inmunologia guia 2º cuatrimestre 2010

8/7/2019 Inmunologia Guia 2 Cuatrimestre 2010

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INMUNOLOGA BSICA CURSADA 2010

La Inmunologa estudia un sistema sumamente interrelacionado y dinmico, pero lametodologa de estudio por temas, obliga a separar contenidos ntimamente relacionados quedeben ser finalmente integrados. Es importante considerar esta caracterstica desde el primerda de clases para encarar su estudio intentando incorporar paulatinamente los temas y

alcanzar la comprensin global. Nuestro objetivo es que puedan comprender el funcionamientodel Sistema Inmune y utilizarlo como herramienta de decisin en el diagnstico, profilaxis ysolucin de problemas de la prctica profesional. En la cursada 2010 hemos decidido abordarlos contenidos de Inmunologa Bsica a travs de diferentes metodologas de TrabajosPrcticos:

Durante las clases terico-prcticas se analizarn y resolvern preguntas y problemasen forma grupal. El objetivo de estas preguntas es utilizarlas como eje temtico, para queguen al alumno en el estudio de cada tema. Se espera que los alumnos sean capaces decontestar stas u otras preguntas similares despus de haber estudiado el tema. Algunas clases consistirn en la discusin de trabajos cientficos relacionados con lostemas tratados durante el curso. Nuestro objetivo es que comprendan la metodologa de

trabajo y de investigacin en Inmunologa y que a travs de esta discusin puedan integrarcontenidos de la materia. Los trabajos prcticos de laboratorio sern realizados en forma directa por los alumnosy supervisados por los docentes. Los alumnos, formarn grupos de trabajo y presentarn uninforme por cada trabajo prctico realizado en el laboratorio.

La presente gua de Inmunologa est destinada a facilitar el abordaje de los contenidos que setratarn en las clases prcticas, por lo que es complementaria y de ninguna manera reemplazaa la bibliografa recomendada.

Esperamos que la informacin presentada en esta gua les sea til. Si tienen dudas odificultades, acerquen sus inquietudes a los docentes participantes del curso y responsables dela redaccin de la presente gua.

La Sra. Viviana Chevaga, secretaria del rea, los orientar administrativamente en el horariode 13.30 a 19.30 en forma telefnica (4524-8450) o por mail a [email protected].


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Docentes del curso 2010

Dra. Med. Vet. Silvia L. Mundo Profesora Adjunta a cargo

MS. Md. Vet. Adriana M. Fontanals J.T.P.

Dra. Md. Vet. Ana M. Jar J.T.P.Lic. Silvia Colavecchia Ayudante de 1 era.

Md. Vet. Liliana Ramayo Ayudante de 1 era.

Vet. Lucas Goldman Ayudante de 1era.

MS: Md. Vet. Federico Hoffman Ayudante de 1era.

Dr. Matias Ostrowski Ayudante de 1era.

MS. Md. Vet. Pablo Maure Ayudante de 1era.

Vet. Javier Mas Ayudante de 1era.

Vet. Ana Jolly Ayudante de 1era.Vet. Ana Stempler Ayudante de 1era.

Vet. Laura Bass Ayudante de 1era.

Vet. Brbara Fernndez Ayudante de 1era.

Alumna Stella M. Velsquez Ayudante de 2da.

Alumna Mara Laura Fortuny Ayudante de 2da

El rea de Inmunologa agradece por la colaboracin en la correccin de esta gua a

los alumnos que a continuacion se detallan:- Badino, Mara Paula- Bezenzette, Gretel- Maffi, Carolina- Ortiz, Ariel O.- Roberti, Paula A.


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INDICE

Sistema de evaluacin 4

Condiciones para promocionar 4

Condiciones para regularizar 4

Condiciones para quedar en condicin de asistencia cumplida 4

Bibliografa fundamental 4

Bliografa ampliatoria 4-5

Programa analtico 5-8

Conceptos bsicos de bioseguridad 8-11

Toma de muestras para la evaluacin del sistema inmune 12-15Tcnicas de evaluacin de inmunidad innata 16-22

Complemento 23-24

Anticuerpos 25-26

Purificacin y fraccionamiento de anticuerpos 27-35

Protenas del plasma y suero 36

Electroforesis 37-41

Electroforesis en geles de poliacrilamida (PAGE) 42-47

Introduccin a las tcnicas serolgicas 48-49Conversin serolgica o seroconversin 50-51

Sensibilidad y especificidad 52

ELISA 53-61

RIA (radioinmunoensayo) 62

Inmunoblot 63-65

Inmunocromatografa 66

Inmunohistoqumica 67-68

Inmunofluorescencia 69-72

Citometra de Flujo 73-78

Reacciones secundarias: precipitacin y aglutinacin 79-92

Grupos sanguneos 93

Linfoproliferacin 93-96

Tcnica de seroneutralizacin 97-104

Inhibicin de la hemoaglutinacin 105

Tcnica de fijacin de complemento 105-107

Tcnica de polarizacin fluorescente 108-111


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Citotoxicidad 111-115

Tcnicas para la deteccin de anticuerpos maternales 116-121

Inmunoelectroforesis 119

Pautas para la elaboracin y presentacin de los informes de laboratorio 122

Soluciones de uso corriente 123-125

Ejercicos y problemas de aplicacin 126-141

El cronograma de las clases se encuentra en el diarito y aparaceran en cartelera web.Los das de laboratorio, consulte con su docente dnde y en qu horario debe concurrir.No olvide traer el guardapolvo.

SISTEMA DE EVALUACINLos alumnos sern evaluados a travs de:

a)El desempeo en los trabajos prcticos.

b)La aprobacin de los informes de laboratorio.c)Dos parciales obligatorios.

CONDICIONES PARA PROMOCIONAR Haber cumplido con el 75% de asistencia a los terico-prcticos. Aprobar todos los informes (de carcter grupal) correspondientes a los trabajos prcticos de

laboratorio. Aprobar losl parciales con por lo menos el 80% de los contenidos, Aprobar un coloquio integrador en fecha a convenir con los alumnos.

CONDICIONES PARA REGULARIZAR

Haber cumplido con el 75% de asistencia a los terico-prcticos Aprobar todos los informes (de carcter grupal) correspondientes a los trabajos prcticos de

laboratorio. Aprobar los parciales con por lo menos el 60% de los contenidos.

CONDICIONES PARA QUEDAR EN CONDICIN DE ASISTENCIA CUMPLIDA Haber cumplido con el 75% de asistencia a los terico-prcticos. Aprobar todos los informes (de carcter grupal) correspondientes a los trabajos prcticos de

laboratorio.

BIBLIOGRAFA FUNDAMENTAL

FAINBOIM, L. y GEFFNER, J. Introduccin a la Inmunologa Humana. 5ta Edic. 2005editorial Mdica Panamericana.

TIZARD, I. Inmunologa Veterinaria. 6ta. Edic. 2002. Editorial Interamericana McGraw-Hill.

Gua de Trabajos Prcticos. rea de Inmunologa. 2009

BIBLIOGRAFA AMPLIATORIA

ABBAS, A. Inmunologa Celular y Molecular, 5ta. Edic. 2004. Editorial Elsevier.

DAY M.J. Clinical Immunology of the Dog and Cat. Iowa State University Press. 1999.


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JANEWAY, C. A. Inmunobiologa: El sistema Inmunitario en condiciones de salud yenfermedad, 2da Edic. 2003. Editorial Masson. (www.ncbi.nlm.nih.gov/Bookshelf)

REGUEIRO GONZALEZ J.R. Inmunologa: Biologa y Patologa del Sistema Inmune. 3ra.Edic. 2002. Editorial Mdica Panamericana.

ROITT, I. Inmunologa. Fundamentos. 10ma. Edic. 2003. Editorial Mdica Panamericana.

STITES-PARSLOW. Inmunologa Bsica y Clnica. 10ma. Edic. 2003. Editorial ManualModerno.

PROGRAMA ANALTICO

Unidad 1: Mecanismos de Defensa

RGANOS Y TEJIDOS LINFOIDESrganos linfticos primarios y secundarios: Estructura. Diferencias en las especies domsticas:Bolsa de Fabricio. Ganglios linfticos en cerdos. Glndulas de Harder.Patrones de migracin celular: molculas asociadas. SISTEMAS INMUNESBarreras naturales: piel y mucosas.Mecanismos humorales: va alternativa del complemento; protenas de fase aguda;interferones.Mecanismos celulares: fagocitosis y lisis. Citotoxicidad natural.Importancia de la respuesta T gama-delta y LB1 en las especies domsticas y de produccin. SISTEMA INMUNE ESPECIFICOPropiedades: especificidad, adaptabilidad y memoria. Organizacin clonal. Molculas desuperficie: concepto de receptor.Clulas que reconocen al antgeno en forma especfica: Linfocito B (LB), Linfocito T (LT).

FILOGENIA DE LOS MECANISMOS DE DEFENSA ONTOGENIA DE LOS MECANISMOS DE DEFENSA EN LAS ESPECIES DOMESTICAS YDE PRODUCCIN.

Unidad 2: Inmunoqumica

ANTGENOSAntigenicidad e Inmunogenicidad.Estructura fsico-qumica de los antgenos. Haptenos. Carriers. Concepto y tipos dedeterminantes antignicos.Tipos de Antgenos: propios (de rgano; de grupos sanguneos; de gnero H-Y) y extraos (depatgenos, de tumores, de transplantes).

ANTICUERPOSInmunoglobulinas (Igs) de membrana y secretadas.Estructura fsico-qumica: cadenas pesadas y livianas, dominios constantes y variables. Clasesy subclases.Caractersticas de las Igs en las diferentes especies domsticas y de produccin: IgT enequinos, IgY en aves e Igs en camlidos.La Ig como antgeno: isotipo, alotipo e idiotipo.Funciones biolgicas de las diferentes clases de Igs. Distribucin en el organismo. RESULTADO DE LA UNION DEL ANTICUERPO CON EL AG.Neutralizacin. Opsonizacin. Activacin del Complemento. Citotoxicidad celular dependientede anticuerpos (ADCC). PASAJE DE IGS MATERNO FETAL.


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Incidencia de los diferentes tipos de placentacin en el pasaje de Igs. de la madre al feto en lasespecies domsticas. Composicin en Igs. del calostro y leche. Importancia de la ingestin decalostro.Tcnicas de determinacin de la ingestin de calostro.

Unidad 3: Molculas de membranas relacionadas con el reconocimiento antignico

MADURACION DE LOS LINFOCITOS BGeneracin de diversidad de las Igs: Recombinacin somtica, hipermutacin, conversingnica, diversidad N-Terminal. Mecanismos caractersticos en las diferentes especies.Ontogenia del linfocito B. Exclusin allica, exclusin isotpica. Splicing alternativo. MOLECULAS DE HISTOCOMPATIBILIDADMolculas de histocompatibilidad clase I y clase II: Estructura. Localizacin. Funcin.Complejo mayor de histocompatibilidad: nomeclatura y herencia. Mapa gentico en lasespecies domsticas y de produccin.Molculas de histocompatibilidad no clsicas. RECEPTOR ANTIGENICO DEL LT

Estructura, molculas asociadas (CD3, CD4, CD8) y otras molculas de adhesin. MADURACION DE LOS LINFOCITOS TGeneracin de diversidad de los receptores T.Educacin tmica de los LT. MECANISMOS DE AUTOTOLERANCIA PROCESAMIENTO Y PRESENTACION ANTIGENICAVa endoctica y va biosinttica.

Unidad 4: Respuesta Inmune

COLABORACIN CELULARActivacin de los LT, Interleuquinas. Influencia del antgeno y el microambiente en la

cooperacin celular: Perfiles Th 1 y Th 2.Colaboracin T-B: Activacin de LB y produccin de Igs: Switch isotpico. Antgenos timo-dependientes y timo-independientes.Colaboracin T-T: Citotoxicidad ejercida por LT citotxicos.Colaboracin T-Macrfagos: Macrfagos activados.Memoria inmune. REGULACIN DE LA RESPUESTA INMUNERegulacin intrnseca: Efecto de la desaparicin del Ag., Niveles de Igs: retroalimentacin.Regulacin por linfocitos T (Th 3).Regulacin extrnseca: neuroinmunoendocrinologa.Regulacin en sitios privilegiados: ojo, placenta, sistema nervioso central. CINTICA DE LA RESPUESTA INMUNE

Respuesta inmune sistmica.Respuesta inmune en mucosas: caractersticas diferenciales en las especies domsticas.

Unidad 5: Daos producidos por el Sistema inmune

HIPERSENSIBILIDAD TIPO IAlergia. Shock anafilctico: rgano de choque en las diferentes especies. HIPERSENSIBILIDAD TIPO IIDaos por anticuerpos en enfermedades autoinmunes y en reacciones alogeneicas. Anemiahemoltica en equinos y cerdos. HIPERSENSIBILIDAD TIPO IIIDaos por complejos inmunes en enfermedades autoinmunes y en enfermedades infecciosascrnicas. Pimetra en caninos. HIPERSENSIBILIDAD TIPO IV


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Bases celulares de la hipersensibilidad retardada. Granuloma tuberculoso. Dermatitis porpulgas en caninos. HIPERSENSIBILIDAD TIPO VAnticuerpos anti-receptores.

FENMENOS DE AUTOINMUNIDADConcepto. Ejemplos de enfermedades autoinmunes especficas de rgano y sistmicas. INMUNODEFICIENCIASInmunodeficiencias primarias y secundarias. Virus inmunosupresores que afectan las diferentesespecies. TRANSPLANTESMecanismos de rechazo del injerto. RESPUESTA INMUNE A TUMORES

Unidad 6: Respuesta Inmune a Patgenos

RESPUESTA INMUNE A BACTERIAS, VIRUS, PARSITOS Y HONGOS

Antgenos involucrados. Mapeo de epitopes.Ciclo biolgico del patgeno.Inmunidad innata.Inmunidad especfica.Mecanismos de evasin.Consecuencias desfavorables.

Unidad 7: Inmunoprofilaxis

INMUNOPROFILAXIS PASIVAVentajas e inconvenientes de su uso. ELABORACIN DE SUEROS HIPERINMUNES

Uso de aves en la elaboracin de sueros hiperinmunes.Produccin de anticuerpos por biotecnologa. INMUNOPROFILAXIS ACTIVATipos de vacunas. Ventajas e inconvenientes de su uso:Vacunas atenuadas.Vacunas inactivadas.Vacunas a subunidades. Vacunas a pptidos.Vacunas recombinantes (a vectores).Vacunas deleteadas.Vacunas a DNA desnudo. METODOLOGA DE PREPARACIN DE VACUNASProceso de produccin de inmungenos a escala industrial.

Requisitos de bioseguridad.Controles durante las diferentes etapas de produccin.Mtodos de inactivacin.Mtodos de atenuacin.Uso de adyuvantes.Aprobacin de vacunas por organismos oficiales. Controles de inocuidad, esterilidad ypotencia. ADMINISTRACIN DE VACUNASVas de inmunizacin.Esquemas de vacunacin en las diferentes especies animales.Vacunas mixtas.Fracasos de la vacunacin.Reacciones adversa a la vacunacin.


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Unidad 8: Tcnicas Inmunolgicas de Diagnstico

TCNICAS DE IDENTIFICACIN DE IGS.Precipitacin salina. Cromatografa. Electroforesis. Electroforesis en geles de poliacrilamida(PAGE). TCNICAS DE INTERACCIN (AG-AC) PRIMARIATcnicas inmunoenzimticas: ELISA. Inmunoblot. Inmunohistoqumica.Inmunofluorescencia. Citometra de flujo. Radioinmunoensayo. TCNICAS DE INTERACCIN (AG-AC) SECUNDARIAInmunodifusin. Inmunoelectroforesis. Aglutinacin. Lisis por Complemento. TCNICAS DE INTERACCIN (AG-AC) TERCIARIAInhibicin de la hemoaglutinacin. Seroneutralizacin. Seroproteccin. Intradermorreaccin.Fijacin de Complemento. TCNICAS CELULARESFagocitosis. Linfoproliferacin. Intradermorreaccin. Citotoxicidad. APLICACIN DE LAS TCNICAS INMUNOLGICASEvaluacin del sistema inmune en un individuo.

Deteccin de la respuesta inmune frente a patgenos.Diagnstico de hipersensibilidades.Evaluacin del resultado de la inmunoprofilaxis. HIBRIDOMAS Y ANTICUERPOS MONOCLONALESHibridomas: Produccin y seleccin.Anticuerpos monoclonales: Produccin. Aplicaciones.

Conceptos Bsicos de Bioseguridad

Cuando en un ambiente se manipulan agentes infecciosos se producen una serie deriesgos a los que estn expuestas las personas, el medio ambiente e incluso toda lacomunidad. Estos riesgos varan segn el agente, su patogenia y otros factores como lasmaniobras o procedimientos empleados.Las Normas de Bioseguridad pretenden reducir a un nivel aceptable el riesgo inherente a lamanipulacin de material peligroso. Por ello, se efecta una evaluacin de los riesgosbiolgicos para darles a las personas una contencin (instalaciones, equipo de proteccin yprcticas de trabajo) que reduzca la exposicin hasta lmites mnimos, de forma que estnexpuestos al menor riesgo posible (aclarando que, el riesgo cero no existe).

Clasificacin de agentes biolgicosLos agentes biolgicos se clasifican en grupos segn su peligrosidad hacia el hombre:

Grupo 1. Microorganismos que presentan poca probabilidad de causar enfermedad en el

hombre. Ejemplos: Bacillus subtilis, Saccharomyces sp.Grupo 2. Aqullos que pueden causar una enfermedad en el hombre y pueden suponer unpeligro para las personas expuestas, siendo poco probable que se propaguen a la poblacin.Generalmente existe profilaxis o tratamiento eficaz contra estos agentes. Ejemplos:Actinomyces sp, Bacteroides sp, Enterobacterias, Salmonella sp, Shigella sp, Candida sp,Cryptococcus neoformans.

Grupo 3. Microorganismos que pueden causar enfermedades graves en el hombre ypresentan un serio peligro para las personas expuestas, con riesgo de que se propaguen a lapoblacin. Generalmente existe generalmente profilaxis o tratamiento eficaz contra estosagentes. Ejemplos: Mycobacteriumtuberculosisy bovis, Brucella sp, Histoplasma capsulatum,

Neisseria meningitidis, Coccidioides inmitis, Chlamydia trachomatis, Virus de la encefalomielitisequina.


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Grupo 4. Agentes que, causan enfermedades graves en el hombre, y suponen un serio peligropara otras personas expuestas, con muchas probabilidades de que se propague a la poblacin.Generalmente no se cuenta con profilaxis o tratamiento eficaz contra estos agentes. Ejemplos:Virus de Lassa, Machupo y Ebola.

Niveles de contencinEl primer principio de Bioseguridad es la contencin.

El trmino "contencin" se emplea para describir los mtodos que hacen seguro el manejo demateriales infecciosos en el laboratorio. El propsito de la contencin es reducir al mnimo laexposicin del personal de los laboratorios, de otras personas y del entorno, a agentespotencialmente peligrosos.Se suelen describir cuatro niveles de contencin o de seguridad biolgica, que consisten enla combinacin, en menor o mayor grado, de tres elementos de seguridad biolgica: la tcnicamicrobiolgica, el equipo de seguridad y el diseo de la instalacin. Cada combinacin estespecficamente dirigida al tipo de operaciones que se realizan, las vas de transmisin de losagentes infecciosos y la funcin o actividad del laboratorio.

a) Nivel de contencin 1:Es el nivel de seguridad requerido para los agentes biolgicos del grupo 1.

Es el utilizado habitualmente en los laboratorios de prcticas de universidades o centrosdocentes donde se emplean cepas no patgenas (E. coli K12, B. Subtilis, Naegleria sp,Saccharomyces cerevisiae, etc.). Ejemplos tpicos son todos los microorganismos que seutilizan en la industria de la alimentacin para la elaboracin de quesos, cerveza, embutidos,etc.

b) Nivel de contencin 2:Es el obligado para agentes del grupo 2 como algunos que, perteneciendo a la propia

flora habitual del hombre, son capaces de originar patologas infecciosas humanas de

gravedad moderada o limitada.Deben ser manipulados por personal especializado (tcnicos de laboratorio, especialistas enMicrobiologa) y son los que con ms frecuencia se estudian en el Laboratorio de DiagnsticoVeterinario (Ascaris sp, Estafilococos, Salmonella, Toxoplasma, Clostridiumsp, etc.).

c) Nivel de contencin 3:Debe utilizarse cuando se manipulan agentes biolgicos del grupo 3, microorganismos

que cursan con patologas graves, de difcil y largo tratamiento, que pueden curar con secuelasy son capaces de producir la muerte. El mayor y ms frecuente peligro que entraan stos es lainfeccin adquirida a travs de aerosoles y fluidos biolgicos. Por ello, las principales medidasa tomar en este caso son la correcta manipulacin y la utilizacin de cabinas de seguridad.En los Laboratorios de Diagnstico Veterinario debe evitarse la contaminacin ambiental y la

infeccin del operador con patgenos como M. tuberculosis, Brucella sp, Virus de laencefalomielitis equina, etc. Estos microorganismos slo pueden ser procesados por personalcalificado y en una zona con la infraestructura apropiada para el Nivel de Contencin 3, esdecir, con aire acondicionado independiente, sin recirculacin de aire, con gradiente de presin,cabinas de seguridad, etc.

d) Nivel de contencin 4:Es el nivel requerido cuando se trabaja con un agente patgeno extico o no, que

produce una enfermedad infectocontagiosa, de alta mortalidad y para la cual no existetratamiento o el tratamiento existente es poco fiable. Normalmente son microorganismos dedosis infectiva baja y alta contagiosidad.Agentes del grupo 4 animales de experimentacin infectados con ellos: Ejemplos de estenivel son los arenavirus como el que produce la fiebre de Lassa y el virus Machupo, virusEbola, etc. Adems, deben incluirse en este nivel de contencin los microorganismos propios


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del grupo 3 que adquieran propiedades patgenas que los eleven al grupo 4. Un ejemplo seraMycobacteriumbovismultirresistente que puede causar fallecimiento por fracaso teraputico.

En la prctica veterinaria diaria, el profesional se encuentra expuesto a agentespatgenos pertenecientes a los grupos 2, 3 y eventualmente al grupo 4, que sonpotencialmente peligrosos tanto para l mismo como para sus pacientes y otras personas. Porlo tanto, deben tomarse todas las precauciones y establecer y respetar medidas de contencinadecuadas para evitar el riesgo de la diseminacin a la comunidad.El inicio de algunas enfermedades profesionales es lento y muchas veces enmascarado porotros trastornos fsicos. Por esto, el profesional veterinario tiene que tener una clara concienciadel riesgo de su profesin y conocer en cada una de sus actividades los riesgos a los cualespuede verse expuesto.Slo si se conocen las posibles enfermedades a las que se expone el veterinario, su forma detransmisin, produccin y exposicin, se podrn realizar las acciones correspondientes a fin deprevenirlas.

Bioseguridad en el consultorio veterinario.

Durante la revisacin clnica se contaminan las manos del profesional, por lo tantodeben lavarse entre la atencin de pacientes. Asimismo, debe desinfectarse la camilla y todoslos elementos empleados durante la consulta.Es comn la toma de muestras (sangre, orina, materia fecal, biopsias, etc.) para efectuaranlisis complementarios que ayuden al diagnstico o al seguimiento de un caso clnico. Estasmuestras, en general, son analizadas por laboratorios de diagnstico externos a la clnica, porlo tanto debe evitarse la diseminacin de patgenos durante su traslado: Los tubos de sangre deben estar correctamente tapados e identificados. Nunca se debe

enviar la sangre dentro de la jeringa de extraccin. Si se toman muestras de orina o muestras de rganos para diagnstico histopatolgico

(conservados en formol al 10%), los frascos deben estar cerrados hermticamente. Las muestras de rganos remitidas en fro para diagnstico microbiolgico deben colocarse

en bolsas plsticas cerradas. Nunca se deben colocar muestras de diferentes rganos en lamisma bolsa.

Todas las muestras deben remitirse dentro de cajas, preferiblemente de telgopor (conrefrigerantes, cuando se requiera) y adecuadamente precintadas para evitar su aperturaaccidental.

Las muestras deben ir acompaadas de un protocolo de remisin de muestras que incluyael tipo de muestra que se enva, el anlisis solicitado y una resea clnica del caso. Estaresea debe contener la especie animal de la que provienen las muestras, edad, sexo,sintomatologa observada, hallazgos de necropsia y el diagnstico presuntivo; de maneraque el destinatario est advertido de los riesgos potenciales antes de tomar contacto con lamuestra.

Residuos patognicos:Son considerados residuos patognicos todos aquellos desechos o elementos

materiales en estado slido, semislido, lquido o gaseoso que presumiblemente presenten opuedan presentar caractersticas de infecciosidad, toxicidad o actividad biolgica que puedanafectar directa o indirectamente a los seres vivos o causar contaminacin del suelo, del agua ode la atmsfera, que sean generados en la atencin de la salud humana o animal por eldiagnstico, tratamiento, inmunizacin o provisin de servicios, as como tambin en lainvestigacin o produccin comercial de elementos biolgicos o txicos. (Ley 154 de la CiudadAutnoma de Buenos Aires, 18 de febrero de 1999).

Residuos patognicos son, por ejemplo:

Los provenientes de cultivos de laboratorio, restos de sangre y sus derivados.


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Restos orgnicos provenientes del quirfano, de servicios de hemodilisis, hemoterapia,anatoma patolgica, morgue.

Restos, carcasas y excrementos de animales de experimentacin biomdica. Algodones, gasas, vendas, jeringas, objetos cortantes o punzantes, materiales descartables

y otros elementos que hayan estado en contacto con agentes patognicos y que no se

esterilicen (Nivel de bioseguridad 3). Todos los residuos, cualesquiera sean sus caractersticas, que se generen en reas de altoriesgo infectocontagioso (Niveles de bioseguridad 3 y 4).

Restos de animales provenientes de clnicas veterinarias, centros de investigacin yacadmicos.

Frascos de medicamentos y vacunas vacos.Los residuos patognicos deben tratarse de manera especial hasta su destino final. Estaactividad est reglamentada en la ley N 154 de la Ciudad Autnoma de Buenos Aires. Todoslos residuos patognicos deben colocarse en bolsas rojas de ms de 120 micrones de espesor.Estas bolsas se colocan en cajas de cartn o en recipientes plsticos debidamente sellados eidentificados. El tratamiento de estos residuos es llevado a cabo por empresas especializadasque cuentan con la infraestructura necesaria para esterilizarlos sin riesgo de eliminar

patgenos al medio ambiente. En general los residuos patolgicos son incinerados en hornos atemperaturas mayores a los 1200C que dejan como residuo vapor de agua y cenizas inocuas(hornos pirolticos).

Bioseguridad en la produccin agropecuariaSon varias las zoonosis que el profesional puede adquirir durante prcticas rutinarias en

la produccin agropecuaria, por lo tanto tambin deben tomarse precauciones. Usar mameluco descartable o de algodn resistente al lavado intenso y botas de goma. Revisar el estado de la manga, andenes, cepos, puertas laterales, etc. Usar guantes para realizar tacto rectal o necropsias. Comprobar el buen funcionamiento de las jeringas metlicas, verificar que no tengan

prdidas cuando se inyecta. Desinfectarlas y lavarlas muy bien luego del uso. No reutilizar las jeringas descartables. Luego del trabajo en la manga, desinfectar las botas y colocar la ropa en una bolsa plstica

y luego lavarla, separada de otras, en agua a 90C. Enterrar o incinerar los cadveres de animales sospechosos de haber muerto por

enfermedades infecciosas graves o zoonticas. La prctica depender de la enfermedad dela que se sospeche.

Remitir las muestras al laboratorio siguiendo las indicaciones descriptas anteriormente.

Bioseguridad en el laboratorio de diagnsticoEl laboratorio de diagnstico recibe muestras que deben ser consideradas como

potencialmente peligrosas y deben tomarse todos los recaudos necesarios para evitar el

contagio y la diseminacin de los agentes infecciosos. No comer, beber o fumar en el laboratorio. Debe usarse guardapolvo u otra indumentaria diferente a la ropa de calle. Utilizar guantes para manipular las muestras. Nunca pipetear con la boca, usar pipetas automticas, propipetas o peras de goma. Luego de trabajar, desinfectar las mesadas y todos los elementos utilizados. Luego de procesadas, tratar las muestras como residuos patognicos. Rotular todos los frascos utilizados en el laboratorio indicando su contenido, la fecha de

apertura o preparacin, la fecha de vencimiento y la peligrosidad de la solucin o sustanciaqumica (irritante, carcinognica, inocua, etc.).


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Toma de muestras para la evaluacin del Sistema Inmune

La toma de muestras es el primer paso antes de indicar cualquier prueba de laboratorio;sin ella no hay sustrato sobre el cual comenzar a trabajar, por lo cual es el primer tema que setrata.

Se entiende la importancia de detenerse en algunos puntos sobre ellas si se piensa qupasara si se cometen errores durante su recoleccin: el estudio de muestras inapropiadas omal conservadas puede llevar a resultados falsos que invaliden la prueba.

Por lo tanto, se nombran a continuacin algunos conceptos a tener en cuenta en la toma demuestras, como primer paso, antes de empezar a trabajar.

Se hace hincapi en las muestras de sangre y suero ya que, la evaluacin de la respuestainmune sistmica se realiza a partir de sangre perifrica, y la obtencin de suero a partir desangre es frecuente en inmunologa (por ejemplo, para buscar anticuerpos).

Las pruebas sobre estas muestras, en laboratorios de inmunologa, se realiza con dos objetivosprincipales:

1. En el caso del diagnstico de enfermedades infecciosas:- Identificar y tipificar antgenos en una muestra: por ejemplo, Parvovirus canino o

Coronavirus bovino en materia fecal. En estos casos se utilizan anticuerpos especficoscontra el patgeno o contra subtipos o cepas del mismo.

- Identificar la produccin de anticuerpos especficos contra un determinado patgeno, porejemplo: anticuerpos antiBrucella abortus, anticuerpos antiVirus de la Fiebre Aftosa, etc.,obteniendo como resultado:

presencia o ausencia de anticuerpos, si la tcnica es cualitativa;

el ttulo de estos anticuerpos, si la tcnica es semicuantitativa;los miligramos de anticuerpos especficos, si la tcnica es cuantitativa.

2. En el caso de la evaluacin del sistema inmune (SI):- Determinar los niveles de inmunoglobulinas en general o de alguna clase de

inmunoglobulina en particular, por ejemplo, cuando queremos saber si un animal tieneniveles normales de IgG en suero.

- Determinar la relacin entre las clulas pertenecientes al sistema inmune; por ejemplo,relacin CD4/CD8.

- Evaluar la funcionalidad de las clulas del sistema inmune, midiendo su proliferacin o laproduccin de citoquinas.

Conocer la tcnica que se va a usar permitir:*Elegir la tcnica ms adecuada, segn el objetivo del inmunodiagnstico.*Tomar la muestra correcta.*Evaluar los resultados de forma de cumplir los objetivos planteados.Es por eso que, consecuente con la toma de muestras se describirn las tcnicas, ya que esnecesario conocerlas para saber qu muestra tomar y cmo prepararla.


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Toma de muestras de sangre:La toma de muestras de sangre es una de las prcticas ms habituales en la clnica

diaria. Se realiza en razn de mltiples objetivos, entre los cuales tenemos desde una pruebabioqumica hasta un examen de funcionalidad celular. De acuerdo con estos objetivos, vara lamanipulacin y preparacin de las muestras. Es por ello que es importante conocer algunosconceptos bsicos para que la maniobra realizada resulte en datos que nos puedan servir debase para formular un diagnstico exacto.

A continuacin se enumeran algunos consejos particularmente tiles:- Extraer la cantidad mnima necesaria para las pruebas. Esto es crtico cuando se deben

hacer sangras sucesivas a pequeos animales.- Consultar con el laboratorio que procesar la muestra. Algunas de las pruebas realizadas

en los laboratorios de Inmunologa clnica deben tener una notificacin previa (como laprueba de estimulacin de linfocitos) y requieren del envo de una muestra control junto conla muestra del paciente. Cuando la muestra debe ser extrada con anticoagulante, previo ala extraccin debe ser consultado el laboratorista, quien indicar el ms conveniente para

las pruebas que deba realizar. Los ms usados son los quelantes del Ca++

como el citratode Na o la solucin de Alsever que tiene glucosa para proteger a los eritrocitos y citrato deNa como anticoagulante.

- Trabajar cuidadosamente para obtener la muestra en las condiciones ms aspticasposibles. Siempre es recomendable usar jeringas y agujas descartables o esterilizadas porcalor seco.

- Evitar la hemlisis. La presencia de hemoglobina puede afectar algunos resultados. El usode elementos sucios o mojados (excepto con anticoagulantes), el manipuleo brusco y laformacin de espuma cuando trasvasamos la muestra de la jeringa al tubo de ensayospueden producir hemlisis. La susceptibilidad a sta, segn las especies y en ordencreciente es: equinos, bovinos, ovinos, aves, felinos y caninos.

- Tener en cuenta que lo ptimo es obtener la muestra en el mismo laboratorio para evitar el

deterioro que sufre durante el envo; esto es de particular importancia en los estudios queimpliquen evaluacin de clulas o de los factores del complemento.- Las pruebas que requieren clulas viables hacen necesario que la sangre se transporte en

hielo hasta el laboratorio en pocas horas. Si esto no es posible, se debe enviar la muestraacondicionada del modo ms conveniente para cada caso y lo ms rpidamente posible.

- Rotular las muestras de forma inequvoca y acompaar las muestras con elcorrespondiente protocolo que contenga la mayor cantidad de informacin posible. Escomn observar que los profesionales remitan muestras en las cuales slo se detalla, porejemplo, el nombre de la mascota en tratamiento. Es importante aclarar no slo las pruebasque se solicitan al laboratorio, sino tambin adjuntar fecha, especie, sexo, diagnsticopresuntivo y una breve resea del caso en cuestin, ya que esto ser de suma utilidad a lahora de interpretar los resultados por parte del personal del laboratorio. (Se adjunta como

ejemplo el protocolo de envo de muestras utilizado en el servicio que brinda el rea deInmunologa).

Extendidos de Sangre:Los extendidos de sangre conviene hacerlos inmediatamente despus de extrada la

muestra, junto al animal. Para esto se utilizan las ltimas gotas de sangre que quedan en laaguja. Preparados correctamente, estos extendidos son estables an si no estn fijados.Pueden teirse hasta varios das despus si se conservan secos y protegidos de la humedad.Envueltos en papeles limpios y colocados en un recipiente hermtico, pueden remitirse porcorreo. El mtodo de fijacin puede variar segn la tincin, pero en general se pueden fijar concalor o con distintos alcoholes. Los extendidos fijados son de estabilidad casi indefinida.


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Extraccin de Suero:Para extraer el suero de la sangre total obtenida, se la deja coagular. Una vez formado

el cogulo, se lo desprende del vidrio con la ayuda de una aguja o varilla. Para obtener lamayor cantidad posible de suero, se coloca el tubo en una estufa a 37oC durante 30 minutos a1 hora y luego, para obtener la mayor retraccin del cogulo, se lo deja en heladera (4 oC)durante una noche. A partir de aqu, se puede centrifugar el tubo (a 3000 r.p.m. durante 30minutos) o extraer directamente el suero (sobrenadante) con una pipeta. En ambos casos debeoperarse cuidadosamente tratando de evitar tocar el cogulo para no producir hemlisis.

El suero puede mantenerse a 4oC durante 48-72 horas. Si hay riesgo de contaminacin,conviene agregarle una pizca de azida sdica (este conservante puede ser txico por lo que esconveniente consultar al profesional del laboratorio antes de hacerlo). Si no se va a usar dentrode ese lapso, el suero debe congelarse a temperaturas inferiores a -20oC (lo ptimo es a -70oC). Si bien a estas temperaturas prcticamente no hay degradacin proteica, s la haydurante cada ciclo de congelacin descongelacin.

Para los exmenes serolgicos de diagnstico especfico no tiene mayor importancia,pero para exmenes electroforticos conviene evitar el congelamiento si es posible Es

conveniente aclarar en el protocolo si la muestra ha sido congelada o mantenida a 4

o

C ycualquier otra observacin que se considere necesario.Tambin se puede enviar la sangre entera, siempre que no se tarde ms de unas pocas

horas. La sangre entera se conserva refrigerada, nunca congelada, pero si se prevn demorasentre la extraccin y la llegada al laboratorio, lo mejor es enviar el suero ya separado.


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Ej. : PROTOCOLO DE ENVO DE MUESTRAS

FACULTAD DE CIENCIAS VETERINARIAS

AREA INMUNOLOGA

SERVICIO DE DIA GNSTICO INMUNOLGICO

NDE PROTOCOLO

Fecha de recepcin: / /

Examen solicitado:............................................................................................................

Muestra remitida:...............................................................................................................

Observaciones de la muestra:...........................................................................................

DATOS DEL PACIENTE

Especie: C F

Raza:.................................................................................................................................

Edad:.................................................................................................................................

Sexo: M H

DATOS DEL PROPIETARIO

Apellido y Nombre:............................................................................................................

Telfono:............................................................................................................................

DATOS DEL PROFESIONAL

Apellido y Nombre:............................................................................................................

Telfono:............................................................................................................................

Pertenece al Hospital Canepa: SI NO Nde Historia Clnica:.............................DIAGNOSTICO PRESUNTIVO:........................................................................................ANALISIS COMPLEMENTARIOS REALIZADOS:..........................................................

MEDICACIN RECIBIDA:...........................................................................................


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Tcnicas de evaluacin de inmunidad innata

La respuesta inmune innata representa la primera lnea de defensa del husped a lainfeccin. Una de sus caractersticas primordiales es la capacidad de responder a patgenosque no ha visto previamente. Esta capacidad inherente del sistema innato se debe a su

habilidad de reconocer estructuras muy conservadas y compartidas por diversos patgenos.Dichas estructuras son conocidas como patrones moleculares asociados a patgenos(PAMPs, acrnimo proveniente del nombre en ingles: pathogen associated molecular patterns)entre los que podemos ejemplificar a componentes de la pared bacteriana comolipopolisacridos (LPS), peptidoglicanos y cido lipoteicoico entre otras estructuras. Estasmolculas pueden ser vistas como firmas molecularesde los microorganismos invasores.

Si bien las bacterias de distintas cepas presentan algunas diferencias estructurales, sedescriben patrones conservados. Por ejemplo, el lpido A que forma parte del LPS de lasbacterias Gram negativas es siempre constante y es el responsable de los efectosproinflamatorios, mientras que el antgeno O es variable entre las distintas especies y no esreconocido por el sistema inmune inespecfico.De esta forma, el sistema inmune innato puede responder a muchas infecciones slo con un

repertorio limitado de receptores. El reconocimiento de los PAMPs est mediado porestructuras tambin muy conservadas en la evolucin y que son conocidas comoreceptores para el reconocimiento de patrones (PRRs, acrnimo proveniente del nombre eningles: pattern recognition receptors).

Entre los PRRs se describen varias familias, entre ellas, los receptores de tipo Toll(TLR) son capaces de reconocer distintos PAMPs. Al menos diez miembros de la familia deTLR se identificaron en mamferos y cada miembro es capaz de reconocer distintos PAMPs.Por ejemplo, el TLR 2 reconoce peptidoglicano y cido lipoteicoico del S. aureus. El TLR 4reconoce LPS de bacterias gram negativas incluyendo a E.coli.

Fagocitosis

Los mecanismos que tienen las clulas para incorporar en su interior fluidos, solutos ypartculas desde el medio externo son: pinocitosis, endocitosis mediada por receptoresespecficos y fagocitosis. Mediante el proceso de pinocitosis ingresan a las clulas fluidos ysolutos. Por medio de la endocitosis mediada por receptores especficos, entran a la clulamacromolculas, virus y otras partculas de pequeo tamao. Ambos mecanismos sonindependientes de la polimerizacin de la actina. En cambio, la fagocitosis, que es la ingestinde partculas de mayor tamao, ocurre por mecanismos dependientes de la actina. Las clulasms eficientes para fagocitar partculas son los monocitos, macrfagos y neutrfilos a los quese los denomina fagocitos profesionales.

La fagocitosis fue descripta por Metchnikoff en 1882 y es uno de los mecanismosasociados al sistema inmune que aparece ms tempranamente en la escala filogentica. Seconoce como fagocitosis al proceso por el cual una partcula es ingerida por una clula. Laspartculas pueden ser bacterias, parsitos, clulas muertas y partculas inertes como el carbn,etc. La partcula puede ser degradada o no luego de la fagocitosis dependiendo de lanaturaleza de la misma.

No todos los microorganismos son fagocitados; muchos de ellos tratan de evadir elreconocimiento que es la primera etapa de la fagocitosis. Simultneamente con esta evasin, elsistema inmune de los vertebrados ha evolucionado para contrarrestarlo. Se conocen factoressricos denominados opsoninas que favorecen el reconocimiento e ingestin demicroorganismos.

Las principales opsoninas son los anticuerpos (IgG e IgM), los factores del complemento(C3b, C3bi, etc.) y las protenas de fase aguda. Entre las protenas de fase aguda seencuentran la protena C reactiva, las protenas de unin al lipopolisacrido (LBP) y protenas

de alto peso molecular llamadas fibronectinas. El LBP se une al LPS bacteriano y aumenta launin de stos a la molcula de CD14 presente en la membrana de las clulas fagocticas. La


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fibronectina puede unirse a algunas bacterias como el Staphylococcus aureusy actuar comopuente entre la bacteria y el polimorfonuclear (PMN).

El reconocimiento del microorganismo est mediado por diferentes receptores demembrana del fagocito pertenecientes a los PRRs o aquellos que reconocen a las opsoninas.Estos receptores pueden estar involucrados tanto en la adherencia como en la activacin delproceso de fagocitosis. Algunos de ellos son, por ejemplo, el receptor para el fragmentocristalizable constante de la inmunoglobulina G (FcR), el receptor para la protena C3b delcomplemento (CR1)), o para la protena C3 (CR3 o CD11b/CD18), y los receptores depatrones (PRRs) como el receptor de manosa, y el receptor scavenger o carroero.Se ha observado que la cantidad de anticuerpos IgG necesarios para inducir la ingestin de unmicroorganismo se reduce alrededor de 100 veces si ste adems est recubierto por C3b.Estos receptores actan cooperativamente para estimular vas de sealizacin, no slo parainiciar la polimerizacin de la actina sino tambin para activar la NADPH-oxidasa para laproduccin de O2. Este ltimo es uno de los mecanismos citotxicos que entran en juego luegode la fagocitosis.

Clulas efectoras de la fagocitosis

Los polimorfonucleares se originan en la mdula sea (MO) y son continuamenteenviados a la circulacin. Viven pocos das y tan pronto como los microorganismos invaden lostejidos dejan el torrente circulatorio, se adhieren al endotelio celular activado y se mueven atravs de la barrera endotelial hacia el sitio de la lesin. Son considerados como la primerabarrera de defensa frente a los microorganismos, ya que son los primeros en llegar al sitio deinvasin atrados por los factores quimiotcticos que se generan en el foco inflamatorio.

Los factores quimiotcticos son principalmente componentes bacterianos, productos dedegradacin de las bacterias, mediadores de la inflamacin y restos de tejidos alterados por lainvasin.

Los monocitos se originan tambin en MO y pasan a la circulacin, desde donde seextravasan a los tejidos y se diferencian en los distintos rganos, tomando caractersticaspropias como es el caso de las clulas de Kupffer en el hgado, los macrfagos alveolares en el

pulmn y los histiocitos en el tejido conectivo. La transformacin de monocito a macrfagotisular involucra una serie de cambios morfolgicos y metablicos en la clula, como son elaumento del tamao celular, la modificacin en la calidad y cantidad de enzimas lisosomales,etc.

Activacin del polimorfonuclear / macrfagoLos PMN responden a una gran variedad de factores quimiotcticos, incluyendo los N-

formilpptidos, factores derivados de la activacin del complemento como el C5a, losleucotrienos B4 (LTB4), la interleuquina 8 y el factor activador de plaquetas (PAF). Algunos delos receptores de los factores quimiotcticos han sido identificados como miembros de lasuperfamilia de los receptores unidos a la GTPasa (protenas G), cuya caracterstica estructurales que poseen 7 dominios transmembrana. Estos receptores existen en estados

interconvertibles de alta y baja afinidad a consecuencia de que desarrollan un ciclo deintercambio del nucletido guanina e hidrlisis de GTP durante el cual estas protenas sufrenvarios cambios conformacionales. Estos estados de alta o baja afinidad dependen delmicroambiente y los niveles de factores quimiotcticos.Las protenas G funcionan como intermediarios entre los receptores de superficie celular y lasenzimas efectoras responsables de la generacin de segundos mensajeros: AMPcinositoltrifosfato (IP3), Ca2+, diacilglicerol (DAG), cido fosfatdico (PA), cido araquidnico(AA).Estos segundos mensajeros son generados directa o indirectamente como consecuencia de laactivacin de las fosfolipasas A2, C y D. La activacin de los segundos mensajeros permite laremodelacin de la membrana citoplasmtica, el aumento del metabolismo de los fosfolpidos,la polimerizacin de la actina y el estallido respiratorio.


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Los eventos tempranos de activacin estn interrelacionados y son fundamentalmente cuatro:1- fosforilacin en tirosina de protenas de membrana y citoplasmticas2- hidrlisis del fosfolpido inositol de membrana3- incremento del Ca2+ citoplasmtico4- incremento de la actividad de la proteinquinasa C (PKC)

Los neutrfilos contienen una gran variedad de quinasas de serina/treonina y de tirosinas.Estas enzimas son blanco especfico de los segundos mensajeros.El entrecruzamiento de FcR induce la activacin de diversas familias de quinasas y detirosinas. Macrfagos y PMN defectivos para estas quinasas exhiben una considerabledisminucin de la fagocitosis y produccin de O2.

Mecanismo de fagocitosisLa interaccin receptor-ligando entre el fagocito y la partcula a ingerir activa la

maquinaria de la fase de ingestin para lo cual es necesario la modificacin de las protenasinvolucradas en el remodelamiento de la membrana y el citoesqueleto: actina, miosina yprotenas de unin a la actina. Los microfilamentos de actina en la porcin de citoplasma que

subyace al sitio de unin comienzan a polimerizarse. Esta polimerizacin lleva a que lamembrana envuelva la partcula, formndose seudpodos (extensiones de la membrana enforma de dedos). Estos rodean a la partcula y finalmente se fusionan formando la vesculafagoctica o fagosoma primario. Mientras esto ocurre, los grnulos citoplasmticos se fundencon la membrana del fagosoma y se produce un fagolisosoma. En el interior del fagolisosoma,la partcula ingerida queda expuesta a sistemas microbicidas que pueden clasificarse comooxgeno independientes y oxgeno dependientes.

Molculas efectoras independientes del oxgenoEstas sustancias estn localizadas en los lisosomas o grnulos citoplasmticos, se

liberan dentro de los fagolisosomas y no requieren la produccin de oxidantes para ser activas.Pueden actuar tanto intra como extracelularmente en el caso de que la partcula sea muygrande para ser ingerida generando lesin en el tejido subyacente y efecto conocido como

fagocitosis frustrada. Estos agentes incluyen proteasas y enzimas hidrolticas comofosfolipasas, glicosidasas y lisozima; la fagocitina y las leucinas que actan sobre lasmembranas bacterianas; la lactoferrina fija el hierro privando a las bacterias de este elementoindispensable para su crecimiento y la lisozima, que cliva los mucopptidos de la pared celularbacteriana.

Molculas efectoras dependientes del oxgenoDurante el proceso de fagocitosis las clulas pueden incrementar en 50 veces la

cantidad de oxgeno consumido y metabolizar grandes cantidades de glucosa. Debido al granconsumo de oxgeno, este fenmeno se denomina estallido respiratorio. El consumo deoxgeno es utilizado para la produccin de metabolitos txicos como anin superxido, perxidode hidrgeno, radicales hidroxilo, oxgeno singulete, hipocloritos y cloraminas.Se ha confirmado experimentalmente la relacin entre la citoxicidad de los macrfagos y la

produccin aumentada de los reactivos del nitrgeno e intermediarios del oxgeno. En lossobrenadantes de cultivo de macrfagos activados por citoquinas se encuentran niveleselevados de nitritos inorgnicos (NO2

-) y de anin superxido (O2-), ambos asociados con la

actividad antimicrobiana. Las vas oxidativas productoras de estos dos metabolitos sondiferentes y no comparten precursores comunes.

El siguiente esquema muestra las vas de produccin de molculas efectoras,sealando algunos de los estmulos necesarios para su activacin, a saber: interfern gamma(IFN), lipopolisacrido de E. coli(LPS) y forbomiristil acetato (PMA).


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L-arginina oxgeno

xido ntrico anin superxido(NO) (O2)

nitrito perxido de hidrgeno(NO2-) (H2O2)

nitrato radicales hidroxilo(NO3

-) (OH)

Existen mecanismos para incrementar la capacidad microbicida del H2O2,Uno de ellos

es la accin de la mieloperoxidasa (MPO), que cataliza la oxidacin y halogenacin dediferentes estructuras presentes en los microorganismos.El xido ntrico (NO) posee una vida media de pocos segundos, interacta con una serie

de molculas dando como resultado citotoxicidad. En presencia de oxgeno y agua, el NOgenera otros reactivos intermedios del nitrgeno y por ltimo se descompone para formar NO 2

-y NO3

-.Los niveles de formacin de los reactivos del oxgeno y produccin de NO estn

relacionados con el grado de susceptibilidad a las infecciones. A modo de ejemplo, podemoscitar la Enfermedad Granulomatosa Crnica que se presenta en individuos genticamentedeficientes en la enzima NADPH oxidasa.

Mtodos de evaluacin de las fases de la fagocitosis

a) Quimiotaxis:La quimiotaxis es el movimiento de los PMN a travs de un gradiente de concentracin desustancias (como la formil-metionina) que producen migracin dirigida. Los factoresquimiotcticos provienen principalmente de componentes bacterianos, de la degranulacin delos mastocitos durante el proceso inflamatorio y de la activacin del complemento (el C5a estconsiderado como uno de los ms potentes factores quimiotcticos).

Las pruebas de quimiotaxis se utilizan, en determinados pacientes sospechados depadecer una inmunodeficiencia, para evaluar la capacidad de sus clulas principalmenteneutrfilos frente a factores comprobadamente inductores de migracin

Tcnica de migracin celular bajo capa de agarosa: Consiste en preparar un mediosoporte de agarosa sobre un portaobjeto en el cual se siembran las clulas en posicin central,ubicando frente a las mismas la sustancia quimiotctica y una sustancia control. Durante laincubacin las clulas migran. Luego se fijan con metanol, se desprende la capa de agarosa yse tien las clulas. La migracin de los PMN se evala microscpicamente comparando ladistancia recorrida en direccin al factor quimiotctico (dirigida) y la migracin espontnea delas clulas (al azar). Los valores normales deben determinarse para cada especie y en ellaboratorio de referencia.

b) Quimiotaxis y adherenciaTcnica de migracin y adherencia a travs de una membrana: para ello se utiliza la

cmara de Boyden, que posee una membrana microporosa con poros de 3 micrones dedimetro. Se colocan las clulas en un compartimento y los factores quimiotcticos en otro y se

NADPHoxidasa

Oxido ntricosintasa (INOS)

Estimulacin por

fagocitosis o

tratamiento con

PMA

Otros reactivosintermediarios ymolculas efectoras

Activacin por

INF


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lleva a incubar. La capacidad de las clulas para migrar hacia el estmulo se evala tiendo lasque quedan retenidas en la membrana. Los resultados se comparan con los obtenidos conclulas del mismo animal (sin estmulo) y con PMN de un individuo normal utilizado comocontrol de valor de animal sano.

b) Activacin:La activacin de las clulas fagocticas se sealiza a travs de eventos de fosforilacin ydesfosforilacin de las protenas celulares involucradas en la trasmisin de la seal deactivacin. La posibilidad de identificar protenas fosforiladas con el uso de anticuerposmonoclonales que detectan, por ej., tirosinas fosforiladas, permite identificar el primer paso deactivacin de las clulas fagocticas. Para esta evaluacin es necesario recurrir a las tcnicasde PAGE e Inmunoblot a partir de las clulas activadas (ver captulos correspondientes en lapresente gua).La identificacin de la migracin de protenas del citoplasma al ncleo celular para regular latrascripcin de molculas relacionadas con la inflamacin y fagocitosis constituye tambin unamanera de identificar los primeros eventos de activacin celular. Como ejemplos de estossistemas podemos incluir la activacin del factor NF-kB que involucra la degradacin del factor

inhibidor de kB citoplasmtico (protena IkB) y el incremento de sus componentes p50 y p65 enel ncleo celular. Esta modificacin en los componentes proteicos celulares tambin se estudiautilizando anticuerpos marcados y mediante el uso de tcnicas de SDS-PAGE e inmunoblot.

c) Ingestin:La etapa de ingestin se puede evaluar utilizando como partcula a ingerir diferentesmicroorganismos. La utilizacin de levaduras como por ejemplo el Saccharomyces cerevisiae,se fundamenta en el tamao de las partculas (fcil de ver en el microscopio ptico) y laestructura de manosas que poseen estos microorganismos que son fcilmente detectados porlos PRRs. La capacidad de ingestin de las clulas provenientes del individuo a evaluar sedetermina realizando una cuantificacin del nmero de levaduras ingeridas en un determinadotiempo de incubacin.

El recuento de las partculas o microorganismos ingeridos puede ser realizado mediantediversas metodologas:- Tincin de las clulas con las coloraciones de Wright o Giemsa; de esta manera sediferencian las clulas que han ingerido de las que no. Se deben contar por lo menos 200clulas y determinar cuentas partculas por citoplasma celular es considerado como ingestinpositiva. Los mtodos microscpicos requieren una laboriosa observacin para determinar laasociacin de los microorganismos a las clulas y discriminar si estos microorganismos fueroningeridos o no.-Marcacin de las partculas a ingerir con fluorescena; se utiliza la marcacin de la partculacon isotiocianato de fluorescena u otro colorante fluorescente previo a la incubacin con lasclulas, luego se elimina por lavado las partculas no ingeridas y se detectan las clulas queingirieron por microscopia de fluorescencia o citometra de flujo (ver captulo correspondiente

en la presente gua). La utilizacin de la coloracin combinada diferencial con bromuro de etidiopermite identificar las bacterias extracelulares (fluorescen en color rojo-naranja) de aqullasinternalizadas (permanecen de color verde correspondiente a la fluorescena).-Marcacin de componentes bacterianos como protenas, DNA y/o RNA con sustanciasradiactivas. Las bacterias se marcan durante su fase de crecimiento con aminocidos onucletidos marcados con 14C, 35S amino 3H nucletidos: tritio y luego del experimento deingestin en el que se incuban las clulas y las bacterias durante un periodo de tiempogeneralmente entre 30 a 60 minutos a 37C se lavan las clulas para eliminar las bacterias noingeridas y se utiliza un detector de radioactividad como un contador de centelleo lquido oslido para cuantificar la radiactividad retenida por el sedimento celular. Esta actividad serelaciona con el nmero de partculas radiactivas ingeridas y por lo tanto con la capacidad deingestin de las clulas fagocticas del individuo evaluado.


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d) Digestin:

Evaluacin del estallido respiratorio

Reduccin del colorante nitroazul de tetrazolio

El nitroazul de tetrazolio (NBT) es un aceptor de un electrn utilizado para detectar enforma indirecta la produccin de superxido por parte de los PMN estimulados.El NBT de color amarilloy soluble, se transforma en formazn de color azul e insoluble

que precipita intracelularmente.

NBT (color amarillo y soluble) + O2- ---------- Formazn (color azul e insoluble) + O2

Para esta prueba se pueden utilizar PMN provenientes de sangre entera aislados delindividuo, estimulados con levaduras o forbolmiristilacetato (PMA) Luego de una incubacin de30 minutos a 37C, la formacin del formazn puede ser evaluada cuali o cuantitativamente.

Los cristales pueden identificarse intracelularmente por microscopa y realizar un recuento del

nmero de clulas que sufrieron estallido respiratorio, o bien los cristales pueden sersolubilizados utilizando N,N dimetilformamida y realizar la cuantificacin por espectrofotometraobteniendo los datos en densidad ptica.

QuimioluminiscenciaEl estallido respiratorio en los PMN normales est asociado con la generacin de

energa luminosa conocida como quimioluminiscencia, la cual es dependiente de la produccindel oxgeno singulete (1O2). Este oxgeno se produce cuando uno de los electronesdesapareados de oxgeno es elevado a una rbita superior con la inversin del spin. La luz seemite cuando el electrn retorna a su nivel inicial y se mide como quimioluminiscencia. Eloxgeno singulete es producido por la reaccin entre H2O2 y el hipoclorito:

H2O2 + OCl- ---------- 1O2 + H2O + Cl

-

La luz emitida se mide por la deteccin fluoromtrica apropiada. La sensibilidad del ensayo seincrementa por el uso de hidracina cclica, 5-amino-2,3-dihidro-1,4-phthalazinedione (luminol)que actan como substrato para el 1O2. La luminiscencia se mide en un contador de centelleousando el canal del 3H.

Evaluacin de la produccin de xido Ntrico (NO)Puede realizarse mediante la evaluacin de la produccin de NO o de la enzima que cataliza suproduccin (iNOS o NOS2)

Produccin del NOLos niveles de produccin de NO en los cultivos de macrfagos estimulados con

bacterias o productos bacterianos nos permiten evaluar el grado de activacin de estas clulas.La vida media del NO es de segundos, por esto, la evaluacin de su produccin se realizamediante la cuantificacin de nitritos en el medio de cultivo.La sntesis de nitritos comienza 4 a 6 horas luego del tratamiento con IFN y LPS en un cultivode macrfagos y es lineal por 72 horas. La identificacin de este metabolito en lossobrenadantes de cultivo se realiza mediante la utilizacin del reactivo de Greiss (sulfanilamiday naftiletilendiamina) que se colorea cuando reacciona con nitritos y nos permite relacionar lacoloracin con los niveles producidos en un cultivo. El cambio de color se evala porespectrofotometra a 550 nm. Se realiza una curva patrn utilizando diferentes concentracionesconocidas de NaNO2 y reactivo de Greiss. De esta curva se obtiene la relacin que permiteestimar la produccin de NO in vitro.


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Los anlogos de la L-arginina,como la NG-monomethyl-L-arginina (L-NMA), poseen accininhibitoria de la produccin de nitritos a partir del NO por la va de la iNOS por un fenmenocompetitivo. La utilizacin de estas molculas permite confirmar que el aumento de produccinde nitritos en un cultivo est dado por este mecanismo.

Incremento de la sntesis de la enzima xido ntrico sintasa inducible (iNOS oNOS2)

La produccin de NO en altos niveles se cataliza por la accin de la enzima xido ntricosintasa inducible. La expresin de esta enzima se produce por la accin de IFN y LPS en loscultivos y se relaciona con la activacin de macrfagos in vivo. Para la evaluacin del aumentoen la produccin de esta enzima se utilizan anticuerpos monoclonales que reconocen suestructura marcados con enzimas que se utiliza para identificarla en los extractos proteicoscelulares evaluados mediante las tcnicas de SDS-PAGE e Inmunoblot.

Evaluacin del efecto bacteriosttico o bactericidaLa digestin de las partculas ingeridas depende no slo de los mecanismos O

dependientes y O independientes descriptos sino de la capacidad del microorganismo de evadir

o inhibirlos, las bacterias intracelulares pueden permanecer en estas clulas fagocticas que setransforman en su habitat. En el caso de bacterias extracelulares u otros patgenos estemecanismo se constituye como capaz de contener o eliminar al agente agresorconstituyndose en un mecanismo efector bacteriosttico o bactericida. Estos mecanismospueden ser evaluados utilizando tcnicas de cultivo bacteriano y determinando el nmero deunidades formadoras de colonias sobrevivientes al proceso de fagocitosis.

Deficiencias en el mecanismo de fagocitosisLas deficiencias pueden estar dadas en el nmero de clulas fagocticas que posee un

individuo (diferencias cuantitativas) o sobre la funcionalidad de alguno de los mecanismosdescriptos (diferencias funcionales).Las granulocitopenias son frecuentes en las deficiencias secundarias a enfermedades

linfoproliferativas, tratamientos inmunosupresores o excesiva destruccin mediada poranticuerpos anti-leucocitarios. Las deficiencias funcionales pueden afectar la movilidad yadherencia o la capacidad de ingestin y digestin.

Algunas de las deficiencias descriptas como entidades clnicas son: Enfermedad Granulomatosa Crnica Deficiencia en la adhesin leucocitaria Deficiencia en glucosa 6 fosfatodeshidrogenasa Deficiencia en los grnulos secundarios

Para el diagnstico de estas inmunodeficiencias se trabaja con niveles de complejidadcrecientes.

Ensayos de nivel bsico:1. Determinacin cuantitativa y morfolgica de los granulocitos y monocitos.2. Estudios de mecanismos microbicidas oxigeno dependientes.

a) Prueba de la reduccin del nitroazul de tetrazolio.b) Quimioluminiscencia.

Ensayos de nivel complejo:1. Estudio de la expresin de las protenas de adhesin (antgenos LFA-1,

CD11b/CD18, etc.)2. Ensayos de quimiotaxis.3. Estudios enzimticos: mieloperoxidasa, glucosa 6 fosfatodeshidrogenasa, etc.


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Bibliografa1. Wyllie J. Currents Protocols in Immunology.1994.2. Margni R.A. Inmunologa e Inmunoqumica. Fundamentos. Editorial Mdica Panamericana

S A 1996.3. Baehner RL, Nathan DG. Quantitative nitroblue tetrazolium test in chronic granulomatous

disease. N.Engl. J. Md. 278: 971-976. 1968.4. Abramson JS, Wheeler JG. The Neutrophil. Oxford University Press. 1992.5. Aderem A, Underhill DM. Mechanisms of phagocitosis in macrophages. Ann Rev Immunol

1999. 17:593-623.

Complemento

El sistema de complemento (C) est formado por unas 30 protenas del suero queinteraccionan entre s de modo regulado formando una cascada enzimtica que permite unaamplificacin de la respuesta inmune humoral.Las principales consecuencias de la activacin del C son:1. Lisis del microorganismo o clula diana

2. Opsonizacin, con la consiguiente mejora de la fagocitosis y destruccin delmicroorganismo fagocitado3. Quimiotaxis sobre los fagocitos4. Accin anafilotxica,5. Eliminacin de inmunocomplejos circulantes

El complemento puede activarse por tres vas:1. La va alternativa, en la que interacciona directamente con la superficie del microorganismo.2. La va de las lectinas, una especie de variante de la va clsica, pero que se inicia sin

necesidad de anticuerpos3. La va clsica, a travs de la interaccin del C con inmunocomplejos.Las tres rutas comparten las ltimas fases, consistentes en el ensamblaje del denominado

complejo de ataque a la membrana (CAM).

El complemento puede ser estudiado para determinar su concentracin o funcionalidad enun animal sospechoso de padecer una inmunodeficiencia o una enfermedad autoinmune. Laconcentracin de los factores del complemento en un suero problema se miden porinmunodifusin simple radial o prueba de Mancini (ver captulo sobre reacciones secundarias).La funcionalidad del complemento en un suero problema se evala por la tcnica de hemlisis.Por otra parte, el complemento puede ser utilizado como un indicador de que la reaccinAg-Ac tuvo lugar, ya sea para identificar antgenos como anticuerpos. Por ejemplo, la lisis porcomplemento se puede utilizar para tipificar grupos sanguneos en animales utilizandoantisueros especficos. Mientras que, la tcnica de fijacin de complemento se emplea paradetectar Acs especficos para el diagnstico de algunas enfermedades infecciosas, utilizandoun Ag de referencia.

Fundamentos de la hemlisis mediada por complemento:Cuando a una suspensin de GR sensibilizados con anticuerpos especficos se le agregacomplemento, se produce la hemlisis y la consiguiente liberacin de hemoglobina (Hb) en elsobrenadante. Esta concentracin de Hb est en funcin directa con el grado de hemlisis quetuvo lugar en la muestra y puede ser evaluada por absorcin a 542 nm en unespectrofotmetro. Los estudios de cintica de esta inmuno-hemlisis han demostrado que lasensibilidad de estas valoraciones es mayor cuando el ttulo se establece sobre la base de ladosis de complemento que produce la lisis del 50% de los hemates del sistema.Esto tiene una explicacin clara si se analiza la curva que resulta de graficar los porcentajes de

hemlisis en funcin de la cantidad de complemento agregado al sistema, puede observarseque dicho grfico no corresponde a una recta, sino a una curva sigmoidea que presenta unamarcada pendiente en la zona que va del 25 al 75% de hemlisis. Los extremos de la curva,


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que corresponden a la zona que va del 0 al 25% y del 75 al 100 % de hemlisis, presentan unapendiente significativamente menor o nula.

De este grfico se deduce que, cuando se hacen cuantificaciones de C a 50% de hemlisis, elconsumo de pequeas cantidades de complemento produce cambios significativos en elporcentaje de hemlisis. Esta relacin no se observa cuando las cuantificaciones de C serealizan sobre la base del 100% de hemlisis. Por esto, la tcnica es ms sensible basndoseen el 50% de hemlisis.

Se define as la unidad de complemento hemoltica 50% (CH50), que corresponde a los mililitrosde suero fresco completo (como fuente de complemento) que son necesarios para producir la

lisis del 50% de los GR sensibilizados con anticuerpos, durante una hora de incubacin a 37C.La unidad CH50 se calcula sobre 5 X 108 eritrocitos ptimamente sensibilizados, resuspendidos

en un volumen total de 7.5 ml, en presencia de concentraciones ptimas de Calcio y Magnesio,a una fuerza inica y a un pH ptimo para cada especie.

Evaluacin de la funcionalidad del complemento en un suero problemaEn la prueba para evaluar la funcionalidad del complemento, los sueros de los animalesproblema y de referencia se diluyen en forma seriada en un rango que va desde 1/20 a 1/320.Luego se agrega una suspensin estndar de eritrocitos ptimamente sensibilizados a cadadilucin de suero. El complemento presente en el suero se activa por los Acs que recubren losGR (complejos inmunes) y causa la lisis de los eritrocitos (hemlisis). El porcentaje dehemlisis es proporcional a la concentracin de complemento dentro de cada dilucin de cada

suero en particular. La hemoglobina liberada se mide en un espectrofotmetro luego delperodo de incubacin.Se deben realizar los siguientes controles: 0% de hemlisis (buffer + GR sensibilizados), y 100% de hemlisis (agua destilada + GR sensibilizados).

El porcentaje de hemlisis para cada dilucin de suero evaluado se calcula de la siguienteforma:

DO (problema) - DO (0%lisis)% de hemlisis = x 100

DO (100% lisis) - DO (0%lisis)

Figura 1: Porcentaje de hemlisis en una muestra de GR sensibilizados en funcin de lacantidad de complemento agregado. El porcentaje de hemlisis se mide como la

concentracin de Hb que se obtiene en el sobrenadante por absorcin a 542 nm. Fuentede complemento: suero fresco de cobayo.


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Este ensayo produce tambin una curva sigmoidea si se grafica el % de hemlisis vs. ladilucin del suero problema. El valor del 50% de hemlisis es el elegido para definir el ttulo deun suero como la inversa o recproca de la dilucin del suero que produce un 50% dehemlisis. Las muestras de suero que van a ser utilizadas para evaluar la funcin del C debenser conservadas a -70C dentro de las 2 hs de extradas, dada la labilidad de las protenas delC. Mediante esta tcnica se evala la va clsica de activacin del complemento.Este ensayo tambin puede ser realizado usando placas de agarosa que contienen GRsensibilizados. El suero se agrega en hoyos cavados en la placa de agarosa y se permite quedifunda durante 20 hs a 4C. Las placas se incuban luego a 37C por 90 min para permitir lahemlisis, que se ve como un anillo rodeando los hoyos, cuyo dimetro es proporcional allogaritmo de la concentracin del complemento en el suero.

Anticuerpos

Obtencin de antisueros policlonalesCuando se inmuniza un animal con un antgeno y se provoca una respuesta inmune

aumenta notablemente en el suero del animal la cantidad de Igs especficas frente al antgenoempleado. Esto es la consecuencia de la seleccin clonal de los linfocitos B que producenanticuerpos contra el antgeno, el cual puede presentar diferentes epitopes, y cada uno de ellosser reconocido por varios clones de linfocitos B que producirn inmunoglobulinas especficas.Como consecuencia de esta respuesta inmune humoral especfica se acumulan un nmerodesconocido, posiblemente elevado, de diferentes molculas de inmunoglobulinas especficasfrente al antgeno en el suero del animal inmunizado. Se trata de un suero producido por laaccin de sntesis de numerosos clones de linfocitos B y por ello se ha denominado policlonal.(Figura 1)

Figura 1: Produccin de antisueros policlonales.

Antisuero policlonal


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El proceso de inmunizacin es aquel en el que se inyecta al animal el antgeno slo ocon adicin de adyuvantes, cuya funcin es favorecer su inmunogenicidad. Cuando lainmunizacin se realiza sobre animales vrgenes o naive, a la primera dosis se la describecomo: inmunizacin primaria o respuesta primaria. La primer dosis induce la sensibilizacindel individuo generando la expansin de los clonos especficos y la aparicin de clulas dememoria, pero la calidad de la respuesta en niveles de anticuerpos y clulas especficas puedeser incrementada y mejorada en dosis sucesivas, por lo tanto en los planes de inmunizacin seaplican diversas dosis. Existen numerosos protocolos de inmunizacin, con una duracinvariable, aunque una fase de inmunizacin primaria suele durar de 1 a 3 meses coninyecciones cada 15 a 21 das, y el proceso puede durar de 3 a 6 meses (puede variar tambinde acuerdo con la especie a inmunizar). La cantidad de antgeno depender del animalempleado. Los ms comnmente utilizados son ratn, rata, conejo, cabra y gallina. Lascantidades oscilan de los 50 a 1000 g de antgeno para una dosis en ratn a los 0,25 a 5 mgpor dosis en el caso de la cabra o los 15 mg en el caso de caballo.Cuando nuestro objetivo es obtener sueros hiperinmunes para utilizar como reactivos dediagnstico o inmunidad pasiva, los planes estn compuestos por varias dosis. Si nuestroobjetivo es sueros anti-sueros de diferentes especies, debemos considerar la distancia

filogentica para la eleccin de la especie dadora de suero. Como ejemplo, la utilizacin de lagallina como especie para obtencin de anticuerpos tiene dos ventajas: la distancia filogenticaexistente con los mamferos, y la purificacin de los anticuerpos de la yema del huevo, esengorrosa pero su obtencin no afecta la vida del animal dador.

En conclusin, se denomina suero hiperinmune al obtenido de animales que hanrespondido a mltiples inoculaciones de un antgeno determinado. Las aplicaciones sonnumerosas, por ejemplo, como reactivos para el diagnstico de ciertas enfermedades. Estossueros contendrn anticuerpos policlonales en alta concentracin contra los distintoscomponentes de un antgeno.

Anticuerpos monoclonales

Kohler y Milstein desarrollaron una tcnica que permiti la produccin de anticuerposproducidos a partir de un solo clon de linfocitos B. El fundamento de la tcnica consiste enfusionar linfocitos B provenientes de un ratn inmunizado con el antgeno de inters con lneascelulares provenientes de mielomas no secretante murino. Los hbridos resultantes presentandos propiedades: secretan anticuerpos especficos hacia el antgeno empleado en lainmunizacin, proliferan indefinidamente y pueden ser mantenidos como lneas celulares.

Esta tecnologa ha revolucionado el empleo de los anticuerpos, tanto en lo referido alenfoque diagnstico como teraputico. Es importante destacar que mediante esta metodologase pueden obtener anticuerpos homogneos (ya que proviene de un nico clon de linfocitosB) y de muy alta especificidad, lo que facilita la puesta a punto y repetitividad de varias tcnicasinmunolgicas.

Los anticuerpos monoclonales son inmunoglobulinas secretadas por un nico clon delinfocitos B y por lo tanto, con idntica secuencia aminoacdica en sus regiones variables.Poseen una especificidad nica, con una afinidad hacia el antgeno determinada e invariable ypresentan un nico isotipo. En estas caractersticas residen las principales ventajas quepresentan los anticuerpos monoclonales para su uso en investigacin y diagnstico. Por elcontrario, los anticuerpos policlonales consisten en una mezcla de inmunoglobulinasprovenientes de distintos clones de linfocitos B. A continuacin se enumeran las principalesdiferencias entre anticuerpos monoclonales y policlonales:


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Tabla 1: Comparacin de diferentes fuentes de anticuerpos

FuentesTipo de

Anticuerpo

Concentracinde Anticuerpostotales (mg/ml)

Concentracinde Anticuerpos

especficos(mg/ml)

Anticuerposcontaminantes

Posible purezade anticuerposespecficos (%)

Suero policlonal 10 1 (10% mximo) Otros Ac delsuero 10% comomximoSobrenadantede cultivo de

hibridoma (con10% de SueroFetal Bovino)

Monoclonal 1 0.05 (5%) Anticuerposbovinos > 95%

Sobrenadantede cultivo (sinSuero Fetal)

Monoclonal 0.05 0.05 (100%) Ninguno >95%

Lquido asctico Monoclonal 1-10 0.9-9 (90%) Anticuerpos deratn 90%

Fuente: Antibodies A Laboratory Manual. Ed. Ed. Harlow y David Lane. Cold Spring Harbor Laboratory. 1988.pp726.

Mtodos de Aislamiento y purificacin

1-aPrecipitacinLas interacciones de una protena en agua ocurren entre las molculas de protena-agua y

protena-protena. Cuando predominan las interacciones protena-agua, stas se hallan ensolucin; cuando predominan las segundas (protena-protena), stas precipitan. Cuando a unaprotena que se encuentra en solucin acuosa agregamos una sal, como la sal es mshidroflica que la protena, interacciona con el agua, le quita el agua y hace que predominen lasinteracciones protena-protena. Por lo tanto, la protena precipita.

Es importante considerar el pH de la solucin de trabajo: Cuando el pH de la solucin esigual al punto isoelctrico (pI) de la protena, la carga neta de dicha protena es cero y por lo

tanto sus molculas no se repelen, se aglomeran y precipitan. Es conveniente trabajar consulfato de amonio a 4C: A mayor temperatura, mayor solubilidad proteica y viceversa; esto secumple para el rango de 0 a 40C.En resumen, los factores que afectan la concentracin salina a la cual una protena enparticular precipitar son:1- el nmero y la posicin de los grupos polares;2- el peso molecular de la protena a purificar;3- el pH de la solucin;4- la temperatura a la que se desarrolla la precipitacin.

Precipitacin salinaLa precipitacin salina es un mtodo que permite separar las distintas fracciones proteicas

del suero. Las sales mas comnmente utilizadas son el sulfato de amonio y el sulfato de sodio.La ventaja de trabajar con sulfato de amonio es que no se cristaliza a temperaturas bajas ni

a temperatura ambiente, como lo hace el sulfato de sodio. La concentracin de sal a la cualprecipitan los anticuerpos vara segn la especie. Por ejemplo, la mayora de los anticuerposde conejo precipitan con una solucin saturada al 40%, mientras que los anticuerpos de ratnnecesitan entre 40-50%.

Precipitacin con cido caprlicoLa adicin al suero de cidos grasos de cadena corta como el cido caprlico en

condiciones medianamente cidas, precipita la mayora de las protenas con excepcin de lasIgGs. Esta metodologa, por lo tanto, permite obtener IgG purificada a partir de suero si se la

realiza en combinacin con otras metodologas (por ejemplo, cromatografa de intercambioinico).


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1-b CromatografaLa caracterstica que distingue a los mtodos cromatogrficos es la presencia de dos fases

mutuamente no miscibles (una mvil y una estacionaria) que se hallan en contacto. La muestraa purificar se introduce en la fase mvil, por lo que es transportada a lo largo de una columnaque contiene la fase estacionaria homogneamente distribuida. Los diferentes componentes dela muestra experimentan repetidas interacciones entre la fase mvil y la fase estacionaria.Durante el proceso, los componentes de la muestra se separan en funcin de su interaccincon la fase estacionaria: el componente que menos interacta es el menos retenido y eluyeprimero, el que ms interacta resulta retenido ms fuertemente y eluye ltimo. Una separacinptima entre dos componentes de una muestra se obtiene cuando el componente que eluye ensegundo trmino es retenido lo suficiente como para impedir su superposicin con elcomponente que eluy en primer trmino.

Las macromolculas biolgicas difieren en sus caractersticas fisicoqumicas: tamao,forma, carga, hidrofobicidad y arreglo de sus grupos funcionales dentro de su estructuratridimensional. La separacin de las muestras entre las fases aprovecha las diferencias entrelas propiedades fisicoqumicas de cada uno de los componentes de una muestra dada. Eslgico, por lo tanto, que los mtodos cromatogrficos ms comunes para la purificacin de

estas molculas sean:Cromatografa de exclusin molecular (discriminacin por tamao y forma),Cromatografa de intercambio inico (discriminacin por carga),Cromatografa de interaccin hidrofbica (discriminacin por superficie hidrofbica),Cromatografa de afinidad (distribucin de aminocidos especficos en la superficie de lasprotenas, inmovilizacin de metales).

Cromatografa de Exclusin Molecular

Fundamentos:

Este tipo de cromatografa utiliza como soporte esferas de gel con poros de diferentetamao. Una columna construida de esta manera tendr dos volmenes medibles, el volumenexterno (Vo), constituido por el volumen intersticial (el espacio que queda entre las esferas degel), y el volumen interno (Vi) que es el volumen de las esferas a los que los solutos y solventespueden acceder cuando se introducen dentro de aqullas a travs de sus poros. Las molculasque no puedan acceder al Vi, debido a que su tamao es mayor al de los poros, slo seequilibrarn en el Vo, mientras que las de menor tamao se equilibrarn en ambos volmenes.Cuando una muestra compleja de protenas y otros componentes, disuelta en un pequeovolumen, es aplicada a una columna con estas caractersticas, filtrar a travs de la misma. Lasprotenas de mayor peso molecular eluirn con el Vo y por lo tanto eluirn primero, mientrasque las protenas de menor tamao, que pueden acceder al Vi, eluirn ms tardamente y enun volumen de elucin (Ve) determinado que depender de su peso molecular. Ver esquema


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Aspectos metodolgicos: La matriz ms utilizada en este tipo de cromatografa es Sephadex , que se expende en

forma de polvo y puede tener diferentes tamaos de poro, lo que implica la separacin deprotenas de diferente tamao.

Las muestras no pueden contener una concentracin proteica de ms de 50 mg/ml. Lasmuestras deben ser clarificadas por centrifugacin a fin de eliminar todo el materialinsoluble que pueda disminuir el flujo de la columna y contaminar la matriz de la mismaprevio a la cromatografa.

La fuerza inica de los solventes cromatogrficos debe ser lo suficientemente elevada

como para impedir la adsorcin inespecfica del soluto a la matriz por interaccioneselectrostticas o uniones de Van Der Waals

Como las molculas de IgM son mucho ms grandes que las molculas de IgG y de otrasprotenas que se encuentran en el suero, la cromatografa de exclusin molecular puedeser usada para separar IgM. Cuando se requiere obtener una preparacin pura de IgM, sepuede utilizar esta tcnica combinada con la precipitacin con sulfato de amonio.

Cromatografa de Intercambio Inico

Fundamentos:La cromatografa de intercambio inico trabaja mediante la unin de biomolculas con una

carga determinada, a una matriz estacionaria de carga opuesta.Las biomolculas se unen a resinas de intercambio inico cuando tienen carga opuesta a la delos iones fijos de la resina. Esta unin es de tipo electrosttico y reversible: La fuerza de esta unin puede ser modificada variando la concentracin salina y el pH de la solucin bufferutilizada como eluyente.

La separacin de dos o ms sustancias mediante la utilizacin de resinas de intercambioinico se consigue por un mecanismo de adsorcin reversible, que consiste en la fijacin inicialy posterior remocin de tales sustancias a una resina estabilizada. Si las sustancias fijadastienen diferentes propiedades elctricas, mediante la variacin del pH o fuerza inica deleluyente se conseguir que cada una de ellas eluya por separado.


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Matrices y solventes:La matriz puede estar constituida por silicato de aluminio, resinas sintticas, polisacridos

como la celulosa o el dextrano, etc. La naturaleza de los grupos cargados es la que determinael tipo y la fuerza de unin del in intercambiador. Los dos tipos de resinas ms utilizadas son: de intercambio catinico (con matrices con carga negativa) y de intercambio aninico (con matrices con carga positiva).La eleccin correcta de la resina, en especial en lo que se refiere al grupo funcional que leaporta la carga, depender de la carga neta de la sustancia que se desea separar.En los casos de molculas anfotricas como las protenas, que poseen grupos cargadospositiva y negativamente, su carga neta depender del pH del medio. Estas sustancias, segnsea el pH del medio, podrn unirse a resinas aninicas o catinicas; en su punto isoelctrico(pI), tendrn carga neta cero y no se fijarn a ningn tipo de resina intercambiadora.

Cromatografa de AfinidadFundamentos:

La tcnica de cromatografa de afinidad es una de las tcnicas ms utilizadas para la purificacin deprotenas. Consiste en una cromatografa de adsorcin en la que se aprovecha la especificidad de

interacciones biolgicas como las interacciones antgeno-anticuerpo, enzima-inhibidor, hormona-receptor, lectina-hidrato de carbono, etc. La biomolcula que se quiere purificar (por ejemplo, unanticuerpo) usualmente tiene un sitio de reconocimiento a travs del cual puede interactuar con otramolcula natural o artificial a la que se llama ligando. El ligando es inmovilizado sobre una matrizpolimrica y es usado para capturar selectivamente a la biomolcula que se desea purificar, cuando stase encuentra en una mezcla impura. La biomolcula deseada puede ser eluda del ligando por cambiosen las condiciones externas (pH, fuerza inica, solventes y temperatura) que desestabilizan la interaccinbiomolculaligando y permiten que la molcula deseada sea eluida en forma purificada.

Existe una gran diversidad de biomolculas que pueden purificarse por este mtodo cromatogrfico,entre ellas: antgenos, anticuerpos, enzimas, protenas unidas a hormonas, protenas unidas a vitaminas,receptores, glicoprotenas, lectinas, ARN, ADN, bacterias, virus, fagos, clulas y protenas producidaspor ingeniera gentica.

La naturaleza de la matriz a la que se fijan los ligandos es muy importante, ya que en las condiciones

experimentales debe ser fsica y qumicamente estable, no debe actuar como tamiz molecular y debeasegurar un buen flujo durante la elucin.Existen numerosas matrices comerciales disponibles en su forma activada o sin activar para

ser utilizadas como soporte para el ligando. La activacin de la matriz se realiza para que elligando quede inmovilizado en ella a travs de una interaccin qumica que produzca una uninestable entre matriz y ligando.

En general, se utilizan matrices de naturaleza polisacrida, en su mayora derivados de laagarosa. Debido a su estructura qumica, estas matrices tienen la caracterstica de ser casiinertes, de forma que no producen interacciones inespecficas. Esto es esencial porque lacromatografa de afinidad se basa en interacciones especficas.La seleccin del ligando utilizado en cromatografa de afinidad debe tener en cuenta:1- que la afinidad de unin del ligando sea especfica y reversible por la sustancia que ser

purificada.2- que el ligando posea grupos qumicamente modificables que permitan su unin a la matrizsin que se destruya su capacidad de unin a la sustancia que ser purificada.Por ejemplo, si el ligando es un anticuerpo, ste se va a unir a la matriz a travs de su porcinFc, y por lo tanto, quedar libre el sitio de unin al antgeno. Al agregar un antgeno, ste serreconocido y unido por el anticuerpo inmovilizado en la columna. Las dems molculaspresentes pero no unidas a la matriz (no reconocidas por el ligando) se eliminan por lavado.Posteriormente, el antgeno unido al anticuerpo de la columna se eluye y se obtiene en formapura.

El ligando idealmente debera tener una afinidad de unin de 10-4 a 10-8 M-1 en solucin. Sila constante de disociacin es mayor que 10-8 M-1 esta tcnica no puede ser utilizada para lapurificacin de estas molculas pues la unin es muy estable y la separacin de la biomolcula

del ligando se hace muy difcil. Estas afinidades muy altas corresponden a la interaccinhormona-receptor para lo cual este mtodo no resulta til.


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Ejemplos,

Purificacin por columna de protena A-sepharosa:La protena A se encuentra en las paredes celulares de Staphylococcus aureusy tiene la

particularidad de unirse al fragmento Fc de anticuerpos. Se han encontrado protenas similares

en otras bacterias (por ejemplo protena G en Streptococcus sp.). Aunque se desconoce laexplicacin biolgica de la fuerte afinidad que tienen la protena A y la protena G con lasmolculas de IgG, se supone que representara un mecanismo de escape de las bacterias a larespuesta inmune del husped. A partir del estudio de estas protenas, se las comenz autilizar para purificar especficamente anticuerpos a partir de una muestra impura.La protena A se acopla a una matriz de sepharosa activada.

En la Tabla 2 se muestran las afinidades de las protenas A y G con anticuerpos de diferentesespecies:

Tabla 2

Especie Afinidad por Protena A Afinidad por protena GHumano ++++ ++++Caballo ++ ++++Vaca ++ ++++Cerdo +++ +++Oveja +/- ++Cabra - ++Conejo ++++ +++Pollo - +Hamster + ++

Cobayo ++++ ++Rata +/- ++Ratn ++ ++

Fuente: Antibodies A Laboratory Manual. Ed. Ed. Harlow y David Lane. Cold SpringHarbor Laboratory. 1988. pp726.

Purificacin por columnas de inmunoafinidadEn este caso se puede utilizar una columna a la que se une un anticuerpo especfico frente alantgeno que se va a purificar o una columna a la que se une un antgeno, al colocar la muestraa purificar solo se unirn los anticuerpos especficos frente a ese antgeno.

Purificacin por columnas de afinidad a metales

inmunologia guia 2º cuatrimestre 2010

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