7/24/2019 IgE ELISA Monobind

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Distribuidora de Reactivos y Agentede Diagnstico para Laboratori

Blvd. J. Alonso de Torr es 312 PTE. Col. San Jernimo Len Gto.(477) 718-5948 ventasleon@microelisas.com

Inserto Inmuno-globulina E (IgE) ElisaMONOBIND, INC.

Inmunoglobulina E (IgE)C d i g o d e P r o d u c t o : 2 5 2 5 - 3 0 0

Intencin de Uso: La determinacin cuantitat iva de la concentracin deInmunoglobulina E (IgE) en suero humano por inmuno-ensayo deenzima en microplaca.

RESUMEN Y EXPLICACION DE LA PRUEBALas reacciones alrgicas, las cuales se estn expandiendo ms, son usualmentediagnosticadas basadas en el historial de sntomas mdicos y clnicos. Sinembargo, en pruebas In Vitro e In Vivo , juegan un papel importante en laconfirmacin de sospechas clnicas y un tratamiento a dec uado . La medicin de lainmunoglobulina E (IgE) en suero es u tilizada ampliamente en los diagnsticos dereacciones alrgicas e infecciones parasitarias. Muchas ale rgias son causadas porlas inmunoglobulinas de subclase IgE actuando como punto de contacto entre el

alergeno y clulas especializad as. Las mo lculas IgE (MW 200,000) se enlaza a lasuperficie de clulas mastoflicas y basoflicos granulocitos . Subsecuentemente launin entre el alergeno a limite de la clula IgE causa que estas clulas segreguenhistaminas y otras sustancias vaso activas. La segregacin de histaminas en elcuerpo ocasiona el inicio de lo que co mnmente es conocido como una reaccin dealergia.

Antes de hacer alguna determinacion terapeutica es importante saber si la reaccionalergica, es mediante IgE, o no-IgE. La medicio n del IgE total en una muestra desuero, juanto con otra informacion de diagnostico de soporte pueden ayudar ahacer esta determinacion. Medir el total del IgE circulante puede ser muy valiosopara la deteccion de alergias tempranas en infantes, asi como predecir futurasmanifestaciones atopicas. Antes de decidir por cualquier terapia, es importantetomar en consideracion t oda la informacion clinica relevante, a si como lainformacion arrojada por las pruebas alergicas especificas. Los niveles de IgE,muestran un ligero incremento durante la niez, alcanzando niveles adultos en lasegunda decada de su vida. En general los niveles de IgE total se incrementan conalergias a personas dependiendo de los tiempos de exposicion a alergenosrelevantes. Incrementos significativos pueder reflejarse en personas sensibilizadas,pero tambien en casos de mieloma, aspergilosis pulmonar y durante etapas activasde infecciones paras iticas.En este mtodo, el calibrador IgE, la muestra del pac iente o el control, primero seagrega al pozo previamente impregnado con streptavidin. El Anticuerpo monoclonalbiotinlado (especifico para IgE) sera agregado y los reactivos mezclados. Lareaccio n entre los anticuerpos IgE y los nativos de IgE, forman un complejo que seunira a los pozos impregnados con streptavidin. El exceso de suero y proteinasseran lavadas mediante pasos de lavado. Ot ra enzima etiquetada co n anticuerpomonoclonal especifico de IgE, es agregado a los pozos, esta enzima e tiquetadacon anticuerpo, se liga al del IgE actualmente inmovilizado en el p ozo a travs de lcual se une al anticuerpo monoclonal biotinlado. El exceso de enzima es lavada pormedio de un paso de lavado. Un c olor es generado al aadir e l sustrato. L aintensidad de la generacin de ese color es directamente proporcional a laconcentracin de la IgE en la prueba.

PRINCIPIOAnlisis de Secuencia Inmunoenzimomtrico (TIPO 4):Los reactivos esenciales requieren de un ensayo Inmunoenzimomtrico quecontenga anticuerpos de alta afinidad y especificidad (enzima e inmovilidad), conreconocimiento diverso y distinto del e pitome, en exceso y antgeno de o rigen. Eneste procedimiento, la inmovilizacin se lleva acabo durante el ensayo en lasuperficie de un pozo de la microplaca a travs de la interseccin del pozorecubierto con Streptavidin y anticuerpo anti-IgE monoclonal b iotinilado e xgeno.

Al mezclarse el anticuerpo monoclonal biotinilado un suero que contenga antgenode origen, la reaccin se produce ente el antgeno de origen y los anticuerpos,formando un complejo antgeno-anticuerpo.La interaccin es ilustrada por la siguiente ecuacin.

Simultneamente, el complejo es depositado en el pozo a travs de la alta afinidadcon la reaccin del streptavidin y el anticuerpo biotinilado.Esta interaccin es ilustrada como sigue:

Despus de un periodo apropiado de incubacin , la fraccin ligada al antgeno-anticuerpo es separada por medio de la decantacin o aspiracin. Otro anticuerpo(dirigido a un eptome diferente) etiquetado con una enzima es aadido. Otrainteraccin ocurre para formar una enzima etiquetada antgeno-anticuerpocomplejo de anticuerpo biotinlado en la superficie de los pozos. El exceso deenzima es lavada por medio de un paso de lavado. Un sustrato adecuado esaadido para que el color pueda ser cuantificable con el uso de unespectrofotmetro de microplacas. La act ividad de l a enzima en el pozo esdirectamente proporcional a la concentracin del antgeno de origen. Al utilizarvarios y diferentes sueros de referenci a de concentracin de ant geno c onocido,una curva de dosis de respuesta puede ser generada desde la cual laconcentracin del antgeno de un desconocido puede ser comprobada.

REACTIVOS MATERIAL PROVEEIDO A. Suero Humano Referencias ---1.0 ml/frasco Iconos A-F Seis (6) frascos de suero humano con calibradores de referencia establecida aconcentraciones de 0 (A), 5 (B), 25 (C), 50 (D), 150 (E) y 400 (F) IU/ml. Almacenara 2-8C. Un preservati vo ha sido aadido.(Los calibradores estn estandarizados contra el WHOs 2ndlRP 75/502 pa ra IgE).B. IgE Reactivo Biotin -13ml/frasco ? Un (1) frasco de biotinlado anti-humano IgE mlgG reactivo presentado e n un ma trizde protena-estabilizada. Un preservativo ha sido aadido. Almacenar a 2-8C

C. IgE Reactivo Enzima- 13 ml/frasco Icono Un (1) frasco de anti-humano IgE- HRP complejo incorporado en un matriz deprotena-estabilizada. Un preservativo ha sido aadido. Almac enar a 2-8CD. Microplaca Cubierta de Streptavidin - 96 pozos - Icono ? Un microplato de 96 pozos cubierto con streptavidin y empaquetado en un bolso dealuminio con un elemento deshidra tador. Almacn en 2-8C.E. Concentrado de Solucin de lavado - 20 ml - icono Un (1) frasco que contiene un surfactante en salino protegida. Se ha agregado unpreservativo. Almacn en 2-30C.F. Substrato A -- 7ml/vial - botella del icono SA Un (1) fras co que contiene tetrametilbenzidina (TMB) solucin. Almacn en 2 -8C.

G. Substrato B -- 7ml/vial - botella del icono SB

Un (1) frasco con perxido de hidrgeno (H 2O2) en solucin. Almacn en 2-8C.H. Solucin de paro -- 8ml/vial - icono Un (1) bote que contiene un cido fuerte (1N H Cl ). Almacn en 2-8 C.Nota 1: No utilice los reactivos ms all de la fecha de vencimiento del kit.Nota 2: Los reactivos abiertos son estables por sesenta (60) das cuando estnalmacenados en 2 -8C.Nota 3: Los reactivos son para una solo microplaca de 96-pozos

MATERIAL REQUERIDO PERO NO PROPORCIONADO:1. Pipeta capaz de entregar los volmenes de 25l y 50l co n una precisin mejorde 1.5%.2. Dispensadores para las e ntregas re petidas de los volmenes 0.100ml y 0 .300mlcon una p recisin de mejor de 1 .5%.3. Lavador de Microplacas o u na botella del apretn pizeta (opcional). 4. Lector de Micro placa con capacidad de absorbancia con una longitud de ondade 450nm y 620nm.5. Papel absorbente para retirar los excesos de los pozos de la microplaca.

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6. Plstico envolvente o tapa para la microplaca para los pasos de la incubacin.7. Aspirador de vaco (opcional) para los pasos de lavado.8. Contador de tiempo.9. Materiales del control de calidad

PRECAUCIONESPara el uso de di agnstico in Vitro no para el uso interno o ex terno en seres

humanos o animalesTodos los productos que contienen el suero humano han sido encontrados para serno-reactivos para el antgeno superficial de la hepatitis B, l os anticuerpos del VIH1&2 y de HCV por los reactivos con licencia de la FDA. Puesto que ninguna pruebasabida puede ofrecer el aseguramiento de que los agentes infecciosos estnausentes, todos los productos humanos del suero deben ser dirigidos comopotenc ialmente peligrosos y capaces de transmitir enfermedad. Los buenosprocedimientos del laboratorio para manejar productos de la sangre se puedenencontrar en el centro para el control de enfermedad/el instituto nacional de lasalud, "Bioseguridad en laboratorios microbiolgic os y biomdicos," 2da Edi cin,1988, publicacin No. (CDC) 88-8395 de HHS.

RECOLECCION DE LA MUESTRA Y PREPARACION Los especimenes sern la sangre, su ero en tipo y las precauciones generalmenteen la coleccin de muestras de veni-puntura deben ser observados. Para lacomparacin exacta a los valores normales establecidos, una muestra de ayunodel suero de la maana debe ser obtenida. La sangre se debe recoger en un tubollano de venipuntura de tapn rojo sin los aadidos o anticoagulantes. Permita quela sangre coagule. Centrifugue el espcimen para separar el suero de las clulas.Las muestras se pueden refrigerar en 2-8C. por un perodo mximo de cinco (5)das. Si el espcimen no se puede probar dentro de este tiempo, la muestra sepuede almacenar en las temperaturas de -20C. po r hasta 30 das . Evite congelar ydeshelar. Cuando est probado en duplicado, 0.050ml d el espcimen se requiere.

PREPARACION DE LOS REACTIVOS1. Solucin Lavadora (Wash) Diluya el co ntenido de la solucin de lavado en 1000ml con agua destilada odesionizada en un envase adecuado de almacenaje. Almacnese a temperaturaambiente 20-27C. hasta por 60 das.2. Solucin de Trabajo sustrato Vierta los contenidos del frasco mbar dentro del frasco etiquetado con SolucinA dentro del frasco transparente que diga Solucin B. Coloque la tapa amarillaen el frasco para una fcil identificacin. Mezcle y etiquete acordemente.

Almacnese a 2-8C. Nota: No utilice el sustrato de trabajo si parece azul.

PROCEDIMIENTO DE LA PRUEBA Antes de proceder con el anlisis, tenga todos los reactivos, referencias del suero ycontroles a temperatura ambiente (20 - 27C.).1. Ajuste el formato de los pozos de las microplacas para cada referencia delsuero, control y espcimen del paciente sean probados en duplicado. Coloquecualquier tira sin usar de micro pozo nuevamente dentro del bolso de aluminio,sllela y almacnela en 2-8C. 2. Mida con una pipeta 0.025 ml (25l) de la referencia, del control o del espcimen

apropiado del suero en el pozo asignado.3. Agregue 0.100 ml (100l) del reactivo de enzima de PSA en cada pozo. Es muyimportante dispensar todos lo s reactivos c erca del fondo del pozo cubierto. 4. Agitar la microplaca suavemente por 20-30 se gundos. Mezcle y cubra.5. Incube 30 minutos a temperatura ambiente.6. Deseche el contenido de la microplaca por la decantacin o la aspiracin. Sidecanta, cubra, voltee y golpee ligeramente la placa con el papel absorbente.7. Agregue 300l del buffer lavador (vase la seccin de la preparacin el reactivo),decntelo (golpee contra el papel absorbente o asprelo). Repita dos (2) vecesadicionales para un total de tres (3) lavadas. Un lavador automtico o manual deplacas puede ser utilizado. Siga la instruccin del fabricante para el uso apropiado.Si se emplea una botella del apretn o pizeta, llene cada pozo presionando elenvase (que evita burbujas de aire) para dispensar la lavada. Decante la lavada yrepita dos (2) veces adicionales. 8. Agregue 0.100 ml (100l) del anticuerpo de enzima IgE a todos los pozos (vasela seccin de la preparacin el reactivo). Agregue siempre los reactivos en elmismo orden para reducir al mnimo diferencias del tiempo de reaccin entrelos pozos. 9. Cubra e incube a temperatura ambiente por quince (15) minutos.

10. Deseche el contenido d e la microplaca por la decan tacin o la aspiracin. Sidecanta, cubra, voltee y golpee ligeramente la placa con el papel absorbente.11. Agregue 300l del buffer lavador (vase la seccin de la preparacin elreactivo), d ecntelo (golpee contra el papel absorbente o asprelo). Repita dos (2)veces adicionales para un total de tres (3) lavadas. Un lavador automtico omanual de placas puede ser utilizado. Siga la instrucc in del fabricante para el usoapropiado. Si se emplea una botella del apretn o pizeta, llene cada pozopresionando el envase (que evita burbujas de aire) para dispensar la lavada.Decante la lavada y repita dos (2) veces adicionales.12. Aadir 0.100 ml (100l) de solucin de sustrato de trabajo a todos los pozos.(Ver seccin de preparacin de reacti vos) Siempre aadir los reactivos en el mismoorden para minimizar el tiempo de reaccin. NO AGITE EL PLATO DESPUES DEAADIR EL SUSTRATO. 13. Incube a t emperatura ambiente por 15 minutos. 14. Agregue 0.050ml (50l) de la solucin de paro a cada pozo y mzclesesuavemente por 15-20 segundos.15. Lea la abs orbancia en cada pozo a los 450nm (con una longitud de onda dereferencia de 620-630nm p ara reducir al mnimo imperfecciones del p ozo) en un

lector de microplaca. Los resultados se deben leer en el plazo de treinta (30)minutos de agregar la solucin de paro.

CONTROL DE CALIDADCada laboratorio debe probar controles en los niveles de rango bajo, normal yelevado para supervisar el funcionamiento del anlisis. Estos controles se debentratar como desconocidos y valores determinados en cada mtodo de pruebarealizado. Las cartas del control de calidad se deben mantener para seguir elfuncion amiento de los reactivos provistos. Los mtodos estadsticos pertinentes sedeben emplear para comprobar tendencias. La desviacin significativa delfuncion amiento establecido puede indicar el cambio inadvertido en c ondiciones o ladegradacin experimental de los reactivos del kit. Los reactivos frescos se debenutilizar para determinar la razn de las variaciones.

RESULTADOSUna curva de la re accin a cierta dosis se utiliza para comprobar la co ncentracinde IgE en especimenes desconocidos.1. Regist re la absorbencia obtenida del listado del lecto r del micro placas conformeal ejemplo 1.2. Trace la absorbancia para cada referencia duplicada del su ero contra laconcentracin correspondiente de IgE en IU/ml en el papel de grfico linear (nohaga un promedio de los duplicados de las referencias del suero antes de trazar).3. Dibuje la curva a travs de los puntos trazados.4. Para determinar la concentracin de IgE para un desconocido, localice laabsorbancia media de los duplicados p ara cada desconoc ido en e l eje vertical delgrfico, encuentre el punto que se interseca en la curva, y le a la concentracin (enIU/ml) del eje horizontal del grfico ( los duplicados del desconocido se puedenpromediar segn se indica). En el ejemplo siguiente, la absorbencia media (1.323)interseca la curva de la r eaccin a cierta dosis en (142 IU/ml) la concentracin deIgE (vase el cuadro 1).

Nota: El software de la reduccin de datos de la computadora diseado para los

anlisis de ELISA se puede tambin utilizar p ara la reduccin de datos.

Los datos presentados e n el ejemplo 1 y el cuadro 1 son ilustrativos s olamente y nose deben utilizar en lugar de una curva de la reaccin a cierta preparacin de cadaensayo.

PARAMETROS DEL CONTROL DE CALIDADEn orden de que los resultados del anlisis se an considerados vlidos, deben serresueltos los siguientes criterios:1. La absorbancia (OD) del calibrador A debe ser ? 0.12. La absorbancia (OD) del calibrador F debe ser ? 1.33. Cuatro fuera de seis pools del control de calidad deben estar dentro de rango.

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LIMITACIONES DEL PROCEDIMIENTO1. Es importante que el tiempo de reaccin en cada pozo sea lle vado a caboconstan te para la reproduccin de resultados. El medir con una pipeta de muestrasno debe extender ms de diez (10) mins para evitar deriva del anlisis. Si se utilizams de una (1) p laca, s e recomienda repetir la curva de la r eaccin a cierta dosis. 2. La adicin de la solucin del sustrato inicia una reaccin cintica, que esterminada por la adicin de la solucin de paro. Por lo tanto, l a adicin del sustratoy de la solucin de paro debe agregarse en la misma secuencia para eliminar encualquier momento la des viacin durante l a reaccin.3. Los lectores de la placa miden verticalmente. No toque el fondo de los pozos.4. La falta de remover la solucin adherida adecuadamente en los pasos de laaspiracin o de la decantacin puede dar lugar a la rplica pobre y a resultadosfalsos.5. Muestras que estn contaminadas microbiolgicamente, no se debe utilizar en el

anlisis. Lipemica alta o hemolizada del e spcimen(es) no debe ser utilizado.6. La concentracin del suero IgE, depende de una multiplicidad de factores.Incluyendo si e l paciente es sensible, cuantas veces el p aciente ha sido expuesto auna alergia especfica etc. La concentracin total IgE por si sola no es suficientepara aquilatar su estatus clnico. Todas los posibilidades clnicas especialmentepruebas de alergia especifica deben ser tomadas en consideracin en lo quedeterminan el estatus clnico del paci ente.7. Dado que no todas las reacciones atpicas son medidas por IgE, toda lainformacin clnica relevante debe ser t omada e n consideracin antes de cualquierdeterminacin para pacientes que puedan estar dentro del rango normal.

RANGOS ESPERADOS Y VALORESUn estudio de poblacin de d iferentes grupos y edades fueron llevados a evaluar elIgE AccuBind sistema de p rueba E LISA. Los res ultados son presentados acontinuacin en la Tabla 1.

TABLA IValores Esperados para la Prueba de IgE de ELISA.

(En IU/ml)Edad Nmero Promedio Rango(Aos) (n) Absoluto 0-3 31 6.4 ND 46%3-16 43 25.0 ND 280

Adulto 145 43 0 200

Es importante tener en mente que el establecim iento del un rango de valores loscuales pueden ser esperados para encontrarse por un mtodo dado para unapoblacin de personas normales es dependiente a una variedad de factores: laespecificidad del mtodo, la poblacin analizada y la precisin del mtodo en lasmanos de los analistas. Por estas razones cada laboratorio debe depender solo delos rangos de valores esperados establecidos por el fabricante solo hasta que unrango local pueda ser determinado por los analistas usando el mtodo con unpoblacin indgena al rea en la que el laboratorio est localizado.

CARACTERISTICAS DE ACTUACIONA. PrecisinPara poder validar las precisiones del intra-ensayo de la IgE AccuBind sistemade prueba ELISA, veinte replicas de cada uno de tres su eros (rangos medio bajo y

alto de la curva) fueron probados en el mismo ensayo. Un intra-ensayo conprecisin del 1.95 a 5.87% fue obtenido.TABLA 2

Precisin dentro de la prueba (En IU/ml)Bajo Mediano Alto

Nmero 20 20 20Significado 48.9 160.5 297.61 S.D. 2.87 6.47 5.81% CV 5.87 4.03 1.95

Para poder validar la precisin del inter-ensayo de la IgE con el sistema de pruebaELISA AccuBind, un dupli cado de cada tres sueros (rangos medio, bajo y al to dela curva) fueron probados 10 ensayos terminados durante el periodo de 6 mesesque involucran 5 sets diferentes de reactivo y tres d iferentes tcnicas. Unaprecisin de Inter-ensayo de 3.52 a 8.42% fue obtenido. Ver tabla 3 a continuacin.

TABLA 3Precisin Inter de la prueba (En IU/ml)

Bajo Mediano AltoNmero 10 10 10

Significado 46.3 157 3011 S.D. 3.9 7.3 10.6% CV 8.42 4.64 3.52

B. Exactitud El sistema de prueba por ELISA AccuBind IgE fue comparada con un mtodo detubo cubierto de radio inmunoensayo (RIA) Muestras biolgicas con niveles de IgEen bajo, mediano y altos rangos fueron usados (Los rangos de los valores fueronde 0.8 a 3100IU/ml). El nmero total de muestras fue 219. La mn ima ecuacin deregresin cuadrada y la correlacin coeficiente fueron computadas para est a IgE

AccuBind mtodo de ELISA en comparacin con el mtodo predicho.

TABLA 4Regresin Correlacin

Mtodo Significado Anlisis CoeficienteMonobind EIA X 179 x=-12.9 + 1.21(Y) 0.967Predicado RIA Y 157

Solamente las pequeas cantidades diagonales entre el procedimiento deMonobind ELISA IgE en Microplaca y el mtodo de referencia son indicadas por laproximidad de los valores medios. La ecuacin del lt imo cuadro de regresin y elcoeficiente de correlacin ind ica un acuerdo exc elente de l mtodo.

C. Linearidad Dos pacientes comunes fueron ensayados diluyendo (un calibrador A) yconcentrado con la IgE AccuBind sistema de prueba ELISA. Los valoresobservados y esperados estn listados en la Tabla 5 a continuacin:

TABLA 5Muestra Observado Esperado %RecuperacinPool 1 106.8 - -Pool 50.8 53.4 95.1Pool 25.3 26.7 94.8

Pool 1/8 13.4 13.3 100.6Pool 1/16 6.6 6.7 98.5Pool 2 395.9 - -Pool 2/2 189.5 197.9 95.8Pool 2/4 106.1 98.9 107.2Pool 2/8 48.0 49.5 96.9Pool 2/16 25.8 24.7 104.2

D. Sentividad La IgE AccuBind prueba de ELISA tiene una sensibilidad de 1.0 IU/ml. Lasensibilidad fue asegurada por la determinacin de la variabilidad del suerocalibrador 0 IU/ml y usando el 2 (95% de certeza) estadstica para calcular ladosis m nima.E. Especificidad La especificidad del sistema de prueba ELISA AccuBind IgE, para relacionar la sinmunoglobulinas fue evaluada aadiendo aquellos dos veces las concentracionesfisiolgicas al suero matriz. Ninguna reaccin cruzada entre los anticuerpos fueusada y las molculas relacionadas fueron detectadas.F. Recuperacin Dos pacientes comunes fueron picados con cantidades conocidas de IgE yensayado con la IgE AccuBind sistema de prueba ELISA. Los valoresobservados y esperados estn listados en la Tabla 6 a continuacin:

TABLA 6Muestra Observado (O) Esperado (E) %Recuperacin

IU/ml IU/ml (O/E)Pool 1 25.7 - -Pool 1+25 50.7 50.7 100.0Pool 1+50 74.8 75.7 101.2Pool 1+100 122.7 125.7 97.6Pool 1+200 232.0 225.7 102.7Pool 2 12.3 - -Pool 2+25 41.7 37.3 111.2Pool 2+50 62.6 62.3 100.6Pool 2+100 109.4 112.3 97.4Pool 2+200 197.2 212.3 92.8

G. Efecto de Dosis Alta Dado que el ensayo diseado secuencial, las concentraciones altas de IgE no

demuestran el efecto gancho. Muestras de pacientes con Mieloma IgE conconcentraciones mas de 8 millones IU/ml demuestran altos niveles de absorbanciaextremos.

REFERENCIAS