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INFORME FINAL DEL PROYECTO

AISLAMIENTO E IDENTIFICACIN DE GENES Cry EN CEPAS NATIVAS DE Bacillus thuringiensis CON POTENCIAL INSECTICIDA

CONTRA Spodoptera frugiperda

SIP20080073 RESUMEN El maz es un cultivo de importancia econmica en el Estado de Durango. Uno de los graves problemas fitosanitarios que enfrenta es el ataque de insectos-plaga, entre los que destacan Spodoptera frugiperda y Heliothis zea. Una alternativa para el control biolgico de estos insectos es mediante el uso de microorganismos entomopatgenos, tales como la bacteria Bacillus thuringiensis, considerado el bioinsecticida de mayor xito comercial (90%), para el control de plagas de importancia agrcola, forestal y mdica, su actividad txica radica en el cristal paraesporal que la bacteria sintetiza en el momento de la esporulacin, el cual esta compuesto por protenas cristalinas o delta-endotoxinas. Algunos de estos cristales son txicos para ciertas especies de insectos, propiedad que ha conferido a este organismo un enorme inters. Dentro de las lneas de investigacin relacionadas a B.t. radica el llevar a cabo la bsqueda y mejoramiento de cepas de B. thuringiensis. La seleccin y caracterizacin de cepas nativas permite hacer estudios ecolgicos, as como tambin la bsqueda y seleccin de cepas que pudiesen tener mayor toxicidad que las cepas comerciales contra determinado tipo de plagas. En este trabajo se aislaron cepas nativas de B. thuringiensis en muestras de suelo cultivados en reas productoras de maz y en reas no cultivadas cercanas al cultivo, en cuatro municipios del Estado de Durango, las cuales fueron caracterizadas genticamente mediante la determinacin de los genes cry I y los genes especficos cry1Aa, cry1A, cry1Ac y cry1F por la tcnica de PCR. Se obtuvieron un total de 17 aislamientos. La mayor cantidad de cepas (29.41%), se aislaron en el municipio de Poanas, Durango en rea cultivada, el 11.76% de las muestras fueron obtenidas en reas sin cultivar cerca al cultivo (en los surcos). Se selecciono la cepa Bt2 para realizar los bioensayos de preferencia alimenticia contra larvas neonatas de Spodoptera frugiperda obteniendo una mortalidad de 62.66% a una concentracin de 10% (100 g/ml) de un microencapsulado elaborado a base de la cepa seleccionada de Bt.

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INTRODUCCIN

El maz es el cultivo de mayor importancia en Mxico. Durante la ltima dcada, se han producido alrededor de 18 millones de toneladas al ao. En Durango se sembraron 205 516.3 ha de maz, con una produccin estimada de 290 115.0 ton (SAGARPA, SIAP, 2006). Sin embargo, un 60% del total de la produccin se ve afectada por un complejo de plagas (Heliothis zea, Dalbulus maidis, Diabrotica sp, Phyllophaga spp.), dentro de las cuales Spodoptera frugiperda (J. E Smith), gusano cogollero es considerada la plaga ms significativa de este cultivo, debido a que el ataque se puede producir desde la formacin de plntulas hasta la formacin de espigas, circunstancia que dificulta su control, para el cual actualmente se emplean plaguicidas qumicos como: Karate, Sevin (80% PH, Folidol M-50, Decis y Lorsban *480 EM, a dosis de 100 a 600 cc/ha, que son de alto impacto negativo sobre los organismos benficos presentes en el ambiente.

Una alternativa es el control biolgico, que consiste en la aplicacin de tcnicas compatibles con la conservacin del medio ambiente, mediante el uso de los enemigos naturales de las plagas que actuando de un modo natural, controlan el nivel poblacional de las especies plaga sin ocasionar problemas de contaminacin ni de residuos a partir de estos se obtienen productos biolgicos llamados bioinsecticidas (Fragas et al, 2005). La bacteria Bacillus thuringiensis (Bt) es el bioinsecticida que ms se comercializa a nivel mundial para el control de plagas agrcolas, forestales y de vectores de enfermedades. Es una bacteria Gram positiva, la cual produce diferentes protenas como cry, cyt, vip y s-layer, entre otras, con propiedades bioinsecticidas, adems de afectar otros organismos como nematodos, caros y protozoarios (de Maagd, et al., 2003; Pea et al., 2006). Las protenas son biodegradables, altamente especficas, inocuas al hombre, vertebrados y plantas. Algunos de los genes que codifican las protenas cry y vip han sido expresados en plantas como maz y algodn (Bravo, et al., 2005). Sin embargo, es importante contar con cepas nativas de la regin que conserven la especificidad contra insectos plaga de la regin, debido a lo anterior, el objetivo del presente proyecto de investigacin fue el Aislamiento de cepas nativas de Bacillus thuringiensis en suelos cultivados con maz en el Estado de Durango, identificacin molecular de genes Cry I y evaluacin de su toxicidad contra larvas de gusano collogero.

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MTODOS Y MATERIALES META 1. AISLAMIENTO DE CEPAS NATIVAS Colecta de muestras de suelo.

Se recolectaron muestras de suelo de reas cultivadas con maz y de reas no cultivadas, en cuatro municipios del Estado de Durango (Tabla 1), con diferente ubicacin geogrfica, en relacin a los cuatro puntos cardinales, partiendo de la Ciudad de Durango. Se tomo aproximadamente 1Kg de muestra de suelo a una profundidad de alrededor de 10 a 15 cm. Las muestras se colocaron en bolsas de plstico y se trasladaron al laboratorio de entomologa del CIIDIR-IPN Unidad Durango.

Tabla 1. Ubicacin de los sitios de muestreo.

Sitio

Municipio

Ubicacin

Latitud Longitud Altitud

Canatln

Mezquital

Poanas

Pueblo Nuevo

24 33 10.60

23 28 22

23 55 59.90

23 47

104 44 28.70

104 24 40

104 8 7.40

105 22

1945 m

1400 m

1871 m

2560 m

En el laboratorio se abrieron las bolsas con las muestras y se dejaron una semana al aire libre para eliminar el contenido de humedad. Despus se tamizaron para retirar los residuos de piedras, terrones, plantas, insectos o basura.

Colecta de insectos con manifestacin de la enfermedad por bacterias

Adems se colectaron insectos con manifestacin de infeccin por bacterias (coloracin obscura, lisis osmtico coloidal, Fig.1), los cuales se retiraron del interior de las hojas de maz con ayuda de una pinza entomolgica y se trasladaron al laboratorio en vasitos de plstico No. 0 para aislar las bacterias presentes.

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Aislamiento de Bacillus thuringiensis (Bt) a partir de muestras de suelo. Se realizaron diluciones 1:10 a partir de las muestras de suelo. Se tomo 1g de suelo, se adiciono en 9 ml de agua destilada estril en un tubo de ensaye. Esta dilucin 1:10 fue pasteurizada a 80C durante 15 minutos. La muestra se somete a un shock trmico frio, colocando los tubos en bao de hielo durante 5 minutos. Posteriormente el tubo se somete a un nuevo proceso de pasteurizacin a 80C durante 5 minutos. A partir de esta dilucin se realizaron diluciones seriadas tomando 1 ml de la dilucin 1:10 y colocndola en un tubo con 9 ml de agua destilada estril para de esta manera generar la dilucin 1:100 o 1x10-2, a partir de esta dilucin se repite el procedimiento hasta generar una dilucin del suelo de 1x10-5, -6. De las dos o tres ltimas diluciones se toma una alcuota de 100 l (0.1 ml) y se transfiere a una placa o Caja Petri con agar nutritivo. La muestra se expande con la ayuda de una varilla de vidrio estril o mediante un proceso de estriado en 3 o 4 cuadrantes. Caractersticas macroscpicas. Las placas se incuban a 30C durante 24 horas y se seleccionan colonias con caractersticas tpicas de Bt (colonias color crema, con bordes redondeados, ligera elevacin cncava, aspecto seco). Cada colonia tpica fue trasferida a una nueva placa tratando de sembrarla de tal manera que se colocara en un solo punto de la placa. En una placa se pueden sembrar hasta 8 colonias cuidando de colocar una colonia de otra con una separacin aproximada de 15 a 20 mm con la finalidad de evitar el empalme de colonias al momento de irse desarrollando. Una vez seleccionadas las colonias a resembrar, se realizo la prueba de la catalasa adicionando una pequea gota de perxido de oxgeno (H2O2) sobre la colonia original con la finalidad de observar la efervescencia de la solucin (Catalasa positiva). Las colonias resembradas son incubadas a 30C por espacio de 96 horas cerciorndose de llevar a cabo el monitoreo de la aparicin de las esporas y de los respectivos cristales proteicos. Aquellas colonias cristalferas son conservadas en tubos con agar nutritivo inclinado e incubadas por espacio de 24 horas, las cuales posteriormente se conservaron a 4 C. Caractersticas microscpicas. A las colonias seleccionadas se les realiz un frotis, para conocer si se trataba de bacilos gram positivos o Gram negativos, mediante una tincin de Gram y as poder descartar las que se trataran de bacilos Gram negativos que no corresponden a bacterias.

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Frotis y Tincin de Gram

Frotis

1.- Colocar una gota de solucin salina estril en un portaobjetos

2.-Con el asa bacteriolgica estril tomar un inoculo de la colonia elegida y colocarlo en la gota de solucin salina

3.-Con el asa bacteriolgica esparcir a lo largo de portaobjetos

4.- Dejar secar al aire libre

5.-Fijar a la flama del mechero

Se fija el frotis y se tie de la siguiente manera:

Tincin de Gram

1.-Se cubre con el cristal violeta 1 minuto.

2.-Se lava con agua corriente, se sacude levemente para quitar el exceso de agua.

3.- Se cubre con lugol un minuto

4.-Se lava nuevamente.

5.-Se le pone un instante alcohol acetona para decolorar

6.-Se lava nuevamente

7.- Se cubre con safranina por 30 seg.

8.-Se lava nuevamente, se deja que se seque y se observa al microscopio.

Obtencin del complejo espora-cristal. Las cepas se cultivaron en caldo de leche peptonizada (leche peptonizada 10g, dextrosa 10g, extracto de levadura 2g, sulfato de magnesio heptahidratado 0.3g, sulfato de fierro heptahidtarado 20mg, sulfato de zinc heptahidratado 20 mg, sulfato de manganeso 20 mg, en un litro de agua, pH 7.2-7.5) a 28C, agitacin 130 rpm, hasta alcanzar la etapa de autlisis. El complejo espora-cristal se centrifug a 10,000 rpm por 10 min, se liofiliz. META 2. CRA MASIVA DE S. frugiperda EN LABORATORIO Colecta de insectos en campo.

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Se colectaron larvas de gusano cogollero, en cultivos de maz, en zonas agrcolas en el Estado de Durango, Dgo. (Francisco I. Madero, Carlos Real y Guadaluper, Victoria, Durango). Mantenimiento de insectos en laboratorio. Las larvas fueron mantenidas en dieta natural por 45 das hasta que estuviesen libres de los contaminantes del campo, posteriormente fueron colocadas individualmente en vasitos de plstico No. 0 con dieta artificial (Tabla 2) elaborada de acuerdo a la tcnica descrita por Shorey, (1963), a base de harina de soya y germn de trigo, las pupas fueron colocadas en una cmara de emergencia, las palomillas se colocaron en bolsas de papel hasta la oviposicin en una cmara de cra (28C, fotoperiodo 12:12 luz: oscuridad y una humedad relativa del 80%, con depsitos de plstico impregnados con sacarosa al 25%, los huevecillos se colectaron de las bolsas de papel y se colocaron en cajas de Petri con dieta artificial hasta que eclosionaron, luego se colocaron en vasitos de plstico de forma individual. META 3. DETERMINACIN DEL TIPO DE GENES CRY PRESENTES EN LAS CEPAS AISLADAS Extraccin de ADN. El ADN molde fue obtenido a travs de un lisado celular. Para ello, se obtuvieron cultivos de 18h de incubacin en placas de agar Luria Bertani bajo una atmosfera aerobia a 30C. Una asada del cultivo bacteriano proveniente de una sola colonia fue depositada en un tubo ependorff de 1500 L con 500 l de agua miliQ estril. La suspensin celular fue sometida a un proceso de lisado sometindolo a un ciclo de 10 minutos a 100C y 5 min a 4C en un termociclador Peltier Thermal Cycler, Marca Biorad. El lisado celular posteriormente fue centrifugado a 16 000 rpm durante 1 minuto en una centrifuga refrigerada Hettich Mikro 22R modelo D-78537 y posteriormente fueron separados 300 microlitros de la fase acuosa a un tubo de 600l estril. El material obtenido fue utilizado como molde en la reaccin de PCR.

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Tabla 2. Dieta artificial para Spodoptera frugiperda (Shorey, 1963).

Ingredientes CantidadHarina de Soya Germn de trigo Solucin vitamnica Sal Wesson Agar Agar Sacarosa cido srbico Metil Paraben cido ascrbico cido actico (25%) Cloruro de colina Formalina (10%) Agua

71.1 g 31.7 g 0.5 g 10.6 g 14 g 13 g 1 g 1.6 g 4.3 g 12 mL 7.3 mL 4.4 mL 1 L

META 3. DETERMINACIN DEL TIPO DE GENES CRY PRESENTES EN LAS CEPAS AISLADAS Extraccin de ADN. El ADN molde fue obtenido a travs de un lisado celular. Para ello, se obtuvieron cultivos de 18h de incubacin en placas de agar Luria Bertani bajo una atmosfera aerobia a 30C. Una asada del cultivo bacteriano proveniente de una sola colonia fue depositada en un tubo ependorff de 1500 L con 500 l de agua miliQ estril. La suspensin celular fue sometida a un proceso de lisado sometindolo a un ciclo de 10 minutos a 100C y 5 min a 4C en un termociclador Peltier Thermal Cycler, Marca Biorad. El lisado celular posteriormente fue centrifugado a 16 000 rpm durante 1 minuto en una centrifuga refrigerada Hettich Mikro 22R modelo D-78537 y posteriormente fueron separados 300 microlitros de la fase acuosa a un tubo de 600l estril. El material obtenido fue utilizado como molde en la reaccin de PCR. Para la bsqueda de genes del tipo Cry1 generales se utilizaron el par de primer Un1(d) y Und1(r) descritos por BenDov et al (1997), mientras que para la bsqueda de genes especficos cry1Aa, cry1Ab, cry1Ac fueron utilizados los primer descritos por Jurez-Prez (1997), y para el gen cry1F los primer descritos por Cern et al (1995). Las mezclas de reaccin con volumen final de 25 L fueron preparadas como sigue: ocho microlitros del lisado celular fueron utilizados como ADN templado. Posteriormente se adicionaron 5 l de Buffer GoTaq 5x (1X), 1.5l cloruro de magnesio 25mM (1.5mM), 1 L de cada uno del par de primer (5pM) y 0.25L de dNTPs 10mM (200M de cada uno)

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y 7.5L de agua miliQ estril y 0.5 L de la enzima Taq DNA polimerasa (5U/L) de la marca Promega dando un volumen final de reaccin de 25L. Amplificacin de genes. La amplificaciones fueron realizadas en un termociclador Peltier Thermal Cycler de la marca Biorad. Para la amplificacin del gen general cry1 se realizo un ciclo de desnaturalizacin de 94C por 2 minutos seguido de un ciclo de 30 repeticiones del programa (94C por 60 segundos, 56C por 35 segundos y 72C por 60 segundos, seguido de una extensin final a 72C por 5 minutos). Para la amplificacin de los genes cry1Aa, cry1Ab y cry1Ac se realizo un ciclo de desnaturalizacin de 94C por 5 minutos seguido de un ciclo de 25 repeticiones del programa (94C por 60 segundos, 45C por 45 segundos y 72C por 120 segundos, seguido de una extensin final a 72C por 10 minutos). Para la amplificacin del gen cry1F se realizo un ciclo de desnaturalizacin de 95C por 2 minutos seguido de un ciclo de 30 repeticiones del programa (95C por 60 segundos, 44C por 60 segundos y 72C por 60 segundos, seguido de una extensin final a 72C por 10 minutos). Seguido de la amplificacin 5 L de cada mezcla de reaccin sometida a amplificacin fueron mezclados con 2 L del buffer de carga del Green GoTaq-10x Cyber gold y separados por electroforesis en un gel de agarosa al 1.5% en TAE1X. META 4. BIOENSAYOS DE TOXICIDAD Determinacin de la CL50. Se utilizaron larvas neonatas de S. frugiperda para los bioensayos de preferencia alimenticia. Se utiliz la cepa (Bt2) de B. thuringiensis, para la produccin del complejo espora cristal utilizado para la formulacin del bioinsecticida. Se utilizaron dos tipos de fagoestimulantes, dos tipos de adherentes y un tipo de encapsulante. Se utiliz hoja de maz fresca como control. Elaboracin de soportes granulares para bioensayos de preferencia alimenticia Los soportes granulares se elaboraron a base de Capsul (almidn de maz modificado) gelatina bovina y pectina de limn. Los fagoestimulantes utilizados fueron maz molido y panoja de maz. En total se realizaron 7 tipos de granulados. Los soportes de Capsul-gelatina y Capsul-pectina se elaboraron mezclando los polmeros a razn de 1:1 con los fagoestimulantes al 4% + 25 mL de agua destilada (por cada 50 g de polmero). En estos bioensayos se utilizaron tres blancos: Capsul, Capsul-pectina, Capsul-gelatina sin fagoestimulante. Las mezclas se colocaron en un molde y se desecaron en un horno de tiro forzado a una temperatura de 40C por 24 h. Una vez desecadas, las mezclas se molieron

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con un mortero. Los grnulos obtenidos se almacenaron en botes de plstico hermticos a temperatura ambiente para su uso posterior. Los bioensayos de preferencia alimenticia se realizaron para determinar el polmero y el fagoestimulante ms aceptados por S. frugiperda. El bioensayo de preferencia alimenticia se realiz por el mtodo de dos alternativas descrito por Bartelt et al. (1990), para el cual se elaboraron soportes granulares sin extracto de B. turingiensis. Para el bioensayo se utilizaron cajas de Petri desechables de 5 cm de dimetro con el fondo cubierto con una mezcla de pasta de pars y carbn activado en proporcin 10:1. En cada caja se depositaron en sitios opuestos 0.2 g de grnulos a comparar. Un total de 28 pares de grnulos se compararon. Se realizaron 5 repeticiones por cada comparacin. En cada repeticin se transfirieron 10 larvas de dos das de desarrollo de S. frugiperda a las cuales se les permiti alimentarse durante 16 h a 28 C en completa oscuridad. Las cajas de Petri se congelaron a 20 C y el nmero de larvas sobre cada sitio se registr. Se utilizaron 280 larvas del primer instar aproximadamente en cada una de las repeticiones. Tabla 3. Combinaciones de los soportes para los bioensayos de preferencia alimenticia

Formulado

Ingredientes Combinaciones

1 Capsul - gelatina - espiga 2 3 4 5 6 7 8 2 Capsul - gelatina - maz - 3 4 5 6 7 8 3 Capsul - pectina - espiga - - 4 5 6 7 8 4 Capsul - pectina - maz - - - 5 6 7 8 5 Capsul - gelatina - - - - 6 7 8 6 Capsul - pectina - - - - - 7 8 7 Capsul - - - - - - 8 8 Control - - - - - - -

Obtencin del ingrediente activo La cepa se activ durante 18 horas en tubos con agar inclinado a pH 7.0, se tomaron varias asadas para inocular 50 mL de caldo soya tripticasena (CST) contenido en matraces Erlenmeyer de 250 mL, los matraces se mantuvieron en agitacin a 120rpm, a 30C por 10h. Del CST se tom 1mL el cual se inocul en 100mL de medio a base de melaza (melaza 20 g/L, harina de soya 20 g/L, lactosuero en polvo 2 g/L y carbonato de calcio 1 g/L) a pH 7.0-7.2, en matraces Erlenmeyer de 1000 mL con agitacin a 200 rpm y 30C. Los cultivos se monitorearon hasta observar un 80% de esporulacin, en este punto se detuvo la fermentacin y se ajust el medio a pH de 7.0. Para la recuperacin del complejo espora-cristal, el medio de cultivo fue sometido a centrifugacin a 6,000 rpm por 30 min y se determin el peso del precipitado mediante la siguiente ecuacin: PP=P2- P1, donde P1 (peso 1) correspondi al peso del bote ms el medio de cultivo, P2 (peso 2) correspondi al peso del precipitado en el bote, descartando el

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sobrenadante y PP (peso del precipitado) corresponde al peso del precipitado obtenido de la diferencia de los pesos. Para obtener el volumen de lactosa al 5% necesario para la coprecipitacin, el PP se multiplic por el factor 1.71 y al volumen obtenido de lactosa se le sum el PP, de esta manera se obtuvo el volumen total, esta cantidad se multiplic por un factor para obtener el volumen de acetona necesario para la coprecipitacin, segn lo reportado por Dulmage, (1970). El precipitado se coloc en un vaso de precipitado con los volmenes de lactosa y acetona en agitacin durante 30min, posteriormente se dej reposar por 10min. Toda la mezcla se filtr en un matraz Kitasato utilizando papel Whatman # 1, el precipitado se lav con tres volmenes de acetona. El filtrado se dej secar y se moli finalmente en un mortero y se guard en frascos hermticos hasta su utilizacin. Elaboracin de los formulados asperjables a base de B t para bioensayos de laboratorio Segn los resultados obtenidos en los bioensayos de preferencia alimenticia, se desarrollaron formulados asperjables con el polmero y el fagoestimulante ms aceptado por S. frugiperda usando B. t al 3, 7 y 10% para pruebas de laboratorio. Para la elaboracin de los formulados asperjables se utiliz el mtodo reportado por Luna Santillana, (1998). Se hicieron las soluciones acuosas con los polmeros correspondientes, Capsul y gelatina bobina en los cuales se dispers el fagoestimulante y el extracto de B.t y se secaron utilizando un secador por aspersin. Las condiciones del secador por aspersin fueron: temperatura de entrada: 140C, temperatura de salida: 80C y flujo de alimentacin de 7 mL/min. Determinacin de la actividad txica de las formulaciones contra S. frugiperda a nivel de laboratorio. Una vez obtenidos los formulados, se realizaron bioensayos en laboratorio para determinar la retencin de la actividad txica de B.t. Los formulados asperjables se reconstituyeron en agua estril para incorporarse a la dieta artificial de S. frugiperda, ajustando las tres concentraciones de los formulados a la dosis 100 mg/mL. RESULTADOS META 1. AISLAMIENTO DE CEPAS NATIVAS Muestras de suelo. Las muestras de suelo se clasificaron de acuerdo a la siguiente tabla. Se colectaron un total de 24 muestras de suelo, los cuales fueron colectados de 4 sitios diferentes en reas cultivadas con maz y en reas sin cultivar (cercanas al cultivo), as como insectos muertos con sintomatologa de infeccin por bacterias, colectados principalmente adheridos a las hojas. Caractersticas macroscpicas.

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Las cepas de Bt fueron identificadas primeramente por las caractersticas fenotpicas de las colonias y la presencia de cristales, posteriormente se identificaron los genes cry presentes en las cepas. La morfologa que se consider para el aislamiento de estas cepas fue el siguiente: colonias color crema o ligeramente griscea, de elevacin plana, bordes lisos, redondas, grandes (aproximadamente 0.5-1 cm a las 24 hrs.), estas colonias no deben de ser de aspecto mucoide. En la siguiente tabla se indica el nmero de colonias obtenidas de cada muestra de suelo, ubicadas por municipios, as como el nmero de colonias que fueron bacterias pertenecientes a Bt de acuerdo a las caractersticas microscpicas y macroscpicas, el nmero de colonia y la dilucin utilizada para su aislamiento. Tabla No. 5. Distribucin de cepas de Bt aisladas de muestras de suelo colectadas en maz en Durango, Mxico. Municipio Nmero de

colonias bacteriales

Nmero de colonias de Bt

No. de muestra, dilucin

1A 12 1 [8, 10-1] 1B 61 3 [44, 10-1] [52, 10-2]

[42, 10-1] 2A 23 1 [17, 10-2] 2B 41 1 [28, 10-4] 3A 93 5 [12, 10-4] [15, 10-4] [22, 10-2] [36,

10-2] [88, 10-1] 3B 18 2 [14, 10-1] [18, 10-1] 4A 10 1 [9, 10-2] 4B 43 2 [22, 10-1] [41, 10-1] Total 301 17 Como se puede observar en la informacin anterior, se obtuvo mayor cantidad de cepas (29.41%), en el municipio de Poanas, Durango en rea cultivada con maz, el 11.76% de las muestras fueron obtenidas en reas sin cultivar cerca al cultivo (en los surcos), el mayor nmero de cepas obtenidas fueron provinieron de las primeras diluciones, disminuyendo notablemente a diluciones mayores, ya que a mayor dilucin hay menor cantidad de muestra.

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META 3. DETERMINACIN DEL TIPO DE GENES CRY PRESENTES EN LAS CEPAS AISLADAS Se utilizo la cepa de referencia HD551 para el gen general cry1, la cepa HD133 para el gen cry1Ab y la cepa HD37 para los genes cry1Ac y cry1F, pertenecientes al laboratorio de Biotecnologa Genmica del IPN en Reynosa, Tamaulipas. Tabla No. 6. Caractersticas de los primers empleados para la deteccin de genes cry en cepas de B.t. Gen Par de primer Secuencia Tamao esperado (pb) Cry1 Und1(r) TTGTGACACTTCTGCTTCCCATT 277 Und1(f) CATGATTCATGCGGCAGATAAAC Cry1Aa I- MDATYTCTAKRTCTTGACTA 1283 IAa TTCCCTTTATTTGGGAATGC Cry1Ab I- MDATYTCTAKRTCTTGACTA 1371 IAb CGGATGCTCATAGAGGAGAA Cry1Ac I- MDATYTCTAKRTCTTGACTA 844 IAc GGAAADTTTCTTTTTAATGG Cry1F CJ16 TGAGGATTCTCCAGTTTCTGC 177 CJ17 CGGTTACCAGCCGTATTTCG Deteccin de genes Cry por la tcnica de reaccin en cadena de la polimerasa. Se prepararon 8 lisados de las 10 cepas de referencia que se tenan en el laboratorio de Biotecnologa Genmica, bajo este esquema se corrieron 8 reacciones de PCR para cada uno de los genes de estudio, lo que dio un total de 40 reacciones. Las cepas y el tipo de gen buscado fueron numerados para una mayor simplicidad en el manejo de la informacin, de tal forma que las claves numricas correspondieron: el primer nmero es tipo de gen a buscar y el segundo nmero corresponde al tipo de cepa de Bt. Las claves utilizadas son las siguientes: Clave Gen Tipo de gen cry1 1 cry1Aa 2 cry1Ab 3 cry1Ac 4 cry1F 5

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De igual forma el tipo de gen buscado fue numerado siguiendo la siguiente nomenclatura: Clave Cepa Clave de coleccin

1 HD37 2 HD551 3 HD9 4 HD29 5 HD133 6 HD25 7 GM7 8 GM10

Bajo este esquema se tiene, por ejemplo, que la clave 32 mostrada en el gel corresponde a la determinacin del gen cry1Ab en la cepa HD551. Las claves usadas y la distribucin de estas reacciones se visualizaron en 2 geles de 20 posillos cada uno, los cuales se muestran a continuacin. M corresponde al marcador de peso molecular *Las fotografas fueron tomadas en un fotodocumentador de luz ultravioleta con una cmara Kodak digital science 1D. De los resultados anteriores podemos resumir la presencia o ausencia de estos genes para cada una de las cepas de coleccin en la tabla No.2.

M 34 35 36 37 38 41 42 43 44 45 46 47 48 51 52 53 54

M 11 12 13 14 15 16 17 18 21 22 23 24 25 26 27 28 31

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Tabla 7.- Tipificacin del gen general cry1 y de los genes especficos cry1Aa, cry1Ab , cry1Ac y cry1F.

CCEEPPAA CCrryy11 ccrryy11AAaa ccrryy11AAbb ccrryy11AAcc ccrryy11FF

HHDD3377 - - - + + HHDD555511 + - - - +/- HHDD99 - - - - + HHDD2299 - - - - - HHDD113333 - - + - - HHDD2255 - - - - - GGMM77 + - - + + GGMM1100 - - + - + Se observo la presencia de una banda de tamao mayor al esperado para el caso especifico de la muestra 52 o la determinacin del gen cry1F en la cepa HD551, esto posiblemente debido a la presencia de una amplificacin inespecfica para otro gen e inclusive pudiese ser debido a la presencia de un nuevo gen. Para ello se recomienda clonar y secuenciar la banda amplificada para poder compararla en la base de datos del genBank y poder deducir cual de los 2 casos seria la respuesta. Genes Cry en las cepas aisladas. Fue necesario simplificar las claves de las cepas para un manejo ms sencillo. Las claves utilizadas estaban conformadas por la letra Bt seguida por un nmero consecutivo el cual inici del 1. En la siguiente tabla se muestran las claves utilizadas en el manejo del cepario.

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Tabla 8. Claves de clasificacin de las cepas de Bt aisladas.

Clave Inicial

Fecha aislamiento, sitio, dilucin y nmero de colonia

Clave Secundaria

091208 1B 10- 1 C-4 Bt1

091208 3A 10- 4 C-12 Bt2

121108 1B 10-2 C-5 Bt3

121108 2A 10-2 C-6 Bt4

091208 3A 10-4 C-11 Bt5

121108 4A 10-2 C-15 Bt6

121108 3B 10-1 C-13 Bt7

121108 1A 10-2 C-2 Bt8

091108 1A 10-1 C-1 Bt9

121108 2B 10-4 C-7 Bt10

091108 3A 10-2 C-9 Bt11

121108 3A 10-1 C-8 Bt12

091108 3A 10-2 C-10 Bt13

121108 4B 10-1 C-17 Bt14

121108 1B 10-1 C-3 Bt15

091108 4B 10-1 C-16 Bt16

121108 3B 10-1 C-14 Bt17

Caractersticas microscpicas. Para la obtencin de las muestras bacteriolgicas se utilizaron cultivos de 96 a 120 hrs. con la finalidad de asegurar la obtencin de un cultivos 100% esporulado. Por este motivo en algunos de los casos no se da la descripcin microscpica de las clulas vegetativas, solo se hace una descripcin de las esporas, granulaciones extracelulares o residuos celulares y la presencia del cristal. Bt1.- Cultivo con abundantes esporas. Bacilos medianos (tpicos de B.th. aunque la morfologa de la clula vegetativa tiende a ser variable, lo que si es definitivo

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caracterstico es la presencia de la espora sub-terminal de alrededor de un 30 a 40% del tamao de la clula).

Bt2.- Bacilos medianos largos, espora pequea (aproximadamente el 30% de la clula vegetativa). Abundantes cuerpos amorfos. Esporas de igual proporcin en tamao que los cuerpos amorfos.

Bt3.- Cultivo 100% esporulado. Presencia de estructuras amorfas y ovoides de un volumen aproximado del 90% del tamao de la espora.

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Bt4.- Bacilos medianos y espora central del 40-50% del tamao de la clula vegetativa.

Bt5.- Clulas medianas y anchas. Esporas de tamao del 10% de la clula vegetativa. Abundantes estructuras amorfas (PHB).

Bt6.- Clulas medianas y anchas, citoplasma granular. Abundantes esporas.

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Bt7.- Clulas cortas y anchas. Esporas grandes de alrededor del 80% del volumen de la clula vegetativa.

Bt8.- Bacilos medianos anchos con esporas de alrededor del 30% del volumen de la clula vegetativa. Sin presencia de cristales.

Bt9.- Bacilos delgados y largos. Esporas esfricas presencia de cuerpos amorfos de tamao variable.

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Bt10.- Bacilos delgados y largos con esporas de alrededor del 30% del volumen de la clula vegetativa.

Bt11.- Cultivo 100% esporulado. Esporas grandes y gruesas. Ausencia de cristales.

Bt12.- Clulas vegetativas medianas, cultivo casi al 100% esporulado. Esporas de tamao grande (aprox. El 60% de la clula vegetativa).

Bt13.- Bacilos cortos y gruesos. Esporas abundantes de alrededor del 30- 40% del volumen de la clula vegetativa y situadas al centro.

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Bt14.- Bacilos medianos gruesos con extremos rectangulares. Esporas de alrededor del 30- 40% del volumen de la clula vegetativa.

Bt15.- Bacilos delgados largos con esporas de alrededor del 20- 25% de la clula vegetativa

Bt16.- Bacilos medianos y abundante presencia de esporas

Bt17.- Bacilos medianos delgados con esporas de alrededor del 40% del volumen de las clulas vegetativas.

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Bsqueda de genes generales del grupo cry1. Se realiz la propagacin de los cultivos microbianos en caldo nutritivo. Se tomo una alcuota de 1.5 ml de cada cultivo microbiano a las 18 hrs. Se realiz la extraccin de plsmidos mediante la tcnica extraccin de plsmidos mediante lisis alcalina. El perfil de plsmidos fue visualizado en un gel de agarosa al 1%. Fueron corridos 18 carriles en donde en el carril 1 se le adiciono un micro litro de un marcador de masa molecular de ADN2c de 100 pares de bases. Del carril 2 al 18 fue visualizado el ADN de cada una de los 17 aislados. En el carril 2 se coloco la muestra Bt1, en el carril 3 se coloco la muestra Bt2 y en el resto de los carriles fueron colocados cada una de los ADNs de los aislados de manera consecutiva, hasta llegar al carril 18, donde se coloco el ADN del asilado 17.

M Bt1 Bt2 Bt3 Bt4 Bt5 Bt6 Bt7 Bt8 Bt9 Bt10 Bt11 Bt12 Bt13 Bt14 Bt15 Bt16 Bt17 Una vez obtenido el material plasmtico de cada uno de los aislados se procedi a realizar la bsqueda el conjunto de genes cry1 mediante el uso de primers Un1d y Un1r. Bioensayos de toxicidad. En la Tabla 9, se muestra la preferencia alimenticia de S. frugiperda y en la Tabla 13 se observan los resultados de mortalidad de larvas de S. frugiperda evaluadas a las diferentes concentraciones de Bt con la combinacin seleccionada (Capsul-gelatina-maz) y el control. A las tres concentraciones se logro una mortalidad mayor al 50%. Sin embargo, se recomienda trabajar con una concentracin del 10%, debido a que presenta varias ventajas como son: menor cantidad de fagoestimulante utilizado, menor cantidad de adherente, disminucin en el tiempo de secado, menor volumen y una mayor mortalidad (62.66%). Estos resultados fueron similares a los reportados por Palacios-Cortez, et al. (2004), quienes evaluaron la efectividad de formulados asperjables a base de polmeros contra gusano de la bolsa del nogal Hyphantria cunea obteniendo mortalidades del 70 al 100%, encontrando que el formulado a base de polmero-hoja de cenizo fue el ms atrayente.

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Hofte, et al., 1989 encontraron que las -endotoxinas son efectivas contra lepidpteros, lo cual corrobora estos resultados, al evaluar la toxicidad del bioinsecticida contra larvas de S. frugiperda. Tabla 9. Preferencia alimenticia de S. frugiperda.

Soportes # medio de larvasEE*

Capsul 0.89 0.14a

Capsul-gelatina 1.17 0.19a Capsul-pectina 1.40 0.20a,b Capsul-pectina-espiga 2.26 0.24b,c Capsul-pectina-maz 2.37 0.24b,c Capsul-gelatina-espiga 3.26 0.31c,d Capsul-gelatina-maz 3.71 0.31d Control 7.17 0.30e

*Letras diferentes significan diferencia significativa segn prueba de Tukey (p 0.05). Tabla 10. Efecto del soporte (Matriz)

Soportes # medio de larvasEE*

Capsul 0.89 0.14a

Capsul-gelatina 2.71 0.19b Capsul-pectina 2.01 0.14b Control 7.17 0.30c

*Letras diferentes significan diferencia significativa segn prueba de Tukey (p 0.05). Tabla 11. Efecto del fagoestimulane

Soportes # medio de larvasEE*

Con fagoestimulante 2.90 0.15b

Sin fagoestimulante 1.15 0.10a Control 7.17 0.30c

Tabla 12.Tipo de fagoestimulante

Soportes # medio de larvasEE*

Maz molido 3.04 0.21b

Espiga 2.76 0.21b Blanco 1.15 0.10a Control 7.17 0.30c

Nota. Las letras de los superndices indican el subgrupo al que pertenecen

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Tabla 13. Determinacin de la actividad txica de microencapsulados de Bt contra S. frugiperda a nivel de laboratorio.

Microencapsulado Bt

Promedio de Mortalidad de larvas (%)

Concentracin 7% (100 g/mL) 57.33 Concentracin 7% (100 g/mL) 53.33 Concentracin 10% (100 g/mL) 62.66 Control 0.0

Como se observa en la tabla con los tres formulados se logra una mortalidad mayor al 50 %. Sin embargo, se recomienda trabajar con una concentracin de 10 % debido a que presenta varias ventajas como son: menor cantidad de fagoestimulante utilizado, menor cantidad de adherente, disminucin en el tiempo de secado, menor volumen y una mayor mortalidad. Hofte, et al., 1989 encontraron que las -endotoxinas son efectivas contra lepidpteros, igual a los que se utilizaron en este experimento (S. frugiperda, son lepidpteros). Los polmeros con fagoestimulantes y sin fagoestimulantes mostraron una diferencia significativa La mezcla Capsul-gelatina-maz molido es la formulacin que se utilizar junto con el ingrediente activo de Bacillus thuringiensis en la formulacin de bioinsecticida asperjable.

IMPACTO El uso de la bacteria Bacillus thuringiensis es una herramienta importante no solo para el control de larvas de gusano cogollero, sino tambin en la supresin del complejo de lepidpteros defoliadores en hortalizas. Este mtodo de control biolgico de insectos no interfiere con otros enemigos naturales de la palomilla, como depredadores, parasitoides y otros patgenos de insectos, que generen un efecto adicional de control. Adems si se trata de cepas nativas de la regin, como es el caso en este estudio, se cuenta con cepas adaptadas al ambiente que pudieran ser ms txicas contra las plagas del sitio de estudio, se contribuye con el control biolgico en Mxico.