (raíz (a*)2 +
(b*)2).
2.3.4 Evaluación de CO2 y Etileno
Antes de comenzar con las mediciones, se obtuvó el volumen de los frutos evaluados. Se
colocaron tres frutos de jitomate dentro de un frasco de plástico (2000 mL) y se sellaron
(se utilizaron tres frascos por tratamiento), se dejaron los frutos durante dos horas y
después se extrajeron 6 mL de aire de los frascos con una jeringa. El aire obtenido se
inyectó en tubos vacoutainer para su posterior evaluación en un cromatografo de gases
(Varian Star 3400 CX, EE. UU.) equipado con detectores de conductividad térmica (TCD)
para la medición de CO2 y de ionización flama (FID) para evaluar el etileno. El gas
acarreador fue el helio.
La tasa de respiración y producción de etileno fueron calculadas de acuerdo a la siguiente
formula:
Dióxido de carbono
111
Etileno
2.4 Análisis Estadístico
El arreglo de los experimentos fue completamente al azar, y se realizó un análisis de
varianza con un arreglo de los datos factorial. Para las variables destructivas se utilizaron
seis frutos por semana, mientras que para las variables no destructivas se utilizaron nueve
frutos por tratamiento. Se utilizó un paquete estadístico de SAS.
3. Resultados
3.1 Evaluación de la firmeza, SST y pérdida de peso en jitomates tratados
con recubrimientos comestibles
Con respecto a la firmeza en los estados de madurez, se observó que los frutos veteados
mantuvieron mayores valores que los frutos maduros durante toda la evaluación. (Cuadro
13). Los frutos almacenados a 10 ± 2 °C tuvieron una firmeza mayor comparada con los
almacenados en temperatura ambiente (6.95 N y 1.98 N, respectivamente). Entre las
cubiertas aplicadas y el control, no se observaron diferencias estadísticas en las últimas
dos semanas de almacenamiento.
La interacción estado de madurez y temperatura de almacenamiento fue altamente
significativa (P ≤ 0.0001) en la primer y segunda semana, mientras que en la semana tres
solo fue significativa (P ≤ 0.01). En el resto de las interacciones individuales (EM * C y C
* T), así como en la interacción de los factores tres factores estados de madurez, cubiertas
aplicadas y temperaturas de almacenamiento, no se detectaron diferencias significativas
durante el almacenamiento.
112
Cuadro 13.Valores de firmeza de frutos de jitomates tratados con recubrimientos a
base de quitosano adicionados con compuestos antimicrobianos y almacenados
durante 3 semanas.
*,**,***,NS; 0.05, 0.001, 0.0001, No significativo
Los frutos rojos tuvieron un contenido de SST significativamente mayor (P ≤ 0.05) durante
las semanas 0, 1 y 2 (5.05%, 4.96% y 5.05%, respectivamente) comparado con los verdes
(4.63%, 4.42% y 4.72%, respectivamente), al final de la evaluación los SST fueron
similares entre los estados de madurez. No se detectó efecto por la cubierta o temperatura
de almacenemiento (Cuadro 14).
FACTOR SEMANAS DE ALMACENAMIENTO
Nivel 0 1
FIRMEZA (N)
2
3
ESTADO DE MADUREZ (EM)
Verde 14.51 a 7.33 a 12.09 a 9.84 a
Maduro 8.69 b 4.61 b 8.75 b 5.37 b DMSH 1.26 0.65 1.18 1.14
CUBIERTAS (C) Quitosano 1% + ácido oleico 1%
+ aceite esencial de limón 0.1%
11.30a 11.07 b 10.8 a 8.40 a
Quitosano 1% + cera de abeja
0.1% + aceite esencial de limón 0.1%
11.23 a 10.79 a 10.24 a 7.47 a
Control (Agua) 11.27 a 11.0 b 10.21 a 6.95 a DMSH 1.85 0.96 1.74 1.68
TEMPERATURA (T)
10±2 °C 11.53 a 6.97 a 12.4 a 8.59 a 25±2 °C 11.68 a 4.97 b 8.43 b 6.63 b DMSH
INTERACCIONES
1.26 0.65 1.18 1.14
EM * C NS NS NS NS
EM * T NS *** *** * C * T NS NS NS NS EM * C * T NS NS NS NS
C.V. 23.04 23.23 24.13 31.89
113
No se detectaron diferencias entre las interacciones simples y triple (Cuadro 14).
Cuadro 14. Valores de SST de frutos de jitomates tratados con recubrimientos a base
de quitosano adicionados con compuestos antimicrobianos y almacenados durante 3
semanas.
*,**,***,NS; 0.05, 0.001, 0.0001, No significativo
FACTOR SEMANAS DE ALMACENAMIENTO
Nivel 0 1
SST (%) 2 3
ESTADO DE MADUREZ (EM)
Verde 4.63 b 4.42 b 4.72 b 4.70 a Maduro 5.05 a 4.96 a 5.05 a 4.81 a
DMSH 0.13 0.19 0.21 0.25
CUBIERTAS (C)
Quitosano 1% + ácido oleico 1% + aceite esencial de limón 0.1%
4.85 a 4.80 a 4.87 a 4.82 a
Quitosano 1% + cera de abeja 0.1% + aceite esencial de limón 0.1%
4.88 a 4.62 a 4.88 a 4.8 a
Control (Agua) 4.79 a 4.66 a 4.80 a 4.65 a
DMSH 0.20 0.28 0.31 0.36
TEMPERATURA (T)
10±2 °C 4.81 a 4.66 a 4.97 a 4.67 a 25±2 °C 4.87 a 4.72 a 4.8 a 4.84 a
DMSH
INTERACCIONES
0.13 0.19 0.21 0.25
EM * C * NS NS NS
EM * T NS NS NS NS C * T NS NS NS NS
EM * C * T NS NS NS NS
C.V. 5.99 8.61 9.21 11.18
114
Con respecto al porcentaje de pérdida de peso, en la primera semana los frutos veteados
mostraron menor velocidad de pérdida de peso (2.17%) que los frutos maduros (2.52%)
(Cuadro 15). Sin embargo, el resto del almacenamiento no se observaron diferencias
significativas entre los dos estados de madurez evaluados. Se detectaron observar
diferencias estadísticas (P≤ 0.05) en las cubiertas evaluadas. Los frutos cubiertos con
quitosano 1% +ácido oleico 1% +aceite esencial de limón 0.1% mostraron pérdida de peso
menor durante las tres primeras semanas de almacenamiento (1.89%, 4.67% y 7.19%,
respectivamente), comparado con los frutos tratados con la cubierta de quitosano 1% +
cera de abeja 0.1% + aceite esencial de limón 0.1% y los frutos control (2.77%, 5.93% y
8.93%) Los frutos que se almacenaron a 10 ± 2ºC (0.97%, 3.41% y 5.16%) tuvieron menos
peso que los almacenados a 25 ± 2 ºC (3.76%, 8.18% y 12.26%) durante todo el tiempo de
almacenamiento.
La interacción estado de madurez y temperatura de almacenamiento fue altamente
significativa (P ≤ 0.0001) en la primer semana. En el resto de las interacciones no se
observaron diferencias significativas.
115
Cuadro 15. Porcentaje de pérdida de peso de frutos de jitomates tratados con
recubrimientos a base de quitosano adicionados con compuestos antimicrobianos y
almacenados durante 3 semanas.
*,**,***,NS; 0.05, 0.001, 0.0001, No significativo
FACTOR SEMANAS DE ALMACENAMIENTO
Nivel 0 1
PÉRDIDA DE PESO
(%)
2 3
ESTADO DE MADUREZ (EM)
Verde - 2.17 b 5.97 a 8.75 a
Maduro - 2.52a 5.51 a 8.51 a DMSH - 0.308 0.50 0.69
CUBIERTAS (C) Quitosano 1% + ácido oleico 1%
+ aceite esencial de limón 0.1%
- 1.89 b 4.67 b 7.19 b
Quitosano 1% + cera de abeja
0.1% + aceite esencial de limón 0.1%
- 2.39a 6.57 a 9.69 a
Control (Agua) - 2.77 a 5.93 a 8.93 a DMSH - 0.45 0.74 1.01
TEMPERATURA (T) 10±2 °C - 0.97 b 3.41 b 5.16 b
25±2 °C - 3.76 a 8.18 a 12.26 a DMSH - 0.30 0.50 0.69
INTERACCIONES
EM * C
-
EM * T - *** NS NS
C * T - NS NS NS EM * C * T - NS NS NS
C.V. - 30.27 20.59 18.61
116
3.2 Evaluación de color en frutos de jitomate tratados con recubrimientos
comestibles
Los frutos cosechados veteados, mostraron luminosidad (P≤ 0.05) mayor durante las tres
semanas de almacenamiento (41.07, 40.30 y 41.48) comparado con los frutos maduros
(35.29, 38.09 y 38.52). Los frutos con las cubiertas evaluadas, mostraron diferencias en la
primer semana de almacenamiento; donde la cubierta de quitosano 1% + ácido oleico 1%
+aceite esencial de limón 0.1%, mostró una luminosidad significativamente (P≤ 0.05)
mayor (40.1) comparada con la cubierta de quitosano (1%) + cera de abeja (0.1%) + aceite
esencial de limón (0.1%) + glicerol (0.3%) + ácido acético 1% (98.5%) (37.8) y el control
(36.39). En la semana dos y tres no se observaron diferencias significativas entre las
cubiertas evaluadas incluyendo el control. El factor temperatura influyó durante el
almacenamiento. En las semana uno y dos, los frutos almacenados a 25 ± 2 ºC tuvieron un
valor de luminosidad mas alto (38.9 y 41.05, respectivamente) que los almacenados a 10 ±
2 ºC (37.3 y 37.34, respectivamente), mientras que en la última semana de almacenamiento
los frutos que se encontraban a 10 ± 2 ºC tuvieron los valores mayores (Cuadro 16).
El efecto de la interacción estado de madurez y cubiertas aplicadas no fue significativa, sin
embargo, la interacción estado de madurez y temperatura de alacenamiento fue altamente
significativo (P≤ 0.0001) hasta la semana 2. Con respecto a la interacción cubiertas
aplicadas y temperatura de almacenamiento se observaron diferencias altamente
significativas (P≤ 0.001) en la última semana de almacenamiento. La interacción estado
de madurez, cubiertas y temperatura fue significativa (P≤ 0.001) durante las primeras tres
semanas de almacenamiento (Cuadro16).
117
Cuadro 16. Valores de luminosidad (L*) de frutos de jitomates tratados con
recubrimientos a base de quitosano adicionados con compuestos antimicrobianos y
almacenados durante 3 semanas.
*,**,***,NS; 0.05, 0.001, 0.0001, No significativo
FACTOR SEMANA
Nivel 0 1
LUMINOSIDAD
(L*)
2 3
ESTADO DE MADUREZ
(EM)
Verde 41.02 a 41.07 a 40.30 a 41.48 a Maduro 36.03 b 35.29 b 38.09 b 38.52 b
DMSH 1.29 1.29 0.74 0.799
CUBIERTAS (C)
Quitosano 1% + ácido oleico 1% + aceite esencial de limón
0.1%
40.1 a 40.1 a 39.65 a 40.84 a
Quitosano 1% + cera de abeja
0.1% + aceite esencial de limón 0.1%
37.5 b 37.8 b 39.28 a 40.55 a
Control (Agua) 37.8 b 36.39 b 38.66 a 38.64 a DMSH 1.9 1.89 1.1 1.1738
TEMPERATURA (T) 10 °C 35.49 b 37.3 b 37.34 b 41.43 a
25 °C 41.56 a 38.9 a 41.05 a 38.61 b DMSH
INTERACCIONES
1.29 1.29 0.74 0.799
EM * C NS NS NS NS
EM * T *** *** *** NS C * T NS NS NS ** EM * C * T ** NS * ***
C.V. 8.82 8.82 5.00 5.20
118
La cromaticidad (C*) no mostró diferencias en la semana 0 y 1 en los dos estados de
madurez evaluados. En la semana dos los frutos maduros mostraron diferencias estadísticas
(P≤ 0.05) comparados con los verdes (35.91 y 31.19, respectivamente, sin embargo al
término del almacenamiento los frutos veteados fueron los que mostraron valores mayores
de cromaticidad (36.04), comparados con los maduros (33.47). Los frutos cubiertos con
quitosano 1% + ácido oleico 1% + aceite esencial de limón 0.1% tuvo valores mayores de
cromaticidad en la semana 0 y 1 (34.33 y 34.88, respectivamente) a diferencia de la
cubierta de quitosano 1%) + cera de abeja 0.1% + aceite esencial de limón 0.1% (30.88 y
32.53, respectivamente) y el agua (32.62 y 33.68). Con respecto a la temperatura de
almacenamiento hubo diferencias estadísticas (P≤ 0.05), en la semana 0 y 1, ya que los
frutos almacenados a 25 ± 2 ºC, mostraron valores mayores de C* (34.42 y 34.42,
respectivamente) comparado con los almacenados a 10 ± 2 ºC (30.80 y 32.96) (Cuadro 17).
Existio poca interacción entre los factores evaluadod, solo en la interacción estados de
madurez y temperatura (P≤ 0.0001), en la semana 0 de almacenamiento y la interacción de
cubiertas y la tempratura fue significativa (P≤ 0.01) en la semana 0 y 2.
119
Cuadro 17. Valores de cromaticidad (C*) de frutos de jitomate tratados con
recubrimientos a base de quitosano adicionados con compuestos antimicrobianos y
almacenados durante 3 semanas.
*,**,***,NS; 0.05, 0.001, 0.0001, No significativo
FACTOR SEMANAS DE ALMACENAMIENTO Nivel 0 1
CROMATICIDAD (C*)
2 3
ESTADO DE MADUREZ
(EM)
Verde 32.74 a 34.07 a 31.19 b 36.04 a
Maduro 32.49 a 33.33 a 35.91 a 33.47 b DMSH 1.21 1.17 1.25 1.42
CUBIERTAS (C) Quitosano 1% + ácido oleico
1% + aceite esencial de limón 0.1%
34.33 a 34.88 a 35.63 a 34.70 a
Quitosano 1% + cera de abeja 0.1% + aceite esencial de limón
0.1%
30.88 b 32.53 b 37.29 a 35.22 a
Control (Agua) 32.62 b 33.68 ab 36.72 a 34.33 a
DMSH 1.77 1.72 1.84 2.09
TEMPERATURA (T) 10±2 °C 30.80 b 32.96 b 36.90 a 35.80 a 25±2 °C 34.42 a 34.42 a 36.20 a 33.70 b
DMSH
INTERACCIONES
1.21 1.17 1.25 1.42
EM * C NS NS NS NS EM * T *** NS NS NS C * T * NS * NS
EM * C * T NS NS NS NS
C.V. 9.72 9.09 8.99 10.73
120
En los datos de ángulo matiz (H*), se observaron diferencias significativas (P≤ 0.05),
durante el almacenamiento. Los frutos cosechados verdes tuvieron un valor de H* mayor
que los maduros desde la semana 0 hasta la 3 (57.19, 53.72, 50.66 y 45.98,
respectivamente) es decir mayor tendencia al verde o amarilo. Los frutos tratados, tanto
con la cubierta de quitosano 1% + ácido oleico 1% + aceite esencial de limón, así como la
de quitosano 1% + cera de abeja 1% + aceite esencial de limón 0.1%, no mostraron
diferencias estadísticas (P≤ 0.05), entre ellas durante todo el almacenamiento; sin embargo,
los frutos testigo mostraron siempre los valores menores. Con respecto a la temperatura de
almacenamiento en la semana 1 y 2, los frutos almacenados a 10 ± 2 ºC tuvieron valores de
H* mayores que los que se almacenaron a temperatura ambiente, si embargo, en la última
semana de almacenamiento no hubo diferencias entre las dos temperaturas (Cuadro 18).
La interacción entre estados de madurez y cubiertas fue significativa la semana 0, 1 y 2. La
interacción cubiertas y temperatura fue significativa durante todo el almacenamiento. La
interacción de los factores estados de madurez, cubiertas y temperatura fue significativa la
semana 1 y 2.
121
Cuadro 18. Valores de matiz (H*) de frutos de jitomates tratados con recubrimientos
a base de quitosano adicionados con compuestos antimicrobianos y almacenados
durante 3 semanas.
*,**,***,NS; 0.05, 0.001, 0.0001, No significativo
FACTOR SEMANAS DE ALMACENAMENTO
Nivel 0 1
ÁNGULO
MATIZ (º)
2 3
ESTADO DE MADUREZ (EM)
Verde 57.19 a 53.72 a 50.66 a 45.98 a Maduro 48.44 b 45.62 b 37.49 b 41.88 b
DMSH 1.95 1.72 1.47 1.41 CUBIERTAS (C)
Quitosano 1% + ácido oleico 1% + aceite esencial de limón 0.1%
54.45 a 51.47 a 48.63 a 45.81 a
Quitosano 1% + cera de abeja 0.1% + aceite esencial de limón
0.1%
52.46 ab 51.19 a 48.65 a 43.88 ab
Agua 51.53 b 46.14 b 34.93 b 42.09 b DMSH 2.86 2.53 2.16 2.07
TEMPERATURA (T)
10 °C 51.28 b 51.09 a 49.12 a 44.03 a
25 °C 54.34 a 48.21 b 39.03 b 43.82 a DMSH
INTERACCIONES
1.95 1.72 1.47 1.41
EM * C * * *** NS
EM * T NS NS *** NS C * T * *** *** ** EM * C * T NS ** *** NS
C.V. 9.67 9.04 8.74 8.42
122
3.3 Evaluación de la producción de CO2 y etileno en frutos de jitomate
tratados con recubrimientos comestibles
Al inicio de la evaluación, la producción de CO2 fue significativamente mayor (P≤ 0.05),
en los frutos cosechados en estado verde (22.01 mg kg-1 h-1) que en el rojo (20.57 mg kg-1
h-1). El mismo patrón se observó la siguiente semana. En la semana tres no se observaron
diferencias estadísticas entre los dos estados de madurez. Sin embargo, en la ultima
semana los frutos rojos fueron los que produjeron mayor contenido de CO2 (16.05 mg kg-1
h-1) a diferencia de los verdes (14.32 mg kg-1 h-1) (Cuadro 19). Con respecto a los frutos
tratados con cubiertas, no se observaron diferencias estadísticas.
Durante las dos primeras semanas los frutos almacenados a 10 ± 2 ºC produjeron mayor
contenido de CO2 (22.14 mg kg-1 h-1y 16.87 mg kg-1 h-1, respectivamente) que los
almacenados a 25 ± 2 ºC (20.57 mg kg-1 h-1 y 15.50 mg kg-1 h-1, respectivamente). En la
semana tres no hubo diferencias significativas. En la semana cuatro los frutos almacenados
a 25 ± 2 ºC tuvieron mayor producción de CO2 (16.19 mg kg-1 h-1) que los almacenados a
10 ± 2 ºC (14.39 mg kg-1 h-1)
Las interacciones estados de madurez y cubiertas, estados de madurez y temperatura, y
cubiertas y temperatura de almacenamiento fueron significativas la semana 1 de
almacenamiento (Cuadro 19).
Con respecto a las evaluaciones de la produción de etileno, durante las tres primeras
semanas de almacenamiento de los frutos no se observaron diferencias estadísticas entre
los estados de madurez evaluados. En la cuarta semana se observó que los frutos
cosechados en un estado de madurez rojo tuvieron un contenido de etileno mayor (25.28
μL kg-1 h-1) que los frutos verdes (21.48 μL kg-1 h-1) (Cuadro 20). En la primera y segunda
semana los frutos que fueron lavados con agua tuvieron valores de etileno mas altos
(32.31, 25.55, respectivamente) que los tratados con la cubierta de quitosano 1% + ácido
oleico 1% + aceite esencial de limón 0.1% (24.26 y 23.06, respectivamente) y la cubierta
123
de quitosano 1% + cera de abeja 0.1% + aceite esencial de limón 0.1% (25.27 y 21.65,
respectivamente). Sin embargo, durante las siguientes dos semanas no se observaron
diferencias estadísticas entre los tratamientos evaluados. Con respecto a las temperaturas
evaluadas no se observaron diferencias significativas durante todo el almacenamiento de
los frutos.
La interacción estados de madurez y cubiertas fue significativa solo la semana 2, mientras
que la interacción estados de madurez y temperatura de almacenamiento fue significativa
la semana 1 y 2. El resto de las interacciones no fueron significativas.
124
Cuadro 19. Valores de CO2 de frutos de jitomates tratados con recubrimientos a base
de quitosano adicionados con compuestos antimicrobianos y almacenados durante 3
semanas.
*,**,***,NS; 0.05, 0.001, 0.0001, No significativo
FACTOR SEMANAS DE ALMACENAMIENTO
Nivel 0 1
PRODUCCIÓN
DE CO2
(mL kg-1 h-1)
2 3
ESTADO DE MADUREZ (EM)
Verde 22.01 a 17.36 a 18.68 a 14.32 b Maduro 20.57 b 15 b 17.87 a 16.05 a
DMSH 1.12 1.25 1.25 1.44
CUBIERTAS (C) Quitosano 1% + ácido oleico 1% + aceite esencial de limón 0.1%
21.77 a 16.52 a 20.45 a 16.43 a
Quitosano 1% + cera de abeja
0.1% + aceite esencial de limón 0.1%
20.31 a 16.07 a 17.63 a 15.03 a
Agua 21.80 a 15.96 a 16.74 a 14.45 a DMSH 1.66 1.86 5.54 2.14
TEMPERATURA (T) 10±2 °C 22.14 a 16.87 a 16.54 a 14.39 b
25±2 °C 20.44 b 15.50 b 20.01 a 16.19 a DMSH
INTERACCIONES
1.12 1.25 3.74 1.44
EM * C NS * NS NS EM * T NS *** NS NS
C * T NS NS NS NS EM * C * T NS * NS NS
C.V. 7.66 11.27 29.77 13.28
125
Cuadro 20. Valores de etileno de frutos de jitomates tratados con recubrimientos a
base de quitosano adicionados con compuestos antimicrobianos y almacenados
durante 3 semanas.
*,**,***,NS; 0.05, 0.001, 0.0001, No significativo
FACTOR SEMANAS DE ALMACENAMIENTO
Nivel 0 1
PRODUCCIÓN
DE ETILENO μL kg-1 h-1
2 3
ESTADO DE MADUREZ (EM)
Verde 26.71 a 24.49 a 24.59 a 21.48 b
Maduro 27.85 a 22.35 a 26.77 a 25.28 a DMSH 2.77 2.45 3.89 2.58
CUBIERTAS (C) Quitosano 1% + ácido oleico 1%
+ aceite esencial de limón 0.1%
24.26 b 23.06 ab 25.63 a 23.18 a
Quitosano 1% + cera de abeja 0.1% + aceite esencial de limón 0.1%
25.27 b 21.65 b 26.49 a 24.19 a
Agua 32.31 a 25.55 a 24.92 a 25.05 a
DMSH 4.1 6.63 5.77 3.83
TEMPERATURA (T)
10±2 °C 26.10 a 25.59 a 25.32 a 23.04 a 25±2 °C 28.47 a 21.25 b 26.04 a 23.99 a
DMSH
INTERACCIONES
2.77 2.45 3.89 2.58
EM * C NS NS * NS
EM * T NS ** *** NS C * T NS NS NS NS
EM * C * T NS NS NS NS
C.V. 7.66 11.27 29.77 13.28
126
4. Discusión
La firmeza es el factor más importante para determinar la calidad del jitomate la cual está
estrechamente ligada al estado de madurez. Los resultados mostraron que los frutos en el
estado de madurez verde tuvieron una firmeza mayor (9.84) al término del
almacenamiento, esto concuerda con lo reportado con Davis y Gartner (1994), donde
mencionan que los frutos cosechados en estado de madurez verde, son mas firmes al
término del almacenamiento. Según lo reportado por González et al. (2005), la firmeza de
los frutos va disminuyendo cuando pasa del color verde al rojo y esta disminución es la
consecuencia de la maduración del fruto, durante este proceso se incrementa la actividad
de la enzima poligalacturonasa sobre las pectinas y paredes celulares, provocando el
ablandamiento del tejido. En los frutos que fueron almacenados a 10 ± 2°C, también se
observó una mayor (8.59 N) firmeza al término de la evaluación, coincidiendo con los
experimentos reportados por Ramírez et al. (2004), quienes demostraron que frutos
almacenados a temperaturas bajas (9 ºC) conservaron una mayor firmeza (5.5 kg cm-2)que
los almacenados a temperatura ambiente (27 ºC). La firmeza también se ve afectada por la
transpiración, razón por la cual el fruto pierde agua y por lo tanto pierde turgencia y
firmeza (Navarro, 2010).
En esta investigación la aplicación de las cubiertas de quitosano 1% +ácido oleico 1% +
aceite esencial de limón 0.1% y, de quitosano 1% + cera de abeja 0.1% + aceite esencial
de limón 0.1% no influyeron en la firmeza de los frutos al término del almacenamiento, a
diferencia de los reportado por Hernández-Muños et al. (2006), los cuales reportaron que
frutos tratados con cubiertas de quitosano (1%) y ácido acético, tuvieron una firmeza
mayor (1.5 N) al término del almacenamiento que el control (1N). Otros investigadores
como Chien et al. (2007), probaron cubiertas de quitosano (0.2%) y ácido acético sobre la
firmeza de frutos de mandarina y mostraron que la firmeza fue mayor (269 g) en las
mandarinas cubiertas a diferencia del control (136 g). Coinciden con lo anterior
Hewajulige et al. (2007) reportando que la firmeza de frutos de papaya cubierta con
quitosano al 1% fue más alta (2.93 N) que los frutos no tratados. Ali et al. (2001), del
mismo modo en experimentos de papaya, mostraron que los frutos tratados con quitosano
127
al 1% tuvieron una mayor firmeza (80 N), mientras que el control tuvo una firmeza menor
de 20 N.
Es común encontrar que durante la maduración de los frutos de jitomate su contenido de
azúcar aumenta progresivamente y esto comienza a partir de que los frutos presentan un
estado de madurez “Breaker” (aparición de de los primeros pigmentos amarillos). Los
azúcares mas frecuentes son fructuosa (25%) y glucosa (22%), así como los ácidos
orgánicos cítrico (9%) y málico (4%) (Young et al., 1993). Sin embargo, no todos los
cultivares de jitomate se comportan igual. Alvino et al. (1998), en frutos de jitomate
cosechados en tres diferentes estados de madurez no tuvieron ninguna variación en el
contenido de SST, por lo que probablemente el contenido de SST depende principalmente
de la variedad de jitomate evaluada. Al revisar nuestros resultados, se observó que no hubo
una clara variación en los SST de los frutos verdes y rojos de la variedad 'Cuauhtémoc',
desde el corte hasta el final del almacenamiento. Misma situación se ha reportado en otras
variedades tales como 'Sofía' y 'Bravona' donde no hubo variación en los SST desde el
estado verde hasta su maduración (Casierra-Posada y Aguilar-Avendaño, 2008). Con
respecto a la aplicación de cubiertas en los frutos, no se observaron diferencias en el
contenido de de SST, comparado con los frutos no tratados.
El porcentaje de pérdida de peso en los frutos, fue menor en los que se almacenaron a 10
°C, esto es similar a los resultados obtenidos por Navarro (2010) y De Castro et al. (2006),
los cuales mencionaron que la pérdida de peso fue menor en frutos de jitomate
almacenados a 10 °C y 13 °C, que en los almacenados a temperatura ambiente (24 °C) y
esta pérdida de peso menor puede deberse a que a menor temperatura se presenta menor
déficit de presión de vapor entre el aire de los espacios intercelulares del fruto y el aire del
entorno lo que reduce la transpiración y la pérdida de peso del fruto (Navarro, 2010). En
nuestra investigación los frutos tratados con la cubierta de quitosano 1% + ácido oleico 1%
+ aceite esencial de limón 0.1%, disminuyeron en mayor proporción la pérdida de peso en
los frutos de jitomate comparado con el resto de los tratamientos, lo cual pudo deberse al
efecto del ácido oleico. El ácido oleico es un ácido graso que posee características
hidrofóbicas que le permiten mantener la humedad debido a que impide la transpiración
acelerada de los frutos disminuyendo su pérdida de peso (Murphy, 2005).
128
Con respecto al color las coordenadas CIE L*C*H* registradas con el espectofotometro se
mostró que los frutos cubiertos con quitosano 1% + cera de abeja 0.1% + aceite esencial de
limón 0.1% tuvieron valores estadísticamente similares en todos los ángulos de colo r que
el control, mientras que la cubierta de quitosano 1% + ácido oleico 1% + aceite esencial de
limón 0.1% solo en los valores de luminosidad (claridad ó brillo) y la cromaticidad (tono
de color que presenta fruto) fue igual que los frutos que no se cubrieron, el ángulo matiz a
pesar de ser estadísticamente diferente al resto de los tratamientos, se mantuvo en un
ángulo de 45.81º, muy cerca de la otra cubierta (43.88º) y el control (42.09º). El tono de
color rojo corresponde a un ángulo de matiz de aproximadamente de 45º (Boscarol, 2007),
por lo tanto no se observaron diferencias visibles entre los tratamientos evaluados. El
Ghaout et al. (1992a), mostraron que frutos cubiertos con quitosano al 1% no maduraron
de manera similar al control, los frutos cubiertos tuvieron un índice de color de 4 (dos
terceras partes de rojo) al término del almacenamiento, a diferencia de los frutos que no
fueron tratados los cuales tuvieron un índice de 6 (rojo). En frutos de fresas, al aplicar
cubiertas con quitosano y ácido acético, la luminosidad de los frutos al término del
almacenamiento disminuyó (26), por lo tanto los frutos se mostraron más opacos que el
control (31), sin embargo en la cromaticidad y ángulo matíz, no se observaron diferencias
(Hernández-Muños et al., 2006). Chien et al. (2007), a diferencia de lo anterior, mostraron
que la luminosidad en mangos aumentó al aplicar cubiertas de quitosano (61.37) a
diferencia del control que fue de (56.54).
La respiración es un proceso vital mediante el cual las reservas orgánicas tales como
carbohidratos, proteínas o grasas, se degradan a productos finales simples, las reservas que
mantienen vivo al producto se van agotando y dan lugar a una transformación de sabor
(Wills et al., 1998 ). En general, en esta investigación, en la primera semana los frutos
mostraron un contenido de CO2 mayor que el resto de las semanas evaluadas, y esto puede
atribuirse a que los frutos después de la cosecha fueron transportados en temperaturas altas
y estas condiciones aceleraron su proceso de respiración, además el incremento de CO2 se
asocia a la respuesta del fruto a la herida, la cual hace más intenso el proceso de
maduración (Ramírez et al., 2004; Mencarelli et al., 1988).
129
Los frutos rojos tratados con ambas cubiertas presentaron una mayor producción de CO2
(16.05 mL kg-1 h-1) al término del almacenamiento (semana 4) que los verdes (14.32 mL
kg-1 h-1). A diferencia de lo anterior Calegario et al. (2001), al realizar evaluaciones en
frutos de jitomate var. “Santa Clara”, obtuvieron valores de CO2 mayores en frutos verdes
(90 mg kg-1 h-1) comparados con los frutos rojos (120 mg kg-1 h-1 ) al término de la
evaluación , al igual que Suslow y Cantwell (2000), el cual obtuvo un incremento de CO2
en frutos verdes (18-26 mL kg-1 h-1) comparado con frutos rojos (15-26 mL kg-1 h-1)
almacenados a 25º C. Salgado (2011), por su parte obtiene datos similares, en frutos verdes
donde se observó mayor contenido de CO2 (55 mL kg-1 h-1)comparado con los rojos (21
mL kg-1 h-1). Los frutos almacenados a 25 °C tuvieron una producción de CO2 mayor al
término del almacenamiento que los almacenados a 10 °C. El jitomate se considera un
fruto de producción moderada de CO2, cuando se almacena a bajas temperaturas produce
entre 10 y 20 mL kg-1 h-1, según lo reportado por Kader (1992) y de 15 a 26 mL kg-1 h-
1cuando se almacena a temperatura ambiente (Suslow, 2000).
El metabolismo de maduración en los frutos de jitomate es un proceso climatérico que
involucra principalmente al etileno (Ramírez et al., 2004). En el presente estudio la mayor
producción de etileno se registró al inicio de la evaluación, en las temperaturas de
almacenamiento de 10 ± 2 y 25 ± 2 ºC se registró una producción de etileno de 26.10 μL
kg-1 h-1 y 28.47 μL kg-1 h-1, respectivamente. Datos similares reporta Artés et al. (1999),
donde mostraron una mayor producción de etileno (35 pmol kg-1 h) el primer día de
almacenamiento en jitomates var. 'Durinta' almacenados a 10 ºC. Así como Ding y Yi
Wang (2003), reportaron una mayor producción de etileno (9 ng g-1 h-1) el primer día de
almacenamiento en frutos de jitomate cv 'Sun Bright' almacenados a 20 ºC. En este
investigación con respecto a la producción de etileno, no se observaron diferencias entre
las dos temperaturas de almacenamiento al final de la evaluación, a diferencia de lo
reportado por McDonald et al. (1999), donde mostraron una incremento en la producción
de etileno en frutos cv 'Sunbeam' cuando se almacenaron a 20 ºC (4.2 nL g-1 h-1) a
diferencia de los almacenados a 2 ºC (3.2 nL g-1 h-1). Ramírez et al. (2004) de igual forma
reporta un incremento de etileno en frutos que se almacenaron a 27 ºC (8.5 nl g-1 h-1)
comparado con los almacenados a 9 ºC. Los frutos cosechados en estado de madurez rojo
mostraron al final del almacenamiento un aumento en la producción de etileno de 25.28 μL
130
kg-1 h-1 comparado con los frutos cosechados en estado de madurez verde (21.48 μL kg-1 h-
1). Esto concuerda con lo reportado por Wills et al. (1998), donde describen que frutos
maduros producen más etileno que otros estados de madurez. A diferencia de lo anterior
Ding y Yi Wang (2003), reportaron que los frutos de jitomate cosechados en estado verdes
produjeron mayor contenido de etileno (7 ng g-1 h-1) que los maduros (5 ng g-1 h-1).
5. Conclusiones
Los frutos de jitomate cosechados en un estado de madurez verde, cubiertos con
formulaciones de quitosano 1% + ácido oleico + aceite esencial de limón 0.1% y con
quitosano 1% + cera de abeja 0.1% + aceite esencial de limón 0.1% y almacenados a 10 ±
2 °C, mostraron una firmeza mayor al término del almacenamiento que los frutos
cosechados rojos.
Los frutos cubiertos con quitosano 1% + ácido oleico 1% + aceite esencial de limón 0.1%
y almacenados a 10 °C mostraron menor porcentaje de perdida de peso al final de la
evaluación.
Los frutos cubiertos con formulaciones de quitosano 1% + ácido oleico + aceite esencial de
limón 0.1% y con quitosano 1% + cera de abeja 0.1% + aceite esencial de limón 0.1%,
cosechados en un estado de madurez verde tuvieron una menor producción de CO2 y
etileno, comparado con los frutos rojos.
6. Referencias bibliograficas
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137
Capitulo V
Propiedades mecánicas y de
permeabilidad al agua de películas
comestibles elaboradas con quitosano y
adicionadas con compuestos
antimicrobianos.
138
Propiedades mecánicas y de permeabilidad al agua de películas
comestibles elaboradas con quitosano y adicionadas con compuestos
antimicrobianos.
Resumen
Las películas comestibles están dirigidas a mejorar la calidad de los productos comestibles
y a alargar su vida de anaquel, actuando como una barrera física. Pueden estar elaborados a
base de lípidos, proteínas o carbohidratos o una mezcla de ellos. El quitosano es un
polisacárido ampliamente utilizado que proporciona excelentes propiedades mecánicas a
los frutos así como permeabilidad a los gases, sin embargo, sus propiedades de barrera al
agua son pobres, es por eso que surge la necesidad de combinarlo con algunos agentes
lipídicos, para que estos a su vez le briden esta propiedad de barrera a la humedad,
fundamental en una película. En esta investigación se determinaron las propiedades
mecánicas y de barrera al agua en películas a base de quitosano 1% + ácido oleico 1% +
aceite esencial de limón 0.1% y quitosano 1% + cera de abeja 0.1% + aceite esencial de
limón 0.1%. La película de quitosano 1% + ácido oleico 1% + aceite esencial de limón
0.1% mostró una mayor tensión a la fractura (18.6 Mpa) que la película de quitosano 1%
+cera de abeja 0.1% + aceite esencial de limón 0.1% (7.4 Mpa), lo que nos indica que la
primera película presenta mejores propiedades de elasticidad que la segunda, con respecto
a la permeabilidad de vapor de agua
1. Introducción
Las películas o cubiertas comestibles son definidas como un material de que se aplica y se
forma sobre la superficie del fruto, el cual lo protege como una barrera y puede ser
consumido (Del-Valle et al., 2005; Bravin et al., 2006). Han sido usadas para brindarle
mejor apariencia a los productos alimenticios y conservarlos por un periodo más largo de
tiempo (Dalal et al., 1971), gracias a que crean una atmosfera modificada y se reduce la
pérdida de peso en los frutos y vegetales que ocurre durante la transpiración (Hoa et al.,
139
2002). Los materiales que se utilizan para su elaboración son lípidos, proteínas y
polisacáridos solos o combinados (Kester y Fennema, 1986).
Los polisacáridos que se utilizan para formar películas son la celulosa y sus derivados,
dextrinas, almidones, alginatos, pectinas, quitosano, etc. (McHugh et al., 1996; Krochta et
al., 1997). La celulosa y la quitina presentan una insolubilidad en estado natural es por eso
que deben ser tratadas químicamente con otros compuestos para incrementar su solubilidad
en agua (Miranda et al., 2003). Los polisacáridos pueden reducir los niveles internos de O2
y elevar el CO2, permitiendo prolongar la vida de los vegetales cubiertos, además de
conservar su sabor, ácidos, firmeza y color, mejora su apariencia y evitar fermentaciones
(Bosques et al., 2000).
El quitosano es un polímero natural no tóxico, biodegradable y comestible derivado de la
desacetilación parcial de la quitina (Shahidi et al., 1999), se extrae del exoesqueleto de
artrópodos, insecto, cangrejos, camarones y de la pared celular de algunos hongos, t iene
potencial como recubrimiento por su capacidad para formar películas sin el empleo de
aditivos (Suyatma et al., 2004), además presenta propiedades de barrera al oxigeno y
efecto antimicrobiano contra patógenos de frutas y vegetales. Sin embargo, carece de
hidrofobicidad, es por eso que se combinan con lípidos para fortalecer sus propiedades de
barrera al agua y sus propiedades mecánicas (Kester y Fennema, 1986; Baldwin et al.,
1997). El quitosano posee una elevada carga positiva sobre sus grupos aminos cuando se
disuelve en medio acuoso y por lo tanto es capaz de adherirse con los lípidos o grasas
cargados negativamente (Widro et al., 2007). El polisacarido para formar la película se
rompe en segmentos y después se regenera para formar la cadena al inter ior de la película
(Butler et al., 1996). Las formulación de las peliculas necesitan tener compuestos
plastificantes, para que estos intervengan en las uniones entre las cadenas del polímero
reduciendo su cohsión, aumentando así la movilidad entre las las cadenas y por lo tanto la
flexibilidad y elasticidad de las cadenas del `polímero (Banker, 1966).
Generalmente la adición de lípidos en la formulación de las películas mejora las
propiedadaes de barrera al vapor de agua, sin embargo el efecto sobre sus propiedades
140
mecanicas varia con el tipo de hidrocoloide que se combine (Navarro, 2007). Sin embargo
un aumento exesivo de lípidos en la formulación empeora las propiedades mecanicas de las
películas y esto origina películas frágiles (Bravin et al., 2004; Pérez-Gago y Krochta,
2001).
El objetivo de este trabajo fue determinar las propiedades mecánicas y de permeabilidad de
vapor de agua en cubiertas a base de quitosano, ácido oleico/cera de abeja, aceite esencial
de limón y glicerol.
2. Materiales y métodos
2.1 Preparación de las formulaciones
Para este estudio se utilizaron las siguientes formulaciones:
1) quitosano 1% + ácido oleico 1% + aceite esencial de limón 0.1% + glicerol 0.3% +
ácido acético al 1% y 2) quitosano 1% + cera de abeja 0.1% + aceite esencia l de
limón 0.1% + glicerol 0.3% + ácido acético al 1%. La preparación de las
formulaciones se explica en el capitulo 2 inciso 2.4.
2.2 Formación de películas
Se tomaron 30 mL de las formulaciones y se esparcieron sobre una placa de acrílico,
posteriormente se dejaron secar durante 48 h a 25 ± 2 ºC (Figura 21). Una vez formada la
película se desprendió cuidadosamente de la placa partiendo de los extremos con la ayuda
de un bisturí y se dejo lista para utilizarse.
141
Figura 21. Formación de las películas sobre la placa
2.3 Acondicionamiento de las cámaras
Las muestras de las películas a analizar se mantuvieron durante 48 h en una cámara de
acondicionamiento, la cual tenía una solución saturada de Bromuro de sodio (57 % HR) y
una temperatura promedio de 23 ºC (Figura 22).
Las celdas se colocaron en desecadores con una solución saturada de cloruro de sodio (75
% HR) y una temperatura de 25 ºC, para evaluar su permeabilidad.
Figura 22. Cámara de acondicionamiento
2.4 Evaluación del grosor de la película
Para determinar el grosor de las películas, se realizaron mediciones con un micrómetro
marca MYTUTUYO numero 2096-08 en 10 áreas diferentes de las muestras.
142
2.5 Determinación de la permeabilidad del vapor de agua
Para la permeabilidad del vapor de agua se utilizó el método E96-80 (ASTM, 1996) con
algunas modificaciones.
Cada muestra de película se corto y se colocó en una celda de aluminio (ver anexo) de
prueba con un área circular abierta de 0.00264 m2 la cual contenía 37 g. de silica gel (0 %
HR). Se registró el peso inicial de las celdas y se colocaron en los desecadores.
Posteriormente, se pesaron las muestras cada hora por 8 h (Figura 23). El transporte al
vapor de agua se determinó por una ganancia en el peso de la celda de permeación. El
cambio de peso en las celdas se graficó en función del tiempo. Se calculó la pendiente de
cada línea por regresión lineal (R2 = 0.99), el coeficiente de transmisión de vapor de agua
(CTVA) se calculó de la pendiente (g s-1) dividido por el área de la celda (m2). Se midió el
espesor y con esta determinación se calculó la permeabilidad (PVA) (gm-1 s-1 Pa-1). Las
muestras se analizaron por triplicado.
143
Figura 23. Diagrama de flujo de la determinación de permeabilidad total de vapor de
agua.
2.6 Determinación de las propiedades mecánicas.
Las propiedades mecánicas se evaluaron en un analizador de textura TA TX2i (Stable
Micro Systems, Co., Surrey, Inglaterra) de acuerdo con la norma D882-97 (ASTM, 1996).
10 tiras de muestra (10 cm x 1 cm) de cada película se cortaron, se midió su grosor y se
colocaron en las pinzas del texturómetro. La fuerza máxima a la tensión (MPa) y la
deformación (%) se registraron durante la extensión a una velocidad de 50 mm min-1 y una
distancia inicial entre las pinzas de 8cm. Se determinaron las variables de tensión a la
fractura y porcentaje de elongación.
144
3. Resultados y Discusión
Las películas de quitosano 1 % + ácido oleico 1% + aceite esencial de limón 0.1%,
tuvieron una tensión a la fractura de 18.65 Mpa y un porcentaje de elongación de 12%
(Cuadro 21). Vargas et al. (2009), caracterizó películas de quitosano y ácido oleico y tuvo
un tensión a la fractura similar (18 Mpa) y un porcentaje de elongación de 15%, otras
películas a base de quitosano que no contenian ácido oleico su tensión a la fractura fue
menor, tal es el caso de Pereda et al. (2012) donde demostró una tensión a la fractura de
8.52 Mpa, sin embargo, el porcentaje de elongación fue de 21.91%. Para el caso de la
película de quitosano 1% + cera de abeja 0.1% + aceite esencial de limón 0.1% la tensión a
la fractura fue de 7.46 Mpa y el porcentaje de elongación de 24.96%, lo cual indica un
mayor flexibilidad que en la cubierta anterior (Cuadro 21), estos datos fueron muy
parecidos a lo reportado por Pérez-Gago y Krochta (2001), donde en películas con suero de
leche y cera de abeja su tensión a la fractura fue de 8.5 Mpa, pero la elongación fue de
3%, lo cual indica que en este caso, la película a base quitosano y cera de abeja aumentó
más la flexibilidad que las elaboradas con proteínas (Miranda et al., 2003). Una de las
funciones que presenta la cera de abeja en las formulaciones es la de plastificante, lo cual
le permite a las películas menor ruptura (Kester y Fennema, 1986).
145
Cuadro 21. Propiedades mecánicas y de permeabilidad al vapor de agua de películas
a base de quitosano.
Película Tensión a la
fractura (Mpa)
Elongación (%) Permeabilidad
al vapor de agua
(gm-1 s-1 Pa-1)
Quitosano 1% +
ácido oleico 1% +
aceite esencial de
limón 0.1%
18.65 12.5
5.08 X1010
Quitosano 1% + cera
de abeja 0.1% +
aceite esencial de
limón 0.1%
7.43 24.96
9.14 X 1010
Con respecto a las propiedades de permeabilidad al agua, la película de quitosano 1% +
ácido oleico 1% + aceite esencial de limón 0.1% mostró una permeabilidad menor (5.08 x
1010g m1 s1 Pa1) que la cubierta de quitosano 1% + cera de abeja 0.1% +aceite esencial de
limón 0.1% (9.14x1010 g m-1 s-1 Pa-1). La mayor concentración de ácidos grasos aplicados
en las películas permitió que se redujera la permeabilidad de vapor de agua (Vargas et al.,
2009). Otros estudios reportan que ceras tales como de abeja, candelilla y carnauba
reducen notablente la pérdida de peso en frutos (Hagenmaier y Bakerl, 1997). Martinez-
Jávega formularon cubiertas a base de goma laca, cera de abeja y cera de candelilla y
reporto que reducen la perdida de peso en naranjas y mandarinas comparado con las no
tratadas.
4. Conclusiones
La película de quitosano 1% +ácido oleico 1% +aceite esencial de limón 0.1% presentó
una mayor tensión a la fractura que la que contiene cera de abeja. La película de quitosano
1% + cera de abeja 0.1% +aceite de limón 0.1% mostró una elongación mayor que la
película que contenía ácido. La cera de abeja funcionó mejor como plastificante en esta
formulación que al ácido oleico.
146
La cubierta a base de quitosano 1% + ácido oleico % + aceite esencial de limón 0.1% tuvo
menor permeabilidad al vapor de agua que la que contiene cera de abeja.
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149
CONCLUSIONES
Los recubrimientos estudiados a base de quitosano 1% + ácido oleico 1% + aceite esencial
de limón 0.1% y quitosano 1% + cera de abeja 0.1% + aceite esencial de limón 0.1%
controlaron por completo el desarrollo in vitro de R. stolonifer, además mejoraron la
calidad postcosecha del jitomate veteado, al redicir la pérdida de firmeza, la pérdida de
peso, principalmente en frutos almacenados a 10 ± 2ºC y produciendo una menor
respiracón y etileno.
Los recubrimientos que contenían cera de abeja 0.1% controlaron satisfactoriamente el
crecimiento de E. coli de manera in vitro y directamente en los frutos de jitomate.
La película a base de quitosano + ácido oleico + cera de abeja + aceite esencial de limón
presento una menor permeabilidad al vapor de agua mientras que la película de quitosano +
cera de beja + aceite esencial de limón mostró mayor flexilbilidad.
150
PERSPECTIVAS
En esta presente investigación se evaluó el efecto de cubiertas comestibles a base de
quitosano 1% + ácido oleico 1% + aceite esencial de limón sobre R. stolonifer. En los
resultados se manifestó una disminución en el porcentace de infección de R. stolonifer al
utilizar esta cubierta en frutos de jitomate, por lo tanto se propone evaluar otros hongos
postcosecha del jitomate, tal es el caso de Alternaria alternata.
En este estudio la cubierta de quitosano 1% + cera de abeja 0.1% + aceite esencial de
limón 0.1%, inhibió por completo el desarrollo de E. coli DH5α. Por lo tanto seria de gran
interés conocer el efecto que tiene esta cubierta en el desarrollo de otras bacterias
patógenas.
Las cubiertas vegetales a base de quitosano son una tecnología que debe seguir siendo
estudiada y evaluarse en un amplio grupo de productos hortofrutícolas.
151
ANEXOS
Celdas de aluminio utilizadas en las evaluaciones
permeabilidad de vapor de agua.
152
153