UNIVERSIDAD NACIONAL DEL CENTRO DEL PERFACULTAD E INGENIERIA EN INDUSTRIAS ALIMENTARIAS

INTRODUCCIN

Las bacterias presentan una amplia variedad de formas. Algunas, como la bacteria Escherichia coli, tienen forma de bastn. El paramecio, un tipo de protozoo, tiene forma de zapatilla y la ameba, otro protozoo, tiene una forma irregular que cambia conforme se mueve.

Existen varias formas de reconocer el tipo de bacterias; entre ellas estn la tincin simple, tincin Gram, tincin acido-resistente (tcnica de Domer, tcnica de Schaeffer y Fulton, etc.)

La tincin simple es un mtodo bsico y directo que mediante el uso de un solo colorante nos permite contrastar para poder identificar el tipo de microorganismo.Se denominan bacterias Gram positivas a aquellas que retienen la tincin azul y bacterias Gram negativas a las que quedan decoloradas. Algunas bacterias presentan capacidad variable de tincin de Gram y se llaman Gram variables. Bacterias Gram positivas tpicas son los estafilococos que producen fornculos; Gram negativas representativas son la Escherichia coli de la flora intestinal o los bacilos de la tos ferina; Gram variables son los bacilos de Koch de la tuberculosis.Tcnica de Schaeffer y Fulton; este mtodo se utiliza para aquellas bacterias que posen endosporas.

Objetivos generales: Identificar los microorganismos previa coloracin. Desarrollar las tcnicas de coloracin simple, diferencial y de estructuras.

Objetivos especficos:Tincin simple con colorantes bsicos: Identificar las bacterias mediante las diferentes formas, tamaos y agrupaciones que presentan aplicando un mtodo simple de tincin.Tincin diferencial de Gram: Desarrollar la tcnica de tincin diferencial de Gram y demostrar la existencia de dos grupos principales de bacterias.Tincin diferencial Acido Resistente: Distinguir a travs de la tcnica de Schaeffer y Fulton la presencia de endosporas bacterianas.REVISIN BIBLIOGRAFICACARACTERISTICAS MORFOLOGICAS DE LAS BACTERIASTINCIN:

Segn (Fernndez Mara 1994). Es el proceso por el cual las molculas de un colorante se adsorben a una superficie. El uso de colorantes permite cambiar el color de las clulas de los microorganismos y poder realizar la observacin en microscopio ptico. Dado que las bacterias son casi incoloras, no presentan contraste con el medio en el cual se encuentran suspendidas y no pueden observar se claramente sin algn tratamiento previo. De acuerdo a la reaccin que ocurre, existen diferentes tipos de tincin.

MECANISMOS DE COLORACIN:

La coloracin celular y tejidos son una combinacin de fenmenos fsicos y qumicos de absorcin: los fenmenos fsicos de absorcin, capilaridad y smosis participan en cierto grado. La afinidad de colorantes bsicos por los tejidos cidos y viceversa indican que hay reaccin qumica.

TINCION SIMPLE:

Segn (Gerard J. Tortora, 2007). La tincin simple se basa en la afinidad del colorante por los componentes celulares. La tincin puede seruniforme o presentar algunos grnulos en su interior. Utiliza un solo colorante (violeta de genciana, azul de metileno, fuscina diluida).La tincin simple se utiliza para destacar el microorganismo completo para que se vean las formas y las estructuras celulares bsicas. En las tinciones simples se usa un nico reactivo, que preferentemente es de tipobsico y contiene un cromgeno (compuesto que da color al tinte) con carga positiva, ya que la pared celularde las bacterias posee componentes con carga negativa que atraen y enlazan el cromgeno. Se utilizan solamente para incrementar el contraste; todas las clulas absorbern el colorante y quedarn teidas del mismo color. Por tanto, la tincin simple mejora la observacin de la clula completa. Se fija el espcimen, se aade el colorante y se deja el tiempo adecuado para que se absorba, se retira el exceso de colorante y lapreparacin ya est lista para ser observada. Si se utiliza un mordiente (sustancia qumica utilizada paraintensificar la coloracin), hay que aadirlo justo antes del colorante.

Tcnica:Las tinciones simples se realizan sobre preparaciones previamente secadas. Sobre un portaobjetos con una suspensin de microorganismos previamente secada y fijada a la llama, se vierte una solucin diluida de un colorante y se mantiene durante uno o dos minutos; a continuacin se lava varias veces con agua y se seca. Debido a que las clulas son muy pequeas, este tipo de preparacin suele observarse con aceite de inmersin en la lente objetivo.

Colorantes:En la tincin simple se utilizan tintes como safranina, azul de metileno, cristal violeta y carbolfuesina.

TINCIN DIFERENCIAL: Segn (Evelyn Rodrguez,2005). El colorante utilizado pone de manifiesto diferencias entre clulas bacterianas o entre partes de una misma clula. Estas tcnicas utilizan ms de un colorante o bien ciertos reactivos complementarios para la tincin. Ejemplos: Tincin de Gram, Tincin de Ziehl Neelsen, etc. ColorantesLos colorantes ms utilizados: azul de metileno, cristal violeta, safranina, son catinicos y se combinan fuertemente con componentes celulares cargados negativamente, como los cidos nucleicos y los polisacridos cidos (las envueltas externas de los microorganismos estn por lo general cargadas negativamente).

TINCIN DIFERENCIAL DE GRAM:Esta tincin se denominada as por el bacterilogo dans Christian Gram, quien la desarroll en 1844. Sobre la base de su reaccin a la tincin de Gram, las bacterias pueden dividirse en dos grupos, gram positivas y gram negativas (en este caso, los trminos positivo y negativo no tiene nada que ver con carga elctrico, sino simplemente designan dos grupos morfolgicos distintos de bacterias). Descripta en forma breve, la secuencia de la tincin es la siguiente: el Frotis fijado con calor se tie 1 min con Violeta Cristal, se lava con agua, se cubre con solucin Yodada durante 1 - 2 min. y se lava de nuevo con agua, decolorar con mezcla alcohol etlico/acetona. Escurrir y cubrir con Safranina (color de contraste) durante 1 2 min. Lavar y secar. Las bacterias gram-positivas y gram-negativas tien de forma distinta debido a las diferencias constitutivas en la estructura de sus paredes celulares. La pared de la clula bacteriana sirve para dar su tamao y forma al organismo as como para prevenir la lisis osmtica. El material de la pared celular bacteriana que confiere rigidez es el peptidoglicano. La pared de la clula gram-positiva es gruesa y consiste en varias capas interconectadas de peptidoglicano as como algo de cido teicoico. Generalmente, 80%-90% de la pared de la clula gram-positiva es peptidoglicano. La pared de la clula gram-negativa, por otro lado, contiene una capa mucho ms delgada, nicamente de peptidoglicano y est rodeada por una membrana exterior compuesta de fosfolpidos, lipopolisacridos, y lipoprotenas. Slo 10% - 20% de la pared de la clula gram negativa es peptidoglicano.

FUENTE:http://es.wikipedia.org/wiki/Bacteria_Gram_negativa

Descripcin de la tincin de GRAM:

Las clulas fijadas al calor sobre un portaobjetos se tien, primero con una solucin de cristal violeta (otros colorantes bsicos no son tan efectivos) y son lavadas despus para quitar el exceso de colorante. En este estado, todas las clulas, tanto las gram positivas como las gram negativas, estn teidas de azul. El portaobjetos se cubre entonces con una solucin de yodo-yoduro potsico. El ingrediente activo es aqu el I2; el KI simplemente hace soluble el I2en agua. El I2 entra en las clulas y forma un complejo insoluble en agua con el cristal violeta. De nuevo tanto las clulas gram positivas como las gram negativas se encuentran en la misma situacin. Se lleva a cabo despus la decoloracin, usando una mezcla de alcohol-acetona, sustancias en las que es soluble el complejo I2-cristal violeta. Algunos organismos (gram positivos) no se decoloran, mientras que otros(gramnegativos) lo hacen. La diferencia esencial entre esos dos tipos de clulas est por tanto en su resistencia a la decoloracin; esta resistencia se debe probablemente al hecho de que en el caso de bacterias gram-negativas, la mezcla de alcohol/acetona es un solvente lipdico y disuelve la membrana exterior de la pared de la clula (y tambin puede daar la membrana citoplsmica a la que se une peptidoglicano). La delgada capa de peptidoglicano es incapaz de retener el de complejo cristal violeta-yodo y la clula se decolora. Las clulas gram positivas, a causa de sus paredes celulares ms espesas (tienen ms peptidoglicano y menos lpido), no son permeables al disolvente, provocando que el de complejo cristal violeta-yodo quede atrapado dentro de la pared celular. Despus de la decoloracin las clulas gram positivas son todava azules, pero las gram negativas son incoloras. Para poner de manifiesto las clulas gram negativas se utiliza una coloracin de contraste. Habitualmente es un colorante de color rojo, como la safranina o la fucsina bsica. Despus de la coloracin de contraste las clulas gram negativas son rojas, mientras que las gram positivas permanecen azules. Bacillus anthracis (Gram positivo) Pseudomonas aeruginosa (Gram negativo)

TINCIN DIFERENCIAL- CIDO RESISTENTE:

Las paredes celulares de ciertos parsitos y bacterias contienen cidos grasos (cidos miclicos) de cadena larga (50 a 90 tomos de carbono) que les confieren la propiedad de resistir la decoloracin con alcohol-cido, despus de la tincin con colorantes bsicos. Por esto se denominan cido-alcohol resistente. El frotis se tie durante unos 5 min con Fucsina fenicada aplicando calor suave. Lavar con agua. Decolorar con alcohol etlico 95% con un 3% de ClH concentrado. Lavar y teir durante 30-60 seg con Azul de Metileno (color de contraste). Lavar y secar. http://www.monografias.com/trabajos15/tinciones/tinciones.shtml#ixzz2hYyFxAfj

MATERIALES Y MTODOSA. TINCIN SIMPLE CON COLORANTES BSICOSa. Materiales .i. Laminas fijadas de microorganismosii. Aceite de inmersiniii. Colorantes bsicosiv. Azul de metilenov. Cristal violetavi. Carbolfucsinavii. Papel secanteviii. Pizeta de aguaix. Soporte para tincin

PROCEDIMIENTO

B. TINCIN DIFERENCIAL GRAMa. Material y mtodoi. Cultivos jvenes de microorganismos (18-24 horas) Bacillus sp. Staphylococcus sp. Escherichia coli.ii. Aceite de inmersin asa de kolleiii. Colorantes bsicos: cristal violeta safraninaiv. Decolorante :alchol cetonav. Laminas porta objetosvi. Mordiente: lugolvii. Papel secanteviii. Pizeta de aguaix. Soporte para tincinPROCEDIMIENTOC. TINCION DIFERENCIAL ACIDO RESISTENTEa. Material y mtodoi. Tcnica de dorner Cultivos de 48 horas Bacilus y Clostridium Aceite de inmersin Asa de kolle Bao de agua a 100C Laminas portaobjeto Soluciones colorante carbolfucsina nigrosina Tubos con agua destilada estril

PROCEDIMIENTO

ii. Tcnica de schaeffer y fulton Cultivo de 48 horas bacillus clostridium Aceite de inmersin Asa de kolle Laminas portaobjeto cocinilla pinzas soluciones colorantes Safranina Verde malaquita solucin decolorante : alcohol acido

PROCEDIMIENTO

RESULTADOS Y DISCUSIONESTINCION SIMPLE CON COLORANTES BASICOS

Segn la pagina: http://es.wikipedia.org/wiki/tincionsimpleLa tincion simple mejora la observacion de la celula completa. Se fija el especimen, se aade el colorante y se deja el tiempo adecuado para que se absorba, se retira el exceso de colorante y la preparacion ya esta lista para ser. Si se utiliza un mordiente (sustancia quimica utilizada para intensificar la coloracion) hay que aadirlo justo antes del colorante.

Tal como lo comprabamos en la practica despues de realizar correctamente los procedimientos indicados para la tincion simple con una muestra de yogurt natural y utilizando el colorante azul de metileno; se pudo observa a traves del microcopio que las bacterias del yugurt tienen forma redonda y forman grupos de dos,lo que significa que son diplococos.TINCION DIFERENCIAL GRAM

Segn: Brooks GF. Butel JS y Morse SA. Microbiologa Mdica de Jawetz, Melnick y Adelberg. 17Edicin. El Manual Moderno, Mxico D.F. 2002.La tincin de Gram es usada para catalogar bacterias sobre la base de sus formas, morfologas celulares y reaccin Gram (color). A nivel del laboratorio es til como test para un rpido anlisis presuntivo de agentes infecciosos, tanto en muestras como en cultivos en crecimiento. Las bacterias se tien Gram positivas, Gram negativas o no se tien debido a sus diferencias en la constitucin de su pared y diseo celular.

Tal como lo comprobamos en la prctica, despus de realizar correctamente los procedimientos se pudo observar a travs del microscopio que la muestra de yogurt natural es Gram positiva, ya que al ser observado a travs del microscopio se puede percibir un color azul.C. TINCIN DIFERENCIAL CIDO RESISTENTE

Para este caso utilizamos una especie de batera( bacillus clostridium),al ser llevar al microscopio pudimos ver pocas bacterias llamadas endosporas

DISCUCIONES: Segn la INAL (Instituto Nacional de Alimentos) 2004: Este tipo de procedimiento se utiliza para poner en evidencia algunas estructuras subcelulares. Esta tcnica utiliza ms de un colorante en forma secuencial. Lo cual usamos dos colorantes como: verde malaquita y safranina. Segn Jwest, Melnick y Adelberg: las bacterias acido alcohol resistente son las que retiene la carbolfucsina incluso al ser tratadas con cido clorhdrico en alcohol , estas bacterias se observan rojas mientras que otros tomas el color de la contra tincin.

TINCION SIMPLE CON COLORANTES BASICOSTINCION DIFERENCIAL GRAMTINCIN DIFERENCIAL CIDO RESISTENTE

Se utiliza para destacar el microorganismo completo para que se vean las formas y las estructuras celulares basicas

Usada para catalogar bacterias sobre la base de sus formas, morfologas celulares y reaccin Gram (color).Despus de la coloracin ,las clulas Gram negativas son rojas, mientras que las Gram positivas permanecen azules. se utiliza para poner en evidencia algunas estructuras subcelulares.

En las tinciones simples se usa un unico reactivo,En la tincin gram se usan tres colorantes (safranina, cristal violeta y lugol)utiliza ms de un colorante en forma secuencial. Lo cual usamos dos colorantes como: verde malaquita y safranina.

BIBLIOGRAFIA Pedro Garca Martos, Fernando Paredes Salido, Mara Teresa Fernndez del Barrio - 1994

Evelyn Rodrguez Cavallini - 2005 Gerard J. Tortora, Berdell R. Funke, Christine L. Case - 2007 - Vista previa - Ms ediciones

http://www.monografias.com/trabajos15/tinciones/tinciones.shtml#ixzz2hYyFxAfj

http://es.wikipedia.org/wiki/Bacteria_Gram_negativa

CONCLUSIONES Esta prctica done se aprendi a realizar adecuadamente las diferentes tinciones que se utilizan en microbiologa; para observar la forma, agrupacin y tipos de bacterias.

Los mtodos de tincin son de gran utilidad, pero deben usarse siempre con precaucin, ya que pueden conducir a errores.

Se pudo observar a travs del microscopio que la muestra de yogurt natural es Gram positiva, ya que al ser observado a travs del microscopio se puede percibir un color azul.

En la tincion simple con la muestra de yogurt natural y utilizando el colorante azul de metileno; se pudo observa a traves del microcopio que las bacterias del yugurt tienen forma redonda y forman grupos de dos,lo que significa que son diplococos

CUESTIONARIOCUESTIONARIO DE LA TINSION SIMPLE1. Cules son las asociaciones ms frecuentes en bacterias?

2. En qu rango de tamaos se define las bacterias?

Bacillus megaterium mide 1.3 x 3 m.Una bacteria relativamente pequea es Haemophilus influenzae, que mide 0.25 x 1.2 m.Los organismos celulares cultivables ms pequeos que existen son los micoplasmas, muchos de los cuales no superan los 0.2 m de dimetro.Las nanobacterias o ultramicrobacterias miden en torno a 0.05 m, pero la mayora no se han podido cultivar, y slo se pueden estudiar al microscopio3. Cules son las formas bacterianas ms frecuentes?

cocos (clulas ms o menos esfricas) bacilos (en forma de bastn, alargados) espirilos: al igual que los bacilos, tienen un eje ms largo que otro, pero dicho eje no es recto, sino que sigue una forma de espiral, con una o ms de una vuelta de hlice. vibrios: proyectada su imagen sobre el plano tienen forma de coma, pero en el espacio suelen corresponder a una forma espiral con menos de una vuelta de hlice.

4. Cul es la diferencia a una tincin directa de una tincin negativa?

Tincin directa simple: Utiliza un solo colorante, el cual debe ser bsico para que la clula bacteriana se tia. Permite mostrar la morfologa general de una clula de manera rpida ,al emplearse un nico colorante. Tincin negativa: la clula bacteriana permanece sin sin teir y resalta sobre el fondo coloreado. Tie el exterior, pero no el interior de clulas y estructuras.

5. Qu importancia le atribuye a las diferencias en reactividad de los colorantes empleados? Los colorantes hacen posible la observacin, igualmente de diferentes tipos de bacterias.Existen las tinciones simples que se usan para observar la morfologa y el agrupamiento bacteriano, entre los colorantes tenemos el azul de metileno, cristal violeta y fuscinaLas tinciones dobles ,se usan para poner de manifiesto diferencias entre microorganismos o parte de ellos, la tincin de gram, es la ms utilizada en, ya que diferencia a las bacterias en gram positivas y gram negativas, segn retengan el cristal violeta utilizado en la tincin.( las gram negativas no retienen el cristal violeta cuando son decoloradas por una mezcla de alcohol y acetona. las gram positivas (+) si retienen el colorante inicial, las gram negativas (-) se cogern el segundo colorante; la safranina y presentan color rojo).CUESTIONARIO DE TINCIN GRAM1. Para qu casos la tincin Gram podra resultar errada?Los peores obstculos de laTincin, que impiden conseguir el resultado perseguido, son los errores del tcnico. Para evitarlos hay que elegir bien los reactivos y ser muy cuidadosos al ejecutar la tcnica. A continuacin describimos algunas de las fuentes de error: Impurezas en los reactivos deTincin. Concentracin inadecuada de los reactivos de tincin. pH inadecuado. El colorante se fija a la clula por mecanismos fsico-qumicos, que se alteran si el Ph no es el apropiado. Los colorantes pueden ser cidos, bsicos o neutros. Tiempo deTincinincorrecto. Temperatura suficiente.2. Qu efecto traera reemplazar el lugol con otro agente oxidante? No habra el mismo resultado. El Lugol, es una sustancia que aumenta la afinidad de la clula, qu suele aadirse despus del colorante en determinadas tinciones diferenciales En las tinciones simples se usa un nico colorante de carcter bsico. Todas las clulas de la preparacin quedan teidas y se observan del mismo color. Las tinciones diferenciales se utilizan para distinguir entre tipos de microorganismos. Se basan en el uso de dos colorantes. Se realiza una tincin primaria y posteriormente una tincin de contraste para teir las clulas que no se hayan teido previamente. 3. Podra usted variar el colorante primario y el contraste obteniendo los mismos resultados?Si cambiamos el orden del colorante con del contraste de ,se obtendra resultado la coloracin del contraste ya que las bacterias del yogurt son gran positivas y retendran la primera decoloracin , al poseer una pared celular ms resistente y con mayor proporcin de peptidoglicano, no son susceptibles a la accin del solvente orgnico, sino que este acta deshidratando los poros cerrndolos, lo que impide que pueda escaparse la primera decoloracin , y manteniendo la coloracin primaria.4. Qu es la influencia del pH en la reaccin de Gram?La reaccin de Gram no es constante; puede variar con el tiempo del cultivo y el pH del medio, y por otras causas. Los microorganismos Gram positivos tienen una escala de pH inferior a la de los microorganismos Gram negativos, es as que el pH afecta la reaccin de Gram de una manera extraordinaria ya que los microorganismos Gram positivos pueden hacerse Gram negativos al aumentar la acidez, de la misma forma los microorganismos Gram negativos pueden hacerse Gram positivos al aumentar la alcalinidadListe cinco ejemplos de bacterias Gram positivos y cinco de Gram negativas, sealando su importancia.Gram negativas: Escherichia coli es el lder en infecciones seguida por la Klebsiella, el factor de riesgo en este tipo de infecciones hospitalarias es el husped y si presenta un catter urinario es ms importante an Neisseria meningitidis: causa meningitis. Yersinia enterocoltica provoca una fiebre entrica Shigella son responsables de la disentera bacilar Pectobacterium carotovora:Una bacteria asociada con el deteriorode hortalizas Helicobacter pylori: enfermedades gastrointestinales.

Gram positivas:Lactobacillus pueden ser anaerobias facultativos o microaerfilas.Clostridium altera con frecuencia alimentos que han sido sometidos a calentamiento. Los clostridios productores de cido butrico pueden crecer a bajas temperaturas y ocasionan deterioro en algunos quesos.

Carnobacterium se encuentra en pescados, canales de aves y carnes rojas envasadas al vaco Thermoanaerobacterium thermosaccharolyticum es un organismo termoflico que deforma los envases de hojalata. Clostridium sporogenes produce putrefaccin, Clostridiumbutyricum y Clostridium tertium causan el deterioro butrico Clostridium bifermentans genera sulfuro de hidrgeno

CUESTIONARIO DE TINCIN DIFERENCIAL O ACIDO RESISTENTE

1. Cul de los mtodos utilizados le permiti observar mejor las endosporas bacterianas? A qu atribuye la diferencia?

La tincin diferencial ,fue el mtodo ms eficaz pues es el ms usado ya que las bacterias con endosporas. Este mtodo es el ideal para este tipo de bacterias. La diferencia est en el tipo de colorantes usados los cuales(capaces de distinguirse en las endospora).2. Qu efecto producira al reemplazar el alcohol cido por otro decolorante como el alcohol cetona?La mezcla de alcohol/acetona es un solvente lipdico y disuelve la membrana exterior de la pared de la clula (y tambin puede daar la membrana citoplsmica a la que se une peptidoglicano). La delgada capa de peptidoglicano es incapaz de retener el de complejo cristal violeta-yodo y la clula se decolora. Las clulas grampositivas, a causa de sus paredes celulares ms espesas (tienen ms peptidoglicano y menos lpido), no son permeables al disolvente ya que ste deshidrata la pared celular y cierra los poros, disminuyendo as el espacio entre las molculas y provocando que el de complejo cristal violeta-yodo quede atrapado dentro de la pared celular. Despus de la decoloracin las clulas grampositivas son todava azules, pero las gramnegativas son incoloras.3. Qu otro gnero de bacterias pueden formar endosporas?Las bacterias capaces de esporular pueden crecer y reproducirse en forma de clulas vegetativas durante muchas generaciones. Sin embargo, en cierto perodo del desarrollo del cultivo en medio nutritivo apropiado, se produce, dentro del citoplasma, la sntesis de nuevo protoplasma destinado a transformarse en espora.Algunas bacterias pueden transformarse en pequeos ovoides o esferas, que son formas celulares muy resistentes, denominadas esporas, o endosporas, porque se producen intracelularmente. Todos los organismos de los gneros Bacillus y Clostridium se caracterizan, en parte, por su propiedad de producir esporas. Tambin tienen esta propiedad otros gneros de bacterias verdaderas, pero slo en casos aislados. 4. Revise otras tcnicas de tincin de esporas y comprtelas con las usadas en este ejercicio. Determine ventajas y desventajas:

TINCION DE ESPORAS Las esporas son la forma de resistencia de las bacterias, tienen forma esfrica u oval. Al microscopio sin teir, presentan una estructura de granulo brillante. Segn la localizacin de la espora puede ser: central subterminal y terminales (en el centro, prxima al extremo y al final del extremo de la bacteria), lgicamente la esporas solo lo formaran estructuras bacilares. Existen dos tipos de tinciones: Moeller y Wirtz-Conklin. Moeller .Como reactivos se emplean, solucin acuosa 5% de cido crmico, fucsina fenicada de Zhiel-Neelsen, solucin acuosa de clorhidrato de anilina 5%, solucin de azul de metileno y alcohol absoluto.Las esporas se observan con objetivo de inmersin y se visualizando color rojo o rosado y las bacterias de color azul. Wirtz-Conklin Los reactivos empelados son, solucin acuosa de verde malaquita 5% y solucin acuosa de safranina al 0,5%. Se observaron objetivo de inmersin y las esporas e habrn teido de verde y las bacterias de color rojo intenso.TINCION DE NARANJA DE ACRIDINA Esta tincin se utiliza principalmente para el estudio de microorganimos en hemocultivos y liquido cefalorraquideo (LCR), el colorante presenta una gran afinidad por el cido nucleico bacteriano. TECNICA Como reactivos se emplean Naranja de Acridina al 0,01% en tampn de acetato de pH 4, el procedimiento es el siguiente: se extiende y se seca la preparacin. se fijan los frotis con metanol o por calor. se cubre la preparacin con el colorante y se deja durante dos minutos se lava con agua se seca al aire. se examina la preparacin con objetivo de inmersin en microscopio de fluorescencia. Las bacterias presentan un color naranja brillante sobre un fondo verdoso u oscuro.

TINCION DE RODAMINA-AURAMINA. Los fluorocromos auramina y rodamina tienen la propiedad de fijarse a las paredes celulares de las micobacterias, que aparecern de color amarillo o naranja brillante sobre un fondo verdoso. Se utiliza, adems un colorante de contraste (permanganato potsico) que tiene como funcin evitar la fluorescencia inespecfica. TECNICA. Como reactivos reemplean: solucin colorante rodamina-auramina, solucin de colorante, colorante de contraste. El procedimiento es el siguiente: se cubre la preparacin con el colorante auramina-rodamina, durante quince minutos se lava con agua destilada se cubre la preparacin con solucin decolorante (alcohol clorhdrico) dejndose actuar durante dos o tres minutos.

se lava con agua destilada se cubre la preparacin con el colorante de contraste y se deja actuar durante tres o cuatro minutos. se lava y se deja secar al aire.

Se observa a microscopia de fluorescencia, las bacterias cido alcohol resistentes aparecen de color amarillo-naranja sobre un fondo verdusco.

TINCION DE CALCOFLUOR Las paredes celulares de los hongos fijan el colorante blanco de calcoflor aumentando considerablemente su visibilidad en los tejidos y otras muestras. Segn fue descrito por Hageage y Harrington, este colorante se emplea en lugar de KOH al 10% para el examen inicial de los materiales clnicos. Tambin se emplea para aumentar la visualizacin de los elementos morfolgicos de los cultivos puros de los hongos. En algunos laboratoros ha suplantado al azul de lactofenol en muchas aplicaciones. Los organismos fluorescen con luz blanco-azulada o verde manzana, segn la fuente luminosa que se utilice.

Ing.Mg. Vilma J. Reyes de la Cruz