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Análisis de Variación génica mediante el método HRM (High

Resolution Melting)

Fecha de creación 28/09/2012

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HRM

Estudio realizado por:

FRANCISCA GALLEGOa Y ROSA ARJONAb

a)Técnico superior especialista en RT-QPCR; b)Técnico de Laboratorio

Unitat Cientificotècnica de Suport

Vall d’Hebron Institut de Recerca (VHIR) Hospital Universitari Vall d’Hebron

28 de septiembre de 2012


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Introducción El método denominado de curvas de disociación de alta resolución (High Resolution Melting, HRM) es un método simple, rápido y de bajo coste que se usa para la identificación de variaciones en secuencias de ácidos nucleicos (por ej. SNP, mutaciones, metilación). El método se basa en la caracterización de los productos de la PCR de acuerdo al comportamiento de disociación de hebras, o dicho de otra manera, se basa en las características de desnaturalización térmica de los amplicones y suministra información con un rendimiento nunca antes alcanzado por el análisis de la curva de disociación clásica de ADN. Las variaciones en las secuencias son detectadas tanto por un cambio en la Tm como por un cambio en la forma de la curva de disociación. Esto es posible gracias a la introducción de fluorocromos de unión a doble cadena de DNA de tercera generación y a la incorporación de instrumentos de PCR a tiempo real con un sistema de control de temperatura preciso y una capacidad de captura de datos avanzada. Los datos son analizados y manipulados con programas diseñados específicamente para el análisis de HRM. Los aspectos más importantes a considerar en un análisis de HRM son: 1.- Química- El análisis de HRM utiliza fluorocromos de tercera generación. Son fluorocromos que presentan una baja toxicidad en las reacciones de amplificación y por tanto pueden ser usados a mayores concentraciones que los convencionales para conseguir una mayor saturación de las muestras de ADN de doble cadena. No interfieren con la reacción de la PCR. 2.- Instrumentos- El análisis de HRM requiere instrumentos que recolecten datos de fluorescencia a una resolución de temperatura muy fina. 3.- Software- El análisis de HRM requiere un programa más sofisticado que use nuevos algoritmos. En el presente trabajo presentamos los resultados de un estudio de genotipado realizado en la UCTS con la plataforma de PCR a Tiempo Real LightCycler480 de ROCHE utilizando el reactivo LightCycler480 High Resolution Melting Master para la detección de cuatro clases de SNPs humanos. Objetivo El objetivo principal del presente estudio es poner a disposición de los investigadores el bagaje experimental adquirido por personal técnico de la UCTS durante la realización de un estudio de genotipado mediante la técnica de HRM (High Resolution Melting) realizada con la plataforma LightCycler480 de ROCHE. Pretendemos que con esta información los investigadores puedan extraer un código de buenas prácticas para la realización de experimentos HRM.


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Diseño Experimental Para la realización del presente estudio se ha seguido el flujo de trabajo descrito por ROCHE en la nota técnica Nº.1: High Resolution Melting Optimization Strategies: 1.- Elección de SNPs. 2.- Diseño de Cebadores. 3.- Elección de la fuente de DNA. 4.- Comprobación de la especificidad y optimización de la Tm de las diferentes parejas de cebadores mediante PCR convencional y Bioanalyzer. 5.- Optimización de la mezcla de reacción PCR-HRM. 6.- Optimización del programa de PCR y disociación. 7.- Análisis de los datos experimentales utilizando un software apropiado y Validación de la técnica. 1.- Elección de SNPs. El objetivo de este ensayo es reproducir la detección de 4 tipos de SNPs conocidos mediante HRM con el uso de herramientas de la UCTS que están a disposición de los investigadores. Con el fin de simplificar la puesta a punto de un ensayo de genotipado mediante HRM se hizo una búsqueda bibliográfica para la selección de cuatro SNPs que ejemplifican cada uno de los 4 tipos existentes descritos en la literatura (Tabla 1) Tabla 1 Clasificación y frecuencia de SNPs. Un ejemplo de cada tipo.

Tipo SNP

Cambio de base Frecuencia Ejemplo de SNP

Mutación

1 C>T, T>C, G>A, A>G 64% Rs12913832 A/G

2 C>A, A>C, G>T, T>G 20% Rs12896399 G/T

3 C>G, G>C 9% Rs35731153 C/G

4 A>T, T>A 7% RS641805 A/T


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2.- Diseño de Cebadores. Las secuencias de los cebadores para la detección de los cuatro SNPs seleccionados fueron diseñadas utilizando el programa Primer Express de Life Technologies (Applied Biosystems). De acuerdo con los prerrequisitos de la PCR a tiempo real, los cebadores fueron diseñados para tener una temperatura de anillamiento de alrededor de 60ºC, un porcentaje en el contenido de C-G de entre 30%-80% (excepto uno de los cebadores que contiene 28.1% C-G) y amplificar amplicones menores de 150 bp. Además, y siguiendo las recomendaciones de expertos en HRM (soporte técnico de Roche), con el fin de aumentar la probabilidad de identificar una pareja válida y robusta para el genotipado, se diseñaron dos parejas de cebadores para los tipos de SNPs I (cebadores 1/2 y 3/4), II (cebadores 9/10 y 11/12) III (cebadores 5/6 y 7/8) y IV (cebadores 15/16 y 17/18). Se testó, además, una pareja extra de cebadores de secuencias conocidas y publicadas para el SNP tipo IV (cebadores 13/14). Los cebadores fueron resuspendidos en el volumen de agua calculada con la hoja de cálculo de IDT technology, con el fin de obtener una concentración de 50 µM. La concentración de trabajo fue de 5 µM y la concentración final de los cebadores en la mezcla de PCR fue 0.3 µM. En contra de lo recomendado por Roche y con el fin de minimizar costes se usaron cebadores no purificados mediante HPLC. Los detalles de la secuencia de cada pareja de cebadores y el tamaño del amplicón resultante en cada caso se recogen en la Tabla 2. Tabla 2 Secuencias de cebadores para el genotipado mediante HRM de cuatro tipos de SNPs.

SNP Tipo SNP

Mutación Secuencia de Cebadores Tamaño Amplicón (bp)

1-Rv= 5´TCGGCCCCTGATGATGATAG 3´ 2-FW= 5ÁTGGCTCTCTGTGTCTGATCCAA 3´

90 Rs12913832 1 A/G

3-Rv= 5ĆTCGGCCCCTGATGATGATA 3´ 4-FW= 5´ TTCATGGCTCTCTGTGTCTGATC 3´

94

9-Rv= 5´ TACTTAGCCCTGGGTCTTGATGTT 3´ 10-FW=5ĆAATTCTTTGTTCTTTAGGTCAGTATATTTTG 3´

97 Rs12896399 2 G/T

11-Rv= 5´ GTATTGATGAGGAAGGTTAATCTGCTGTG 3´ 12-FW= 5ÁGCTAAAAGTTGTTATTTATCTGAAAATTCAA 3´

139

5-Rv= 5´GTGACGGCAGGGAAGT 3´ 6-FW= 5´GCATCTTCATCAGGACCTACT 3

89 Rs35731153 3 C/G

7-Rv= 5´GCTAGCATTGCAGATGGT 3´ 8-FW= 5ÁTCTTCATCAGGACCTACTTGAG 3

99

15-Rv= 5´ ACTACCAGAAATGTTAGTGAAAGTTTGC 3´ 16-FW= 5´ GTCTAAACAAATAGACTGGCGCATTAC 3´

101

17-Rv= 5´ TGTTTCTTTCTGTCTTGAGCAATACCT 3´ 18-FW= 5´ GCGCATTACTTTTGGCTTTTCT 3´

121 RS641805

4

A/T

13-Rv= 5ÁCATTCATCCTTACATGGCACCA 3´ 14-FW= 5ÁACTTGGCTTTAATGGACCTCCA 3´

101


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3.- Elección de la fuente de DNA. Se utilizó un DNA genómico humano comercial (ROCHE) para el testado de la especificidad y optimización de la temperatura de anillamiento (Tm) de cada una de las dos parejas de cebadores diseñadas para cada tipo de SNP. Este DNA se utilizó también para la optimización de la mezcla de reacción (ver detalles en el punto 5). Para el análisis completo de HRM con una pareja válida de cebadores para cada SNP se utilizaron muestras de DNA genómico pertenecientes al panel comercial HRC-5 del banco de células Europeo ECACC, que representa una población control de 96 donadores de sangre Caucasianos de origen UK. Se utilizaron 30 ng de cada muestra de DNA como molde en la PCR. 4.- Comprobación de la especificidad y optimización de la Tm de las diferentes parejas de cebadores mediante PCR convencional y Bioanalyzer. La temperatura de anillamiento es el parámetro con mayor influencia sobre la eficiencia y especificidad de la reacción de PCR. Reacciones eficientes y robustas generan datos reproducibles. La determinación de la temperatura de anillamiento se realizó mediante PCR convencional y la especificad de cada pareja de cebadores se comprobó con el Bioanalyzer utilizando chips de DNA 1000. La Tabla 3 muestra el programa universal de temperaturas de PCR utilizado. Tabla 3 Programa Universal de temperaturas de PCR

Tª Time

Pre-Incubation 95ºC 10 min Amplification 95ºC 15 seg

(X40) 60ºC 1 min

5.- Optimización de la mezcla de reacción PCR-HRM. La mezcla de reacción HRM se optimizó utilizando el reactivo LightCycler480 High Resolution Melting Master, una mezcla de reacción específicamente desarrollada para producir resultados óptimos de HRM con la plataforma de PCR a tiempo real LightCycler480. Todas las variantes se amplificaron en un formato de placas blancas de 384 pocillos (Roche) con las mismas condiciones de mezcla de PCR siguiendo las


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instrucciones recomendadas por el producto. Para más detalles sobre la mezcla de reacción ver Tabla 4. Las sales afectan al comportamiento de disociación, de manera que es importante que la concentración de buffer, Mg2+ y otras sales en la mezcla de reacción sean tan uniformes como sea posible en todas las muestras. Para asegurar la especificidad y robustez de la PCR llevamos a cabo una titulación para determinar la concentración óptima de MgCl2 en la reacción. Para ello se utilizó un rango de concentraciones finales de MgCl2 entre 1.5 y 3.5 mM, partiendo de una solución stock de concentración 25 mM suministrada individualmente con el kit de master mix. Tabla 4 Mezcla de reacción PCR_HRM

Componentes Volumen Concentración Final

Master Mix Resolight Melting Master (2X) 10 µl 1X MgCl2 (25mM) - 1.5-3.5 mM Primer Fw (5 µM) 1,2 µl 0,3 µM Primer Rv (5 µM) 1,2 µl 0,3 µM DNA (10 ng/µl) 3 µl 30 ng H2O 3 µl - Volumen Final 20 µl

6.- Optimización del programa de PCR y de disociación. En la Tabla 5 se muestra el programa de temperatura PCR-HRM recomendado para la realización de un ensayo de genotipado en el instrumento LightCycler480 utilizando la LightCycler480 High Resolution Melting Master Mix.


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Tabla 5 Programa de Temperatura

Tª Time Adquisition Mode

Ramp rate (ºC/s)

Adquisition (per ºC)

Pre-Incubation 95ºC 10 min none 4,8 Amplification 95ºC 15 seg none 4,8 (X40) 60ºC 1 min Single 2,5 High Resolution Melting 95ºC 1 min none 4,8 40ºC 1 min none 2,5 65ºC 1 seg none 1 95ºC - Continous 0 25 Cooling 40ºC 10 seg none 2,5 7.- Análisis de Datos y Validación con la tecnología Sanger. El análisis de los datos de amplificación y la especificidad del producto se realizó con el programa LightCycler 480 específico de la plataforma que lleva el mismo nombre y el análisis de curva de disociación de alta resolución mediante el módulo Gene Scanning versión 1.2 que ofrece el mismo programa. Previo al análisis de HRM hay que revisar siempre los datos de la amplificación. Para conseguir un análisis óptimo de HRM:

a) todas las curvas de amplificación deben producir un valor de Cp < 30 b) todas las curvas deben alcanzar una fase plató similar, c) entre las muestras, el valor de Cp no debe variar más de 5 unidades de Cp

(correspondientes a aproximadamente una dilución 1:100). A continuación, la aplicación Gene Scanning analiza las curvas de disociación de la siguiente manera (Figura 1):

1) Normalización de los datos crudos de curvas de disociación, estableciendo valores uniformes de fluorescencias inicial (“pre-melt”) y final (“post-melt”) de todas las muestras;

2) “Temperature shift”: mueve las curvas normalizadas a lo largo del eje de temperaturas, para equiparar el punto en el cual el dsDNA en cada muestra está totalmente desnaturalizado;

3) “Difference Plot”: Sustrae a partir de una curva de referencia para mostrar de forma más clara las diferencias en la forma de las curvas de disociación entre las muestras y las traza.


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En el gráfico de diferencias resultante, las muestras forman grupos en función de las formas de sus curvas de disociación.

Figura 1 El módulo Gene Scanning del programa LighCycler480 permite analizar curvas de disociación de alta resolución o HRM. Si bien la aplicación Gene Scanning puede detectar cualquier variación de secuencia entre diferentes muestras, no determina en cambio cuál es exactamente la base que está presente en los respectivos alelos. Por tanto, a veces se requiere de la secuenciación de un amplicón de cada grupo establecido por HRM para definir las variaciones. En el presente trabajo se ha utilizado la secuenciación Sanger para la validación del genotipado por HRM. Para analizar la relación existente entre las dos tecnologías se han empleado tablas de contingencia. Resultados y Discusión 1. Comprobación de la especificidad de producto y optimización de la Tm.

Para la determinación de la Tm óptima se testó primero la temperatura de 60ºC para amplificar mediante PCR convencional 30 ng de DNA genómico humano (Roche) con cada una de las parejas de cebadores diseñadas para la detección de los diferentes tipos de SNP. La calidad del producto de PCR resultante se determinó mediante gel de agarosa al 4% (Figura 2 A) y mediante Bioanalyzer utilizando chips de DNA 1000 (Figura 2 B). En el gel de agarosa se aprecia una banda del tamaño esperado (Tabla 2) resultante de la amplificación con los cebadores 1/2, 3/4, 7/8, 9/10, 11/12, 15/16 y 17/18; múltiples bandas resultantes de la amplificación con los cebadores 5/6 y ninguna banda resultante de la amplificación con los cebadores 13/14. La verificación de este resultado mediante un chip DNA-1000 reveló la presencia de dos picos resultantes de la amplificación con los

Normalización Temperature Shift Difference Plot


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cebadores 5/6, 7/8 y 9/10. Este dato es indicativo de que el Bioanalyzer es más sensible que el gel de agarosa, de acuerdo con las especificaciones técnicas de este equipo. Con el fin de corroborar este resultado se repitió la amplificación en las mismas condiciones con los cebadores 5/6, 7/8, 9/10 y 13/14, de la que se obtuvo una única banda con los cebadores 5/6 y 9/10. Por ello consideramos que los picos extra que se observaron anteriormente con estos cebadores son posiblemente producto de un artefacto. Los cebadores 7/8 y 13/14 tampoco generaron un amplicón único al variar la temperatura de anillamiento a 59 y 58ºC (no se muestran datos). La Figura 3 muestra el análisis por Bioanalyzer (chips DNA-1000) de los amplicones obtenidos con los cebadores 1/2, 9/10, 5/6 y 15/16, seleccionados para el análisis completo de HRM Figura 2 Verificación de la calidad de amplicones mediante A) Gel de agarosa y B) gel de un Bioanalyzer con Chips de DNA 1000, C) Electroferogramas resultantes del Chip de DNA 1000 A) B)

1/2 3/4

5/6 7/8

9/10

11/12

13/14

15/16

17/18

4% Gel agarosa TM=60ºC

bp

1/2 3/4

NTC1/2

5/6 9/10 11/12 15/16 7/8 13/14 17/18

NTC3/4 NTC5/6 NTC9/10 NTC11/12 NTC13/14 NTC7/8 NTC15/16 NTC17/18 10bp Ladder

2ug

10bp Ladder

0.5ug


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C)


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Figura 3 Análisis por Bioanalyzer (chips DNA-1000) de los amplicones obtenidos con los cebadores seleccionados para el análisis completo de HRM.

Una vez hecha la comprobación mediante PCR convencional de la especificidad y optimización de la Tm con cada uno de los cebadores diseñados, escogimos para la realización del análisis completo de HRM las parejas de cebadores 1/2, 9/10, 5/6 y 15/16 que constituyen un ejemplo de cada uno de los tipos de SNPs I, II, III y IV, respectivamente. En la Tabla 6 se muestra las secuencias de los cebadores seleccionados para el análisis completo de HRM y la Tm de trabajo. Tabla 6 Secuencias de los cebadores seleccionados para el análisis completo de HRM y la Tm de trabajo.

SNP Tipo SNP

Mutación Secuencia de Cebadores Tm (ºC)

Rs12913832 I A/G 1-Rv= 5´TCGGCCCCTGATGATGATAG 3´ 2-FW= 5´ATGGCTCTCTGTGTCTGATCCAA 3´

60

Rs12896399 II G/T 9-Rv= 5´ TACTTAGCCCTGGGTCTTGATGTT 3´ 10-FW=5´CAATTCTTTGTTCTTTAGGTCAGTATATTTTG 3´

60

Rs35731153 III C/G 5-Rv= 5´GTGACGGCAGGGAAGT 3´ 6-FW= 5´GCATCTTCATCAGGACCTACT 3

60

RS641805

IV

A/T

15-Rv= 5´ ACTACCAGAAATGTTAGTGAAAGTTTGC 3´ 16-FW= 5´ GTCTAAACAAATAGACTGGCGCATTAC 3´

60

bp 1/2 9/10 5/6 15/16


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2. Titulación de MgCl2. Teniendo en cuenta que las sales pueden afectar al comportamiento de disociación, el siguiente paso fue la determinación de la concentración óptima de MgCl2 titulando concentraciones de entre 1 mM y 4 mM en la reacción de PCR con las parejas de cebadores 1/2, 5/6, 9/10 y 15/16. La verificación de la calidad de los amplicones se puede llevar a cabo mediante un gel de agarosa o mediante análisis de curva de disociación. Debido a la posibilidad de monitorizar la cinética de la amplificación en un instrumento de PCR a tiempo real, se utilizó preferentemente la plataforma LightCycler480 en lugar de un termociclador convencional para verificar la calidad de los amplicones mediante el análisis de curva de disociación. Se escogió como mejor concentración de MgCl2 la que dio lugar a un amplicón con un valor de Cp bajo con una fase plató elevada, teniendo en cuenta que un valor de Cp menor de 30 ciclos es indicativo de que hay una cantidad apropiada de muestra y una eficiencia de amplificación idónea. De las amplificaciones resultantes de la titulación de MgCl2 concluimos que la concentración que ofrece un valor de Cp por debajo de 30 con la fase plató más elevada es de 2 mM en todas las parejas de cebadores testadas. La Figura 4 muestra el perfil de curvas de amplificación con el correspondiente valor de Cp y las curvas de disociación obtenidas con cada una de las parejas de cebadores.


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Figura 4 Titulación típica de MgCl2. La concentración óptima para todos los casos es de 2 mM debido al valor más bajo de Cp y la fase plató más elevada.


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3. Análisis de HRM y validación mediante la tecnología Sanger. Una vez optimizada la Tm y la mezcla de reacción se procedió a la realización de la PCR a tiempo real y posterior análisis de HRM de 96 muestras de DNA con cada una de las parejas de cebadores seleccionadas. Se aplicaron los siguientes tipos de análisis que ofrece el programa LightCycler 480 para la validación de los datos: 1.- Abs Quant/2nd Derivative Max Este tipo de análisis está indicado para testar los valores de Cp y las curvas de amplificación. De acuerdo con el gráfico de la Figura 5, todas las muestras amplificadas con las parejas de cebadores 1/2, 5/6, 9/10 y 15/16 dieron valores de Cp < 30. Además, entre las muestras, el valor de Cp no varió más de 5 unidades.

Figura 5 Valores de Cp de 96 muestras de DNA con las parejas de cebadores 1/2, 9/10, 5/6 y 15/16.

23.70 ± 0.054 26.05 ± 0.047 24.35 ± 0.039 24.03 ± 0.077


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Hay que mencionar la presencia de producto amplificado también en los NTCs con las parejas de cebadores 1/2, 5/6, 9/10 y 15/16. Mientras que esta contaminación estaba siempre presente en los NTCs con la pareja de cebadores 5/6, sólo aparecía a veces en los NTCs con el resto de cebadores. Un ejemplo de ello lo muestran los gráficos de la Figura 6. Es conocido que la aparición de producto amplificado en las muestras NTCs es indicativo de la contaminación por DNA o de la formación de dímeros de cebadores en las reacciones de PCR. Para obtener más detalle acerca del tipo de contaminación observada procedimos al análisis de curvas de disociación clásicas que ofrece el software LightCycler 480 denominado Tm calling (ver apartado 2) En cualquier caso, asumimos que la presencia de estos productos inespecíficos no afecta a la valoración final del ensayo dado que la aparición de dicha contaminación se produce siempre en el valor de Cp 35, más allá de nuestro Cp límite de 30.

Figura 6 Aparición ocasional de producto inespecífico en las muestras NTCs a un valor de Cp=35. 2.- Tm calling Este tipo de análisis está indicado para corroborar la especificidad de los productos amplificados obtenidos así como para informar de la presencia o ausencia de posibles contaminantes. En todas las muestras problema amplificadas con las parejas de cebadores 1/2, 5/6, 9/10 y 15/16 se obtuvo un único producto de PCR con Tm de entre 78-84ºC. En la figura 7 se detalla la Tm obtenida con cada pareja de cebadores. En cuanto a las muestras NTCs, la presencia de producto amplificado con las parejas de cebadores 1/2, 9/10 y 15/16 tenía siempre el mismo valor de Tm que los productos amplificados en las muestras problema, lo que hace pensar en la posibilidad de que se trate de contaminación por producto de PCR procedente de reacciones previas y no en la formación de dímeros de cebadores. Se descartó que la contaminación fuera debida a la contaminación por DNA de algunos de los reactivos de la mezcla de PCR, ya que se tomaron todas las precauciones posibles, inclusive la compra de novo de los cebadores. En cuanto al producto amplificado detectado en las muestras NTCs con la pareja de cebadores 5/6, el valor de Tm=76ºC apuntaba a que se trata de dímeros de cebador. No obstante, cabe destacar en este último caso que la presencia de dímeros de cebadores en sólo las muestras


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NTCs y no en las muestras problema indica que la amplificación del DNA problema por la polimerasa se ve favorecida frente a los dímeros de cebadores, evitando así el uso de los mismos con los que interactúa en ausencia de DNA de la muestra.

Figura 7 Análisis de la especificidad de producto mediante el tipo de análisis “Tm calling” del software LightCycler 480. Las pequeñas variaciones en la Tm de un mismo producto de PCR que se aprecian entre las diferentes muestras pueden ser debidas a las variaciones en la secuencia del amplicón resultante causadas por el SNP.

P1-2

Tm = 81.50 ± 0.184

P5-6

Tm = 83.61 ± 0.104

P15-16

Tm = 79.11 ± 0.59

P9-10

Tm = 78.96 ± 0.37


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3.- Gene Scanning, para el análisis PCR-HRM. La Figura 8 muestra el análisis de curva de disociación de alta resolución, mediante la aplicación Gene Scanning, de las muestras amplificadas con las diferentes parejas de cebadores: 1/2 (para la detección del SNP tipo I), 9/10 (para la detección tipo II), 5/6 (para la detección del SNP tipo III), y 15/16 (para la detección del SNP tipo IV). Además, se contrasta este resultado con la secuenciación mediante Sanger del producto amplificado por HRM. La secuenciación se realizó utilizando uno de los cebadores y sólo en caso de dudas se utilizó el cebador contrario para la confirmación de la secuencia. Además, la secuenciación se llevó a cabo sin previa purificación del producto amplificado, comprobando de esta manera que el fluorocromo 480 ResoLight contenido en la master mix no interfiere con el proceso de secuenciación. Concretamente: SNP de tipo I: A/G Para la detección del SNP de tipo I A/G mediante HRM se procesaron 96 muestras a la vez, resultando dos grupos de muestras, el grupo 1 y el grupo 2, cada uno con una forma de curvas de disociación característica y diferente entre sí (apartado A-1 de la Figura 8). De la validación por Sanger de estas muestras con el cebador en sentido directo, un 3% (3/96) de muestras fueron homocigotos AA, un 66,6% (64/96) fueron homocigotos GG y un 30% (29/96) fueron heterocigotos A/G. Concretamente, dentro del grupo 1 detectado por HRM había muestras pertenecientes a los tres genotipos y dentro del grupo 2 detectado por HRM había muestras pertenecientes a los genotipos GG y AG (apartado B-1 de la Figura 8). SNP de tipo II: G/T Para la detección del SNP de tipo II G/T mediante HRM se procesaron las muestras en tres tandas de 30 y una de 6, resultando dos grupos de muestras en la tanda 1 y tres grupos de muestras en el resto de tandas (apartado A-2 del gráfico X). La validación por Sanger de estas muestras con el cebador en sentido directo produjo un 25% (24/96) homocigotos GG, 20% (19/96) homocigotos TT y 55% (53/96) heterocigotos GT. (apartado B-2 de la Figura 8). SNP de tipo III: C/G De la detección del SNP de tipo III mediante HRM en las 96 muestras a la vez se obtuvieron dos grupos, cada uno con una forma de curva de disociación característica (A-3 del gráfico X). La validación por Sanger de estas muestras con el cebador en sentido directo coincidió con el análisis HRM, detectándose un 98% (94/96) homocigotos CC y 2% (2/96) homocigotos GG (apartado B-3 de la Figura 8). La secuenciación de las dos únicas muestras homocigotos GG más 10 muestras de la otra variante se corroboró con el cebador antisentido. SNP de tipo IV: A/T Para la detección del SNP de tipo IV A/T mediante HRM se procesaron las muestras en dos tandas de 30 y una de 36, resultando dos grupos de muestras en las tres tandas analizadas. (A-4 de la Figura 8). La validación por Sanger de estas muestras con el cebador en sentido directo produjo un 9.4% (9/96) homocigotos AA, 38.5% (37/96) fueron homocigotos TT y 52% (50/96) heterocigotos AT. (apartado B-4 de la Figura 8).


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Figura 8: A.- Detección mediante HRM del: A-1) SNP tipo I; A-2) SNP tipo II; A-3) SNP tipo III y A-4) SNP tipo IV; B.- Comparación del genotipado mediante HRM versus secuenciación Sanger del: B-1) SNP tipo I; B-2) SNP tipo II; B-3) SNP tipo III y B-4) SNP tipo IV.

A-1) HRM del SNP tipo I: G/A

SNP clase I: G/A

0

10

20

30

40

50

60

70

80

1 2HRM

San

ger

GGAAAG

B-1) Sanger del SNP tipo I: G/A


Resolution Melting)


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SNP clase III:G/C

0

20

40

60

80

100

1 2

HRM

San

ger GG

CC

A-3) HRM del SNP tipo III: G/C

B-3) Sanger del SNP tipo III: G/C

A-2) HRM del SNP tipo II: G/T

SNP clase II: G/TTanda de muestras 1

0

24

68

10

1214

16

1 2

Grupos HRM

San

ger

CC

CA

AA

SNP clase II: G/TTanda de muestras 2

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

20

1 2 3

Grupos HRM

San

ger

TT

GT

GG

SNP clase II: G/TTande de muestras III

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

20

1 2 3

Grupos HRM

San

ger

CC

CA

AA

B-2) Sanger del SNP tipo II: G/T

SNP clase II:G/TTanda de muestras IV

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

3,5

1 2 3

HRM

San

ger

CC

CA

AA


Resolution Melting)


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Diferenciación entre variantes genotípicas Con el fin de diferenciar entre las tres variantes genotípicas para los SNPs de tipo I, tipo II y tipo IV, se repitió el genotipado mediante HRM de 10 muestras con cada una de las parejas de cebadores correspondientes a los tres tipos de SNPs y se añadió en todas ellas un 50% de DNA homocigoto conocido. En el caso de los SNPs de tipo I y II se consiguieron diferenciar los tres genotipos esperados, sin embargo para la detección del SNP tipo IV no fue posible dicha discriminación. La figura 9-A) muestra un ejemplo del electroferograma de las secuencias Sanger de cada genotipo para el SNP tipo I, indicado con una flecha; los grupos asignados mediante HRM de las 10 muestras amplificadas sin y con DNA Spike para la detección del SNP-I; y la comparación entre ambas tecnologías para dicho SNP-I. La figura 9-B), muestra lo mismo para la detección del SNP tipo II.

A-4) HRM del SNP SNP tipo IV: A/T

B-4) Sanger del SNP tipo IV: A/T

SNP clase IV: A/T Tanda de muestras I

0

2

46

8

10

1214

16

18

1 2

HRM

San

ger

TT

AT

AA

SNP clase IV: A/T Tanda de muestras II

0

2

4

6

8

10

12

14

16

1 2

HRM

San

ger TT

AT

AA

SNP clase IV: A/T Tanda de muestras III

0

5

10

15

20

1 2

HRM

San

ger TT

AT

AA


Resolution Melting)


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Figura 9-A)

Muestras sin Spiking Muestras con Spiking

B8 D5 F1

GG

GG

AG

AA

AA

AG

GG

GG

GG

GG

ResultadoSanger Sin Spiking Con Spiking

AA AG GG

Diferenciación de las variantes genotípicas para el SNP tipo I: A/G

SNP Clase I: A/G Muestras sin Spiking

0

1

2

3

4

5

6

7

8

1 2

HRM

San

ger

GG

AA

AG

SNP Clase I: A/GMuestras Spiking con DNA Homocigoto AA

0

0,5

1

1,5

2

2,5

1 2 3

HRM

San

ger

GG

AA

AG


Resolution Melting)


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Figura 9-B)

Rv_H7 Rv_H9

Diferenciación de las varian tes genotíp icas para el SNP tipo II: G/T

Rv_H11

CC CA AA

Resu ltadoSa ng er

AA

C A

C C

CA

CC

CC

AA

AA

AA

CC

Mu estras Sin Spik ing Mues tras Con Spik ing

Rv_H7 Rv_H9

Diferenciación de las varian tes genotíp icas para el SNP tipo II: G/T

Rv_H11

CC CA AA

Resu ltadoSa ng er

AA

C A

C C

CA

CC

CC

AA

AA

AA

CC

Mu estras Sin Spik ing Mues tras Con Spik ing

SNP tipo II: G/T

Muestras sin Spiking

0

1

2

3

4

5

6

7

8

1 2

HRM

San

ger

TT

GT

GG

SNP tipo II: G/T Muestras sin Spiking

0

1

2

3

4

5

6

7

8

1 2

HRM

San

ger

TT

GT

GG


0

1

2

3

4

5

6

7

8

1 2

HRM

San

ger

TT

GT

GG


0

1

2

3

4

5

6

7

8

1 2

HRM

San

ger

TT

GT

GG

SNP tipo II: G/T

Muestras con Spiking

00,5

11,52

2,53

3,5

44,5

1 2 3

HRM

San

ger TT

GT

GG


Resolution Melting)


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Conclusiones HRM es una técnica simple, fácilmente accesible y de bajo coste que sirve para analizar de forma rápida múltiples variantes genéticas. No obstante, el cuidado en la preparación de la muestra y el planteamiento del diseño experimental, en especial el diseño de cebadores, son cruciales para la obtención de resultados robustos y reproducibles. De la experiencia adquirida en la realización de este análisis, consideramos que para la realización de un estudio de genotipado mediante HRM son cruciales los siguientes puntos: 1.- Testado de más de una pareja de cebadores por SNP 2.- Mismo método de extracción de DNA de todas las muestras 3.- Triplicados de las muestras Está descrito que aunque el genotipado de SNPs mediante HRM es posible en aproximadamente un 90% de los casos amplificando productos cortos de PCR, en el caso de algunos SNPs los amplicones procedentes de las diferentes variantes homocigotas a veces generan curvas de disociación con formas tan similares que son difíciles de distinguir entre sí (Liew et al. 2004). En nuestra experiencia, incluso las variantes heterocigotas son a veces difíciles de distinguir respecto a las variantes homocigotas. En cualquier caso, hemos podido comprobar que la adición en todas las muestras de una cantidad conocida de ADN tipo salvaje (“spiking”) ofrece una solución a dicho problema, asegurando una clara discriminación entre las diferentes variantes genotípicas. Además hemos podido comprobar que: 1.- Los cebadores no purificados por HPLC son óptimos para análisis de HRM. 2.- No es necesario purificar el producto HRM, obtenido con el reactivo LightCycler480 High Resolution Melting Master Mix (Roche), para la validación por Sanger. 3.- La adición a las muestras de una cierta cantidad de ADN de tipo salvaje claramente mejora la discriminación de las diferentes variantes genotípicas. Bibliografía High Resolution Melting: Optimization Strategies. Technical Note No.1. ROCHE A practical guide to High Resolution Melt Analysis Genotyping. Technical Note 6004. 2010 Bio-Rad Laboratories. Beginners Guide to High Resolution Melt (HRM) analysis M. Liew, R. Pryor, R. Palais, C. Meadows, M. Erali, E. Lyon, C. Wittwer, Genptyping of single-nucleotide polymorphisms by high-resolution melting of small amplicons, Clin. Chem. 50(7) (2004) 1156-64.

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