informecromatografía

Universidad Nacional Agraria La Molina

Laboratorio de Química Orgánica

1. Objetivos Cromatografía en papel:

Medir la distancia recorrida por el absorbente en el papel Calcular los Rf para cada uno de las sustancias separadas. Separar los componentes de una mezcla.

Cromatografía en capa fina:

Conocer la técnica de cromatografía en capa fina (CCF), sus características y los factores que en ella intervienen.

Calcular valores de Rf de cada una de las sustancias y aplicarlo como identificación de sustancias.

Cromatografía en columna:

Utilizar la cromatografía en columna para la purificación de una sustancia contaminada con un colorante.

Conocer la cromatografía en columna como técnica de separación de mezclas de sustancias, sus características y los factores que en ella intervienen.



2. IntroducciónEn 1910, el botánico ruso M. Tswett describió por vez primera esta técnica, que fue aplicada a la separación de pigmentos de plantas, dándole el nombre de cromatografía en referencia a las bandas coloreadas de pigmentos que se separaban por su adsorción selectiva sobre columnas de yeso. Tras su descubrimiento, la cromatografía quedo prácticamente olvidada hasta 1930 año en que fue redescubierta por Kuhn y Lederer, quienes la aplicaron para la separación de carotenoides; a partir de este momento, el uso de esta técnica se fue extendiendo cada vez más, al tiempo que se desarrollaban diferentes versiones de la misma: cromatografía de reparto (Martin y Synge, 1941),de papel (Consden, Gordon y Martin, 1944), de capa fina (Stahl, 1958), etc. Un hito importante en el desarrollo de la cromatografía lo constituyó el desarrollo de la cromatografía gas-líquido (Martiny James, 1952), técnica que encontró rápidamente aplicaciones de gran importancia, lo que llevo a su vez al desarrollo de la teoría de la separación cromatográfica (Van Deemter, 1956; Giddings, 1965, etc.) Es la técnica más desarrollada en los últimos años, empleada en la química analítica.Su empleo presenta notables ventajas:1. Es sencilla, rápida y no requiere aparatos complicados.2. Abarca escalas micro analíticas hasta escalas industriales.3. Es una técnica poco o nada destructiva que puede aplicarse a sustancias lábiles.Constituye una metodología imprescindible en estudios bioquímicos, toxicológicos, estructurales, etc. No solo utilizando como técnica de separación e identificación, sino como método preparatorio, incluso a escalas industriales.

La palabra cromatografía proviene de kromatos, color y graphos, escrito. Una de las definiciones de la técnica más correcta seria, la dada por Keulemans:"Método físico de separación en el que los componentes a separar se distribuyen en dos fases, una de las cuales constituye un hecho estacionario de gran desarrollo superficial y la otra un fluido que pasa a través o a lo largo del lecho estacionario (fase móvil)"En todo proceso cromatográfico la fase móvil es la que provoca un movimiento de las distintas especias para que abandonen el medio soporte, y la fase estacionaria la que suministra el efecto retardador, selectivo para cada componente, que condiciona que cada uno de ellos se desplace con distinta velocidad.



3. Fundamento TeóricoLa cromatografía es una técnica que permite la separación de los componentes de una mezcla debido a la influencia de dos efectos contrapuestos.

a) Retención. Efecto producido sobre los componentes de la mezcla por una fase estacionaria, que puede ser un sólido o un líquido anclado a un soporte sólido.

b) Desplazamiento. Efecto ejercido sobre los componentes de la mezcla por una fase móvil, que puede ser un líquido o un gas.

Tipos de cromatografía:

Dependiendo de la naturaleza de la fase estacionaria y de la fase móvil se pueden distinguir distintos tipos de cromatografía

a) Cromatografía sólido-líquido. La fase estacionaria es un sólido y la móvil un líquido.

b) Cromatografía líquido-líquido. La fase estacionaria es un líquido anclado a un soporte sólido.

c) Cromatografía líquido-gas. La fase estacionaria es un líquido no volátil impregnado en un sólido y la fase móvil es un gas.

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d) Cromatografía sólido-gas. La fase estacionaria es un sólido y la móvil un gas.

Según el tipo de interacción que se establece entre los componentes de la mezcla y la fase móvil y estacionaria podemos distinguir entre.

a) Cromatografía de adsorción. La fase estacionaria es un sólido polar capaz de adsorber a los componentes de la mezcla mediante interacciones de tipo polar.

b) Cromatografía de partición. La separación se basa en las diferencias de solubilidad de los componentes de la mezcla en las fases estacionaria y móvil, que son ambas líquidas.

c) Cromatografía de intercambio iónico. La fase estacionaria es un sólido que lleva anclados grupos funcionales ionizables cuya carga se puede intercambiar por aquellos iones presentes en la fase móvil.



Técnicas cromatográficas:

Según la forma de llevar a cabo la separación cromatográfica, es decir, según el dispositivo utilizado para conseguir entre la fase móvil y la estacionaria, cabe distinguir dos tipos de técnicas cromatográficas: en columna y plana.

Cromatografía en columna: Se usa para la separación de mezclas de sustancias. La muestra ha separar se deposita (siembra) en la parte superior de la columna y se va adicionando la fase móvil o eluyente, el que arrastrará las sustancias hacia abajo, mientras que la fase fija tratará de retenerlas. Etapas:

1. Llenado de la columna, preparar una columna uniformemente compactada, son burbujas de aire ni rajaduras.

2. La aplicación de la siembra, se hace con una solución de la misma, el solvente usado debe ser de una polaridad similar al que se va a usar al iniciar la elución.

3. Elución o desarrollo, la muestra que queda debe ser absorbida por la fase fija. Eluir los compuestos que se desplazan lentamente usando otro solvente con mayor polaridad.



Equipo de cromatografía armado en el laboratorio.

Cromatografía de Gases: Sirve para la separación y análisis de gases, líquidos y de sólidos al estado de vapor. La fase móvil es un gas llamado gas portador o



carrier, mientras que la fase fija puede ser un sólido o líquido depositado en forma de fina película en la superficie de un sólido inerte.

Cromatografía Líquida de Alta Performance (HPLC):La cromatografía líquida de alta presión es una técnica de separación basada en la distinta retención de los componentes de una muestra disueltos en la fase móvil al pasar por la fase estacionaria. Se caracteriza por la elevada presión de operación necesaria para conseguir una velocidad óptima de la fase móvil. La interacción entre el soluto de la fase móvil y la fase estacionaria puede ser modificada eligiendo diferentes disolventes y fases estacionarias, siendo en consecuencia una técnica de gran versatilidad.

Cromatografía con Fluidos Supercríticos:La cromatografía de fluidos supercríticos (SFC) es una técnica híbrida entre la cromatografía de gases (GC) y la HPLC, que combina lo mejor de ambas técnicas. Esta técnica es importante porque permite la separación de mezclas en las que no es adecuada la aplicación de la GC ni de la HPLC. En concreto, se aplica a compuestos no volátiles o térmicamente inestables que no pueden ser separados mediante GC, o aquellos que contienen grupos funcionales que imposibilitan su detección en HPLC.

Cromatografía en capa fina:

Se realiza sobre papel u otro material sólido. Suele llamarse “en capa fina” o “en capa delgada” porque la fase estacionaria recubre un soporte plano y rígido. También se la puede denominar como cromatografía en columna abierta.

En este caso se utiliza una placa recubierta con fase estacionaria manteniendo un pequeño espesor constante a lo largo de la placa. El eluyente ascenderá por la placa y arrastrará los componentes a lo largo de ésta produciendo "manchas" de los componentes. En la cromatografía en capa fina (CCF), el grado de elución de las sustancias depende tanto de su propia polaridad como de la polaridad del eluyente utilizado.

Rf es el factor de retardo o retraso, que mide la movilidad relativa de cada componente con respecto al máximo posible, la distancia recorrida por el frente de fase móvil.



Componente 1: Rf = a / DComponente 2: Rf = b / D Componente 3: Rf = c / D

1. Aplicación de la muestra 2. Se sumerge el extremo inferior en la fase móvil 3 a 5. La fase móvil asciende por capilaridad y se va produciendo la separación de los componentes 6. Se marca el frente de avance del disolvente y se deja secar la placa7. Revelado de los componentes ya separados y medida de su avance

Cromatografía sobre papel:

La cromatografía en papel es la técnica de separación de identificación de sustancias químicas en la cual la fase estacionaria es el agua absorbida. La fase móvil es una solución que consiste en u disolvente o de una mezcla de varios líquidos que contiene agua.

Es la más sencilla de las técnicas, pero sólo nos dará resultados cualitativos. Está casi en desuso. El proceso de cromatografía tiene dos fases distintas: una fase estacionaria y una fase líquida. La cromatografía en papel es parte de la fase estacionaria. En la cromatografía en papel, se utiliza papel absorbente especial para probar los elementos de una mezcla para ayudar a determinar su pureza



4. Parte Experimental4.1 Cromatografía en columna

a) Preparación de la columna:Introducir un trozo de algodón hasta el fondo de la columna adicionándole luego 10 ml de Etanol, luego 5g silicagel y por último 20ml de etanol. Abrir la llave de la columna hasta que sobrepase 1 mm la superficie del adsorbente.

b) Siembra:Añadir 2ml de mezcla a separar con etanol, abrir la llave hasta que todo el colorante sea adsorbido por la fase fija.

c) Elución:Adicionándole etanol hasta que se eluya el colorante, luego se cambia el etanol por agua acidulada para eluir el siguiente colorante.

d) Comparar el color y aspecto de las fracciones obtenidas.



4.2 Cromatografía en Capa Fina

a) Cuando ya se tienen los portaobjetos previamente preparados para la cromatografía, se señalan dos puntos, como se muestra en el gráfico inferior.

b) Siembra, en uno de los puntos se siembra con un capilar 2 o 3 gotas del colorante, anaranjado de metilo, y en el otro la mezcla.

c) Introducir la placa en la fase móvil, 1_propanol_butanona_agua 4:1:1, previamente depositado en un recipiente.

d) Cuando el solvente está por llegar a la placa se retira y se halla la Relación de Frente (Rf)

1.7 cm

Frente del solvente

2 – 3 gotas del colorante

2 – 3 gotas de la mezcla

a

bRf = a/b



Rf= Distancia recorrida por la sustancia/Distancia recorrida por el disolvente

4.2 Cromatografía en Papel

En primer lugar se traza una línea horizontal con lápiz a 1,7cm de la parte inferior del papel filtro de 2x18cm, en ella se siembran las dos muestras con capilares, para este caso se usó la mezcla y el azul de metileno, en consecuencia, para cada muestra se tiene que esperar que cada gota seque antes de sembrar la siguiente gota.

)

Lab Q5 cromatografía en papel (UNALM)



Se deja unos minutos para que se evapore el solvente de siembra; posteriormente se introduce la tira de papel filtro en un tubo de ensayo, en este tuvo se coloca el solvente de desarrollo (1-propanol-butanona-agua 4:1:1), tener en cuenta que la zona de siembra no debe estar sumergida en el solvente de desarrollo, también se debe tener en cuenta que, no se debe mover el sistema hasta terminar el desarrollo.

Posteriormente cuando la fase móvil asciende, se traza una línea a la misma altura de

la sombra del solvente (línea de referencia del recorrido cromatografico), observamos también las manchas que se han producido y procedemos a realizar el barrido cromatográfico con la formula siguiente:

Rf = Distancia recorrida por el compuesto / Distancia recorrida por el disolvente

Rf del azul metileno(A):

Rfa= 4.2 ÷ 9.3= 0.451

Rf de la Sustancia B:



Rfb= 6.9 ÷ 9.3= 0.741

5. Discusión 5.1 Cromatografía en columna

Se vertió la mezcla para observar la separación de los componentes de la mezcla, entonces lo vamos a identificar como son colorantes, a través de los colores, donde por la diferencia de solubilidad van cayendo, el que es más soluble cae primero y el menos soluble cae después y se van poniendo en frascos separados para así observar los compuestos que contiene la mezcla.


.El cociente obtenido es 1/18 que resulto de la división de 0.3/ 5.4 de la siguiente relación.


Se observa que el Rfb es mayor que Rfa debido a que el compuesto B tiene mayor peso molecular que el compuesto A( azul de metileno)

En esta práctica no se pudieron obtener los resultados deseados debido a varios factores que modificaron los resultados como lo fueron:

La falta de tiempo, ya que si la placa hubiera sido dejada hasta que el disolvente subiera del todo en la placa o como indica en la guía de laboratorio de 10 a 18 cm.

Rf = a/b



6. Conclusiones y Recomendaciones6.1 Cromatografía en columna

Conclusiones

La cromatografía en columna es el método más usado para la separación de compuestos orgánicos

La mezcla se deposita sobre la parte superior de la fase estacionaria mientras que la fase móvil atraviesa el sistema.

Los compuestos van saliendo por separado de la columna y se recogen en fracciones, los más polares quedan más retenidos y para que salgan generalmente hace falta aumentar la polaridad del disolvente.

El tiempo necesario para eluir un compuesto de la columna se llama tiempo de retención

Recomendaciones

Diámetro de la columna y cantidad de gel de sílice. La altura del adsorbente está relacionada con la diferencia de Rf de los componentes de la mezcla. El diámetro de la columna con la cantidad de producto a separar.

Elección del disolvente. El disolvente tienen que conducir a una buena separación de los componentes de la mezcla en capa fina, utilizándose en muchos casos mezclas de disolventes y se realiza una elución en gradiente. Una de las mezclas más utilizadas es hexano/acetato de etilo.

Evitar la utilización de Aldehídos y Cetonas con columnas de Amino. Antes de comenzar con la separación, es recomendable equilibrar

adecuadamente la columna con la fase móvil a utilizar.


Conclusiones

En la cromatografía por capa fina sólo se puede hacer un análisis cuantitativo. En esta práctica logramos conocer y aplicar la cromatografía por capa fina, sus

características y los factores que influyen en la separación por cromatografía, además de aprender a calcular los valores del factor de retención de las sustancias para poder deducir la relación que existe entre la polaridad de las



sustancias que se analizan con la de los eluyentes que se utilizan con ellas y así mismo poder aplicar un criterio para identificar la pureza de sustancias de acuerdo con la pigmentación (es) que estas presenten al realizar la cromatografía.

Recomendaciones

Para obtener mejores resultados se debe esperar un tiempo prudente para retirar la placa de la solución de fase fija.


Conclusiones

Se observó en esta práctica que por medio de la cromatografía es posible identificar de qué sustancias está compuesta la mezcla.

También se observa como la polaridad del solvente utilizado determina dichos resultados (Rfa=0.451;Rfb=o.741) mostrándonos sus diferentes compuestos

Se observó como las diferentes características de la mezcla se veían en la placa por medio de sus diferentes manchas

7. Bibliografía McMurray, John. Química Orgánica. Sétima edición. Impreso en México por Ed.

Iberoamericana. MERCK AG, E. Reactivos de coloración para Cromatografía en Capa Fina y

Papel. DURS, GOKEL. Química Orgánica Experimental. 2007. Impreso en España por

Ed. Reverté. BEYER, WALTER. Manual de Química Orgánica.1987. impreso en España por

Ed. Reverté. PASTO, Daniel y JOHNSON, Carl. Determinación de Estructuras Orgánicas.

2003. Ed. Reverté. GUARNIZO, Anderson y MARTINEZ, Pedro. Experimentos de Química Orgánica. DOMINGUEZ, Xorge Alejandro. Cromatografía en Papel y en Capa Delgada.

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TOUCHSTONE, Joseph and DOBBINS, Murrell F. Practice of Thin Layer Chromatography. 2nd Edition.Willey Interscience. U.S.A. 1983.

ZLATKIS, A. and KAISER, R.E. HPTLC. High Performance Thin-Layer Chromatography. Vol. 9. Journalof Chromatography Library. Elsevier. 1977

8. Apéndice8.1 Cuestionario 1 Cromatografía en columna

1. ¿Cuál es la principal utilidad de la cromatografía en columna?

La cromatografía en columna es el método más utilizado para la separación de compuestos orgánicos. Se emplea para la separación de mezclas o purificación de sustancias a escala preparativa.

La utilidad de la cromatografía en columna se basa en el análisis, la separación o purificación de sustancias o mezcla de éstas a través de ciertas técnicas y métodos muy eficientes usados en los laboratorios de química.

2. ¿Qué fenómenos físicos intervienen en una columna cromatográfica que utilice silicagel como base fija?

Los fenómenos físicos que intervienen en la columna cromatografía son la adsorción y desorción. La adsorción es un proceso mediante el cual se extrae materia de una fase y se concentra sobre la superficie de otra fase y desorción es el proceso inverso a la adsorción, es la separación de las moléculas adheridas en la superficie de la fase.

Fenómeno de adsorción



3. ¿Cuáles son las principales diferencias entre un HPCL y una columna cromatográfica simple?

Las principales diferencias derivan en que las columnas de HPCL el solvente circulan con dificultad (por su empaquetamiento mucho más compacto), por lo que debe ser impulsado a alta presión (mediante bombas de alta presión). Además, para lograr la máxima eficiencia de los solventes usados en HPCL deben tener un mayor grado de pureza y el eluato al salir de la columna pasa a través de un detector para monitorear la presencia del material.

4. ¿Cuál es el principal factor que hace que la HPLC sea mucho más eficiente que una columna cromatografía simple?

La mayor eficiencia de esta técnica se debe a que la fase estacionaria está formada de partículas esféricas muy pequeñas y de tamaño uniforme. Usándose micro esferas con un tamaño de 5 a 10 micrones.

5. Estamos operando una columna cromatográfica usando como adsorbente silicagel y casi todos los compuestos se han eluido, excepto un compuesto que no es eluido con este solvente ¿Qué cambios introduciría para poder eluirlo?

Para poder eluir este compuesto se tiene que cambiar de adsorbente, generalmente la mezcla de dos o tres adsorbentes de distinta polaridad resultan más eficientes que absorbentes puros.

6. ¿Cómo se puede trabajar con sustancias incoloras en una columna cromatográfica, si no es posible localizar las sustancias dentro de la columna?

Se realiza el análisis del eluato por cromatografía en capa fina o sobre papel. Como este proceso es largo suele recibirse el eluato en muchos matraces o tubos de ensayo de volúmenes similares, anotándose en cada uno un número o cogidos que indique su orden de salida de la columna (utilizando un colector de fracciones el proceso se vuelve casi automático). Luego se juntan las fracciones que tienen igual o similar contenido y se elimina o recupera el solvente (por destilación o usando un rota vapor) obteniéndose el residuo de cada fracción. Posteriormente se pueden aplicar otros procesos de purificación (cristalización, destilación, etc.) o de identificación de sustancias (puntos de ebullición, espectro IR, etc.



7. ¿Qué tipo de cromatografía utilizaría para eliminar las sales minerales que están contaminando una muestra de cafeína?

Para poder eliminar las sales minerales que se encuentran en una muestra de cafeína se utilizaría el tipo de cromatografía en capa fina. Es un procedimiento que se utiliza para separar moléculas relativamente pequeñas, se colocan las muestras a un centímetro del borde en uno de los extremos de la placa, se deja secar, se coloca la placa en un envase (tanque de desarrollo) que ya contiene una pequeña cantidad del solvente, se tapa y se deja correr por un rato. El solvente subirá por capilaridad e irá arrastrando las moléculas, las cuales se moverán según la afinidad que muestren por la fase estacionaria. Si la mezcla de muestras que se está analizando presenta color, se verán los distintos colores migrando a distintas velocidades. Si son incoloras hay que someter la placa a algún tratamiento con una sustancia desarrolladora para poder determinar la presencia de sustancias sobre el silicato. El tipo de desarrollador dependerá del tipo de moléculas que se analizan.

8. ¿Qué es un “colector de fracciones” y cuál es su principal utilidad?

El colector de fracciones es un dispositivo automático que recoge uniformemente los eluídos a la salida del HPLC. Los viales o tubos son colocados en un carrusel o en una gradilla y el usuario programa el intervalo de tiempo en el que se recolecta cada fracción. Cada vial contiene fase móvil y fracciones de la muestra en el correspondiente tiempo de elución.



Colector de fracciones

9. ¿Qué diferencias encuentra usted entre la cromatografía de gases y la cromatografía de columna?

La cromatografía de gases, tiene el mismo fundamento que la cromatografía en columna es decir, ambos están basados en la adsorción relativa de los componentes de una mezcla sobre un soporte adecuado, sin embargo; lo que le diferencia es que en la cromatografía en gases utiliza un aparato más complejo, además utiliza gases como eluyentes en lugar de líquidos.

10.¿Que son las resinas de intercambio iónico y cuál es su utilidad?

Son sustancias insolubles de elevado peso molecular, pues en ella se adsorben compuestos orgánicos por fuerzas electrostáticas, estas pueden ser catiónicas o aniónicas, en ambos casos la resina queda al estado insoluble.



Su utilidad principal es: si en un proceso la solución atraviesa las dos capas de resinas, quedara privada de sus iones obteniendo así, agua desionizada.

8.2 Cuestionario 2 Cromatografía en Capa Fina y Papel

1. ¿Qué entiende usted por Rx?

Es una constante usada especialmente en el caso de cromatografía sobre papel y capa fina, este método sirve para identificar con más eficacia a un compuesto orgánico a comparación del Rf, en este caso se siembra una muestra patrón similar a la muestra. Se calcula de la siguiente manera:

Distancia recorrida por la muestra desconocida

Rx= ------------------------------------------------------------------

Distancia recorrida por el patrón



2. ¿Cuáles son las diferencias entre la CCF y la de papel?

En la elección del disolvente; los disolventes para la C. sobre papel se pueden preparar por simple saturación con agua de un disolvente orgánico, en CCF se lleva a cabo una comparación de la polaridad del mismo y la de la sustancia que se desea separar.

Una de las ventajas de la cromatografía en capa fina sobre la del papel es la posibilidad de revelado con agentes corrosivos, tal como los ácidos concentrados y compuestos fuertemente oxidantes, a alta temperatura debido a la naturaleza inorgánica de la capa.



3. Cite algunas aplicaciones de la cromatografía en su especialidad

En agronomía /zootecnia/forestal:

Aplicación de una técnica de Cromatografía de Exclusión molecular para la purificación de ADN en plantas

Cromatografía en papel filtro en ciertos cultivos, permite la migración diferencial de los componentes de la mezcla, en este caso de la solución pigmento que obtendremos del cultivo.

Control Ambiental.- Dentro de los contaminantes posibles de ser estudiados están: los hidrocarburos aromáticos, BTEX, pesticidas organoclorados y órgano-fosforados en muestras de aguas superficiales, subterráneas, suelos y lodos.

La valoración de aminoácidos en orina de los animales vacunos. Residuos de plaguicidas organofosforados en cultivos como la cabezuela de

brócoli (Brassica oleracea) determinados por cromatografía de gases

4. Interprete los valores de Rf 0,05; 0,6 y 0,98.

Indica que la Rf 0,98 tiene una mayor movilidad en el soporte respecto a las demás, ya que presentará mayor distancia recorrida a la recorrida por el frente del solvente. En conclusión Rf 0.98 tendrá mayor movilidad que 0.6 y este que 0.05.

Otro es que el que tiene mayor Rf indica una menor polaridad del compuesto, entonces el 0.98 será menos polar que el de 0,6 y este que 0,05.

5. Introduciría algún cambio cuando se tiene un Rf de 0,05, ¿Por qué?

Sí, porque esa distancia es muy pequeña para utilizarla como identificación de un compuesto. El máximo valor de RF que se puede alcanzar es de 1, lo ideal es un RF entre 0.55 y 0.7.

6. Explique algún método para localizar las bandas de adsorción cuando se trabaja con sustancias incoloras en una columna.

En algunos casos la coloración de algunos componentes es observable directamente por la coloración que presentan en el espectro visible. En otros hay que recurrir a algún procedimiento de revelado más o menos selectivo que permite la visualización de los componentes separados. Muchas sustancias vegetales absorben en el espectro UV y, en algunos casos, muestran fluorescencia en el visible por lo que la mera exposición a una fuente de luz UV (de la zona próxima al visible) hace visible la existencia de bandas no observadas directamente.



En otros casos cambios ácido-base pueden alterar o hacer aparecer coloraciones en el cromatograma o en la fluorescencia observada, lo que aumenta la efectividad de la cromatografía. En el caso de los flavonoides la respuesta a la luz UV y sus cambios con el pH se utilizan de forma rutinaria en la clasificación estructural de los mismos

7. ¿Qué es la “electroforesis” y cuál es su principal aplicación en los compuestos biológicos?

La electroforesis consiste en la separación de partículas aprovechando su traslado mediante la aplicación de campos eléctricos. La capacidad de movimiento de las diferentes moléculas depende de la intensidad del campo aplicado, su carga y su peso molecular. La principal aplicación en los compuestos biológicos es para el análisis cuantitativo de moléculas biológicas, principalmente proteínas, péptido y aminoácidos.

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