1 INTRODUCCINLas enzimas son de naturaleza proteica, protenas complejas, que producen un cambio qumico especfico en otras sustancias, son biocatalizadores. Estas son afectadas principalmente por la temperatura, el pH y la concentraciones de sales en el medio, se debe trabajar en condiciones ptimasparapoder lograr lamayor eficienciadeellas, hayquetener presentequeal ser protenas, son lbiles, por lo que si los parmetros nombrados no tienen un buen control, los cambios pueden alterar el desempeo de la enzima, desactivarla o destruirla. La cuantificacin de la actividad enzimtica, velocidad de reaccin ocantidad de enzima que cataliza la conversin de 1 mol de sustrato en un minuto, se debe realizar bajo condiciones ptimas de los parmetros nombrados anteriormente para la obtencin de ptimos resultados.Lasenzimasanivel industrial sonocupadasenbiorreactorescontinuos, porloteoporlote alimentado. Elreactor enzimtico ms utilizado en elrea industrialy especficamente en la industria alimentaria es elbiorreactor por lote, de manejo simple y de mucha utilidad por su funcionalidad en los procesos de produccin. Algunos lugares donde se utilizan estos reactores son en la industria: cervezera, panificadoras, jugo, etc. Al igual que las enzimas, los reactores enzimticos tienen factores que entorpecen su funcionamiento ptimo, adems de los nombrados anteriormente para las enzimas, dentro de los cuales podemos nombrar: concentracindel sustrato, tipodeenzima, capacidaddel flujoyparmetroscinticosdela reaccin.El almidn se encuentra ampliamente distribuido en los rganos de las plantas como carbohidratodereserva. Estambin, componentedegrancantidaddealimentos, siendola fuente ms importante de carbohidratos en la alimentacin humana. Adems los almidones y susderivadostienengranimportanciaendiferentesramasdelaindustria, talescomola alimentaria,textily delpapel.Su obtencinse lleva a cabo principalmente apartir de maz, mijo, papa, trigo y arroz. Se encuentra formado por dos componentes, amilosa y amilopectina, ambas compuestas por cadenas largas demolculas deglucosa, enlamayoradelos almidones el porcentaje de amilosa es del 20% y de amilopectina del 80%, La amilasa es un polmero lineal formado de unidades D-glucosa unidas por enlaces (1-4), en cambio, la amilopectinaesunamacromolcularamificadaenlas queunidades D-glucosaestn unidas por enlaces (1-4) cuando forman parte de cadenas lineales y por enlaces (1-6) cuando actan como nexo de unin entre dos cadenas para formar ramificaciones. La alfa-amilasa cataliza la hidrlisis del almidn cortando los enlaces interiores (1-4) para formar una mezcla de dextrina con poca produccin de maltosa, al ser una endoenzima corta los enlaces al azar.La experiencia en el laboratorio constar en la determinacin de actividad enzimtica de la alfa-amilasa comercial y en la puesta en marcha y operacin de un reactor enzimtico por lotes, en elcualse espera alcanzar un 20% de conversin enzimtica en un periodo de tiempo de 2 horas. 2 MATERIALES Y MTODOS2.1 Materiales2.1.1 Equipos Balanza analtica Bao termosttico a 60C Agitador vertical Espectrofotmetro Pesa agitadora y calefactora Refrigerador2.1.2 Enzimas y reactivos Enzima alfa-amilasa de B.licheniformisTermamyl 120L de NOVO Nordisk Solucin almidn a 20 (g/L) Tampn acetato 0,02 M a pH 5 Reactivo DNS 1,6 (g) de NaOH 30 (g) de tartrato de sodio y potasio Agua desionizada2.1.3 Materiales Vaso precipitado 100 mL Esptula Pizeta Aluza de aluminio Agitador magntico Matraz de aforo de 100 mL Tubos de ensayo Gradilla Pipeta graduada de 1, 2,5, 5 y 10 mL Propipeta Matraz Erlenmeyer Mechero2.2 Mtodos2.2.1 Mtodos analticos2.2.1.1 Mtodo DNSEl mtodo consiste en que las azucares reductoras del producto, en este caso, puedan reducir el cidodinitrosaliclico(DNS), dandoas unacoloracinanaranjadaala mezcla, la que refleja una mayor concentracin de azucares reductores mientras ms intenso se vaya tornando el color mencionado.Preparacin reactivo DNS: En un vaso precipitado con 50 mL de agua destilada disuelva 1.6 g de NaOH Disolver luego 30 g de tartrato de sodio y potasio Calentar con agitacin y agregar lentamente 1 g de cido dinitrosaliclico Aforar a 100 mL Almacenar bajo refrigeracin y protegido de la luz2.2.1.2 Mtodo turbidimtricoEste mtodo mide la reduccin de la intensidad de la luz al pasar por una suspensin de partculas, lacual arrojaunvalor deabsorbanciaqueseinterceptarenunacurvade calibrado para obtener ciertas concentraciones.2.2.1.3 Curva de calibradoLa curva de calibrado es un mtodo de qumica analtica empleado para medir la concentracin de una sustancia en una muestra por comparacin con una serie de elementosdeconcentracinconocida. Sebasaenlaexistenciadeunarelacinen principio lineal entre un carcter medible (por ejemplo la absorbancia en los enfoques de espectrofotometra) y lavariableadeterminar (laconcentracin). Paraello, se efectan diluciones de unas muestras de contenido conocido y se produce su lectura y el consiguiente establecimiento de una funcin matemtica que relacione ambas; despus, se lee el mismo carcter en la muestra problema y, mediante la sustitucin de la variable independiente de esa funcin, se obtiene la concentracin de esta (Harris,Daniel Charles (2003). Quantitative chemical analysis).2.2.2 Mtodos experimentales2.2.2.1 Confeccin curva patrn de glucosa Se deben realizar soluciones de glucosa de concentraciones 0.5, 1, 1.5, 2, 2.5 y 3 (g/L) Se realiza el anlisis de azcares reductores a las soluciones antes sealadas, por duplicado Lacurvapatrnseconstruyegraficandolaabsorbanciaa540nmversusla concentracin en g/L2.2.2.2 Determinacin de actividad enzimtica Adicionar en 6 tubos de ensayo 0.9 mL de una solucin de almidn de concentracin 20 (g/L) Incubar 4delostubossealadosanteriormenteenunbaoa60Cpor 4 minutos de manera que la solucin de almidn alcance la temperatura del bao Adicionar 0.1 mL de solucin enzimtica Incubar2tubospor2minutosylosotrosdospor4minutos, al cabodelos cuales se adiciona 1 mL del reactivo DNS para detener la reaccin A los otros dos tubos se les adiciona el reactivo DNS y luego 0.1 mL de solucin enzimtica Conlosseistubosseprocedesegnloindicadoenlametodologaparala determinacin de azcares reductores2.2.2.2.1 Preparacin tampn acetatoComponente Concentracin Acetato de sodio 0.36g/Lcido actico 0.3mL/L2.2.2.2.2 Preparacin solucin almidnSepreparautilizandotampnacetato0.02MapH5. Sedebecalentar partedel tampn y cuando ste ebulla se adiciona lentamente el almidn suspendido en tampn. Una vez que se ha adicionado todo el almidn se deja ebullir por 2 minutos.2.2.2.2.3 Determinacin de azucares reductores Agregar 1mLdereactivoa1mLdemuestra( el blancosehaceconagua destilada como muestra) en un tubo de ensayo y luego taparlo Incubar en bao de agua a ebullicin por 15 minutos Enfriar el tubo en un bao de hielo Agregaral tubo 10 mL de agua destilada y dejar reposar por 15 minutos Determinar la absorbancia de la mezcla a 540 nm2.2.2.3 Puesta en marcha del reactor enzimtico2 ecAGXt ( ) 1 1 ln ec tKVX XKsmmmo Cargar el reactor con el medio de reaccin consistente en una solucin de almidn de una concentracin de 20 (g/L) , preparada con tampn acetato 0.02 M a pH 5 Introducir el reactor en un bao termosttico a 60C. Poner en marcha el sistema de agitacin Esperar que el medio de reaccin alcance la temperatura de reaccin, de 60C. Adicionar la enzima Antes de adicionar la enzima se debe sacar una muestra para determinar la concentracin de azcares reductores a tiempo cero. Se comienza a registrar el tiempo de reaccin y tomar muestras de un volumen de 2 mLaintervalosde15minutos, luegosedeterminarlaconcentracindeazcares reductores.2.2.2.3.1Tratamiento de las muestrasLasmuestrasdebenser tratadasparainactivar laenzimayasegurarsedequese detiene la reaccin, esto se logra con un cambio brusco de pH. En tubos de ensayo , colocar 0.1 ml de hidrxido de sodio 5N Diluir las muestras cuando corresponda, para llegar a una concentracin de azcares reductores dentro de un rango de linealidad del mtodo DNS (0-1 g/L), esto se logra con la ecuacin del reactor que mezcla un balance al sustrato y la velocidad de reaccin de laenzima, y laecuacindel porcentajedeconversin; las cuales semuestrana continuacin:3 RESULTADOS Y DISCUSIONES3.1 Determinacin de curva patrn de glucosaPara la determinacin de los azcares reductores se realiz una curva patrn, ocupando el mtodo DNS,obteniendo la siguiente ecuacin 0,5199 0,002 y x , a continuacin se muestra la curva patrn. Figura 1: curva patrn de glucosa (ver anexo 1, tabla 3.1)Esta curva nos servir para la obtencin de la actividad enzimtica de la-amilasa comercial.3.2 Determinacin de Actividad EnzimticaA partir de lacurva patrn mencionada anteriormente, se obtuvieron las concentraciones de azcares reductores en el tiempo, con la cual se obtendr la velocidad mxima de reaccin.Figura 2: Determinacin de actividad enzimtica (ver anexo 2, tabla 3.2)Enlagrficasepuedeobservarlavelocidaddereaccindelaenzima, correspondiendoal valor de la pendiente, 0,0808 g/L*min (4,848 g/L*h). Con este valor e incluyendo las diluciones previas de la enzima, se pudo calcular el valor experimental de la velocidad de reaccin de la enzima M(experimental)V 96960 / * g L h (ver Anexo 2, ec3).3.3 Puesta en marcha: Determinacin del grado de conversin de la reaccin en funcin del tiempo de operacinEl grado de conversin de la reaccin en funcin del tiempo de operacin, tiene una estrecha relacin entre la concentracin de glucosa producida y el almidn hidrolizado, por efecto de la alfa amilasa. A continuacin se muestran las figuras correspondientes a la determinacin de la concentracindeglucosa, el gradodeconversintericoyexperimental delareaccinen funcin del tiempo en el reactor enzimtico.Figura 3: Concentracin de glucosa en el tiempo (ver anexo 3, tabla 3.3.1)Figura 4: Grado de conversin experimental de la reaccin en funcin del tiempo de operacin (ver anexo 3, tabla 3.3.2)Figura 5: Grado de conversin terico de la reaccin en funcin del tiempo de operacin (ver anexo 3, tabla 3.3.3) Gracias a los valores de M(experimental)V y ( ) M TeoricoV(ver anexo 3, ec1) se pudo estimar el volumen delaenzimaal adicionar enel reactor(( )10, 8EnzimaVolumen L ; veranexo3, ec4)parala puesta en marcha, bajo las condiciones de pH 5, temperatura 60 C. Cabe mencionar que la ( ) M TeoricoVserecalcul, debidoaquenosepudoadicionar el volumendeenzimaantes mencionado, por el poco volumen con el que se contaba en el laboratorio, debido a esto, se adiciono un volumen de 10 L de enzima, dndonos un ( )1, 93( / * )M TeoricoV g Lh (ver anexo 3, ec5), con el cual se calcularon los grados de conversin a los distintos tiempos. A causa del nuevoVmterico, laconversinde20%yanosecumpliraalas2horasquehabamos estimado, sino que esta sufrira un desfase de 20 minutos.Como se aprecia en la figura 5 el porcentaje de conversin experimental fue sobrepasado en casieldoble (37,86%), alestimado en elclculo terico (20%). Elparmetro que determin este cambio, lo ataamos a la temperatura, debido a que la curva terica se confeccion con losdatosobtenidosdeladeterminacindelaactividadenzimtica, loscualesestuvieron ambientados a 60C, en cambio, la puesta en marcha en un comienzo tuvo una temperatura mayor, debidoaquelasolucintampnconsustratovenaensupuntodeebullicinyel periododetiempoquetranscurriparasuambientacinconel baotrmico(todoestoal interior del reactor) no fue la suficiente para una perfecta estabilizacin a 60 C. Cuantitativamente esto se refleja en la segunda muestra a los 15 minutos, se observa claramente en la figura 5 que la pendiente entre el punto 0 y 15 es mucho ms elevada que en los puntos restantes, de hecho en estos puntos la pendiente resulta en su mayora constante.4 CONCLUSINLos objetivos planteados en un comienzo se cumplieron parcialmente, se determin la actividad enzimtica y posteriormente se puso en marcha un reactor enzimtico por lote a condiciones de temperatura 60C (siendo el ptimo para la enzima de 80C) y pH 5, en la cual se esperaba un gradodeconversin del 20%, sinembargo, esteporcentajefuedistintoal esperado, el porcentaje obtenido a las 2 horas de operacin fue casi el doble (37,86%), esto debido a las condiciones en las que se oper en un comienzo. Lo cual de todas maneras nos sirvi para la familiarizacindeunapuestaenmarchayademsparael desarrolloanalticoenloque respecta a los parmetros que pueden influir en este proceso.De acuerdo a los datos obtenidos y al anlisis realizado se pudo observar que hay parmetros que afectan la actividad de la enzima, siendo estos elvolumen de enzima adicionado para llevar a cabo la reaccin, el pH y la temperatura. Este ltimo fue uno de los ms influyentes en esta experiencia, ya que al no alcanzar la estabilidad trmica, en un comienzo, aceler el poder cataltico de la enzima al encontrarse cercano a su ptimo, 80C.5 BIBLIOGRAFA Illanes, A. Biotecnologa de enzimas, 1994.Ediciones universitarias de Valparaso de la Universidad Catlica de Valparaso.Valparaso,Chile. Illanes, A. Acevedo, F. Gentina, J.C. 2002. Fundamentos de Ingeniera Bioqumica, Ediciones Universitarias de Valparaso, Chile. Harris, Daniel Charles 2003. Artculo Quantitative chemical analysis.ANEXO Anexo 1: Curva patrn de glucosaTabla 3.1: Determinacin curva patrn de glucosaAnexo 2: Actividad enzimticaTabla 3.2: Determinacin de actividad enzimticaTiempo (min)Absorvancia (540 nm)Concentracin (g/L)0 0,11665705 0,058328522 0,27822658 1,139113294 0,45999231 2,22999615Determinacin de la velocidad experimental de reaccin:La velocidad de reaccin enzimtica se calculo mediante la siguiente ecuacin: 3 * *) (expec V D d Merimental MDonde:matraz dilucion Densayo tubo dilucion dpendiente M.. .Obtenindose as:. cos0, 0808 *10*2000*min. cos1616*min. cos96960*MMMgr glu aVLtgr glu aVLtgr glu aVLt h ] ] ] ] ] ] ] ] ]Anexo 3: Puesta en marcha.Tabla 3.3.1: Concentracin de glucosa en el tiempo. Tabla 3.3.2: Grado de conversin experimental de la reaccin en funcin del tiempo de operacin.Tabla 3.3.3: Grado de conversin terico de la reaccin en funcin del tiempo de operacin.Tiempo (h) X0,0000 00,2500 0,012Tiempo (h)Glucosa (g/L)0,0000 0,0730,2500 3,1050,5000 4,6630,7500 5,9101,0000 6,4031,2500 7,6571,5000 8,4501,7500 8,2972,0000 7,574Tiempo (h) X 0 0,0040 0,1551 0,2331 0,2951 0,3201 0,3832 0,4232 0,4152 0,379( ) 1 1 ln ec tKVX XKsmmmo 0,5000 0,0240,7500 0,0361,0000 0,0481,2500 0,0601,5000 0,0711,7500 0,0832,0000 0,095Determinacin de la Velocidad terica de reaccin y volumen de enzima.Velocidad Terica de reaccin. La velocidad Terica de reaccin se calcula mediante la ecuacin de comportamiento del reactor.Donde: ( )0.: 20120%( )2 .Mgr almidonSLtK teoricoX gradoconversiont h ] ] ]( )20*0, 2 ln(1 0, 2) *21 1M teoricoV Por lo tanto:( ). cos2,1*M teoricogr glu aVlt h ] ] ]Volumen de enzima.Datos:( )( )( ). cos2,1*. cos96960*500.M TeoricoM Experimentalreacciongr glu aVLt hgr glu aVLt hVolumen ml ] ] ] ] ] ]( )cos2,1 500cos96960enzimagGlu amlL hVolumengGlu aL h| ` . ,| ` . , ec. 4( )10, 8EnzimaVolumen L Ya que realmente se adicionaron 10 L de enzima, la velocidad terica se recalcula quedando:( ). cos1, 93*M teoricogr glu aVlt h ] ] ]ec5.