iinforme 1 genetica extendido cromosomico

7
UNIVERSIDAD NACIONAL DE COLOMBIA OBSERVACIÓN DE EXTENDIDOS CROMOSÓMICOS R ESUMEN El presente trabajo muestra los resultados de la observación de un extendido cromosómico, a partir de un previo cultivo celular. Los extendidos cromosómicos son un método sencillo para identificar una línea de células y relacionarla con la especie a la que pertenece, permitiendo también distinguir entre células normales o aquellas que presentan aberraciones cromosómicas, mediante la determinación del número de cromosomas, tamaño y ubicación del centrómero. La observación se realizó directamente a una placa ya preparada, previamente se le hizo una tinción homogénea con Giemsa. El extendido revelado con la tinción homogénea mostro los cromosomas en metafase y núcleos tanto activos como inactivos, y se logró identificar por observación directa al microscopio el número de cromosomas y diferenciar aspectos generales de ellos como morfología y estructura. Se encontró que la placa estudiada corresponde a células somáticas (diploides) de la especie Homo Sapiens ya que presenta en promedio 46 cromosomas. El cálculo del índice mitótico fue del 5,3 % indicando la baja proliferación de las células al momento de realizar el extendido. Palabras Clave: Tinción homogénea, extendido cromosómico, número de cromosomas, mitosis, índice mitótico. __________________________________________________________________________ ______________ I ntroducción La obtención de un extendido cromosómico y su respectivo análisis requieren de células provenientes de u n cultivo primario o un subcultivo de una línea celular ya establecida (Navarro y Carlos, 2011). Es importante resaltar que el ADN es la molécula que contiene toda la información genética de un individuo que al expresarse determina las características fenotípicas y genotípicas que identifica a cada especie en la naturaleza ( Tamar Silva, C.; Contreras N.; Fonseca D, 2008 ) Las células de los organismos eucariotas realizan la división celular como estrategia para conservar la información genética , duplican y distribuyen en partes iguales su material genético para dar o rigen a dos células hijas con el mismo número de material genético en el caso de la mitosis o cuatro células hijas con la mitad de la información genética en el caso de la meiosis. Durante estas divisiones se forman los cromosomas constituidos por ADN ( Tamar et al., 2008), en algunas circunstancias en estas divisiones se presentan aberraciones cromosómicas de tipo numérico o

Upload: cristinakendal

Post on 11-Jan-2016

19 views

Category:

Documents


0 download

DESCRIPTION

Extendidos cromosomicos

TRANSCRIPT

Page 1: Iinforme 1 Genetica Extendido Cromosomico

UNIVERSIDAD NACIONAL DE COLOMBIA

OBSERVACIÓN DE EXTENDIDOS CROMOSÓMICOS

RESUMEN

El presente trabajo muestra los resultados de la observación de un extendido cromosómico, a partir de un previo cultivo celular. Los extendidos cromosómicos son un método sencillo para identificar una línea de células y relacionarla con la especie a la que pertenece, permitiendo también distinguir entre células normales o aquellas que presentan aberraciones cromosómicas, mediante la determinación del número de cromosomas, tamaño y ubicación del centrómero. La observación se realizó directamente a una placa ya preparada, previamente se le hizo una tinción homogénea con Giemsa. El extendido revelado con la tinción homogénea mostro los cromosomas en metafase y núcleos tanto activos como inactivos, y se logró identificar por observación directa al microscopio el número de cromosomas y diferenciar aspectos generales de ellos como morfología y estructura. Se encontró que la placa estudiada corresponde a células somáticas (diploides) de la especie Homo Sapiens ya que presenta en promedio 46 cromosomas. El cálculo del índice mitótico fue del 5,3 % indicando la baja proliferación de las células al momento de realizar el extendido.

Palabras Clave: Tinción homogénea, extendido cromosómico, número de cromosomas, mitosis, índice mitótico.

________________________________________________________________________________________

Introducción

La obtención de un extendido cromosómico y su respectivo análisis requieren de células provenientes de un cultivo primario o un subcultivo de una línea celular ya establecida (Navarro y Carlos, 2011).

Es importante resaltar que el ADN es la molécula que contiene toda la información genética de un individuo que al expresarse determina las características fenotípicas y genotípicas que identifica a cada especie en la naturaleza (Tamar

Silva, C.; Contreras N.; Fonseca D, 2008)

Las células de los organismos eucariotas realizan la división celular como estrategia para conservar la información genética, duplican y distribuyen en partes iguales su material genético para dar origen a dos células hijas con el mismo número de material genético en el caso de la mitosis o cuatro células hijas con la mitad de la información genética en el caso de la meiosis. Durante estas divisiones se forman los cromosomas constituidos por ADN (Tamar et al., 2008), en algunas circunstancias en estas divisiones se presentan aberraciones cromosómicas de tipo numérico o estructural, que pueden resultar inadvertidas o fatales.

El estudio del estado de los cromosomas es una útil herramienta para la identificación de género y anomalías genéticas que se determinan fácilmente

por medio de la observación de una serie de características como morfología, estructura, bandeo y número que es particular para las distintas especies (Freshney, R. 2009)

Para realizar un estudio cromosómico de células mamíferas se prefiere que están tengan alta capacidad de proliferación si se estimulan con agentes inductores de la división celular (López; Juan.

Márquez; María. 2002)En este informe se presentan los resultados de la observación de un extendido cromosómico , el cual se obtuvo a partir de ciertas pautas que consistieron principalmente en estimular y detener la división celular de las células en metafase, debido a que en esta fase mitótica los cromosomas se encuentran perfectamente individualizados , organizados en el plano ecuatorial de la célula y adquieren mayor grado de compactación , lo cual facilita la observación al microscopio (Campuzano;

German. 2008) .

Para favorecer el análisis cromosómico se realizan tinciones, como la coloración homogénea con Giemsa al 5%, que presenta una afinidad por los ácidos nucleicos, en adición se pueden implementar otras técnicas de tinción, como la diferencial que permite realizar un análisis más a fondo del estado de los cromosomas, ya que estas técnicas permiten la observación de bandas a lo largo de los cromosomas

La tinción de núcleos con Giemsa revela en una tonalidad de rosados el estado de ellos, los

Page 2: Iinforme 1 Genetica Extendido Cromosomico

estimulados de color rosado claro, los no estimulados morado oscuro y los cromosomas en la mitosis se observan teñidos de morado (Alzate;

Mónika. López; Juan. Márquez; María. 2006).

La práctica realizada tiene como propósito observar detalladamente un extendido cromosómico obtenido a partir de técnicas de cultivo celular, para identificar características visuales de la morfología y estructura de los cromosomas, y determinar el número de cromosomas de las mitosis y de esta manera la especie a la que pertenece , mediante pautas de reconocimiento adecuadas. También es objetivo calcular el indicie mitótico y evaluar la presencia o no de anomalías cromosómicas relacionadas con patologías.

2. Metodología

Cultivo con mitógeno y sincronizadorLas células son tomadas de un cultivo primarios en condiciones de asepsia usando heparina como anticoagulante, (López et al., 2002). El sembrado se realizó en medio RPMI 1640 (ampliamente usado para cultivos primarios,con SFB el cual aporta los factores de crecimiento y las hormonas; fitohemaglutinina (mitógeno) para estimular el crecimiento de los linfocitos; antibiótico penicilina y estreptomicina.La fitohemaglutinina, hormona de origen vegetal, fue extraída de extracto de frijol cargamanto. Para la cosecha de las células se agrega Colcemid 10 ug/ml (agente sincronizador) (López et al., 2002), este químico detiene la división celular en la etapa de metafase (Zon; Mar., 2004). Se homogenizo el cultivo por agitación suave y se incubo.

Tratamiento hipotónicoLas células se pasaron tubos Falcon, se centrifugo se descartó el sobrenadante. se re suspendió la solución con KCl 0.075M. La solución de KCL es hipotónica fuerte que provoca un movimiento neto de agua hacia dentro de la célula y esta explota por turgencia.

FijaciónSe centrifuga y al pellet se agrega una solución fijadora con metanol y ácido acético glacial en proporción 3:1 también llamado fijador Carnoy este fijador modifica la célula mediante la estabilización de las proteínas de modo que hace la célula resistente a los cambios posteriores. Carnoy es un fijador tipo coagulante que transforma las proteínas en estructuras insolubles manteniendo la morfología de las estructuras celulares a nivel de microscopía de luz [7].

La muestra se mantuvo expuesta al fijador por un tiempo de 10 min a temperatura ambiente. Luego se centrifugo a 1000 g por 7 minutos, se descarto el sobrenadante y se resuspendió el pellet en fijador ,se centrifugo nuevamente. Este paso se realizó 3 veces hasta que se logró obtener una solución translucida. La muestra se almaceno a -20 °C hasta el día del goteo.

Dispersión sobre portaobjetosPara el goteo, los portaobjetos o láminas son limpiados exhaustivamente con etanol al 70 %, introducido en agua destilada con hielo con el fin de generar un choque térmico en el goteo, el cual se realizó desde una altura de 45- 60 cm. Es importante tener en cuenta que la altura es clave para realizar un adecuado choque mecánico, pues permite que las células estallen y así se puedan liberar los cromosomas. Se flameo cuidadosamente hasta lograr que se elimine toda la humedad de la placa.

Coloración homogénea: El colorante Giemsa se agregó directamente a las placas y se dejó por 5 min, luego se lavó con abundante agua destilada, se fijó nuevamente con flameo, y posteriormente de sellaron las placas con xilol usando cubreobjetos.

Observación al microscopio y conteo:Se observó directamente al microscopio, Anexo 6. y se procedió a contar el número de núcleos estimulados, no estimulados y mitosis en metafase, para esto se hizo un barrido de forma ordenada en 40x, y posteriormente con los resultados se determinó el índice mitótico, Ecuación (1).

*Núcleos Totales = Núcleos Estimulados + MitosisEcuación  (1)

3. Resultados

3.1 MMorfología estructura de los cromosomasComo se observa en el Anexo 7, se logró identificar algunas partes que constituyen el cromosoma, como lo son los telómeros, el centrómero y sus brazos.

3.2. ÍÍndice mitótico:

No de placa

Núcleos Estimulados

Núcleos en

metafase

Núcleos totales

Page 3: Iinforme 1 Genetica Extendido Cromosomico

66-14-1-18 1911 108 2019Tabla 1. Conteo de núcleos activos y núcleos en metafase.

Con los datos de la Tabla 1 y con la Ecuación 1 se calculó el valor del índice mitótico que es igual a 5,3%.

3.3Número de cromosomas de la especie estudiada:A partir de las fotografías de los Anexos 1-5 se realizó el conteo de cromosomas. Tabla 2.

MetafaseNumero de

cromosomas1 462 463 454 465 46

Promedio 45,8Especie Homo sapiens

Tabla 2. Número de cromosomas promedio presentes en metafase de la especie estudiada.

 4. Discusión

El valor obtenido del índice mitótico 5,3%, indica que hay una gran cantidad de núcleos en interface con respecto a los que alcanzaron metafase en mitosis, es decir sólo el 5,3% de los núcleos que había en interface alcanzaron la metafase en la placa analizada. Este parámetro en términos de tiempo está definido como la duración relativa de la mitosis en relación a la duración total del ciclo. Indicando de esta manera que la mitosis de estas células en los núcleos ocurre en un tiempo demasiado corto, comparado con el resto de su ciclo celular. Si el ciclo celular mitótico de unas células mamíferas en promedio tiene una duración entre 48 a 72 horas, la mitosis solo dura entre 7,3 a 11 horas. El índice mitótico bajo puede un indicativo directo de evidencia de problemas patológicos (López et al.,

2002).

La presencia de este porcentaje de mitosis en el extendido se debió principalmente al papel que juega el Colcemid o sincronizador, que inhibe que el huso cromático se adhiera a los cromosomas y de esta manera no tenga lugar la anafase y se puedan obtener los cromosomas en metafase (López et al.,

2002).

Los extendidos cromosómicos coloreados con Giemsa al 5% , no permiten ver bandas ni características muy particulares y específicas de los cromosomas , por lo que se usa con el fin de calcular el índice mitótico , la determinación del número de cromosomas y el tipo de cromosomas dependiendo de la ubicación del centrómero (López

et al., 2002).

La calidad del extendido cromosómico influye en la visualización de los cromosomas , puesto que la longevidad de estas placas puede ir desnaturalizando el ADN , haciendo que los cromosomas no sean vean bien definidos por lo que es preferible hacer la visualización lo más rápido, en cuanto se haya fijado la placa y así obtener resultados más certeros.

La dotación cromosómica que se obtuvo fue de 46 cromosomas aproximando el promedio, lo que indica que posiblemente estos núcleos pertenecen a células de la especie Homo Sapiens, o en el caso más particular de la especie de liebre, Lepus europaeus que también tiene el mismo número de cromosomas.

Por otro lado la presencia de un valor muy cercano a 46 como 45 o 47 no indicaría la dotación cromosómica de otra especie, sino más bien, anomalías cromosómicas de tipo numérico, como lo son las aneuploidías, si es 45 podría ser un monosomía (2n-1) o si es 47 podría ser una trisomía (2n+1) estas mutaciones conllevan a patologías graves en el ser humano como lo son los síndromes de Turner , Hlinefelter , Súper Macho , Down entre otras que son letales (Susuki,  D. 1994).

  5. Conclusiones

Se logró determinar el número de cromosomas de la placa estudiada, el individuo posee una dotación cromosómica diploide (2n) con un total de 46 cromosomas que corresponde a la dotación cromosómica normal de un humano sano.

El bajo valor del índice mitótico 5,3 % se debe quizá a la naturaleza de las células cultivadas que presentan problemas de división celular evidenciados en mutaciones posiblemente de tipo estructural por lo que habría que realizar un bandeo para analizar esta hipótesis, o se asume que fueron linfocitos obtenidos de cultivo primario de sangre periférica, que no fueron cultivados a las

Page 4: Iinforme 1 Genetica Extendido Cromosomico

condiciones óptimas , tiempo y temperatura , y reactivos en buen estado como el anticoagulante , el mitógeno y el sincronizador .

El índice mitótico podría estar sujeto a cierta variación, dado que en la visualización del extendido se observaron núcleos estimulados rosados muy grandes que contenían cromosomas morados en mitosis en su interior, que por causas de un goteo no óptimo, no se produjo el choque mecánico e hipotónico adecuado y homogéneo para toda la placa, por lo que no se consideraron estas posibles mitosis, lo que hubiera aumentado en un cierto porcentaje el valor del índice mitótico.

Para próximas prácticas se sugiere hacer el análisis del extendido cromosómico con placas hechas recientemente para poder observar más diferenciados y nítidos los cromosomas y de esta manera poderlos contar adecuadamente y dar un resultado más fiable.

Para mejorar los resultados se sugiere usar agentes químicos nuevos, no antes usados o lo más puros posibles para obtener cromosomas con una constitución más definida libres de ruido o interferencia de suciedades o contaminantes; Procurar no usar simultáneamente los mismos reactivos para diferentes muestras a evaluar , para así evitar resultados alterados con muestras distintas a la de interés.

Los extendidos cromosómicos obtenidos permitieron evaluar la forma, estructura y número de cromosomas presentes en los linfocitos de humano, lo que resalta la buena calidad de los resultados, dado también, que se desarrolló con detalle el protocolo propuesto por el Laboratorio de Genética y Biotecnología Animal, que es un protocolo validado y aplicado para estudios de carácter investigativo en el mismo laboratorio.

Para la detección de aberraciones estructurales en los cromosomas como borrados, duplicaciones, sutiles translocaciones, al igual que la identificación de cromosomas marcadores, es esencial realizar una tinción diferencial usando Giemsa que produce una alternancia de bandas claras y oscuras a lo largo de los cromosomas que permiten una fácil caracterización del extendido pues cada cromosoma tiene un patrón de bandas característico.

Anexos.

Anexo 1. Mitosis en metafase No1.

Anexo 2. Mitosis en metafase No2

 

Anexo 3. Mitosis en metafase No3.

Anexo 4. Mitosis en metafase No4.

Anexo 5. Mitosis en metafase No 5.

Page 5: Iinforme 1 Genetica Extendido Cromosomico

Anexo 6. Campo visual de los núcleos estimulados (grandes rosados) y no estimulados (pequeños violetas) y mitosis en metafase (cromosomas dispersos).

Anexo 7. Estructura observable al microscopio de un cromosoma.