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IDENTIFICACIÓN DE RAZAS Y ESTUDIO PRELIMINAR DE LA DIVERSIDAD GENÉTICA DE Peronospora farinosa f. sp. spinaciae AGENTE CAUSAL
DEL MILDEO VELLOSO EN CULTIVOS DE ESPINACA EN LA SABANA DE BOGOTA
MARIA IRENE CHABUR ORTEGON
PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA FACULTAD DE CIENCIAS BASICAS
MICROBIOLOGIA AGRICOLA Y VETERINARIA
Bogotá, D. C. Colombia
JULIO DE 2008.
IDENTIFICACIÓN DE RAZAS Y ESTUDIO PRELIMINAR DE LA DIVERSIDAD GENÉTICA DE Peronospora farinosa f. sp. spinaciae AGENTE CAUSAL
DEL MILDEO VELLOSO EN CULTIVOS DE ESPINACA EN LA SABANA DE BOGOTA
MARIA IRENE CHABUR ORTEGON
TRABAJO DE GRADO
PRESENTADO COMO REQUISITO PARCIAL PARA OPTAR EL TITULO DE
MICROBIOLOGA AGRICOLA Y VETERINARIA
DIRECTOR:
JOSE SALVADOR MONTAÑA
CO-DIRECTOR:
JAIME JIMENEZ
PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA
FACULTAD DE CIENCIAS BÁSICAS
MICROBIOLOGÍA AGRICOLA Y VETERINARIA
Bogotá, D. C. Colombia
JULIO DE 2008.
NOTA DE ADVERTENCIA
Articulo 23 de la resolución No 13 de julio de 1946
“La universidad no se hace responsable por los conceptos omitidos por sus
alumnos en sus trabajos de tesis. Solo se velara porque no se publique nada
contrario al dogma y a la moral católica y porque las tesis no contengan ataques
personales contra persona alguna, antes bien se vea en ellas el anhelo en
buscar la verdad y la justicia”
IDENTIFICACIÓN DE RAZAS Y ESTUDIO PRELIMINAR DE LA DIVERSIDAD GENÉTICA DE Peronospora farinosa f. sp. spinaciae AGENTE CAUSAL
DEL MILDEO VELLOSO EN CULTIVOS DE ESPINACA EN LA SABANA DE BOGOTA
MARIA IRENE CHABUR ORTEGON
APROBADO
________________________ ________________________ Jose Salvador Montaña Msc. Jaime Jiménez PhD. Director Codirector ________________________ ________________________ Clemencia Forero de La Rotta Msc. Maria Ximena Rodríguez PhD. Jurado 1 Jurado 2
Bogotá, D. C. Colombia
JULIO DE 2008
IDENTIFICACIÓN DE RAZAS Y ESTUDIO PRELIMINAR DE LA DIVERSIDAD GENÉTICA DE Peronospora farinosa f. sp. spinaciae AGENTE CAUSAL
DEL MILDEO VELLOSO EN CULTIVOS DE ESPINACA EN LA SABANA DE BOGOTA
MARIA IRENE CHABUR ORTEGON
APROBADO
________________________ ________________________ Ingrid Shuler PhD. Janeth Arias Msc. Decana Academica Directora de Carrera
Bogotá, D. C. Colombia
JULIO DE 2008.
DEDICATORIA
A Dios por permitirme vivir este proceso de aprendizaje. A mis padres, a mi
hermana y a mi sobrino les agradezco su comprensión, su apoyo y su esfuerzo
durante esta etapa tan importante de mi vida.
AGRADECIMIENTOS
A mi director José Salvador Montaña por su apoyo constante y su disposición
para compartir sus conocimientos y experiencias.
A mi codirector Jaime Jiménez por darme la oportunidad y la confianza de
realizar este trabajo.
A todas las personas que hacen parte del Laboratorio de Microbiología
Ambiental y de Suelos por su colaboración y apoyo incondicional.
A todos los investigadores que pertenecen al grupo de Manejo Integrado de
plagas del Centro de Investigaciones y Asesorías Agroindustriales de la
Universidad Jorge Tadeo Lozano por haber confiado en mí para realizar y hacer
parte de esta investigación y por su ayuda constante.
A los investigadores que hacen parte de la Unidad de Biotecnología Vegetal
(UBV) por su asesoria y su disposición.
A mis padres, a Karol y Mateo por su amor, confianza y apoyo constante durante
el transcurso de mi carrera.
A mi familia y amigos por su compañía y por hacer parte de mi vida.
TABLA DE CONTENIDO
1.INTRODUCCION……………………………………….…………..………………...1
2.MARCO TEORICO……………………………….…………..…………………..4
2.1 Descripcion Botánica………..……………………………………………………...4
2.2 Origen y distribución en Colombia………………………………………....……4
2.3 Condiciones del Cultivo ………….………………………………………………..5
2.4 Composición Nutricional……………………………………….……..……………6
2.5 Manejo del cultivo…………………………………………………..……………….6
2.6 Enfermedades y plagas del cultivo de Espinaca……………..…………..7
2.6.1 Arvenses………………………………………………………………………….7
2.6.2 Enfermedades……………………………………………………………………7
2.6.3 Plagas…………………………………………………………………………….8
2.7 Sintomatología causada por Peronospora farinosa f. sp spinaciae……….8
2.7.1 El patógeno Peronospora farinosa……….…………………………………….9
2.7.2 La morfología de Peronospora farinosa………………………………………9
2.7.3 Ciclo de vida de Peronospora farinosa………..……………………………11
2.8 Razas reportadas de Peronospora farinosa f. sp. spinaciae…………………12
2.9 Variabilidad genetica de los microorganismos…………………………………14
2.9.1 Técnicas usadas para la identificacion de la variabilidad genética………85
2.9.1.1 ITS (Internal Transcribed Spacer)............................................................16
2.9.1.2 AFLP (Amplified fragment lenght polymorphisms)...................................17
3. FORMULACION DEL PROBLEMA Y JUSTIFICACION…..…………………20
4. OBJETIVOS…………………………………………………………………………22
4.1 Objetivo General………………….……………………………………………….22
4.2 Objetivos Específicos………………………………………………..……..22
5. MATERIALES Y METODOS……………………………………………………..23
5.1 Lugar de muestreo……………………………………………………….……...23
5.2 Toma de muestras e Información de cada finca……………………………...23
5.3 Identificación de razas……………….……………………………..………...…24
5.3.1 Germinación de las semillas………………………………………………….25
5.3.2 Preparación del inoculo……………………………………………………….25
5.3.3 Inoculación de Peronospora farinosa f. sp spinaciae sobre hojas
cotiledonales de las variedades diferenciales………………………………………
2 6
5.4 Diversidad genética de Peronospora farinosa……………..…………………27
5.4.1 Extracción de ADN…………………………………………………………….28
5.4.1.1 Evaluación espectrofotométrica del ADN………………………………....28
5.4.1.2 Evaluación electroforética del ADN……………………..…….…………...28
5.4.2 PCR con iniciadores específicos para la amplificación de ITS……………29
5.4.3 Técnica de AFLPs…………………………………….……………………….29
5.4.4 Análisis de la información……………………………………………………..31
6. RESULTADOS………………...…………………………………………………..32
6.1 Recolección de muestras y caracterización ambiental………………………32
6.2 Identificación de razas por medio de cultivo de genotipos diferenciales..…34
6.3 Estandarización de la extracción de ADN…………………………………..…37
6.4 Amplificación de la región ITS……………………………………...………….38
6.5 AFLPs…………………………………….…………………………………….…39
7. DISCUSION DE RESULTADOS. …………………….………………………....43
8. CONCLUSIONES……………………………………………………………….…51
9. RECOMENDACIONES……………………………………………………………53
10. BIBLIOGRAFIA……………………………………………………………………54
11. ANEXOS……………………………………………………………………………64
INDICE DE FIGURAS Figura 1. Hojas de espinaca. A.) Micelio en el envés de la hoja causado por
Peronospora farinosa f. sp. spinaciae. B.) Manchas cloróticas en el haz de la
hoja causada por Peronospora farinosa f. sp. spinacia………..……………9
Figura 2. Esporangióforo y esporangio de Peronospora farinosa………….10
Figura 3. Oosporas de Peronospora farinosa……..………..……..………….…..11
Figura 4. Ciclo de vida de Peronospora Farinosa………………………………...12
Figura 5. Recursos de genes y diversidad genotípica en poblaciones de
patógenos………………………………………………….………………………….15
Figura 6. Esquema de la unidad de rADN par hongos. Se muestran los
dominios altamente variables (AV) y altamente conservados (AC) dentro de la
región ITS1-5.8S-ITS2 de la unidad transcripcional (rADN)………………….17
Figura 7. Representación sistemática de la técnica de AFLP…………………..18
Figura 8. Lugar de Muestreo en la Sabana de Bogotá…………………………...23
Figura 9. Semillas de diferentes genotipos de espinaca germinadas 10 días
después de la siembra………………………………………………………………...25
Figura 10. Procedimiento realizado para la obtención del inoculo de
Peronospora farinosa f. sp spinaciae. A. Hoja de espinaca con lesión
ocasionada por el patógeno. B. fracciones de hoja en agua destilada. C. Micelio
filtrado para obtención de esporangios……………………………………………...26 Figura 11. Procedimiento de inoculación de Peronospora farinosa f. sp
spinaciae en los diferentes genotipos. A. Inoculación del patógeno por aspersión
B. Bandeja de semillas en bolsa transparente (cámara húmeda al 100%). C.
Bandeja de germinación dentro de una cámara húmeda 80%............................27
Figura 12. A. Hojas cotiledoneas (100%) de variedades diferenciales a los siete
días de inoculadas. A. Variedad de Viroflay susceptible a Peronospora farinosa
f. sp. spinaciae. B. Hoja cotiledonea de la variedad de Resistoflay susceptible a
Peronospora farinosa f. sp. spinaciae………………..………………………….34
Figura 13. Peronospora farinosa f. sp. spinaciae. A. Esporangióforo con
ramificación dicotómica. B. Esporangios………………………..……………..35
Figura 14. Electroforesis en gel de agarosa al 0.8% para observar la calidad de
ADN………………………………………….………………………………………38
Figura 15. Electroforesis en Gel de agarosa (1.5%) de las regiones ITS
amplificadas………………………….………………………………………………..39
Figura 16. Dendograma obtenido mediante el análisis de los AFLPs con el
Coeficiente de Dice y el algoritmo UPGMA……………………………………41
Figura 17. “Huellas dactilares" obtenidas con AFLPs………………………… 42
INDICE DE TABLAS
Tabla 1. Área sembrada y número de lotes de los municipios productores de
espinaca en la Sabana de Bogotá…………………………………………………….5
Tabla 2. Composición nutricional de la espinaca. Fuente: Frutas y hortalizas de
Colombia…………………………………………………………………………………6
Tabla 3. Genotipos de espinaca utilizados para la identificación de razas de de
Peronospora farinosa f. sp. spinaciae……………………………………………….14
Tabla 4. Secuencia y número de pares de bases de los iniciadores utilizados
para ITS.....................................................………………………………………….29
Tabla 5. Información general y características geográficas de las fincas
evaluadas………………………………..…………………………………………….33
Tabla 6. Porcentaje de esporulación obtenido con los 10 genotipos diferenciales
inoculados con cada “pool” de Peronospora farinosa f. sp. spinaciae de cada
municipio………………………………………………………………………………..36
Tabla 7. Susceptibilidad (+) o resistencia (-) obtenida de los genotipos al inoculo
Peronospora farinosa f. sp. spinaciae de cada finca………………………………36
Tabla 8. Razas obtenidas en los municipios de Cota, Tabio y Tenjo a partir de
variedades diferenciales………………………………………………………………37
Tabla 9. Cantidad de ADN y relación de la absorbancia a 260/280 de cada una
de las muestras………………………….………………..………………………...37
RESUMEN
La sabana de Bogotá (Cundinamarca) es el principal productor de espinaca en
Colombia. El mildeo velloso causado por Peronospora farinosa f. sp spinaciae,
es una enfermedad de importancia económica en la mayoría de regiones donde
se cultiva esta hortaliza. Hasta el 2007 se han reportado a nivel mundial 10
razas fisiológicas de Peronospora farinosa f. sp spinaciae; las cuales han sido
identificadas por medio de la susceptibilidad y resistencia de las hojas
cotiledoneas de genotipos diferenciales (Viroflay, Califaly, Resitoflay, Polea,
Bolero Campania, Dolhin, Lion, Lazio y Tarpy) a varios inóculos del patógeno.
En el presente trabajo se identificaron las razas presentes en tres municipios
(Cota, Tabio y Tenjo) de la Sabana de Bogotà y el estudio preliminar de la
variabilidad genética del patógeno a partir del mismo inoculo con el fin de
comparar los resultados obtenidos de las dos metodologías utilizadas. En las
fincas de “Alcalà” del municipio de Cota y “La Palestina” del municipio de Tabio
se identificò la raza 5 y en la fincas de “EL Cucharo” del municipio de Tenjo y “El
Hoyo” del municipio de Cota se identificó la raza 8 por medio de genotipos
diferenciales. Por otro lado con la tecnica AFLPs utilizada para el estudio
preliminar de la variabilidad genética se obtuvo 43 bandas distribuidas entre
40pb y 200pb, las cuales permitieron la construcción de la matriz de similaridad
genética utilizando el índice de Dice a partir del cual se realizó el análisis de
agrupamiento UPGMA y se construyó el dendograma.
Igualmente se amplifico la región espaciadora interna ITS del rADN con los
iniciadores universales (ITS1-ITS4). El peso molecular de los productos
correspondió alrededor de 750pb-800pb. Al comparar los resultados obtenidos
por diferenciales para la identificación de razas con los resultados del estudio
preliminar de la diversidad genética basados en AFLPs se observó que la raza 8
identificadas en dos fincas presenta relación con respecto al análisis de
agrupamiento UPGMA obtenido.
ABSTRACT
The Sabana of Bogotá (Cundinamarca) is the principal producer of spinach in
Colombia. The downy mildew caused by Peronospora farinosa f. sp spinaciae, is
a disease of economic importance in the majority of regions where this vegetable
is cultivated. Until 2007 10 physiological races of Peronospora farinosa f. sp
spinaciae have been brought worldwide; which have been identified by means of
the susceptibility and resistance of the leaves of differential genotypes (Viroflay,
Califaly, Resitoflay, Pulley, Bolero Campania, Dolhin, Lion, Lazio and Tarpy).
The races were identified in three municipalities (Level, Tabio and Tenjo) and the
preliminary study of the genetic variability of the pathogenic for compared the
results obtained of both used methodologies. In the estates of "Alcalà" of the
municipality of Level and " La Palestina " of Tabio' identified the race 5 and in " El
Cucharo " of Tenjo " The Hoyo "identified the race 8 by means of differential
genotypes. On the other hand with the technology AFLPs used for the preliminary
study of the genetic variability 43 bands were obtained distributed between 40pb
and 200pb. The similarity genetics was realized the analysis of grouping
UPGMA.
Equally it was amplified the ITS of the rADN with the universal initiators (ITS1-
ITS4). The molecular weight of the products corresponded about 750pb-800pb.
On having compared the results obtained for differential for the identification of
races with the results of the preliminary study of the genetic diversity based on
AFLPs was observed that the race 8 identified ones in two estates presents
relation with regard to the analysis of grouping obtained UPGMA.
1. INTRODUCCION Las hortalizas son plantas herbáceas de ciclo anual o bienal o excepcionalmente
perennes. Los sistemas de producción de hortalizas se caracterizan por ser
intensivos y porque sus productos son usados en la alimentación humana. En
términos generales las hortalizas presentan un alto contenido de agua (>70%),
un bajo contenido energético (<100cal/100g) y una corta vida útil en
poscosecha. La producción hortícola en Colombia es muy heterogénea y
dispersa, se cultivan aproximadamente 42 especies, en los diferentes pisos
térmicos del país. En el 2004 se sembraron 119.500 hectáreas y se obtuvo una
producción de 1.350.000 toneladas. El consumo de hortalizas en Colombia es
de aproximadamente 38kg/año; esta cifra es inferior a la recomendada por la
Organización Mundial de la Salud (146kg//año) como consumo mínimo (Vallejo.,
2007).
La espinaca (Spinacia oleracea L.), fue introducida a Colombia hace 30 años
aproximadamente, es de origen asiático y pertenece a la familia
Chenopodiaceae. Según la red de Agronet (2006) es una especie de
importancia agrícola que cuenta con una producción nacional de 3.800
toneladas por año, un área cosechada de 4.200 hectáreas y un rendimiento de
16.000 kg/ha. Los principales departamentos con áreas de producción incluyen
Cundinamarca, Antioquia, Norte de Santander y existen indicios no
documentados de cultivos en Boyacá (Rodríguez et al., 2008).
Para la selección y mercadeo de esta hortaliza generalmente generalmente se
realiza una clasificación teniendo en cuenta características morfológicas como: la
forma de las hojas, el aspecto del cogollo y del tallo, longitud del pecíolo y otro
criterio de gran importancia es su precocidad. En Colombia se cultiva un amplio
rango de variedades e híbridos como son: Bolero®, Saporo®, Marutsubu®,
Virofaly®, Spoter®, Grenell® y Quinto®. En el sistema de producción de espinaca
en la Sabana de Bogotá los agricultores utilizan diferentes materiales de siembra
de acuerdo a las condiciones del mercado y el destino del producto.
Generalmente los productores emplean materiales precoces (por ejemplo
Sapporo®) cuando el precio de la espinaca se encuentra alto y con mayor vida
útil poscosecha (por ejemplo Grenell®) cuando el destino del producto se
encuentra lejano.
Según el Censo Hortícola de la Sabana de Bogotá (DANE, 2002) el cultivo de
espinaca cuenta con 385 lotes con un área sembrada de 139,37 Ha y un área
cosechada de 112,69 Ha. El municipio de Cota, es el principal productor de
espinaca, el cual tiene 324 lotes y un área sembrada de 86,91 Ha; en segundo
lugar esta el municipio de Facatativá con un área sembrada de 14,82 ha
distribuida en 18 lotes; el municipio de Madrid ocupa el tercer lugar ya que tiene
10 lotes y 10.78 Ha de área sembrada, y el cuarto lugar lo ocupa por último el
municipio de Mosquera el cual tiene 6 lotes y un área de siembra de 3.51 Ha. En
el caso del municipio de Cota, principal productor de espinaca, la economía
directa de 300 familias depende de la producción de esta hortaliza.
El zonas del mundo donde se produce espinaca, la enfermedad de mayor
importancia económica es el mildeo velloso causado por el hongo Peronospora
farinosa f. sp. spinaciae (Brandenberger et al, 1994). Cuando las condiciones
ambientales son favorables, la enfermedad puede progresar rápidamente y
generar la perdida total del cultivo en corto tiempo, además de reducir la calidad
en postcosecha (Brandenberger et al., 1991).
Se han reportado diez razas patogénicas de este hongo en cultivos de Estados
Unidos, Europa y Japón. La identificación de estas razas ha permitido la
utilización de variedades comerciales resistentes. Debido a lo anterior es de gran
importancia la determinación de posibles diferencias en la variabilidad genética y
la identificación de las razas asociadas a cultivos de espinaca en la sabana de
Bogotá, que permitan, la incorporación de variedades comerciales con
resistencia genética a las razas reportadas como una alternativa de manejo de la
enfermedad la cual se basa principalmente en el uso de fungicidas de síntesis
química.
La caracterización de nuevas razas de mildeo velloso se ha realizado por medio
de genotipos diferenciales de espinaca comparando la resistencia y
susceptibilidad de los cotiledones (Brandenberger et al., 1991; Irish et al., 2003).
También se han realizado estudios con técnicas moleculares para la
identificación y detección de razas de mildeo velloso en rosa (Lindqvist et al.,
1998; Lindqvist et al., 2002) soya (Shan Lai et al., 2004) y girasol (Loos et a.l,
2007), en donde se han obtenido excelentes resultados. Actualmente las
principales técnicas usadas para realizar una caracterización molecular son la
amplificación aleatoria del ADN polimórfico (RAPD), la amplificación de los
espaciadores internos de transcripción del ADN ribosomal (ITS); Polimorfismo en
la longitud de fragmentos de restricción (RFLP) y recientemente el Polimorfismo
en la longitud de fragmentos amplificados al azar (AFLPs) los cuales han
permitido observar una variabilidad genética entre aislamientos obtenidos de un
mismo hongo (Weising et al., 1995).
2. MARCO TEORICO 2.1 Descripción botánica de la espinaca. El desarrollo de la planta de espinaca se puede dividir en dos etapas; en una
primera de crecimiento vegetativo, en la cual se forma una roseta de hojas cuya
duración depende de las condiciones climáticas. La segunda fase, de tipo
reproductivo, inicia con la elongación del tallo. De las axilas de las hojas o
directamente del cuello surgen tallos laterales que dan lugar a ramificaciones
secundarias, en las que pueden desarrollarse flores. El tallo es de porte erecto
con una longitud variable (30 a 100 cm.); sobre él se sitúan las flores. Las Hojas
son caulíferas, más o menos alternas, pecioladas, de color verde oscuro con
forma y consistencia variables en función del material genético El pecíolo es
cóncavo y a menudo rojo en su base, con longitud variable, que va
disminuyendo a medida que aparecen hojas nuevas y va desapareciendo en las
hojas que se sitúan en la parte más alta del tallo. Las Flores presentan color
verde y se agrupadas en número de 6-12 en las espigas terminales o axilares
(Caicedo et al., 1995).
2.2 Origen y distribución en Colombia La espinaca se introdujo en Europa alrededor del año 1000 D.C. procedente de
regiones asiáticas, probablemente de Persia. Sin embargo fue a partir del siglo
XVIII cuando comenzó a difundirse por Europa y se establecieron cultivos para
su explotación, principalmente en Holanda, Inglaterra y Francia. En Colombia, el
cultivo se estableció hace aproximadamente 30 años y se ha convertido en una
actividad económica importante para algunos municipios con vocación hortícola.
Según Agronet, (2006); los principales departamentos productores de esta
hortaliza son Cundinamarca, con una producción de 2.918 toneladas, luego se
encuentra Antioquia con 504 toneladas y por ultimo el departamento de Norte de
Santander con 192 toneladas. En la sabana de Bogota, el municipio con mayor
cantidad de lotes dedicados a la siembra de espinaca es Cota, según el censo
agrícola del DANE (2000), en donde se siembran en promedio 90 Ha
anualmente (Tabla 1).
Tabla 1. Área sembrada y número de lotes de los municipios productores de espinaca en la
Sabana de Bogotá. Fuente: Censo Hortícola DANE 2002.
Municipio No Lotes Área Sembrada
Sabana de Bogota Cota Facatativa Madrid Funza Mosquera Cajicá
385
324
18
10
12
6
6
139.37 Ha
86.91 Ha
14.82 Ha
10.78 Ha
16.41 Ha
3.51 Ha
4.00 Ha
2.3 Condiciones del cultivo En condiciones subtropicales la espinaca se desarrolla de manera óptima en
climas calidos, donde la temperatura mínima para su germinación es de 2° C con
una temperatura máxima de germinación de 30°C y un rango ideal entre 7 y
24°C. En las condiciones propias del trópico alto andino la espinaca parece
desarrollarse bien en zonas frías. Las plantas jóvenes pueden crecer a una
temperatura mínima de 9°C y el mejor crecimiento del cultivo ocurre de 15 a
20°C con una temperatura mínima de 10°C y una máxima de 32°C. Las plantas
pueden llegar a un tamaño adecuado para el mercado en 40 a 70 días
dependiendo de la temperatura, humedad y fertilidad entre otros factores
(Hochmuth et al., 2005). La espinaca puede crecer en una variedad de suelos,
pero preferiblemente en suelos arcillo-arenosos o arcillosos con un adecuado
contenido de materia orgánica y que tengan un buen drenaje para evitar
problemas de pudrición en la raíz. El pH del suelo debe mantenerse alrededor
de 6, ya que la espinaca es sensible a suelos ácidos. La espinaca es tolerante a
suelos salinos y muy tolerante a suelos alcalinos (Carrie et al., 2000). En el caso
de Colombia la espinaca prefiere temperaturas promedio de 14°C a 18°C., pero
se desarrolla en temperaturas menores; aunque en climas muy fríos las plantas
pueden producir tallos y flores prematuras por lo que disminuye su calidad. Para
obtener un buen cultivo la espinaca en la sabana de Bogotá se siembra en
suelos franco arenoso con alto contenido de materia orgánica, bien drenados y
ligeramente ácidos con un pH entre 5.5 y 6.5 (Guzmán., 1986).
2.4 Composición nutricional La espinaca es una hortaliza con un elevado valor nutricional y carácter
regulador, debido a su elevado contenido en agua y riqueza en vitaminas y
minerales (Tabla 2).
Tabla 2. Composición nutricional de la espinaca. Fuente: Frutas y hortalizas de Colombia. 2008
<online>
Elemento o compuesto Unidad Cantidad
Agua Proteínas Fibra Grasas Carbohidratos Fósforo Hierro Calcio Ácido ascórbico Vitamina A Vitamina B1 Vitamina B2 Vitamina C Calorías
%
%
%
%
%
Mg
Mg
Mg
Mg
U.l
Mg
Mg
Mg
Kcal
89.7
3.5
1.1
0.3
3.3
50
4.1
118
30
2.500
110
200
59
27
2.5 Manejo del cultivo En las zonas donde se cultiva espinaca se dispone de agua durante todo el año,
proveniente de diferentes fuentes: pozos profundos, aljibes, reservorios, aguas
lluvia y aguas del río Bogotá en un porcentaje muy bajo. El sistema de riego más
utilizado es el de aspersión.
La preparación del suelo en la mayoría de los casos se hace
convencionalmente, esto es con el uso de arados de discos, rastras californianas
y rotovos implementos que deterioran el suelo pero que son usados por su
disponibilidad, tradición y falta de conciencia del daño que están causando
(Sánchez et al., 2004). La espinaca generalmente se siembra al voleo en camas
de 1.7m de ancho; con este sistema se alcanza una densidad promedio de 34
plantas /m2 (Gil et al., 2007). En cuanto a la fertilización, esta no se realiza con
base en los resultados e interpretación de una análisis de suelos, sino que
generalmente se realiza una incorporación de estiércol al momento de la siembra
en dosis entre 1 a 1.5 ton/ha antes de surcar y armar las camas. Se realizan
aplicaciones complementarias de fertilizantes foliares con altos contenidos de
nitrógeno y elementos menores. La principal razón de aplicar cantidades altas
de nitrógeno es este cultivo es 90% área foliar y para ello se necesitan buenas
cantidades de este elemento (Sánchez et al., 2004).
2.6. Enfermedades y plagas del cultivo de Espinaca La producción de espinaca como otras hortalizas, el principal limitante es el
manejo de enfermedades, plagas y arvenses. En los cultivos se observa una
serie de daños que generan que los productores realicen hasta seis aplicaciones
de mezclas de pesticidas en un ciclo de cultivo de solo 60 días. Las moléculas
aplicadas con mayor frecuencia son: organofosforados, piretroides, cabamatos,
organosulfurados y extractos vegetales (Gil et al., 2007).
2.6.1 Arvenses Según los productores las arvenses no constituyen un problema severo en la
producción de espinaca, ya que los daños no se observan fácilmente; sin
embargo, en términos biológicos afectan directamente el rendimiento del cultivo
e indirectamente pueden ser hospederas de plagas y enfermedades que inciden
negativamente en la sanidad. Las principales arvenses que se presentan en el
cultivo en el municipio de Cota son: Urtica ureas L.; Ambrosia sp. (Asteraceae),
Capsella bursa-pastori; Galinsogla ciliata L. (Rodríguez et al., 2008).
2.6.2 Enfermedades Son varias enfermedades que afectan el cultivo de espinaca entre ellas se
encuentran: el damping-off causada por el complejo de hongos de Fusarium sp,
Pythium sp, y Rhizoctonia sp; otro hongo que causa una mancha en la hoja de
espinaca es Colletotrichum dematium f. sp spinaciae, y en el caso de
Heterosporium sp., el cual causa lesiones circulares pequeñas de color amarillo.
(LeStrange et al., 2000). Pero la enfermedad que causa mas perdidas
económicas en la mayoría de países en donde se produce espinaca es el mildeo
velloso que es causado por P. farinosa f. sp. spinaciae. En Colombia los
principales limitantes sanitarios del cultivo de la espinaca P. farinosa,
Cladosporium sp., Pythium sp. y Alternaria sp. (Guzmán., 1986) Un manejo
integrado de enfermedades incluye el uso de variedades resistentes, rotación de
cultivos, irrigación, manejo de fertilidad, y fungicidas, que usualmente todos son
necesarios en forma conjunta, para una producción final de alta calidad.
2.6.3 Plagas
En Colombia, principalmente en el municipio de cota (Cundinamarca), Gil et al
(2007) se encontró que los principales artrópodos asociados al cultivo de
espinaca son: Delia sp. (Diptera:Anthomyiidae), Tyrophagus putrescentiae
(Acari: Acaridae), M. persicae (Hemiptera: Aphididae),Clavipalpus ursinus
(Coleoptera:Melolonthidae), trips (Thysanoptera: Tripidae) y trozadores
(Lepidoptera: Noctuidae). Dentro de este grupo los principales daños están
relacionados con la presencia de larvas de Delia sp. y del ácaro T. putrescentiae.
2.7 Sintomatología causada por P. farinosa f. sp. spinaciae.
Esta enfermedad aparece bajo condiciones de baja temperatura y alta humedad.
Las lesiones que causa son irregulares de color amarillo pálido que aparecen en
el haz de las hojas y eventualmente estas se forman distorsionadas y
encrespadas. En el envés de la hoja se forma micelio de color gris azulado
oscuro compuesto además por esporangioforos y esporangios, el cual es del
tamaño de la lesión clorótica que se observa en el has de la hoja (Figura 1A y
1B) (Satou et al., 2002).
BA Figura 1. Hojas de espinaca. A.) Esporangióforos y esporangios en el envés de la hoja causado por Peronospora farinosa f. sp. spinaciae. B.) Manchas cloróticas en el haz de la hoja causada por Peronospora farinosa f. sp. spinaciae. Fuente: Autor.
2.7.1 El patógeno Peronospora farinosa
P. farinosa pertenece al reino Chromista, orden Peronosporales, familia
Peronosporaceae y al género Peronospora (Choi et al., 2006). Donde se
encuentran patógenos que ocasionan enfermedades conocidas con el nombre
de mildeos vellosos. Estos microorganismos son parásitos obligados lo cual
impide su aislamiento en medio artificial (Hall, 1996). Este hongo afecta
especies de la familia Chenopodiaceae del género Beta, Spinacea y
Chenopodium. El aislamiento de Peronospora farinosa únicamente afecta el
género del cual es aislado. El patógeno es subdividido en tres grupos de
acuerdo a sus hospederos: P. farinosa f. sp. betae., P. farinosa f. sp. spinaciae y
P. farinosa f. sp chenopodii (Danielsen et al., 2004).
2.7.2 La Morfología de Peronospora farinosa La morfología de este hongo consiste en una estructura vegetativa con hifas
cenocíticas y multinucleadas, las cuales forman esporangióforos con
ramificaciones dicotómicas y esporangios (Figura 2). Su desarrollo tiene lugar en
la apertura intracelular de la hoja del hospedero y tiene haustorios que sirven
para la absorción dentro de la célula. Al principio el patógeno ataca el envés de
la hojas formando esporangióforos que tiene un tamaño entre 167-227um de
longitud y 110-148um de diámetro (Danielsen et al., 2004).
Figura 2. Esporangióforo y esporangio de Peronospora farinosa. Fuente: Danielsen et al., 2004.
Las oosporas juegan un papel muy importante en el desarrollo de esta
enfermedad (Figura 3). Frinking et al. (1985), mencionan que la producción de
oosporas puede ser inducida por factores que causan estrés en el momento que
la colonización por parte del hongo. Las condiciones favorables de la formación
de oosporas en diferentes especies de Peronospora brindan ciertas
características:
1. Se forman bajo condiciones favorables de senescencia del tejido del
hospedero.
2. Son abundantemente formadas en el tejido clorótico y necrótico del
hospedero.
3. Son frecuentemente encontradas en cotiledones rápidamente debilitados.
4. Son formadas bajo condiciones climáticas no favorables por
reproducción asexual.
5. Son fácilmente formadas en material vegetal separado bajo condiciones
de humedad.
Figura 3. Oosporas de Peronospora farinosa. Fuente: Danielsen et al., 2004.
2.7.3 Ciclo de Vida de Peronospora farinosa
Cuando el esporangio cae en la hoja, este inmediatamente produce el tubo
germinativo en condiciones de humedad relativa de aproximadamente el 80%. El
tubo de incubación tiene una hifa infectiva que penetra la epidermis y después
del período de latencia comienza a formar un micelio que penetra a través de
espacios intercelulares. Cinco o seis días después de la penetración, mientras el
patógeno se va desarrollando dentro del hospedero, inicia la producción de
esporangióforos, el cual se mueve a través de la cara inferior de la hoja dentro
del estoma (Figura 4) (Danielsen et al., 2004).
Las esporangióforos una vez alcanzan su desarrollo total, forman el esporangio.
En ese tiempo el área infectada muestra los primeros síntomas como clorosis, lo
cual indica debilitamiento en las células y menor capacidad de síntesis.
Finalmente el área afectada comienza a sufrir una necrosis y al mismo tiempo la
forma vegetativa del hongo comienza a desaparecer (Danielsen et al., 2004)
Figura 4. Ciclo de vida de Peronospora farinosa. Fuente: Danielsen et al., 2004.
2.8 Razas reportadas de Peronospora farinosa f. sp. spinaciae. En una población de hongos patógenos se tiene determinado las características
morfológicas y fenotípicas en común, las cuales son agrupadas en especies de
patógeno como ocurre con Puccinia graminis que causa la roya en cereales.
Alguno de estos individuos atacan únicamente el trigo o la avena, según esta
característica se agrupan en formas especiales como Puccinia graminis f. sp.
tritici. Dentro de cada forma especial, algunos individuos atacan algunas
variedades de plantas únicamente y de este modo se agrupan en razas. Esto se
conoce como estados de variación de un patógeno (Agrios, 2005).
Se han identificado diferentes razas de P. farinosa f. sp. spinaciae. alrededor del
mundo, las cuales se han registrado principalmente en los Estados Unidos,
Europa y Japón. La identificación de estas razas se ha realizado utilizando la
metodología de un grupo de genotipos de diferenciales, en donde se observa la
susceptibilidad y/o resistencia de los cotiledones como respuesta a diferentes
inóculos del patógeno (Irish et al., 2003). Con el uso de esta metodología se han
registrado en total 10 razas pertenecientes a este hongo.
La raza numero 1 se registró en 1956 y no causo ningún daño en la evaluación
realizada por Bradenberger (1992), en donde utilizó cinco genotipos
diferenciales, de los cuales solamente Viroflay fue susceptible a esta raza. Zink
y Smith (1958) reportaron la raza fisiológica número 2 en el estado de California
en las localidades de Santa Clara, Salinas y Oxnard. La tercera raza fue
reportada por Eenick (1976) en Holanda y causó grandes pérdidas en todos los
cultivos resistentes a las razas 1 y 2 en Europa en 1977; y esta misma raza
apareció en el área de Uvalde, Texas en 1982 (Bradenberger et al., 1991).
La raza 4 de este hongo fue identificada en California y Texas en donde se uso
genotipos diferenciales que incluían Viroflay (susceptible a las razas 1, 2, 3),
Nores (resistente a las razas 1 y 2), Califlay (resistente a las razas 1 y 3) y Polka
y St. Helens (resistentes a las razas 1,2,3). Todos los diferenciales mostraron
susceptibilidad a la raza 4 (Bradenberger et al., 1991). Por otro lado en Italia,
Lorenzini & Nali (1994) reportaron la presencia de esta misma raza. En Japón la
raza 4 es la que causa mayor incidencia de la enfermedad y es controlada por
variedades resistentes. En enero de 2003 en cultivos de espinaca en Palm
Beach Country Florida se reconoció la raza 5 (Irish et al., 2004).
Las razas 6 y 7 se identificaron en aislamientos obtenidos en Estados Unidos y
Europa (Irish et al., 2003). En el 2006 en Japón se encontró una nueva raza, la
cual fue identificada como 5 por medio de genotipos de espinaca establecidos
por The Internacional Seed Federation (ISF), (Satou et al., 2006). El último
reporte indicó la presencia de tres nuevas razas denominadas 8, 9 y 10, las
cuales se obtuvieron en California y Holanda (Irish et al., 2007).
Los genotipos de espinaca de mayor utilización para la identificación de razas
del patógeno que causa mildeo velloso en Estados unidos son Viroflay,
Resistoflay, Califlay, Polka, Bolero, Campania. Dolphin, Tarpy, Lion y Lazio
(Tabla 3). El resultado se evalúa como positivo mayor al 85% de cotiledones
susceptibles y negativo menor al 15% de hojas cotiledonales resistentes.
Tabla 3. Genotipos de espinaca utilizados para la identificación de razas de Peronospora farinosa f. sp. spinaciae. Fuente: Irish et al., 2007.
Razas Genotipo
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
Viroflay Resitoflay Califaly Polea Bolero Campania Dolphin Lion Lazio
+
-
-
-
-
-
-
-
-
+
-
+
-
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+
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-
+
+
+
+
+
+
+
+
-
2.9 Variabilidad genética de los microorganismos La variabilidad genética es de gran importancia en cualquier población de
patógenos para proponer una estrategia en el control de la enfermedad. La
variabilidad depende de diferentes factores, el principal es de selección,
recombinación sexual y parasexual, migración, mutación y de la fluctuación
genética. (Danielsen et al., 2004). Es muy común que muchos organismos,
como hongos patógenos de plantas dependan de un proceso de mutación y
recombinación como ultimo recurso basado en la variación genética (Figura 5).
Dentro de las especies, el flujo de genes entre poblaciones suplementa estos
procesos como propágulos esparciéndose desde un área epidemiológica a otra.
Este flujo de genes, el cual es talvez el más simple, ya que contribuye a una
diversidad de baja estimación (Burdon et al., 1997). El siguiente proceso de
mutación contribuye a la diversidad efectiva de poblaciones que son afectadas
por el coeficiente inherente de la mutación, el nivel ploide de la población de
patógenos (haploide vs. diploide o dicariotico), el tamaño de la población de
patógenos, y la ventaja selectiva se confiere por mutante genotipo. A pesar de
la complejidad, la mutación espontánea es un recuso poderoso para variación de
muchas poblaciones de patógenos. (Burdon, 1992)
Figura 5. Recursos de genes y diversidad genotípica en poblaciones de patógenos. Fuente:
Burdon et al., 1997
Otro factor que influye en la variabilidad genética es la recombinación. En los
organismos fitopatógenos ocurre a través de la reproducción sexual o a través
de procesos de hibridación somática, en el cual el material nuclear y
citoplasmático es intercambiado. El intercambio nuclear debe encontrase por
fusión nuclear y recombinación (ciclo parasexual). Todos estos mecanismos
deben generar el aumento de la diversidad genotípica en poblaciones de
patógenos, pero su importancia varia entre especies (Ellingboe, 1961).
Peronospora farinosa es heterotálico, y la distribución geográfica de los dos tipos
de emparejamiento indica la probabilidad de la formación de estados sexuales y
por consiguiente nuevos tipos patogénicos a través de recombinación (Danielsen
et al., 2004).
2.9.1 Técnicas usadas para la identificación de la variabilidad genética. El análisis de la diversidad genética y las relaciones entre diferentes especies, o
poblaciones e individuos es un trabajo para muchas disciplinas de las ciencias
biológicas. El desarrollo de los llamados “marcadores moleculares”, los cuales
se basan en la búsqueda de polimorfismos en proteínas o ADN han sido
aplicados en una amplia variedad de disciplinas como: taxonomía, filogenia,
ecología, y genética (Weising et al., 1995).
El termino “fingerprinting” o huella del ADN describe el método para la detección
simultánea de una gran cantidad de loci de ADN mediante la hibridación de
pruebas específicas multilocus para fragmentos de restricción separados
electroforéticamente. Los fingerpritings son principalmente obtenidos por dos
estrategias:
1.”Clásica” Fingerprinting basado en hibridación, la cual involucra un corte de
ADN genómico con enzimas de restricción; separación electroforética de
fragmentos resultantes de ADN de acuerdo el tamaño y detección del multilocus
polimórfico por hibridación con una secuencia complementaria de ADN, llamada
previamente “sonda”.
2. Fingerprinting basada en PCR (Reacción en cadena polimerasa), la cual
envuelve la amplificación in vitro de secuencias particulares de ADN con ayuda
de oligonucleotidos (iniciadores) específicos o arbitrarios y una polimerasa
termoestable; la separación electroforética de fragmentos amplificados, y la
detección de patrones de bandas polimórficas mediante tinción con bromuro de
etidio o nitrato de plata (Weising et al., 1995). Las principales técnicas usada
son las de análisis de isoenzimas, técnicas de huella genética como:
amplificación aleatoria del ADN polimórfico (RAPD), la amplificación de los
espaciadores internos de transcripción del ADN ribosomal (ITS); Polimorfismo en
la longitud de fragmentos de restricción (RFLP) y recientemente el Polimorfismo
en la longitud de fragmentos amplificados al azar (AFLPs) (Weising et al, 1995).
2.9.1.1 ITS (Internal Transcribed Spacer) Para la caracterización de un hongo particular es necesario tener iniciadores que
propicien la amplificación de un gen o un segmento especifico de la especie o de
la función que se desea identificar. Así, el desarrollo de procedimientos de
diagnostico basados en PCR requiere el conocimiento de secuencias de
nucleótidos de las regiones blanco, con el fin de diseñar iniciadores específicos.
El ADN que codifica para rRNA se presenta como cluster génico (Figura 6) que
aparece repetido cientos de veces en el genoma del hongo, en donde se incluye
los tres genes: el gen para la subunidad pequeña (18S) el gen para la subunidad
(5.8S) y el gen para la subunidad grande (28S). Estos genes están separados
por dos secuencias no codificantes, denominadas espaciadores internos
transcritos (ITS1 y ITS2) (Ferrucho, 2006).
El cluster génico, que codifica para rRNA aparece repetido cientos de veces en
el genoma del hongo. El hecho de que este cluster génico presenta algunas
regiones altamente conservadas y otras regiones altamente variables, ha
permitido el análisis de variación en diferentes niveles taxonómicos (Steven y
Taylor., 1992). Estudios con ITS han permitido determinar variabilidad entre
seis aislamiento de Peronospora sparsa en donde se según Lindqvist et al.
(1998) informan que los genes de rADN entre las regiones de ITS evolucionan
rápido y tiene una variación interespecifica. De igual manera estas regiones son
útiles para la detección e identificación basada en PCR de otros hongos como
en especies de Phytophthora (Tooley et al., 1997), Fusarium sambbucinum
(O´Donnell, 1992), Colletotrichum acutatum (Sreenivasaprasad et al., 1996).
Figura 6. Esquema de la unidad de rADN par hongos. Se muestran los dominios altamente variables (AV) y altamente conservados (AC) dentro de la región ITS1-5.8S-ITS2 de la unidad transcripcional (rADN) Escala: Barra = 100pb. Fuente: Ospina, et al., 1998. 2.9.1.2 AFLP (Amplified fragment lenght polymorphisms) Otra técnica molecular usada es la detección del polimorfismo de fragmentos
amplificados al azar (AFLP), esta técnica es altamente reproducible,
relativamente rápida y es usada en el estudio de la variación genética de los
hongos (O´Neill et al., 1997; Rosendahl y Taylor, 1997; DeScenzo et al., 1999).
Esta técnica es basada en la amplificación de fragmentos de restricción por PCR
a partir del ADN genómico y esta compuesta por tres pasos: el primero es la
restricción de ADN y la ligación de adaptadores oligonucleótidos; el segundo
consiste en la amplificación selectiva de un grupo de fragmentos de restricción
y el tercer paso es el análisis en gel de poliacrilamida de los fragmentos
amplificados (Figura 7) (Vos et al., 1995).
AV AV AC ITS
ITS
5.8 S rADN
Figura 7. Representación sistemática de la técnica de AFLP. Fuente: Savelkoul et al., 1999.
La amplificación por PCR de fragmentos de restricción es conseguida por el uso
de adaptadores y sitios de secuencias de restricción como sitios dirigidos al
anillamiento del iniciador. La amplificación selectiva se consigue por el uso de
iniciadores que se extienden dentro de los fragmentos de restricción,
amplificando solamente estos fragmentos, los cuales en las extensiones de los
iniciadores se complementan con los nucleótidos flaqueados de los sitios de
restricción (Vos et al., 1995). En la segunda PCR los iniciadores calificados son
extendidos con uno, dos o tres bases selectivas en la posición 3´. En esta línea
el número de fragmentos que pueden amplificarse simultáneamente puede ser
en un rango de 10 a 100 (Van der Lee et al., 1997).
Mediante la selección del número de nucleótidos selectivos es posible controlar
el número de fragmentos a amplificar. El polimorfismo es detectado por la
presencia o ausencia de bandas debido a mutaciones en los sitios de restricción
o en secuencias adyacentes a estos, los cuales se complementan o se
diferencian de los nucleótidos selectivos añadidos a los cebadores de la PCR,
por inserciones o delecciones dentro del fragmento amplificado (Savelkoul et al.,
1999).
Las ventajas de esta técnica es que desde la restricción de los fragmentos de
ADN que se amplifican por PCR en AFLP, únicamente una pequeña parte del
ADN geonómico es necesario para la producción de miles de marcadores de
AFLP. Esto es esencial con un organismo biotrófico como Peronospora sparsa
que esporula débilmente, así limitando la cantidad de material disponible para la
extracción de DNA (Lindqvist et al., 2002).
Además se obtiene un alto grado de polimorfismo, un mayor número de
marcadores por gel analizado y no requiere del conocimiento de la secuencia de
ADN. Debido a la cantidad de marcadores que pueden ser generados, el mapeo
genético puede realizarse con mayor rapidez y más fácilmente. Es una técnica
que se utiliza para estudios de biodiversidad porque revela fundamentalmente el
polimorfismo dominante, que puede ser por la presencia o ausencia del sitio de
restricción o por una simple variación de un nucleótido en el genoma (Cornide et
al., 2002).
3. FORMULACION DEL PROBLEMA Y JUSTIFICACION
La producción de frutas y hortalizas ha contribuido en el desarrollo y en la
generación de empleo en las zonas rurales de Colombia. Según el Ministerio de
Agricultura y Desarrollo Rural, la superficie sembrada de hortalizas en nuestro
país presentó un crecimiento de 26% entre 1991 y 2001 (DANE et al 2002), lo
que permite considerarla como una alternativa productiva económicamente
viable en diversas zonas geográficas. Sin embargo, muchos factores como el
atraso tecnológico en la producción de hortalizas generan una baja
sostenibilidad y competitividad, que ligados principalmente con problemas
fitosanitarios y deterioro de recursos dan como resultado bajos rendimientos
biológicos incentivando el uso indiscriminado de agroquímicos.
El cultivo de la espinaca Spinacea oleracea L. (Chenopodiaceae) es uno de los
mas importantes en el área de producción de hortalizas de la Sabana de Bogotá
por su demanda mundial como producto fresco y procesado. El municipio de
Cota en Cundinamarca ha presentado un mayor crecimiento del cultivo, hasta el
punto de convertirse en la principal actividad productiva. Por tal razón es de
gran importancia observar una excelente calidad en las hojas de la espinaca, ya
que son la parte comercial de este producto y la más susceptible al ataque de
Peronospora farinosa causante del mildeo velloso. Si la enfermedad no es
controlada puede generar grandes pérdidas económicas al agricultor. Para el
manejo de esta enfermedad se utilizan productos químicos que en periodos
cortos inhiben el desarrollo del hongo y a largo plazo pueden llegar a generar
resistencia lo que conlleva a aplicaciones indiscriminadas del mismo causando
un deterioro ambiental y riesgo para la salud humana.
Este trabajo de investigación hace parte del proyecto de Generación de
estrategias de manejo integrado de plagas en cultivos de lechuga, cilantro y
espinaca bajo esquemas de producción limpia, el cual tiene como objetivo
específico la evaluación de estrategias de Manejo Integrado de plagas (MIP)
teniendo en cuenta la búsqueda de controles culturales y ecológicos.
En este contexto es necesario conocer dentro del sistema de producción de
espinaca en la sabana de Bogotá, la presencia de razas de Peronospora
farinosa f. sp. spinaciae reportadas mundialmente. De esta manera, el desarrollo
de esta propuesta es de gran importancia para el manejo del cultivo de espinaca
a través de la identificación de las razas de Peronospora farinosa f. sp. spinaciae
y el reconocimiento de diferencias genéticas entre las muestras obtenidas en
fincas de tres municipios de la Sabana de Bogotá.
Los resultados producto de la investigación permitirán un manejo adecuado de la
enfermedad mediante el uso de variedades resistentes, la disminución en la
aplicación de fungicidas y la reducción en los costos de producción; igualmente
estimulará a los agricultores en el empleo de controles culturales y ecológicos
así como en un uso racional, oportuno y seguro de productos químicos. Por otra
parte se pretende desarrollar herramientas que permitan a los productores ser
más competitivos y mejorar sus relaciones con el entorno en el que se
desarrollan su actividad.
4. OBJETIVOS
4.1 Objetivo general Determinar las razas y la diversidad genética preliminar de Peronospora farinosa
f. sp. spinaciae, agente causal del mildeo velloso en cultivos de espinaca en tres
municipios de la Sabana de Bogotá.
4.2 Objetivos específicos
Identificar razas de Peronospora farinosa f. sp. spinaciae mediante el uso
de genotipos diferenciales de espinaca.
Evaluar la diversidad genética de las muestras de Peronospora farinosa f.
sp. spinaciae, obtenidas en cultivos de espinaca de la sabana de Bogotá
con base en el análisis AFLP.
Comparar si las razas obtenidas de los tres municipios presentan
diferencias genéticas entre ellas, detectables con el marcador utilizado.
5. MATERIALES Y METODOS
5.1 Lugar de muestreo El muestreo se realizó en la Sabana de Bogotá, en los municipios de Cota, Tabio
y Tenjo, principales productores de espinaca en el país (Figura 8).
Figura 8. Lugar de Muestreo en la Sabana de Bogotá. Fuente: geocities <online>, 2008
Se evaluaron cuatro fincas distribuidas en los tres municipios entre los meses de
diciembre 2007 y enero 2008. En el municipio de Cota se evaluaron las fincas
“Alcalá” y “El Hoyo” que en ese momento se encontraban cultivadas con el
híbrido Quinto®. En Tabio se evaluó la finca “La Palestina” cultivada con el
híbrido Corona superior® y en Tenjo la finca “El Cucharo” cultivada con el híbrido
Grenell® (Select 424). En cada finca se tomó un lote con un área promedio de
2000m2. Se realizó un muestreo aleatorio tomando varias muestras de hojas de
espinaca con la presencia de mildeo velloso y síntomas de la enfermedad.
5.2. Toma de muestras e información de cada finca Inicialmente se elaboró un formato por cada finca con datos del tipo de suelo,
híbrido o variedad de semilla, edad del cultivo, esquema de fertilización,
irrigación, uso de químicos para el control de mildeo velloso, etc. y
posteriormente en cada lote de espinaca se tomaron registros de humedad
Municipios seleccionados
relativa y temperatura utilizando un controlador Cox tracer®. y de precipitación
con un pluviómetro durante el mes de muestreo (diciembre 2007- enero 2008).
En cada finca se tomó una hoja por planta para un total de 40 hojas por finca. La
selección de las hojas se realizó teniendo en cuenta la clorosis en el haz de la
hoja ocasionada por el patógeno y presencia de esporangióforos y esporangios.
Los muestreos se realizaron en la cuarta o quinta semana de cultivo.
Las hojas colectadas fueron almacenadas en bolsas de papel que a su vez se
colocaron dentro de bolsas con cierre hermético para mantener la humedad. Las
muestras se rotularon con el nombre de la finca y fecha de colección y fueron
transportadas en nevera de icopor a temperatura ambiente al laboratorio de
fitopatología del centro de investigaciones y Asesorías Agroindustriales (CIAA)
de la Universidad Jorge Tadeo Lozano en donde se realizaron las pruebas de
identificación de razas y al Laboratorio de Microbiología ambiental y de suelos
del Departamento de Microbiología de la Pontificia Universidad Javeriana donde
se llevó a cabo el estudio preliminar de diversidad.
5.3 Identificación de razas
En el CIAA se llevó a cabo la identificación de razas con un grupo de
diferenciales suministrado por el Dr. James Correll del Departamento de
Patología de plantas de la Universidad de Arkansas en Fayeteville. En este
grupo se encuentran los genotipos que se han utilizado para la caracterización
de razas de mildeo velloso en Estado Unidos. Los genotipos utilizados por
Correll et al (2005) son Virofaly, Resistoflay, Califaly, Polka, Bolero, Campania,
Dolphin, Tarpy, Lion, Lazio con los cuales se ha hecho la identificación de 10
razas patogénicas (Tabla 3).
Debido a que el ingreso de semillas debe ser verificado y validado por el Instituto
Colombiano agropecuario (ICA), se realizó el procedimiento necesario exigido
por el ICA y por la APHIS- USDA de Estados Unidos (Anexo 1). La metodología
se llevó a cabo siguiendo el protocolo propuesto por Irish y sus colaboradores en
el 2003 (Anexo 2), con algunas modificaciones con el fin de estandarizar la
metodología en el laboratorio de fitopatología del CIAA. Los ensayos se
realizaron por triplicado con cada uno de los cuatro inóculos.
5.3.1 Germinación de las semillas.
Para la siembra se utilizó turba estéril. Se realizaron tres lavados de las semillas
con agua destilada 24 horas previas a la siembra para eliminar residuos del
fungicida (Thiram) aplicado como requisito de ingreso de las semillas a
Colombia. Nueve de los diez genotipos diferenciales se sembraron en la mitad
de una bandeja de germinación y en la otra mitad se sembró la variedad Virofaly
(susceptible a todas las razas) con el fin de mantener el inóculo de cada finca.
Las semillas germinaron entre 8 y 10 días hasta la aparición de las hojas
cotiledonales (Figura 9). Este ensayo se realizó bajo condiciones de invernadero
con una temperatura promedio de 18°C.
Figura 9. Plántulas de diferentes genotipos de espinaca 10 días después de la siembra. Fuente:
Autor.
5.3.2 Preparación del inóculo.
Para la preparación del inóculo inicialmente se realizó una impronta de las hojas
con micelio visible y tinción con azul de lactofenol con el fin de identificar
esporangióforos con ramificaciones dicotómicas características del género
Peronospora (Agrios, 2005). Las partes de las hojas que tuvieran micelio externo
fueron cortadas y colocadas en un beaker con agua destilada a 4°C y agitadas
durante 5 minutos. Posteriormente se filtró el inóculo a través de una capa de
“miracloth” para eliminar el micelio y obtener únicamente esporas. Finalmente se
ajustó la concentración entre 2.0 y 3.0 X 105 esporas/ml empleando una cámara
de Neubauer (Figura 10).
Figura 10. Procedimiento realizado para la obtención del inoculo de Peronospora farinosa f. sp spinaciae. A. Hoja de espinaca con lesión ocasionada por el patógeno. B. fracciones de hoja en agua destilada. C. MIcelio externo filtrado para obtención de esporangios. Fuente: Autor.
5.3.3 Inoculación de Peronospora farinosa f. sp spinaciae sobre hojas
cotiledonales de los genotipos diferenciales.
Para los ensayos de inoculación se seleccionaron 10 plántulas germinadas por
genotipo para un total de 100 plántulas por inóculo. Las bandejas de
germinación fueron regadas previamente con agua destilada a 4°C. En cada
genotipo se inocularon las hojas cotiledonales por aspersión de la suspensión de
esporas de P. farinosa utilizando un aerógrafo. Cada bandeja de germinación se
colocó dentro de una bolsa transparente en una cámara húmeda para mantener
las condiciones necesarias para la infección del hongo (100% de humedad
relativa y temperatura de 20°C por 24 horas). Posteriormente las bandejas
fueron retiradas de las bolsas plásticas y se mantuvieron dentro de la cámara
húmeda con una HR del 80%. En esta cámara se mantuvieron durante 6 días
con un fotoperíodo de 12 horas con el fin de inducir la esporulación (Figura 11).
La humedad y la temperatura fueron medidas utilizando un controlador de
temperatura (Cox Tracer®) durante todo el proceso de esporulación del hongo.
Una vez esporulado el hongo (séptimo día) se realizó la identificación cualitativa
de razas tomando como susceptible cualquier genotipo con una esporulación ≥
85% del total del número de cotiledones y como resistente los genotipos con
esporulación ≤15% del total del número de cotiledones. La evaluación de la
esporulación se realizó cualitativamente y cuantitativamente en donde se dividió
cada hoja cotiledonal en cuatro partes (25%) para obtener un 100% y así
obtener el porcentaje de esporulación.
A B C Figura 11. Procedimiento de inoculación de Peronospora farinosa f. sp spinaciae en los diferentes genotipos. A. Inoculación del patógeno por aspersión. B. Bandeja de semillas en bolsa transparente (cámara húmeda al 100%). C. Bandeja de germinación dentro de una cámara húmeda 80%. Fuente: Autor
5.4 Diversidad genética de Peronospora farinosa Para tener un panorama general de la diversidad de P. farinosa, las hojas
muestreadas en las cuatro fincas se lavaron cuidadosamente con agua destilada
para eliminar residuos de suelo y otros elementos. Posteriormente se realizó
una observación microscópica con azul de lactofenol para reconocer los
esporangios y esporangióforos. Una vez confirmada la presencia del hongo, las
muestras fueron almacenadas a -20°C. Los esporangióforos y esporangios
congelados fueron retirados con ayuda de una espátula delgada previamente
autoclavada y se colocó en tubos de 1.5 ml. El micelio externo obtenido de las
hojas de cada cultivo fue reunido para obtener un “pool” del patógeno por finca.
5.4.1 Extracción de ADN
Se probaron los protocolos de extracción de ADN propuestos por Lindqvist et al
(1998), Ristaino et al (1998) y Judelson et al (1996). Se escogió el protocolo de
Judelson y sus colaboradores por la calidad, pureza y cantidad de ADN
obtenida.
La Extracción de ADN se realizó a partir de esporangióforos y esporangios
obtenidos empleando el protocolo propuesto por Judelson et al., 1996. Para
esto se tomó entre 5 y 15mg de inóculo puro del patógeno y se colocó en tubos
eppendorff de 1.5 ml. A cada tubo se agregó 400 µl de buffer de extracción (Tris
HCL 0.2M pH 8.5, NaCl 0.25M, EDTA 0,025M) (Anexo 3), se llevó a un beaker
con agua en ebullición durante 5 minutos y se adicionó 400 µl de
fenol:cloroformo 1:1 (Anexo 4). Esta mezcla se colocó en el vortex por 5 minutos
y se centrifugó a 7000 rpm durante 10 minutos (Jouan®). El sobrenadante se
transfirió a un tubo de eppendorf nuevo al cual se le adicionó 2 volúmenes de
etanol absoluto frío y se dejó precipitar a -20°C por una hora. Posteriormente se
centrifugó a 10000 rpm por 15 minutos y el sobrenadante fue descartado El
pellet se lavó con etanol al 70% y se centrifugó de nuevo durante 3 minutos a
4000rpm. El pellet se dejó secar durante 15 minutos manteniendo en posición
vertical el tubo de eppendorf sobre una toalla absorbente y el ADN fue
resuspendido en 50 µl de agua HPLC.
5.4.1.1 Evaluación espectrofotométrica del ADN.
La pureza y concentración del ADN se evaluó en un equipo NanoDrop 1000 de
Thermo Scientific®. El procedimiento consistió en colocar una alícuota de 2µl de
ADN purificado. Primero se analizó la cantidad de ácidos nucleicos y
posteriormente se calculó el valor de la relación a260/280 para determinar la
pureza del ADN extraído de cada muestra de acuerdo a la siguiente formula:
[ADN] µg/ml = A260x FDx50.
5.4.1.2 Evaluación electroforética del ADN.
La calidad del ADN se evaluó por electroforesis en un gel de agarosa 0.8% en
buffer TAE 1x (Tris-acetato) teñido con Bromuro de Etidio (EtBr) 0.5µg/ml de
acuerdo con el protocolo propuesto por Sambroock et al., (1989) (Anexo 6), El
corrido se llevó a cabo en una electroforético cámara Thermo EC330 Midicell®
Primo. El peso molecular del ADN obtenido se evaluó por comparación visual
con los marcadores de tamaño molecular 100kb (Promega®), bajo luz
ultravioleta. Los geles fueron fotografiados en el equipo Gel documentation de
Biorad®.
5.4.2 PCR con iniciadores específicos para amplificación de ITS. Para la amplificación de los espaciadores internos ITS1-ITS2 se utilizaron los
iniciadores universales ITS1 e ITS4 (Lindqvist et al., 1998) (Tabla 5). La mezcla
de reacción contenía 2µl de ADN diluido (1:10), buffer PCR 1X, 2mM MgCl2, 200
µM de la mezcla de dNTPs, 0.2 µM de cada primer y 0.75U/15µl de Taq DNA
polimerasa para un volumen total de 15µl. Las reacciones de amplificación se
llevaron a cabo en un termociclador MJ PTC-100 con el siguiente perfil de
temperaturas: denaturación inicial a 95°C durante 5 min, 35 ciclos de 1.5
minutos a 95°C, 2 minutos a 56°C y 3 minutos a 72°C; y una extensión final de 5
minutos a 72°C (Casimiro, et al., 2004). Los productos de amplificación se
corrieron en gel de agarosa al 1.5%, en 1X TBE (0.09MTris, 0.09M borato de
sodio y 2.4mM EDTA pH 8.3) a 60 V por 1h, usando el marcador 1kb (Promega®)
y fueron visualizados y fotografiados un equipo Gel Documentation de Biorad®.
Tabla 4. Secuencia de los iniciadores utilizados para la amplificación de las regiones ITS. Fuente:
Lindqvist et al., 1998
Iniciadores Secuencia bases
ITS1 (forward)
ITS4 (reverse)
(5´-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3´)
(5´-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3´)
19
20
5.4.3 Técnica AFLP
La amplificación aleatoria de fragmentos de ADN genómico digerido se llevó a
cabo empleando el protocolo que acompaña el kit “.AFLP® Analysis System for
Microorganisms” de Invitrogen life technologies® (Anexo 7), con las siguientes
modificaciones:
- Digestión de ADN genómico: Cada muestra de ADN se ajustó a una
concentración de 100ng/μl. La restricción se realizó con las enzimas Mse I de
corte poco frecuente y EcoRI de corte frecuente. El volumen final de la reacción
fue de 12.5μl que contenían 2.5μl de buffer 5X, 1μl de la mezcla de las enzimas
y 5μl de ADN de cada muestra. Como control positivo se utilizó DNA de E. coli a
una concentración de 100ng/μl. La reacción se incubó a 37°C por 2 horas.
- Ligación de Adaptadores: En este caso se utilizó la solución de ligación que
contenía los adaptadores de EcoRI / Mse I. Se tomaron 11μl de la reacción de
restricción y 1μl de T4 ADN ligasa con una concentración de 1U/μl para un
volumen final de 12μl, el cual se incubó a 20°C por 2 horas. La reacción de
ligación se diluyó 1:5 en buffer TE (10mM Tris-HCl (pH 8.0), 0.1 mM EDTA).
- Reacción de Preamplificación: En la primera amplificación se utilizaron
iniciadores con nucleótidos no selectivos (E+0 y M+0); del primer E-0 se agregó
1.35μl y 6 μl del primer M-0; igualmente se adicionó 2.5μl de buffer 10X con Mg;
0.5μl de la Taq polimerasa (5U/μl); y 2.5μl.del ADN producto de la restricción y
ligación. El volumen final de la reacción fue de 25.5μl. Esta preamplificación se
realizó en un termociclador MJ PTC-100, con las siguientes condiciones: 20
ciclos a 94°c por 30s, 56°C por 60s y por ultimo 72°C por 1 minuto. El producto
de esta reacción se diluyó 1:10 en TE (10mM Tris-HCl (pH 8.0), 0.1 mM EDTA).
- Amplificación selectiva: En este último paso se utilizaron iniciadores con
nucleótidos selectivos (E+1/M+1 o E+2/M+1) como: EAC-MA, EAC-MC, EA-MT
Y EC-MG. Esta reacción utilizó dos mezclas: la primera mezcla tenía los
iniciadores de EcoR I y Mse I, en donde se adicionó 0.5 y 4.5 respectivamente.
El segundo “Mix” contenía 2μl de buffer 10X; 0.1μl de Taq polimerasa (5U/μl) y
7.9μl de agua destilada. A la reacción final se le agregó 5μl de el ADN diluido
(producto de la amplificación); 5μl del “Mix1” y 10μl del “Mix 2”. Las condiciones
de PCR que se utilizarón fueron las recomendadas por el protocolo que
acompaña el “kit” de Invitrogen.
- Preparación del gel de poliacrilamida: El gel de poliacrilmaida se preparó al 4%
29:1(acrilamida-bisacrilamida) (Anexo 8). Para la polimerización del gel se
agregaron 700 μl de Persulfato de amonio y 150 μl de TEMED. A cada una de
las muestras (20 μl) se les agrego 3.2 μl de buffer de carga (Anexo 9) y
posteriormente se denaturaron durante 4 minutos. La electroforesis se corrió a
110W durante 1 hora y 25 minutos en buffer TBE 1X (Anexo 10), utilizando 4 μl
de la reacción de amplificación. El gel fue teñido con nitrato de plata de acuerdo
con las indicaciones de Van der Lee et al (1997) (Anexo 11 y 12).
5.4.4 Análisis de la información
Se establecieron los patrones de bandas en cada finca evaluada mediante una
matriz básica de presencia y ausencia (1 y 0) (Anexo 13): los pesos moleculares
de cada banda se determinaron teniendo como referencia los pesos moleculares
del marcador 10pb (Invitrogen®). Posteriormente, se utilizó el programa NTSYS
versión 2.0 y se construyó la matriz de similaridad genética utilizando el índice de
Dice a partir del cual se realizó el análisis de agrupamiento UPGMA (Anexo 14) y
el correspondiente dendograma.
6. RESULTADOS
6.1 Recolección de muestras y descripción climática Paralelamente al muestreo de mildeo velloso, se elaboró una ficha con la
información general del cultivo que incluye nombre del propietario, nombre de la
finca, municipio, vereda, coordenadas, condiciones ambientales, clase de textura
del suelo, híbridos cultivados, esquema de fertilización, plagas y patógenos
presentes en cada una de las fincas de los tres municipios seleccionados (Tabla
5). La edad promedio de los cultivos de espinaca de las 4 fincas en el momento
del muestreo fue de 4.5 semanas.
La temperatura promedio registrada entre los meses de diciembre 2007 y enero
de 2008 tiempo en cual se realizaron los muestreos fue de 12.90°C, para el
municipio de Cota, 12.25°C en el municipio de Tabio y 12.05°C para el municipio
de Tenjo. La humedad relativa en las fincas muestreadas presentó valores
promedio entre 85-86%, lo que favorece la esporulación del patógeno. Según la
metodología utilizada para este trabajo la esporulación de hongo bajo
condiciones del laboratorio se obtuvo con un 80% de humedad relativa.
De acuerdo con la información consignada en la ficha técnica, se observó que
los principales problemas fitosanitarios en los cultivos muestreados son
causados por hongos como Pythium sp. y Peronospora farinosa f. sp. spinaciae.
En cultivos de espinaca en Washington se ha identificado a Pythium sp. como un
hongo que ataca principalmente las plántulas de espinaca causando el
“Damping off” (Washington State University, 2008 <online>). Debido a los
problemas que generan estos patógenos sobre la producción de espinaca, los
agricultores utilizan estrategias de control basadas principalmente en la
aplicación de productos químicos. En el caso de Peronospora sp. se utiliza
ampliamente un fungicida sistémico que tiene como principio activo
Metalaxyl+Mancozeb; y otro producto comúnmente empleado es Antracol que es
un fungicida de contacto cuyo principio activo es Propineb. De acuerdo con la
información consignada en las fichas técnicas se observó que no hay evidencia
del uso de productos biológicos para el manejo del agente causal del mildeo
velloso en ninguno de los cultivos muestreados
Otros problemas fitosanitarios asociados a este cultivo en los diferentes
municipios son ocasionados por insectos plaga como: Delia sp., y Tyrophagus
sp. que de acuerdo al estudio realizado por Gil y colaboradores en 2007 son
controlados principalmente con compuestos: organofosforados como: Clorpirifos,
Profenofos y Metamidofos),piretroides (Deltametrina), carbamatos
(Carbofuran),organosulfurados (Tetradifon) y extractos vegetales entre otros
(ajo-ají).
Tabla 5. Información general y características geográficas de las fincas evaluadas. Fuente: Autor
Finca 1 2 3 4 Nombre del propietario
Carlos Calderón Néstor Calderón Frescura Emiliano Mejia
Nombre de la finca El Hoyo Cota
Alcalá El Cucharo La Palestina
Municipio Cota Cota Tenjo Tabio Vereda Pueblo Viejo Rozo Martín y Espina Casco urbano Área de Lote 4 fanegadas 5 fanegadas 9
hectáreas 2 fanegadas
Edad del cultivo 3 semanas 6 semanas 4 semanas 5 semanas Altura (msnm) 2.572 2.570 2.594 2.615 Latitud 0.4°47´37” 0.4°46´51.15” 0.4°50´6.54” 0.4°54´05” Longitud 74°06´54.5” 74°07´28.75” 74°07´2.67” 74°06´01” Temperatura Promedio (°C)
12.90 12.90 12.05 12.25
Humedad Promedio (%)
85.06 85.06 86.54 86.0
Precipitación promedio (cm)
0.72 0.72 1.80 1.90
Tipo de suelo Franco Arenoso Franco Limoso Franco Limoso Franco Arenoso
Hibrido Quinto Quinto Grenell Corona Irrigación Aspersión Aspersión Aspersión Aspersión Fertilización Triple 15
Uniplex Uniplex Roca fosfórica
Compost Humus sólido
Gallinaza
Químicos (mildeo velloso)
Ridomil Antracol
Antracol Ridomil Ridomil Antracol
Otros patógenos y plagas
-Tyrophagus sp -Delia sp - Phytium sp
-Tyrophagus sp - Delia sp - Phytium sp
-Tyrophagus sp - Delia sp - Phytium sp
-Tyrophagus sp - Delia sp
6.2 Identificación de razas por medio de cultivo de genotipos diferenciales. Los genotipos más susceptibles a los cuatro inóculos del patógeno fueron
Viroflay, Resistoflay y Campania con las cuales se obtuvo un porcentaje >85%
de esporulación en las hojas cotiledóneas (Figura 12). Otros dos genotipos que
presentaron esporulación en un porcentaje menor (17% aproximadamente)
fueron Dolphin y Bolero. En los cinco genotipos restantes no se observó
susceptibilidad a Peronospora farinosa f. sp. spinaciae en los tres ensayos
realizados. Igualmente para comprobar la presencia del patógeno se realizó una
observación microscópica de hojas cotiledóneas esporuladas y se observaron
esporangióforos con ramificaciones dicotómicas y esporangios (Figura 13).
Estas características morfológicas coinciden con las descritas para Peronospora
spp (Agrios, 2005).
Figura 12. A. Hojas cotiledonales de genotipos diferenciales a los siete días de inoculadas. A. Variedad de Viroflay susceptible a Peronospora farinosa f. sp. spinaciae. B. Hoja cotiledonea de Resistoflay susceptible a Peronospora farinosa f. sp. spinaciae. Fuente: Autor.
Figura 13. Peronospora farinosa f. sp. spinaciae. A. Esporangioforo con ramificación dicotómica. B. Esporangios. Fuente: Autor
En la finca “Alcalá” (Cota) los genotipos más susceptibles (>85%) fueron
Viroflay, Resistoflay y Campania y un 22% en Bolero. Respecto a la finca de
“La Palestina” del municipio de Tabio, los resultados también se presentaron en
los cuatro genotipos anteriores, pero con Bolero se obtuvo solamente un 17% de
esporulación. Por otro lado en la fincas de “El Hoyo” (Cota) y “El Cucharo”
(Tenjo) se observó la esporulación de las hojas cotiledonales en los genotipos
Dolphin (18% y 21% respectivamente), Viroflay, Resistoflay y Campania (>85%)
(Tabla 6). La Tabla 7 muestra los resultados sobre la susceptibilidad (+) y/o
resistencia (-) de los diez genotipos a los cuatro inóculos de Peronospora
farinosa f. sp. spinaciae.
Tabla 6. Porcentaje de esporulación obtenido con los 10 genotipos diferenciales inoculados con cada “pool” de Peronospora farinosa f. sp. spinaciae de cada municipio. Fuente: Autor.
Genotipo
% Esporulación
Alcalá (Cota)
El Hoyo (Cota) La Palestina
(Tabio) El Cucharo
(Tenjo) Viroflay Resistoflay Califaly Polka Bolero Campania Dolphin Tarpy Lion Lazio
>85
>85
0
0
22
>85
0
0
0
0
>85
>85
0 0 0
>85
18 0 0 0
>85
>85
0
0
17
>85
0
0
0
0
>85
>85
0
0
0
>85
21
0
0
0
Tabla 7. Susceptibilidad (+) o resistencia (-) de los genotipos al inoculo de Peronospora farinosa f.
sp. spinaciae en cada finca. Fuente: Autor.
Genotipo
Susceptible (+) Resistencia (-)
Alcalá (Cota)
El Hoyo (Cota) La Palestina
(Tabio) El Cucharo
(Tenjo)
Viroflay Resistoflay Califaly Polka Bolero Campania Dolphin Tarpy Lion lazio
+ + - - + + - - - -
+ + - - - + + - - -
+ + - - + + - - - -
+ + - - - + + - - -
Con los resultados obtenidos se puede afirmar que las razas identificadas en
estos tres municipios de la Sabana de Bogotá corresponden a la razas 5 y 8
(Tabla 8). La raza 5 fue identificada por Correll et al., 1997 en el estado de
California, en Europa se reconoció en 1998 por Schafer (no publicado);
igualmente en cultivos de Chiba, Japón en julio de 2003 (Satou et al., 2006); y
por último en Palm Beach Country Florida (Irish et al., 2004). Por su parte, la
raza 8 fue identificada por Irish y sus colaboradores en 2007 en los estados de
California y Arizona en los Estados Unidos.
Tabla 8. Razas obtenidas en los municipios de Cota, Tabio y Tenjo a partir de variedades
diferenciales. Fuente: Autor.
Municipio
Raza
Alcalá (Cota)
El hoyo (Cota)
La palesrina
(Tabio)
El Cucharo (Tenjo)
5
8
5
8
6.3 Extracción de ADN Para la extracción de ADN se utilizaron los protocolos propuestos por Lindqvist
et al (1998), Ristaino et al (1998) y Judelson et al (1996). Los dos primeros
protocolos no fueron exitosos porque al realizar la evaluación de la pureza
(A260/A280) se obtuvieron valores promedio de 1,1 mientras que con el
protocolo de Judelson y colaboradores se obtuvo una mejor pureza del ADN
(Tabla 9). Aunque la pureza que se recomienda a partir de una extracción de
ADN es de 1.8 – 2.0.
Tabla 9. Cantidad y pureza del ADN extraído de cada una de las muestras. Fuente: Autor.
Muestra Cantidad µl/ml Absorbancia 260 Absorbancia 280
Relación 260/280
Alcalá (Cota)
El hoyo (Cota)
La Palesrina
(Tabio)
El Cucharo (Tenjo)
213.78
476.90
54.065
164.27
1.200
1.321
0.170
0.479
0.901
0.959
0.132
0.362
1.332
1.378
1.352
1.322
El protocolo de Judelson et al (1996) utiliza solventes orgánicos como el fenol y
cloroformo, los cuales permitieron una mejor remoción de polisacáridos y
proteínas dando como resultado un ADN de alto peso molecular que fue
confirmado mediante electroforesis en gel de agarosa al 0.8% (Figura 14).
Figura 14. Electroforesis en gel de agarosa al 0.8% para observar la calidad de ADN. 1.) Finca de “El Hoyo” (Cota). 2.) Finca “Alcalá” (Cota) 3.) Finca de “El Cucharo” (Tenjo). 4.) Finca de “La Palestina” (Tabio). 5.) Control Negativo y MPM (1Kb ladder). Fuente: Autor. 6.4 Amplificación de la región ITS
En la Figura 15 se puede observar los productos de amplificación, fragmentos
ITS obtenidos con los iniciadores, ITS1 e ITS4. El peso molecular de los
productos se encuentra alrededor de 750pb-800pb. Casimiro et al (2004)
amplificaron el ITS1, ITS2 y toda la región ITS de Peronospora parasitica
utilizando los iniciadores ITS4 y ITS5 y obtuvieron fragmentos de 323pb, 684pb y
987pb respectivamente. Por otro lado con especies de Phytophtora se amplificó
el ITS1 (región entre el gen 18S y 5.8S) y el ITS2 (región entre el gen 5.8S y
28S) con los iniciadores ITS1 y ITS4. Los resultados obtenidos por Lee et al
(1992) indicaron 233pb para la región ITS1 y 436pb para el ITS2.
Figura 15. Electroforesis en Gel de agarosa (1.5%) de las regiones ITS amplificadas. . 1.) Finca de “El Hoyo” (Cota). 2.) Finca “Alcalá” (Cota) 3.) Finca de “El Cucharo” (Tenjo). 4.) Finca “La Palestina” (Tabio). 5.) Control Negativo y MPM (1Kb ladder). Fuente: Autor.
6.5 AFLPs Para la estandarización del protocolo AFLP se utilizaron inicialmente las
combinaciones sugeridas en el “kit” y que han sido evaluadas en Colletotrichum
spp. y otras dos combinaciones (EAC-MA, EAC-MC, EA-MT Y EC-MG) fueron
escogidas para obtener mayores patrones de bandas reproducibles. Aunque con
la combinación EAC-MC se obtuvo una mayor cantidad de bandas (43) y una
mejor densidad de marcadores polimórficos (Figura16). Las bandas que se
tuvieron en cuenta por su resolución en el gel, fueron aquellas que estuvieron
entre 40pb y 200pb. Con la información obtenida en el gel de poliacrilamida, se
elaboró la matriz básica de ausencia (0) y presencia (1) de bandas (Anexo 13) y
se construyó la matriz de similaridad genética (Anexo 14) utilizando el índice de
Dice a partir del cual se realizó el análisis de agrupamiento UPGMA y se
construyó el dendograma que se muestra en la figura 17.
El OTU correspondiente al inóculo de Peronospora farinosa f. sp. spianciae de
la finca “La Palestina” del municipio de Tabio fue el más distante con un
coeficiente de 0.45. Los OTUS que pertenecían a los inóculos procedentes de la
finca de “El Hoyo” (Cota) y la finca de “El Cucharo” del municipio de Tenjo
mostraron gran similitud (0.75); y por último el OTU del inóculo de la finca de
“Alcalá” (Cota) fue genéticamente más cercano al grupo que incluye los OTUS
de la finca “El Hoyo” (Cota) y “El Cucharo” (Tenjo) con un coeficiente de 0.48. El
resultado del análisis de AFLPs con las combinaciones de iniciadores evaluadas
mostró que ninguno de los OTUS presenta un patrón de bandas igual al de otro
(Figura 16). .
Un resultado muy importante al realizar AFLPs es obtener bandas únicas que
pueden ser utilizadas para el diseño de iniciadores específicos de cada especie
y así permitir la identificación de una sola cepa o aislamiento de determinada
población. Los resultados obtenidos indicaron bandas únicas por inoculo de
Peronospora farinosa f. sp. spinaciae. Para la finca de “Alcalá” del municipio de
Cota se generaron 3 bandas, para el inoculo de la finca de “El Hoyo” se obtuvo
una sola banda, en el caso de la finca “La Palestina” de Tabio se obtuvo 5 y por
último 2 bandas para el inoculo proveniente de la finca “El Cucharo” de Tenjo.
Este resultado sugiere que es necesario evaluar nuevas combinaciones de
iniciadores que como en este caso generen bandas únicas que permitan
establecer una relación clara con la identificación de razas en los genotipos
diferenciales.
Figura 16. “Huellas genéticas” obtenidas con AFLPs. Combinación de iniciadores EAC-MC. 1.) Finca “Alcalá” (Cota). 2.) Finca “El Hoyo” (Cota). 3.) Finca “La Palestina” (Tabio). 4.) Finca “El
Cucharo” (Tenjo). Fuente: Autor
Figura 17. Dendograma obtenido mediante el análisis de los AFLPs con el Coeficiente de Dice y el algoritmo UPGMA. Finca “Alcala” de la vereda de Rozo (Cota). Finca “El Hoyo” de la vereda
Pueblo Viejo (Cota). Finca “El Cucharo” (Tenjo). Finca “La Palestina” (Tabio)
7. DISCUSION DE RESULTADOS
Los cultivos de hortalizas son de gran importancia agrícola en nuestro país por
su demanda a nivel local, por su potencial para exportación y por ser materia
prima para la agroindustria. Las hortalizas son un producto que se comercializa
generalmente en fresco, lo que obliga a los productores a mantener altos
estándares de calidad e inocuidad. La espinaca hace parte de las hortalizas de
hoja que son importantes en Colombia por su producción y rendimiento
(Agronet, 2006). Con el fin de brindar alternativas para el control del mildeo
velloso, principal enfermedad de la espinaca, este estudio determinó las razas
del patógeno que se encuentran presentes en la Sabana de Bogotá. Para la
obtención de inóculo fresco de Peronospora farinosa f. sp. spinaciae se escogió
el municipio de Cota por ser el mayor productor de espinaca en la Sabana de
Bogotá (DANE, 2002). Este sitio ha sido seleccionado para la identificación de
las principales arvenses (Rodríguez et al., 2008) y las principales plagas (Gil et
al., 2007) asociadas al cultivo. También se seleccionaron los municipios de
Tabio y Tenjo en donde se cultiva espinaca en menor proporción.
En los tres municipios la siembra de espinaca es permanente, no existe rotación
de cultivos y los principales cultivos cercanos son de hortalizas como lechuga,
cilantro, rábano, acelga, remolacha, perejil y algunas pertenecientes a la familia
Brassicaceae como Brócoli, Coliflor y repollo. El mildeo velloso es la principal
enfermedad que afecta los cultivos de espinaca en muchas áreas productoras
alrededor del mundo, causando pérdidas económicas obligando a los
agricultores a aplicar fungicidas químicos (Brandenberger et al., 1992; Irish et al.,
2003; Satou et al., 2006). Se conocen 10 razas de Peronospora farinosa f. sp.
spinaciae descritas en Estados Unidos y Europa. Estas razas han sido
identificadas de acuerdo a la susceptibilidad o resistencia que presentan los
diferentes genotipos de espinaca frente a inóculos aislados de diferentes zonas
donde se cultiva esta hortaliza (Irish et al., 2008).
De acuerdo con los resultados obtenidos utilizando la metodología propuesta por
Correll et al., 2005, se encontraron solamente dos razas (5 y 8) de Peronospora
farinosa f. sp. spinaciae. En las muestras provenientes de los cultivos de la
finca “Alcala” del municipio de Cota y la finca “La Palestina” del municipio de
Tabio se identificó la raza 5, este resultado se basa en la información obtenida
con la prueba de diferenciales en la cual se determinó una susceptibilidad del
20% para el genotipo Bolero cultivado en la finca “Alcalá” (Cota) y 17% para el
mismo genotipo en la finca “La Palestina” ubicada en el municipio de Tabio. Para
los genotipos Viroflay, Resistoflay y Campania se obtuvo una susceptibilidad
mayor del 85% para ambos municipios. Esta raza fue identificada en el estado
de California en 1997 (Correll et al., 1998); en Europa se reconoció en 1998 por
Schafer (no publicado), en cultivos en Chiba, Japón se describió en 2003 (Satou
et al., 2006) y por último en el estado de Florida, Estados Unidos (Irish et al.,
2004).
De otra parte en la finca “El Hoyo” en el municipio de Cota y la finca “El
Cucharo” en el municipio Tabio se observó una susceptibilidad del 18 y 21%
respectivamente en el genotipo Dolphin mientras que los genotipos Viroflay,
Resitoflay y Campania presentaron una susceptibilidad mayor al 85% en ambas
localidades. Estos resultados no permiten identificar una raza particular. Sin
embargo a través del soporte científico brindado por el doctor Correll de la
Universidad de Arkansas (comunicación personal) quien realizó un análisis que
incluye el genotipo Tarpy del cual no se conocía la respuesta frente a la
inoculación del patógeno, se determinó que se trata de la raza 8. Esta raza junto
con las razas 9 y 10 se identificaron recientemente en California y Arizona (Irish
et al., 2007).
En los últimos años se ha observado que las variedades de espinaca
consideradas resistentes han sido atacadas por mildeo velloso, demostrando
que el patógeno ha logrado superar las barreras de la resistencia obtenida a
través del mejoramiento genético. El mecanismo por el cual nuevas razas se
desarrollan y se distribuyen aun no es conocido (Irish et al., 2003). Existen
muchas variables que pueden contribuir a la aparición de razas en diferentes
lugares, una de ellas puede ser atribuida al frecuente uso de fungicidas con
ingrediente activo metalaxyl + mancozeb. Este fungicida sistémico es absorbido
por las raíces y transportado a través del cuello y tronco de las plantas. Este
producto se aplica de manera preventiva para reducir la propagación del
patógeno (Brandenberger et al., 1991).
Según Dainello et al., 1990, la eficacia de tres aplicaciones de un fungicida con
componente activo metalaxyl para el control de Albugo occidentales que causa
la roya blanca en la espinaca (Spinacia oleracea) es determinante en la
susceptibilidad y la resistencia parcial del cultivo; metalaxyl en ambos cultivares
retrasa el desarrollo de síntomas iniciales de la roya blanca pero no reduce el
rango de progreso de la enfermedad. El fungicida con principio activo metalaxyl
+ mancozeb es utilizado para el control del mildeo velloso en tres de las fincas
muestreadas ( “El Hoyo” en Cota, “El Cucharo” en Tenjo y “La Palestina” en
Tabio), en donde se realiza de una a tres aplicaciones en un solo ciclo del cultivo.
Por otro lado existen otros fungicidas utilizados para el control de mildeo velloso
en Cota como: Mancozeb + Metalaxyl, este producto es aplicado a razón de 2.68
Kg/Ha por ciclo, cuando la dosis recomendada son de 1.70 kg/ha, el Oxicloruro
de Cobre se aplica en 1.15 Kg/Ha y la dosis recomendada para un ciclo es de
2.65 kg/ha y por último Propineb que se utiliza 0.16Kg/Ha en una sola dosis y la
recomendada es de 2.65 Kg/Ha (Datos no publicados).
Otras variables que influyen en la aparición de razas son las condiciones
climáticas, debido a que cambios significativos en factores como: temperatura,
humedad relativa y precipitación afectan aspectos de la biología del patógeno
(Irish et al., 2003). Las altas precipitaciones durante el muestreo, generaron
periodos prolongados de humedad que pudieron ser favorables para la infección
del patógeno aumentando las poblaciones del mismo. Irish et al (2003) afirman
que las altas precipitaciones (85.3cm) registradas durante 1998 en los estados
de Florida y Arkansas en Estados Unidos como consecuencia de los fenómenos
de la Niña y el Niño pudo ser un factor determinante en la aparición de tres
nuevas razas.
La aparición de razas como la 5 y 8 puede ser consecuencia de introducción de
semillas infectadas. Inaba et al., 1983 e Irish et al., 2003 realizaron un ensayo
que consistió en tomar oosporas colectadas por el método de lavado en varias
semillas comerciales, las cuales fueron sembradas en suelo estéril y mantenidas
en cámara húmeda a 15°C bajo luz natural. Como resultado obtuvieron un alto
porcentaje de infección indicando que el patógeno puede transmitirse por
semilla. La presencia de las razas 5 y 8 en la Sabana de Bogotá puede ser
posible debido a que el material genético empleado como semilla (variedades
y/o híbridos) es importado de Estados Unidos por diferentes casas comerciales a
las que solo se les exige el tratamiento con el fungicida Thiram y la ausencia de
patógenos como: Colletotrichum dematium f. sp. spinaciae y Fusarium
oxysporum. (ICA <online>, 2008)
En la Sabana de Bogotá usualmente los productores utilizan los híbridos
Quinto®, Select 424®, Bandolero® y Corona Superior® (Rodríguez et al., 2008).
Los híbrido Quinto® y Bandolero® de acuerdo con la información suministrada por
la compañía semillas Arroyave (Semillas arroyave <online>, 2008) son
resistentes a las razas 1, 2 ,3 y 4. Este hecho se confirmó por la presencia de las
razas 5 y 8 en las fincas “El Hoyo” y “Alcala” del municipio de Cota donde se
cultiva el híbrido Quinto®. Con respecto a los híbridos Corona superior® y
Grenell® que son utilizados como material de siembra en Tabio y Tenjo no se
conoce ningún dato con respecto a la susceptibilidad o resistencia frente a las
razas reportadas mundialmente.
Una posible razón para explicar la presencia de estas razas en nuestro país
puede estar asociada a la mutación de una raza existente de mildeo velloso y su
posterior selección (Brandenberger et al., 1991). Según Wellings et al., 1990 el
origen de la mayoría de nuevos fenotipos de P. striiformis f. sp. tritici están
relacionados con mutaciones espontáneas, las cuales contribuyen a la variación
original en muchas poblaciones de patógenos. Por otro lado Goodwin et al.,
1995 afirman que la rápida evolución de la virulencia entre linajes clonados ha
generado una diversidad genotípica en poblaciones de el oomycete
Phytophthora infestans.
Una vez identificadas las razas en los tres municipios de la Sabana de Bogotá se
procedió a realizar el estudio preliminar de la diversidad genética. Las
marcadores moleculares, ITSs y AFLPs, se constituyen en una herramienta útil
para caracterizar genéticamente hongos fitopatógenos (Lindqvist et al., 1998).
Peronospora farinosa f. sp. spinaciae es un parásito obligado y no crece en un
medio artificial, Este hecho sumado a la presencia de otros hongos saprófitos,
hacen difícil su detección o identificación en la planta (Lindqvist et al., 1998). Por
esta razón es de gran importancia la observación microscópica del patógeno con
el fin de identificar estructuras características del género como esporangióforos
con ramificaciones dicotómicas, esporangios e hifas cenocíticas.
Está documentado que las comparaciones de las secuencias de rADN proveen
resultados para el análisis de relaciones filogenéticas en varios niveles
taxonómicos (Lee et al., 1992). Las regiones de ITS y la región nuclear
intergénica de la unidad repetitiva de rRNA evolucionan rápidamente y debe
variar entre especies y poblaciones (Ristaino et al., 1998; Sheriff et al., 1994). En
este estudio se utilizaron los iniciadores universales ITS1 y ITS4, que han sido
empleados para amplificar las regiones ITS en varios hongos entre los que se
cuentan parásitos obligados como Peronospora sparsa (Linqvist et al., 1998).
Como producto de la amplificación de la región ITS con los iniciadores ITS1 e
ITS4 se obtuvo un fragmento entre 750-800pb. Choi et al., 2006 reportan
productos de amplificación de 798pb utilizando combinaciones de los iniciadores
ITS1, ITS2, ITS3 y ITS4 en tres diferentes aislamientos de Peronospora farinosa
f. sp. spinaciae). El fragmento amplificado en este trabajo (/750 – 800 pb)
confirma que posiblemente se trate del patógeno que causa el mildeo velloso en
espinaca. Sin embargo es conveniente realizar el análisis de restricción con
endonucleasas que permitan la detección de polimorfismos entre diferentes
secuencias amplificadas (Buscot et al., 1996). Casimiro et al., 2004, utilizado las
enzimas RsaI, Sau3AI y HpaII lograron obtener polimorfismos entre diferentes
aislamientos de Peronospora destructor patógeno en cultivos de cebolla.
La técnica de “fingerprinting” utilizada para abordar el estudio de la diversidad
genética de los cuatro inóculos obtenidos fue AFLP. Este marcador es altamente
reproducible, genera mayor grado de polimorfismo y es más confiable que otros
marcadores como RAPDs y RAMs (Van der Lee et al., 1997). Los AFLPs son
usados hoy en día para estudios de variación genética en hongos (Lindqvist et
al., 2002). Una de las mayores ventajas del AFLP es que utiliza una pequeña
cantidad de ADN genómico para producir cientos de marcadores. Este hecho es
esencial en organismos biotróficos como Peronospora sparsa (Lindqvist et al.,
2002) y Peronospora farinosa (Danielsen et al., 2004) que esporulan débilmente
limitando la cantidad de material disponible para la extracción de ADN.
La técnica de AFLPs mostró ser resolutiva, pues con una sola combinación de
iniciadores (EAC-MC) se logró obtener un total de 43 bandas (figura 16). Con las
otras tres combinaciones evaluadas se obtuvieron en promedio 15 bandas por
inóculo del patógeno. El número reducido de bandas y su poca resolución puede
ser atribuida a la digestión incompleta del ADN genómico. En el gel de
poliacrilamida se observaron zonas de bandeo comunes entre las cuatro fincas
así como regiones con una diferencia marcada entre los mismos. Estos
resultados son consistentes con los obtenidos por Lindqvist et al., 2002, quienes
con una sola combinación de iniciadores obtuvieron 52 bandas distribuidas entre
76 y 300pb por aislamiento de Peronospora sparsa agente causal del mildeo
velloso en rosa. La reproducibilidad de la técnica fue evaluada con dos
extracciones diferentes de ADN.
El dendograma (Figura 17) obtenido a partir de la matriz de similitud mostró tres
grupos diferentes. En el primer grupo se encuentra el inóculo de la finca “El
hoyo” del municipio de Cota y el inóculo de la finca “El Cucharo” del municipio de
Tenjo con el mayor coeficiente de similitud (0.75), indicando que estos dos
OTUS de Peronospora farinosa f. sp. spinaciae no generaron ningún morfotipo
similar a ninguno de los otros dos inóculos del patógeno. El siguiente grupo está
conformado por el inóculo de la finca de la finca “Alcalá” del municipio de Cota
que tuvo un coeficiente de similitud de 0.48 con respecto al grupo anterior. El
último grupo correspondió al inóculo de la finca “La Palestina” del municipio de
Tabio con un coeficiente de 0.45 respecto a los otros dos grupos mostrando la
mayor distancia genética.
Al comparar los resultados obtenidos por diferenciales para la identificación de
razas (Tabla 8) con los resultados del estudio preliminar de la diversidad
genética basados en AFLPs, se observó que los dos inóculos de la raza 8
identificada en las fincas “El Hoyo” y “El Cucharo” presentaron una similitud del
0.75 y se encontraron formando un mismo cluster (Figura 17). Con respecto a
la raza 5 identificada en las fincas de “Alcalá” y “La Palestina” se observó que
aunque no formaron un mismo cluster presentaron una similitud de 0.45 entre
ellas. Esto indica que aunque se trate de la misma raza tienen diferencias
genotípicas y por esta razón el análisis UPGMA agrupó estas razas en dos
clusters diferentes.
Observando el resultado del gel de poliacrilamida se evidenció la presencia de
11 bandas únicas distribuidas en los cuatro inóculos del patógeno. Aunque la
presencia de bandas únicas permite el diseño de iniciadores específicos, el gran
número de estas bandas dificulta el diseño debido al polimorfismo presentado
para cada inóculo. Esto indica que es necesario utilizar más combinaciones de
iniciadores para disminuir la cantidad de bandas únicas y aumentar la resolución
de bandas polimórficas.
En conclusión los resultados de la identificación de razas a través de genotipos
diferenciales pueden ser parcialmente comparados con el estudio preliminar de
la variabilidad genética. Aunque el análisis molecular es confiable se
recomienda el uso de cultivos monospóricos que generen mayor confiabilidad en
el estudio preliminar de la variabilidad genética de Peronospora farinosa f. sp.
Spinaciae.
En el caso del control de mildeo velloso en estados de Florida y California en
Estados Unidos se han empleado variedades y/o híbridos resistentes para el
manejo de este problema sanitario como: el híbrido Lazio que tiene hojas lisas
redondas de color oscuro y que presenta una resistencia contra las razas 1 a 7
del mildeo velloso (Gourmet Seed Internacional <online>, 2008). En las
condiciones de la Sabana de Bogotá esta alternativa no ha sido implementada
por el desconocimiento del número de razas de Peronospora farinosa f. sp.
spinaciae presentes. Es por esta razón que los productores emplean como
único método de control productos de síntesis química.
Los resultados obtenidos en esta investigación permitirán re-direccionar las
estrategias en el manejo de esta enfermedad, ya que con la identificación de la
raza 5 y 8 en estas cuatro fincas de los municipios de Cota, Tabio y Tenjo los
productores podrán acceder a semillas de genotipos resistentes. Por otro lado,
los importadores de semillas también deben promover la entrada de nuevos
genotipos resistentes a las razas 5 y 8 como: Lion y Lazio.
Igualmente se deben valorar características morfológicas de las hojas que son
muy importantes en la aceptación del producto en el mercado, la tolerancia a las
condiciones climáticas de la Sabana de Bogotá, el rendimiento y la precocidad.
Además el agricultor es muy exigente con las características físicas de la
hortaliza, ya que prefieren la espinaca cuatro puntas de color verde oscuro y con
un alto rendimiento.
El uso de híbridos resistentes a las razas 5 y 8 permitirá por un lado, reducir el
uso de productos químicos que deterioran el suelo y medio ambiente y de otra
parte producir una mejor calidad de espinaca para el consumidor. Estas
acciones están encaminadas al desarrollo de estrategias para el manejo de esta
enfermedad bajo esquemas de producción limpia.
8. CONCLUSIONES
Se identificaron las razas 5 y 8 de Peronospora farinosa f. sp spinaciae en los
tres municipios de la Sabana de Bogotá. La raza 5 está presente en la finca “La
Palestina” en el municipio de Tabio y en la finca “Alcalá” en el municipio de Cota;
Por su parte la raza 8 se encontró en la finca “El Cucharo” en los municipios de
Tenjo y la finca “El Hoyo” en el municipio de Cota.
Los híbridos cultivados actualmente en los municipios de Cota, Tenjo y Tabio
(Bolero® y Quinto®) son susceptibles a las razas 5 y 8 identificadas en este
trabajo y a las razas 1, 2, 3 y 4 de Peronospora farinosa f. sp spinaciae
identificadas por Correll y colaboradores previamente. La variedad Viroflay,
susceptible a las 10 razas reportadas, fue susceptible a las razas 5 y 8con
inóculos de la sabana de Bogotá.
Utilizando el protocolo de Judelson, (1996), se logró extraer ADN con una
pureza y calidad adecuadas para amplificar la región ITS del rDNA e
implementar los marcadores moleculares AFLPs, permitiendo iniciar el estudio
de la diversidad genética de Peronospora farinosa f. sp spinaciae.
Con la combinación de iniciadores EAC-MC se obtuvo un total de 43 bandas con
un buen nivel de polimorfismo. El análisis de agrupamiento empleando el
algoritmo UPGMA generó tres grupos de similitud. El primero grupo se formó
con el mayor coeficiente de similitud (0.75) e incluye los inóculos de las fincas “El
Hoyo” y “El Cucharo” de los municipios de Cota y Tenjo respectivamente. El
segundo grupo que fue el más distante incluye el inóculo de la finca “La
Palestina” del municipio de Tabio con un coeficiente de similitud de 0.45.
Finalmente el inóculo de la finca “Alcalá” del municipio de Cota formó un grupo
aparte con coeficiente de similitud de 0.48 respecto al primer grupo mencionado.
Al comparar las dos metodología empleadas en este trabajo (Identificación de
razas mediante el uso de genotipos diferenciales y Diversidad genética por
AFLPs generó algunos resultados esperados debido a que la raza 8 identificada
en las fincas de “El Hoyo” del municipio de Cota y en la finca “El Cucharo” del
municipio de Tenjo fueron paralelas al agrupamiento de similitud genética que
fue estimado según el coeficiente de Dice mediante el algoritmo UPGMA.
9. RECOMENDACIONES Utilizar cultivos monospóricos que son necesarios para estudios de diversidad y
caracterización molecular.
Realizar una identificación de razas en otros municipios productores de espinaca
con el fin de tener varias muestras de un solo lote y así poder analizar si
posiblemente existen mas razas de Peronospora farinosa f. sp. spinaciae en la
Sabana de Bogotá.
Se sugiere evaluar el polimorfismo de los inóculos de Peronospora farinosa f. sp.
spinaciae mediante la restricción del producto ITS amplifcado con las
endonucleasas (Sau3AI, RsaI y HpaII) y así complementar y/o confrontar los
resultados obtenidos con AFLPs.
Respecto a los AFLPs, es necesario evaluar otras combinaciones de iniciadores
para obtener bandas únicas que permitan el diseño de iniciadores específicos
para la identificación de cada raza. Igualmente evaluar la reproducibilidad de la
técnica a partir de otra extracción de ADN del patógeno e incluir un número
mayor de individuos.
Proponer una estrategia en la cual se busque implementar el uso de variedades
y/o híbridos resistentes a las dos razas identificadas en este trabajo con el fin de
disminuir el uso de productos químicos para el manejo de la enfermedad y hacer
uso de estos de manera óptima y racional.
10. BIBLIOGRAFIA
ABU - EL SAMEN., SECOR G. A., AND GUDMESTAD N. C. 2003. Genetic
Variation among Asexual Progeny of Phythptora infestans detected with RAPD
and AFLP markers.
AGRIOS, G. N. 2005. Plant pathology. Quinta Edicion. Elsevier Academic. 922
paginas
BRANDENBERGER, L. P., CORRELL, J. C., AND MORELOCK, T. E. 1991.
Identification of and Cultivar Reactions to a New Race (Race 4) of Peronospora
farinosa f. sp. spinaciae on Spinach in the United States. Plant Disease 75:630-
634.
BRADENBERGER, L. P., CORRELL, J. C., AND MORELOCK, T. E. 1991.
Reaction of Spinach Cultivars to a New Race (Race 4) of Downy Mildew in the
United States. Phytophatology 78: 1026.
BRANDENBERGER, L. P., MORELOCK, T. E., AND CORRELL, J. C. 1992.
Evaluation of Spinach Germplasm for Resistance to a New Race (Race 4) of
Peronospora farinosa f. sp. Spinaciae. HortScience 27(10): 1118-1119.
BRADENBERGER, L. P., CORRELL, J. C., AND MORELOCK, T. E., AND
MCNEW, W. 1994. Characterization of resistance of spinach to white rust
(Albugo occidentalis) and downy mildew (Peronospora farinosa f. sp. spinaciae).
The American Phytopathology Society Vol 84, No. 4, 1994).
BURDON, J. J. 1992. Genetic variation in Pathogen populations and its
implication for adaption to host resistance. Pages 41-56 in: Durability of Disease
Resistance. Th Jacobs and J. E. Parlevliet, eds. Kluwer Academic Publishers,
Amsterdam.
BURDON, J. J., AND SILK, J. 1997. Sources and Patterns of Diversity in Plant-
Pathogenic fungi. Phytopathology 87(7): 664-669.
BUSCOT, F., WIPF, D.,BATTISTA, C., MUNCH, J. C., BOTTON, B., AND MARTIN, F. 1996. DNA polymorphism in morels: PCR/RFLP analysis of the
ribosomal DNA spacers and microsatellite-primed PCR. Mycological Research
100, 63-71.
CAICEDO, G. A Y RUIZ, A. 1995. Análisis de crecimiento y desarrollo para dos
genotipos de espinaca (Spinacia oleracea L.) en variedad monstruosa de Viroflay
y el híbrido 424. Ingeniero Agrónomo. Universidad nacional de Colombia.
Facultad de Agronomía. Santafe de Bogota. 102p.
CARRERO, J. M. 1996. Lucha Integrada control las plagas agrícolas y
forestales. Mundi- Prensa Libros.
CARRIE, R. F., AND LENORA, J. J. 2000. Crop Profile for Spinach Seed in
Waschington. Waschington State University.
CASIMIRO, S., MOURAL, M., ZE-ZE, L., TENREIRO, R., AND MONTEIROL, A. 2004. Internal Transcribed Spacer 2 Amplicon as a Molecular Marker for
Identification of Peronospora parasitica (Crucifer Downy Mildew). Journal of
Applied Microbiology 96: 579-587.
CHOI, Y. J., HONG, S. B., AND SHIN, H. D. 2006. Re-consideration of
Peronospora farinosa infecting Spinacia oleracea as distinct species,
Peronospora effuse. The British Mycological Society. 381-390.
COOKE. D. E. L., DRENTH, A., DUNCAN, J. .., WAGELS, G., AND BRASIER, C. M. 2000. A molecular phylogeniy of Phytophtora and related oomycetes.
Fangal Genetics and Biology 30: 17-32.
CORNIDE, MARIA TERESA Y COLECTIVO DE AUTORES. 2002. Marcadores
moleculares: nuevos horizontes en la genética y la selección de las plantas. Ed.
Félix Varela, La Habana, Cuba.
CORRELL, J. C., KOIKE, S.T., SDHAFER, J., ANDERS, J. M., IRISH, B. M.J AND MORELOCK, T. E. 1998. Two new races of the downy mildew pathogen
(Peronospora farinosa f. sp. spinaciae) of spinach in the United states. (Abstract).
Phytopathology 88:S19.
DAINELLO, F.J., BLACK, M. C., AND KUNKEL, T. E. 1990. Control of white
rust of spinach with partial resistance and multiple soil applications of metalaxyl
granules. Plant Disease. 74:913-916.
DANIELSEN, S., AND AMES, T. 2004. Mildew (Peronospora farinosa) of Quinua
(Chenopodium quinoa) in the Andian Region. Benson Agriculture and Food
Institute 110 B-49. Brigham Young University Provo, Utah 84602
DESCENZO, R. A., ENGEL, S. R., GOMEZ, G., JACKSON, E. L., MUNKVOLD, G. P., SÉLLER, J., AND IRELAN, N. A. 1999. Genetic análisis of Eutypa strains
from California supports the presence of two pathogenic species.
Phytopathology 89:884-893.
EENICK, E. E. 1976. Resistance in Spinach to Downy Mildew. Pages 53-54 in:
Proc. Eucarpia Meet. Leafy Veg.
ELLINGBOE. A. H. 1961. Somatic recombination in Puccinia graminis var. Tritici.
Phytopathology 51:13-14.
FERRUCHO, R. L. 2006. Diagnostico molecular y variabilidad genética de
Peronospora sparsa Berkeley en cultivos de rosa (Rosa sp.) bajo invernadero.
Posgrado en Ciencias Agrarias. Universidad Nacional de Colombia. Facultad de
Agronomía. Santafé de Bogotá. 89p
FRINKING, H. D., HARREWIJN, J. L., AND GEERDS, G. D. 1985. Factors
governing oospore production by Peronospora farinosa f. sp. spinaciae in
cotyledons of spinach
GIL, R., CARRILLO, D., Y JIMENEZ, J. 2007. Determinación de las principales
plagas de la espinaca (Spinacia oleracea) en Cota, Colombia. Revista
Colombiana de Entomología 33 (2): 124-128.
GONZÁLES. M., RODRÍGUEZ, R. J ZAVALA, M. E., JACOBO, J. L., HERNÁNDEZ, F., ACOSTA, J., MARTÍNEZ, O., AND SIMPSON, J. 1998.
Characterization of mexican isolates of Colletotrichum lindemuthianum by using
differential cultivars and molecular markers. Phytopathology 88:292-299.
GOODWIN, S. B., SUJKOWSKI, L. S., AND FRY, W. E. 1995. Rapid evolution
of pathogenicity within clonal lineages of the potato late blight disease fungus.
Phytopathology 85:669-676.
GUZMÁN, R. 1986. Producción y comercialización de la Espinaca en la Sabana
de Bogota. Universidad de la Salle. Facultad de administración Agropecuaria.
HALL, G. S. 1996. Modern Approaches to Species Concepts in Downy
Mildews. Plant Pathology 45: 1009-1026.
HOCHMUCTH, G. J., VAVRINA, C. S., STALL, W. M., AND OLSON, S. M. 2005. Spinach Prduction in Florida. University of Florida. Extension IFAS.
Horticultural Sciences Dept., UF/IFAS, Fla. Coop. Ext. Serv. 325-328.
INABA, T., TAKAHASHI, K., AND MORINAKA, T. 1983. Seed transmission of
spinach downy mildew. Plant Disease Vol. 67, no. 10, pp. 1139-1141.
IRISH, B. M., CORRELL, J. C., KOIKE, S. T., SCHAFER, J., AND MORELOCK,
T. E. 2003. Identification and Cultivar Reaction to Three New Races of the
Spinach Downy Mildew Pathogen From the United States and Europe. Plant
Disease 87: 567-572.
IRISH, B., AND CORRELL, J. 2004. First Report of Peronospora farinosa f. sp.
spinaciae Race 5 causing Downy Mildew of Spinach in Florida. Plant Disease
88:84
IRISH, B. M., CORRELL, J. C., KOIKE, S. T., AND MORELOCK. 2007. Three
New Races of the Spinach Downy Mildew Pathogen Identified by a Modified Set
of Spinach Differentials. Plant Disease 91:No 11 1392-1396.
IRISH, B. M., CORRELL, J. C., BENG, T., AND DE LOS REYES, B. G. 2008.
Characterization of a resistance locus (Pfs-1) to the spinach downy mildew
pathogen (Peronospora farinosa f. sp. Spinaciae) and development of a
molecular marked linked to Pfs-1. Phytopathology 98: 894-900.
JUDELSON, M.S. 1996. Chromosomal Heteromorphis linked to the mating type
locus of the oomycete Phytophtora infestans. Molecular General Genetics
252:155-161.
LESTRANGE, M., KOIKE, S., VALENCIA, J., AND CHANEY, W. 2000. Spinach
Production in California. Vegetable Research and Information Center. University
of California. Division of agricultura and Natural Resources. Publication 7212.
LINDQVIST, H., KAPONEN, H., AND VALKONEN, J. 1998. Peronospora
sparsa on Cultivated Rubus arcticus and Its Detection by PCR Based on ITS
Sequences. Plant Disease 82: 1304-1311.
LINDQVIST, H., KAPONEN, H., AND VALKONEN, J. 2002. Variability of
Peronospora sparsa (syn. P. Rubi) in Finland as Measured by Amplified
Fragment Length Polymorphism. European Journal of Plant Pathology 108: 327-
335.
LOOS, R., LAUGUSTIN, S., ROSE, S., TOURVIEILLE, J., AND TOURVIEILLE
DE LABROUHE, D. Development of a PCR test to detect the downy mildew
causal agente Plasmopara halstedii in sunflower seeds. Plant Pathology 56,
209-218.
LORENZINI, G AND NALI, C. 1994. A New Race (Race 4) of Spinach Downy
Mildew in Italy. Plant Disease 78: 208.
MCDONALD BRUCE A. 1997. The population genetics of fungi: Tools and
Techniques. Phytopathology Vol 87, No. 4, 448-453.
MARTINEZ P., RODRIGUEZ D. A., BORRERO F. 1999. Manejo de Plagas de
Hortalizas de Clima Frío. Ministerio de Agricultura y Desarrollo Rural. Instituto
Colombiano Agropecuario. División de Sanidad Vegetal. Ed. Produmedios,
Bogotá, Colombia. P. 103.
O´DONNELL, K. 1992. Ribosomal DNA internal transcribed spacers are highly
divergent in the phytopathogenic ascomycete Fusarium sambucinum (Gibberella
pulicaris). Curr. Genetics 22:213-220.
O´NEILL N. R., VANBERKUM, P., LIN, J. J., UDE, G. N., KENWORTHY, W., AND SAUNDERS J. A. 1997. Application of amplified restriction fragment lenght
polymorphism for genetic characterization of Colletotrichum pathogens of
alfalafa. Phytopathology 87:745-750.
RISTAINO, J. B., MADRITCH, M., TROUT, C. L., AND PARRA, G. 1998. PCR
Amplification of Ribosomal DNA for Species Identification in the Plant Pathogen
Genus Phytophthora. Applied and Enviromental Microbiology. 948-954.
RODRIGUEZ, M., PLAZA, G., GIL, R., CHAVES, B., Y JIMENEZ, J. 2008.
Reconocimiento y fluctuación poblacional arvense en el cultivo de espinaca
(Spinacia oleracea L.) para el municipio de Cota, Cundinamarca. Agronomía
Colombiana 26(1), 87-96.
ROSENDAHL S AND TAYLOR J. W. 1997. Development of multiple genetic
markers for studies of genetic variationin arbuscular mycorrhizal fungi using
AFLP. Molecular Ecology 6:821-829.
SAMBROOCK B., MANNIATIS C. 1989. Molecular Cloning. A Laboratory
Manual. Prentice Hall. USA
SÁNCHEZ, G., ESPAÑOL, J., HENRÍQUEZ S. 2004. Programa integral de
transferencia de tecnología para la producción limpia y la comercialización de
hortalizas en la sabana. SENA. 1-9.
SATOU, M., SUGIERA, T., OHSAKI, R., HONDA., HORIUCHI, S., AND YAMAUCHI, N. 2002. A New race of Spinach Downy Mildew in Japan. J. Gen.
Plant Pathol. 68: 49-51.
SATOU, M., KAZUFUMI, N., MASAHARU, K., FUKAMI, M., HIDEAKI, T., AND ETTEKOVEN, K. 2006. Appearance of Race Pfs:5 of Spinach Downy Mildew
Fungus, Peronospora farinosa f. sp. spinaciae, in Japan. J. Gen. Plant Pathology
72: 193-194.
SAVELKOUL, P. J. M ; AARTS, H.J.M ; DE HAAS, J ; DIJKSHOORN, L ; DUIM, B; OTSEN, M; RADEMAKER, J. L. W; SCHOUL, L; LENSTRA, J. A. 1999. Amplified fragment length polymorphism analysis: the state of an art.
Journal of Clinical Microbiology, 37(10):3083-3091.
SHAN LAI, P., LIEN. T. J., CHEN, R. S., AND TSAY, J. G. 2004. The ocurrence
of downy mildew of vegetable soybean and its detection by PCR. Plant Prot.
Bull. 46: 155-162.
SHERRIFF, C., WHELAN, M .J., ARNOL, G. M., LAFAY, J. F., BRYGOO, Y., AND BAILEY, J. A. 1994. Ribosomal DNA sequences analysis reveals new
species grouping in the genus Colletotrichum. Exp. Mycol. 18:121-138.
SREENIVASAPRASAD, S., SHARADA, K., BROWN, A. E., AND MILLS, P. R. 1996. PCR-based detection of Colletotrichum acutatum on strawberry. Plant
Pathology 45:650-655.
STEVEN, B.L. AND TAYLOR, J. W. 1992. Phylogeny of five Fungus-like
Protoctistan Phytophthora species, Inferred from the Internal Transcribed
Spacers or Ribosomal DNA. Mol. Biol. Evol. 9(4):636-653.
STEWART, J. E., MEE, S. K., JAMES R. L., DUMROESE, K. R., AND KLOPFESTEIN, N. B. 2006. Molecular Charaterization the Fusarium
oxysporum and Fusarium commune Isolates from a Conifer Nursery.
Phytophatology 96.
TOMLINSON, A. N., CORRELL, J.C., KOIKE, S.T., KAMMEIJER, K. 2007. First
Report of Race 8 of Downy Mildew, Caused by Peronospora farinosa f. sp.
spinaciae, of Spinach in the United States. Plant Disease 91: 1205.
TOOLEY, P. W., BUNYARD, B. A., CARRAS, M. M., AND HATZILOUKAS, E.
1997. Development of PCR primers from internal transcribed spacer region 2 for
detection of Phytophthora species infecting potatoes. Applied Enviromental
Microbiology. 63:1467-1475.
VALLEJO, F .A. 2007. Las hortalizas en Colombia. Revista Horticultura
Brasileira 25: No 1.
VAN DER LEE, T., DE WITTE, I., DRENTH, A., ALFONSO, C., AND GOVERS,
F. 1997. AFLP Linkage Map of the Oomycete Phytophthora infestans. Fungal
Genetics and Biology 21:278-291.
VOS, P., HOGERS, R., BLEEKER, M., REIJANS, M., VAN DE LEE, T., HORNES, M., FRIJTERS, A., POT, J., PELEMAN, J., KUIPER, M., AND ZABEAU, M. 1995. AFLP: a New Tecnique for DNA Fingerprinting. Nucleic
Acids Research 23: 4407-4414.
WEISING, K., NYBOM, H., WOLFF, K., AND MEYER, W. 1995. DNA
Fingerprinting in Plants and Fungi. Edicion No 2. CRC Press, Inc. Boca Raton,
Florida. 1-297.
WELLINGS, C. R AND MCINTOSH, R. A. 1990. Puccinia striiformis f. sp. tritici in
Australia: Pathogenic changes during the first ten years. Plant Pathology 39:316-
325.
WHITE, T. J., T. BRUNS, S. LEE, and J. TAYLOR. 1990. Amplification and
direct sequencing of fungal ribosomal RNA genes for phylogenetics. Pp. 3 15-
322
WHITE B. 1993. PCR Protocols Current Methods and Applications. Methods in
Molecular biology. Vol 15. Capitulo 1.
ZINK, F. W., AND SMITH, P. G. 1958. A Second physiologic Race of Spinach
Downy Mildew. Plant Dis. Rep. 42:818.
FUENTES ELECTRONICAS: AGRONET, 2008. Análisis estadísticos. http://www.agronet.gov.co/. [Consulta:
24 Mar. 2008].
CROP PROFILE FOR SPINACH SEED IN WASHINGTON, 2000.
http://caheinfo.wsu.edu. Washington State University. [Consulta: 18 Jul. 2008].
FRUTAS Y HORTALIZAS DE COLOMBIA, 2008.
<http //frutasyhortalizas.com.co/portal/includej/product_view.php. Consulta: 23
Jun. 2008].
GEOCITIES, 2008. espanol.geocities.com/.../atabio1.gif. [Consulta: 10 Abr.
2008].
GOURMET SEED INTERNACIONAL, 2008. Information of spinach seed.
http://www.gourmetseed.com/Spinach_Seed.0.html. [Consulta: 10 Jul. 2008].
ICA. INSTITUTO COLOMBIANO AGROPECUARIO, 2008. www.ica.gov.co/
[Consulta: 25 Nov. 2007].
INTERNACIONAL SEED FEDERATION DIFFERENTIAL SETS. Peronospora
farinosa f. sp. Spinaciae.
<http://www.worldseed.org/Differentials/Spinachdowny%20mildew.pdf. [Consulta:
20 Nov. 2007].
SEMILLAS ARROYAVE, 2008. Información De productos www.semillasarroyave.com. [Consulta: 10 Jul. 2008].
11. ANEXOS ANEXO 1. PAPELES DE IMPORTACION DE SEMILLAS USDA-APHIS. Fuente: Autor
February 01, 2008 Test No. B 6049 Account No: 4675 Kina of Seed: SPINACH/OLERACEA VARIETY/LOT: DOLPHIN Colletotrichum dematium f. sp. Spinaciae – Negative Fusarium oxysporum - Negative Test No. B 6050 Account No: 4675 Kina of Seed: SPINACH/OLERACEA VARIETY/LOT: RESISTOFLAY Colletotrichum dematium f. sp. Spinaciae – Negative Fusarium oxysporum - Negative Test No. B 6051 Account No: 4675 Kina of Seed: SPINACH/OLERACEA VARIETY/LOT: VIROFALY Colletotrichum dematium f. sp. Spinaciae – Negative Fusarium oxysporum - Negative Test No. B 6052 Account No: 4675 Kina of Seed: SPINACH/OLERACEA VARIETY/LOT: BOLERO Colletotrichum dematium f. sp. Spinaciae – Negative Fusarium oxysporum - Negative Test No. B 6053 Account No: 4675 Kina of Seed: SPINACH/OLERACEA VARIETY/LOT: LAZIO Colletotrichum dematium f. sp. Spinaciae – Negative Fusarium oxysporum - Negative
Test No. B 6054 Account No: 4675 Kina of Seed: SPINACH/OLERACEA VARIETY/LOT: POLKA Colletotrichum dematium f. sp. Spinaciae – Negative Fusarium oxysporum - Negative Test No. B 6055 Account No: 4675 Kina of Seed: SPINACH/OLERACEA VARIETY/LOT: TARPY Colletotrichum dematium f. sp. Spinaciae – Negative Fusarium oxysporum - Negative Test No. B 6056 Account No: 4675 Kina of Seed: SPINACH/OLERACEA VARIETY/LOT: LION Colletotrichum dematium f. sp. Spinaciae – Negative Fusarium oxysporum - Positive Test No. B 6057 Account No: 4675 Kina of Seed: SPINACH/OLERACEA VARIETY/LOT: CAMPANIA Colletotrichum dematium f. sp. Spinaciae – Negative Fusarium oxysporum - Negative Test No. B 6058 Account No: 4675 Kina of Seed: SPINACH/OLERACEA VARIETY/LOT: CALIFALY Colletotrichum dematium f. sp. Spinaciae – Negative Fusarium oxysporum - Negative
ANEXO 2. PROTOCOLO IDENTIFICACIÓN DE RAZAS. Fuente: Irish et al, 2003
1. Se sembró una bandeja de germinación por genotipo y en cada celda se
coloco dos (2) semillas de cada variedad, se regó diariamente y se
mantuvo bajo invernadero en un rango de temperatura de 15°C a 25°C.
2. La preparación del inoculo se realizo a partir de cada unas de las
muestras de las hojas de espinaca obtenidas por finca que previamente
fueron almacenadas a -20°C. Se tomo por muestra una hoja que tuviera
tejido esporulado y se realizo una impronta para observar el hongo en el
microscopio 3. La hoja con la lesión se llevo a un beaker con agua destilada a 4°C y se
coloco en agitación durante 5 minutos, Posteriormente se calculo la
concentración de esporas empleando una cámara de Neubauer y se
ajusto a una concentración de 2.0 a 3.0 X 105 esporas/ml. Esta
suspensión se coloco en un compresor de aire para ser regada por
aspersión sobre las semillas previamente germinadas (10 a 15 días). 4. Las plantas se colocaron en una cámara húmeda en donde se mantuvo
un 100% de humedad relativa y una temperatura de 18°C por 24 horas y
luego se incubo en otra cámara a 20°C durante un ciclo de 12 horas de
luz y oscuridad por 6 días. En el sexto día las plantas regresaron a la
cámara húmeda a 18°C y 100% de humedad relativa por 18 a 24 horas
para inducir la esporulación.
5. Para la identificación de razas se evaluó los cotiledones cualitativamente
por esporulación del patógeno en donde se tomo como susceptible
cualquier genotipo con una esporulación ≥ 85% del total del numero de
cotiledones y ≤15% será resistente.
ANEXO 3. PREPARACIÓN DE SOLUCIONES PARA EL BUFFER DE EXTRACCIÓN. Fuente: Sambrock, 1989
Composición Cantidad /200ml
Tris HCL1M (pH 8.5)
Disolver 30.27g de Tris base en 160ml de Agua. Ajustar el pH, agregando 44.6ml de HCL concentrado. Llevar a un volumen final de 200ml. Dejar la solución a temperatura ambiente. Esterilizar por autoclavado
NaCl 5M
Pesar 73.05g de NaCl en 160ml de agua. Ajustar el volumen hasta 200ml con agua. Esterilizar por autoclavado
EDTA 0.5M (pH8.0)
Agregar 46.525g de Disodio etillenediaminetetra acetato en 200ml de agua. Agitar en un shaker. Ajustar el pH a 8.0 con NaOH (5g de Pellets de NaOH). Esterilizar por autoclavado
ANEXO 4. PREPARACIÓN FENOL:CLOROFORMO. Fuente: Autor.
Composición Cantidad/ 10ml
Fenol Buffer saturado
5ml
Cloroformo 99% 5ml
ANEXO 5. PREPARACIÓN TAE 10X*. Fuente: Sambrook, 1989.
Composición Cantidad/ 200ml
Tris 9.68g
Acido Acético glacial
2.284ml
EDTA (pH 8.0) 4ml
*Para la preparación de TAE 1.0X se diluye con agua destilada.
ANEXO 6. ELECTROFORESIS EN GEL DE AGAROSA. Fuente: Sambroock, 1989
1. Sellar los bordes de una placa limpia y seca (o los extremos abiertos del
plástico del aparato) con un a cinta de autoclave dándole forma al molde.
Acomodar el molde en una sección horizontal del banco (verificar con un
nivel)
2. Prepare suficiente buffer de electroforesis (TBE 1X), para llenar el tanque
de electroforesis y preparar el gel. Adicionar la cantidad correcta de
azarosa para medir la cantidad de buffer de electroforesis en un
erlenmeyer o en una botella tapa rosca. Para el caso, se prepara 100ml
de agarosa al 0.8% para evaluar ADN de alto peso molecular y de 1.5%
para productos de amplificación de PCR.
3. Calentar la mezcla a baño de Maria o en microondas hasta que se
disuelve la agarosa.
4. Cuando la solución este a 60°C se le adiciona el bromuro de etidio (de
una solución stock de 10mg/ml en agua), para una concentración final de
0,5ul/ml y mezclar.
5. Colocar la peinilla 0,5-1.0mm arriba de la placa para completar bien
cuando la agarosa sea agregada.
6. Vaciar el remanente de la agarosa tibia en el molde. El gel puede tener
de 3mm a 5mm de grueso. Verificar que no se hayan creado burbujas
abajo o dentro de los dientes de la peinilla.
7. Después de que el gel este completamente acomodado (30-45 minutos a
temperatura ambiente), remover cuidadosamente la peinilla y la cinta de
autoclave y colocar el gel en el tanque de electroforesis.
8. Agregar el buffer hasta que cubra más o menos 1mm el gel.
9. Mezclar las muestras de ADN con el buffer y colocarlas en los orificios del
gel sumergido usando una micropipeta.
10. Cerrar la tapa del tanque y colocar los campos eléctricos de tal manera
que el ADN migre al ánodo (cable rojo). Aplicar un voltaje de 1 a 5V/cm
(medido como las distancia entre los electrodos). Si los cables se han
colocado correctamente se generaran burbujas en el ánodo y en el
cátodo (debido a la electroforesis) y después de un par de minutos el azul
de bromofenol migrara desde los pozos dentro del cuerpo del gel. Se
corre el gel hasta que el azul de bromofenol y el cianol de xileno hayan
migrado la distancia apropiada a través del gel.
11. Interrumpa el flujo de la corriente eléctrica y remueva los cables y tape el
tanque del gel. Si había bromuro de etidio en el buffer o en el gel,
examinar el gel con luz ultravioleta y fotografiar la electroforesis. De otra
forma, teñir el gel con el bromuro de etidio y luego fotografiar.
ANEXO 7: PROTOCOLO DEL KIT DE AFLP. Fuente: Protocolo de Invitrogen.
life technologies. Instruction manual. Catalog nos. 11352-010 and 11352-018
A. Digestión de restricción de ADN genómico. 1. Agregar a un tubo de microcentrifuga de 1.5ml:
Componente Control Muestra
Reacción de buffer 5μl 5 μl
ADN control E. coli (100 ng/μl) 2.5 μl –––
Muestra de ADN (250 ng in ≤ 18 μl) ––– 18 μl
EcoR I/Mse I 2 μl 2 μl
Agua destilada 15.5 μl a 25 μl
Volumen total 25 μl 25 μl
2. Se mezcla suavemente y se colecta la reacción por breve centrifugación.
Incubar la mezcla por 2h a 37°C.
3. Incubar la mezcla por 15 minutos a 70°C para inactivar la restricción de
endonucleasas. Llevar el tubo a hielo y colectar contenidos por breve
centrifugación.
B. Ligación de adaptadores 1. Agregar la digestión del ADN desde el paso 3 de la sección anterior:
Componente Cantidad
Adaptador de la solución de ligación 24 μl
Ligasa ADN T4 1 μl
2. Mezclar suavemente a temperatura ambiente, centrifugar breve para colectar
el contenido, e incubar a 20°C ± 2°C for 2 h.
3. Diluir 1:10 la mezcla de la dilución como sigue:
a. Tomar 10 µl de la mezcla de reacción y transferirla a un tubo de
microcentrifuga de 1.5-ml.
b. Añadir 90 µl de buffer TE y mezclar bien.
4. La porción no usada de la mezcla de reacción debe ser almacenada a –20°C.
C. Reacciones de preamplificacion 1. Añadir lo siguiente a un tubo de microcentrifuga delgado de 0.2- o 0.5-ml
Componente volumen
ADN molde diluido
(desde el paso 3 de la sección anterior)
5 µl
primer E-0 2.7 μl
primer M-0 12 μl
10X PCR buffer plus Mg 5 μl
Taq DNA polymerasa 1 μl
Agua. 25.3 μl
Volumen total 51 μl
2. Mezclar suavemente y centrifugar
Realizar 20 ciclos a:
94°C por 30 s
56°C por 60 s
72°C por 60 s
3. Realizar una dilución de 1:50 como sigue: transferir 3 µl a un tubo de
microcentrifuga de 1.5-ml conteniendo 147µl de buffer TE. Suficiente para 30
amplificaciones AFLP selectivas.
Si es necesario nuevas diluciones pueden hacerse de las reacciones
preamplificación para dar moldes adicionales para la amplificación selectiva.
Ambas reacciones diluidas y sin diluir pueden ser almacenadas a –20°C.
D. Amplificación selectiva de AFLP 1. Para cada pareja de primers, añadir a un tubo de 1.5-ml y marcarlo “Mix 1”.
Componente volumen
Primer EcoR I 5 µl
Primer Mse I (contiene dNTPs) 45 µl
Volumen total (suficiente para 10 reacciones) 50 µl
2. Añadir a un tubo de 1.5-ml y marcarlo “Mix 2”.
Componente volumen
Agua destilada 79 µl
Buffer PCR 10X + Mg 20 µl
Taq Polimerasa ADN (5 unitdades/µl) 1 µl
Volumen total (suficiente para 10 reacciones) 100 µl
3. Cada amplificación AFLP es analizada combinando lo siguiente en un tubo de
0.2- o 0.5-ml:
Componente volumen
ADN 5 µl
Mix 1 (primers/dNTPs) 5 µl
Mix 2 ( Taq DNA polimerasa/buffer) 20µl
Volumen total 20ul
4. Mezclar suavemente y centrifugar para recoger reacción.
Programa termociclador, Perkin-Elmer 9600 o similares: A. Realizar 1 ciclo a 94°C por 30 s; 65°C por 30 s; y 72°C por 60 s.
B. Disminuir la temperatura de anillamiento cada ciclo 0.7°C durante 12 ciclos.
C. 23 ciclos a:
94°C por 30 s;
56°C por 30 s; y
72°C por 60 s.
Tiempo total: 2 h, 2 min.
ANEXO 8. PREPARACION POLIACRILAMIDA al 4% 29:1. Fuente: Van der
Lee et al., 1997.
Componente Cantidad (1000ml)
Arcrilamida 39.98g
Bisacrilamida 2.01g
Trisma base 5.4g
Ácido bórico 2.748g
EDTA 0.5M 2ml
Urea 7M 420.42g
Agua 700ml
ANEXO 9. BUFFER DE CARGA UTILIZADO EN AFLPs.
Composición Cantidad/ 100ml
Formamida 90ml
TBE 5X 10ml
Azul de bromofenol 0.05g
Xilene Cyanol 0.05g
ANEXO 10. PREPARACIÓN TBE 10X*. Fuente: Sambrock, 1989.
Composición Cantidad/ 200ml
Tris 10.8g
Acido Borico 5.5g
EDTA (pH 8.0) 4ml
*Para la preparación de TBE 1.0X se diluye con agua destilada
ANEXO 11. TINCION DE NITRATO DE PLATA. Fuente: Sambrock, 1989.
Solución Componente Cantidad
Solución fijadora Acido acético 350ml
Agua bidestilada 3150ml
Solución De tinción
Nitrato de plata 3.5g
Formaldehído 37% 4.5ml
Agua bidestilada 3150ml
Solución de revelado
Carbonato de Sodio 105g
Tiosulfato de Sodio 10mg/ml. 650 µl
Formaldehído 37% 4.5ml
Agua bidestilada 3150ml
Solución de parada
Acido Acético 350ml
Agua bidestilada 3150ml
ANEXO 12. PROTOCOLO TINCION DE NITARATO DE PLATA. Fuente: Van
der Lee et al, 1997.
1. En la cabina de extracción de gases, colocar el vidrio con el gel de
poliacrilamida hacia arriba en una bandeja que contenga 3500ml de la
solución fijadora y agitar durante 20 minutos.
2. Sacar el vidrio de la solución fijadora y llevarlo a otra bandeja con agua
bidestilada durante tres minutos. Repetir este procedimiento.
3. Colocar el vidrio en una bandeja con La solución de tinción manteniendo
la posición inicial agitando durante 20 minutos. Con otra bandeja del
mismo tamaño tapar la bandeja que tiene la solución. Mantener el
espacio oscuro.
4. Sacar el vidrio de la solución de tinción y llevarlo a otra bandeja con agua
bidestilada durante 10 segundos.
5. Colocar el vidrio en una bandeja con la solución de revelado durante 5
minutos. El tiempo depende de la presencia de bandas en el gel de
poliacrilamida, teniendo en cuenta que si se deja mucho mas tiempo del
necesario es posible que el gel se queme.
6. Luego de obtener las bandas, se retira el vidrio de esta solución y se lleva
a una bandeja con la solución de parada durante 5 minutos. Esta
bandeja debe estar en la cabina de extracción.
7. Por ultimo, se coloca el vidrio en agua bidestilada, y posteriormente se
seca la parte donde no se encuentra la poliacrilamida.
8. Se observa las bandas y se toma la foto en un transiluminador de luz
blanca.
ANEXO 13. MATRIZ BINARIA POR PRESENCIA (1) O AUSENCIA (0) DE BANDAS. Fuente: Autor.
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
1 0 1 0 0 1 1 1 1 0 0 1 0 1 0 1
2 1 0 1 0 0 0 0 0 0 1 0 0 1 0 0
3 0 0 0 1 0 1 1 1 1 0 0 1 0 1 0
4 0 1 1 1 0 1 0 0 0 1 0 0 1 0 0
16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30
1 1 0 1 1 0 0 0 1 0 0 1 1 1 1 1
2 0 0 0 0 1 0 1 1 1 0 0 1 1 1 0
3 0 0 0 0 1 1 0 1 0 1 0 0 1 1 0
4 0 1 0 1 1 0 1 1 1 0 0 1 1 1 0
31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43
1 0 0 0 1 1 1 1 0 0 0 1 1 1
2 0 0 0 1 0 1 1 0 1 1 1 0 0
3 0 1 0 0 0 1 1 1 0 1 1 0 1
4 1 0 1 0 0 1 1 0 1 1 1 1 0
1. Finca “Alcalá” (Cota). 2. Finca "El Hoyo” Pueblo Viejo (Cota). 3. Finca “La Palestina” (Tabio). 4. Finca “El Cucharo” (Tenjo).
ANEXO 14. RESULTADOS DEL AGRUPAMIENTO RESPECTIVO CON EL MÉTODO UPGMA UTILIZANDO EL COEFICIENTE DE SIMILITUD DE DICE.
Rows/Cols Rozo Pueblo Viejo
Tenjo Tabio
Alcalá 1.000.000
El Hoyo 0.4390244 1.000.000
El Cucharo 0.4545455 0.4324324 1.000.000
La Palestina 0.5106383 0.7500000 0.4651163 1.000.000