INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL UNIDAD PROFESIONAL INTERDISCIPLINARIA DE BIOTECNOLOGÍA

TÍTULO DEL TRABAJO:

PRODUCCIÓN DE PROBIÓTICOS Y BACTERIOCINAS A PARTIR DE DESECHOS AGRÍCOLAS.

INFORME TÉCNICO FINAL DE LA OPCIÓN CURRICULAR EN LA MODALIDAD DE PROYECTO DE INVESTIGACIÓN

QUE PARA OBTENER EL TÍTULO DE INGENIERO BIOTECNÓLOGO.

PRESENTA: CABRERA ORDOÑEZ OSCAR

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México, D.F. Mayo 2007

DIRECTOR INTERNO: Dr. AJEJANDRO OLMOS DICHARA

INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL UNIDAD PROFESIONAL INTERDISCIPLINARIA DE BIOTECNOLOGÍA

RESUMEN:

Axelson (1993), describe las bacterias ácido lácticas BAL, como organismos Gram positivos, no esporulados, catalasa y oxidasa negativa, sin citocromos, anaerobios facultativos, con producción de ácido láctico como producto final de su metabolismo. Las BAL se agrupan en diferentes géneros como son Lactobacillus, Leuconostoc, Pediococcus y Lactococcus. Las BAL constituyen un diverso grupo de microorganismos de importancia a la salud y económica asociados con productos hortícola. En México se estima que aproximadamente 5,000 toneladas diarias de desechos agrícolas que son eliminados en la Central de Abasto, los cuales son un medio adecuado para el aislamiento de BAL. Por lo que se consideró aislar de hortalizas a las BAL que sean productoras de sustancias tipo bacteriocinas. Resultados: Se analizaron 30 muestras de hortalizas (Col, Coliflor, Alcachofa, Brócoli, y Col de Bruselas), obtenidas de la Central de Abasto de la ciudad de México. Se tomaron 50 g de cada una de las hortalizas y se colocaron en 450 mL de agua peptonada, se realizó un lavado suave por frotación, se hicieron diluciones (10-1-10-3) que fueron sembradas en APN, se incubaron 48 h a 30º C en estufa de CO2 al 5 %. Se seleccionaron colonias que presentaban la morfología colonial característica de las BAL se realizó catalasa, oxidasa y Gram. Se obtuvieron 141 cepas con características de BAL, sólo 46 se identificaron como lácticas. De las cuales el 21.7% fueron de alcachofa, 2.2% de col, 21.7% de coliflor, 28.3% de brócoli y 26.1% de col de Bruselas. A estas 46 cepas se les realizaron pruebas bioquímicas para su identificación. Las especies identificadas fueron Lactobacillus delbrueckii subsp. delb., Lactobacillus fructivorans, Lactobacillus curvatus y Lactococcus lactis subsp. lactis. Posteriormente se determinó su característica inhibitoria contra patógenos con ATCC: Listeria monocytogenes (19115), Escherichia coli O157:H7 (700728), Candida albicans (1031), Staphylococcus aureus (6538), Salmonella typhi (6539), Lactobacillus acidophilus (314) utilizada como control. De las 46 cepas identificadas como BAL el 19.6% inhibieron a los patógenos estudiados. Los resultados obtenidos nos muestran la diversidad en las poblaciones de Lactobacillus que existen en las hortalizas, por otro lado, las actividades antagónicas, mostradas por las diferentes especies de Lactobacillus, muestran el amplio espectro que tienen contra los patógenos lo que señala que es posible que estas especies identificadas produzcan sustancias tipo bacteriocinas. La importancia de estas especies identificadas es que pueden inhibir el crecimiento de microorganismos patógenos, por ejemplo: L. delbrueckii Subs. delbrueckii que inhibió a Listeria monocytogenes y Escherichia coli O157:H7 por bacteriocina. Conclusiones: Se demostró la presencia de BAL en hortalizas. Se identificaron 9 diferentes cepas de BAL. La especie más predominante es Lactobacillus delbrueckii. Las especies identificadas inhibieron a los patógenos estudiados. La cepa que produce a la bacteriocina con mayor eficacia es Lactobacillus delbrueckii.

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AGRADECIMIENTOS: Agradezco primeramente a todos aquellos que hicieron posible que llegara a este momento de la vida. A Dios (Alá) por haberme creado, a mis papás por poner el apoyo a mis estudios (El dinero), a mis hermanos por su comprensión (No estorbarme mucho), a Lady Heshar ya que siempre me brindo su compañía en los tiempos mas difíciles de mi vida, a los Lores por haberme brindado su amistad, compañía y sus conocimientos, y a los demás miembros de la FAMILIA ya que siempre me apoyaron en mis decisiones. Le agradezco a mi querida esposa por soportarme (se que tengo un carácter horrible y te desespero mucho), también le agradezco a mis demás amigos por toda la paciencia que me tuvieron, al igual que a mis profesores ya que gracias a ellos el conocimiento es transmitido, y les agradezco a mis enemigos ya que sin ellos mi vida hubiera sido muy aburrida. Por la realización de este trabajo le agradezco a: Lizeldi: gracias por apoyarme en el proyecto, tenerme paciencia e incluso explicarme algunas dudas. Dr. Oscar: gracias por explicarme dudas en el transcurso del proyecto aunque usted no estaba involucrado en mi proyecto. Dr. Alejandro: por brindar la oportunidad de trabajar en diferentes escuelas en este proyecto. Maestra Elsa: Le agradezco el préstamo de material, a por cierto ¿y los API? Dr. Carlos: Gracias por brindarnos el laboratorio de la UAM de Iztapalapa ya que nos facilitó el trabajo.

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i. CONTENIDO

i Índice de figuras 2

ii Índice de cuadros 3

1.- Introducción 4

2.- Antecedentes 5

3.- Justificación 15

4.- Objetivos 15

5.- Desarrollo 16

6.- Materiales y Métodos 17

7.- Resultados 25

8.- Discusión 30

9.- Conclusiones 32

10.- Bibliografía 33

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ii. ÍNDICE DE FIGURAS

Fig. 1: Fermentación de glucosa. 25

Fig. 2: Hidrólisis de esculina. 25

Fig. 3: Prueba de movilidad. 25

Fig. 4: Inhibición antagónica a Listeria. 26

Fig. 5: Inhibición antagónica a Salmonella. 26

Fig. 6: Fermentación con diferentes fuentes de carbono. 27

Fig. 7: Fermentación con diferentes fuentes de carbono. 28Fig. 8: Inhibición por bacteriocina a Listeria monocytogenes. 29Fig. 9: Inhibición por bacteriocina a Staphylococcus aureus. 29

Fig. 10: Inhibición por bacteriocina a Candida albicans. 29Fig. 11: Inhibición por bacteriocina a Escherichia coli. 29

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iii. ÍNDICE DE TABLAS Tabla 1. Principales mecanismos de acción propuestos para los prebióticos. 10Tabla 2. Muestras analizadas y procesadas para el aislamiento de Bacterias Lácticas. 17

Tabla 3. Cepas testigos que se utilizaron en el desarrollo de la metodología. 17

Tabla 4. Cepas testigos que se utilizaron para la inhibición. 22Tabla 5. Resultados obtenidos para el aislamiento de BAL, para cada uno de los alimentos procesados. 25

Tabla 6. Cepas que inhibieron a las cepas testigos por antagonismo. 26

Tabla 7. Género y especies provenientes de hortalizas. 27Tabla 8. Cepas que inhibieron a las cepas testigos por posible bacteriocina. 28

Tabla 9. Género y especies provenientes de hortalizas. 29

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1.- INTRODUCCIÓN

En las últimas décadas el mercado de los alimentos saludables ha crecido notablemente a

nivel global. Tanto en Asia como en Europa, el crecimiento anual de ésta industria fue del

20% entre 1992 y 1997. Dentro de esta gama de alimentos se destacan, con cerca del

65% de participación en el mercado mundial, aquellos con un contenido probiótico, los

cuales contienen microorganismos bacterianos de tipo ácido lácticos.

Los componentes activos de los probióticos son una mezcla de bacterias ácido lácticas,

entre las que se encuentran Lactobacili, Bifidobacteria y Enterococci entre otras, las

cuales componen la flora intestinal de humanos y animales. Sin embargo, según estudios,

Bifidobacterium y Lactobacillus son las que ejercen todo el efecto positivo sobre el

organismo.

Estudios han demostrado la influencia positiva que tienen los cultivos probióticos en la

salud humana y del ganado vacuno, actuando benéficamente en la flora intestinal del

individuo, y se ha descubierto que para los vacunos, evita enfermedades tales como:

mastitis, descalcificación e infecciones en el tracto reproductivo. Además, los probióticos

disminuyen las alteraciones digestivas e inducen el aumento del peso del animal en un

20%, lo cual reduce los costos por unidad producida de carne (Vargas, 2006).

Por años la industria farmacéutica ha promovido el uso de probióticos como herramienta

terapéutica en las diarreas agudas. Desde hace algún tiempo, la industria alimenticia se

ha sumado a la producción de probióticos, lo cual ha permitido disminuir sus costos y

facilitar su acceso por parte de los pacientes. Lo anterior, si bien supone un beneficio,

también exige una revisión crítica que permita sustentar su efectividad en el tratamiento

de ciertas patologías, y asegurar que su consumo no implique riesgos relevantes para la

salud de la población (Pamela, 2007).

Europa, Estados Unidos y Japón, han desarrollado alimentos de varias clases con cultivos

probióticos, entre los cuales se encuentran los derivados de la leche y los cereales. En

Latinoamérica el mercado de los probióticos se ha desarrollado básicamente en los

productos lácteos (Vargas, 2006).

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Las bacteriocinas, son péptidos antimicrobianos producidos por muchas especies

bacterianas que han generado un gran interés en su investigación, debido principalmente

a las características de antagonismo que han presentado estos contra microorganismos

patógenos presentes en alimentos, a la demanda de los consumidores por la producción

de alimentos menos procesados, y a la bioconservación, es decir, el uso de bacterias

lácticas, sus productos metabólicos o ambos, para mejorar la seguridad y calidad de los

alimentos que generalmente no son fermentados (Montville y Winkowski, 1997).

Durante los ultimos años se han identificado y caracterizado un gran número de nuevas

bacteriocinas producidas por las bacterias lácticas. Las bacteriocinas constituyen un

grupo heterogéneo de péptidos o proteínas de síntesis ribosomal que presentan una gran

variedad de características físico-químicas y espectros de acción antimicrobiana

reducidos o amplios frente a bacterias Gram-positivas. Las bacteriocinas se clasifican en

los siguientes grupos: (i) lantibioticos (clase I); (ii) no lantibióticos de pequeño tamaño

molecular (<10 kDa), termoestables y no modificados postraduccionalmente (clase II),

entre los que se incluyen las bacteriocinas del tipo pediocina, muy activas frente a Listeria

spp. (subclase IIa), los sistemas de dos péptidos (subclase IIb) y las bacteriocinas sec-

dependientes (subclase IIc), y (iii) no lantibióticos de elevado tamaño molecular (>30 kDa)

y termolábiles (clase III). La mayoría de las bacteriocinas descritas hasta ahora

pertenecen a la clase II y se sintetizan como péptidos precursores (preprobacteriocinas)

que contienen una secuencia líder N-terminal del tipo doble-glicina, la cual se elimina

concomitantemente con la liberación al medio extracelular de la bacteriocina

biológicamente activa mediante un transportador ABC-específico y su proteína accesoria

(CINTAS, 2001).

2.- ANTECEDENTES 2.1.- PROBIÓTICOS

Los probióticos son microorganismos vivos que al ser ingeridos en cantidades adecuadas,

ejercen una influencia positiva en la salud o en la fisiología del hospedero. Una vez que

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los probióticos son ingeridos, ocurren cambios en la microflora intestinal que repercuten

positivamente en el estado de salud del consumidor (Gonzalez-Martinez, 2003).

Para que un probiótico sea ideal debe sobrevivir al tracto gastrointestinal. Llegando intacto

al intestino se aloja allí, para lo que necesita tener la propiedad de adherencia al epitelio

para poder colonizarse y así aumentar la acidez, lo que impide que se desarrollen

bacterias que provocan enfermedad y por sobre todas las cosas, debe ser inocuo

(Alimentos, 2006). La mayoría de los probióticos son bacterias ácido lácticas, que

constituyen un importante porcentaje de la flora autóctona del intestino humano

(Gonzalez-Martinez, 2003).

En 1989 Fuller define de esta manera el término probiótico: “Complemento alimenticio a

base de microorganismos vivos y vitales que produce efectos beneficiosos sobre el

organismo animal, mejorando el equilibrio microbiano intestinal” (Cagigas, 2002).

Algunos efectos investigados de los Probióticos son los siguientes (Nutrar,

2006):

• Producción y aumento en la biodisponibilidad de vitaminas B1 - B2 - B6 – B12,

niacina, biotina, ácido fólico, ácido pantoténico.

• Mayor biodisponibilidad de minerales como el calcio, hierro, cobre, zinc y

magnesio en alimentos con adición de probióticos.

• A través de diferentes mecanismos presentan actividad antimicrobiana.

• Efectos hipocolesterolémicos.

• Se ha observado en estudios realizados en animales, una inhibición en el

crecimiento tumoral, o una eliminación total, y la hipótesis plantea que esto se da

porque hay acciones sobre el sistema inmune.

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• La producción de ácidos que provocan los probióticos estimulan el peristaltismo

intestinal reduciendo el tiempo de tránsito de las heces, por lo tanto se consideran

útiles para la profilaxis y tratamiento de disturbios intestinales.

Entre las bacterias probióticas mas utilizadas para el consumo humano se encuentran las

llamadas bacterias ácido lácticas (BAL), que incluyen a las siguientes: Lactobacillus

acidophilus, L. plantarum, L. casei, L. casei spp. rhamnosus, L. delbrueckii spp.

bulgaricus, L. fermentum, L. reuteri, Lactococcus lactis spp lactis, Lactococcus lactis spp.

cremoris, Bifidobacterium bifidum, B. infantis, B. adolecentis, B. longum, B. breve,

Enterococcus faecalis, Enterococcus faecium, entre otros (Farnworth, 2001).

Algunos ejemplos de alimentos que contienen probióticos se pueden encontrar en el

mercado como (Nutrar, 2006):

• Yogurt Yogurísimo con Probio 2

• Yogurt La Serenísima con GG

• Queso Ilolay Vita

• Leche fermentada Yakult

• Leche fermentada Sancor Bio

• Leche Actimel

Dichos productos son algunos, entre otros, de los que equilibran la flora intestinal,

protegiéndola de bacterias nocivas y de toxinas, como así también, refuerzan las

defensas naturales.

Características de las bacterias probióticas:

Los microorganismos que se pueden utilizar en medicina clínica como prebióticos, se

seleccionan en base a una serie de requisitos que éstas deben poseer. Encontrar

microorganismos verdaderamente activos, vitales y eficaces lleva muchos años de

investigación; con el fin de encontrar bacterias cada vez más seguras y eficaces. Muchos

reportes mostraron la utilidad de Bacterias Ácido Lácticas, como probióticos para

humanos y animales (Brashears, 2003). Se ha demostrado que algunos productos de las

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LAB son útiles para prevenir al humano de los desórdenes gastrointestinales y de la

enteritidis aguda (Armuzzi, 2001).

En particular hay que considerar:

• La seguridad biológica: no deben causar infecciones de órganos o de sistemas;

• La capacidad de ser toleradas por el sistema inmunitario del organismo huésped,

y, por lo tanto, deben ser preferiblemente de proveniencia intestinal;

• La capacidad de resistir la acción de los ácidos gástricos y de las sales biliares,

para llegar vivas en grandes cantidades al intestino;

• La capacidad de adherirse a la superficie de la mucosa intestinal y de colonizar el

segmento gastrointestinal;

• La sinergia con la microflora endógena normal;

• El efecto barrera: este término define la capacidad de producir sustancias que

tengan una acción trófica sobre el epitelio de la mucosa intestinal;

• La capacidad de potenciar las defensas inmunitarias del huésped (Casapsia,

2007).

2.2.- BACTERIAS ÁCIDO LÁCTICAS (BAL): La definición propuesta por Axelsson en 1993 para la típica bacteria láctica es la

siguiente: son microorganismos Gram positivos, no esporulados, catalasa negativos, no

aerobios pero aerotolerantes, de difícil cultivo, acidúricas y estrictamente fermentativas

con producción de ácido láctico, como principal producto final de su metabolismo. Crecen

entre los 2-53°C, siendo su óptimo entre los 30-40°C.

Las BAL son exigentes en sus demandas nutricionales; requieren carbohidratos,

aminoácidos, como fuente de nitrógeno y una diversidad de factores de crecimiento como

péptidos, ésteres de ácidos grasos y vitaminas. La demanda de determinados nutrientes

permite diferenciar a algunas especies. En cuanto a las fuentes de nitrógeno, las BAL

necesitan una serie de aminoácidos, siendo el desarrollo estimulado por las sales

amoniacales (Pellizzari, 2004).

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Los requerimientos de las BAL están reflejados en sus hábitats, ya que estos deben ser

ricos en hidratos de carbono; para poderlas encontrar en las plantas, así como en comida

fermentada o en asociación con los animales (Tannock, 2001).

Este tipo de microorganismos pueden desarrollarse bien en hábitats como verduras,

carnes y leche, así como también en localidades del cuerpo de mamíferos como boca,

intestino, vagina (Escartín, 2000).

Los Lactobacillus autóctonos han sido introducidos en los ecosistemas porque son

ubicuos en la naturaleza, ellos son parte de la microbiota de muchos alimentos y dichas

especies derivadas de los alimentos pueden ser detectados en las heces humanas

(Tannock, 2001).

Especies de Lactobacillus autóctonos pueden ser identificados en pollos, pueden llegar a

establecerse en el buche de los pájaros (Tannock, 2001).

Antagonismo (Amores, 2004).

Las BAL contienen ciertas actividades por las cuales pueden inhibir el crecimiento de

otras bacterias estrechamente relacionadas con ellas. Esta actividad de competición

puede existir, incluso, entre bacterias de la misma especie. Algunos ejemplos se muestran

en la Tabla 1.

Causas del antagonismo láctico:

Producción de bacteriocinas

Antibióticos peptídicos de síntesis ribosomal producidos por distintos tipos

de bacterias. (No sólo lácticas, aunque las más interesantes

industrialmente en la actualidad son las producidas por bacterias lácticas).

Suelen tener un espectro de acción muy reducido.

Normalmente plasmídicas (prescindibles, transmisibles), aunque se han

encontrado algunas genómicas.

Algunas son muy termorresistentes, aunque otras son termosensibles.

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Producción de ácidos láctico y acético

Los ácidos orgánicos de cadena corta son muy tóxicos para los

microorganismos porque atraviesan la membrana bacteriana en la forma

no ionizada y se acumulan en la forma ionizada en el interior

Producción de peróxidos

Ciertas cepas de bacterias lácticas son capaces de tomar oxígeno para

formar peróxidos mediante flavoproteína-oxidasa o mediante peroxidasas.

El H2O2 producido y liberado al medio, resulta extremadamente tóxico para

otras bacterias que comparten el hábitat y que son así eliminadas.

Tabla 1. Principales mecanismos de acción propuestos para los probióticos (Amores,

2004).

ACCIÓN MECANISMO EJEMPLO

Prevención de la

colonización por

microorganismos

patógenos

Bloqueo de receptores

específicos (adhesión) y

competencia por nutrientes

L. rhamnosus GG, L.

plantarum, S. boulardii

Actividad antimicrobiana Producción de sustancias con

acción antimicrobiana (H2O2,

bacteriocinas, ácidos orgánicos,

etc.)

L. rhamnosus GG, S.

boulardii

Inmunomoduladora Regulación de la respuesta

inmunitaria humoral y celular

L. rhamnosus GG, L.

acidophilus,

Bifidobacterium spp., L.

Reuderi

Actividad enzimática Disminución en la actividad de

enzimas asociadas con la

síntesis de lactosas,

procarcinógenos, etc.

S. termophilus,

Bifidobacterium spp.,

Lactobacillus spp.

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Usos de las BAL (Tannock, 2001). Las BAL son importantes en la producción de alimentos que requieren de una

fermentación ácido láctica, muchos productos comunes diariamente como son el yogurt,

queso, etc., otras utilidades como en el caso de los vegetales fermentados son la

producción de aceitunas, pepinillos, y otro grupo donde hay beneficios son las carnes

fermentadas como es el caso del salami.

Los productos prebióticos, muchos de los cuales contienen BAL, son promovidos

diariamente en la comida, esto para conservar la salud; las industrias han aceptado que

los científicos de la salud ayuden en la salud pública, por lo que la eficacia de los

probióticos se relaciona con la salud humana.

2.3.- BACTERIOCINAS

Los microorganismos poseen distintas formas para competir en su ambiente, una de ellas

es la producción de sustancias antagónicas. Entre estas se incluyen antibióticos clásicos,

algunos productos del metabolismo, agentes líticos, numerosos tipos de exotoxinas

proteicas y bacteriocinas. La diversidad de estas sustancias inhibitorias es muy grande y

muchas bacteriocinas han sido identificadas. No obstante, los orígenes evolutivos y la

función que desempeñan en la mediación de las interacciones microbianas son aún poco

conocidos.

Las bacteriocinas, son definidas como proteínas biológicamente activas contra miembros

de la misma especie o especies muy relacionadas a la cepa productora. En la naturaleza

existe una enorme diversidad de este tipo de sustancias. Se piensa que el 99% de todas

las bacterias pueden producir cuando menos una bacteriocina y la única razón de que no

se hayan aislado, es debido a que han sido muy poco estudiadas (Muñoz-Rojas, 2006).

La actividad antimicrobiana de las bacteriocinas representa un gran potencial para la

industria alimenticia, ya que se pueden utilizar como conservadores biológicos puros, que

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en un momento dado podrían reemplazar a los conservadores químicos ya que tienen la

ventaja de ser proteínas, que al biodegradarse no forman compuestos secundarios.

Algunas bacteriocinas se utilizan en procesos que requieren la inhibición del crecimiento

de bacterias indeseables específicas estrechamente relacionadas al productor de la

bacteriocina, y en otros casos se aplican para inhibir el crecimiento de microorganismos

degradadores de alimentos o de patógenos (Gonzalez-Martinez, 2003).

La producción de algunas bacteriocinas puede ser favorecida bajo ciertas condiciones de

crecimiento. Por ejemplo las condiciones de cultivo, como son la temperatura, el pH y el

tiempo de incubación, influyen fuertemente en la producción de bacteriocinas activas. Las

condiciones óptimas de producción deben ser determinadas para cada organismo

productor. La composición del medio de crecimiento, también afecta grandemente a la

producción de bacteriocinas (Muñoz-Rojas, 2006).

Clasificación de las bacteriocinas (Gonzalez-Martinez, 2003).

Clasificación propuesta por Ness en 1996 en base a las características bioquímicas y

genéticas:

Clase I.- Lantibióticos.- Son péptidos pequeños activos a nivel de membrana y que

contienen algunos aminoácidos poco comunes como lantionina, β-metil-lantionina y

dihidroalanina que se forman debido a modificaciones posteriores al proceso de la

traducción.

Clase II.- No lantibióticos.- Son bacteriocinas de peso molecular variable, que contienen

aminoácidos regulares. En este grupo se pueden identificar tres subclases:

• Clase IIa.- Son péptidos activos contra Listeria.

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• Clase IIb.- Son formadores de complejos de poración que consisten de dos

péptidos diferentes. Ambos péptidos son necesarios para una mejor actividad

antimicrobiana.

• Clase IIc.- péptidos pequeños, termoestables, no modificados y que se transportan

mediante péptidos líder. Se reportan las bacteriocinas divergicina A y acidocina B.

Clase III.- Son péptidos grandes mayores de 30 kDa, en esta clase se encuentran las

helveticinas J y V, acidofilicina A, lactacinas A y B.

Mecanismo de acción de las bacteriocinas (Gonzalez-Martinez, 2003).

Es posible que las clases I y II de las bacteriocinas compartan mecanismos de acción

semejantes. Los péptidos se unen a la membrana citoplasmática a través de uniones

electrostáticas con los fosfolípidos cargados negativamente, luego se insertan a la

membrana con una reorientación que depende del potencial de membrana, el cual esta

influenciado por el pH y la composición fosfolipídica. Los monómeros de bacteriocina

forman agregados proteicos que resultan en la formación del poro, con la consecuente

salida de iones (principalmente potasio y magnesio), pérdida de la fuerza motriz de

protones (FMP), salida de ATP y aminoácidos. La fuerza motriz de protones juega un

papel central en la síntesis de ATP, en el transporte activo y el movimiento bacteriano, por

lo tanto, se inhibe la síntesis de macromoléculas y la producción de energía dando como

resultado la muerte celular.

Aplicación de bacteriocinas:

Aplicaciones en alimentos.

Los conservadores son una parte esencial en los productos alimenticios ya que extienden

la vida de anaquel del producto, controlan las propiedades organolépticas de los

alimentos y garantizan la salud del consumidor inhibiendo del crecimiento y/o aniquilando

a microorganismos indeseables. Hoy en día, ha disminuido el consumo de los productos

que contienen aditivos sintéticos, ya que la mercadotecnia ha generado una tendencia

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favorable hacia el consumo de productos con conservadores naturales o

bioconservadores (ejemplo, nisina). En consecuencia, se requiere un nuevo conservador

que sustituya a los sintéticos actuales, que su ingesta diaria admisible (IDA) no se rebase

al consumirlo, que su espectro de inhibición sea adecuado para usarse en alimentos

enlatados y que su uso sea económicamente factible (Cano-Crespo y Gómez-Álvarez ,

2006).

Las BAL han sido usadas por siglos para comidas fermentadas, ellas son generalmente

consideradas como seguras por la FDA (Food and Drug Administration) de USA. Esto

permite su uso en la fermentación de alimentos sin una aprobación adicional. La nisina

fue la primer bacteriocina en ser aislada y aprobada para ser usada en alimentos,

específicamente para prevenir el brote de esporas de Clostridium botulinum en quesos

distribuidos en Inglaterra (Roos, 1999).

Las bacteriocinas también han sido usadas en carne curada, leche, queso y pasta de

soya. Se ha desarrollado gelatina de pediodicina, una bacteriocina de clase IIa hecha por

bacterias productoras de ácido láctico, que protegen a los hot-dogs de la contaminación

bacteriana. Otro ejemplo de una bacteriocina que podría usarse en la industria alimenticia

es la piscicolina, una bacteriocina de otra bacteria productora de ácido láctico. La

piscicolina ya ha sido patentada y pronto será usada en productos de carne y para lavar

ensaladas verdes (Muñoz-Rojas, 2006).

Aplicaciones biomédicas (Muñoz-Rojas, 2006).

Aunque en la medicina veterinaria se han usado tradicionalmente los antibióticos para el

tratamiento profiláctico y terapéutico, las bacteriocinas ofrecen un tratamiento alternativo

que puede tener algunas ventajas.

La idea de usar bacteriocinas en el área de veterinaria surgió en los años 40’s. Desde

entonces la nisina fue evaluada como una alternativa en el tratamiento de mastitis. Ha

sido demostrado recientemente que la nisina es inhibitoria de los principales patógenos

Gram-positivos involucrados en la mastitis como cepas de los géneros Streptococcus y

Staphylococcus.

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3.- JUSTIFICACIÓN

La cantidad de desechos orgánicos generada en la Central de Abasto, ubicada en

Iztapalapa es demasiada, se desea utilizar algunos de estos desechos (alcachofa, brócoli,

col, col de Bruselas y coliflor) para la obtención de microorganismos probióticos y

productores de bactericinas, ya que estos microorganismos son empleados en la industria

alimentaría y farmacéutica ya que generan beneficios al hospedero.

Se desea que las bacterias probióticas produzcan bacteriocinas, ya que esta sustancia es

empleada en diferentes sectores.

4.- OBJETIVOS

4.1- OBJETIVO GENERAL:

Aislar y seleccionar bacterias lácticas a partir de desechos agrícolas para la producción de

probióticos y bacteriocinas.

4.2.- OBJETIVOS PARTICULARES:

• Aislar bacterias lácticas tomando como fuente los desechos de alcachofa, brócoli,

col, col de Bruselas y coliflor.

• Identificar las bacterias lácticas aisladas.

• Evaluar la actividad inhibitoria de sustancias producidas por las bacterias lácticas

sobre cepas conocidas.

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5.- DESARROLLO:

Desechos agrícolas de 6 diferentes hortalizas

Aislamiento de Bacterias Lácticas empleando medio APN

Pruebas Tamiz: Pruebas bioquímicas presuntivas de

BAL Inhibición antagónica de cepas

patógenas.

Identificación: Fermentación con diferentes fuentes de carbono.

Técnica de pocitos (producción de bacteriocina)

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6.- MATERIALES Y MÉTODOS Las hortalizas para el aislamiento de las bacterias lácticas, fueron recolectadas en la

Central de Abastos ubicada en Iztapalapa, se transportaron las muestras por separado en

bolsas de polietileno y se transportó al laboratorio para su procesamiento.

Tabla 2. Muestras analizadas y procesadas para el aislamiento de Bacterias Lácticas.

MUESTRAS ANALIZADAS

TIPO DE MUESTRA NÚMERO DE MUESTRAS

Alcachofa (Cynara scolymus) 6

Brócoli (Brassica oleracea var. italica) 6

Col (Brassica oleracea var. viridis) 6

Col de Brucela (Brassica oleracea var. gemmifera) 6

Coliflor (Brassica oleracea var. botrytis) 6

Tabla 3. Cepas testigos que se utilizaron en el desarrollo de la metodología.

Cepas Testigo

Listeria monocytogenes ATCC 19115

Escherichia coli O157:H7 ATCC 700728

Candida albicans ATCC 1031

Staphylococcus aureus ATCC 6538

Salmonella typhi ATCC 19430

Lactobacillus acidophilus ATCC 314

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6.1- AISLAMIENTO DE BACTERIAS LÁCTICAS A PARTIR DE HORTALIZAS.

1. Se pesaron 50 gramos de la muestra.

2. Se lavaron por frotación con 450 mL de agua peptonada amortiguada para tener la

dilución 10-1.

3. Se realizaron las diluciones decimales hasta 10-3.

4. Se inocularon con 0.1 mL de cada dilución y se sembraron por dispersión en

superficie en medio APN (Agar actidiona-polimixina).

5. Dejamos absorber el inóculo en el medio de cultivo, el cual se incubó a 30°C por

72 horas en atmósfera parcial (CO2, 5%).

6. Se seleccionaron colonias de morfología diferente y se resembró en agar MRS

(Man-Rogosa-Sharpe).

7. Se incubaron a 37°C durante 24 h en atmósfera parcial (CO2, 5%).

Las colonias obtenidas como presuntivas se les hizo catalasa, oxidasa y tinción de Gram,

la identificación de las bacterias ácido lácticas se hizo mediante las pruebas bioquímicas

convencionales.

6.2.- PRUEBAS TAMIZ

IDENTIFICACIÓN DE BAL (Alvarado-Rivas, 2000).

1. Cada una de las colonias que tuvieron morfología colonial característica se

sembraron en placas con agar MRS y se incubaron a 37ºC por 24 horas, en

atmósfera parcial (CO2, 5%).

2. Se realizaron bioquímicas que nos ayudaron a identificar a dichas Bacterias

Lácticas (Tincion de Gram, oxidasa, catalasa, producción de Indol, movilidad,

fermentación de glucosa, bilis, esculina).

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TINCIÓN DE GRAM Los constituyentes protoplasmáticos de las células Gram positivas y Gram

negativas se combinan con el cristal violeta por un enlace iónico entre sus

grupos ácidos y los grupos básicos del colorante. El yodo en solución acuosa

entra a la célula y reacciona con el colorante, formando un complejo insoluble

al agua y poco soluble en alcohol. En la decoloración, el alcohol al 95%

deshidrata a las bacterias Gram positivas que poseen una pared celular muy

gruesa, dando como resultado el cierre de los poros de la pared, impidiendo la

salida del complejo de cristal violeta-yodo insoluble, eliminando únicamente el

colorante que quedó fuera de la célula. En las bacterias Gram negativas, el

alcohol penetra en la capa externa que es rica en lípidos, sin que la capa de

peptidoglicana evite el paso del solvente, permitiendo de este modo la

eliminación del complejo cristal violeta-yodo insoluble.

PRUEBA DE LA CATALASA

La mayoría de las bacterias que presentan citocromos presentan la enzima

catalasa, la cual es una hemoproteína, su grupo prostético esta formado por

cuatro átomos de hierro trivalente por molécula que retiene su estado oxidado

durante la actividad enzimática. La catalasa, es una enzima que descompone

el peróxido de hidrógeno formando agua y oxigeno gaseoso. En la

descomposición del oxígeno del peróxido de hidrógeno, una molécula actúa

como el sustrato y otra como el donador.

Método del portaobjetos: 1.- Tomar una colonia bacteriana y colocarla en un portaobjetos.

2.- Añadir sobre la colonia una gota de peróxido de hidrógeno al 3%.

3.- Observar si hay la formación de burbujas.

INTERPRETACIÓN: La formación de burbujas, indica que la bacteria

sintetiza la enzima catalasa. Una prueba negativa indica que la enzima

catalasa no se produce, dado a que no hay descomposición del

peróxido de hidrógeno.

PRUEBA DE OXIDASA La prueba de la oxidasa está basada en la producción bacteriana de la enzima

oxidasa. Esta reacción de la oxidasa se debe a la presencia de un sistema

19

citocromo oxidasa, que activa la oxidación del citocromo reducido por el

oxígeno molecular, el que a su vez actúa como un aceptor de electrones en la

etapa terminal del sistema de trasferencia de electrones.

Los organismos obligatoriamente anaerobios carecen de actividad oxidasa, ya

que no pueden vivir en presencia de oxígeno atmosférico y no poseen el

sistema citocromo oxidasa.

O2

Dimetil-p-fenilendiamina + naftol azul de indofenol + 2H2O

Método indirecto con papel filtro

a) Tiras de papel.

• Colocar tiras de papel filtro en una caja Petri estéril, humedecer

con el reactivo.

• Tomar una pequeña porción de la colonia con un asa de platino o

un aplicador de madera y frotar el cultivo en el papel filtro húmedo.

INTERPRETACIÓN. La lectura es positiva si se produce un color púrpura en la colonia o

sobre el papel frotado con la colonia.

MOVILIDAD

El medio SIM es un medio semisólido que se utiliza para determinar la

producción de ácido sulfhídrico, de Indol a partir del triptofano y la producción

de flagelos en un medio que contiene una cantidad mínima de agar que facilita

la movilidad de los microorganismos.

PRODUCCIÓN DE INDOL: El triptofano, es un amino ácido que puede ser oxidado por ciertas bacterias

para formar 3 metabolitos indólicos principales: Indol, escatol (metilIndol) e

Indolacético, las enzimas intracelulares que intervienen en este proceso

reciben el nombre de triptofanasas. El principal intermediario en la

degradación del triptofano es el ácido piruvico, del cual puede formarse Indol

por desaminación, y escatol por descarboxilación del ácido Indolacético.

20

Triptofanasa

L- triptofano Indol + ácido pirúvico + amoníaco

El Indol, desdoblado de la molécula de triptofano puede ser detectado

por el reactivo de Kovacs o de Ehrlich, que produce un anillo de color rojo.

Indol + Reactivo de Kovacs Anillo color rojo

MÉTODO: 1) Inocular hasta 5 mm del fondo del tubo con asa recta y por

picadura el medio semisólido del microorganismo a probar.

2) Incubar a 37°C durante 24 horas.

3) Tener cuidado de sacar el asa por la misma línea.

LECTURA: Observar si hay desarrollo bacteriano en la línea de siembra o si se

observa turbiedad en todo el medio.

INTERPRETACIÓN:

Movilidad positiva: Los organismos que presentan flagelos migran de

la línea de siembra y se difunden en el medio provocando turbiedad.

Movilidad negativa: Desarrollo en la línea de siembra indica que la

bacteria no presenta flagelos, el medio circundante se mantiene claro.

Producción de Indol: Un anillo rojo en la capa alcohólica del reactivo

nos indica que hubo producción de Indol. Un color anaranjado en la

superficie del medio muestra la producción de escatol (compuesto

metilado que puede ser precursor de la formación de Indol).

No-producción de Indol: No hay producción de color en la capa

alcohólica, se mantiene el color del reactivo.

MEDIO BASAL OF (Oxido-Fermentativo) Algunas bacterias son capaces de metabolizar un hidrato de carbono, sólo en

condiciones anaeróbicas, mientras otras producen ácido aeróbica como

21

anaeróbicamente. La fermentación es un proceso anaeróbico y los

fermentadores bacterianos de un hidrato de carbono son por lo general

anaerobios facultativos.

MÉTODO: 1.- Se siembran dos tubos de medio basal de OF por picadura, cada

una de las cepas.

2.- A uno de los tubos se pone un tapón con aceite mineral estéril.

3.- Se incuban a 37°C por 24 horas.

4.- Se observa el tipo de fermentación que presentan.

INTERPRETACIÓN

1.- OXIDACIÓN

Tubo sin sello de aceite color amarillo.

2.- FERMENTACIÓN

Tubo con sello de aceite amarillo y tubo sin sello amarillo.

INHIBICIÓN ANTAGÓNICA (Ortigoza y Ruiloba, 2003). Tabla 4. Cepas testigos que se utilizaron para la inhibición.

Cepas Testigo Listeria monocytogenes ATCC 19115

Escherichia coli O157:H7 ATCC 700728

Candida albicans ATCC 1031 Staphylococcus aureus ATCC 6538 Salmonella typhi ATCC 19430

1. Se inoculó 1 mL de una suspensión de las cepas ATCC mencionadas en la

Tabla 4, en un tubo de agar MRS fundido y conservado aproximadamente a

45°C, homogenizar.

22

2. Dicha mezcla se vació en cajas Petri estériles, se rotó para extender y se dejó

solidificar.

3. Después se sembró una estría delgada de cada una de las cepas de BAL a

probar.

4. El tiempo de incubación fue de 24 h a 37°C en tensión de CO2 (5%).

5. Se observó el crecimiento de cada una de las cepas, así como la inhibición que

presentó.

6.3.- IDENTIFICACIÓN DE GÉNERO TÉCNICA CULTIVO EN MICROPLACAS (Gusils, 2001):

1. Se prepararon y esterilizaron soluciones de azúcar (al 20% w/v) empleando

diferentes hidratos de carbono (maltosa, rabinosa, ribosa, lactosa, manosa,

ramnosa, arabinosa, xilosa, arginina, trehalosa, galactosa, celobiosa, manitol,

gluconato, fructosa, sorbitol, salicina, sucrosa).

2. Se preparó medio MRS para las fermentaciones empleando un indicador del pH

(rojo de fenol).

3. Se agregó a microplacas 10 µL de cada solución del azúcar (concentración final

del 2%).

4. A cada microplacas se agregaron 200 µL del medio inoculado previamente.

5. Las microplacas fueron incubadas durante 24 h a 37°C en tensión de CO2 (5%).

6. Se observó si la fermentación era considerada positiva mediante el cambio de

color.

7. Se agregaron los resultados en el programa de API Web, para la obtener el género

y especie de nuestros microorganismos.

6.4.- PRODUCCION DE BACTERIOCINA ESPECTRO ANTIMICROBIANO 1) PRODUCCIÓN DE BACTERIOCINAS EN MEDIO LÍQUIDO (Tagg Y MC Given, 1971)

1. Cada una de las cepas de bacterias lácticas se inocularon al 2% en tubos de

caldo MRS.

2. Se incubó durante 24 h a 37°C en una atmósfera parcial de CO2 (5%).

23

3. Se centrifugaron los cultivos a 3500 rpm por 5 min.

4. El sobrenadante se recolectó en viales estériles.

5. Se les ajustó el pH a 7 con NaOH 0,1 N.

6. Se esterilizaron mediante una jeringa acoplada a un porta filtros equipado con una

membrana de nitrocelulosa estéril con poro de 0,45 µm.

7. Se recolectaron los filtrados en viales estériles (Los cuales serán empleados en la

técnica de reto antimicrobiano).

RETO ANTIMICROBIANO. TÉCNICA DE DIFUSIÓN EN POCILLOS (Tagg Y MC Given, 1971).

Se emplearon cepas testigos (ver Tabla 4). Las cuales fueron cultivadas en matraces con

150 mL de caldo BHI a 37°C por 24 h.

1. En cajas Petri se vaciaron 20 mL de agar Mueller-Hinton para formar la base y se

dejó solidificar.

2. En tubos con 10 mL de agar blando, fundido y mantenido a 45°C se adicionó la

cepa testigo a probar ajustando su concentración bacteriana a 3x108 UFC/mL.

3. Se mezcló y vació el contenido de los tubos sobre las placas, dejándose solidificar.

4. Se colocaron las torres de acero inoxidable en cada caja Petri.

5. Se adicionaron 200 µL de cada uno de los sobrenadantes crudos y neutralizados

obtenidos en el paso 7 de la técnica de producción de bacteriocinas en medio

líquido.

6. Se incubó durante 24 h a 37°C en una atmósfera parcial (CO2, 5%).

7. Se midió el diámetro de los halos de inhibición del crecimiento de cada una de las

cepas testigo.

Agar Mueller-Hinton. FUNDAMENTO: Es un medio rico ampliamente utilizado para pruebas de susceptibilidad a los antibióticos, asegura que las zonas de inhibición sean evidentes. La presencia del almidón, además de actuar como un factor de crecimiento, funciona como coloide protector y neutralizante de productos tóxicos que pudieran estar presentes en las peptonas o que se formen durante el desarrollo de los microorganismos.

24

7.- RESULTADOS

AISLAMIENTO DE BAL: Se analizaron 30 muestras, de las cuales se lograron aislar 141 cepas y solo 46 de ellas

presentaron características de las bacterias lácticas: catalasa (-), oxidasa (-), tinción de

Gram (+), movilidad (-), producción Indol (-), fermentación de glucosa (+), hidrólisis de

esculina (+) y tolerancia a bilis (+); los resultados obtenidos se presentan en la Tabla 5.

Fig 1: Fermentación de glucosa.

Fig 2: Hidrólisis de esculina.

Fig 3: Prueba de movilidad.

Tabla 5. Resultados obtenidos para el aislamiento de BAL, para cada uno de las muestras

procesadas.

MUESTRAS AISLADOS

MUESTRA ANALIZADAS CEPAS OBTENIDAS

Alcachofa 6 10 Brócoli 6 13

Col 6 1 Col de

Bruselas 6 12

Coliflor 6 10 TOTAL 30 46

25

INHIBICIÓN ANTAGÓNICA: A las cepas que presentaban las características de BAL se les realizó una inhibición

antagónica contra las cepas testigos (Tabla 4) obteniendo como resultado la Tabla 6. En

la Fig. 4 se muestran las inhibiciones antagónicas de las cepas marcadas como 22 y 28

contra Listeria mientras que la cepa marcada como 27 no pudo inhibir a la cepa testigo.

En la Fig. 5 se muestra un halo de inhibición antagónica de la cepa marcada como 157

contra Salmonella.

Tabla 6. Cepas de BAL que inhibieron a las cepas testigos por antagonismo.

Inhibición antagónica contra

cepas Listeria Candida Staphylococcus Escherichia Salmonella Muestra

obtenidas monocytogenes albicans aureus coli typhi Alcachofa 10 1 0 2 3 5

Brócoli 13 1 0 2 5 7 Col 1 0 0 0 0 0

Coliflor 10 1 1 2 4 5

Col de Bruselas 12 2 1 0 2 2

Total 46 5 2 6 14 19

Fig. 4: Inhibición antagónica a Listeria. Fig. 5: Inhibición antagónica a Salmonella.

26

IDENTIFICACIÓN: Las cepas que inhibieron por antagonismo a las cepas testigos se les realizaron

fermentaciones con diferentes fuentes de carbono empleando microplacas como se

muestra en las figuras 7 y 8, posteriormente se realizó la lectura en un espectro de ELISA

para indicarnos si había fermentación con las distintas fuentes de carbono, los resultados

se descargaron en el programa de computo “API Web”, este programa indicaba los

géneros y especies de nuestras cepas como se muestra en la Tabla 7.

Tabla 7. Género y especies provenientes de hortalizas.

Identificación de género y especie.

Alcachofa Brócoli Col Col de

Bruselas Coliflor Lactobacillus acidophilus 1 1 0 0 0 Lactobacillus curvatus 0 0 0 1 0 Lactobacillus delbrueckii 0 4 0 0 2 Lactobacillus fructivorans 0 1 0 0 0 Lactobacillus lactis 1 0 0 2 Lactobacillus plantarum 1 0 0 0 0

Fig. 6: Fermentación con diferentes fuentes de carbono.

27

Fig. 7: Fermentación con diferentes fuentes de carbono.

IDENTIFICACION CUALITATIVA DE BACTERIOCINA: Posteriormente se realizó la técnica de pocillos para ver si existía inhibición por

producción de algún metabolito extracelular (posible bacteriocina) contra las mismas

cepas testigo (Tabla 4). Los resultados se muestran en la Tabla 8.

Tabla 8. Cepas que inhibieron a las cepas testigos por posible bacteriocina.

Inhibición por posible bacteriocina Listeria Candida Staphylococcus Escherichia Salmonella

Muestra monocytogenes albicans aureus coli typhi

Alcachofa 1 0 1 1 0 Brócoli 1 0 1 2 1

Col 0 0 0 0 0 Coliflor 1 0 0 1 0

Col de Bruselas 2 1 0 1 0

Total 5 1 2 5 1

28

Fig. 8: Inhibición por bacteriocina a Listeria monocytogenes.

Fig. 9: Inhibición por bacteriocina a Staphylococcus aureus.

Fig. 10: Inhibición por bacteriocina a Candida albicans.

Fig. 11: Inhibición por bacteriocina a Escherichia coli.

Tabla 9. Género y especies provenientes de hortalizas.

Identificación de género y especie.

Alcachofa Brócoli Col Col de

Bruselas Coliflor Lactobacillus curvatus 0 0 0 1 0 Lactobacillus delbrueckii 1 1 0 0 0 Lactobacillus fructivorans 0 1 0 0 0 Lactobacillus lactis 0 0 0 0 1

29

8.- DISCUSIÓN Como se mencionó anteriormente el gran interés de las BAL como parte de los

microorganismos conocidos como probióticos ha sido muy importante en los últimos años,

ya que estos microorganismos vivos al ser ingeridos en cantidades adecuadas ejercen

una influencia positiva en la salud o en la fisiología del hospedero (Schrezenmeir y Vrese,

2001). Las BAL han estado presentes en la alimentación del hombre desde hace siglos ya

que, se encuentran en productos como leches fermentadas, yogurt, jocoque, quesos

madurados, productos cárnicos y en algunas hortalizas. En general puede afirmarse que

las bacterias lácticas son muy exigentes en cuanto a la nutrición se refiere. Todas

fermentan la glucosa, algunas no fermentan la sacarosa, otras no atacan la lactosa, las

pentosas o las dextrinas (Li y O’ Sollivan, 2002).

De un total de 30 muestras cultivadas en medio APN se aislaron BAL provenientes de

hortalizas, se empleó el medio APN ya que éste contiene antibióticos, haciendo que este

medio sea especifico para BAL, de esta forma se logró encontrar que de estas 6

diferentes hortalizas se pueden aislar éstos microorganismos, las hortalizas en si no

deberían ser una fuente natural de obtención de BAL pero se ha encontrado que estas

hortalizas son regadas con agua tratada, además que en distintos mercados o

distribuidoras de alimentos tienen a las hortalizas en lugares en condiciones antihigiénicas

como en el caso de la Central de Abasto que tienen a estos alimentos en el piso, en un

área sucia, en contacto con otros diversos alimentos e incluso en contacto con

desperdicios. Dadas estas condiciones, y a pesar que la BAL son microorganismos

exigentes nutricionalmete las hortalizas proporcionan los nutrientes necesarios

(principalmente fuentes de nitrógeno) para el crecimiento de dichos microorganismos,

debido a esto se dice que las hortalizas son una fuente de obtención de BAL.

En total, se obtuvieron 141 cepas, de las cuales solo 46 mostraban las características

morfológicas y bioquímicas de las bacterias lácticas que son: Oxidasa (negativa), catalasa

(negativa), tinción de Gram (positiva), fermentación de la glucosa (positiva) (Fig 1),

hidrólisis de Esculina (positiva) (Fig 2), movilidad (negativa) (Fig. 3), tolerancia a bilis

(positiva) y producción de Indol (negativa). Las bacterias lácticas obtenidas de cada una

30

de las fuentes fueron las siguientes (%): Alcachofa 21,7%, col 2,2%, coliflor 21,7%,

brócoli 28,3% y col de Bruselas 26,1% (Tabla. 5).

Se encontró que el brócoli es la mejor fuente de aislamiento para las BAL, ya que en esta

hortaliza se pudieron aislar la mayor cantidad de cepas que corresponden a las

características de las BAL, mientras que en la col se creía que se obtendría una gran

cantidad de BAL ya que contiene los nutrientes necesarios para el crecimiento de estos

microorganismos así como proporciona cierta condición de anaerobiosis, propiciando el

crecimiento de las BAL, sin embargo, la col proporcionó la menor cantidad de BAL,

suponemos que esto es porque la hortaliza contiene hojas que la envuelven propiciando

una protección para esta hortaliza, impidiendo que los microorganismos puedan infectarla.

Después del aislamiento de bacterias se realizó como prueba tamiz la inhibición por

antagonismo contra microorganismos patógenos (Tabla 4) dando como resultado la Tabla

6 que indica que la mayoría de nuestras cepas inhiben a Salmonella typhi y tan solo 2

cepas inhibieron a Candida albicans, de esta forma se obtuvo que solo 18 cepas de las 46

podían inhibir por lo menos a un microorganismo patógeno testigo, descartando los

restantes ya que al no inhibir por antagonismo indica que también no podría inhibir a la

cepa testigo por la producción de una bacteriocina.

Posteriormente se realizó la identificación de las capas restantes mediante fermentación

empleando diferentes fuentes de carbono, además se determinó la resistencia a NaCl al 4

y 8%, posteriormente se leyeron las microplacas observando el cambio de color (Fig. 6 y

7), si la placa se tornaba amarilla o rosa es positiva, si seguía roja es negativa. Se utilizó

esta técnica ya que resulta más económica que realizar las bioquímicas cotidianas, y se

obtuvo que las 18 cepas pertenecen al género Lactobacillus, y la mayoría de estas

pertenecen a la especie delbrueckii siendo un 42.9% de esta especie (Tabla 7). Se

empleó el programa API Web para deducir la especie, aunque ésta sólo es presuntiva ya

que proporciona un porcentaje de aceptación mayor del 60% en cada cepa. Para una

mayor confirmación se puede utilizar la galería API sin embargo esta galería no garantiza

un 100% de identificación de la subespecie, por lo que se podrían emplear técnicas de

biología molecular para lograr conocer la subespecie.

31

Posteriormente a estas 18 cepas, se les realizó la técnica de pocitos para observar si

producían alguna sustancia que actuara como bacteriocina, por lo que después de filtrar

el medio, se neutralizó y se calentó para eliminar peróxidos y no diera falsos positivos.

Después de dejar crecer a la cepa patógena testigo en presencia de la presunta

bacteriocina, esta formaba un halo de inhibición, como se muestra en las Figuras 8, 9, 10

y 11. De estas 18 cepas probadas, se obtuvo que sólo una de ellas inhibe a 3 de estas

cepas testigos por presunta bacteriocina, 2 BAL inhiben a 2 cepas testigos, y 2 solo a una

cepa testigo. Se obtuvo un total de 5 cepas que producen una sustancia con actividad de

bacteriocina. Las 5 BAL producen una sustancia que inhiben el crecimiento de E. coli

mientras que sólo una inhibe a Candida y a Salmonella pero son cepas distintas.

Se encontró que la alcachofa nos proporciono una cepa (Lactobacillus delbrueckii) capaz

de inhibir a 4 cepas testigos, siendo 3 de estas inhibidas por la presencia por una posible

bacteriocina.

También se encontró que la hortaliza que proporcionó más cepas con propiedad

inhibitoria a estas cepas testigo fue el brócoli, haciendo a esta hortaliza una fuente

potencial de obtención de BAL.

9.- CONCLUSIONES Las hortalizas son una gran fuente de aislamiento de BAL.

La hortaliza que podría emplearse para la formulación de un medio para el crecimiento de

BAL es el Brócoli.

La mayor cantidad de BAL aisladas son Lactobacillus delbrueckii.

La cepa que produce a la bacteriocina con mayor eficacia fue aislada de alcachofa.

La cepa que produce a la bacteriocina con mayor eficacia es Lactobacillus delbrueckii.

Las 5 cepas obtenidas producen una sustancia que inhibe a E. coli.

32

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