inmunoexpresiÓn de cÉlulas productoras de …
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Tercer Congreso virtual de Ciencias Morfológicas.
Tercera Jornada Científica de la Cátedra Santiago Ramón y Cajal.
INMUNOEXPRESIÓN DE CÉLULAS PRODUCTORAS DE BOMBESINA EN
ESTÓMAGO DE CERDOS CON DIAGNÓSTICO DE GASTRITIS CRÓNICA
PROVOCADA POR HELICOBACTER SPP.
Mac Loughlin Roy Virginia Hebe1, Dauria Maglione Pascual Guillermo2, Van Deer Veen
Maria Paula3, Bonino Destribat Facundo Ubaldo4 , Sagripanti Centeno Graciela Esther5,
Martínez Astorga Ramiro Andrés6, Navarro Ferrer Osvaldo Esteban7, Gimenez Sabrina
Ramona8, Sona Sicot Liliana Angela9, Ritta Leandro Domingo10 , Hernandez Aldana11.
1 Dra. Prof Adjunta exclusiva, categoría V, Histología - FAV.UNRC- Río Cuarto-
Argentina.
2 MSC, Prof Asociado, categoría III, Histología-FAV.UNRC- Río Cuarto- Argentina
3 Med Vet docente adscripta Histología-FAV.UNRC- Río Cuarto- Argentina
4 JTP exclusivo, categoría V , Bioestadística- FAV.UNRC- Río Cuarto- Argentina
5 Histotecnóloga, Histología-FAV.UNRC-Río Cuarto-Argentina
6 Dr, Ayudante de primera exclusivo, categoría IV, Histología-FAV.UNRC- Río
Cuarto- Argentina
7 Med Vet, JTP exclusivo, categoría V, Histología-FAV.UNRC- Río Cuarto- Argentina
8 Lic en Biología, docente adscripta Histología-FAV.UNRC- Río Cuarto- Argentina
9 Msc, JTP exclusivo, categoría V, Histología-FAV.UNRC- Río Cuarto- Argentina
10 Ayudante alumno, Técnico en Laboratorio, Histología-FAV.UNRC-Río Cuarto-
Argentina
11 Ayudante alumno. Alumno carrera Medicina Veterinaria- FAV.UNRC-Río Cuarto-
Argentina.
Correo electrónico del primer autor: [email protected]
RESUMEN
La mitad de la población humana está infectada por la bacteria Helicobacter pylori
(Hp) asociada a las gastritis crónica, aguda, úlcera, cáncer y linfoma gástrico.
Estudios confirman la intervención de (Hp) en enfermedades gástricas de humanos
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y la existencia de diferentes especies en diversos animales. En porcinos se ha
detectado H. heilmannii o suis. Estas bacterias serían patógenos responsables de
zoonosis. Helicobacter pylori altera el control inhibitorio de la liberación de gastrina
lo que resulta en una excesiva secreción ácida con la consecuente formación de
úlceras pépticas. La hipergastrinemia asociada con H. pylori es producida por la
acción de la bombesina, ya que una vez erradicada la bacteria, los niveles de la
hormona vuelven a su normalidad. Se determinó la presencia de Helicobacter spp.
en biopsias de la región antral de estómago de cerdos mestizos, obtenidas de
Frigoríficos de la zona de Río Cuarto, diagnosticados con gastritis. La detección de
células productoras de bombesina se realizó con anticuerpos comerciales a través
de técnica inmunohistoquímica. Se determinó el porcentaje de células bombesina
positivas en muestras de cerdos gastritis crónica H(+)/(-). En este estudio
preliminar, no se detectaron diferencias estadísticas significativas entre los grupos
gastritis agudas Helicobacter H (+)/ (-)(p= p=0,89).
PALABRAS CLAVES: cerdos, estómago, bombesina, Helicobacter spp,
inmunohistoquímica.
INTRODUCCIÓN
La mitad de la población humana está infectada por la bacteria Helicobacter pylori
asociada a gastritis crónica, aguda, ulcera, cáncer y linfoma gástrico (22; 33).
El Helicobacter pylori, microorganismo Gram negativo, fue observado por primera
vez por el patólogo Robin Warren a principios de junio de 1979. Su detección en
estudios histopatológicos continuó algunos años más, asociando la presencia del
microorganismo con enfermedades gástricas en el hombre, tras varios intentos, sin
éxito, de aislar la bacteria (39; 27; 43; 38; 28). En 1994, Helicobacter pylori fue
declarado como la principal causa de úlcera péptica y cáncer en humanos, como lo
demuestran estudios efectuados sobre el particular (30; 38). Sin embargo, algunos
autores sugieren que la úlcera péptica es una enfermedad multifactorial donde
Helicobacter pylori no desempeñaría necesariamente un papel relevante en la
misma (20; 42).
3
Estudios posteriores confirman la intervención de Helicobacter pylori en
enfermedades gástricas de humanos como así también la existencia de diferentes
especies de Helicobacter en diversos animales, como H. mustelae en hurones; H.
acynonyx en leopardos y chitas; H.felis, H. helmannii; H. bizzozeronii en perros; H.
helmannii, H. felis y H. pylori en gatos (31).
En porcinos se ha logrado reproducir úlcera gástrica mediante la inoculación
experimental de H. pylori (36); detectándose, además, otra bacteria espiralada,
ureasa positiva, que se presenta de manera natural en el cerdo, asociada con la
presencia de úlceras gastroesofágicas, por lo que se la propuso como un factor
posible relacionado con la etiopatogénesis (34; 36). A este microorganismo se lo
puede conocer como Helicobacter heilmannii o Helicobacter suis y en la actualidad
son consideradas como idénticas (16; 2; 36). La evaluación histológica, con la
coloración de Warthin-Starry, reveló la presencia de dos tipos morfológicos de
bacterias: la primera, caracterizada por su mayor tamaño y morfología
marcadamente espiralada, concuerda con las descripciones de H. heilmannii y la
segunda, de menor tamaño y con forma de "s" itálica, se corresponde
morfológicamente con la bacteria H. pylori. Algunas investigaciones sugieren que
estos microorganismos colonizan el estómago del cerdo o que un mismo género
podría asumir patrones morfológicos diferentes por causas inherentes al ambiente
gástrico del huésped (25; 11; 36). Estas bacterias serían patógenos responsables
de zoonosis y podrían transmitirse a partir de la especie porcina (40; 3; 23).
En el tracto gastrointestinal (TGI) de humanos, animales domésticos y silvestres se
encuentran diversas hormonas peptídicas cuyas funciones se relacionan no sólo con
los procesos digestivos, metabólicos, crecimiento y desarrollo de aquél, sino
también con las emociones y conductas (41). La producción de estas hormonas se
atribuye a células especializadas denominadas gastroenteropancreáticas (GEP)
encuadradas dentro del sistema enteroendocrino, En diversas especies animales
aquéllas muestran una distribución variable en estómago e intestino delgado y
grueso (14; 5; 6;35) asociadas a diferentes estructuras de las túnicas mucosa,
submucosa y muscular. El TGI es considerado como el órgano endócrino más
grande del organismo con al menos quince tipos de GEP, cuyas funciones guardan
conexión con el cerebro (35). Dichas células producen distintos péptidos como la
4
motilina, gastrina, secretina, serotonina, GIP, etc (41). La secreción de ácido
gástrico es principalmente controlada por la hormona gastrina sintetizada por las
células G de la mucosa estomacal. Cuando la gastrina es liberada, ingresa a la
circulación sistémica y estimula a las células parietales para que secreten ácido
clorhídrico. Helicobacter pylori altera el control inhibitorio de la liberación de
gastrina a cargo de las células productoras de bombesina y las células D
productoras de somatostatina, lo que se traduce en una excesiva secreción ácida
que conlleva a la producción de úlceras pépticas (37).
La bombesina pertenece a un grupo de neuropéptidos, originalmente aislado de la
piel de los batracios, que en los mamíferos encuentra su similar en dos péptidos:
péptidos liberador de gastrina (GRP) y la neuromedina B (NMB) cuya función es
desconocida (44). La GRP estimula la secreción de gastrina y motilina (35), siendo
liberada, como neurotransmisor, desde las terminaciones nerviosas a las células
diana (miocitos de la muscular de la mucosa, muscular externa, túnica media de los
vasos sanguíneos). También actúa a nivel del SNC y estimula la concentración
plasmática de PP, glucagón, insulina, GIP (1). La hipergastrinemia asociada con H
pylori es estimulada y producida por la acción de la bombesina, ya que, una vez
erradicada la bacteria, los niveles de la hormona recobra los valores normales lo
cual explicaría la importancia de la bombesina en la infección por H pylori (18, 20;
4).
Diversas investigaciones demuestran que la infección provocada por dicho
microorganismo, a nivel del antro gástrico, produce anomalías importantes en la
secreción de hormonas polipéptidicas gastrointestinales como la gastrina (8; 10;
37). La acción inflamatoria sobre el epitelio gástrico disminuye la cantidad de
células D que sintetizan somatostatina, lo que altera a su vez a las células
productoras de bombesina (33) esta última, actúa estimulando a las células G
productoras de gastrina, lo cual provoca no solo un aumento de la cantidad de
gastrina sérica (37) sino también un aumento del número de células que la
producen (24) incrementándose así la secreción del jugo gástrico (9) lo que
conlleva a un aumento de la secreción de ácido clorhídrico. Estos fenómenos, al
aumentar los factores agresivos y disminuir los factores defensivos, provocan un
desbalance con la consiguiente pérdida de la homeostasis local generando una
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lesión ulcerada (26; 12). Estas anomalías tienen consecuencias importantes en la
fisiopatología gástrica y en la patogenia de la ulceración (29).
Los estudios realizados en gerbos de Mongolia y en el hombre han asociado la
infección de Helicobacter spp. con el desarrollo de carcinomas gástricos (21; 13).
Dos tipos de tumores aparecen luego de la infección prolongada con H. pylori:
adenocarcinomas y carcinoides de células enterocromafines o ECL.
Concomitantemente, en roedores africanos (Mastomys natallensis), se investigó el
desarrollo de tumores gástricos asociados a ECL determinándose que la gastrina
está estrechamente vinculada con la aparición de este tipo de tumores y con
adenocarcinomas (21; 13).
No se sabe exactamente como Helicobacter (H) se transmite de animales a
humanos, pero lo más probable es que sea a través del contacto directo. Vivir en
proximidad con gatos, perros y en especial con cerdos, se constituye en un factor
de riesgo para estas infecciones. La intensidad del contacto con animales también
es importante ya que se observó una mayor incidencia de estas afecciones en
criadores de cerdos y personal de mataderos (17; 23). En las afecciones gástricas
humanas, H. pylori es el microorganismo más frecuentemente hallado aunque
también en esta especie se ha reportado la presencia de H. suis (17).Por otro lado,
diversos estudios han establecido que el H. suis, asociado a úlceras estomacales en
cerdos, pueden ser causal de muerte súbita lo que motiva un impacto desfavorable
sobre la producción. Así mismo, otros estudios, demuestran que los seres humanos
en contacto cercano con cerdos tienen un riesgo más alto de adquirir la infección
(3; 40; 23).
Las pérdidas económicas para la industria porcina y el riesgo de que las bacterias
puedan infectar a humanos, justifican la necesidad de futuras investigaciones.
La capacidad de estos microorganismos para colonizar en forma natural y para
inducir lesiones gástricas en el hombre, incluyendo el cáncer gástrico en diferentes
especies animales, ha generado preocupación a nivel mundial por su posible riesgo
zoonótico, pero hasta el presente esto aún no ha sido dilucidado
Por ello, se estima que el presente estudio aportaría conocimientos no solo en el
campo de la producción animal sino también en el de la medicina humana ya que
permitiría indagar sobre posibles impactos zoonóticos entre especies susceptibles a
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Helicobacter. La importancia de este trabajo no solo refiere a las ciencias básicas,
sino también a aquellas relacionadas con la Producción Animal y la Salud Pública,
debido al vínculo disciplinar e interdisciplinar que se establece respectivamente y al
convocar aspectos comunes relacionados con patologías que afectan a la especie
humana y animal.
Hipótesis
Las gastritis producidas por Helicobacter spp. provocan, a nivel gástrico,
alteraciones en células productoras de hormonas gastrointestinales (HGI). Dada la
falta de estudios relacionados con el comportamiento de las células productoras de
HGI, tales como bombesina en cerdos afectados por gastritis, y que estudios
efectuados en otras especies, también afectadas por gastritis, han revelado
alteraciones en células productoras de otras hormonas, es de esperarse un
comportamiento similar en cerdos que padecen gastritis.
Objetivo general
Determinar el comportamiento de la hormona bombesina en estómago de cerdos
afectados por gastritis crónica provocada por Helicobacter spp.
Objetivos específicos
-Determinar la presencia de gastritis en cerdos a través de técnicas histológicas
convencionales.
-Determinar la presencia de Helicobacter spp. a través de tinciones especiales e
inmunohistoquímica.
-Determinar mediante la técnica inmunohistoquímica la presencia y expresión
cualitativa y cuantitativa de la hormona bombesina en cerdos afectados por
gastritis crónica provocada por Helicobacter spp.
MATERIAL Y METODOS
Se emplearon cerdos mestizos de diferentes edades y sexos, provenientes de
frigoríficos de la zona de Río Cuarto, Argentina (33,11º S, 64,3º O). En todos los
casos se trato de animales destinados a faena y considerados libres de enfermedad
de acuerdo al examen clínico y postmortem realizado. Se procesaron 60 muestras
de estómago de cerdos. Inmediatamente de obtenidas se lavaron con solución
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salina de Hank’s (SSH) (Gibco), conteniendo 10.000 u/ml de penicilina g sódica, 10
mg/ml de sulfato de estreptomicina y 2,5 mg/ml de fungizona, y posteriormente
fueron fijadas con formol salino tamponado hasta su procesamiento en el
laboratorio. Una vez fijadas se sometieron a la técnica histológica convencional;
deshidrataron con baterías de alcoholes de graduación creciente e incluyeron
incluyeron en parafina. Se realizaron cortes histológicos de aproximadamente 4 µm
las muestras se distribuyeron en partes iguales y se sometieron a las tinciones de
hematoxilia-eosina para el diagnóstico de gastritis, de Giemsa y Warthin Starry
para la detección de Helicobacter spp. y a estudios inmunohistoquímicos para la
detección de Helicobacter spp y de células productoras de bombesina utilizando
anticuerpos comerciales.
Se empleó la técnica Indirecta denominada Complejo Avidina-Biotina-Peroxidasa
(ABC) (32;45;15). Los marcadores a utilizar fueron anticuerpos primarios
comerciales mientras que, como reveladores, el Complejo universal avidina-biotina
(ABC) y el sustrato peroxidasa diaminobencidina (DAB).
La obtención de las imágenes se efectuó mediante una cámara digital Powershot
G6, 7.1 Megapixeles (Canon Inc, Japón) adosada al microscopio óptico Axiophot
(Carl Zeiss, Alemania)
Análisis Estadístico
Para el recuento celular se procededió a contar, en cada preparación histológica, 5
(cinco) campos al azar con el fin de obtener el porcentaje de células positivas a
bombesina. Se recurrió al conteo a ojo de por lo menos dos investigadores. Estos
resultados fueron sometidos a diversas Pruebas t para muestras Independientes
utilizando el programa estadístico InfoStat versión 2011 (7).
RESULTADOS
La figura 1, correspondiente a una muestra de mucosa gástrica con diagnóstico de
gastritis crónica sometida a la tinción de hematoxilina/eosina, revela una marcada
infiltración leucocitaria en la lámina propia.
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En la Figura 2 se observa una muestra gástrica de cerdo con diagnóstico de
gastritis crónica teñida con Giemsa donde se visualiza la presencia de bacterias con
forma bacilar correspondientes a Helicobacter spp.
La figura 3, correspondiente a una muestra de la región antral de la mucosa
gástrica de cerdos con diagnóstico de gastritis crónica H (+) sometida a la tinción
de Warthin Starryn, revela la presencia de Helicobacter spp.
En la figura 4, correspondiente a una muestra gástrica con diagnóstico de gastritis
crónicas Helicobacter (+), se observa en el epitelio glandular la presencia de células
con inmunomarca positiva a bombesina.
En la figura 5, correspondiente a una muestra gástrica de la región antral con
diagnóstico de gastritis crónicas Helicobacter (+), se observa en el epitelio
glandular la presencia de células con inmunomarca positiva a bombesina.
Al evaluar el porcentaje de células positivas a bombesina en los cerdos con
diagnóstico de gastritis crónica H(+) y gastritis crónica H(-) se determinó que no
existen diferencias significativas entre los valores medios poblacionales (p=0,89).
DISCUSIÓN
En el presente estudio los resultados histopatológicos son coincidentes con los
hallados por otros investigadores puesto que en las biopsias gástricas se pudo
determinar la presencia de un infiltrado leucocitario y lesiones compatibles con
gastritis aguda y crónica. Dichas lesiones se corroboraron a través de tinciones
histológicas convencionales.
La observación histológica también reveló la presencia de bacterias espiraladas que
concuerdan con las descripciones de Helicobacter spp. Se observó que la
colonización de estos microorganismos fue más evidente en la región antral
(5;6;9).
Este hallazgo confirma lo reportado por otros investigadores respecto a la
presencia del Helicobacter spp en el estómago de cerdos ya que que los
microorganismos observados se presentan colonizando con mayor frecuencia la
mucosa fúndica y pilórica. Otros investigadores asociaron, la gastritis pilórica, con
la infección producida por Helicobacter spp en el cerdo (5;6;8).
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La infección por Helicobacter spp, como revelan distintas investigaciones, produce
anomalías importantes, a nivel del antro gástrico, en la secreción de hormonas
gastrointestinales, entre ellas la producción de bombesina. Estas anomalías tienen
consecuencias importantes en la fisiopatología gástrica y en la ulceración. La
hipergastrinemia asociada con H. pylori es producida por la acción de la bombesina
ya que, una vez erradicada la bacteria, los niveles de la hormona vuelven a su
normalidad lo cual explicaría la importancia de la bombesina en la infección por H
pylori (18;4). Hasta el presente, las investigaciones hacen referencia al aumento de
esta hormona respecto a su concentración sérica (5;10). En este estudio preliminar
los resultados obtenidos nos indican que no hay aumento de la cantidad de células
productoras de bombesina, contrariamente a lo que sucede con las células
productoras de gastrina donde no solo aumenta la concentración tal como lo
establece Sleinsinger et al., 2000 sino que también se produce un aumento en el
número de células que las producen (24).
CONCLUSIONES
En este estudio preliminar, los resultados indican que no hay diferencias
estadísticamente significativas respecto al número de células productoras de
bombesina en cerdos con diagnóstico de gastritis crónica Helicobacter positivos y
gastritis crónica Helicobacter negativos.
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14
Anexos.
Figura 1: Microscopía óptica de biopsias gástricas, región antral con diagnóstico de
gastritis crónica. LP: lámina propia. G: glándula gástrica. IL: infiltrado leucocitario.
Tinción H/E, 400 x.
Figura 2- Microscopía óptica de biopsias gástrica, región antral con diagnóstico de
gastritis crónica H(+). Helicobacter spp. Tinción de Giemsa, 1000 x.
15
Figura 3: Microfotografía de biopsia gástrica región antral con diagnóstico de
gastritis crónica coloreada con la tinción de Warthin-Starry en donde se observan
Helicobacter spp, 1000x.
Figura 4- Inmunoexpresión de células productoras de Bombesina en biopsia
gástrica con diagnóstico de gastritis crónica H (+). 1000x.
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Figura 5-Inmunoexpresión de células productoras de gastrina en biopsia gástrica
con diagnóstico de gastritis crónica H (-). 1000x.