III   

3.1 - Desistema O

APOBE

recrutam

para de

celulare

desamin

present

aquand

alvo.

C

mecanis

interacç

entre o

células

proteína

lactama

pcDNA

transcri

fragmen

hidroliza

hidrólise

N

celulare

Figura 3.2com  ~70usando ade Vif‐B2 Vif.    

                      

etecção daa de compl mecanism

EC3G celula

mento por p

egradação p

es de A3G

nase nos vi

te para se

o do proce

om o ob

smo de acç

ção com A3

o Vif do HI

eucariotas

as de intere

ase (B1 e B2

A3G-B1 e

ção de leve

ntos da β-la

ar um subs

e é elevado

a situação

es como a

2 ‐ VisualizaçãoKDa  e  A3G‐B2nticorpo anti He VifSLQ>A3‐B2  

                     

interacçãolementação

mo pelo qu

ar depende

parte do Vif

proteossom

baixam, im

iriões em fo

er capaz d

esso de tra

bjectivo de

ção da pro

3G, começá

V-1 e APO

através de

esse foram

2) (Fig. 3.1)

pcDNA A3

edura GCN

actamase o

strato a um

o.

in vivo o V

EloC, EloB

o da expressão 2  com  ~56kDa A; de Vif‐B1 e Vcom ~34kDa, u

                      

o da Vif doo proteica.ual a prote

, pelo meno

f da maquin

mal (Yu et a

mpedindo a

ormação, nã

e desamin

anscrição r

e compree

teína Vif, o

ámos por es

OBEC3G h

e um sistem

clonadas e

, obtendo-s

3G-B2. Com

N4 (ZIP), qu

riginando a

a taxa elev

Vif, ao inte

B e Cul5 q

em HEK293T, através  de  W

VifSLQ>A3‐B1 comusando um anti

                     

o HIV-1 com. eína Vif do

os em parte

naria celula

al., 2003; M

a incorporaç

ão estando

nar o cDNA

reversa na

ender mel

o qual depe

studar a inte

humano (A3

ma de com

em fusão c

se assim os

mo controlo

ue forma h

assim uma e

vada. O sin

ragir com A

que conjuga

d

p

V

p

d

p

a

mde A3G‐B1

Wester  blotm ~43kDa ecorpo anti‐

                      

m A3G hum

o HIV-1 co

e, da ligaçã

r de ubiquit

Marin et al.,

ção da

o A3G

A viral

célula

lhor o

ende da

eracção

3G) em

mplementaçã

com cada u

s plasmídios

o positivo

homodimero

enzima β-la

nal obtido a

A3G, vai re

am o A3Gc

degradação

pretendemo

Vif/A3G, tem

proteossom

dos passos

por mutagen

alaninas (K

mutação tor

FigdaVie 

                      

IIImano, ex vi

ontraria o f

ão destas d

tinação, que

2003). Des

ão proteica

ma das po

s pcDNA Vi

do PCA us

os, associa

actamase fu

através des

ecrutar uma

com ubiqui

proteosso

os detecta

mos de imp

al de A3G

a jusante.

nizar o moti

Kobayashi e

rna a Vif in

gura  3.1  ‐  Repa  interacção def estão em fusãB2 da TEM‐1 β‐

                     

. Resultivo, através

factor de r

duas proteín

e direcciona

sta forma o

a (PCA). Am

rções da T

if-B1, pcDNA

samos o fa

da a cada

uncional e c

sa mesma

a série de

itina para p

mal. Uma

ar a int

pedir a deg

bloqueand

Para isso o

ivo SLQ da

et al., 2005

ncapaz de

presentação  ese Vif/A3G quanão com os frag‐lactamase. 

          16 |

tados s de um

restrição

nas e do

a o A3G

os níveis

mbas as

TEM-1 β-

A Vif-B2,

actor de

um dos

capaz de

taxa de

factores

posterior

vez que

teracção

gradação

o algum

optamos

Vif para

5). Esta

interagir

squemáticando   A3G ementos B1

                                                                                                                                                                                17 |

com EloC, impedindo assim a ubiquitinação de A3G e a sua degradação proteossomal.

Esta VifSLQ>A3 foi também clonada em fusão com cada uma das porções da TEM-1 β-

lactamase (B1 e B2), obtendo-se assim os plasmídios pcDNA VifSLQ>A3-B1 e pcDNAVifSLQ>A3-

B2.

A expressão de cada uma das construções foi confirmada através de Western blot dos

lisados de células HEK293T transfectadas com 2 clones de cada um dos plasmídios (Fig.

3.2).

A partir da determinação da actividade enzimática da β-lactamase (taxa de hidrólise

utilizando um substrato comercial da enzima β-lactamase - CENTA) em lisados de células

HEK293T transfectadas com diferentes combinações de plasmídios, é possivel analisar

interacções entre proteínas em fusão com os dois fragmentos da β-lactamase (B1 e B2).

O cálculo da taxa de hidrólise de CENTA é feito a partir do cálculo da variação da

absorvância. A variação da absorvância está correlacionada com a hidrólise do substrato e

logo dependente da aproximação dos dois fragmentos da enzima, o que torna a enzima

funcional. Esta proximidade só se verifica se ocorrer interacção das proteínas que estão em

fusão com os fragmentos da β-lactamase. Os dados são apresentados em taxas relativas de

hidrólise, tomando como 100% o controlo positivo de cada conjunto de dados.

Foi testada a actividade da enzima para os dois pares possíveis de plasmídios,

utilizando cada uma das proteínas de interesse em fusão com cada uma das duas porções

da enzima. Assim, testámos os pares A3G-B1 com Vif-B2 e A3G-B2 com Vif-B1 e A3G-B1

com VifSLQ>A3-B2 e A3G-B2 com VifSLQ>A3-B1. Os melhores resultados foram obtidos quando

utilizamos a Vif em fusão com B2 e o A3G fundido com B1 (dados não apresentados), sendo

que a partir deste ponto será sempre usada esta combinação.

Tal como esperado, não foi possível observar uma variação significativa de

absorvância para a interacção da Vif selvagem com A3G (Fig. 3.3A). Apesar disso, não

podemos concluir que não ocorreu interacção, uma vez que o Western blot (Fig. 3.3C)

revela que a proteína A3GB1 foi degradada. Isto indica que Vif-B2 é funcional e é capaz de

degradar A3G-B1 sendo que para tal é necessária uma interacção proteína-proteína.

No Western blot do lisado de células transfectadas com pcDNA VifSLQ>A3-B2 e pcDNA

A3G-B1 foi possível detectar a presença de A3G-B1 a níveis semelhantes aos observados

para células transfectadas somente com pcDNA A3G-B1. Podemos desta forma concluír que

a mutação SLQ>A3 na Vif é capaz de impedir a degradação de A3G, permitindo a detecção

de uma taxa de hidrólise para a interacção VifSLQ>A3-B2 e A3G-B1. Apesar de corresponder a

apenas ~10% do valor do controlo positivo (ZIP-B1 + ZIP-B2) usado como referência, é cerca

de 5 vezes maior que o valor do controlo negativo mais elevado (Fig. 3.2B). De qualquer

forma, não era esperado um sinal muito forte uma vez que esta interacção está descrita

como sendo fraca e o tempo de semi vida da Vif é muito curto (+/- 3h).

               

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0

Uni

d. d

e A

bs. 4

05nm

Fo

descrito

segundo

PCA co

U

trabalha

importa

degrada

proporc

fusão V

lisado.

interacç

causa,

técnica

se um

diferent

O

mostram

CENTA

express

no lis

A

C

                      

1 2

T

oi também

o que este

o controlo

om valores b

ma vez que

ar são dife

nte demons

ação de

cional à qua

VifSLQ>A3-B2

Este facto

ção entre

não sendo

usada. Par

ensaio em

tes rácios d

s resultad

m que a t

A depend

são de prote

sado, dem

                     

3 4

empo (horas)

testada a

forma mul

positivo. Ve

bastante ele

e o rácio e

erentes das

strar que o

CENTA)

antidade de

e A3G-B1

representa

as duas

apenas um

ra o demon

m que se

os dois plas

dos obtido

taxa de de

de direct

eínas de fu

mostrando

                      

5 6

ZI

V

V

A3

V

V

A3

A3

ZI

pc

interacção

ltímeros in

erificamos q

evados .

 

as quantid

s existente

sinal (taxa

obtido

e proteínas

presentes

a realmente

proteínas

m artefacto

nstrar realiz

transfectar

smídios.

os (Fig. 3

egradação

tamente

usão presen

assim q

Figurana TEMem  lisade  placombicontroindepeactividWestefragme

                     

2

4

6

8

10

12

Taxa

s re

laiv

as d

e id

rólis

e

A

B

Figura hidróliscom difB2  (qusumarizmédia ddo  lisadpara a fragmen

IP-B1 + ZIP-B2

if-B2 + A3G-B1

ifSLQ>A3-B2 + A3G

3G-B1 +A3G-B2

ifSLQ>A3-B2

if-B2

3G-B1

3G-B2

IP-B1 + A3G-B2

cDNA3.1

o de A3G c

vivo (Opi

que é poss

ades de pr

s em cond

a de

é

de

no

e a

em

da

zou-

ram

3.4)

de

da

ntes

que

3.3 ‐ DetecçãoM‐1  β‐lactamasados de  célulaasmídios.  (B)  Tanações de plasolo positivo ZIPendentes  com dade  de  β‐lactrn blot para exentos B1 e B2 d

                      

0

0

0

0

0

0

0

3.4  ‐  Diferentee CENTA para ferentes rácios antidades  de zadas na Tabelade dois valoresdo provenientedetecção de Vntos 1 e 2 da β‐

-B1

com o próp

et al., 200

sível detect

roteína de V

dições fisio

B

o de interacçõese.(A) Variaçãos HEK293T  traaxas  relativas  dmídios, calcula‐B1 + ZIP‐B2. Vo  respectivo  damase  em  (A)xpressão de Vifda β‐lactamase.

                      

es  rácios  Vif/Alisados de célude DNA dos plaDNA  usadas

a 5 em anexo).obtidos em du de uma só tra

Vif  (α‐Vif) e A3G‐lactamase nos 

prio A3G,

06), servind

tar esta inte

Vif e A3G c

ológicas co

s proteína‐proto de absorvâncinsfectadas  comde  hidrólise  dedos a partir doalores  relativosdesvio  padrão. )  e  (B)  foram f (α‐Vif) e A3G .  

                     

A3G.  (A)  Taxas ulas HEK293T  tasmídios A3G‐B  nas  transfec. Cada valor couas leituras de ansfecção. (B) WG  (α‐HA) em  fulisados usados

uma vez q

do assim co

eracção atr

com que es

onhecidas,

teína usando PCia por hidrólisem diferentes  coe  CENTA  para o gráfico (A) ems à média de  t(C)  Células  teslisadas  e  ana(α‐HA)   em fu

          18 |

relativas  deransfectadasB1 e VifSLQ>A3‐cções  estãoorresponde àabsorvância.Western blotusão  com oss em (A). 

que está

omo um

ravés de

stamos a

torna-se

CA baseado e de CENTA ombinaçõesas mesmas

m função do três ensaios stadas  paralisadas  por são com os 

               

Figura 3.5(~50kDa) 

quantida

Podemo

das pro

formaçã

confirma

C

Vif/A3G

alaninas

lactama

3.2 - A V Ap

APOBE

(Zheng

degrada

sendo n

equipas

não (Do

Ti

no noss

deste n

clonámo

ZIP-B1.

obtidas,

O

interage

maior d

                      

5  ‐ Visualizaçãoe A2‐B2 (~43kD

ades de pr

os também

oteínas resu

ão de comp

ação com d

oncluimos

G em célula

s, evitando

ase funciona

Vif do HIV-pesar de s

EC3s são c

et al., 200

ação parcia

neutralizado

s chegaram

oehle et al.,

irando parti

so sistema.

não estar d

os A3C, A3

Realizámo

, através de

Os resultad

em com Vif

o que o con

                     

o da expressãoDa) em HEK293

roteína sup

m observar q

ulta no aum

plexos Vif/A

dados adeq

assim que

as HEK293T

a degrada

al capaz de

-1 interageser o A3G

apazes de

04) e A3DE

al por parte

o pela Vif.

a conclusõ

2005) de u

do da técni

Testámos

descrito co

3F e A2, em

os um ens

e um Weste

dos obtidos

f uma vez q

ntrolo negat

                      

o de A3C‐B1  (~53T, através de W

periores às

que o aum

mento da ex

A3G estabil

uados.

utilizando

T, desde q

ção proteos

e hidrolizar o

, ex vivo, cque possu

inibir, men

E são capaz

da Vif. A3B

As opiniõe

ões contrad

uma interacç

ica de PCA

também se

omo possu

m fusão com

aio de exp

ern blot com

s por PCA

que o sina

tivo mais el

                     

50kDa), A3C‐B2Wester blot usa

fisiológicas

mento da qu

xpressão da

liza as mes

a técnica

ue o motiv

ssomal de

o substrato

com APOBEui a mais p

nos significa

zes de ina

B é capaz d

es diferem q

ditórias quan

ção com Vif

A podemos t

e a Vif era o

índo qualq

m uma cau

pressão, co

m anticorpo

não perm

l obtido nes

evado (Fig.

                      

2  (~34kDa), A3ndo anticorpo α

s nos perm

uantidade t

a outra prot

smas. Esta

de PCA po

vo SLQ da

A3G e perm

CENTA.

EC3F, APOpotente acç

ativamente,

ctivar HIV-

de inibir tan

quanto ao A

nto à existê

f.

testar se A3

ou não capa

uer tipo de

da de HA,

onfirmando

anti-HA (Fig

item afirma

stes casos

. 3.6).

                      

F‐B1  (~60kDa),α‐HA.  

mite apenas

ransfectada

teína, possi

possibilida

odemos de

Vif esteja m

mitindo a o

OBEC3C e Ação anti H

, o HIV-1.

1Δvif, send

nto HIV-1 co

A3C, uma

ência (Lang

3C realmen

az de intera

e função a

em pcDNA

os taman

g. 3.5).

ar claramen

não chega

                     

, A3F‐B2  (~56k

s amplificar

a de qualqu

ivelmente p

ade necess

tectar a int

mutageniza

btenção de

APOBEC2 IV-1, vários

Em particu

do também

omo HIV-1Δ

vez que di

lois et al., 2

nte interage

agir com A2

antiviral. Pa

A VZIP-B2 e

hos das p

nte se A3C

a a ser dua

          19 |

Da), A2‐B1

o sinal.

uer uma

porque a

itaria de

teracção

ado para

e uma β-

s outros

lar, A3F

alvo de

Δvif, não

iferentes

2005) ou

com Vif

2, apesar

ara isso

e pcDNA

proteínas

C ou A2

as vezes

               

0

20

40

60

80

100

Taxa

s re

lativ

as d

e hi

dról

ise

M

verificar

3.3 - OsVif do H A

literatur

F

resíduo

resíduo

A3G sã

qualque

degrada

pergunt

desemp

Pa

resíduo

também

de A3G

Vif (Sch

A

B

                      

VifS

LQ-B

2 +

A3G

-B1

VifS

LQ-B

2 +

A3C

-B1

VifS

LQ-B

2 +

A3F

-B1

Mas quando

r que este

s aminoáciHIV-1

região de

ra como pró

Foi recente

s 122 e 124

s 128-130 e

ão capazes

er tipo de e

ação deste

ta: estes re

penham tam

ara esclare

s 122 e 12

m usada, co

G no aa 128

hrofelbauer

                     

VifS

LQ-B

2 +

A2-

B1

VifS

LQ-B

2

A3G

-B1

A3C

-B1

olhamos p

é muito pró

idos 122, 1

A3G envo

óxima ou me

emente pub

4-127 de A3

estão envol

s de inibir

efeito sobre

s mutantes

esíduos (12

mbém algum

ecer esta q

27, obtendo

omo controlo

8 (A3GD128K

et al., 2004

                      

A3F

-B1

A2-

B1

pcD

NA

3.1

para o sinal

óximo do s

127 e 128 d

olvida na in

esmo sobre

blicado (Hu

3G são imp

lvidos na in

a sua en

e a infeccio

s de A3G

2 e 127) es

m papel na i

uestão fora

o-se assim

o positivo d

K-B1) (Fig. 2

4).

                     

resultante

inal obtido

de

po

do

m

A

do A3G são

nteracção c

eposta à reg

thoff and M

portantes pa

teracção co

capsidação

osidade de

pela Vif nã

stão apena

interacção c

am criadas

A3GR122A-B

de inibição d

2 em anexo

                      

da interacç

para A3C

escrito co

odemos su

os sinais

menor afinid

A2 comparat

o importan

com a Vif

gião de inte

Malim, 2007

ara a sua en

om Vif. As m

o nos viriõe

HIV-1Δvif.

ão foi ainda

as envolvido

com Vif?

versões m

B1 e A3GW1

de interacçã

o), que está

FiguraA2.  (A)para liscom  dCada  vvaloresabsorvtransfeVif  (α‐Vcom oslisados

                      

ção da Vif c

e A2. Sabe

omo inter

gerir que a

está relac

ade de Vif

tivamente a

ntes para a

está actua

racção com

7) que a re

ncapsidaçã

mutações R

es, não ap

A capacida

a esclareci

os na intera

mutagenizad

127L-B1 (Fig

ão, uma ve

á envolvido

3.6  ‐  Interacçã) Taxas  relativasados de célulaiferentes  comvalor  correspos  obtidos  eância. do lisadoecção (B) WesteVif)  e A3G, A3s fragmentos 1 usados em (A)

                     

com A3F, p

endo que A

ragindo co

a baixa inte

cionada co

para o A3F

ao A3G.

interacção

lmente des

m Gag. egião que i

o, enquanto

R122A e W1

presentando

ade de ind

da. Surge

acção com

das de A3G

. 2 em ane

ersão mutag

na interacç

ão da Vif com Aas de hidrólise as HEK293T trabinações  de  ponde  à  médiaem  duas  leio proveniente ern blot para de3F  e A2  (α‐HA) 1 e 2 da β‐lacta.

          20 |

podemos

A3F está

om Vif

ensidade

om uma

F, A3C e

o com a

scrita na

inclui os

o que os

127L em

o assim

ução da

então a

Gag ou

G-B1 nos

exo). Foi

genizada

ção com

A3C, A3F ede CENTAnsfectadasplasmídios.a  de  doisturas  dede uma sóetecção deem  fusão

amase, nos

               

Pa

das dif

relação

foi feit

HEK293

DNA (F

Ta

A3GD128

VifSLQ>A3

neste c

controlo

Ve

A3GR122

ser inca

que os

CENTA

controlo

Po

tipo de

122 e

para alé

com a p

3.4 - Asinteracç N

começá

assim o

níveis d

ensaio d

Es

através

para a

que a re

(Mehle

PCA, qu

DRMR>A4-

                      

ara detecta

ferentes co

à versão n

o um en

3T com d

ig. 4 em an

al como es

8K-B1 não fo

3-B2, uma

caso foi

o negativo (

erificámos

2A como o m

apazes de i

s valores d

A obtidos nã

o positivo V

odemos as

envolvime

127 de A3

ém do seu e

proteína Ga

s mutaçõesção com Auma tentat

ámos por m

os plasmídi

de expressã

de expressã

stas duas

de ensaio

interacção

egião da Vi

et al., 2007

ualquer sina

-B2 e A3F-B

                     

ar variações

onstruções

não mutage

saio de

iferentes q

exo).

sperávamos

oi capaz de

vez que

menor qu

Fig. 3.7).

que tant

mutante A3G

interagir co

de taxa d

ão ultrapass

ifSLQ>A3/A3G

ssim suspe

ento destes

3G na inter

envolviment

ag.

s YRHHY>AA3G, A3F, A

iva de defi

utagenizar

ios VifSLQ>A

ão das nova

ão em 293T

regiões da

s de co-im

com A3G

if compreen

7). Tomand

al para a in

B2.

                      

s de expres

mutantes

nizada A3G

expressão

quantidades

s a constru

e interagir

o sinal ob

ue o valor

to o mut

GW127L pare

om Vif, uma

e hidrólise

sam os 25%

G (Fig. 3.7).

eitar de a

s dois resí

racção com

to na intera

A5 e DRMRA3C ou A2nir a região

os aa Y40R

A3 + YRHHY>A5

as construç

T com difere

a Vif, Y40RH

munoprecipit

e A3F, res

ndida entre

o estes dad

teracção en

                     

2

4

1

Taxa

s re

lativ

as d

e id

rólis

e

ssão

em

G-B1,

em

s de

ução

com

btido

r do

tante

ecem

a vez

e de

% do

lgum

íduos

m Vif,

acção

R>A4 na Vi

o da Vif en

RHHY44 e D1

-B2 e VifSLQ

ções eram

entes quant

HHY44 e D

tação (Russ

pectivamen

os aa 40 a

dos em con

ntre VifSLQ>A

A

B

Figurarealizapara diferecorresleituratransfA3G lactam

                      

0

20

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2 +

A3G

-B1

VifS

LQ-B

2 +

A3G

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1

VifS

LQ-B

2 +

A3G

W12

7L-B

1

f do HIV-1

nvolvida na14RMR17 da

Q>A3 + DRMR>

próximos d

tidades de

D14RMR17, f

sell and Pa

nte. Foi tam

a 71 é impo

nsideração

A3 + YRHHY>A3-

a 3.7 ‐ Influêncadas no A3G. (Alisados  de 

entes  combinsponde  à  médas  de  absorvâfecção.  (B) Wes(α‐HA)  em  fusmase, nos lisado

                      

VifS

LQ-B

2 +

A3G

D12

8K-B

1

VifS

LQ-B

2

A3G

-B1

A3G

R12

2A-B

1

não são ca

a interacção

a Vif para al

>A4-B2. Para

os da VifSL

DNA (Fig. 4

foram recen

athak, 2007

mbém public

rtante na in

não era es

-B2 e A3G-B

ia na interacçãA) Taxas relativcélulas  HEK2ações  de  pdia  de  dois  vncia  do  lisado stern blot parasão  com  os  fos usados em (A

                     

A3G

R12

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1

A3G

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7L-B

1

A3G

D12

8K B

1

pcD

NA

3.1

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o com A3G

aninas, obt

a confirmar

Q>A3-B2, foi

4 em anexo

ntemente d

7) como es

cado recen

nteracção c

sperado, atr

B2 e entre V

o com a Vif davas de hidrólise93T  transfectplasmídios.  Cavalores  obtidosproveniente  d detecção de Vfragmentos  1 A).

          21 |

abolir a

G e A3F,

tendo-se

r que os

feito um

o).

descritas

ssenciais

ntemente

om A3G

ravés de

VifSLQ>A3 +

s mutações e de CENTA tadas  com ada  valor s  em  duas de  uma  só Vif  (α‐Vif) e e  2  da  β‐

               

Tl

id

hid

óli

Ve

com A3

positivo

mutação

U

A3G ou

A

C

Figura 3.8relativas Cada valotransfecçlactamase

E

                      

0

100

200

300

400

500

600

700

Taxa

s re

lativ

as d

e hi

dról

ise

erificou-se

3G, uma vez

o (Fig. 3.8A

o DRMR>A

ma vez qu

u A3F fomo

8  ‐ Efeito de mde hidrólise deor correspondeão. (E) Westerne, nos lisados u

0

100

200

300

400

500

600

700

Txas

rela

tivas

de

hidr

ólis

e

                     

que a cons

z que o sina

), em que a

A4 não é ca

e não vimo

os testar ca

mutações na rege CENTA para lis à média de don blot para detusados em (A) (B

                      

strução da V

al obtido, ne

a Vif não a

paz de abo

os qualquer

ada uma de

gião N terminasados de célulaois valores obtidtecção de Vif (αB) (C) e (D).

                     

Vif com a m

este caso, é

apresenta e

lir a interac

r efeito des

elas na inte

al da Vif na  inteas HEK293T trandos em duas leα‐Vif) A3G, A3F

                      

mutação YR

é muito próx

sta mutaçã

ção de Vif c

stas mutaçõ

eracção co

B

D

eracção com  (Ansfectadas comituras de absorF e A2 (α‐HA) e

0

100

200

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700Ta

xas

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de

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e

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s re

lativ

as d

e hi

dról

ise

                      

RHHY>A5 é

ximo do ob

ão. Verificám

com A3F (F

ões da Vif

m outros m

A) A3G, (B) A3Cm diferentes comrvância do lisadem fusão com o

                     

é capaz de

tido para o

mos também

Fig. 3.8C).

na interacç

membros da

C, (C) A3F e (D)mbinações de pdo proveniente os fragmentos 

          22 |

interagir

controlo

m que a

ção com

a família

) A2. Taxasplasmídios.de uma só 1 e 2 da β‐

                                                                                                                                                                                23 |

APOBEC. Em nenhum dos casos se observou uma inibição da interacção devida às

mutações YRHHY>A5 ou DRMR>A4 na Vif (Fig. 3.8 A,B,C e D). Podemos inferir que a

alteração dos aa YRHHY ou DRMR da Vif não é suficiente para inibir a interacção desta

com A3G, A3F, A3C e A2, apesar de não termos avaliado se estas são interacções

funcionais ou não.

Observamos, para a interacção de VifSLQ>A3 + DRMR>A4-B2 com A3G-B1, um aumento do

sinal em relação ao controlo positivo, indicando que a interacção de A3G com Vif está a ser

facilitada quando alteramos o local DRMR.

Deste modo concluímos que as mutações YRHHY>A5 e DRMR>A4 na Vif não são

capazes, por si só, de abolir a interacção com A3G e A3F, A3C e A2.

3.5 - A substituição da sequência DRMR por SEMQ na Vif do HIV-1 favorece a interacção com A3F, A3C e A2

A proteína Vif do HIV-1 não é capaz de inibir a actividade antiviral do A3G de Macaco

Verde Africano (AGM), enquanto que a Vif do SIVAGM não é capaz de inibir a actividade do

A3G humano. Esta selectividade de espécie parece estar relacionada com o aa 128 do A3G.

Quando este aa (D128) é mutado no A3G humano, para aquele que encontramos no A3G

de AGM (K128), obtemos uma versão de A3G humano sensível à inibição pela Vif do

SIVAGM, sendo que o contrário também é verdade (Schrofelbauer et al., 2004).

Uma outra forma de reverter esta especificidade de espécie da Vif é mutagenizar a

região D14RMR presente na Vif do HIV-1 para SEMQ (Schrofelbauer et al., 2006), que

corresponde à região homóloga da Vif do SIVAGM. Desta forma a Vif do HIV-1 passa a ser

capaz de inibir o A3G de AGM.

Podemos então sugerir que a Vif do HIV-1 evoluiu de forma a aumentar a sua

capacidade para inibir A3G humano, aumentando a afinidade com que se liga a esta

proteína em detrimento de A3G’s de outras espécies, ou mesmo a outros membros da

família A3G, uma vez que no caso do Homem este é o APOBEC com maior actividade anti-

retroviral. Se esta hipótese fôr verdadeira, ao utilizarmos uma versão de Vif do HIV-1 com a

mutação DRMR>SEMQ podemos testar se esta região pode regular, não só a

especificidade de espécie, mas também a escolha do APOBEC humano a inibir.

Ao analisar os valores para a interacção dos vários APOBEC com a versão

mutagenizada de Vif DRMR>SEMQ (Fig. 3.8) verificamos que apenas o A3G não revela um

aumento significativo da interacção para os valores de taxa de hidrólise. Enquanto que os

valores da interacção da Vif DRMR>SEMQ com A3F, A3C e A2 aumentaram

significativamente, cerca de quatro vezes mais que o controlo positivo para o A3F, cinco

para o A3C e sete para A2.

                                                                                                                                                                                24 |

Podemos sugerir, a partir destes resultados, que a região DRMR parece ser

importante para a “escolha” do APOBEC que a Vif inibe.

3.6 - VifSLQ>A3 + DRMR>SEMQ é capaz de interagir com A3GD128K e A3GW127L

Tal como previamente descrito por Schrofelbauer et al. (2006), é possível reverter o

efeito da mutação D128K no A3G, alterando a região D14RMR da Vif para SEMQ. Com esta

mutação a Vif recupera a capacidade de inibir a acção antiviral de A3G, o que implica

provavelmente uma recuperação da capacidade de interacção com A3G.

Os nossos resultados estão de acordo

com os de Schrofelbauer et al., uma vez que

a realização da mutação DRMR>SEMQ na

VifSLQ>A3-B2 origina uma proteína Vif (VifSLQ>A3

+ DRMR>SEMQ-B2) capaz de interagir com

A3GD128K, ao contrário do que acontece com a

VifSLQ>A3B2 (Fig. 3.9).

Para além de recuperar a interacção

com A3GD128K, a mutação DRMR>SEMQ é

também capaz de recuperar a capacidade da

Vif para interagir com A3GW127L. O mesmo

não se verifica para o A3GR122A.

As mutações DRMR>A4 e YRHHY>A5,

realizadas na VifSLQ>A3-B2, não foram capazes

de recuperar a interacção com nenhuma das

construções de A3G-B1 (Fig. 5 em anexo)

3.7 - A interacção Vif/A3G é alterada pela presença de HIV-1Δvif Uma vez que a interacção entre Vif e A3G ocorre naturalmente em células infectadas

com HIV-1, explorou-se a possibilidade de criar um ensaio que permitisse estudar esta

interacção de uma forma mais próxima da situação fisiológica.

A intensidade do sinal no PCA depende claramente da quantidade de proteína no

lisado, a qual depende da eficiência da transfecção. A situação ideal passaría por trasfectar

linfócitos T CD4+, infectados com NL4.3Δvif, com as proteínas de fusão para PCA. Não foi

possível transfectar eficientemente estas células de modo a obter um sinal por PCA para o

controlo positivo ZIP-B1 + ZIP-B2 (dados não apresentados). Assim, recorremos às células

HEK293T e testámos a co-transfecção das proteínas de fusão para PCA com o pNL4.3Δvif.

Nesta situação todos os processos de replicação viral que levam à formação de partículas

Figura  3.9  ‐ A mutação DRMR>SEMQ na Vif permite queesta interaja com o A3GD128K e A3GW127L. Taxas relativas dehidrólise  de  CENTA  para  lisados  de  células  HEK293Ttransfectadas com diferentes combinações de plasmídios.Cada  valor  corresponde  à média  de  dois  valores  obtidosem duas leituras de absorvância. do lisado proveniente deuma  só  transfecção.  O  Western  blot  correspondente  aestes lisados encontra‐se na Fig. 5 em anexo. 

0

50

100

150

200

250

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s re

lativ

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a influên

O

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3.10C).

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encapsi

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Vif/A3G

A

B

                      

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ncia dos me

Os dados

ção Vif/A3G

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ação pode e

r uma difere

oi também t

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mos que, q

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G que possiv

                     

ocorrem de

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G obtido po

0A). Apesar

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ente dispon

testada a e

nadantes da

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quando isol

uando em c

o. Esta obse

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nteracção V

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conjunto a

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biente celu

Vif/A3G.

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ando a maq

s de proteín

usência do

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a existênc

ara interagir

ão das prote

usadas par

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o a VifSLQ>A3

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apsidados.

C

FiguraHIV‐1relativHEK2plasmvaloreprovedetecfragm

                      

lar, possibi

ma redução

quinaria de

nas de fusã

o NL4.3Δvif

1 prejudica

ia de outras

r com A3G.

eínas de fus

ra o PCA fo

para a pres

3-B2 como o

a das prote

lacionada c

a 3.10  ‐   A pre1  prejudica  a  ivas  de  hidrólis93T  transfecta

mídios.  Cada  ves obtidos em eniente de umacção  de  Vif  (α‐mentos  1  e  2  d

                      

litando-nos

o significativ

replicação

o VifSLQ>A3-B

f (Fig. 10B),

a a interac

s funções d

são VifSLQ>A

oram centri

sença das p

o A3G-B1

eínas de fu

com a forma

esença da maqunteracção  de  Vse  de  CENTA adas  com  difevalor  correspoduas  leituras da só transfecção‐Vif)  e  A3G  (αda  β‐lactamase

                     

s desta form

va do sinal

do NL4.3Δ

B2 e A3G-B

, verificamo

cção Vif/A3

da Vif, que

A3-B2 e A3G

fugados e

proteínas d

são eficien

usão, o A3

ação de co

uinaria de replVif  com  A3G. para  lisados  drentes  combinonde  à  média de absorvância o. (B)  Westernα‐HA)  em  fusãoe,  nos  lisados 

          25 |

ma testar

l para a

Δvif está

B1 serem

os que a

G. Esta

poderão

-B1 (Fig.

os vírus

e fusão.

ntemente

3G-B1, é

mplexos

icação do(A)  Taxasde  célulasnações  de

de  doisdo  lisado blot parao  com  ose  (C)  nos