informe de practicas

INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL

ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLÓGICAS

SECCIÓN DE ESTUDIOS DE POSGRADO E INVESTIGACIÓN

PROGRAMA DE BIOMEDICINA Y BIOTECNOLOGÍA MOLECULAR

DEPARTAMENTO DE MORFOLOGÍA

INFORME DE PRÁCTICAS

IBQ. HERNÁNDEZ MARÍN, MIGUEL ANGEL

MATERIA: “CULTIVO DE CÉLULAS Y TEJIDOS (ANIMALES)”

PROFESORA: BIÓL. MARÍA LUISA VEGA BARRITA (LABORATORIO DE CITOPATOLOGÍA AMBIENTAL)

FECHA DE ENTREGA: LUNES 26 DE SEPTIEMBRE DEL 2011

INFORME DE PRÁCTICAS

1. Introducción

1.1 Cultivo de células 1

El cultivo de células se considera como la adaptación y proliferación de células dispersas tomadas de un tejido original, de un cultivo primario o de líneas celulares, por mecanismos enzimáticos o disgregación química y que serán capaces de crecer en suspensión en un medio líquido o como una monocapa adherente sobre un sustrato. Para el mantenimiento de un cultivo celular se requiere de subcultivos (también llamados pases), por lo que se requiere de la dispersión por tratamiento enzimático de células (tripsinización) en un cultivo que presentan una confluencia del 100% (o monocapa) cuando crecen sobre un substrato, o un crecimiento significativo cuando están en suspensión, requiriendo el cambio a una botella de cultivo nueva en ambos casos.

1.2 Condiciones requeridas para el cultivo de células 1

El crecimiento de células in vitro requiere lo siguiente:

1) Substrato. La naturaleza del substrato o fase sobre la cual crecen las células, puede ser sólido como en el crecimiento de una monocapa sobre plástico, semisólido como la colágena o agar y líquido como en el cultivo en suspensiones.

2) Fase gaseosa. Los constituyentes significativos de la fase gaseosa son el oxigeno y el bióxido de carbono, los cultivos varían en sus requerimientos en base al tipo celular o al tipo de cultivo como pueden ser de tejidos, órganos o de células.

3) pH. La mayoría de las células crecen bien a pH 7.4, aunque el pH óptimo varia relativamente entre las diferentes líneas celulares. Para realizar una valoración subjetiva del pH mediante el color se usa comúnmente el rojo de fenol como indicador (Figura 1), así el medio es rojo a pH 7.4, naranja a pH 7.0, amarillo a pH 6.5, ligeramente rojizo a pH 7.6 y púrpura a 7.8.

Figura 1. Estructura química del Rojo de fenol.

4) Temperatura. La temperatura óptima del cultivo de células depende de: a) La temperatura del cuerpo del animal del cuál se obtuvieron las células. b) La incorporación de un factor de seguridad que permita minimizar los errores en la

incubación. c) La temperatura recomendada para la mayoría de las células humanas y líneas

celulares derivadas de animales de sangre caliente es de 36.5 °C.

5) Medios de cultivo. Son una mezcla de sales inorgánicas y otros nutrientes capaces de ayudar a la célula a que sobreviva in vitro por 24 horas o más, uno de los medios más sencillo es el medio mínimo esencial (MEM) el cual contiene aminoácidos esenciales, vitaminas y sales, otros medios se diferencian por contener además de aminoácidos y vitaminas, complementos como metabolitos extras (por ejemplo nucleosidos) y minerales.

1.3 Cultivo primario 1

El cultivo primario es el que se realiza tomando un tejido procedente de un animal vivo y que contiene varios tipos celulares. En general, se utiliza sólo disección mecánica superficial y breve, se conoce también como cultivo de tejidos, y es el procedimiento inicial que se debe seguir para obtener un cultivo de células disociadas. El manejo del concepto de cultivo primario es útil para referirse a la obtención de células procedentes de un animal vivo mediante una disección mecánica o por el uso de enzimas (Figura 2). El cultivo primario tiene 3 etapas:

1) Aislamiento del tejido de interés.

2) Disección y/o disgregación.

3) Obtención de células disociadas y siembra de las mismas en botellas de cultivo.

Figura 2. Tipos de cultivo de tejidos. Etapas

de cultivo primario.

Las enzimas más utilizadas en el cultivo primario son: tripsina, colagenasa, elastasa, hialouronidasa, DNAasas, pronasa, dispasas, solas o en combinación. Existen algunas condiciones generales para hacer un cultivo primario, los más importantes se describen a continuación:

a) La grasa y el tejido necrosado deberán ser retirados durante la disección.

b) El tejido deberá cortarse finamente (1 mm2) para evitar largos periodos de exposición a las

enzimas.

c) Las enzimas utilizadas deberán ser neutralizadas y removidas frecuentemente por

centrifugación.

d) Para la siembra deberá colocarse un número mucho más alto de células que generalmente

se coloca en una botella de cultivo, considerando que durante el proceso sobreviven pocas.

e) Deberá utilizarse un medio altamente enriquecido y complementado con suero fetal bovino y

los requerimientos que tenga cada tipo celular (hormonas, aminoácidos no esenciales,

vitaminas y proteínas específicas, etc.). Los sueros de ternera y de caballo son poco

efectivos.

f) Los tejidos embrionarios son preferidos, debido a su fácil disgregación y proliferación in vitro

a diferencia de los tejidos adultos.

El cultivo primario es útil cuando se necesita un testigo diploide. En el área de cultivo de tejidos, las células de un cultivo primario normalmente mantienen su cariotipo y es lo más parecido al comportamiento del tejido en condiciones in vivo. Sin embargo es importante no olvidar tomar en consideración lo siguiente: las células en cultivo están aisladas de las interacciones complejas con el resto de los sistemas orgánicos, se propagan en una sola dimensión, hay inicio de un incremento de proliferación y de movilidad celular, cambios en su metabolismo, generalmente las células en cultivo dependen de la glicólisis y en menor medida del ciclo de Krebs, Aun así en los últimos años organismos como la Food and Drug Administration (FDA) de los Estados Unidos de Norteamérica, ha autorizado el uso de cultivos primarios para determinar el efecto tóxico varios compuestos.

1.4 Ensayos de citotoxicidad in vitro 1,2

Las nuevas drogas, cosméticos, aditivos de alimentos y muchos compuestos más deben ser probados antes de ser liberados al público. Estas pruebas usualmente involucran un gran número de animales de experimentación así que actualmente existe presión para llevar a cabo gran parte de los ensayos de citotoxicidad en cultivos de células animales. Así la introducción de líneas celulares especializadas y el cultivo de órganos han sido una proposición razonable. La toxicidad es un evento complejo in vivo, donde hay daño directo a las células como la citotoxicidad provocada por las drogas anticancerosas, efectos fisiológicos como transporte de membrana en el riñón o neurotoxicidad en el cerebro, efectos inflamatorios tanto en el sitio de aplicación y otros sitios, y otros efectos sistemáticos. Es difícil monitorear los efectos sistemáticos y

fisiológicos in vivo, sin embargo existen muchos ensayos in vitro para determinar efectos a nivel celular o de citotoxicidad. La definición de citotoxicidad varía según la naturaleza del estudio y si las células están muertas o simplemente tienen su metabolismo alterado. Mientras un agente anticanceroso puede ser requerido para matar células, demostrar la falta de toxicidad de otros compuestos farmacéuticos puede requerir un análisis más sutil de cambios en metabolismos menores o una alteración entre célula y célula lo que puede llevar a una reacción inflamatoria o respuesta alérgica. Todos estos ensayos son sumamente simples, fáciles de cuantificar y reproducibles. La citotoxicidad celular se define como una alteración de las funciones celulares básicas que conlleva a que se produzca un daño que pueda ser detectado. A partir de aquí, diferentes autores han desarrollado baterías de pruebas in vitro para predecir los efectos tóxicos de las drogas y los compuestos químicos, utilizando como modelos experimentales cultivos primarios y órganos aislados como líneas celulares establecidas.

1.5 Ensayo de capacidad metabólica 1,2

Un ensayo de citotoxicidad depende del agente a estudiar, la naturaleza de la respuesta y las células blanco. Los ensayos de capacidad metabólica, están basados en la microtitulación usualmente, de la duración de intermediarios que pueden medir tanto una respuesta metabólica, DNA, RNA o síntesis de proteínas. El punto final de la microtitulación se refiere a la estimación del número de células sobrevivientes a una exposición de un agente a estudiar. La viabilidad celular puede medirse por la reducción del bromuro de 3 – (4,5, – dimetiazol – 2 – il) – 2,5 – bromo difeniltetrazolio (MTT) a formazan. Se ha utilizado esta técnica para el estudio de drogas anticancerosas pero puede ser aplicable a ensayos citotóxicos (Figura 3).

Figura 3. Ensayo de citotoxicidad por reducción de MTT.

2. Antecedentes

2.1 El compuesto N – (3 – hidroxi – 4 – carboxi – fenil) – maleimida

La preparación de la N – (3 – hidroxi – 4 – carboxi – fenil) – maleimida se basa en estudios realizados a partir de compuestos análogos del compuesto de Baker: ácido 4 – (yodoacetamido) – salicílico (Figura 4), el cual puede actuar como agente alquilante al sitio activo de la enzima glutamato deshidrogenasa 3,4. Se había postulado que el tejido tumoral muestra una actividad glicolítica elevada debido a la baja actividad de la glicerol fosfato deshidrogenasa y de la β – hidroxibutirato deshidrogenasa; al mismo tiempo se encuentra elavada la enzima deshidrogenasa láctica (LDH). Por lo tanto, la inhibición especifica de la DL es un posible blanco terapeútico para el tratamiento de cáncer. Se diseño y sintetizó, de acuerdo a la idea de Baker de los “antimetabolitos no clásicos”, el compuesto N – (4 – carboxi – 3 – hidroxi – fenil) maleimida. Es compuesto actúa como inhibidor irreversible de la LDH, mostrando una constante de inhibición (Ki) de 1 * 10 – 4 M 3. El oxamato (un inhibidor competitivo de la LDH protege a la enzima contra la inactivación irreversible lo que parece ser una inhibición del sitio activo. Cuando se dializa la LDH, inhibida por la maleimida, no se obtiene recuperación de la actividad enzimática, pero cuando la LDH inhibida por el oxamato, se dializa se obtiene una reactivación total 3. El tejido tumoral muestra una concentración elevada de la isoenzima M de la LDH y un inhibidor específico de esta isoenzima M podría poseer actividad antitumoral. La maleimida es este inhibidor 3. El ensayo biológico mostró los siguientes resultados: En ratas Sprangue – Dawley portadora de carcinoma mamario provocado con 7, 12 – dimetilbenzantranceno, la maleimida inhibió significativamente la aparición y desarrollo del tumor. Por otra parte no se encontró actividad contra el tumor de ascitis y el sarcoma 180 3.

Figura 4. Estructura química del compuesto de Baker y de la N – (3 – hidroxi – 4 – carboxi – fenil) – maleimida.

3. Objetivos

Llevar a cabo los procedimientos de buenas prácticas de laboratorio y cuidar de mantener

las condiciones de esterilidad en el cuarto de cultivo.

Esterilizar el material de vidrio, instrumental quirúrgico y soluciones salinas en autoclave.

Preparar y esterilizar por filtración la solución del compuesto a evaluar y los medios de

cultivo DMEM y F12 complementándoos con suero fetal bovino (SFB).

Efectuar el cultivo primario de fibroblastos de embriones de ratón, así como su

mantenimiento hasta la formación de monocapa.

Descongelar, propagar y congelar células de la línea celular HeLa.

Realizar el conteo de células del cultivo primario y de la línea celular mediante un

Hemocitómetro.

Realizar el análisis morfométrico de los fibroblastos y de las células HeLa en placas de 6

pozos frente a una serie de concentraciones del compuesto N – (3 – hidroxi – 4 – carboxi –

fenil) – maleimida, mediante tinción por la técnica de Papanicolaou.

Conocer el efecto citotóxico del compuesto N – (3 – hidroxi – 4 – carboxi – fenil) – maleimida

a diferentes concentraciones en fibroblastos de embrión de ratón y la línea celular HeLa, en

placas de 96 pozos.

4. Materiales, equipo y reactivos

4.1 Materiales

Probeta de 1L.

Matraces Erlenmeyer de 1 y 2 L.

Sistema de filtración Millipore

estéril con membrana de celulosa

de 0.2 micras.

Botella de plástico para cultivo de

células de 25 y 75 cm2.

Pipetas graduadas de 5 y 10 mL.

Pipetas Pasteur.

Bulbo de hule.

Matraz Erlenmeyer con tapón de

50 mL.

Agitadores magnéticos.

Embudos de filtración de tallo

corto con organza.

Placas de Petri chicas y

medianas.

Tijera recta.

Tijera curva.

Bisturí.

Pinza punta roma.

Pinza de diente de ratón.

Probetas de 50 y 100 mL.

Placas de siembra de 6 y 96

pozos.

Cubreobjetos redondos.

Portaobjetos.

Vasos de precipitados de 50 y

100 mL.

Frascos Gerber.

Mechero Bunsen.

Frascos de vidrio de 500 mL con

tapón de rosca.

Tubos de ensaye para centrifuga

con tapón de rosca.

Tubos tipo falcón de 15 y 50 mL.

Botellas de 500 mL para

soluciones y medio.

Puntas azules y amarillas.

Micropipetas de 100 y 1000 μL.

Tubos Eppendorf.

Hemocitómetro (Cámara de

Neubauer)

Frascos pequeños de 10 mL.

Criotubos de 2 mL.

Jeringa con aguja de 5 mL.

Filtros para esterilización.

Gasas estériles y algodón.

Papel aluminio y kraft.

Papel parafilm.

4.2 Equipo

Campana de flujo laminar.

Campana de extracción.

Autoclave.

Incubadora de CO2 (5% CO2 –

95% Aire, 37 ºC).

Microscopio de luz visible.

Microscopio invertido.

Centrífuga.

Balanza analítica.

Potenciómetro.

Pipeteros automáticos

Parrilla de agitador magnético.

Refrigerador (– 4 ºC).

Congelador (– 20 ºC).

Congelador “Revco” (– 70 ºC).

Espectrofotómetro lector de Elisa.

4.3 Material biológico

Células HeLa (Células epiteliales de cáncer cervicouterino).

Embriones extraídos de ratonas preñadas con 13 días de gestación.

4.4 Reactivos

Medio mínimo esencial por

Dubelco (DMEM – 1X).

Medio F12 de Gibco.

Glucosa.

Bicarbonato de sodio.

Solución de anestesia

Fenobarbital.

Antibiótico (Penicilina –

Estreptomicina).

Suero fetal bovino (SFB).

Solución Tripsina – Verseno

(0.05% – 0.05%).

Solución de Tripsina 0.25%.

Solución salina de fosfatos PBS

A.

Azul de tripano al 0.02%.

Solución de MTT (7 mg / mL).

Alcohol etílico absoluto.

Xileno.

Solución Xileno – Etanol absoluto.

Soluciones de alcohol etílico al

96º, 80º, 70º y 50º.

Hematoxilina.

Colorante OG – 6

Colorante EA – 50.

Hidróxido de amonio

concentrado.

Resina sintetíca.

Agua tipo I.

Agua bidestilada.

Compuesto N – (3 – hidroxi – 4 –

carboxi – fenil) – maleimida.

Isopropanol ácido (pH = 4).

5. Desarrollo experimental 1

5.1 Limpieza, esterilización del material y asepsia del área de cultivo

La preparación del material de vidrio empleado en el cultivo de células implica un protocolo de limpieza, el cual a continuación se expone en el siguiente diagrama de bloques:

Las soluciones de lavado se preparan de la siguiente forma:

Solución desinfectante – detergente: Se realiza una solución de hipoclorito de sodio a 300

ppm y detergente 7X al 2% en agua corriente.

Solución de detergente 7X: Se realiza una solución del detergente 7X al 2% en agua

corriente.

El procedimiento de esterilización del material de vidrio limpio, cajas con puntas para micropipeta, gasas, agua para la preparación de los medios y la solución de PBS, se describe en el siguiente diagrama de bloques.

Preparar la solución desinfectante - detergente y la

solución de detergente 7X.

Sumergir el material en la solución

desinfectante - detergente durante 10

minutos.

Sumergir el material en la solución de

detergente 7X durante una noche.

Enjuagar con agua corriente mínimo 4

veces.

Enjuagar con agua bidestilada en 3

cambios.

Secar al aire y posteriormente con

calor (en horno) durante 1 hora a 100

ºC.

Empaquetar el material con papel

aluminio, papel kraft, ligas y algodón

(pipetas).

Esterilizar en autoclave a una

presión de 15 lb/in2 (121 ºC) por 15

minutos .

Guardar el material esteril en una gaveta del cuarto de cultivo.

Para mantener las condiciones de asepsia del cuarto de cultivo, y así disminuir el riesgo de contaminación en los cultivos es necesario efectuar los siguientes procedimientos.

El cuarto de cultivo debe ser irradiado con luz ultravioleta antes de trabajar dentro de él.

El piso del cuarto de cultivo debe ser limpiado con una solución de germicida.

La campana de flujo laminar, así como las mesas de trabajo y demás accesorios a emplear

(gradillas, pipeteros automáticos y botellas de cultivo), deben ser limpiados con gasa estéril

y una solución de alcohol etílico al 70%.

Limpieza de la incubadora de CO2 periódicamente, así como el cambio de la solución de

sulfato de cobre que se encuentra dentro de esta.

Es también importante realizar pruebas de esterilidad del suero fetal bovino y de los medios de cultivo.

5.2 Preparación de medios de cultivo

El procedimiento para la preparación de los medios de cultivo DMEM y F12, se realiza dentro del cuarto de cultivo en la campana de flujo laminar como se describe a continuación:

Se preparan 100 mL de cada medio de cultivo y se complementa cada uno con SFB al 7%, de acuerdo con la siguiente relación:

Reactivo Volumen (mL)

Medio DMEM o F12 92 Suero fetal bovino (SFB) 7

Antibiótico (Penicilina – Estreptomicina) 1

Medir 950 mL de agua esteril en matraz Erlenmeyer con

agitador magnético.

Agregar el polvo de medio (DMEM o F12), 3.7 g de NaHCO3 y 3.5

g de glucosa.

Agitar suavemente, hasta disolución total.

Ajustar el pH con HCl concentrado entre 6.8

y 6.9.

Aforar a 1 L y esterilizar por filtración en el

sistema Millipore.

Guardar en refrigeración y realizar pruebas de esterilidad.

Durante la preparación de los medios se debe de evitar la formación de burbujas y derrame de estos. El uso de antibiótico en el medio es para mantener en condiciones de esterilidad al medio, sin embargo la concentración de este debe ser cuidadosamente considerada, ya que puede afectar la integridad mitocondrial de las células.

5.3 Prueba de esterilidad

Una vez preparado el medio complementado, se procede a realizar pruebas de esteri lidad, que consisten en depositar 3 mL de medio (complementado y sin complementar) en tubos de ensaye con tapón de rosca, incubados por 24 horas. Transcurrido el tiempo, se observa el estado del medio. Se puede permitir ocupar el medio para el cultivo de células una vez que se aprecia inocuidad en este.

5.4 Descongelación de células HeLa

Las células HeLa se descongelan de un criotubo mantenido en nitrógeno liquído, y se transfieren a un baño de agua a 37 ºC, donde se agita hasta que se descongela. Se limpia con gasa estéril y alcohol etílico y es llevado a la campana de flujo laminar. Se abre el criotubo que contiene a las células (aproximadamente 2 mL), y con ayuda de una pipeta Pasteur y bulbo se transfiere el contenido a una botella de cultivo de 75 cm2, dejando que la suspensión celular resbale por las paredes del recipiente, evitando así que las células sufran el menor daño físico. Se adiciona por la pared de la botella en 3 porciones con ayuda de una pipeta graduada 2, 4 y 8 mL de medio complementado DMEM seguido de una suave agitación por cada adición de medio. La adición del medio a la botella se realiza también por la pared del recipiente, para evitar la menor desgasificación de este. Se observa al microscopio el cultivo y se verifica la viabilidad de las células, diferenciando por morfología, a aquellas que su membrana esta integra y por lo tanto vivas de aquellas que han sufrido algún daño en su cubierta. Se incuba el cultivo a 37 ºC a una tensión de CO2 de 5% durante 4 horas. Transcurridas las 4 horas se evalúa al microscopio la viabilidad celular, y se procede a realizar un cambio de medio de cultivo por medio fresco, debido a la variación de pH neutro a alcalino (rojo – rosa intenso) provocado por la salida del citosol de las células muertas al medio. Se sigue llevando el cultivo en incubación, hasta que se obtiene el 100% de confluencia. La botella de cultivo se mantiene parcialmente abierta dentro de la incubadora para favorecer la transferencia de CO2 al medio, y así mantener el valor de pH requerido durante la incubación.

5.5 Mantenimiento y propagación de la línea celular

El mantenimiento de una línea celular que procede de un subcultivo de una línea celular, requiere un cambio periódico de medio de cultivo. El mantenimiento de las líneas celulares comprende 4 factores por lo cual es necesario realizar cambio de medio:

1) Variación de pH.

2) Concentración celular.

3) Tipo celular.

4) Morfología celular.

En este caso el mantenimiento de la línea de células HeLa de acuerdo con el catalogo de la ATCC, requiere de medio de cultivo complementado con suero fetal bovino a una concentración final de 10% (para esta práctica el complementar con SFB al 7%, las condiciones de cultivo se mantienen idóneas); tener una atmósfera de incubación con una tensión de dióxido de carbono al 5% y de aire al 95%. La temperatura óptima de incubación es de 37 ºC 5.

Figura 5. Vista en microscopio de células adherentes de tejido epitelial de cáncer cervicouterino (HeLa) (ATCC Catalog).

5.6 Subcultivo y tripsinización de la línea celular (Pase)

Una vez que se obtuvo un 100% de confluencia celular se procede a eliminar el medio de cultivo de la botella de incubación, decantando el líquido por la pared contraria a la de la monocapa formada. Se agrega ± 2 mL de una solución de tripsina – verseno (0.05% – 0.05%) por el lado opuesto a la monocapa y se lava la monocapa con la solución enzimática. Se retira la solución enzimática con ayuda de una pipeta Pasteur, y se agrega nuevamente 2 mL de la solución de tripsina – verseno. Se incuba el cultivo a 37ºC por un periodo máximo de 10 – 15 min, observando al microscopio cada 5 minutos la evolución de la tripsinización. La solución de tripsina – verseno se neutraliza por la adición de 4 mL de medio DMEM / SFB, colocado con una pipeta graduada de 10 mL por la cara opuesta de la botella a la de la monocapa. Se golpea suavemente la botella de cultivo para recuperar el mayor número de células y transferirlas a un tubo estéril para centrifuga. La suspensión celular se centrifuga a 1000 rpm durante 10 minutos. Se retira el medio de cultivo sobrenadante por decantación o con ayuda de pipeta Pasteur, y se adiciona 4 mL de medio DMEM complementado fresco. El paquete celular se resuspende con ayuda de una pipeta de 5 mL, y la suspensión obtenida se reparte en 2 botellas de cultivo de 75 cm2 dejando caer el líquido por las paredes de esta.

5.7 Congelación celular

Se requiere preparar 10 mL medio de cultivo complementado con SFB al 15% para la congelación de las células:

Reactivo Volumen (mL)

Medio DMEM 8.4 Suero fetal bovino (SFB) 1.5

Antibiótico (Penicilina – Estreptomicina) 0.1

La congelación celular se realiza tripsinizando la monocapa formada en la botella de cultivo, hasta observar al microscopio disgregación celular. Se neutraliza la tripsina con 3 mL de medio DMEM complementado al 15%. Con ayuda de la pipeta de 5 mL, se homogeniza la suspensión celular, y se transfiere a un tubo estéril para centrifuga. Se centrifuga a 800 rpm por 10 min. Se elimina el sobrenadante por decantación. El botón celular formado es resuspendido y homogenizado en 1.7 mL de medio DMEM / SFB al 15%, y se coloca en hielo (– 4 ºC) por un periodo de 30 minutos, homogenizando la suspensión suavemente cada 5 minutos para evitar la formación de cristales grandes que puedan dañar las células. Transcurrido el tiempo de incubación, se adiciona 127.5 μL de DMSO (dimetilsulfóxido) a una concentración final de 7.5%. La solución celular es homogenizada con una pipeta de 5 mL y transportada a los criotubos estériles necesarios (previamente etiquetados). El criotubo es llevado en baño de hielo al congelador revco (– 70 ºC). Los criotubos son mantenidos en congelación durante 3 días, y posteriormente almacenados en tanque de nitrógeno

5.8 Cultivo primario

El cultivo primario de fibroblastos de ratón se realiza en las más estrictas condiciones de asepsia, de acuerdo al siguiente diagrama de bloques:

Anestesiar con una solución de

Fenobarbital a las ratonas preñadas.

Llevar al animal a la campana de

extracción provista de un mechero Bunsen.

Limpiar el área de disección con una

solución de etanol al 70%.

Disecar el útero haciendo un corte a

nivel de la línea media del abdomen.

Lavar el útero en 2 cajas de petri con la

solución de PBS y antibiótico.

En la campana de flujo laminar extraer los embriones con las

tijeras rectas.

Los embriones se colocan en una caja petri con Tripsina al 0.25%, y se cortan.

Los fragmentos se transfieren a un

matraz de 50 mL y agitador magnético.

La solución se agita durante 15 minutos a

150 rpm

Se adiciona al matraz un volumen igual de

medio de cultivo DMEM - F12 comp.

La solución se filtra en tubos de centrifuga

con ayuda de embudos con organza.

Los tubos se centrifugan a 1000

rpm durante 10 minutos.

El sobrenadante se separa del botón

celular con ayuda de pipeta Pasteur.

El botón celular se resuspende en 4 mL

de medio DMEM - F12 comp.

Los fibroblastos son sembrados en una

botella de cultivo de 25 cm2 en incubación

La siembra de fibroblastos se efectúa a alta densidad considerando que existe una etapa de adaptación de ellos a las nuevas condiciones, y que mueren alrededor de un 25%. Se llevan las condiciones de incubación para los fibroblastos de embrión de ratón a 37 ºC y con una tensión de CO2 del 5% y 95% de aire. El medio que se emplea para detener la acción de la Tripsina en la disgregación del tejido y el mantenimiento de los fibroblastos es la mezcla de los medios F12 y DMEM (ambos complementados) al 50 % cada uno. La incubación de los fibroblastos se lleva hasta la formación de una monopaca sobre la superficie de la botella de cultivo (Figura 6) para llevar a cabo el conteo de células y poder realizar la técnica de Papanicolaou junto con los ensayos de citotoxicidad.

Figura 6. Fibroblastos de embrión de ratón, adheridos a la superficie de la botella de cultivo.

5.9 Cuenta celular

La cuenta celular de las células HeLa o de los fibroblastos, se realiza mediante observación de la Cámara de Neubauer al microscopio. Se emplea azul de tripano (Figura 7) para determinar la viabilidad celular por exclusión de colorante, ya que las células vivas son impermeables a este, mientras que las muertas son teñidas (ruptura de membrana) 6.

Figura 7. Estructura química de Azul de tripano.

Se toma una alícuota de 10 μL de la suspensión celular (HeLa o de fibroblastos) en un tubo Eppendorf con 90 μL de azul de tripano. La solución es resuspendida y homogenizada de forma suave. Se carga la micropipeta con 30 μL (2 veces) y se coloca la solución en la cuadricula del Hemocitómetro (Cámara de Neubauer). Se realiza el conteo de número de células (tomando en cuenta solo las células encontradas en las 4 esquinas de la cuadricula, y se calcula el promedio. La concentración celular (número de células por mililitro) se calcula mediante la siguiente ecuación:

Donde: C = Concentración de células = [Nº Células / mL] n = Promedio de células contadas en los 4 cuadrantes de las esquinas. F.D. = Factor de dilución = 10 (10 μL de suspensión celular en 90 μL de azul de tripano). Factor de cámara = 10,000. Conocida la cantidad de células viables por unidad de volumen, se procede a realizar el cultivo de estas en una microplaca de 6 pozos para la técnica de Papanicoloaou y en placa de 96 pozos para el ensayo de capacidad metabólica.

5.10 Análisis Morfométrico de fibroblastos y de las células HeLa (Tinción de

Papanicoloaou)

En 2 placas de 6 pozos provistas de cubreobjetos redondos, se siembran 1*10 6 células por pozo de fibroblastos o de la línea HeLa, y se incuban a 37 ºC hasta la formación de monocapa sobre el cubreobjeto. Se prepara una solución de 10.6 mM del compuesto N – (3 – acetoxi – 4 – carboxi – fenil) – maleimida en agua tipo I y medio complementado (Depende el medio complementado, si el ensayo es sobre fibroblastos o células HeLa). La solución del compuesto es esterilizada por filtración. Se realiza una serie de 6 diluciones en frascos pequeños de 10 mL a partir de la solución madre del compuesto a evaluar con medio de cultivo a una relación 1:2 consecutiva. Teniendo la confluencia deseada de las células sembradas sobre los cubreobjetos, se retira de cada pozo el medio adicionado inicialmente. Para el pozo testigo se recambia el medio por medio fresco. Las células adheridas en los otros pozos son expuestas a las 6 diferentes concentraciones del compuesto. Las placas son de nuevo incubadas a 37 ºC y 5% de CO2 durante 24 horas. Testigo Conc. I Conc. II

Conc.III Conc. IV Conc. V

Conc. VI

Pozo Células HeLa o

Fibroblastos de ratón

Concentración de la N – (3 – acetoxi – 4 – carboxi – fenil) – maleimida en Medio

DMEM / SFB o DMEM – F12 / SFB (mM)

Testigo + - Concentración I + 10.6 Concentración II + 5.3 Concentración III + 2.65 Concentración IV + 1.325 Concentración V + 0.6625 Concentración VI + 0.33125

Transcurrido el periodo de exposición, se retira totalmente de cada pozo el medio de cultivo y se recambia por etanol del 96º. Las células son fijadas en el alcohol por aproximadamente 3 días.

Las laminillas fijadas se tiñen, en la misma placa, mediante la técnica de Papanicoloaou como a continuación se describe en el siguiente diagrama de bloques.

Los cubreobjetos teñidos se montan con resina sintética en portaobjetos previamente desengrasados con etanol del 96º. Se espera sequen las muestras durante algunos días, para su posterior observación al microscopio de fluorescencia y la toma de imágenes digitales.

Alcohol 96º

1 minuto

Alcohol 80º

1 minuto

Alcohol 70º

1 minuto

Alcohol 50º

1 minuto

Agua destilada

3 minutos

Tinción con Hematoxilina

4 minutos

Lavado rápido con agua corriente

Agua amoniacal

Hasta el vire de color

Lavado rápido con agua destilada

Alcohol 50º

1 minuto

Alcohol 70º

1 minuto

Alcohol 80º

1 minuto

Alcohol 96º

1 minuto

Tinción con OG - 6

4 minutos

Lavado rápido con alcohol del

96º

Tinción con EA - 50

3 minutos

Lavado rápido con alcohol del

96º

Alcohol absoluto

5 minutos

Alcohol absoluto - Xilol

10 minutos

Xilol

10 minutos

5.11 Exposición de células HeLa y fibroblastos al compuesto N – (3 – acetoxi – 4 –

carboxi – fenil) – maleimida

En una placa de 96 pozos, se siembran 10,000 células por pozo de fibroblastos o de la línea HeLa, y se incuban a 37 ºC por 24 horas.

Se prepara una solución de 10.6 mM del compuesto N – (3 – acetoxi – 4 – carboxi – fenil) – maleimida en agua tipo I y medio complementado (Depende el medio complementado, si el ensayo es sobre fibroblastos o células HeLa). La solución del compuesto es esterilizada por filtración. Se realiza una serie de 6 diluciones en frascos pequeños de 10 mL a partir de la solución madre del compuesto a evaluar con medio de cultivo a una relación 1:2 consecutiva.

Transcurrido el periodo de incubación, se retira de cada pozo el medio adicionado inicialmente y se recambia por medio fresco en las columnas correspondientes al blanco y al testigo, en las siguientes 6 columnas se adiciona las diluciones correspondientes de medio con el compuesto a evaluar. La placa es de nuevo incubada a 37 ºC y 5% de CO2 durante 24 horas. Se coloca por cuadriplicado un blanco, un testigo, y 6 concentraciones conocidas del compuesto del cual se determinara su citotoxicidad.

Blanco Testigo Conc. I

10.6 mM

Conc. II 5.3 mM

Conc. III 2.65 mM

Conc. IV 1.325 mM

Conc. V 0.6625

mM

Conc. VI 0.33125

mM

Pozo Células HeLa o

Fibroblastos de ratón

Concentración de la N – (3 – acetoxi – 4 – carboxi – fenil) – maleimida en Medio

DMEM / SFB o DMEM – F12 / SFB (mM)

Blanco + - Testigo + -

Concentración I + 10.6 Concentración II + 5.3 Concentración III + 2.65 Concentración IV + 1.325 Concentración V + 0.6625 Concentración VI + 0.33125

5.12 Ensayo de citotoxicidad por capacidad metabólica (Método de MTT)

El ensayo de citotoxicidad, se realizó por un método de viabilidad celular mediante la reducción de una sal de tetrazolio (MTT). Se puede estimar el número de células sobrevivientes a una exposición de un agente o compuesto a estudiar. La viabilidad celular puede medirse a partir de la reducción de 3 – (4,5, – dimetiazol – 2 – il) – 2,5 – bromo difeniltetrazolio a formazan. El MTT es un colorante de tetrazolio de color amarillo soluble en agua, que es reducido por células vivas pero no por muertas. Las células forman un producto de formazan de color púrpura que es insoluble en agua (Figura 8) 7.

N

SN

N

NN

+N

S

N

N

NH

N

Reductasa mitocondrial

Br-

NADH + H+ NAD+

Lactato deshidrogenasa

O

O-

O

O

O-

OH

Piruvato L - lactato

3-(4,5,-dimetiazol-2-il)-2,5- bromo difeniltetrazolio (MTT)

Formazan (sal reducida de MTT)

Figura 8. Reacción de reducción del MTT a Formazan.

Se ha utilizado esta técnica para el estudio de drogas anticancerosas pero puede ser aplicable a ensayos citotóxicos. En el desarrollo de la práctica, se empleo el método de la sal de MTT para evaluar la viabilidad de las células HeLa y de los fibroblastos. Se retira de los pozos el medio con el compuesto con las cuales fueron incubadas las células, y se recambia por una solución de MTT en una concentración de 100 μg / mL en medio DMEM / SFB o DMEM – F12 / SFB (dependiendo si el ensayo es con los fibroblastos o con las células HeLa), a excepción del blanco que solo es cambiado por medio fresco. La solución de MTT se prepara con 50 μL de una solución inicial de 7 mg / mL en 3.45 mL de medio complementado. Se deja en incubación por 4 horas a 37 ºC. Después de este periodo de incubación se retira el medio del blanco y el medio con MTT de los pozos del testigo y de las 6 concentraciones del compuesto N – (3 – acetoxi – 4 – carboxi – fenil) – maleimida. Se adiciona a cada pozo un volumen de 100 μL de isopropanol ácido (pH = 4), y se pone a agitación a 100 rpm por un periodo de 15 minutos. La microplaca es leída por un lector de Elisa a 595 y 630 nm mediante el software Gen5™ para análisis de datos, en donde es necesario seleccionar la longitud de onda requerida de acuerdo al filtro que emplee el instrumento 8.

Los datos obtenidos son tratados estadísticamente en hoja de cálculo de Microsoft Office Excel.

6. Resultados experimentales y cálculos

6.1 Cuenta celular

La cuenta celular de los cultivos se realiza cuando en la botella de cultivo se observa una alta confluencia (aproximadamente 100%). Se realiza el conteo de número de células por el método de viabilidad por exclusión de colorante (azul de tripano) en el Hemocitómetro, tomando en cuenta solo las células encontradas en las 4 esquinas de la cuadricula, y se calcula el promedio.

Conteo de células HeLa

23 21

24 27

El promedio de células HeLa no teñidas encontradas en la cámara de Neubauer es de 23.75. La concentración celular se calcula como:

Donde: C = Concentración de células = [Nº Células / mL] n = Promedio de células contadas. F.D. = Factor de dilución = 10 (10 μL de suspensión celular en 90 μL de azul de tripano). Factor de cámara = 10,000.

Conociendo que la concentración celular es de 2,375,000 células / mL, se procedió a diluir 150 μL de la suspensión celular obtenida en 3.25 mL de medio DMEM / SFB (3.4 mL de solución celular total) para poder llenar los 32 pozos de la microplaca con 10,000 células (100 μL) cada uno. Para la siembra de células HeLa en la placa de 6 pozos se diluyó 2.95 mL de la suspensión celular en 11.05 mL de medio DMEM complementado, para poder sembrar 1*10 6 células por pozo en 2 mL.

Conteo de fibroblastos

Este experimento se realizó en 2 ocasiones, por ello se tiene dos conteos y por lo tanto dos ensayos de citotoxicidad.

28 25

26 23

4 2

3 3

El promedio de fibroblastos no teñidos encontrados en la cámara de Neubauer en una ocasión es de 25 y en otra de 3. En el segundo ensayo solo se realizó la prueba de viabilidad por MTT. Se procedió a calcular la concentración celular de ambos conteos:

Para la concentración de 2,550,000 células se procedió diluir 133 μL de la suspensión celular obtenida en 3.27 mL de medio DMEM – F12 / SFB (3.4 mL de solución celular) para poder llenar los 32 pozos de la microplaca, por lo tanto en cada pozo se tenían aproximadamente 10,000 fibroblastos. Para la siembra de fibroblastos en la placa de 6 pozos se diluyó 2.75 mL de la suspensión celular en 11.25 mL de medio DMEM – F12 complementado, para poder sembrar 1*10 6 células por pozo en 2 mL. Para el segundo ensayo de MTT para los fibroblastos, se sembraron cerca de 8,823 fibroblastos por pozo.

6.2 Ensayo de citotoxicidad – Método de MTT

La exposición de las células HeLa y de los fibroblastos al compuesto N – (3 – acetoxi – 4 – carboxi – fenil) – maleimida se realizó cuando en cada pozo existía un porciento de confluencia entre el 50 y 60%. Las lecturas en el lector de Elisa para ambos tipos de células se realizaron a 595 y 630 nm. Los datos obtenidos por el espectrofotómetro lector de Elisa a 595 nm fueron los siguientes:

Absorbancia 595 nm (Fibroblastos)

Blanco Testigo

Concentración de la N – (3 – acetoxi – 4 – carboxi – fenil) – maleimida (mM)

10.6 5.3 2.65 1.325 0.6625 0.33125

0.278 0.640 0.300 0.459 0.462 0.511 0.565 0.651

0.164 0.485 0.323 0.414 0.494 0.532 0.545 0.621

0.128 0.456 0.420 0.448 0.497 0.515 0.534 0.617

0.169 0.483 0.406 0.454 0.482 0.564 0.648 0.561

Promedio de lectura de Absorbancia 595 nm

0.154 0.475 0.383 0.444 0.484 0.531 0.573 0.613

Coeficiente de variación de lectura de Absorbancia 595 nm

14.55627 3.41223 13.68953 4.58293 3.28318 4.54623 9.00880 6.12843

Absorbancia 595 nm (Células HeLa)

Blanco Testigo


10.6 5.3 2.65 1.325 0.6625 0.33125

0.042 0.733 0.516 0.548 0.655 0.608 0.674 0.699

0.040 0.602 0.452 0.646 0.665 0.653 0.766 0.699

0.041 0.726 0.476 0.715 0.665 0.632 0.659 0.829

0.037 0.743 0.475 0.573 0.684 0.702 0.717 0.678


0.040 0.701 0.480 0.589 0.667 0.649 0.704 0.726


5.40062 9.46757 5.54203 8.64542 1.81655 6.16233 6.83099 9.53000

Los datos obtenidos por el espectrofotómetro lector de Elisa a 630 nm fueron los siguientes:

Absorbancia 630 nm (Fibroblastos)

Blanco Testigo


10.6 5.3 2.65 1.325 0.6625 0.33125

0.265 0.322 0.179 0.260 0.273 0.279 0.295 0.354

0.156 0.268 0.205 0.238 0.276 0.287 0.295 0.334

0.122 0.254 0.229 0.255 0.269 0.268 0.289 0.315

0.161 0.264 0.230 0.253 0.253 0.298 0.340 0.290


0.146 0.262 0.221 0.252 0.268 0.283 0.305 0.323


14.50186 2.75233 6.39484 3.76511 3.82554 4.47895 7.76689 8.44336

Absorbancia 630 nm (Células HeLa)

Blanco Testigo


10.6 5.3 2.65 1.325 0.6625 0.33125

0.042 0.427 0.300 0.304 0.339 0.320 0.346 0.354

0.040 0.319 0.258 0.331 0.338 0.349 0.378 0.351

0.041 0.375 0.266 0.358 0.336 0.325 0.334 0.432

0.037 0.364 0.255 0.299 0.345 0.387 0.366 0.339


0.040 0.353 0.270 0.311 0.340 0.331 0.356 0.348


5.40062 8.41316 7.67162 5.52923 1.14079 4.67888 5.54257 2.28082

El promedio de las lecturas de absorbancia y los coeficientes de variación de estas fueron obtenidos a través del las funciones del programa de Microsoft Office Excel. Se requirió tener el valor de coeficiente de variación (C.V.) para conocer qué datos se dispersaban demasiado, y por lo tanto eliminarlos. Se tomo como parámetro que el C.V. fuese ≥ 15. Se descartaron varios valores (sombreados en las tablas), para tener los C.V. de acuerdo al criterio establecido, y por lo tanto tener menos dispersión de resultados.

La concentración de la N – (3 – acetoxi – 4 – carboxi – fenil) – maleimida se determina mediante el peso molecular de este (233 g / mol) y la formulación de la “solución madre” que está compuesta por 0.00494 g del compuesto en 0.2 mL de agua tipo I y en 1.8 mL de medio de cultivo complementado.

Se determina la concentración de cada una de las 6 diluciones dividiendo la molaridad de la solución madre entre 2 consecutivamente. El cálculo de porciento de viabilidad celular se efectúa sustrayendo de la lectura del testigo y de las 6 concentraciones, al valor de absorbancia del blanco. Calculo ejemplificado para el testigo y la Concentración I del ensayo de células HeLa a 595 nm:

Para el testigo

Para la Concentración I (10.6 mM N – (3 – acetoxi – 4 – carboxi – fenil) – maleimida)

Se debe de restar a cada lectura el blanco, ya que este comprende la absorción comprendida por las células, el medio de cultivo y el material plástico de la microplaca. El testigo, por no ser expuesto al compuesto en evaluación, se le considera como el 100% de viabilidad celular.

Se obtiene para cada ensayo (de fibroblastos y de células HeLa a 595 y 630 nm cada uno) él % de viabilidad.

Viabilidad celular (Fibroblastos)

Concentración de la N – (3 – acetoxi – 4 – carboxi – fenil) –

maleimida (mM)

Promedio de Absorbancia 595 nm

Ajustada

Porciento de Viabilidad (%)

0 0.321 100.00

0.33125 0.459 142.94

0.6625 0.419 130.63

1.325 0.377 117.39

2.65 0.330 102.83

5.3 0.290 90.37

10.6 0.229 71.44

Viabilidad celular (Células HeLa)


maleimida (mM)


Ajustada


0 0.661 100.00

0.33125 0.686 103.82

0.6625 0.664 100.45

1.325 0.609 92.10

2.65 0.627 94.89

5.3 0.549 83.06

10.6 0.440 66.53

Viabilidad celular (Fibroblastos)


maleimida (mM)


Ajustada


0 0.116 100.00

0.33125 0.177 152.95

0.6625 0.158 136.96

1.325 0.137 118.16

2.65 0.121 104.97

5.3 0.105 90.92

10.6 0.075 64.84

Viabilidad celular (Células HeLa)


maleimida (mM)


ajustada


0 0.313 100.00

0.33125 0.308 98.51

0.6625 0.316 101.07

1.325 0.291 93.18

2.65 0.300 95.79

5.3 0.271 86.78

10.6 0.230 73.48

Se procede a graficar él % de Viabilidad celular contra la concentración del compuesto de interés para 595 y 630 nm de los ensayos sobre los fibroblastos y las células HeLa:

Figura 9. Ensayo de capacidad metabólica (MTT) de fibroblastos y células HeLa leído a 595 nm.

Figura 10. Ensayo de capacidad metabólica (MTT) de fibroblastos y células HeLa leído a 630 nm.

6.3 Análisis morfométrico de los fibroblastos y de las células HeLa

Se tomaron las fotografías de los cubreobjetos teñidos por la técnica de Papanicolaou con ayuda de una cámara digital acoplada al microscopio de fluorescencia. A continuación se presentan las imágenes de los testigos y de las células (fibroblastos y células HeLa) expuestas a diversas concentraciones de la N – (3 – acetoxi – 4 – carboxi – fenil) – maleimida.

Figura 11. Fibroblastos de ratón. Muestra Testigo.

Figura 12. Fibroblastos de ratón expuestos a una concentración de 10.6 mM de maleimida.



Centro germinal.




Figura 18. Línea celular HeLa. Muestra testigo. Figura 19. Células HeLa expuestas a una concentración de 10.6 mM de maleimida.

Figura 20. Células HeLa expuestas a una concentración de 5.3 mM de maleimida.





7. Discusión de Resultados:

7.1 Preparación y esterilización del material, limpieza del cuarto de cultivo, preparación

del medio de cultivo y pruebas de esterilidad.

El éxito de la práctica depende fundamentalmente de las buenas prácticas de laboratorio, la limpieza que se efectué en el cuarto de cultivo, la higiene y cuidado del personal que labore en esta área, el manejo adecuado de reactivos y material biológico y la correcta limpieza y esterilización del material (en autoclave a aproximadamente 1.5 Kg / cm2 durante 15 minutos). La utilización de alcohol etílico al 70% en las superficies del cuarto de cultivo, del material desechable, de plástico y de vidrio, campana de flujo laminar y en las manos permiten mantener condiciones necesarias de asepsia; de ello depende que las inocuidad se mantenga en el área de trabajo, se evite en la medida de lo posible el riesgo de contaminación de tipo bacteriana y por lo tanto errores en los resultados obtenidos. El medio de cultivo DMEM y F12 se complementó con SFB al 7%, debido que este suero posee factores de crecimiento, y algunos metabolitos como el piruvato que favorecen la fosforilación oxidativa y por ende la producción de compuestos de alta energía (ATP). Esta concentración también favorece la duplicación de las células durante la fase de crecimiento exponencial. El uso de antibiótico en la formulación del medio DMEM y F12 disminuye en gran medida la posibilidad de tener contaminación microbiana, sin embargo se debe ser cuidadoso con el manejo de ello ya que puede afectar la viabilidad celular del cultivo. Es importante realizar las pruebas de esterilidad del medio como una medida de seguridad, para corroborar que las condiciones de inocuidad se han mantenido.

7.2 Descongelación de las células (Rehabilitación de una línea celular)

Fue importante llevar correctamente este procedimiento, que implica evitar que las células descongeladas sufran el menor daño mecánico y se mantenga su integridad durante la transferencia del criotubo a la botella de cultivo, así como cuidar que el medio agregado no se desagasifique (perdida de CO2), lo que implica que el valor de pH se mantenga en el parámetro necesario para que se lleve el cultivo en las mejores condiciones. El adicionar los diferentes volúmenes de medio de cultivo y homogenizar con la suspensión celular, permite a la célula adaptarse gradualmente a las condiciones de cultivo.

7.3 Mantenimiento de la línea celular HeLa

Durante el cultivo celular fue importante consultar las indicaciones y recomendaciones contenidas en el catalogo de la ATCC. Esta información explica las condiciones requeridas para llevar a cabo el cultivo de células de forma óptima. Para el caso de la línea celular HeLa, se explica que las condiciones de cultivo deben de tener una concentración de SFB al 10% como complemento del medio, una temperatura de 37 ºC y una tensión de CO2 de 5% y de 95% de aire. Para el caso de esta práctica, el medio complementado con SFB al 7% mantiene las condiciones óptimas de

propagación de la línea celular. Estos factores de crecimiento repercuten en su morfología y favorecen la formación la monocapa de células (proliferación). El recambio de CO2 ayuda a mantener el pH óptimo, ya que en contacto con el medio acuoso se transforma en ácido carbónico (H2CO3) y sales de bicarbonato, permitiendo que el medio no se alcalinice. Es importante por su parte estar al pendiente de la concentración celular, ya que una alta confluencia de células implica que se llegue a agotar el medio, lo que dificulta el subcultivo en un futuro y en el peor de las circunstancias a la muerte celular. La línea celular HeLa es muy proliferante, por lo que su propagación en realidad resulta ser muy sencilla, siempre y cuando se tenga cuidado de no dañar a las células y cuidar que el medio de cultivo este siempre en las condiciones óptimas de pH e inocuidad bacteriana.

7.4 Subcultivo y tripsinización (Pase)

La tripsinización permitió desprender las células que crecieron en la botella de cultivo tanto de la línea celular, como de los fibroblastos. Esta enzima junto con el Verseno (EDTA) ayuda a aislar las células, que se adhirieron a la botella, para realizar la cuenta celular y el estudio citotóxico del compuesto de interés. Es importante mencionar que la tripsinización se debe de realizar con cuidado, ya que la enzima puede afectar negativamente la integridad del cultivo celular (daño proteolítico a la membrana), dependiendo del tiempo de contacto con esta proteasa. Es por ello que se realizó la neutralización de la tripsina con medio de cultivo complementado, en donde este el suero fetal bovino compite como sustrato por el sitio activo de la enzima, evitando así el menor daño a las células. También fue importante que la correcta tripsinización permitiera recuperar el mayor número de células.

7.5 Congelación celular

Las células a congelar, recibieron un tratamiento previo al congelamiento, que implicó la incubación en hielo a – 4 ºC por 30 min (ambientación de la célula a una menor temperatura) y ligeros movimientos que no permiten la formación de cristales grandes que pudieran dañar la integridad celular. El Dimetilsulfóxido es un agente criogénico que se coloca en la membrana celular y le ofrece mayor flexibilidad a esta, permitiendo que sufra el menor deterioro por el cambio de temperatura.

7.6 Cultivo primario

El cultivo primario es una herramienta muy importante para la obtención de células procedentes de un órgano o tejido, en donde este es disgregado enzimática o mecánicamente. Las células disociadas resultantes de este proceso pueden ser sembradas en botellas con medio de cultivo, y pueden emplearse como un testigo cuando se está evaluando alguno agente químicos (compuestos con posible actividad antineoplásica) a los cuales se les desea determinar si son citotóxicos, y si lo son, conocer a que concentraciones pueden generar algún efecto indeseable en tejidos propios de un organismo.

Durante el desarrollo de cultivo primario en la práctica, fue importante mantener las condiciones de asepsia y esterilidad en cada una de las etapas del experimento. Fue importante emplear la solución de Tripsina a la concentración de 0.25%, lo que favoreció la mayor disgregación de los embriones. La siembra en la botella de cultivo, y las condiciones a los cuales se mantuvieron los fibroblastos en incubación fueron de gran relevancia, debido a que la combinación de medios de cultivo (DMEM – F12) aportó los requerimientos metabólicos, energéticos y de crecimiento necesarios para la prevalecía, adhesión y formación de la monocapa deseada. Fue posible percatarse que los fibroblastos formaban centros germinales, en donde las células se colocaban una sobre otra, lo cual es típico de este tipo de cultivos. Fue necesario disgregar estos centros germinales para poder inducir la formación de la monocapa y así poder proseguir con el conteo de células para realizar el ensayo de citotoxicidad y la tinción de Papanicolaou.

7.7 Conteo celular

El conteo celular se realizó mediante una prueba de viabilidad de exclusión de colorante, donde una alícuota de 10 μL de suspensión celular se puso en contacto con una solución de azul de tripano al 0.02%. Las células que fueron teñidas por el colorante son aquellas que sufrieron algún daño en su membrana y por lo tanto permitieron la retención del colorante dentro de ellas, mientras que aquellas que mantuvieron su integridad no se tiñen. La observación de la coloración de las células en la cámara de Neubauer facilitó el conteo de aquellas que aun son viables, y se efectuó el promedio de estas. Conociendo el factor de la cámara y la dilución empleada se conoció la concentración celular tanto de los fibroblastos (2,550,000 células por mililitro) como de las de la línea HeLa (2,375,000 células por mililitro) para la siembra en las placas con cubre objetos de 6 pozos, como en las de 96.

7.8 Ensayo de citotoxicidad – Método de MTT

El ensayo de citotoxidad por el método de la reducción de la sal de MTT a formazan, arrojó unas curvas de viabilidad celular que muestra que a la concentración de 10.6 mM de la N – (3 – acetoxi – 4 – carboxi – fenil) – maleimida, el compuesto tiene un efecto considerablemente negativo en la viabilidad tanto de los fibroblastos como de las células HeLa (Figuras 9 y 10). Sin embargo a concentraciones menores a 2.65 mM, de acuerdo a los gráficos, la disminución de la viabilidad solo parece afectar a las células de cáncer cervicouterino, mientras que los fibroblastos parecen incrementar su crecimiento (valores de viabilidad celular mayores al 100% para los fibroblastos). Esta tendencia puede implicar que en un rango de concentraciones del compuesto, solo haya efecto citotóxico en células cancerosas, y que una elevada concentración mayor a 5.3 mM tiene un efecto totalmente negativo tanto en células tumorales, como epiteliales. Se propone que se llevara acabo de nuevo el experimento, para corroborar si existe repetitividad de los resultados, y así poder tener una idea concluyente. Se sugiere que también se pruebe otros

intervalos de concentraciones que se encuentren dentro de los límites de afectación a los fibroblastos.

7.9 Análisis morfométrico de los fibroblastos y de las células HeLa

Este análisis se realizó a partir de la tinción de Papanicoloaou, donde los fibroblastos y las células HeLa se tiñen con diferentes colorantes tanto el núcleo, los nucléolos y el citoplasma para su identificación en el microscopio. Se llevó el seguimiento del daño a la morfología de los fibroblastos y de células HeLa debido a la exposición de estas a las diferentes concentraciones de la N – (3 – acetoxi – 4 – carboxi – fenil) – maleimida. Para los fibroblastos se pudo observar que entre las concentraciones de 1.325 a 10.6 mM del compuesto, las células sufren un daño en la membrana celular, ya que el citoplasma no se alarga en su forma característica como se puede comparar con la muestra testigo (Figura 11). También es posible percatarse que los núcleos de las células se ven abombados o hinchados, además que unas presentan un daño membranal como de ruptura de la envoltura (Figuras 12, 13, 14 y 15). Las muestras expuestas a las 2 menores concentraciones del compuesto, parecen no tener un daño importante, ya que su morfología característica de alargamiento del fibroblastos está presente, y disminuye los espacios de inhibición de crecimiento (Figuras 16 y 17). Para las células de cáncer cervicouterino, es posible observar que igual forma, las muestras expuestas a las mayores concentraciones de la maleimida (Figuras 19, 20 y 21), sufren un daño a nivel de citoplasma y de abultamiento de núcleo. A pesar de la gran confluencia celular, es posible percatarse de espacio de inhibición de crecimiento por efecto del compuesto. Es también posible identificar que a medida que disminuye la concentración del compuesto, la células HeLa son más parecidas en cuanto a su morfología con respecto a la muestra testigo (Figura 18). Estos resultados pueden explicaran, físicamente, la perdida de viabilidad de las células encontradas en los ensayos de capacidad metabólica y por ende el efecto de este compuesto en la morfología de las células tanto epiteliales como de carácter tumoral.

8. Conclusiones:

Las buenas prácticas de laboratorio y las condiciones de esterilidad evitan la contaminación

microbiana. La formulación del medio es fundamental para llevar a cabo el cultivo celular. La línea celular HeLa tiene condiciones óptimas de cultivo. El cultivo primario es una herramienta importante cundo se requiere tener células que funjan

como testigo en ensayos de citotoxicidad. La correcta tripsinización permite obtener el mayor número de células recuperadas y evita el

menor daño a la integridad celular. El conteo celular fue mayor a 2 millones de células por mililitro para los dos tipos de estirpes

celulares. Las concentraciones del compuesto que afecto considerablemente la viabilidad celular y su

morfología son mayores a 1.325 mM.

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5. http://www.atcc.org/ATCCAdvancedCatalogSearch/ProductDetails/tabid/452/Default.aspx?A

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6. http://es.wikipedia.org/wiki/Azul_de_tripano

7. http://en.wikipedia.org/wiki/MTT_assay

8. http://www.biotek.es/es/products/microplate_software/gen5_data_analysis_software.html

http://www.atcc.org/ATCCAdvancedCatalogSearch/ProductDetails/tabid/452/Default.aspx?ATCCNum=HTB-22&Template=cellBiology

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http://www.biotek.es/es/products/microplate_software/gen5_data_analysis_software.html

informe de practicas

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