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Departamento de Bioquímica y Biología Molecular
Unidad de Biociencias
IDENTIFICACIÓN Y CARACTERIZACIÓN DE
LA PROTEÍNA Ssa2 DE Staphylococcus
aureus.
Memoria del Trabajo experimental correspondiente al Máster en
Bioquímica, Biología Molecular y Biomedicina
Presentada por Yanara A. Astudillo Silva
Septiembre de 2012
Departamento de Bioquímica y Biología Molecular
Unidad de Biociencias
IDENTIFICACIÓN Y CARACTERIZACIÓN DE LA
PROTEÍNA Ssa2 DE Staphylococcus aureus.
Memoria del Trabajo experimental correspondiente al Máster en Bioquímica,
Biología Molecular y Biomedicina
Presentada por Yanara A. Astudillo Silva
Realizada bajo la dirección del Dr. Salvador Ventura y de la Dra. Susanna Navarro
Yanara A. Astudillo S.
Dr. Salvador Ventura Dra. Susanna Navarro
Bellaterra, Septiembre de 2012
i
INDICE
1. RESUMEN ............................................................................................................................. 1
2. INTRODUCCIÓN ................................................................................................................... 2
2.1 PLEGAMIENTO PROTEICO ........................................................................................... 2
2.2 AGREGADOS PROTEICOS ........................................................................................... 2
2.2.1 Fibras Amiloides ..................................................................................... 3
2.3 PROTEÍNAS PRION ....................................................................................................... 5
2.3.1 Sup35 ....................................................................................................... 5
2.3.2 Staphylococcal secretory antigen (Ssa2) .............................................. 6
2.3.3 DOMINIOS CHAP ..................................................................................... 6
2.4 MODELAJE DE LA ESTRUCTURA PROTEÍCA ............................................................. 7
2.4.1 SWISS-MODEL ........................................................................................ 7
3. OBJETIVOS........................................................................................................................... 8
4. MATERIALES Y MÉTODOS .................................................................................................. 8
4.1 MÉTODOS BIOINFORMÁTICOS .................................................................................... 8
4.1.1 Modelaje de la estructura proteica ......................................................... 8
4.1.2 Análisis de propensidad de agregación ................................................ 8
a) PASTA ..................................................................................................... 8
b) WALTZ ..................................................................................................... 8
4.2 MÉTODOS DE DNA RECOMBINANTE .......................................................................... 9
4.2.1 Clonación ................................................................................................ 9
4.2.2 Transformación de células competentes de E. coli Codon Plus… ..... 11
4.3 EXPRESIÓN Y PURIFICACIÓN DE LA PROTEÍNA Ssa2 ............................................ 11
4.3.1 Medios de cultivo y antibióticos ........................................................... 11
4.3.2 Condiciones del cultivo ........................................................................ 11
4.3.3 Crecimiento de cultivos e Inducción de expresión proteica ............... 12
4.3.4 Purificación de la proteína SsaA2 mediante cromatografía de
afinidad.. ......................................................................................................... .12
4.3.5 Preparación de las muestras para los geles de Acrilamida-Bis-
Acrilamida ....................................................................................................... 13
4.3.6 Determinación de la concentración proteica ....................................... 13
4.4 MÉTODOS ELECTROFORÉTICOS .............................................................................. 14
4.4.1 Electroforesis en Geles de Agarosa ..................................................... 14
4.4.2 Electroforesis SDS- PAGE .................................................................... 14
ii
4.4.3 Tinción y Destinción de los Geles ........................................................ 15
4.5 DIGESTIÓN PROTEOLÍTICA ....................................................................................... 15
4.6 MÉTODOS BIOFÍSICOS ............................................................................................... 16
4.6.1 Tinción específica de fibras amiloides ................................................. 16
4.6.1.1 Unión de Tioflavina – T ................................................................... 16
4.6.1.2 Unión de Congo Red ....................................................................... 16
4.6.1.3 Unión de Bis-ANS ............................................................................ 16
4.6.2 Dicroísmo Circular ................................................................................ 17
4.6.3 Determinación de Fluorescencia Intrínseca ........................................ 17
4.6.4 Microscopia electrónica de transmisión (TEM) para la visualización de
fibras amiloides............................................................................................... 17
4.6.5 Ensayo de Citotoxicidad Celular .......................................................... 18
5. RESULTADOS Y DISCUSIÓN ...................................................................................... 18
5.1 CLONACIÓN DE Ssa2 en el VECTOR pET 28-B ......................................................... 18
5.2 ALINEAMIENTO DE SECUENCIAS SIMILARES Y MODELAJE DE LA ESTRUCTURA
PROTEICA DE Ssa2 .................................................................................................... 19
5.3 ANÁLISIS DE LA PROPENSIÓN DE AGREGACIÓN ................................................... 20
5.4 EXPRESIÓN Y PURIFICACIÓN DE LA PROTEÍNA Ssa2 ............................................ 21
5.5 DIGESTIÓN PROTEOLÍTICA ....................................................................................... 23
5.6 MÉTODOS PARA LA DETECCIÓN DE FIBRAS AMILOIDES ...................................... 24
5.6.1 TINCIÓN ESPECÍFICA DE FIBRAS AMILOIDES ................................... 24
5.6.1.1 Unión Tioflavina – T y Congo Red .................................................. 24
5.6.1.2 Unión a bis-ANS .............................................................................. 25
5.6.2 ANÁLISIS DE LA ESTRUCTURA SECUNDARIA DE Ssa2 .................... 26
5.6.2.1 Dicroísmo Circular (CD) .................................................................. 26
5.6.2.2 Determinación de la Fluorescencia Intrínseca ............................... 27
5.6.2.3 TEM .................................................................................................. 27
5.7 ENSAYO DE TOXICIDAD CELULAR ........................................................................... 28
6. CONCLUSIONES ................................................................................................................ 30
7. BIBLIOGRAFIA ................................................................................................................... 31
ABREVIATURAS
Bis-ANS: Ácido 4,4’-dianilino-1, 1’- binphthyl-5,5’ disulfónico
CR: Congo Red
Da: Daltons
DC: Dicroismo Circular
DO: Densidad Óptica
EDTA: Ácido etilendiaminotetraacético
GPI: Glicosil Fosfatidilinositol
IPTG: isopropil-β-D-1-tiogalactopiranósido
LB: Luria Broth
PDB: Protein Data Bank
PSA: Persulfato de Amonio
SDS –PAGE: Sodio Dodecyl Sulfate Polyacrylamide Gel Electrophoresis
Ssa2: Stahphylococcal secretory antigen
TEM: Microscopía/ Microscopio Electrónico de Transmisión
TEMED: Tetramethylethylenedimine
Th-T: Tioflavina-T
1
1. RESUMEN
Las proteínas después de ser sintetizadas en los ribosomas adquieren una conformación
específica de la cual depende su función biológica. La incapacidad de las proteínas para asumir
dicha conformación puede deberse a mutaciones o factores ambientales que dificultan a la
proteína llevar a cabo su función biológica normal y que pueden resultar en la formación de
agregados produciendo enfermedades en animales y humanos.
Las proteínas tipo prion son capaces de formar agregados, por lo que consideradas
proteínas patógenas por ser transmisibles y causar ciertas enfermedades. Sin embargo existen
proteínas de tipo prion que desempeñan una función biológica.
Actualmente se conocen proteínas prion en humanos, animales y levaduras. Con el fin de
caracterizar proteínas de tipo prion en otros organismos en este trabajo se estudió la proteína Ssa2
de Staphylococcus aureus.
Ssa2 se seleccionó mediante un algoritmo computacional basado en la homología de
secuencias. La proteína fue comparada secuencialmente con la proteína priónica Sup35 de
levaduras, encontrando cierta homología como una estructura basada en un dominio
desestructurado en el extremo N terminal y otro globular. Además, la secuencia N terminal de Ssa2
contiene un alto número de residuos de Triptófano y Asparaginas (7 y 31), característica importante
de las proteínas tipo prion.
La proteína recombinante se obtuvo mediante la clonación de un gen sintético en la cepa
bacteriana E. coli BL21 Codon Plus, y su posterior expresión y purificación mediante cromatografía
de afinidad. Así mismo, la fracción globular de la proteína se cortó y clonó para proceder a su
expresión y purificación con el fin de analizarla por separado.
La caracterización de la capacidad de formar agregados amiloides de la proteína total y del
dominio globular se analizó por métodos computacionales con los programas PASTA y WALTZ y
mediante técnicas específicas como la tinción con Congo Red y Tioflavina-T, obteniendo como
resultados gran tendencia a agregar sugiriendo que Ssa2 puede ser un prion potencial.
2
2. INTRODUCCIÓN
2.1 PLEGAMIENTO PROTEICO
El proceso por el cual una proteína adquiere su conformación funcional una vez sintetizada
en el ribosoma se denomina plegamiento. Este proceso genera estructuras tridimensionales desde
una cadena polipeptídica lineal que posee una secuencia de residuos de aminoácidos particular.
Aunque algunas cadenas polipéptidas adquieren espontáneamente su estado nativo, para otras
proteínas, el plegamiento no se produce sin ayuda y está supervisado por un número de proteínas
auxiliares, tales como catalizadores y chaperonas moleculares, que garantizan un alto grado de
fidelidad en el plegamiento (Ecroyd & Carver, 2008). Errores en el proceso de plegamiento pueden
generar una variedad de condiciones patológicas, ya que las proteínas pueden perder su función y
adquirir propiedades tóxicas.
La proteína en su estado nativo no es estática. Los elementos estructurales secundarios de
los dominios, tanto como los dominios en sí están continuamente moviéndose en el espacio.
Además, las actividades funcionales de las proteínas dependen de varios cambios
conformacionales provocado por la unión de ligandos.
A pesar de ser un proceso relativamente rápido, el plegado de una proteína normalmente
no se produce en un solo paso, sino por el contrario, sucede a través de un número de estados de
plegamiento intermediarios en los que se establecen contactos que son cruciales en la dirección de
la estructura de la proteína correcta (Ecroyd & Carver, 2008). Aquellos estados intermediarios
corresponden a aquella estructura termodinámicamente más estable en condiciones fisiológicas
(Dobson, 2003; Selkoe, 2003).
El proceso plegamiento es reversible. La proteína plegada, cuando sea necesario o cuando se
somete al estrés puede desplegarse parcialmente a estados intermedios.
2.2 AGREGADOS PROTEICOS
A pesar del control celular que existe para asegurar el correcto plegamiento de las
proteínas, se pueden presentar problemas durante el proceso resultando en la formación de
depósitos proteicos de estructura ordenada llamadas fibras amiloides causando enfermedades
3
amiloidogénicas como Alzheimer, Huntington, entre otras (Dobson, 2004; Ecroyd & Carver, 2008).
Los agregados pueden también formar estructuras más densas y desordenadas denominadas
cuerpos de inclusión (Figura 1). Cada enfermedad amilodoigénica involucra la agregación de una
proteína además de otros componentes incluyendo otras proteínas y carbohidratos (Sunde, 1997).
Gracias al estudio de proteínas y péptidos con características amiloidogénicas se ha
revelado que eventos como el cambio en la secuencia de una proteína influyen en la tendencia a
agregar indicando así que la secuencia primaria de las proteínas tiene un rol importante en la
propensión a formar depósitos insolubles (Wurth et al., 2002; Dobson, 2003). Además, propiedades
físico- químicas como la carga, la hidrofobicidad o la capacidad para adoptar conformación β
estarán están involucrados también en dicho proceso (Chiti, 2003).
No toda la secuencia de polipéptido contiene regiones de igual importancia para la
agregación, se han observado fragmentos cortos de aminoácidos que pueden actuar como
inhibidores de la agregación; mientras que otros pueden ser inductores de la misma (Ivanova et al.,
2004; Ventura et al., 2004). Aquellas regiones inductoras que dirigen la agregación tienen una
elevada tendencia a agregar cuando son aisladas, razón por la que se denominan Hot spots.
2.2.1 Fibras Amiloides
Las fibras amiloides son agregados ordenados de una proteína o péptido. Más de 20
péptidos y proteínas se han identificado en fibrillas amiloides in vivo (Nilson, 2004). En algunos
Figura 1. Proceso de plegamiento de las proteínas pasando por
estados intermedios. Desde el estado intermediario pueden
formar agregados ordenados como las fibras amiloides
agregados desordenados resultando en precipitaciones (Ecroy et
al, 2008)
4
casos, estas proteínas no están involuvradas en enfermedades amiloidogénicas lo que hace
pensar que la habilidad para formar estructuras amiloides es un característica intrínseca de las
cadenas polipetídicas y que cualquier proteína en condiciones apropiadas podría conseguir formar
fibras amiloides (Dobson, 2003).
A pesar de las diferencias en el tamaño, la estructura nativa y función de proteínas
amiloides, todas las fibrillas de amiloides son de duración indeterminada, tienen aproximadamente
70 a 120Å (Figura 2) de diámetro, y muestran birrefringencia verde cuando se ven en la luz
polarizada después de la tinción con Congo Red (Sunde & Blake, 1997; Makin & Serpell, 2005).
El proceso de agregación implica la formación de especies oligoméricas como resultado de
interacciones relativamente no específicas. Los primeros agregados observados son estructuras
descritas como pequeños agregados amorfos o micelas. Éstos parecen transformarse después en
estructuras con morfologías más distintivas descritas como protofilamentos o protofibrillas que son
generalmente cortas, espiraladas y delgadas (Dobson 2003; Dobson 2004).
Las fibras amiloides son transmisibles produciendo patologías como en el caso de las
formadas por el prion Scrapie. Existen además otras proteínas que forman las fibras que son
putativamente transmisibles como Tau, Hungtinina y Aβ que provocan Taupatias, la enfermedad de
Hungtinton y Alzheimer respectivamente. Sin embargo, otras proteínas amiloideas pueden
transmitir funciones biológicas como es el caso de Sup35 (Soto, 2012).
Existen métodos específicos para identificar la presencia de estas fibras. Las estructuras
amiloides pueden ser detectas mediante tinción específica con Tioflavina –T (Th-T) y Congo Red
(CR). Sin embargo la formación de estas estructuras es comprobada también mediante
microscopía electrónica de transmisión y dicroísmo circular.
Figura 2. Microscopia electrónica de transmisión de fibras
amiloides teñidas. Se pueden observar fibras largas y no
ramificadas de 100Å aproximadamente. (Makin, O. S. & Serpell, L.
C. 2005).
5
2.3 PROTEÍNAS PRION
Los priones, descubiertos primero en hámsters (Prusiner 1982), son definidos como
proteínas patógenas infecciosas causantes de un grupo de enfermedades neurodegenerativas
(encefalopatías espongiformes transmisibles); y que a diferencia de virus y viroides, son
resistentes a tratamientos inactivantes de ácidos nucleícos ya que carecen de ellos (Glover et al,
1997).
Existen proteínas priones que son constituyentes normales de algunas membranas
celulares como las de las neuronas del sistema nervioso central o membranas del tejido linfoide. El
prion patógeno, denominado PrPSc, como otros priones patógenos se caracterizan por ser muy
resistentes a proteasas y tener una estructura en hoja β. El alto porcentaje de hojas β presente en
la proteína prion le proporciona la característica de no ser soluble en detergentes no
desnaturalizantes y de formar fibras amiloides con frecuencia (Collinge, 2001; Apetri, 2004).
Los proteínas prion están presentes en varios organismos como en humanos y ovejas
causando patogenicidad o en levaduras cumpliendo una funcional biológica como es el caso de
Sup35.
2.3.1 Sup35
La Sup35 es una proteína de levadura formada por 685 residuos que pertenece a una
familia de proteínas estructurales designadas como factores de liberación de cadenas
polipeptídicas en eucariotes (eRF3). Esta proteína está compuesta por dos dominios: los primeros
123 residuos correspondientes al dominio N terminal constituyen un dominio de tipo prion; es decir
que produce fibras amiloides y además es transmisible, aunque no es homóloga a las proteínas
priónicas de mamíferos. Mientras que el dominio C terminal que es altamente conservado es
estructuralmente similar al factor de elongación EF-1α y es necesario para la viabilidad celular
(Balbirnie et al., 2000; Pauskin et al., 1997).
6
2.3.2 Staphylococcal secretory antigen (Ssa2)
Ssa2 es una proteína secretada subcelularmente por la bacteria S. aureus, que tiene 269
aminoácidos y un peso molecular de 29650Da (http://uniprot.org/uniprot/Q2G2J2) Su función
todavía a no es conocida, sin embargo; por similitud con otras proteínas de la misma familia se
deduce que es una proteína inmunogénica, involucrada en procesos de virulencia que contiene un
dominio peptidasa C51 y un dominio CHAP.
La secuencia aminoacídica de Ssa2 es:
MKKIATATIA TAGFATIAIA SGNQAHASEQ DNYGYNPNDP TSYSYTYTID AQGNYHYTWK
GNWHPSQLNQ DNGYYSYYYY NGYNNYNYNN YNNGYSYNNY SRYNNYSNNN QSYNYNNYNS
YNTNSYRTGG LGASYSTSSN NVQVTTTMAP SSNGRSISSG YTSGRNLYTS GQCTYYVFDR
VGGKIGSTWG NASNWANAAA RAGYTVNNTP KAGAIMQTTQ GAYGHVAYVE SVNSNGSVRV
SEMNYGYGPG VVTSRTISAS QASSYNFIH
Staphylococcus aureus es un patógeno humano que causa diversas enfermedades desde
abscesos en la piel hasta enfermedades invasivas severas. Vive en la piel, en membranas
mucosas de animales de sangre caliente y sobre casi cualquier superficie incluyendo el agua.
Esta bacteria es un coco Gram positivo agrupado en forma de racimo; mide de 0,5 a 1,5μm
de diámetro; es móvil; anaerobio facultativo y fermentador de glucosa. La mayoría crece en
presencia de 15% a 40% de sal (Bergey, 2007; Deuremberg & Stobberingh, 2008).
2.3.3 DOMINIOS CHAP
El dominio CHAP (cysteine, histidine- dependent amidohydrolases/peptidases) es una
región entre 110 a 140 aminoácidos que se encuentra involucradoa en procesos de unión y división
de peptidoglicanos, y está presente en gran variedad de proteínas de bacterias, bacteriófagos,
Archea y otros organismos. En bacterias está comúnmente asociado con el dominio SH3 (Bateman
& Rawlings, 2003).
7
Muchas de las proteínas que contienen este dominio no están caracterizadas, sin embargo,
se cree que su función es la hidrólisis de peptidoglicanos. Además, se ha sugerido que las
proteínas que lo contienen utilizan un residuo de cisteína catalítico en un mecanismo de ataque
nucleofílico. Los primeros estudios realizados en este dominio sugirieron que tiene una estructura
α + β. Estando su región N terminal compuesta por hélices α y su región C terminal por hojas β
(Rigden et al., 2003; Bateman & Rawlings, 2003; http://pfam.sanger.ac.uk).
2.4 MODELAJE DE LA ESTRUCTURA PROTEÍCA
El Modelaje de estructuras proteicas es un método por el cual se pueden generar modelos
3- D reales de proteínas que comparten una secuencia similar con proteínas cuyas estructuras son
conocidas. La mayoría de algoritmos diseñados usan el Protein Data Bank (PDB) para derivar sus
modelos, usando relaciones observadas entre trozos cortos de secuencia contigua y estructura
secundaria.
2.4.1 SWISS-MODEL
Swiss Model utiliza una librería de estructuras dianas experimentales para alinearlas con
secuencias plantilla significantemente similares con la proteína conocida, la plantilla más similar es
escogida. Basado en el alineamiento entre la secuencia de la proteína diana y la estructura de la
plantilla, las coordenadas del modelo se construyen para las regiones del modelo estructuralmente
conservadas. Los residuos correspondientes a las inserciones y deleciones en la alineación de la
secuencia diana tienen que ser modelados de novo sin utilizar información de la plantilla. Después
de aplicar mecanismos moleculares limitados basados en la minimización de la energía para
regularizar la geometría de los modelos, se utilizan métodos de estimación de modelos de calidad
para detectar los posibles errores e imprecisiones (Guex N, et al., 2009).
8
3. OBJETIVOS
Identificar y caracterizar la proteína Ssa2 de Staphylococcus aureus mediante su
clonación expresión y purificación.
Caracterizar la capacidad de formar agregados amiloides por métodos
computacionales y prácticos.
Comprobar el comportamiento priónico de Ssa2 mediantes técnicas específicas
para el análisis de agregación.
4. MATERIALES Y MÉTODOS
4.1 MÉTODOS BIOINFORMÁTICOS
4.1.1 Modelaje de la estructura proteica
El algoritmo computacional de modelaje usado en esta investigación fue SWISS-MODEL
con el fin de obtener una estructura modelo de la proteína estudiada en base a la secuencia de la
proteína Sup35, que posee una fracción desestructurada y otra globular, ya que estas se
asemejan secuencialmente.
4.1.2 Análisis de propensidad de agregación
a) PASTA
Este método PASTA (Trovato et al, 2006; http://protein.cribi.unipd.it/pasta/) predice
regiones propensas a la agregación en función del apareamiento en forma de hoja β de dos
cadenas polipeptídicas idénticas. Partiendo de la secuencia, el algoritmo calcula la energía teórica
de apareamiento empleando un potencial de apareamiento basado en la tendencia del residuo a
formar hojas β. Cuando para un apareamiento se calcula una energía inferior a un valor umbral los
fragmentos proteicos implicados son identificados como propensos a agregar.
b) WALTZ
El algoritmo WALTZ (http://waltz.switchlab.org/) utiliza una matriz de puntaje de posición
específica deducida del análisis biofísico y estructural de las propiedades amiloides de un gran
9
conjunto de hexapéptidos a distinguir entre secuencias de agregación amiloides o amorfas Este
método se basa en que los hexapéptidos pueden formar fibrillas amiloides por sí mismo y en que la
inserción de una larga secuencia amiloidogénica de seis residuos en una proteína soluble es
suficiente para inducir la agregación en fibrillas amiloides (Castillo et al., 2011).
4.2 MÉTODOS DE DNA RECOMBINANTE
4.2.1 Clonación
Para la obtención de la proteína Ssa2 recombinante se realizó la clonación de un gen
sintético correspondiente a su secuencia desde el vector pUC57, adquirido comercialmente, al
vector pET 28-B para su posterior transformación a la cepa de expresión E.coli BL21 Codon Plus.
El vector pET 28-B (Figura 3), es un vector de expresión que posee varios sitios de
restricción, tiene un tamaño de 5368 pb y contiene el gen de resistencia a kanamicina. Además
contiene una cola de Histidinas que facilita la purificación de la proteína.
Cada vector se transformó en la cepa de clonaje E.coli XL1-Blue con resistencia a
Ampicilina en el caso de pUC57 y resistencia a Kanamicina en el de pET 28-B. Para comprobar
que los vectores se clonaron correctamente se realizó la respectiva extracción de DNA plasmídico
Figura 3. Mapa del Vector pET28B (5568 pB).
10
siguiendo el protocolo del kit GeneJet Plasmid Miniprep (Fermentas Life Sciences); y se los
observó en geles de agarosa 0,8%.
Comprobada la correcta clonación de los vectores, se realizó su digestión con las enzimas
XhoI y NcoI durante dos horas a 37°C en las siguientes proporciones:
pUC57-SSA2 (7µg/µL) 7µL pET 28-B (2,2µg/µL) 9µL
XhoI 10u/ µL 1µL XhoI 10u/µL 1µL
NcoI 10u/µL 1µL NcoI 10u/ µL 1µL
Agua 7µL Agua 5µL
buffer tango 10x 4µL buffer tango 10x 4µL
La comprobación de la digestión se realizó cargando 10µL del producto digerido en geles
de agarosa 2%. A continuación se cortaron del gel las bandas correspondientes al gen de Ssa2 y
se las purificó con el kit GFTTM
PCR and Gel Band Purification Kit, siguiendo las instrucciones del
fabricante (GE HealthCare).
Para la inserción del fragmento de interés en pET28-B, se desfosforiló al vector (20µL
pET28 b, 1µL CIP y 2µL buffer 10x) durante 30 minutos a 37°C dicha reacción se detuvo con 1µL
fosfatasa (1u/µL) a 75° C durante dos minutos.
Se ligó el vector con el inserto durante 1h a 16°C. Se confirmó la presencia del vector con
el inserto mediante digestión con las enzimas anteriormente utilizadas y su posterior separación
por electroforesis en gel de agarosa 2%. El vector conteniendo 7,5µL de inserto se transformó en
las células competentes de E. coli BL21 Codon Plus.
La concentración de DNA se determinó mediante espectrofotometría, en el
espectrofotómetro libre de cubeta NanoDrop, para lo cual se necesitó 1µL de DNA. La longitud de
onda se fijó a 260 nanómetros.
11
4.2.2 Transformación de células competentes de E. coli Codon Plus
La transformación de células competentes E.coli BL21 Codon Plus se realizó por choque
térmico, procediendo de la siguiente manera:
Se añadió 1µg del plásmido pET 28-B – Ssa2 en 100µL de células competentes y se dejó
incubar en hielo durante 30 minutos. Pasado este tiempo se realizó el choque térmico colocando
las células competentes en baño a 42°C durante dos minutos y transfiriéndolas en hielo durante
cinco minutos. Se añadió 900µL de medio LB y se las incubó una hora a 37°C en agitación. A
continuación se centrifugó la muestra durante 3 minutos a 3000 RPM, se extrajo 900µL del
sobrenadante y se resuspendió el pellet en los 100µL restantes. Para finalizar se sembraron las
células en una placa de LB con Kanamicina y se incubaron las placas a 37°C overnight.
4.3 EXPRESIÓN Y PURIFICACIÓN DE LA PROTEÍNA Ssa2
4.3.1 Medios de cultivo y antibióticos
Para la realización de los cultivos se prepararon los medios de cultivo Luria Broth (LB) y
agar bacteriológico americano (Laboratorios CONDA S.A.), según la formulación siguiente:
LB liquido: 10g triptona, 10g Cloruro de Sodio, 5g extracto de levadura /L H2O destilada
Agar: 10g triptona, 10g Cloruro de Sodio, 5g extracto de levadura/L H2O destilada con Agar
bacteriológico 1,5% pH 7.
Los antibióticos utilizados fueron Kanamicina y Cloranfenicol (Sigma), a una concentración
de 100µg/mL.
4.3.2 Condiciones del cultivo
Los cultivos de E.coli BL21 Codon Plus en medio líquido se dejaron crecer en una
incubadora Multriton Estándar (Insfors HT) con agitación constante de 250 RPM a 37°C durante 12
horas.
12
4.3.3 Crecimiento de cultivos e Inducción de expresión proteica
Para la expresión de la proteína de interés se realizó un cultivo LB a partir de una colonia
de células BL21- Codon Plus que contenía el plásmido con el inserto clonado.
Para determinar el crecimiento bacteriano se utilizó el método de dispersión de luz, el cual
permite conocer la cantidad de bacterias presentes en el cultivo a partir de la medida de densidad
óptica (D.O) a 600nm.
El medio de cultivo que contenía una dilución 1/100 de cada antibiótico (kanamicina y
cloranfenicol), se incubó a 37°C en agitación hasta alcanzar una D.O. entre 0.5 y 0.7. Una vez
alcanzada la D.O. mencionada, se indujo la expresión proteica añadiendo 1mM IPTG durante 4h.
Los cultivos se centrigufaron después de la inducción a 4500 RPM durante 30 minutos.
Obtenido el pellet, éste se resuspendió en 30mL de tampón nativo por litro de cultivo (50mM Tris
HCl, 100mM NaCl pH7.5 con 6M de Cloruro de Guanidina).
A continuación los cultivos se sonicaron durante 30 minutos a 70% de intensidad con
intervalos de un segundo y centrifugados nuevamente a 20000 RPM durante 20 minutos para
obtener el sobrenadante el cual fue sonicado 10 minutos más y filtrado en filtros de 0,45mm
(Millipore), para proceder a la purificación.
4.3.4 Purificación de la proteína SsaA2 mediante cromatografía de afinidad
Se purificó la proteína Ssa2 y la parte globular mediante cromatografía de afinidad usando
columnas Histrap HP de 5mL (GE HealthCare) pre-empaquetadas con sefarosa de níquel que
sirven para la purificación de proteínas que poseen una cola de histidinas.
La columna se equilibró pasando 10 volúmenes (50mL) de binding buffer (5mM Imidazol;
0.5 NaCl; 6M GndHCl), a una velocidad de flujo de 3mL/minuto. Y 10 volúmenes de tampón Histrap
1 (20mM Tris HCl pH 8; 0,5M NaCl; 20mM Imidazol; 6M Gnd HCl), a una velocidad de flujo de
3mL/minuto.
Una vez equilibrada la columna se cargó la proteína previamente filtrada a una velocidad
de flujo de 1mL/min, seguido, se lavó la columna con 10 volúmenes de Histrap 1, y finalmente se
13
eluyó la proteína en 3 volúmenes de tampón Histrap 2 (50mM Tris HCl; 0,5M NaCl; 500mM
imidazol y 6M Gnd HCL).
4.3.5 Preparación de las muestras para los geles de Acrilamida-Bis-Acrilamida
Para comprobar la correcta expresión de la proteína se prepararon diferentes muestras de
los cultivos antes y después de la inducción con IPTG.
Como control negativo se tomó 1mL de cultivo antes de añadir IPTG, la muestra fue
centrifugada durante 15 minutos a máxima velocidad y el pellet obtenido se resuspendió en tampón
nativo (50mM Tris HCl pH7.5, 100mM NaCl, 1mM EDTA).
En cuanto al cultivo inducido, se tomó una muestra de 1 mL del cual se separó 100 µL que
sería el extracto total, el resto de la muestra fue sonicada por un minuto al 70% y luego
centrifugada 15 minutos a 13000 RPM. Se separó el sobrenadante y el pellet se resuspendió en
tampón nativo.
Para comprobar la purificación de la proteína se tomaron muestras de la proteína antes de
purificarla, después de cargarla en la columna, del lavado y de la elución en un volumen de 100 µL
cada una. Se añadió 30µL de tampón de carga 3X pH 6.8 (Tris 180mM, Glicerol 30%, SDS 9%, β-
mercaptoetanol 15%, azul de bromo fenol 0.05%) y se calentó las muestras durante 10 minutos a
90°C.
4.3.6 Determinación de la concentración proteica
Una vez obtenidas las proteínas se determinó su concentración mediante
espectrofotometría. Para calcular la concentración se aplicó la ley de Lambert-Beer a una longitud
de 280nm.
C= DO280/Ɛ280 . d
Donde C equivale a la concentración de la proteína, DO280 es la absorbancia de la muestra
a 280 nm. Ɛ280 el coeficiente de extinción molar (M-1
cm-1
) para la proteína de interés a la misma
longitud de onda y d el ancho del paso de la luz en cm. En nuestro caso Ɛ280 78620 ml/mg.cm.
14
También se midió la absorbancia a 320nm, que proporciona información de scattering de la
muestra, para determinar la concentración de posibles agregados presentes en las muestras. De
esta manera se resta el valor de DO320 a DO280 con el fin de determinar la concentración de
proteína soluble total.
4.4 MÉTODOS ELECTROFORÉTICOS
4.4.1 Electroforesis en Geles de Agarosa
Los geles de agarosa se prepararon al 2% para la visualización de los productos de
digestión, y al 0,8% para comprobar la clonación de los vectores. El producto de digestión se cargó
en los pocillos del gel en un volumen de 10µL.
Una vez preparada la agarosa se la vertió en la cubeta añadiendo 1,5µL de Bromuro de
Etidio. El gel polimerizado se colocó en la cubeta de recorrido, la cual se aforo con Tampón TAE
1X. Los geles corrieron a 95V durante 30 minutos.
TAE 1X: Gel Agarosa 2%
40mM Tris acetate 5g Agarosa
1mM EDTA 500mL TAE 1X
4.4.2 Electroforesis SDS- PAGE
El método electroforético usado fue la electroforesis SDS-PAGE, que se basa en la
separación de las moléculas en función de su carga y su peso molecular aplicando un campo
eléctrico externo.
En nuestro caso se realizaron geles de Acrilamida - Bis- Acrilamida (37,5:1) al 15% con la
siguiente composición:
Gel
Concentrador
Gel Separador
Acrilamida (40%
Acrilamida/Bisacrilamida)
0,225mL 1,87mL
Solución B --- 1,25mL
15
(1.5 M Tris
0.4% SDS)
Solución C
(0.46 M Tris
0.4% SDS)
0,5mL ---
Agua destilada 1,27mL 1,87mL
PSA 22,2µL 20 µL
TEMED 2µL 5 µL
Para correr los geles se preparó la cubeta del kit de electroforesis y se la aforó con tampón
de recorrido 1X (Stock 10X: 12g Tris; 57,6g Glicina; 4g SDS). Los geles se corrieron a 20mA
durante 2 horas.
4.4.3 Tinción y Destinción de los Geles
Los geles se tiñeron durante 10 – 15 minutos aproximadamente, mediante inmersión en
Azul de Comassie preparada con la siguiente composición:
2 pastillas PhastGel BlueTM
(Amersham Biosciences)
360mL Agua destilada
180mL Metanol
60mL Ácido Acético
Posteriormente los geles se sumergieron en solución de destinción (20% metanol, 7,5%
ácido acético).
4.5 DIGESTIÓN PROTEOLÍTICA
Para este ensayo 5 µL de Ssa2 total y 5 µL de su fracción globular en tampón 50mM
NaAc/ 100mM NaCl se digirieron con 1µg proteinasa K y se incubaron a 37°C en baño. Las
alícuotas se removieron a diferentes intervalos de tiempo y la reacción se paró añadiendo 50µL de
tampón de carga 3X. Seguidamente las muestras se calentaron durante 10 minutos a 90°C, y
cargaron en geles de electroforesis 15% SDS-PAGE para observar la digestión de la proteína.
16
4.6 MÉTODOS BIOFÍSICOS
4.6.1 Tinción específica de fibras amiloides
El uso de compuestos que se unen específicamente a las estructuras amiloides es una de
las técnicas más comunes para su detección. Dos de los más utilizados son el Congo Red (CR) y
la Tioflavina- T (Th-T), sin embargo todavía no se conoce como estos compuestos interaccionan
con dichas estructuras.
4.6.1.1 Unión de Tioflavina – T
El ensayo de Tioflavina se llevó a cabo utilizando 10µM de proteína total y 10µM de la
fracción globular; y 25µM Th-T (Stock 250µM). De esta manera, 50uL de proteína (Stock 20µM) se
mezclaron con 40µL tampón 50mM NaAc/100mM NaCl pH7.5 y 10µL de Th-T para alcanzar un
volumen de 100µL. La mezcla se incubó 5 minutos a temperatura ambiente. Los espectros de
fluorescencia se recogieron en un equipo Jasco SpectroFluorometer FP 8200. La longitud de onda
de excitación se fijó a 445nm y se registró el espectro de emisión entre 460 y 570nm. La apertura
de la rejilla de excitación se fijó en 5nm, mientras que la de la rejilla de emisión en 10nm.
4.6.1.2 Unión de Congo Red
Se mezcló 100µL de proteína, 20µL de CR (250µM) y 80µL de tampón (50mM
NaAc/100mM NaCl pH 7.5). Las muestras se incubaron durante 5 minutos a temperatura ambiente.
La unión del CR a las fibras amiloides se midió mediante espectrofotometría utilizando un
espectrofotómetro de luz UV- visible CARY 400 B-10. Se recogió el espectro de absorción del CR,
de la proteína Ssa2 completa y la fracción globular antes y después de añadir CR en el intervalo de
longitudes de onda comprendido entre 380 y 650nm.
4.6.1.3 Unión de Bis-ANS
Para alcanzar un volumen final de 200µL se mezcló 99µL de proteína total o de fracción
globular, 1µL de solución bis-ANS 200µM y 100µL (50mM NaAc/100mM NaCl pH7.5). Los
espectros de fluorescencia se recogieron en un equipo Jasco SpectroFluorometer FP 8200. La
17
longitud de onda de excitación se fijó en 370nm mientras que los espectros de emisión de
fluorescencia se midieron entre 400- 600nm. La apertura de la rejilla de excitación se fijó en 5nm,
mientras que la de la rejilla de emisión en 10nm.
4.6.2 Dicroísmo Circular
Se utilizó un equipo UV-Vis JASCO J-715. Se utilizaron cubetas de 1mm Los espectros de
la proteína total y de la fracción globular a una concentración de 20µM en tampón 50mM
NaAc/100mM NaCl pH7.5 se recogieron en un rango de longitud de onda entre 290 y 250nm.
Cada espectro se obtuvo a partir de la media de 10 registros.
4.6.3 Determinación de Fluorescencia Intrínseca
El seguimiento de la variación de la señal intrínseca respecto a la temperatura de 20µM de
Ssa2 total y de 20µM de la fracción globular de Ssa2 en tampón 50mM NaAc/100mM NaCl pH7.5
se realizó utilizando un espectrofluorímetro Jasco SpectroFluorometer FP 8200. Los registros de
emisión de fluorescencia se recogieron empleando una longitud de onda de emisión en un intervalo
desde 300 a 400nm y excitando a una longitud de onda de 280nm, aplicando un incremento de
temperatura de 1°C/min desde 30°C hasta 95°C. La apertura de la rejilla de excitación se fijó en
5nm, mientras que la de la rejilla de emisión en 10nm.
4.6.4 Microscopia electrónica de transmisión (TEM) para la visualización de fibras
amiloides.
Para visualizar los agregados formados por la proteína Ssa2 se prepararon muestras de
Ssa2 agregada y la fracción globular de Ssa2 soluble en tampón 50mM NaAc/100mM NaCl pH7.5.
Se sometió cada muestra a tinción negativa con acetato de uranilo. Se añadió 10µL de proteína
total y de fracción globular 10µM, sobre una rejilla de cobre cubierta con carbón y se dejó reposar
durante 5 minutos. A continuación se aplicó acetato de uranilo al 2% (w/v) para teñir las muestras.
Finalmente las muestras se analizaron en el TEM a un voltaje de 75kV. en un microscopio
electrónico de transmisión modelo HITACHI H-7000.
18
4.6.5 Ensayo de Citotoxicidad Celular
Para realizar el ensayo de citotoxicidad se utilizó el Kit EZ4U (Biomedica Gruppe).
Siguiendo el protocolo del kit se sembraron 3*103 células Hela en 200µL medio DMEM en cada
pocillo de una placa de 96 pocillos, al cultivo se añadió la proteína Ssa2 total en un rango de
concentraciones de 0, 0.1, 0.5, 1 2, 5, 10, 20 y 40µM; y la fracción globular en un rango de
concentraciones de 30, 40 y 80µM. La placa se incubó en una atmósfera con 5% CO2 durante 48
horas a 37°C.
Después de 48 horas se añadió 20µL de substrato ((3H-Timidina) a cada pocillo y se
incubó la placa nuevamente por 45 minutos a 37°C. La absorbancia del producto de cada pocillo
se determinó en un Fluorímetro Victor3 (Perkin Elmer) a 450, 490 y 620nm.
5. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
5.1 CLONACIÓN DE Ssa2 en el VECTOR pET 28-B
El resultado de la digestión del vector pUC-57 que contenía la secuencia de Ssa2 (Figura
4A), se observan los vectores digeridos y no digeridos, y la banda correspondiente al DNA de
Ssa2. Después de cortar las bandas, purificar el DNA, ligar el vector con el inserto y realizar la
digestión se obtuvo el clon de Ssa2 en pET 28B tal y como se observa en la figura 4B.
pUC57-Ssa2 pET 28-B
M D ND D ND
Figura 4. Electroforesis en Gel de agarosa 2%. (A) Digestión depUC57- Ssa2 y pET 28B con las enzimas XhoI Y
NcoI. (B) Digestión del pET 28B con las enzimas XhoI y NcoI.
pET 28B
M D ND D ND D ND
A B
19
5.2 ALINEAMIENTO DE SECUENCIAS SIMILARES Y MODELAJE DE LA
ESTRUCTURA PROTEICA DE Ssa2
Las secuencias del extremo N terminal de Sup35 y Ssa2 se compararon con el fin de
encontrar alguna similitud entre ellas. Al alinear las secuencias se encontró que las dos proteínas
son en efecto similares y que Ssa2 contiene un alto contenido en triptófanos (Q= 7) y asparaginas
(N= 31), aminoácidos frecuentes en las proteínas tipo prión.
Una vez realizada la comparación entre secuencias, se analizó la secuencia de Ssa2 con el
programa Foldindex que es un predictor de orden y desorden que permite relacionar la secuencia
con el modelo predicho. Los resultados indicaron que Ssa2 posee dos dominios; uno
desestructurado y otro globular al igual que Sup35. Según Foldindex en la figura 5 se observa que
desde el aminoácido 29 al 159, que corresponden al extremo N terminal de la proteína, los
residuos aminoacídicos están “desordenados", mientras que el fragmento globular muestra una
estructura plegada.
A
B
1 MKKIATATIA TAGFATIAIA SGNQAHASEQ DNYGYNPNDP TSYSYTYTID
51 AQGNYHYTWK GNWHPSQLNQ DNGYYSYYYY NGYNNYSYNN YNNGYSYNNY
101 SRYNNYSNNN QSYNYNNYNS YNTNSYRTGG LGASYSTSSN NVQVTTTMAP
151 SSNGRSISSG YTSGRNLYTS GQCTYYVFDR VGGKIGSTWG NASNWANAAA
201 RAGYTVNNTP KAGAIMQTTQ GAYGHVAYVE SVNNNGSVRS EMNYGYGPGV
251 VTSRTISASQ AAGYNFIH
Figura 5. (A) Análisis de plegamiento y desplegamiento de
la proteína Ssa2 según la predicción de Foldindex. En rojo
la estructura desplegada (N terminal). En verde la
estructura plegada (C terminal). (B) secuencia primaria de
la proteína Ssa2 completa. En recuadro azul claro los
residuos correspondientes al dominio globular
20
Una vez realizada la comparación entre secuencias se procedió al modelaje de la
estructura proteica con el programa SWISS MODEL (Figura 6).
.
Además, se encontró que SsA2 tiene un dominio CHAP que se encuentra en la región de
los residuos 157 a 266. Este dominio puede ser un determinante de patogenicidad de la bacteria ya
que también se encuentra en otras proteínas que participan en el proceso de infectividad.
5.3 ANÁLISIS DE LA PROPENSIÓN DE AGREGACIÓN
Las secuencias Ssa2 y su fragmento globular se ingresaron en los programas PASTA Y WALTZ
para analizar la tendencia a agregar de la proteína. En la figura 7A se observa que según el
análisis con WALTZ la región N terminal (recuadro verde) posee varias regiones amiloidogénicas al
inicio y al final de la secuencia aminoacídica. Mientras que la región C terminal de la proteína
(recuadro azul) presenta también regiones amiloidogénicas pero en un menor número. Estos
resultados son similares a los obtenidos con el predictor PASTA (Figura 7B).
Figura 6. Modelo de la estructura de Ssa2
obtenido mediante el programa SWISS
MODEL
21
5.4 EXPRESIÓN Y PURIFICACIÓN DE LA PROTEÍNA Ssa2
Después de la expresión de la proteína Ssa2 completa y del dominio globular (residuos
153-260), en la cepa E.Coli BL21 Codon Plus y de lisar las células; se determinó la solubilidad de
la proteína analizando la muestra total y las fracciones soluble e insoluble de las muestras
mediante 15% SDS-PAGE.
Como se puede observar en la figura 8A, antes de inducir la expresión no aparece la banda
correspondiente a Ssa2, que se esperaba tenga un peso de 29650Da, mientras que después de la
inducción de la expresión con IPTG la muestra total (T) y la fracción insoluble (I) expresan la
proteína deseada (≈29kDa). En la fracción soluble no hay presencia de la misma.
Para determinar si hemos purificado la Ssa2 mediante la cromatografía de afinidad, se
realizó un perfil de las distintas etapas de purificación (Figura 8B). En la muestra inicial, flow trough
y lavado se observa la presencia de varias proteínas, incluyendo la de interés. Sin embargo, en el
eluido se observa solamente la presencia de Ssa2, indicando así que se logró obtenerla de forma
pura.
Figura 7. Predicción de Agregación de la proteína Ssa2. (A)Predicción con WALTZ. (B) Predicción con PASTA.
En recuadro verde se observa la predicción para la región N terminal. Enmarcado en azul la predicción para la
región globular
A B
22
Figura 8. Gel 15% SDS- PAGE. (A) Expresión de Ssa2 en el extracto total (T) y la fracción insoluble (I). (M)
Marcador Molecular, (S.I.) Sin inducir, (T) Total, (S) Soluble, (I) Insoluble (B) Perfil cromatográfico de Ssa2 después de ser
purificada con una columna His Trap: (M) Marcador molecular, (IN) Fracción inicial, (F) Flow trough, (L) Lavado, (E) Eluido.
La proteína se observa en las distintas etapas de la purificación.
El fragmento globular de la proteína (153-260) tiene un peso molecular de
aproximadamente 11 kDa y también se detecta en las fracciones total e insoluble (Figura 9A).
El fragmento globular se pudo obtener de forma pura, es decir no se detectaron otras
proteínas después del la purificación en la muestra eluida. En la muestra inicial, flow trough y
lavado se observa la presencia de varias proteínas que no se engancharon a la columna,
incluyendo la de interés (Figura 9B).
KDa
55 45 36 29 24 20.1
M IN F L E M S.I T S I A
B
B
KDa
55 45 36 29 24 20.1
23
Figura 9. Gel 15% SDS- PAGE. (A) Expresión de la fracción globular de Ssa2 en el extracto total (T) y la fracción
insoluble (I). (M) Marcador Molecular, (S.I.) Sin inducir, (T) Total, (S) Soluble, (I) Insoluble (B) Perfil cromatográfico de la
fracción globular de Ssa2 después de ser purificada con una columna His Trap. (M) Marcador molecular, (IN) Fracción
inicial, (F) Flow trough, (L) Lavado, (E) Eluido. La proteína se observa en las distintas etapas de la purificación
.
5.5 DIGESTIÓN PROTEOLÍTICA
Los experimentos de proteólisis limitada son utilizados para determinar las características
conformacionales de las proteínas (Fontana el al., 2004)
Tras haber tratado la proteína Ssa2 total agregada con proteinasa K y calor, se observaron
diferentes fragmentos (Figura 10A). Dos fragmentos de 66 y 55 KDa respectivamente que están
presentes desde el minuto 0 hasta el minuto 30 después de iniciada la proteólisis.
La proteólisis de la fracción globular de la proteína se inicia al primer minuto después de
ser tratada con proteinasa K. En la figura 10B se observa un fragmento de 16kDa
aproximadamente en la muestra sin proteinasa K (minuto 0), que se muestra en muy baja
intensidad después del minuto 1 y a partir segundo minuto desaparece totalmente. En cuanto a la
banda correspondiente a 14 kDa de peso, ésta se mantienen durante los 30 minutos de tratamiento
pero en menor intensidad desde el minuto 1 hasta el 30 comparada con el minuto 0 de exposición.
En los minutos 2 y 5 se observa un fragmento de aproximadamente 6kDa que baja su intensidad
desde el minuto 10 hasta el 30.
Generalmente la proteólisis ocurre preferencialmente en sitios localizados de la proteína en donde
existe flexibilidad y donde hay la presencia de hojas β.
KDa
55 45 36 29 24 14
KDa
55 45 36 29 24 14
M IN F L E A
D
M S.I T S I
B
24
Figura 10. Gel 15% SDS- PAGE: Proteólisis limitada de Ssa2 completa y su fracción globular con proteinasa K. (A) La
proteína completa se encuentra digerida en 4 fragmentos desde el minuto 0 hasta el. Desde el minuto 10 hasta el 30 la
proteína ha sido proteolizada solamente en tres fragmentos. (B) La fracción globular presenta al minutos 0 dos fragmentos.
A partir del minuto 1 hasta el final del experimento se observan dos fragmentos de diferentes pesos moleculares que
reducen su intensidad.
5.6 MÉTODOS PARA LA DETECCIÓN DE FIBRAS AMILOIDES
5.6.1 TINCIÓN ESPECÍFICA DE FIBRAS AMILOIDES
5.6.1.1 Unión Tioflavina – T y Congo Red
La Tioflavina y el Congo Red son agentes de tinción comúnmente usados para la detección
de fibras amiloides.
Los ensayos de Tioflavina-T se emplearon para estudiar el desarrollo de la formación de
estructuras ordenadas como las fibras amiloides ya que al interactuar con este tipo de agregados
aumenta la fluorescencia de la molécula desplazando el máximo de emisión de 415nm a un
máximo de 450nm. De esta manera al tratar la proteína total y la fracción globular con dicho
colorante, se observó (Figura 11A y 11B) un aumento en la intensidad fluorescencia encontrando el
valor máximo a 487nm.
KDa
66 55 45 36 29 24 20.1 14
6
M 0’ 0’ 1’ 2’ 5’ 10’ 15’ 30’
KDa
66 55 45 36 29 24 20.1 14 6
A B M 0’ 1’ 2’ 5’ 10’ 15’ 30’
25
Figura 11. Espectro de Emisión de la fluorescencia de Ssa2 con Th-T. (A) Unión de la proteína total a Th-T (B) Unión del
fragmento globular de Ssa2 a Th-T
En cuanto al ensayo de unión a Congo Red en las figuras 12A y 12B se puede ver que hay
un desplazamiento del espectro del CR de la muestra cuando el congo red se une a la proteína,
respecto a la proteína sola. Por lo tanto estos resultados sugieren una estructura amiloide para los
agregados formados por Ssa2 y su fracción globular.
Figura 12. Espectro de absorción de Ssa2 a CR (A) Unión de Ssa2 total a CR (B) Unión de CR al fragmento globular de
Ssa2.
5.6.1.2 Unión a bis-ANS
El anión 1-anilino-8-naftaleno sulfonato (ANS) permite la detección de las fibras amiloides
gracias a su unión con las regiones hidrofóbicas de las proteínas mediante sus grupos polares.
Dicha unión favorece el aumento de la intensidad de la fluorescencia del bis- ANS.
0
100
200
300
400
500
600
700
460 480 500 520 540 560
Flu
ore
sce
nci
a
Longitud de onda
Tampón
Th-T+ Tampón
Th-T + ssaA2
0
200
400
600
800
1000
1200
1400
1600
1800
460 480 500 520 540 560
Flu
ore
sce
nci
a
Longitud de onda
Tampón
Th-T + Tampón
C- Term
C Term + Th-T
A B
A B
26
En las figuras 13A y 13B se observa que la unión de bis-ANS a la proteína Ssa2 y la
fracción globular de la proteína provoca un aumento en la fluorescencia y un desplazamiento del
máximo de emisión, sugiriendo que las proteínas se encuentran desplegadas promoviendo la
agregación.
Figura 13. Espectro de emisión de fluorescencia de SSA2 con ANS. (A) Unión de Ssa2 total a BIS-ANS (B) Unión del
fragmento globular de Ssa2 a bis-ANS.
5.6.2 ANÁLISIS DE LA ESTRUCTURA SECUNDARIA DE Ssa2
Los agregados de tipo amiloides contienen regiones formadas por arreglos repetitivos de
hojas β formando estructuras cruzadas las cuales generalmente son estudiadas mediante técnicas
que permiten estudiar la estructura secundaria de estos agregados. En este estudio se analizaron
fracciones insolubles de la proteína total y fracciones solubles del fragmento globular de la proteína
mediante tres técnicas para determinar la morfología del tipo de agregados formados por Ssa2.
5.6.2.1 Dicroísmo Circular (CD)
Después de analizar la proteína mediante el método de CD se obtuvo que la proteína total
posee 44,67% de hojas β y 0,4% de hélices α. Mientras que el fragmento globular tienen 40, 56%
de hojas β y 2,06% de hélices α. Además, la fracción globular no posee “random coil” que es propio
del estado agregado.
0
100
200
300
400
500
600
700
800
900
1000
400 500 600
Flu
ore
sce
nci
a
Longitud de onda
ssaA2 + ANS
Tampón +ANS
Tampón
0
1000
2000
3000
4000
5000
6000
7000
8000
9000
10000
400 500 600 Fl
uo
resc
en
cia
Longitud de onda
Tampón
Tampón + ANS
C Term
C Term + ANS
A B
27
5.6.2.2 Determinación de la Fluorescencia Intrínseca
El análisis de la estabilidad térmica de Ssa2 agregada, muestra que la proteína posee una
estructura residual amorfa que se despliega a 40° C de temperatura de forma no cooperativa
(Figura 14A). En el caso del fragmento globular (Figura 14B) su estructura se despliega
rápidamente y se mantiene estable a los 75° C.
Estos resultados nos indican que los agregados formados por el fragmento globular de
Ssa2 no son amorfos.
Figura 14. Estabilidad térmica de Ssa2. (A) Estabilidad térmica de Ssa2 total (B) Estabilidad térmica del fragmento
globular de Ssa2.
5.6.2.3 TEM
En las imágenes obtenidas mediante TEM de los agregados formados por Ssa2 total se
observó la presencia de protofibrillas (Figura 15A). A pesar de no formar fibras amiloides definidas,
se pudo comprobar que las protofibrillas encontradas en estas imágenes no son agregados
amorfos, tal y como se corrobora en los resultados obtenidos en CD, y en la unión de la proteína a
Th-T y a CR que sugieren la presencia de estructura de hojas β.
Por su parte, en las imágenes obtenidas con TEM del fragmento globular de Ssa2, se
observó la presencia de fibras amiloides formadas por esta fracción de la proteína (Figura 15B).
0
200
400
600
800
1000
1200
25 45 65 85
Flu
ore
sce
nci
a
Temperatura
0
200
400
600
800
1000
1200
25 45 65 85
Flu
ore
sce
nci
a
Temperatura
C Term Ssa2
28
Figura 15. Imágenes del TEM de Ssa2 (A) Protofibrillas formadas por Ssa2. (B) Fibras amiloides formadas por el
fragmento globular de Ssa2.
5.7 ENSAYO DE TOXICIDAD CELULAR
Este ensayo se basa en la capacidad de las celulas de reducir sales de tetrazolium no
coloreadas en derivativos de formazan coloreados. Este proceso de reducción requiere actividad
mitocondrial, la cual es inactivada unos minutos después de la muerte celular. Es decir, este
método nos permite detectar la actividad metabólica mitocondrial de la célula.
Las células Hela tratadas con la proteína total después de 45 minutos de haber añadido el
sustrato (3H- timidina), no presentan disminución de la absorbancia a partir de 10µM de
concentración de proteína a 450nm de longitud de onda (Figura 16A), lo que sugiere que la
actividad mitocondrial no disminuye.
Las células tratadas con el fragmento globular de la proteína también disminuyen su
absorbancia al haber añadido 30µM de proteína, sin embargo hay un considerable aumento de la
misma conforme aumenta la concentración a 80µM (Figura 16B).
A B
200µm 0,2µm
29
Figura 16. Ensayo de Toxicidad de Ssa2. (A) Ensayo de Toxicidad de Ssa2 con la proteína total medida a 450nm
de longitud de onda. (B) Ensayo de Toxicidad de Ssa2 con la proteína total medida 450nm de longitud de onda.
1,3
1,35
1,4
1,45
1,5
1,55
1,6
0 10 20 30 40 50
Ab
sorb
anci
a
Concentración
1,45
1,5
1,55
1,6
1,65
1,7
25 45 65 85
Ab
sorb
anci
a
Concentración
Metabolismo a 450 de PGH
A B
30
6. CONCLUSIONES
Tras haber comparado las secuencias de Sup35 y Ssa2 se encontraron ciertas similitudes
como el alto contenido de triptófanos y asparaginas, aminoácidos frecuentes en proteínas de tipo
prión.
En este estudio se analizó la tendencia de la proteína Ssa2 completa y de su fragmento
globular a formar agregados mediante algoritmos computacionales, PASTA y WALTZ específicos
para predecir la propensión de agregación obteniendo un alto índice teórico de agregación de la
proteína.
En el trabajo práctico se clonó, expresó, purificó y caracterizó la proteína en forma
agregada y su fracción globular soluble. Además se observó, mediante TEM la formación de
protofibrillas, las cuales cumplen con las características de los agregados no amorfos al unirse con
agentes específicos para la detección de este tipo de agregados como son Th-T, CR y bis- ANS.
Estos resultados fueron reforzados mediante la medida de la fluorescencia intrínseca de la
proteína, que nos permitió concluir que el triptófano se dispone parcialmente escondido tratándose
de agregados monoméricos. Además al analizar las muestras por dicroísmo circular se constató
también la presencia teórica de un 44% de hojas β en la proteína total y 40% en el dominio
globular.
Nuestra investigación sugiere que Ssa2 cumple con las características de una proteína de
tipo prión en cuanto a la formación de agregados no amorfos, a pesar de no haber causado
toxicidad en el estudio realizado mediante el ensayo MTT. Sin embargo dicha hipótesis debe ser
comprobada con la continuación de este trabajo mediante el estudio del extremo N terminal de la
proteína y el análisis de transmisibilidad de la proteína.
31
7. BIBLIOGRAFIA
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AGRADECIMIENTOS
A mi familia por el apoyo, la confianza y amor a pesar de la distancia.
Al Dr. Salvador Ventura, Director del Laboratorio de Diseño y Plegamiento de Proteínas, por
aceptarme dentro de su equipo de trabajo, la guía durante la realización de esta investigación y por
impartirme nuevos conocimientos.
A todos los miembros del Laboratorio por su ayuda. A Patrizzia Martinelli por la colaboración en la
investigación.
De manera especial agradezco a la Dra Susanna Navarro, por haber co- dirigido la investigación,
por su infinita enseñanza, ayuda, guía y paciencia.
A la Secretaria Nacional de Educación Superior, Ciencia, Tecnología e Innovación del Ecuador por
ser el gestor de este alcance personal.
A todos los compañeros y amigos becarios quienes fueron un apoyo necesario e incondicional
durante la realización de este Máster.