identificaciÓn inequÍvoca de variedades de cÍtricos...

Introducción

La carencia de un procedimien-to de identificación y autentificacióninequívoca de las variedadescomerciales de cítricos supone unproblema importante en el contextode la citricultura española actual.Esta circunstancia parece alentarel desarrollo de plantaciones ilega-les que escapan al control adminis-trativo, obstaculizando el desarrollo

armónico de una planificaciónvarietal lógica y sensata, con elconsecuente perjuicio del sectorindustrial citrícola implicado y espe-cialmente de las asociaciones delpequeño agricultor.

El desarrollo de plantaciones ile-gales de todo tipo tiene un clarointerés lucrativo que vulnera losderechos de los múltiples actoresde la citricultura española especial-mente de los agricultores honestosque compiten en condiciones dedesventaja, de los agricultoresinnovadores que se arriesgan conla adquisición de nuevas varieda-

des y luego se sienten defraudadosy engañados, de los viveristas queproducen y costean la generaciónde plantas certificadas y, por últi-mo, de los propios propietarios yobtentores de las variedades sus-traídas. Sin embargo, todos losesfuerzos realizados hasta lafecha para elaborar protocolosbasados en el uso de marcadoresmoleculares para la autentificaciónde variedades de cítricos, sobretodo de aquellas variedades muypróximas a nivel genealógico comolas mutaciones inducidas y espon-táneas, no han resultado totalmen-te satisfactorios.

Victoria Ibañez ● Javier Terol ● José Carbonell1● Roberto Alonso1 ● Antonio López-García Usach José M. Colmenero-Flores2 ● Vicent Arbona3 ● Leandro H Estornell ● Concetta Licciardello4

Ana Conesa1 ● Francisco R Tadeo ● Joaquín Dopazo1 ● Manuel Talón

Centro de Genomica, Instituto Valenciano de Investigaciones Agrarias (IVIA), Apartado Oficial, 46113 Moncada (Valencia)

1 Instituto de Genómica Computacional, Centro de Investigación Príncipe Felipe (CIPF), C/ Eduardo Primo Yufera 3, 46012 Valencia, Spain

2 Instituto de Recursos Naturales y Agrobiología (IRNAS). Consejo Superior de Investigaciones Científicas (CSIC). Av. Reina Mercedes 10, 41012-Sevilla

3 Departament de Ciències Agràries i del Medi Natural, Universitat Jaume I.Campus Riu Sec. E-12071 Castelló, Spain

4 CRA-ACM, Consiglio per la Ricerca ela Sperimentazione in Agricoltura, Corso Savoia 190, 95024 Acireale (Catania) Italia

IDENTIFICACIÓN INEQUÍVOCA DE VARIEDADESDE CÍTRICOS MEDIANTE COMPARACIÓN

GENÓMICA

Resumen

En los últimos años, el uso de marcadores moleculares que identificancambios polimórficos a nivel del ADN, está jugando un papel cada vezmayor en las aplicaciones biotecnológicas de todo tipo así como en los estu-dios básicos de genética. Sin embargo, todos los esfuerzos realizadoshasta la fecha para discriminar variedades de cítricos próximas y, en parti-cular, variedades derivadas por mutaciones espontáneas e inducidas, hanresultado infructuosos. En este contexto, el consorcio CITRUSEQ formadopor 3 instituciones públicas, el Instituto Valenciano de InvestigacionesAgrarias, el IRNASE del Consejo Superior de Investigaciones Científicas yla Fundación Centro de Investigación Príncipe Felipe y 6 entidades privadas:Eurosemillas, S.L., Investigación Citrícola Castellón S.A., Anecoop, SpecialNewfruit Licensing Mediterraneo S.L., GMC Variedades Vegetales A.I.E yFundación Ruralcaja está desarrollando un número considerable de apli-caciones biotecnológicas basadas en el conocimiento del genoma de loscítricos entre las que se incluyen protocolos y procedimientos de identifica-ción inequívoca de especies y variedades de agrios. En este artículo descri-bimos la estrategia de detección y validación de marcadores de ADN deri-vados de la comparación genómica que permiten mediante análisis de PCRla discriminación rápida, eficaz y asequible de variedades comercialesgeneradas por mutaciones espontáneas e inducidas.

GENÓMICA / IDENTIFICACIÓN VARIEDADES

LEVANTE AGRICOLA

4º Trimestre 2012/309

Existen distintos tipos de marca-dores, por ejemplo, marcadoresmorfológicos, bioquímicos y marca-dores moleculares basados en loscambios que experimenta la molé-cula de ADN (Kumar et al. 2009).En el escenario actual, los marca-dores de ADN son los más efecti-vos y por tanto, son los marcado-res utilizados habitualmente para elestudio de la genética de los culti-vos y en este sentido están revolu-cionando los procedimientos debiotecnología vegetal. Estos mar-cadores pueden ser de dos tipos,los que no dependen de la técnicade la “reacción en cadena de lapolimerasa” conocida como PCR,como los denominados RFLPs ylos marcadores basados en laPCR, como RAPDs, AFLPs, SSRsy SNPs.

Los marcadores SSRs o micro-satélites han sido ampliamente uti-lizados debido a su facilidad demanejo, que requiere en esenciaun simple análisis de PCR seguidode una electroforesis en gel desna-turalizante para la determinacióndel tamaño del alelo. Estos marca-dores presentan un alto grado deinformación proporcionada por elnúmero de alelos del locus. Sinembargo, en las especies, varieda-des o clones que derivan de even-tos de mutación únicos como lamayoría de las variedades en lasque se sustenta la citricultura espa-ñola, es muy improbable que semodifiquen las secuencias micro-satélites. Este hecho limita consi-derablemente, y en la mayoría delos casos, invalida el uso de estosmarcadores para este tipo de varie-dades de cítricos.

Los SNPs (single nucleotidepolymorfism) constituyen un tipo demarcador bi-alélico que está jugan-do un papel importantísimo en lacomprensión de la variabilidadgenética y de la diversidad entre

las especies de plantas. El proble-ma con este tipo de marcador esque en principio es muy complica-da su identificación sin conoci-miento previo de la estructuragenómica.

Frente a este tipo de aproxima-ciones más clásicas, en este traba-jo proponemos un procedimientototalmente original y novedoso quepermite la comparación directa delas secuencias de DNA de losgenomas (Talon et al. 2011) de lasdistintas variedades. Este métodopermite extraer las diferenciasexistentes entre sus secuenciasgenómicas y obtener de esta formalistados de cambios que permitenla discriminación inequívoca entrevariedades extremadamente próxi-mas. A todos los efectos, estoscambios son marcadores molecu-lares como SNPs, indels (deleio-nes/inserciones) de pequeños ta-maños y otras alteraciones estruc-turales que incluyen por ejemplodeleciones de grandes fragmentoscromosómicos. El conjunto de mar-cadores obtenido de esta formaproporciona una identificación ine-quívoca de la variedad en cuestión.

El objetivo de este trabajo fue,por tanto, desarrollar herramientasgenómicas y biotecnológicas paraidentificar las variantes en losgenomas que permitan la obten-ción de un listado de marcadoresque pueda utilizarse en programasde autentificación de variedadesde cítricos.

Métodos

Material de cítricos. Para lasecuenciación se seleccionaronespecies distintas de cítricos queincluyen miembros representativosde las tres taxones básicos origina-les de los cítricos (Citrus máxima -pummelos-, Citrus medica -citro-nes- y Citrus reticulata -mandari-

nas-) y representantes de cada unade las variedades de cítricos culti-vadas en España, como mandari-nas, naranjas, limones, pomelos ylimas. Los patrones y algunasespecies más alejadas de las varie-dades comerciales también se inte-graron en este análisis.

Extracción de ADN

Para la secuenciación de geno-mas, el ADN genómico se extrajo dehojas jóvenes mediante homogeni-zación en un tampón que contienepoliaminas para estabilizar lasestructuras nucleares. El aislamien-to de núcleos se llevó a cabomediante centrifugación a través deun gradiente Percoll y el ADN serecuperó mediante lisis con deter-gentes y digestión con proteinasa K.

Secuenciación. La secuencia-ción de genomas se realizó en elCentro Nacional de AnálisisGenómico con la plataformaIllumina y con un instrumentoHighSeq 2000. Se obtuvieronsecuenciaciones de entre 8-200equivalentes genómicos por geno-tipo. Se construyeron genotecas deextremos pareados con lecturas de100 pares de bases separadas porfragmentos de 500 pares de bases.Las muestras se prepararon deacuerdo con las instrucciones de laplataforma Illumina, se generaronlos correspondientes clusters y serealizó la secuenciación mediantesíntesis.

Plataforma bioinformática y ali-neamiento de genomas

Se desarrolló una plataformabioinformática de almacenamientode los datos generados. Esta plata-forma consta de dos elementos:una base de datos de almacena-miento de la información y un por-tal web de acceso y visualizaciónde datos.


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4º Trimestre 2012310/

Desarrollo de la base de datosgenómicos

Se creó una base de datos paratoda la información generada. Dadoel gran volumen de datos obtenido(la base de datos almacena cercade 45 mil millones de posiciones deADN y un total teórico máximo esti-mado de 7 millones de variantesgénicas), sólo se almacenan datosprocesados y los resultados de losanálisis. Los datos primarios soncodificados y almacenados en cin-tas, con referencias en la basedatos para su recuperación si fueranecesario. El motor de base dedatos es mySQL, un potente soft-ware que ha demostrado proporcio-nar un excelente rendimiento.

Desarrollo de un motor de visua-lización para información genó-mica

Dentro de la plataforma bioinfor-

mática se integra un motor devisualización genómica en formade genomic browser, utilizando elmodelo Ensembl (http://www.-ensembl.org). Se utilizó el sistemabiomart para las funciones de bús-queda y recuperación de la infor-mación y Blast2GO para anotarfuncionalmente los genes. El visua-lizador permite la observación con-junta y separada de las diferentesvariantes de la base de datos parauna o más variedades, así comoobtener vistas globales y zoom-inmás detallados de regiones especí-ficas del genoma.

Alineamiento de genomas devariedades

Los datos de secuenciación secombinaron para realizar alinea-mientos del genoma de cada unade las variedades secuenciadas.Para ello se utilizó un genomahaploide de Clementina como

genoma de referencia

Identificación y caracterizaciónde variaciones puntuales

Los SNPs e indels se identifi-can mediante un conjunto de distin-tos algoritmos (GATK). Para todosellos se realizó una anotación defuncionalidad potencial.

Identificación de variacionesestructurales

El uso de librerías pair-ends enla secuenciación permite la identifi-cación de pares de lecturas conuna distancia mayor o menor de loesperado con respecto al genomade referencia, lo cual posibilita laidentificación de alteracionesestructurales en los genomassecuenciados. De forma comple-mentaria se detectan delecionescromosómicas mediante el estudiode la pérdida de heterozigosidad.

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Validación de los marcadoresmediante PCR

La validación de los marcado-res se llevó a cabo mediante PCRclásica y PCR en tiempo real y pos-terior secuenciación Sanger de losproductos de reacción de la PCR.En algunos casos se clonaron losfragmentos de interés y los insertosse secuenciaron para confirmar lapresencia de haplotipos distintos.

Resultados y Discusión

El punto fundamental de estetrabajo fue proporcionar un métodoeficaz para discriminar variedades.El método propuesto se basa en la

comparación genómica de lassecuencias provenientes de varie-dades mutantes, híbridas y paren-tales. Para alcanzar los objetivospropuestos en primer lugar se dilu-cidó la secuencia del genoma de180 variedades de cítricos entre lascuales se incluyen las principalesespecies, variedades y patrones dela citricultura española. La metodo-logía para la autentificación devariedades se ha ensayado convariedades derivadas aparecidaspor mutación espontánea en elcampo y otras por mutación induci-da mediante irradiación. Así, sedesarrollaron los algoritmos mate-máticos y los programas informáti-cos que permiten almacenar y pro-

cesar la información (Figura 1).Posteriormente, mediante losdesarrollos informáticos se realiza-ron las comparaciones entre lasvariantes genómicas de algunasvariedades problema de cítricos yse listaron las diferencias en sussecuencias (Figura 2). Así, se reali-zó la predicción, por ejemplo, devariantes polimórficas o SNPs(Figura 3) y el set de SNPs de unavariedad se comparó con el devariedades derivadas (Figura 4).Puesto que todas las variedadeshan derivado de un solo evento demutación, el genoma alterado seráidéntico excepto en aquellas regio-nes afectadas por la mutación.

Figura 1. Dentro de la plataforma bioinformática se integra un motor de visualización genómica o “genome browser”. El visualizador permite la obser-vación conjunta y separada de las diferentes variantes de la base de datos para una o más variedades, así como obtener vistas globales y zoom-inmás detallados de regiones específicas del genoma. De arriba a abajo se observa la zona representada en el cromosoma, la abundancia génica,las variantes con el respecto al genoma de referencia y los genes presentes en un fragmento ampliado.


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Figura 2. Listado de diferencias entre dos variedades próximas generado mediante comparaciones entre las variantes genómicas. De izquierda aderecha por columnas se especifica el cromosoma afectado, la posición de la variante en el cromosoma, el alelo de referencia, el alelo alternativo, elgen afectado y las frecuencias alélicas, además de otra información sobre los parámetros de calidad que se presentan en las columnas siguientes.


La estructura y las característi-cas de las secuencias distintas seestudiaron individualmente y deentre ellas se seleccionaron lassecuencias con mayor probabilidadde discriminación (Figura 5).Además de la aparición o pérdida

de SNPs, otro de los efectos cau-sados por las mutaciones es laaparición de indels de tamaño rela-tivamente menor, que en este casose presentarían en hemicigosis enlos genomas derivados. El poderdiscriminatorio de los indels, inclu-

so superior al de los SNPs, los con-vierte en los marcadores candida-tos más adecuados (Figura 5). Lasalteraciones producidas por lasmutaciones también provocan laaparición de deleciones de tamañoconsiderable y consecuentemente

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Figura 3. Representación de lecturasIllu-mina de una variedad parental y dela variedad derivada alineadas con res-pecto al genoma de referencia. Seobserva la presencia de un SNP discri-minatorio entre ambas variedades.

Figura 4. En A se muestra el alinea-miento de las secuencias Illumina delgenoma de referencia, de una variedadparental y de una variedad derivada. Seobserva la presencia de 1 SNP discrimi-natorio. En B se muestra el alineamien-to de las secuencias Sanger de la varie-dad parental y de la variedad derivadaque confirman la presencia del SNP dis-criminatorio. GR = Genoma deReferencia. VP = Variedad Parental. VD= Variedad Derivada

se analizó con detalle la presenciade este tipo de alteraciones estruc-turales (Figura 6) y el poder discri-minatorio de la pérdida de heteroci-gosidad de las variedades deriva-das. La pérdida de heterocigosidadse cuantificó con el número de

SNPs perdidos en una variedadrespecto a las demás. La represen-tación gráfica mostró que la pérdi-da de heterocigosidad se acumula-ba en regiones específicas en cadavariedad, lo que indicaba la pre-

sencia de enormes fragmentos quecontienen secuencias claramentediscriminatorias (Figura 7).

Las secuencias candidatas setestaron en un primer ensayomediante PCR sobre muestras de

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Figura 5. Secuencias Sanger de unavariedad parental y de una variedadderivada alineadas con respecto algenoma de referencia. Se observa unalectura única en la variedad parental yuna mezcla de lecturas en una parte dela secuencia de la variedad derivadaprovocada por la presencia de un indelen la variedad derivada que confirma lapresencia de variaciones discriminato-rias.


hojas de las variedades problema,en el Centro de Genómica del IVIA.Para validar la capacidad discrimi-natoria, los productos de la amplifi-cación se secuenciaron con la tec-nología Sanger (Figuras 4 y 5).Aquellas secuencias que discrimi-naban sin ambigüedades las varie-dades ensayadas se analizaron denuevo en un segundo laboratorioindependiente. Por último, se reali-zó un tercer y último ensayo conmultimuestras ciegas para testar laeficacia y el poder del listado demarcadores seleccionados para laautentificación de estas varieda-des. Una vez perfilado y optimizadoel procedimiento, se generó un lis-tado final de marcadores formadopor las secuencias que mostraronun 100 % de eficacia en los ensa-yos ciegos.

Eficacia del procedimiento

La precisión y capacidad deautentificación del procedimientoque hemos desarrollado son muyelevadas en todas las variedadestestadas hasta la fecha. Aunque, enprincipio, no tenemos evidencia deuna reducción en la eficacia, sepuede pensar que las limitacionesdel procedimiento deberían estarligadas a la calidad de las secuen-ciaciones de los genomas, quedebe de ser óptima y a la localiza-ción de los cambios discriminatoriosen zonas accesibles a la secuencia-ción. También es esperable que ladiscriminación varietal no esté com-prometida con las variaciones clo-nales e incluso individuales, quepresumiblemente son menores quelas variaciones entre variedades.

Conclusiones

El consorcio CITRUSEQ hadesarrollado protocolos y procedi-mientos de identificación inequívo-ca de variedades y especies decítricos. En este artículo se descri-be el desarrollo de marcadores deADN basados en la comparacióngenómica, que permiten la discrimi-nación rápida y eficaz de varieda-des comerciales generadas pormutaciones espontáneas e induci-das. Los marcadores molecularesson SNPs, indels de diversos tama-ños y otras alteraciones estructura-les que incluyen deleciones degrandes fragmentos cromosómi-cos. El conjunto de los marcadoresobtenidos de esta forma proporcio-na una identificación inequívoca dela variedad problema.

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Figura 6. Representa-ción de lecturas Illumina en una variedad que muestran un deleción de unos 2000 pares de bases con respecto al genomade referencia.

Agradecimientos

Quisiéramos expresar nuestroagradecimiento a Elena Blázquez,Ángel Boix, Matilde Sancho,Cristina Martínez, Mariano Monto-ro, Juana Ramirez, Sofía Luque-González, Antonio Prieto e IsabelSanchís por su inestimable ayuda

en las tareas de campo y laborato-rio. Esta investigación ha sidofinanciada por el Consorcio Citru-seq y el Ministerio de Ciencia eInnovación a través de los proyec-tos PSE-060000-2009-8 y IPT-010000-2010-43 y el Fondo Euro-peo de Desarrollo Regional.

ReferenciasP. Kumar, V.K. Gupta, A.K. Misra, D. R. Modi andB. K. Pandey (2009). Potential of Molecular Markersin Plant Biotechnology. Plant Omics Journal , 2(4):141-162 (2009) M. Talón, A. López-García Usach, J. Terol, M.Cercós, V. Ibañez, A. Herrero-Ortega, J.V Muñoz-Sanz, J.M. Colmenero-Flores1, V. Arbona, L. H.Estornell, J. Carbonell, A Conesa, J Dopazo, F. R.Tadeo (2011) CITRUSEQ: una aproximación genómi-ca a la mejora de los cítricos. Levante Agrícola:Revista internacional de cítricos, Nº. 405, págs. 73-78


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Figura 7. Pérdida de heterozigosidad de una variedad parental y una variedad derivada. En la variedad parental (izquierda) la pérdida de variabili-dad alélica se distribuye uniformemente a lo largo del cromosoma 3. En la variedad derivada se observa una gran pérdida de heterozigosidad pro-vocada por una deleción de aproximadamente 2 millones de pares de bases (derecha).

CONTROL BIOLÓGICO DE PLAGAS AGRÍCOLASAutor:J.A. Jacas y A. Urbaneja (Editores). 496 pag. Ilust.color (2008)

Esta obra, que ha sido dirigida por los editores J. A. Jacas y A.Urbaneja (Unidad Asociada de Entomología UJI-IVIA-CIB), estádividida en 33 capítulos agrupados en 5 secciones (Introducción,Agentes de Control Biológico (CB), CB por tipo de plaga, Cultivoscon MIP basado en el CB, y Futuro del CB), recogiendo la infor-mación y elaboración de 56 profesores e investigadores en elcampo del Control Biológico en nuestro país, que han recopiladodesde su propia experiencia para el lector interesado.

Capítulo 1. Origen de las plagas e historia del control biológico.Josep Jacas y Alberto UrbanejaCapítulo 2. Tipos de control biológico y métodos para su implementación.Alberto Urbaneja y Josep JacasCapítulo 3. Regulación de poblaciones por enemigos naturales y su aplicación en el con-trol biológico de plagas. Ramon Albajes y Òscar AlomarCapítulo 4. Artrópodos depredadores. Alberto Urbaneja, Josep Anton Jacas y FerranGarcia-MaríCapítulo 5. Insector parasitoides. Tatiana PinaCapítulo 6. Bacterias entomopatógenas. Joel González-Cabrera y Juan FerréCapítulo 7. Hongos entomopatógenos. Enrique Quesada-Moraga y Cándido Santiago-ÁlvarezCapítulo 8. Virus entomopatógeno. Primitivo Caballero y Trevor WilliamsCapítulo 9. Nematodos entomopatógenos. Magda Galeano RevertCapítulo 10. Control biológico de ácaros. Raquel Abad-Moyano, Ernestina Aguilar-Fenollosa y Sara Pascual-RuizCapítulo 11. Control biológico de langosta y saltamonte. Cándido Santiago Álvarez, Pablo Valverde García y Enrique Quesada-MoragaCapítulo 12. Control biológico de trips. Alfredo Lacasa Plasencia, Juan Antonio Sánchez Sánchez y Carmen María Lacasa MartínezCapítulo 13. Control biológico de chinches. María Jesús Verdú y José CatalánCapítulo 14. Control biológico de pulgones. Belén Belliure, Paloma Pérez, Mª Ángeles Marcos, José Manuel Michelena y Alfonso Hermoso de Mendoza

Capítulo 15. Control biológico de moscas blancas.Cristina Castañé, Judit Arnó, Francisco Beitia y Rosa GabarraCapítulo 16. Control biológico de psyllas. María José Sarasúa y Jesús AvillaCapítulo 17. Control biológico de cochinillas. María Jesús VerdúCapítulo 18. Control biológico de noctuidos y lepidópteros. Tomás CabelloCapítulo 19. Control biológico de minadores. Elena Llácer y María del Mar Téllez NavarroCapítulo 20. Control biológico de moscas de la fruta.Ángeles Adán, Pilar Medina, Pedro Del Estal, Elisa Viñuela y Flor BudiaCapítulo 21. Control biológico en cítricos.Alberto Urbaneja, Josep A. Jacasa y Ferran Garcia MaríCapítulo 22. Manzano, peral y melocotonero.Jesús Avilla, Dolors Bosch, Adriana Escudero-Colomar y María José SarasúaCapítulo 23. Olivo. Manuel González NúñezCapítulo 24. Vid. Vicente Marco, Luz Dary Carvajal-Montoya, Esteban García-Ruiz, Fernando Moreno e Ignacio Pérez-MorenoCapítulo 25. Cultivos extensivo en regadío: cereales, maíz y alfalfa.Xavier Pons y Matilde EizaguirreCapítulo 26. Pimiento bajo abrigo. Jan van der BlomCapítulo 27. Tomate. Rosa Gabarra, Judit Arnó y Jordi RiudavetsCapítulo 28. Cucurbitáceas bajo abrigo. Javier Calvo y José Eduardo BeldaCapítulo 29. Cultivo de flor cortada. José Eduardo Belda Suárez y Ed MoermanCapítulo 30. Aplicación de técnicas moleculares al control biológico de plagas. MónicaHurtado, Nuria Agustí y Beatriz Sabater-MuñozCapítulo 31. Integración del control biológico con otros métodos de control.Pilar Medina, Adan Adán, Pedro del Estal, Flor Budia y Elisa ViñuelaCapítulo 32. Producción de enemigos naturales. Karel J.F. Bolckmans y José E. BeldaCapítulo 33. Situación actual y retos del control Biológico de Plagas.J.A. Jacas y A. Urbaneja

P.V.P. 58 €- (Envíos contra reembolso. I.V.A. incluido. Gastos de envío aparte)

PARA PEDIDOS: EDICIONES L.A.V., S.L.Tel.: 96/ 372 02 61 - [email protected]

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