1. Objetivos:

Separar compuestos qumicos de mezclas binarias, ternarias o de mltiples sustancias por medio de distintas tcnicas cromatogrficas. Elegir correctamente el disolvente o mezcla de disolventes adecuados para realizar una cromatografa. Separar componentes por medio de cromatografa de mezclas coloreadas y no coloreadas. Aprender a realizar una cromatografa en capa delgada de muestras coloreadas y reconocer su utilidad. Realizar correctamente una cromatografa en capa delgada de muestras incoloras y aprender los mtodos para el revelado de las placas cromatogrficas obtenidas. Realizar correctamente un proceso de cromatografa en columna, incluyendo su montaje y ejecucin.

2. Marco terico:

En general, la cromatografa se basa en la distribucin de un compuesto en una serie de dos fases: una lquida y otra mvil. Esto quiere decir que la cromatografa se puede ver como la remocin selectiva de un compuesto (o una mezcla de los mismos) de inters por accin de una fase mvil (compuesta por uno o varios disolventes), de una fase estacionaria en donde se encuentra la mezcla. La cromatografa se puede emplear tanto para analizar la pureza de algunas sustancias, como para separarlas de una mezcla de compuestos en donde se encuentran e identificar las que estn presentes, comparndolas con otras sustancias conocidas.

Existen muchos tipos de cromatografa. Entre ellos estn:

Cromatografa de adsorcin. Cromatografa de particin. Cromatografa de filtracin con geles. Cromatografa de intercambio inico.

Entre los anteriores tipos de cromatografa, el tipo de cromatografa que se realiz en las sesiones de laboratorio fue la cromatografa de adsorcin. Adems, dependiendo de la naturaleza de la fase estacionaria y de la fase mvil se pueden distinguir distintos tipos de cromatografa:

Cromatografa slido-lquido. La fase estacionaria es un slido y la mvil un lquido. Cromatografa lquido-lquido. La fase estacionaria es un lquido anclado a un soporte slido. Cromatografa lquido-gas. La fase estacionaria es un lquido no voltil impregnado en un slido y la fase mvil es un gas. Cromatografa slido-gas. La fase estacionaria es un slido y la mvil un gas.En general, antes de describir el fundamento terico de cada cromatografa empleada en las sesiones de laboratorio, es conveniente definir al trmino Rf. De tal forma el Rf o ndice de retencin se define como se da en la ecuacin (1):

A continuacin (secciones 2.1, 2.2 y 2,3) , se describe brevemente cada tipo de cromatografa usada en el laboratorio [1].

Generalidades sobre la cromatografa en capa delgada (CCD) de muestras coloreadas: La cromatografa en capa delgada (CCD) es una forma de cromatografa de adsorcin slido-lquido que constituye una tcnica importante en Qumica Orgnica para el anlisis rpido de muestras que en algunos casos puede estar en el rango de los 10-9 g. Frecuentemente se usa para el seguimiento de la evolucin del progreso de una reaccin, o para el control y seguimiento de las separaciones que se producen mediante una cromatografa en columna preparativa. Para realizar el anlisis de una muestra por CCF se utiliza un adsorbente slido como gel de slice (SiO2. H2O) o almina (Al2O3), unido a una placa rectangular de de vidrio o plstico. El adsorbente sirve de fase estacionaria. La muestra se aplica en disolucin con un capilar de vidrio en un extremo de la placa, pero no sobre el mismo borde. A continuacin se introduce la placa en un tanque cerrado conteniendo un disolvente o mezcla de disolventes (fase mvil), de manera que la placa quede apoyada sobre el fondo y el punto con la muestra, por encima del nivel del lquido. El tanque contiene una atmsfera saturada en el disolvente para lo cual se introduce un trozo de papel de filtro que debe. La fase mvil asciende por capilaridad, de forma que se produce el mayor o menor avance de los componentes de de la mezcla, segn su polaridad.

Generalidades sobre la cromatografa en capa delgada (CCD) de muestras sin colorear: El fundamento terico para la cromatografa en capa delgada de muestras incoloras es el mismo que para muestras sin colorear. Sin embargo, como las manchas despus del proceso no son visibles, se debe recurrir al uso de agentes reveladores. Los agentes reveladores son sustancias qumicas o acciones fsicas que permiten conocer las variaciones de color en un cromatograma, que a simple vista seran indistinguibles. Los agentes reveladores se clasifican en:

Acciones fsicas Acciones qumicas

Algunos ejemplos de agentes reveladores, se encuentran reactivos como cloruro de aluminio, para flavonoides; o-Aminofenol - cido fosfrico, para azcares, entre otros.

Generalidades sobre la cromatografa en columna: Lacromatografa en columna es quizsel mtodo ms general, utilizado para la separacin, a la vez que para la purificacin, de diferentes compuestos orgnicos que se encuentren en estado slido o lquido.En este tipo de cromatografa, la fase estacionaria utilizada, es decir, elabsorbente, se coloca en el interior de una columna de vidrio, la cual finaliza con una llave para controlar el paso de sustancias al exterior de la columna. La fase estacionaria se impregna con el eluyente o fase mvil. Seguidamente la mezcla orgnica que nos interesa separar la depositamos por la parte superior de la fase estacionaria, y as la fase mvil podr ir atravesando el sistema.Los compuestos que se encuentran disueltos en lafase mvil, poco a poco saldrn de la columna cromatogrfica, y se recogen en fracciones. Las fracciones menos polares, que son por lo general las que se retienen poco o nada en el absorbente, sern las primeras en salir de la columna. Encambio, las sustancias ms polares, quedan retenidas por ms tiempo en el absorbente, y a menudo es necesario el uso de diferentes disolventes con la finalidad de incrementar su polaridad para que sean arrastradas por estos. El disolvente ideal para esta cromatografa, se elige de acuerdo al que haya funcionado haciendo la cromatografa en capa delgada. Los absorbentes ms utilizados son la almina y la slica gel, consiguindose de varios tipos en el mercado. Cuanto menor sea el tamao de partcula del absorbente, mejor ser la separacin de las sustancias

3. Parte experimental.

Materiales y reactivos. Para realizar las cromatografas de capa delgada para componentes coloreados y no coloreados, se emplearon los siguientes materiales:

Placas cubiertas con slica gel. Mezclas a separar, coloreadas y no coloreadas. Frascos mbar con tapa. Papel filtro. Cmara de luz UV (necesaria para la cromatografa de sistemas no coloreados). Cmara de yodo (necesaria para la cromatografa de sistemas no coloreados). Disolventes: Acetato de isopropilo. Metil etil cetona. Tolueno. ter de petrleo. Metanol. Etanol 96%.

Cromatografa en columna.

Materiales y reactivos: Para poder efectuar la cromatografa en columna, se requiri de los siguientes materiales y reactivos: Bureta de 50 mL (usada como columna cromatogrfica). Soporte universal. Pinzas. Mezcla a separar. Agitador de goma. Silica. Algodn. Agitador de vidrio. Micro esptula. Vasos de precipitados Frascos con tapa Disolventes usados en la cromatografa en columna: Acetato de isopropilo. Metil etil cetona. ter de petrleo.

Procedimiento experimental. Para realizar la cromatografa en columna, se siguieron ordenadamente los pasos descritos a continuacin:

1. Se coloc la bureta firmemente sujeta al soporte universal con ayuda de las pinzas.2. Con ayuda de una varilla metlica, se dispuso una motita de algodn al fondo de la bureta y por encima de la llave de paso de la misma. 3. Se calcul la cantidad de slica gel necesario para el proceso. Despus, se prepar una solucin saturada de slice y el disolvente menos polar de la mezcla de disolventes y se agreg rpidamente, teniendo cuidado de agitar vigorosamente con un agitador de goma, para evitar que quedaran adentro de la columna burbujas de aire, que impidieran la correcta separacin de los componentes de la mezcla.4. Se vertieron pequeas cantidades del disolvente menos polar, de tal forma que se permiti la salida del mismo de la bureta, atravesando el algodn.5. Cuando la slica gel se solidific, se agreg aproximadamente 1cm3 del disolvente menos polar y sobre esta capa de disolvente se dispuso unos pocos mililitros de la mezcla a separar.6. Sobre la mezcla a separar, se puso una pequea bola de algodn y se comenz a verter la mezcla de disolventes apropiada para la separacin, que fueron los mismos que se establecieron para las CCD anteriormente descritas.7. Se abri la llave de paso de la bureta y comenzar a recolectar cabeza, cuerpo y cola de cada compuesto siendo la fraccin del cuerpo la porcin de la mezcla de nuestro inters.8. Despus de haberse colectado las fracciones de inters, se concentraron estas fracciones (en rotavapor o simplemente sometiendo a calentamiento la muestra).9. Despus de haber concentrado las muestras, se realiz CCD para las dos fracciones que se consideraron ms puras. Se determinaron sus Rf.10. Se compararon las muestras con las sustancias patrn, realizando CCD con dos muestras y analizando si correspondan o no a dichos patrones.11. Por ltimo, se dio el nombre de los compuestos identificados en la muestra problema.

Conclusiones: Las mezclas de disolventes ms efectivas son aquellas compuestas por uno de los disolventes ms polares y uno de los menos polares, cuando se trata de separar compuestos de polaridad intermedia. La cromatografa es una de las tcnicas ms efectivas para la separacin de compuestos, mezclados homogneamente. La cromatografa es uno de los procesos ms seguros para la identificacin de compuestos. Pero este criterio es relativo puesto que si una sustancia al someterla al proceso cromatogrfico y si en la placa cromatogrfica quedan dos o ms manchas, se trata de una mezcla de compuestos. En cambio, si una sustancia despus de someterla a un proceso cromatogrfico, en la placa queda tan solo una mancha, no se puede concluir que se trata de una nica sustancia pura. Los resultados arrojados por CCD con placas activadas varan considerablemente en comparacin con los resultados arrojados por CCD con placas sin activar y no se puede asegurar antes de la cromatografa qu tipo de placas son las que darn una mejor separacin o una mejor resolucin. Las siembras de la mezcla a separar deben hacerse con el nmero de contactos adecuado, para poder obtener una correcta elusin de los compuestos y no se arruine el proceso cromatografa por exceso de concentracin de los mismos. La cromatografa en columna nos permite separar compuestos y si se lleva a cabo el proceso correctamente (eligiendo la fase mvil adecuada), con un elevado grado de pureza, los cuales son recolectados en las fracciones llamadas cuerpos.

COMENTARIO: Los diferentes tipos de cromatografa son usados para separar sustancias orgnicas, aminocidos, entre molculas con actividad biolgica

14. Cmo se aplica la muestra en la placa para CCP?.La aplicacin de la muestra en la placa para cromatografa preparativa puede realizarse manualmente o con un aparato automtico. Con uno de estos aparatos se obtienen mejores separaciones porque la muestra se aplica homogneamente, mientras que cuando la operacin se efecta con la mano, se producen zonas circulares que impiden un avance homogneo de la fase mvil. En la aplicacin de la muestra es conveniente tener en cuenta que no se debe emplear todo el ancho de la placa porque en los bordes la fase mvil tiende a migrar ms rpidamente, con lo cual se producen bandas cncavas no deseables en la separacin. Se sugiere dejar un margen de por lo menos 0,25cm, tanto a la izquierda como a la derecha de la placa.Torres S.; Introduccin a la cromatografa; Editorial Universidad Nacional; 1994; Bogot, Colombia.

15. Para qu se recomienda disponer un papel filtro con un extremo sumergido en la fase mvil, dentro de la cmara de desarrollo cromatogrfico de la CCP?

Es recomendable que las paredes de la cmara cromatografica tengan papel de filtro, y que este est un poco sumergido en el solvente esto con el fin de lograr la mayor saturacin de la cmara cromatografica sea la mayor posible antes de comenzar el proceso.16. Explique mediante un esquema como se controla la elusin en una CC mediante CCd en fase normal (silica gel). Haga un paralelo o comparacin con el resultado esperado en el control hecho por CCD en fase reversa En la fase inversa la fase fija solida es generalmente de partculas de gel-slice, a las que se han injertado cadenas C18H37 O C8 H17. A diferencia de la cromatografa en fase normal, las partculas forman una fase lipofila que retiene las molculas poco polares. En fase reversa, los componentes ms polares son eluidos preferentemente y los menos polares se eluyen en ltimo lugar.