INGENIERÍA GENÉTICA. MANIPULACIÓN GENÉTICA TECNOLOGÍA DEL ADN RECOMBINANTE

Bajo la denominación de Genética molecular se engloban procesos y fenómenos relacionado con el material genético como son la replicación, transcripción, traducción, el código genético y las mutaciones. La Genética molecular empieza en 1953 cuando Watson y Crick descubren la estructura del ADN, que es la base de disciplinas absolutamente revolucionarios en la Biología y podríamos decir que en toda la Ciencia.

Más adelante, en 1970 Smith y Wilcox descubren las enzimas de restricción, Temin y Baltimore descubren la retrotranscripción, en 1983 K.B Mullis desarrolla la PCR, se desarrollan técnicas de secuenciación de ADN, y otras muchas más. Todas estas técnicas constituyen la Ingeniería Genética (= Manipulación genética) que permitir manipular el genoma de un ser vivo. Esta manipulación consiste en:

Introducir genes (normalmente de otro ser vivo) en un genoma. Eliminar genes. Modificar su secuencia de bases Secuenciar genes Clonar genes

Realmente habría que denominar a dichas técnicas Tecnología del ADN Recombinante, ya que con ellas se obtienen nuevos ADN que no existían.

Si aplicamos estos métodos y técnicas a los seres vivos para obtener un producto o servicio, hablamos de BIOTECNOLOGÍA, que ha experimentado una auténtica revolución gracias a ellos. Por ejemplo, la insulina o la hormona del crecimiento que se inyectan los diabéticos hoy día es la humana, pero la fabrican bacterias (E. coli), también se puede citar muchas vacunas. Por tanto la Ingeniería Genética se sitúa entre la Genética Molecular y la Biotecnología. Es decir, para poder fabricar insulina con bacterias antes hay que manipular el gen humano (localizarlo, cortarlo, clonarlo e insertarlo en la bacteria, es decir, hacer ingeniería genética).

Genética sirve Manipulación se aplica BiotecnologíaMolecular de base para la genética en la

Algunos hechos destacables de la I.G. y la biotecnología son:

1977 Herbert Boyer inserta el gen de la somatostatina en el ADN de E. Coli, 1978 en EE.UU. se logra producir insulina humana en bacterias y en 1983 se

comercializa. 1980 Weismann, en Suiza, sintetiza interferón con bacterias. 1982 Se obtienen ratones transgénicos gigantes a partir de óvulos a los que

se inyectó el gen de la hormona del crecimiento. 1984 Obtención por biotecnología de la vacuna contra la hepatitis B 1985 Alec Jeffreys, en Gran Bretaña desarrolla la técnica de la “huella

genética” , que permite identificar personas a partir de muestras como pelo, sangre, esperma, etc. En 1995 sirve para exculpar a un jugador de futbol americano del asesinato de su mujer.

1990 El médico French Anderson inicia la primera terapia génica en un niña con una inmunodeficiencia. Comienza el P.G.H. de manera oficial.

1995 Secuenciación del genoma de la levadura Sacharomyces cerevisiae 1997 Secuenciación del genoma de la bacteria Escherichia coli 1998 Secuenciación del genoma del gusano Caenorhabditis elegans, y de las

bacterias que producen el tifus y la tuberculosis.

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2000 La empresa Celera Genomics anuncia que ha terminado la secuenciación completa dl genoma humano.

MANIPULACIÓN DEL ADN

El hombre ha manipulado desde siempre el ADN de las especies y así han aparecido variedades de animales domésticos, frutales, cereales, etc., a veces por intercambio entre especies que de forma natural nunca se hubieran cruzado. Ha seleccionado individuos con determinados caracteres y aquellos que les interesaba los ha cruzado de manera selectiva (cruzamientos selectivos.) Es la selección artificial. Es un proceso lento y no siempre se obtenían los resultados esperados.

Desde el descubrimiento de Watson y Crick hasta 1970 la manipulación del ADN fue muy difícil. A partir de 1970 irrumpen con extraordinario éxito unas técnicas que permiten manipular y modificar el ADN de los organismos con facilidad.

Son las TÉCNICAS DE INGENIERIA GENÉTICA o TECNOLOGÍA DEL ADN RECOMBINANTE. Sus ventajas, frente a los procedimientos clásicos son muchas:

Mucho más rápido y preciso. Se transmiten sólo los genes deseados. Obtención de productos en mucho mayor cantidad.

Gracias estos métodos podemos obtener fragmentos de ADN idénticos en cantidades ilimitadas (clonación), determinar la secuencia de los genes, alterarlos, insertar genes de una especie en otra distinta, bien en sus células somáticas o germinales.

Algunas de estas técnicas son:

1. Tomar o aislar fragmentos específicos de ADN de un organismo, para ello se cortan en puntos concretos. Es decir, fragmentar o cortar el ADN.

2. Unión de fragmentos de ADN.3. Clonación del ADN, para tener suficientes copias y estudiarlo mejor, o

para que se exprese su proteína en grandes cantidades. Se utilizan VECTORES DE CLONACIÓN. También se puede hacer con la técnica llamada PCR (Reaction Chain Polymerase = Reacción en cadena de la Polimerasa.)

4. Insertar un gen en el ADN de otro ser vivo para que se exprese en él, o incluso en sus células germinales para que se transmita a la descendencia. Es la transformación, y el ADN es recombinante. Así se obtienen ORGANISMOS MODIFICADOS GENÉTICAMENTE ( = O.M.G.) o TRANSGÉNICOS. Para insertarlo en la célula huésped primero se inserta en unos VECTORES DE TRANSMISIÓN = DE EXPRESIÓN.

5. Identificación y secuenciación, y modificación para mejorar el producto, si su producto tiene interés industrial, farmaceútico, agrícola, etc.

Para manipular el ADN se utilizan herramientas fundamentales: las enzimas de restricción o restrictasas (cortan), las ligasas (unen) y los vectores de transmisión (transportan genes y los insertan en ADN distintos, es decir, de otras especies)

1.- OBTENCIÓN DE FRAGMENTOS DE ADN. CORTE DEL ADN

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Se puede hacer utilizando dos tipos de enzimas: las enzimas de restricción y las retrotranscriptasa.

Enzimas de retricción

En 1970 se descubrió que las bacterias tienen un sistema de defensa para eliminar el ADN extraño que les infectaba. Eran unas enzimas que cortaban el ADN en unos puntos concretos de la secuencia (dianas de restricción, formadas por cuatro u ocho bases).

Se denominan enzimas de restricción, restrictasas o endonucleasas de

restricción. Reconocen puntos concretos del ADN (secuencias palindrómicas o capicúas) y lo cortan ahí. Actúan como tijeras moleculares. Se conocen más de 100 distintas y cada una corta en una secuencia específica a cada hebra de ADN.

El corte puede ser de dos tipos y así se originan:

Extremos romos o lisos, Extremos cohesivos o pegajosos o escalonado, así puede unirse a otros

trozos que sean complementarios.

Enzima Bacteria Tipo de extremo

Eco RI Escherichia coli cohesivos Eco RII Escherichia coli Bam HI Bacillus amyloquefaciens cohesivos Hae III Haemophilus aegyptius romos Hind III Haemophilus influenzae Rd cohesivos Kpn I Klebsiella pneumoniae cohesivos Sma I Serratia marcenscens romos Bsu RI Bacillus subtitlis

Al cortar una molécula de ADN con distintas enzimas de restricción se obtienen una mezcla de fragmentos de distinto tamaño. Los fragmentos obtenidos se pueden separar por un método llamado electroforesis, basándose en la capacidad de desplazamiento en un campo eléctrico según su tamaño y de carga eléctrica. Las pequeñas recorren una distancia mayor y las largas menor. Los fragmentos se mueven sobre una lámina de gel de agarosa. Después se tiñen con un colorante y se obtienen una bandas. Cada banda corresponde a un tamaño medido en pares de bases.

El tamaño de los fragmentos se suele expresar en KILOBASES (1000 nucleótidos) si son cadenas monocatenarias, o 1000 pares de bases si se habla de bicatenarias. Si el tamaño es inferior a 1000 bases se habla de bases o pares de bases.

Transcriptasa inversa

También se puede obtener el fragmento de ADN, en este caso ADN estructural, es decir, que codifica una proteína o enzima, si se conoce su secuencia de aminoácidos o la de su ARNm (éste se sintetiza “in vitro” o se aísla de la célula por hibridación). Una vez aislado, la transcriptasa inversa lee este ARNm y sintetiza se obtiene el ADN que lo codifica, llamado ADNc o complementario, que es un ADN sin intrones. Este método es muy importante si el gen que se introduce es de eucariontes y se introduce en una bacteria. El gen introducido no tiene intrones.

HIBRIDACIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS

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Por medio de la hibridación de ácidos nucleicos podemos localizar genes en el ADN. Hibridamos el ARNm sin intrones con el ADN y con fluorescencia o autorradiografía (isótopos) localizamos el gen en el cromosoma.

CLONACIÓN DEL ADN

Para manipular el ADN es necesario disponer de una gran cantidad de moléculas. Esto se consigue con la clonación. Se puede hacer de dos formas:

Clonación molecular o génica, utilizando células. Amplificación por PCR, sin utilizar células.

Clonación molecular o génica

La clonación molecular se hace utilizando células hospedadoras, bacterias normalmente. Es decir, se inserta el ADN deseado en su ADN y cuando la bacteria se reproduzca hará múltiples copias de ese ADN.

Para ello, una vez aislado el ADN hay que insertarlo en el ADN bacteriano. Para ello se utilizan los vectores de clonación o de clonado. Estos vectores son pequeños moléculas de ADN que tienen capacidad de autorreplicación independientemente del ADN de la célula huésped, como plásmidos, bacteriófagos y cósmidos. El gen deseado hay que insertarlo primero en estos vectores.

Estos vectores llevan además unos genes llamados marcadores que sirven para detectar o identificar las células que han incorporado los vectores. Estos marcadores son genes de resistencia a antibióticos (si se inserta en una bacteria) o genes de bioluminiscencia (si se inserta en una eucarionte). Los plásmidos naturales no tienen estos marcadores, sino que se añaden artificialmente.

¿Cómo se inserta el vector en el ADN de la célula huésped? Se corta el ADN del vector y el que contiene el gen deseado con la misma restrictasa y luego se unen con la ligasa. Así tenemos un ADN recombinante, ya que procede de dos moléculas distintas.

La introducción de un ADN extraño en bacterias, ya sea de forma natural o por vectores, se llama transformación. Si el vector es un virus, la transformación se llama transducción. Si se hace en eucarionte se llama transfección, y si se inserta en las células germinales de estos se llama transgénesis y los descendientes de estos organismos, transgénicos o modificados genéticamente (OMG). Por ejemplo, uno de los vectores más utilizados en plantas es la bacteria Agrobacterium tumafaciens, y en células animales, el virus SV40.

Una vez que las bacterias se han transformado, se las pasa a un medio de cultivo para que se multipliquen. Al mismo tiempo se replican los vectores de clonado y así se obtienen múltiples copias del gen deseado. Cada grupo de bacterias que procedan de una sola, llevarán ese vector y ese gen, constituye un clon. Así se obtienen tantos clones como fragmentos de ADN se hayan insertado en las bacterias. El conjunto de clones obtenido se llama biblioteca genómica o genotecas.

SELECCIÓN DE CLONES o TRANSFORMANTES

De todos los clones obtenidos sólo uno portará el gen deseado. ¿Cómo se localiza o se extrae de la biblioteca genómica?. Es decir, hay que localizar un fragmento de ADN, que está dentro de una célula. El método depende del vector utilizado:

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Transfiriendo los clones a cultivos con antibióticos. El que sobreviva es el que porta el marcador de resistencia.

Otro método muy usado es la hibridación de ácidos nucleicos, utilizando una sonda.

La sonda es un fragmento de ADN o ARN de cadena sencilla complementaria a la secuencia del fragmento que queremos localizar. Esta sonda puede ser:

El ARNm correspondiente a la proteína que codifica el en buscado, y que se ha sintetizado in vitro.

Un ADN llamado complementario (ADNc), obtenido a partir del ARNm por la transcriptasa inversa.

La sonda lleva una molécula (reporter) que puede un isótopo radioactivo o una sustancia fluorescente. Sirve para “verla” por medio de autorradiografía (si lleva isótopos) o con microcosopio de florescencia si lleva sustancia fluorescente. VER PÁGINA 215 BRUÑO. La sonda se añade al conjunto de clones y se espera que hibride.

Si se quiere clonar el gen de la insulina humana y luego secuenciarlo, la sonda se prepara a partir de células del páncreas. Se aísla de ellas el ARNm de la insulina, luego con la transcriptasa inversa (y con nucleótidos marcados con isótopos radiactivos) se obtiene el ADNc, que contiene únicamente secuencias codificantes, sin intrones porque procede del ARNm maduro.

BIBLIOTECAS DE ADNc Y VECTORES DE EXPRESIÓN

VER BRUÑO PAGINA 216

Podemos obtener genes sin intrones.

MÉTODO ACTUAL DE CLONACIÓN DE ADN. AMPLIFICACIÓN DEL ADN. REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA. PCR.

Para manipular el DNA se necesita grandes cantidades. En la actualidad se clona ADN sin necesidad de utilizar células, por tanto in vitro, con un método desarrollado en 1983 por K.B. Mullis, denominado Reacción en Cadena de la Polimerasa, (Polymerase Chain Reaction o PCR). Es una técnica mucho más rápida y productiva: a partir de una sola cadena de DNA en una tarde se pueden obtener hasta 100.000 millones de moléculas idénticas.

El mecanismo es el mismo que utilizan las células cuando replican el DNA. Es decir, reproduce in vitro lo que ocurre dentro de la célula. Se utiliza la DNA polimerasa, que a partir de una cadena molde fabricará dos cadenas hijas idénticas. Para esto hay que suministrarlas:

La cadena molde, que es una de las cadenas de la doble hélice Desoxirribonucleótidos Cebador

El mecanismo es simple: consiste en repetir ciclos de síntesis. Cada ciclo consta de:

1. Desnaturalización de la doble cadena a copiar, con temperaturas altas. Cada hebra sencilla servirá de molde.

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2. Lectura de la hebra molde3. Incorporación de nucleótidos4. Mantener temperatura muy elevada durante todo el proceso

De esta manera, en el primer ciclo se obtienen dos cadenas, en el segundo, cuatro, en el tercero 8, etc. El número de moléculas obtenidas se obtiene por esta fórmula N = 2 n donde n es el número de ciclos realizados. Cada ciclo equivale a una replicación. Así al cabo de 20 ciclos se obtienen 1048576 moléculas de ADN. Cada ciclo dura unos 5 minutos, ya para que se obtenga una amplificación útil se necesita 20 ciclos. Hoy día se hace de manera automatizada.

La DNA polimerasa utilizada al principio era la de Escherichia coli. Pero al elevar la temperatura para la desnaturalización del DNA la enzima se desnaturalizaba y había que reponerla en cada ciclo. Esto encarecía y ralentizaba el proceso. Esto se solucionó al descubrirse las bacterias termófilas (extremófilas) que vivían en aguas termales, cuyas proteínas soportan temperaturas elevadas. Se utilizó la polimerasa de Thermus aquaticus, que soportaba hasta 95 ºC. Esta polimerasa se denominó Taq polimerasa.

La PCR tiene varias aplicaciones: en criminología sirve para obtener copias de la muestra de ADN de los sospechosos (huella genética), pruebas de paternidad, y recuperación de ADNs de especies extinguidas o a punto de extinguirse (lince, oso, bucardo, etc).

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