identificaciÓn de hongos y bacterias asociados al...
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IDENTIFICACIÓN DE HONGOS Y BACTERIAS ASOCIADOS AL TEJIDO
VASCULAR DE FUSTES ENFERMOS DE MELINA (Gmelina arborea Roxb) EN
PLANTACIONES UBICADAS EN LOS MUNICIPIOS DE GUAMO, ARMERO-
GUAYABAL, ESPINAL Y VENADILLO EN EL DEPARTAMENTO DEL TOLIMA
VIVIAN ANDREA COY RODRÍGUEZ
Trabajo de grado presentado como requisito parcial para optar al título de
Ingeniero Forestal
Directora
MARYEIMY VARÓN LÓPEZ
Doctora en Ciencias
UNIVERSIDAD DEL TOLIMA
FACULTAD DE INGENIERÍA FORESTAL
PROGRAMA DE INGENIERÍA FORESTAL
IBAGUÉ-TOLIMA
2017
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DEDICATORIA
A mi hermano Diego quien me motivo a soñar, a mi Padre José
quien me enseño que se debe trabajar fuerte para lograr un objetivo
y a mi Madre Julia quien me fortalece para nunca rendirme.
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AGRADECIMIENTOS
A mi Papá José y Mamá Julia, a Edith, a mis hermanos Julián, Felipe, Paola, Diviana,
Daniela, Diego, Alejandro y Juan José, por todo el apoyo y amor incondicional.
A mi Directora Maryeimy Varón López, por su constancia, dedicación, paciencia y apoyo
incesante.
A Nathali López Cardona, por su orientación y asesoría en el desarrollo del trabajo. Al
profesor Carlos Prada, en el análisis de las secuencias.
A Nataly Ruiz Quiñones, por enseñarme el maravilloso mundo de la microbiología y
Miguel Ángel Quimbayo, por sus consejos y colaboración
Al grupo de Investigación GEBIUT, por permitirme llevar a cabo mi investigación.
A los chicos del laboratorio: Julieth, Yessica y Herick por su gran ayuda en el desarrollo
de mi trabajo y por su colaboración en las actividades de laboratorio.
A quienes de uno u otra manera me acompañaron y guiaron para el llevar a cabo este
trabajo.
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CONTENIDO
INTRODUCCIÓN .................................................................................................... 14
1. OBJETIVOS .................................................................................................... 16
1.1 OBJETIVO GENERAL ................................................................................ 16
1.2 OBJETIVOS ESPECIFICOS ....................................................................... 16
2. MARCO TEÓRICO ........................................................................................... 17
2.1 DESCRIPCIÓN DE LA ESPECIE ................................................................ 17
2.2 PLANTACIONES DE G. arborea Roxb. EN EL MUNDO................................ 18
2.3 PLANTACIONES DE G. arborea Roxb. EN COLOMBIA................................ 19
2.4 SINTOMAS ASOCIADOS A ENFERMEDADES CAUSADAS POR HONGOS Y
BACTERIAS EN PLANTACIONES FORESTALES 19
2.5 PRINCIPALES MICROORGANISMOS PATÓGENOS ASOCIADOS A
PLANTACIONES DE G. arborea Roxb. .................................................................... 20
2.6 CARACTERIZACIÓN DE HONGOS Y BACTERIAS PATOGENOS EN
ESPECIES FORESTALES. ..................................................................................... 21
2.7 PRUEBAS DE PATOGENICIDAD ............................................................... 23
3. METODOLOGÍA .............................................................................................. 25
3.1 ÁREA DE ESTUDIO Y SITIOS DE MUESTREO ........................................... 25
3.2 OBTENCION DE LA MUESTRA .................................................................. 27
3.3 DESINFECCIÓN ........................................................................................ 27
3.4 AISLAMIENTO E IDENTIFICACIÓN MORFÓLOGICA DE LAS CEPAS
FUNGICAS ............................................................................................................ 27
3.5 AISLAMIENTO, CARACTERIZACION MACROSCOPICA E IDENTIFICACIÓN
BIOQUIMICA DE LAS COLONIAS BACTERIANAS .................................................. 29
3.6 IDENTIFICACION MOLECULAR DE HONGOS Y BACTERIAS..................... 30
3.7 PRUEBAS DE PATOGENICIDAD PARA HONGOS Y BACTERIAS ............... 32
6
4 RESULTADOS ................................................................................................ 34
4.1 SINTOMATOLOGÍA EN PLANTAS .............................................................. 34
4.2 CARACTERIZACIÓN E IDENTIFICACIÓN MORFOLÓGICA DE LOS HONGOS
ASOCIADOS A Gmelina arbórea Roxb. ................................................................... 35
4.3 CARACTERIZACIÓN E IDENTIFICACIÓN DE LAS BACTERIAS ASOCIADAS
A Gmelina arbórea Roxb., EN EL DEPARTAMENTO DEL TOLIMA. .......................... 41
4.4 IDENTIFICACIÓN MOLECULAR DE HONGOS Y BACTERIAS..................... 41
4.5 PRUEBAS DE PATOGENICIDAD DE HONGOS Y BACTERIAS EN PLANTAS
DE Gmelina arbórea Roxb....................................................................................... 47
5 DISCUSIÓN ..................................................................................................... 51
6 CONCLUSIONES............................................................................................. 56
RECOMENDACIONES ........................................................................................... 57
REFERENCIAS ...................................................................................................... 58
ANEXOS................................................................................................................ 68
7
LISTA DE TABLAS
Tabla 1. Pruebas realizadas para cada una de las cepas de hongos aislados de los fustes
de Melina. .............................................................................................................. 28
Tabla 2. Morfología de hongos asociados a G. arbórea, y condiciones ideales de
esporulación por aislamiento. .................................................................................. 39
Tabla 3. Caracterización bioquímica de las cepas bacterianas obtenidas de plantaciones
de G. arborea, en el departamento del Tolima .......................................................... 42
Tabla 4. Secuencias de las regiones ITS-ADNr de las cepas fúngicas comparadas con
las secuencias almacenadas en el Gen-Bank ........................................................... 45
Tabla 5. Secuencias de las regiones 16S-ADNr de las cepas bacterianas, comparadas
con las secuencias almacenadas en el Gen-Bank. .................................................... 47
Tabla 6. Resultados pruebas de patogenicidad de diez microorganismos inoculados en
Plántulas de G. arborea. ......................................................................................... 48
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LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Distribución espacial de las áreas donde fueron seleccionadas las muestras de
fustes de Melina. .................................................................................................... 25
Figura 2. Sintomatología de los árboles evaluados.. ................................................. 34
Figura 3. Características morfológicas de los hongos asociados al tejido vascular en
plantaciones ubicadas en el municipio del Guamo. ................................................... 36
Figura 4. Características morfológicas de los hongos asociados al tejido vascular en
plantaciones ubicadas en el municipio de Armero-guayabal. ..................................... 37
Figura 5. Características morfológicas de los hongos asociados al tejido vascular en
plantaciones ubicadas en el municipio del Espinal. ................................................... 38
Figura 6. Análisis filogenético de hongos basado en el método de agrupamiento de
vecinos (NJ); test de filogenia Bootstrap 1000 repeticiones, modelo Kimura 2 + Gama
distribución. ............................................................................................................ 44
Figura 7. Análisis filogenético de bacterias basado en el método de agrupamiento de
vecinos (NJ), test de filogenia Bootstrap 1000 repeticiones, modelo Kimura 2. ........... 46
Figura 8. Consolidado de resultados, pruebas de patogenicidad para L. theobromae, en
G. arborea. ............................................................................................................. 49
Figura 9. Consolidado de resultados, pruebas de patogenicidad para C. geniculata, en
G. arbórea. ............................................................................................................. 50
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LISTA DE ANEXOS
Anexo A. Descripción de síntomas de enfermedades por plantación de G. arborea.... 69
Anexo B. Árboles de G. arborea en el municipio de Venadillo con descortezamiento
basal.. .................................................................................................................... 70
Anexo C. Consolidado de los resultados de las pruebas bioquímicas para Bacillus
cereus.. .................................................................................................................. 71
Anexo D. Consolidado de los resultados de las pruebas bioquímicas para Pseudomonas
alcaligenes.. ........................................................................................................... 72
Anexo E. Consolidado de los resultados de las pruebas bioquímicas para Pantoea
dispersa.. ............................................................................................................... 73
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RESUMEN
Gmelina arborea Roxb, es una especie con alto valor comercial debido a su rápido
crecimiento y a las excelentes propiedades físicas y mecánicas de su madera,
características que la hacen importante en el sector forestal. Melina, como se le conoce
comúnmente, presenta una alta distribución mundial y se ve amenazada por diversos
factores físicos, químicos y biológicos, siendo los hongos y las bacterias
microorganismos que pueden afectar significativamente su producción. En Colombia, y
específicamente en el departamento del Tolima, poco se sabe sobre las patologías que
afectan esta especie, por lo tanto caracterizar los agentes causales de enfermedades en
Melina es fundamental para poder establecer medidas de control. El presente estudio
tuvo como objetivo aislar e identificar los principales hongos y bacterias asociados a
fustes enfermos de G. arborea Roxb, en plantaciones ubicadas en los municipios de
Guamo, Armero-guayabal, Espinal y Venadillo, en el departamento del Tolima. Se
tomaron muestras del tejido vascular de Melina para llevar a cabo el aislamiento y
posterior identificación de los microorganismos. La caracterización morfológica de las
colonias fúngicas se realizó en medio PDA y la identificación microscópica se efectúo
después de inducir las estructuras reproductivas. El aislamiento e identificación de
bacterias se realizó en Agar Nutritivo, con posterior caracterización bioquímica. La
identificación molecular fue realizada mediante la amplificación de la región ITS para
hongos y 16S para bacterias. Se aislaron siete hongos y tres bacterias, de las
plantaciones ubicadas en los municipios de Guamo, Armero-guayabal y Espinal. Los
hongos identificados fueron; Lasiodiplodia theobromae, Coniothyrium aleuritis,
Curvularia geniculata, Dothideomycetes, Chaetomium globosum, Phomopsis columnaris
y Diaporthe sp; y las bacterias Bacillus cereus, Pseudomonas alcaligenes, y Pantoea
dispersa. Las pruebas de patogenicidad, realizadas en fustes jóvenes de Melina,
mostraron que L. theobromae y C. geniculata fueron causantes de pudrición del tejido
vascular, con una incidencia del 75% y 50% respectivamente. Estos resultados
permitieron concluir, que sólo el 20% de los microorganismos identificados fueron
patógenos, causantes de pudrición en el fuste de árboles jóvenes de Melina; con ello se
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amplía el conocimiento sobre los agentes causales de enfermedades de esta especie
forestal.
Palabras clave: Hongos, bacterias, especie forestal, Gmelina arborea Roxb, producción.
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ABSTRACT
Gmelina arborea Roxb, is a species with a high commercial value due to its rapid growth
and the outstanding properties both physical and mechanical of its wood, characteristics
which make it important in the forestry sector. Melina as it is commonly known, features
an elevated worldwide distribution and faces threats because of diverse factors such as
physical, chemical and biological; fungi and bacteria are microorganisms which affect
significantly its production. In Colombia, specifically in the department of Tolima, very few
information is known about pathologies that may influence meaningfully forestry species;
therefore, characterize the causative agents of diseases in Melina is essential to establish
control measures. The objective of this study was to isolate and identify the main fungi
and bacteria associated with the vascular tissue in diseased stems of Gmelina arborea
Roxb, in plantations of the municipalities of Guamo, Armero-guayabal, Espinal and
Venadillo, in the department of Tolima. Vascular tissue samples were taken from G.
arborea to carry out the isolation and subsequent identification of the microorganisms.
The Morphological characterization of fungal colonies was realized in PDA medium and
the microscopic identification was performed after inducing the reproductive structures.
For the isolation and identification of bacteria, fragments of vascular tissue were collected,
sown in nutrient agar, with subsequent biochemical characterization. Molecular
identification was effectuated through amplification of the ITS region for fungi and 16S for
bacteria. Seven fungi and three bacteria were isolated from plantations located in three
of the four municipalities. The identified fungi were: Lasiodiplodia theobromae,
Coniothyrium aleuritis, Curvularia geniculata, Dothideomycetes, Chaetomium globosum,
Phomopsis columnaris and Diaporthe sp; And the bacteria: Bacillus cereus,
Pseudomonas alcaligenes, and Pantoea dispersa. The pathogenicity tests, performed
on young stems of melina, demonstrated that L. theobromae and C. geniculata were
responsible for rotting of the vascular tissue, with an incidence of 75% and 50%,
respectively. These results allowed to conclude that only two fungi out of the ten identified
microorganisms (L. theobromae and C. geniculata) are causative pathogens for rotting in
the stem of Melina trees; Likewise, it concludes that the five remaining fungi and the three
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bacteria isolated from the three plantations do not affect, by no means, the vascular tissue
of G. arborea; Thereby, the knowledge about the causative agents of diseases of this
forestry species is extended.
Keywords: Fungi, bacteria, forestry species, Gmelina arborea Roxb, production.
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INTRODUCCIÓN
Gmelina arborea Roxb., comúnmente conocida como Melina, es una especie con
capacidad de desarrollarse en distintos hábitats, que varían desde húmedos hasta secos.
Es nativa de los bosques húmedos tropicales de la India, Birmania y Sri Lanka hasta el
sur de China. Ampliamente introducida en Brasil, Gambia, Honduras, Costa de Marfil,
Malasia, Malawi y Sierra Leona, gracias a su rápido crecimiento, y a las excelentes
propiedades físicas y mecánicas de la madera (Umana, Akwaji, Markson, & Udo, 2015).
Sus principales usos son para aserrío, ebanistería, molduras, pisos livianos, instrumentos
musicales, embalajes y recientemente en la construcción de viviendas (Arguedas, 2004).
Los países con más hectáreas plantadas de G.arborea, son Costa Rica (Arguedas, 2006)
y Nigeria (Umana et al., 2015). Melina ha sido cultivada en Colombia desde 1980,
principalmente para reforestar los suelos de la costa Caribe Colombiana para la
producción agropecuaria (Mariño & Rodríguez, 2010) y para el proceso de aserrío
(Proexport, 2012). Existen en promedio 14.000 hectáreas de plantaciones de esta
especie forestal, concentradas principalmente en los departamentos de Bolívar,
Magdalena, Llanos Orientales, Cundinamarca, entre otros (Obregón, 2006). En el caso
del departamento del Tolima se registran actualmente 450 ha plantadas, distribuidas en
los municipios de Guamo, Coello, Venadillo, Natagaima, Espinal, Ibagué, Armero-
Guayabal y Coyaima (Barrios et al., 2011; Bustos, 2013).
A medida que aumenta la superficie sembrada de un cultivo, se incrementa la presencia
de enfermedades ocasionados por hongos y bacterias, lo que se conoce como precio de
la popularidad varietal (Castaño-Zapata, 2002). En Costa Rica, hasta el 2004 se
reportaron 36 agentes causales de daños en Melina, de los cuales el 44,4% son insectos,
el 33,3% son patógenos y 22,2% son vertebrados; de estos agentes el 33% reportan
daño en el fuste (corteza y xilema), el 33% en el follaje y el 34% distribuido en semillas,
plántulas, ramas y raíz. Las afectaciones en el fuste, principalmente son: cancros,
necrosis, tumores y muerte vascular (Arguedas, 2004); problemas a los que se les
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atribuye las mayores pérdidas en la producción, ya que en una especie forestal de
objetivo comercial, el fuste es el principal producto aprovechable, y por lo tanto la
presencia de enfermedades en él, puede disminuir significativamente su rendimiento
(Obregón, 2006).
En Colombia, las investigaciones sobre G. arborea han estado dirigidas hacia la
incorporación de ésta a sistemas agroforestales (Zuluaga, Osorio, Gutierrez, Martinez, &
Bocanegra, 2011), mejoramiento genético, resistencia a estrés hídrico (Mariño &
Rodríguez, 2010), efecto del control de malezas, fertilización sobre el crecimiento
(Barrios et al., 2011) y caracterización de plagas (Pacheco, 2007), sin embargo, poco se
conoce sobre los agentes causales de enfermedades en el fuste, a pesar de que existen
evidencias de árboles de Melina con afectaciones en el tejido vascular y sintomatología
asociada a la presencia de hongos y bacterias. Por lo tanto identificar los principales
microorganismos asociados a enfermedades en fustes de Melina, ayudaría a ampliar el
conocimiento sobre los patógenos que pueden afectar esta especie forestal en Colombia,
específicamente en el departamento del Tolima, y con ello plantear medidas de control
mejor direccionadas.
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1. OBJETIVOS
1.1 OBJETIVO GENERAL
Aislar e identificar hongos y bacterias asociados al tejido vascular de fustes enfermos de
Gmelina arborea Roxb, en plantaciones ubicadas en los municipios de Guamo, Armero-
guayabal, Espinal y Venadillo, en el departamento del Tolima.
1.2 OBJETIVOS ESPECIFICOS
Caracterizar morfológica y molecularmente, hongos y bacterias asociadas al tejido
vascular de G. arborea Roxb.
Evaluar la patogenicidad de los hongos y bacterias identificados, sobre plántulas
de G. arborea Roxb bajo condiciones controladas.
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2. MARCO TEÓRICO
2.1 DESCRIPCIÓN DE LA ESPECIE
De acuerdo al Sistema de Información Taxonómica Integrada (ITIS por sus siglas en
Inglés) G. arborea Roxb pertenece a la familia Lamiaceae. La especie G. arborea es
conocida comúnmente en América tropical como Melina, en Indonesia se le conoce como
Yemane y en la India como Gamari o Gumadi. Otros nombres son Gemelina, Gmelina,
Gumhar, Kashmir tree, Malay beechwood, Snapdragon, Teca blanca, Yemani (Birmania),
So, So-maeo (Tailandia), Kumhar, Sewan (Pakistán), Shivani (Indias central), Gamar
(Bangladesh). Se han reportado tres variedades de la especie: G. arborea var. arborea,
G. arborea var. glaucescens y G. arborea var. canencens, las cuales se diferencian entre
sí por su distribución natural (Rojas, y otros, 2004).
La madera de G. arborea se caracteriza por ser moderadamente liviana, de lustre alto y
apariencia suave y sedosa; no presenta olor ni sabor distintivos; entre la albura y el
duramen no existe diferencia, su grano es recto a entrecruzado y su textura es gruesa,
su color varía de crema a pardo amarillento, tornándose pardo-rojizo con la edad
(Obregón, 2003). Presenta una densidad verde de 0.82 g/cm3, seca al aire 0,5 g/cm3,
anhídrida 0,44 g/cm3, básica 0,4 g/cm3; su contracción normal radial es de 2,8%,
tangencial 4,1%, volumétrica 7,1%; la contracción total radial es de 3,8%, tangencial
5,5%, volumétrica 8,3%. Las propiedades mecánicas con el contenido de humedad
ajustado al 12% son, 1) flexión estática: esfuerzo de fibras al límite proporcional 298
kg/cm2, módulo de ruptura 522 kg/cm2, módulo de elasticidad 81 t/cm2; 2) compresión
paralela: esfuerzo de fibras al límite proporcional 192 kg/cm2, resistencia máxima 285
kg/cm2; 3) dureza: extremos 305 kg, lados 243 kg; 4)compresión perpendicular al grano
al límite proporcional 82 kg/cm2; cizallamiento 81 kg/cm2; impacto 1,2 m-kg. Se
considera que la madera de Melina es moderadamente susceptible al ataque de hongos,
sin embargo al ser tratada con sustancias preservantes como CCA (cromo, cobre y
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arsénico) o sales de boro, es clasificada como de alta resistencia (Universidad del
Tolima, Tropicales, Ministerio, & F&M, 2016).
En cuanto a la anatomía de su madera, presenta porosidad semicircular o difusa; con
poros visibles a simple vista, homogéneamente distribuidos, solitarios y en múltiples
radiales de 2 a 4, escasos racemiformes presentes; los vasos en general no poseen
contenidos. Presenta tílides de paredes finas muy abundantes, ocluidos en casi todos
los vasos. El parénquima es visible solo con lupa. El parénquima paratraqueal es escaso,
vacicéntrico y aliforme, con alas muy cortas, raramente confluente. Los radios son finos
y apenas visibles a simple vista, moderadamente pocos (de 5-13 radios/mm) (González
& Serrano, 2004).
2.2 PLANTACIONES DE G. arborea Roxb. EN EL MUNDO
Esta especie se encuentra en hábitats que varían desde húmedos hasta secos. Su
máximo desarrollo lo alcanza a una altitud de 1260 msnm, con una temperatura que
oscila entre los 18ºC – 35ºC y una humedad relativa superior a 40%, sobre todo en valles
húmedos y fértiles de Birmania y Nigeria. Es nativa de India, Bangladesh, Sri Lanka,
Myanmar, Tailandia, sur de China, Laos, Camboya y Sumatra en Indonesia, siendo una
importante fuente de madera en las regiones tropicales y subtropicales de Asia. Se
caracteriza por su acelerado crecimiento, hasta cinco o seis años de haber sido
establecida, sin superar los 30 años de edad, llegando a alcanzar hasta 30 metros de
altura, y 60 cm de diámetro, cuando alcanza la edad adulta su crecimiento se vuelve
lento (Obregón, 2006; Umana et al., 2015).
Melina ha sido introducida en muchos países tropicales incluyendo Filipinas, Malasia
Gambia, Costa Rica, Burkina Faso, Costa de Marfil, Nigeria y Malawi; también es común
en Cuba, Colombia, Brasil, Venezuela, Guatemala y en la zona tropical de México, en
América Central existe un total de 225.000 ha de plantaciones forestales, de las cuales
52.000 ha (23%) corresponden a esta. Siendo cultivada con propósitos comerciales tanto
en Costa Rica como en Guatemala (Rojas et al., 2004).
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2.3 PLANTACIONES DE G. arborea Roxb. EN COLOMBIA
Los primeros plantíos de G. arborea fueron establecidos en la década del 60 en la Costa
Atlántica, en el marco del proyecto FAO – CVM (Corporación del Valle del Magdalena).
Colombia cuenta con unas 14.000 hectáreas de Melina, concentradas principalmente en
los departamentos de Bolívar, Magdalena, Llanos Orientales, Cundinamarca y otras
zonas bajas; de los cuales la empresa reforestadora Pizano S.A. posee cerca de 7 mil
hectáreas, con un 49.7% del total de sus plantaciones en los municipios de Zambrano
(Bolívar), El Difícil de Ariguaní, Fundación y San Ángel (Atlántico) y en el municipio de
Becerríl (Cesar); siendo parte del programa de mejoramiento, liderado por Monterrey
Forestal S.A. (Obregón, 2006).
El departamento Tolima cuenta con 450 ha plantadas con Melina (Barrios et al., 2011),
distribuidas en los municipios de Coyaima, Coello, Venadillo, Natagaima, Espinal,
Ibagué, Armero-Guayabal y Guamo. Armero-guayabal y Guamo poseen la mayor área
cultivada, con 42 ha en la finca Arizona y 25,5 ha en el Centro Universitario Regional del
Norte, respectivamente (Bustos, 2013).
2.4 SINTOMAS ASOCIADOS A ENFERMEDADES CAUSADAS POR HONGOS Y
BACTERIAS EN PLANTACIONES FORESTALES.
Se considera que los árboles presentan una enfermedad cuando sus funciones
fisiológicas son alteradas, generalmente por patógenos o condiciones
medioambientales. Las principales causas de enfermedad en los árboles son los
organismos patógenos (hongos, bacterias, virus, nematodos y fitoplasmas). En un
principio, la reacción del árbol ante el patógeno se concentra en la parte afectada,
posteriormente se difunde en toda la planta y se producen cambios histológicos, que
constituyen los síntomas de la enfermedad (Agrios, 2005).
Los tejidos afectados determinan el tipo de función fisiológica que se verá intervenida,
por ejemplo: La pudrición de la raíz, dificulta la absorción del agua y de los nutrientes del
20
suelo; los marchitamientos vasculares y cancros, interfiere con la translocación del agua
y los minerales hasta la parte superior de la planta; las manchas foliares, tizones y
mosaicos, afecta la fotosíntesis; los cancros corticales e infecciones virales del floema,
obstaculiza la translocación; las infecciones florales, interfieren con la reproducción; y las
pudriciones del fruto, entorpecen la reproducción o el almacenamiento de las reservas
alimenticias para la nueva planta (Agrios, 2005; Bergamin, Kimati, & Armorim, 1995; Boa,
2008).
El diagnostico de una enfermedad en un árbol requiere de la ejecución de varios pasos:
observación de síntomas, determinación de circunstancias (condiciones climáticas,
relieve del terreno, distribución de la enfermedad en campo, historial de cultivos previos,
entre otras), observación de la presencia de patógenos y correlación de lo observado
con bibliografía pertinente. Los síntomas más frecuentes en especies forestales son:
manchas (cloróticas, necróticas y mosaicos), necrosis (apical y terminal), taponamiento
vascular (marchitez y tuberización aérea), cancros (ingreso de microorganismo a través
de una herida), pudrición y crecimiento anormal (agallas de corona o tumores) (Boa,
2008; French & Hebert, 1980).
2.5 PRINCIPALES MICROORGANISMOS PATÓGENOS ASOCIADOS A
PLANTACIONES DE G. arborea Roxb.
Los principales microorganismos causantes de enfermedades en los fustes de G.
arbórea Roxb., son los hongos, con las especies Aspergillus flavus, Aspergillus niger,
Apodachlya pyrifera, Botroyodiplodia theobromae, Dacromyces deliquescens, Fusarium
oxysporum, Phoma herbarum, Trichosporonoide oedocephalus, Graphium penicilliodes
y Ceratocystis fimbriata, asociados a la pudrición de los fustes en plantaciones, en
Nigeria (Umana et al., 2015). Ceratocystis fimbriata, conocido como el “mal del machete”
causa una de las enfermedades de mayor peligro para plantaciones de esta especie, el
patógeno ingresa al tejido vascular exclusivamente por heridas frescas en cualquier parte
del tallo o de las raíces, ocasionando la muerte de la especie en cualquier estado de
desarrollo (Arguedas, 2004). Pestalosphaeria elacidis y Khuskia oryzae causan necrosis
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vascular, Ganoderma spp pudrición en la medula (Orwa, Mutua, Kindt, Jamnadass, &
Anthony, 2009)
El hongo Phomopsis gmelinae se registra como causante del cancro en el tallo, en
Kerala, India (Sankaran, Aorence, & Sharma, 1987). Otros hongos como Botryodiplodia
sp, Corticium salmonicolor, ocasionan pudrición del xilema y Nectria genera un área
necrótica de los tejido corticales del árbol, en plantaciones de Costa Rica (Arquedas,
2004). Nectria ha sido registrado como el principal problema fitosanitario de las
plantaciones de Costa Rica, ya que ataca árboles jóvenes, abarca el perímetro del fuste,
y la parte apical del árbol muere. En árboles de más de 5 años, las áreas de la corteza
afectadas se encuentran delimitadas por “callos” y se resquebrajan (Rojas et al., 2004).
Pocos géneros de bacterias han sido encontradas como causantes de enfermedades en
G. arborea, se resalta Agrobacterium tumefaciens, como causante de agallas en la base
del fuste de plantaciones en Costa Rica (Arguedas, 2004).
2.6 CARACTERIZACIÓN DE HONGOS Y BACTERIAS PATOGENOS EN
ESPECIES FORESTALES.
La caracterización fitopatológica es realizada a través de diferentes métodos de
investigación científica. La implementación de una adecuada estrategia depende del tipo
de enfermedad, y del diseño experimental a realizar. Los métodos de observación e
inducción de formación de estructuras taxonómicas diferenciales, son importantes en el
momento de aislar e identificar un patógeno, porque el primero permite determinar la
relación entre causa y efecto, y el segundo se utiliza para analizar la información (French
& Hebert, 1980).
Para la realización de buenas prácticas fitopatológicas es importante llevar a cabo el
diagnóstico de la enfermedad, y es preciso que la persona que diagnostica tenga
conocimientos de ecología, pues se hace necesario determinar las interacciones de los
factores bióticos y abióticos que estén involucrados, además de poseer conocimiento en
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la ciencia del suelo y la meteorología, así como las ciencias de la protección de plantas
(fitopatología, entomología, nematología, y ciencia de las malezas), pues debe deducir
si la enfermedad es causada por un agente biológico o climático, o si es una respuesta
fisiológica de la planta. Una vez determinada la causa, se debe observar la frecuencia
de los síntomas, su variabilidad en el tiempo y la distribución espacial de la enfermedad
(Grogan, 1981).
Posteriormente se realiza la colecta de material infectado, y el aislamiento del patógeno.
Un factor primordial en el aislamiento es dar las condiciones más favorables al
microorganismo y desfavorables a sus competidores; en la siembra e incubación del
material, el medio de cultivo ideal, un buen corte y desinfección del tejido a cultivar, son
esenciales para generar ambientes adecuados en su desarrollo. En la caracterización
morfológica y cultural de las cepas obtenidos, es recomendable observar las placas todos
los días, identificar las colonias de las cuales se obtienen las muestras para análisis
macroscópico y microscópico (Castaño-Zapata, 1998; French & Hebert, 1980).
Recientemente, la taxonomía convencional viene siendo soportada con los análisis
moleculares, fortaleciendo los resultados que se obtienen a través de caracterizaciones
morfológicas, culturales y bioquímicas, con el objetivo de realizar una identificación
precisa de los microorganismos patógenos en especies forestales y generar bases de
datos actualizadas como apoyo a futuras investigaciones (Cai et al., 2011).
Para el análisis molecular se lleva a cabo la extracción del ADN, secuenciación con
cebadores (primers) específicos y posterior afiliación filogenética (Dereppe et al., 2008).
Las metodologías aplicadas difieren según el microorganismo a analizar. Para la
identificación molecular de hongos y bacterias a partir de tejido vegetal enfermo, es
necesario realizar la siembra de la cepa en el medio de cultivo idóneo para su
crecimiento, a temperatura de 25-30ºC (Capote, Aguado, Sánchez-Torres, & Pastrana,
2012). Posteriormente se realiza la extracción del ADN del microorganismo (hongos o
bacterias), y se lleva a cabo la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) la cual permite
la amplificación de millones de copias de secuencias de ADN específicas por ciclos
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repetidos de desnaturalización, polimerización y alargamiento a diferentes temperaturas,
son utilizados oligonucleótidos específicos (cebadores), desoxirribonucleótidos trifosfato
(dNTP) y una polimerasa termoestable de ADN Taq en el tampón adecuado (Mullis &
Faloona, 1987). En hongos los cebadores más utilizados para la amplificación de la
secuencia de ADN son los genes de las subunidades grandes del espaciador transcrito
interno (ITS) de los genes del RNA ribosomal, y en bacterias se utiliza la subunidad 16S
de los genes del RNA ribosomal; seguidamente los fragmentos de ADN amplificados se
visualizan por electroforesis en gel de agarosa teñido para determinar la calidad y
presencia de ácidos nucleicos de la muestra (Fierro, 2014).
Para realizar la afiliación filogenética, la secuencia obtenida se compara con aquellas
depositadas en la base de datos Genbank del Centro Nacional para Información
Biotecnológica (NCBI por sus siglas en inglés, http://www.ncbi.nlm.nih.gov). Para el
alineamiento de secuencias están disponibles programas como BLAST
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST) que permiten la comparación de secuencias online
o Mega en su versión más actualizada (Moreno-Rico et al., 2010). Posterior a este
alineamiento es realizado el dendrograma que permite analizar las secuencias
homologas, compararlas con la secuencia problema e identificar con cual se presenta
mayor identidad filogenética. En la realización de los dendrogramas se utilizan diferentes
algoritmos: el método de agrupamiento de vecinos (siglas en inglés “NJ” neighbor-
joining), máxima verosimilitud, máxima parsimonia. Si la relación entre las secuencias
analizadas es débil, la apariencia del dendrograma se modifica según el programa
utilizado; un factor que afecta la comparación de secuencias en él, es la selección del
grupo externo ( una cepa relacionada pero fuera del grupo comparado) (Bou, Fernández-
Olmos, García, Sáez-Nieto, & Valdezate, 2011).
2.7 PRUEBAS DE PATOGENICIDAD
En la investigación fitopatológica es fundamental realizar las pruebas de patogenicidad,
donde el microorganismo siempre debe estar asociado con una enfermedad y la
enfermedad no debe presentarse sin que el organismo o agente causal se encuentre o
24
haya estado presente; para ello deben de cumplirse los postulados expuestos por Robert
Köch: 1) el microrganismo debe estar presente en el tejido enfermo, 2) debe ser aislado
en cultivo puro y sus características determinadas, 3) la inoculación del patógeno debe
resultar en los mismos síntomas de enfermedad 4) al ser re-aislado sus características
deben coincidir con las determinadas en el segundo postulado; estos enunciados se
realizan con el fin de determinar la causa de la enfermedad del organismo (Firmino, 2011;
Volcy, 2008).
25
3. METODOLOGÍA
3.1 ÁREA DE ESTUDIO Y SITIOS DE MUESTREO
Las muestras fueron colectadas en plantaciones de G. arborea Roxb, ubicadas en el
departamento del Tolima, se seleccionaron al nororiente los municipios de Armero-
Guayabal y Venadillo, localizados a 59 km de distancia entre ellos, y al suroriente Guamo
y Espinal, con 17km de distancia uno del otro (Figura 1). Las áreas de estudio escogidas
están situadas en la formación de bosque seco tropical, en una franja altitudinal de los
300 a 500 msnm.
Figura 1. Distribución espacial de las áreas donde fueron seleccionadas las muestras
de fustes de Melina.
Fuente: Autor
26
3.1.1 Características de las áreas de estúdio. Las áreas de estudio se seleccionaron de
acuerdo a su ubicación geográfica, fueron elegidas dos plantaciones ubicadas al
Nororiente y dos al Suroriente del departamento. Las condiciones climáticas son
similares en cada una de las plantaciones, y su edad no supera los 20 años. A
continuación se describe cada una de ellas:
Finca Arizona, Vereda Caracolí, municipio del Guamo; ubicada en la vía Ibagué – Ortega
a 82,3 km de Ibagué y 8,9 km del Guamo. El Guamo se encuentra a una altitud de 321
msnm., con temperatura promedio de 26° C, precipitación media anual de 1488 mm y
humedad relativa de 72%. Cuenta con un área de 96 hectáreas de las cuales 42
hectáreas están plantadas con esta especie (Concejo-Municipal, 2012).
Centro Universitario Regional del Norte (CURDN); ubicado en la vía Ibagué - Armero
guayabal a 85 km de Ibagué y 4 km de Armero-guayabal. Armero-guayabal se encuentra
a una altitud de 275 msnm, con una temperatura promedio de 27° C, precipitación media
anual de 1738 mm, y humedad relativa de 71%. Posee un área de 700 hectáreas de las
cuales 26,5 hectáreas son plantadas con Melina. (Facultad de Ingeniería Agronómica,
2010).
Corporación Colombiana de Investigación Agropecuaria (Corpoica) sede Nataima,
ubicado en la vía Ibagué - Espinal a 58,6 km de Ibagué y 10,3 km de Espinal. Espinal se
encuentra a una altitud de 323 msnm., presenta una temperatura promedio de 29° C,
una precipitación media anual de 1766 mm y una humedad relativa de 60% cuenta con
un área de 4,5 hectáreas plantadas con Melina (Alcaldía-Municipal-Despacho, 2012).
Finca La Cabaña, Vereda la Sierrita, ubicada en la vía Ibagué- Santa Isabel a 96,5 km
de Ibagué y 8,7 km de Venadillo vía Santa Isabel. Venadillo se encuentra a una altitud
de 348 msnm., presenta una temperatura promedio de 26° C, una precipitación media
anual de 1840 mm y una humedad relativa de 70%. cuenta con área de 5 hectáreas
plantadas con Melina (Alcaldía-Municipal, 2012).
27
3.2 OBTENCION DE LA MUESTRA
Se observó el estado fitosanitario de los árboles en las cuatro localidades, en cada zona
se seleccionó tres individuos con algún síntoma de enfermedad en el tejido vascular
(pudrición, cancros, necrosis, agallas o muerte) (Anexo1). Fue obtenida una muestra por
individuo. Cuando no se evidenció síntomas de enfermedad, la muestra fue tomada a
partir de una altura de 10 cm del suelo. Se retiró la corteza y con un machete previamente
desinfectado con hipoclorito al 5%, se realizaron los cortes del tejido (Anexo B).
Las muestras fueron almacenadas en bolsas de papel y bolsas de plástico para evitar su
contaminación, marcadas con fecha, número de árbol y localidad, y se transportaron en
una nevera portátil a 4°C hasta el laboratorio de Microbiología y Micorrizas, perteneciente
al grupo de investigación Genética y Biotecnología Vegetal Microbiana de la Universidad
del Tolima (GEBIUT).
3.3 DESINFECCIÓN
Se observó en estereoscopio el material vegetal enfermo y se cortaron segmentos
rectangulares de aproximadamente 3 mmx 5mm, en proporción 3:1 (material sano:
material enfermo). Las muestras de tejido vascular fueron desinfectadas mediante lavado
con agua destilada estéril (ADE), seguidamente sumergidas por un minuto en hipoclorito
al 2%, posteriormente se enjuagaron tres veces con ADE, y se sumergieron por minuto
en alcohol al 70%, para finalizar se realizaron tres lavados con ADE (French & Hebert,
1980).
3.4 AISLAMIENTO E IDENTIFICACIÓN MORFÓLOGICA DE LAS CEPAS FUNGICAS
Las muestras previamente desinfectadas fueron puestas en medio Papa Dextrosa Agar
(PDA) en cinco repeticiones cada una con cinco réplicas para un total de 25 trozos de
tejido vegetal por árbol, esto con el fin de evaluar la frecuencia de crecimiento de cada
28
microorganismo. Las cajas de petri se incubaron en condición de oscuridad a 26-28ºC
durante siete días (Barnett & Hunter, 1998).
Para la evaluación macroscópica, se realizó el aislamiento del hongo hasta obtener
cultivos puros y a partir de ésta se llevó a cabo la caracterización en el medio de cultivo
PDA, a 27ºC y durante 7 días. Los parámetros macroscópicos evaluados fueron: borde,
textura, características de esporulación, tamaño, coloración según la tabla de Mussell
(Agrios, 2005).
La caracterización microscópica fue realizada después de inducir la esporulación en los
medios: Agar Extracto de Malta (EMA: agar 20 g, dextrosa 10 g, extracto de levadura 3
g, extracto de malta 3 g, peptona 5 g, 1 L de agua destilada); Agar Avena (AA: 40 g de
avena en hojuelas, 20 g de agar, 1 L de agua destilada); Agar enriquecido con 8
vegetales (V8: 200 mL de jugo de verduras V8, 3 g CaCO3, 20 g agar, 1 L de agua
destilada); Agua Agar Acículas de pino (AAAP: agar al 2%, acículas de pino previamente
esterilizada con luz ultravioleta de onda larga durante 24 horas); Agar hojas de clavel
(CLA: agar al 2%, hojas de claves previamente esterilizadas con luz ultravioleta de onda
larga durante 24 horas), a las temperaturas de 28ºC y 35ºC, oscuridad 24 horas y luz
ultravioleta de onda larga, fotoperiodo (12h) (tabla 1). Seguidamente se realizó el montaje
en el microscopio, y la identificación se hizo mediante las claves de Barnett y Hunter,
(1998)
Tabla 1. Pruebas realizadas para cada una de las cepas de hongos aisladas de los
fustes de Melina.
Cepas
1 2 3 4 5 6 7
Med
ios d
e
cu
ltiv
o PDA X X X X X X X
AA X X X X X
AAAP X
29
Cepas
1 2 3 4 5 6 7
AEM X X X X
CLA X
V8 X X X X X X
Temp.
(ºC)
28ºC X X X X X X X
35ºC X X X X X X X
LUZ Oscuridad X X X X X X X
UV 12h X X X X X X X
Fuente: Autor
3.5 AISLAMIENTO, CARACTERIZACION MACROSCOPICA E IDENTIFICACION
BIOQUIMICA DE LAS COLONIAS BACTERIANAS
Se utilizaron dos metodologías para realizar la siembra de bacterias en medio Agar
Nutritivo (AN), La primera, siembra directa para las muestras cuyos árboles presentaban
síntomas de pudrición, necrosis, agallas, o muerte del tejido (Santambrosio, Ortega, &
Garibaldi, 2009), obtenidas en los municipios de Armero-guayabal, Guamo y Espinal.; La
segunda, siembra por dilución seriada para las muestras cuyo árbol no presentaba los
síntomas anteriormente descritos, obtenidas de Venadillo.
En la siembra directa, se realizaron cinco repeticiones con cinco réplicas para un total de
25 trozos del tejido vegetal sembrado por muestra. Las muestras fueron incubadas en
condición de oscuridad a 26-28ºC y se evaluó el crecimiento de la colonia a las 24 horas
para evitar el crecimiento de bacterias contaminantes.
Siembra por dilución seriada con distribución superficial, a partir de los segmentos de
tejido vascular previamente sometidos al proceso de desinfección se preparó una
suspensión bacteriana macerando el tejido con 1000 µl de ADE, de esta suspensión
30
original se adicionó 100 µl a 900 µl de ADE, para llegar a una dilución de
aproximadamente 10⁵ células bacterianas por µl (Sosa-Moos, Perdomo-Rolán,
Barthwaite, & Salazar-Cruz, 1996); de esta última solución fueron tomados 100 µl y se
adicionaron en la caja de Petri con medio AN, con un pequeño rastrillo de vidrio estéril
se dispersó la solución por todo el medio de cultivo, estos se incubaron a 28ºC por 24
horas en oscuridad (French & Hebert, 1980; Sosa-Moos et al., 1996).
La caracterización morfológica de las colonias fue realizada evaluando: color, forma,
elevación y borde de la misma (Agrios, 2005). La caracterización bioquímica se
desarrolló siguiendo el esquema de clasificación simplificado (Schaad, 2001), donde fue
determinada su respuesta en: la Tinción de Gram, y los medios Yeast Extract Dextrose
Calcium (YDC), Pseudomonas Agar F (King B), prueba de Hugh & Leifson (óxido-
fermentativa –OF), MacConkey, Agar hierro triple azúcar (TSI), las pruebas de catalasa
y pudrición del tubérculo de papa.
3.6 IDENTIFICACION MOLECULAR DE HONGOS Y BACTERIAS
La extracción de DNA de los hongos fue desarrollada a partir de las colonias puras de
cada cultivo, con 8 días de crecimiento en PDA a 28ºC. El micelio se raspó
superficialmente y se maceró con nitrógeno líquido, adicionando 1.5 ml del tampón de
extracción (SDS 1% EDTA 25 mmol L-¹, Tris- HCl pH 8,0 200mmol L-¹, NaCl 250mmol
L-¹), y se transfirió a tubos eppendorf. Posteriormente esta mezcla se incubó en baño
maría a 60°C por 30 minutos, seguido de centrifugación a 10.000 rpm, por 10 minutos.
600 µl del sobrenadante. Fueron llevados a un nuevo tubo y se le adicionó un volumen
de cloroformo:alcohol isoamilico (24:1). A partir de una nueva centrifugación, se
colectaron 500 µL de sobrenadante y se transfirió en un tubo conteniendo 500 µL de
isopropanol frio. Se centrifugó nuevamente, descartando el sobrenadante y lavado dos
veces con 1.000 µL de etanol al 80%, el ADN fue suspendido en 50 µL de agua MilliQ
estéril a -20°C hasta su utilización (Glienke-Blanco, Aguilar-Vildoso, Viera, Barroso, &
Acevedo, 2002).
31
Para la extracción del ADN de bacterias, el aislamiento purificado se sembró en BHI y se
incubó a 28°C, durante 24 horas. Fueron tomadas alícuotas de 1ml y centrifugadas a
7.400 rpm por 10 minutos, se resuspendió el pellet en 50 µl de SDS 10% (p/v) y 50 µl de
tampón de lisis (SDS 0,1%, EDTA 50 mM pH 8,0, Tris-HCl pH 8,0 50 mM, NaCl 50 mM)
fue incubado a 37°C por 30 minutos, finalizados los 30 minutos se extrajo el DNA con 2
volúmenes de fenol, se invirtió el tubo suavemente por 30 segundos y se centrifugo a
1200 rpm por 10 minutos; la fase acuosa fue transferida a un tubo Eppendorf, se adicionó
un volumen igual de cloroformo, se invirtió suavemente y fue centrifugado nuevamente
a 1200 rpm por 10 minutos, se transfirió la fase acuosa a un nuevo tubo y se adicionaron
2,5 volúmenes de etanol absoluto frio, se mezcló por inversión y se centrifugó a 1200
rpm por 10 minutos, el etanol fue descartado y el Pellet de DNA se resuspendió en 50 μl
de tampón TE (10 mM Tris-HCl pH 8.0, 1 mM EDTA pH 8.0).
La integridad del DNA fue evaluada por electroforesis en gel de agarosa al 1% (TBE
0.5X) en una cámara horizontal ENDURO™ de Labnet, a 120V. Los geles fueron teñidos
con Hydra Green y observados en un transiluminador UV Spectroline.
Se realizaron las reacciones en cadena de la polimerasa (PCR). Para amplificar el ADN
fúngico se seleccionaron cebadores específicos para la región del espaciador Transcrito
Interno (ITS) ITS1-5.8S-ITS2, iniciadores universales ITS1 (5' TCC GTA GGT GAA CCT
GCG G 3') e ITS4 (5' TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC 3') (White, 1990). En el caso de
las bacterias se realizó la amplificación del gen ribosomal 16s rRNA, utilizando los
iniciadores U1 (5'-CCAGCAGCCGCGGTAATACG-3') y U2 (5'-
ATCGG(C/T)TACCTTGTTACGACTTC-3') (Lu, Perng, Lee, & Wan, 2000).
Las reacciones de PCR fueron realizadas en un volumen total de 25 µl, elaborada en un
mix (Corpogen PCR-2x) que contenía Tampón PCR 1x (20mM Tris-HCl pH 8.5, KCL
100mM), 400uM de DNTP, 3 mM de MgCl2, 0.1 unidad/µl de Taq DNA polimerasa, 10 ng
de DNA total, y una concentración final de 0,5mM y 0,2mM para los oligonucleótidos de
hongos y bacterias respectivamente, completado el volumen con agua MilliQ estéril. Las
amplificaciones se desarrollaron en un termociclador Centrifuge 5810 R (Eppendorf),
32
bajo las condiciones de 95ºC por 2 minutos; 30 ciclos de 94ºC por 30 segundos, 53ºC,
por 45 segundos, 72ºCpor 1 minuto, y una extensión final a 72ºC por 7 minutos para
hongos; y 95º C por 1 minuto; 35 ciclos de 95ºC por 1 minuto, 54ºC por 1 minuto, 72ºC
por 1,30 minutos, y una extensión final 72ºC por 10 minutos para bacterias.
Una vez obtenidos los productos de PCR de un tamaño de 500 - 600 pb para hongos y
970 - 990 pb para bacterias, fueron enviados a secuenciar a Macrogen Inc. en Corea del
Sur, usando la química del kit “BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing”, electroforesis
capilar y un secuenciador ABI3730XL.
Para el análisis filogenético las secuencias, fueron editadas con Chromas Pro versión
1.49 (http://www.technelysium.com.au/ChromasPro.html), analizadas vía alineamiento
de secuencias de tipo local, BLAST y comparadas con la base de datos GenBank, el
criterio de selección para la elección de las secuencias comparadas fue el porcentaje de
identidad que estas presentan con la secuencia obtenida. Los análisis filogenéticos
fueron realizados usando el programa MEGA versión 7 (Kumar, Stecher, & Tamura,
2016) después del alineamiento con Muscle (Edgar, 2004) la matriz generada fue
empleada para realizar el análisis filogenético basado en el método de agrupamiento de
vecinos (NJ) sobre el modelo de Kimura 2 (Kimura, 1980). El soporte interno del árbol
filogenético se llevó a cabo mediante el análisis de bootstrap con 1000 repeticiones.
3.7 PRUEBAS DE PATOGENICIDAD PARA HONGOS Y BACTERIAS
La evaluación de la patogenicidad para hongos fue soportada siguiendo los postulados
de Köch (1876). Las pruebas se realizaron bajo condiciones controladas, en el Jardín
Botánico “Alejandro Von Humboldt” de la Universidad del Tolima. Cada planta fue aislada
y cubierta con una bolsa de polietileno sostenida con un marco de alambre evitando así,
que esta tocara el polietileno (Kiraly, Klement, Solymosy, & Voros, 1970). Los
aislamientos fueron inoculados en plántulas de cuatro meses de edad, realizando cuatro
repeticiones.
33
Se utilizó el sistema de herida en el cambium vascular de la parte media del tallo, se
realizaron cortes tipo ventana, ubicándose en su interior un disco de micelio de 5 mm de
diámetro, crecido durante 7 días a 27ºC en PDA, posteriormente la herida fue cubierta
con cinta de tela transpirable (Esparadrapo). Las plantas fueron evaluadas a los 15 y 30
días después de la inoculación para observar la aparición de síntomas (Carolina,
Mauricio & Diez, 2012). Se utilizó un tratamiento control, consistente de discos de PDA.
Las pruebas de patogenicidad para bacterias, se siguieron bajo los mismos postulados
(Volcy, 2008). Las cepas bacterianas fueron encubadas en AN durante 24 horas y se
ajustó una concentración de 9,0 x 10⁸ ufc.mL-1 en la escala de McFarland para realizar
la inoculación en plantas de dos meses de edad, esta se llevó a cabo en sus hojas a
través del método de inyección, con una jeringa de insulina de 1 ml en el cual fue
incrustado un tapón de caucho para permitir la distribución homogénea del inoculo
(Botero, 2001). La valoración se efectuó a los 10 y 20 días después de la inoculación
para observar la sintomatología (Cardona, Marín, & Díez, 2012). Se utilizó un tratamiento
control (Inoculación con ADE)
Los postulados de Köch fueron completados realizando el re-aislamiento de los
microorganismos. Se evaluó para hongos 30 días después, a partir de los tejidos
sintomáticos en medio PDA a 27ºC durante siete días, y para bacterias luego de 20 días,
a partir del tejido previamente inoculado, en medio AN a 37ºC durante 24 horas (Cardona
et al., 2012).
34
4 RESULTADOS
4.1 SINTOMATOLOGÍA EN PLANTAS
Las plantaciones de Melina, evaluadas en los cuatro municipios presentaron árboles con
diferentes sintomatologías. En el Guamo, se caracterizaron por tener pudrición en la
parte basal del fuste y muerte parcial del tejido vascular. En Armero se observó
descortezamiento basal del tallo y cancros basales. En el Espinal los árboles
presentaban pudrición en los entrenudos de las ramas (Figura 2). En Venadillo se
encontró fustes con descortezamiento basal, sin embargo al realizar el corte del tejido
vascular este se halló sano (Anexo 2).
Figura 2. Sintomatología de los árboles evaluados. Guamo: árbol 1 (A), árbol 2 (B),
árbol 3 (C); Armero-guayabal: árbol 4 (D), árbol 5 (E); Espinal: árbol 6 (F), árbol 7(G).
Fuente: Autor
35
4.2 CARACTERIZACIÓN E IDENTIFICACIÓN MORFOLÓGICA DE LOS HONGOS
ASOCIADOS A Gmelina arbórea Roxb.
Las siete cepas fúngicas obtenidas a partir de los tejidos vasculares de las cuatro
plantaciones estudiadas, fueron distribuidos así: un 43% encontrados en el Guamo
(Figura 3), el 28,5% en Armero-Guayabal (Figura 4) y el 28,5% en el Espinal (Figura 5),
en Venadillo no se encontraron hongos relacionados a este tejido. Las características
macroscópicas y microscópicas de cada uno de las cepas se describen en la tabla 2.
En la evaluación de las condiciones más favorables para la esporulación, se observó que
no se pueden establecer las mismas, en todas las cepas. El medio de cultivo V8 es
idóneo para casi todas, a excepción de las cepas 1 y 4, cuya esporulación se desarrolla
mejor en AA y AAAP respectivamente. Así mismo se determinó que las temperaturas
ideales fueron de 28ºC para las cepas 1, 2, 3 y 4, y 35ºC para las cepas 5, 6, 7, y la
exposición a fotoperiodo con Luz ultravioleta cercana, incentiva la esporulación, excepto
para la cepa 2, que responde mejor en oscuridad durante 24 horas. El análisis de las
características morfológicas, culturales y taxonómicas de las cepas fúngicas permitió
identificar la cepa 3 como Curvularia geniculata, y la cepa 5 como Chaetomium
globosum, las cepas 1, 2, 4, 6, 7 se identificaron como pertenecientes al filum
Ascomycota (Anexo 1).
36
Figura 3. Características morfológicas de los hongos asociados al tejido vascular en
plantaciones ubicadas en el municipio del Guamo, se evidencia el desarrollo en el medio
PDA anverso y reverso, después de 9 días a 28ºC, (A, C, E), características
microscópicas, estructuras reproductivas y morfología de los conidios (B, D, F).
Fuente: Autor
37
Figura 4. Características morfológicas de los hongos asociados al tejido vascular en
plantaciones ubicadas en el municipio de Armero-guayabal, se evidencia el desarrollo en
el medio PDA anverso y reverso, después de 9 días a 28ºC, (A, C), características
microscópicas, estructuras reproductivas y morfología de los conidios (B, D).
Fuente: Autor
38
Figura 5. Características morfológicas de los hongos asociados al tejido vascular en
plantaciones ubicadas en el municipio del Espinal, se evidencia el desarrollo en el medio
PDA anverso y reverso, después de 9 días a 28ºC, (A, C), características microscópicas,
estructuras reproductivas (B, D).
Fuente: Autor
39
Tabla 2. Morfología de hongos asociados a G. arbórea, y condiciones ideales de esporulación por cepa.
Cepa
Morfología de la Colonia Condiciones ideales de esporulación
Características microscópicas Borde/Textura/Tipo
de esporulación
Coloración
Mussell
Medios de
Cultivo
Temp.
(°C) Luz
1
Plumoso/Algodonosa
/Uniforme con anillo
central
10YR 8/3. AA/PDA 28 *NUV 12 horas
Hifa septada marrón, no se observó picnidio, microconidias
agrupadas, ovaladas, promedio 2.23 µm de ancho y
7.88µm de largo.
2
Uniforme
entero/Algodonosa/U
niforme con anillos
en toda la colonia
7,5YR 2,5/1 V8/CLA 28 Oscuridad 24h
Hifa septada, microconidias ovoides, septadas y
agrupadas entre sí en forma de espiral, macroconidias
largas septadas y clamidosporas globosas.
3
Plumoso/Algodonosa
/Uniforme con anillos
en toda la colonia
10YR 8/2 AEM/V8 28
Oscuridad
24h/ *NUV 12
horas
Hifa septada marrón, conidióforo corto, los conidios de
promedio 8.71 µm de ancho por 18,20 µm de largo, curvos
en forma de bumerán con septas tritabicadas con célula
central es globosa.
4
Entero/Algodonosa/U
niforme con anillos
en toda la colonia
10YR 8/2 AAAP 28 *NUV 12 horas Hifa septada marrón, no se observó conidióforo, conidios
septados de color marrón.
5 Entero/Afelpada/Unif
orme 10YR 8/3. V8 35 *NUV 12 horas
Hifa septada, peritecios grandes agrupados de dos a tres,
marrón oscuros, globoso y con pelos peridiales, tienen
ostiolos conteniendo ascosporas unicelulares, marrón en
forma de limón.
40
Cepa
Morfología de la Colonia Condiciones ideales de esporulación
Características microscópicas Borde/Textura/Tipo
de esporulación
Coloración
Mussell
Medios de
Cultivo
Temp.
(°C) Luz
6
Plumoso/Afelpada/U
niforme con anillos
en toda la colonia
10YR 8/1 PDA/V8 35 *NUV 12 horas Hifa septada, picnidio oscuro sumergido en el medio,
conidios hialinos unicelulares ovoides.
7
Plumoso/Afelpada/U
niforme con anillos
en toda la colonia
10YR 8/1 PDA/V8 35 *NUV 12 horas Hifa septada, picnidio de color piel sumergido en el medio,
conidios hialinos unicelulares ovoides.
*NUV: Luz Ultravioleta Cercana
Fuente: Autor
41
4.3 CARACTERIZACIÓN E IDENTIFICACIÓN DE LAS BACTERIAS ASOCIADAS A
G. arbórea Roxb., EN EL DEPARTAMENTO DEL TOLIMA.
De los árboles sintomáticos estudiados en los cuatro municipios del departamento del
Tolima, se seleccionaron 3 cepas de bacterias, siendo las cepas 1 y 2 obtenidas del
municipio del Guamo y la cepa 3 del municipio Armero-guayabal. A cada cepa se le
realizó la caracterización bioquímica (Tabla 3). Las tres presentaron forma de bastón,
siendo la cepa 1, una bacteria gram positiva, oxidativa, fermentadora de lactosa (Anexo
3). Las cepas 2 y 3, fueron bastones gram negativas, con características distintivas entre
sí. La cepa 2, es fluorescente, oxidativa, catalasa positivo (Anexo 4); la cepa 3 es
fermentadora de lactosa y glucosa, y sintetiza enzimas pectolíticas (Anexo 5).
El análisis de las características morfológicas, culturales y bioquímicas de las cepas
obtenidas permitió identificar los géneros de las bacterias como, cepa 1: Bacillus sp.,
cepa 2: Pseudomonas Fluorescente y cepa 3: bacteria perteneciente a la familia
Enterobacteraceae.
4.4 IDENTIFICACIÓN MOLECULAR DE HONGOS Y BACTERIAS
La amplificación de la región ITS para hongos y 16S para bacterias mediante la técnica
de PCR, permitió obtener fragmentos de aproximadamente 500-600 pb y 970 -990 pb
respectivamente. Las secuencias generadas para el análisis filogenético, llevó a la
identificación del 85% de las cepas fúngicas, cinco a nivel de especie, una a nivel de
género y una sola cepa hasta nivel de clase. Las cepas bacterianas fueron identificadas
dos a nivel de especie y una a nivel de género.
42
Tabla 3. Caracterización bioquímica de las cepas bacterianas obtenidas de plantaciones
de G. arborea, en el departamento del Tolima
Pruebas Bacillus sp Pseudomonas
Fluorescente
Enterobacteraceae
1 MacConkey Lac (+) Lac (-) Lac (+)
2 King B No
Fluorescente
Fluorescente No Fluorescente
3 Test de Gram Positiva Negativa Negativa
4 KOH al 3% Negativa Positiva Positiva
5 Forma Circular Circular Puntiforme
6 Hugh y Leifson Oxida Oxida Fermenta
7 Prueba de la Papa Negativa Negativa Positiva
8 TSI K/A K/K A/A
9 SIM (Movilidad) Positiva Negativa Negativa
10 Indol Negativa Negativa Negativa
11 Catalasa Negativa Positiva Positiva
12 YDC Colonias
Crema
Colonias Crema Colonias Crema
13 Hidrólisis del
almidón
NA NA Negativa
Fuente: Autor
El árbol filogenético para hongos se construyó con 7 secuencias obtenidas en el presente
trabajo; 10 secuencias depositadas en el GenBank, seleccionadas por presentar altos
niveles de identidad (Tabla 4) con las aquí obtenidas y la levadura Saccharomyces
cerevisiae como grupo externo; se obtuvieron VII clados (Figura 6) identificados como:
Clado I, cepa 6, 75% de similaridad con Phomopsis columnaris; Clado II, cepa 7, 100%
de similaridad con Diaporthe sp; Clado III, cepa 5, 100% de similaridad con Chaetomium
globosum; Clado IV, cepa 1, 77% de similaridad con Lasiodiplodia theobromae; Clado V,
cepa 4, 80% de similaridad con Dothideomycetes; Clado VI, cepa 3, 100% de similaridad
43
con Curvularia geniculata, Clado VII, cepa 2, 100% de similaridad con Coniothyrium
aleuritis.
Para bacterias se construyó con 3 secuencias obtenidas en el presente trabajo; 8
secuencias de bacterias depositadas en el GenBank, seleccionadas por presentar altos
niveles de identidad (Tabla 5) con las aquí obtenidas y la bacteria Acidobacteria
bacterium como grupo externo; se obtuvieron III clados (Figura 7) identificados como:
Clado I, cepa 3, 95% de similaridad con Pantoea dispersa; Clado II, cepa 2, 97% de
similaridad con Pseudomonas alcaligenes; Clado III, cepa 1, 98% de similaridad con
Bacillus cereus.
44
Figura 6. Análisis filogenético de hongos basado en el método de agrupamiento de vecinos (NJ); test de filogenia
Bootstrap 1000 repeticiones, modelo Kimura 2 + Gama distribución.
Fuente: Autor
FI Gmelina 6
KU204666.1 Phomopsis columnaris
KM362372.1 Phomopsis sp
FI Gmelina 7
KP307001.1 Diaporthe sp
FI Gmelina 5
KT385731.1 Chaetomium globosum
JF923841.1 Lasiodiplodia crassispora
FI Gmelina 1
KM357551.1 Lasiodiplodia theobromae
FI Gmelina 4
KC771518.1 Dothideomycetes sp
KT876505.1 Paraconiothyrium fuckelii
FI Gmelina 3
KU715131.1 Curvularia geniculata
FI Gmelina 2
KJ921603.1 Coniothyrium aleuritis
AB714982.1 Saccharomyces cerevisiae
45
Tabla 4. Secuencias de las regiones ITS-ADNr de las cepas fúngicas comparados con
las secuencias almacenadas en el Gen-Bank
Secuencia
obtenida
Accesión Puntuación
máxima
Identificación
máxima
Identidad Espacios
FI 1 KM357551.1
Lasiodiplodia
theobromae
1081 94% 92% 0.0
JF923841.1
Lasiodiplodia
crassispora
1048 94% 91% 0.0
FI 2 KJ921603.1
Coniothyrium
aleuritis
985 100% 98% 0.0
FI 3 KU715131.1
Curvularia
geniculata
929 99% 99% 0.0
FI 4 KC771518.1
Dothideomycetes sp
985 97% 99% 0.0
KJ876505.1
Paraconiothyrium
fuckelii
898 98% 95% 0.0
FI 5 KT385731.1
Chaetomium
globosum
933 100% 99% 0.0
FI 6 KU204666.1
Phomopsis
columnaris
913 96% 99% 0.0
KM362372.1
Phomopsis sp
928 99% 99% 0.0
FI 7 KP307001.1
Diaporthe sp.
939 99% 100% 0.0
Fuente: Autor
46
Figura 7. Análisis filogenético de bacterias basado en el método de agrupamiento de vecinos (NJ), test de filogenia
Bootstrap 1000 repeticiones, modelo Kimura 2.
Fuente: Autor
BI Gmelina 3
NR_116755.1 Pantoea dispersa
NR_118394.1 Pantoea cypripedii
NR_104569.1 Erwinia psidii
NR_026078.1 Pseudomonas aeruginosa
BI Gmelina 2
NR_114472.1 Pseudomonas alcaligenes
KC121330.1 Acidobacteria bacterium
KM014749.1 Bacillus sp.
JF461094.1 Bacillus thuringiensis
BI Gmelina 1
KJ626301.1 Bacillus cereus
47
Tabla 5. Secuencias de las regiones 16S-ADNr de las cepas bacterianas, comparados
con las secuencias almacenadas en el Gen-Bank.
Secuencia
obtenida
Accesión Puntuación
máxima
Identificación
máxima
Identidad Espacios
BI 1 KJ626301.1
Bacillus
cereus
1133 99% 89% 0.0
KM014749.1
Bacillus sp.
1009 96% 87% 0.0
JF461094.1
Bacillus
thuringiensis
961 91% 87% 0.0
BI 2 NR_114472.1
Pseudomonas
alcaligenes
1456 100% 99% 0.0
NR_026078.1
Pseudomonas
aeruginosa
1397 100% 98% 0.0
BI 3 NR_116755.1
Pantoea
dispersa
1589 100% 99% 0.0
NR_118394.1
Pantoea
cypripedii
1526 100% 98% 0.0
NR_104569.1
Erwinia psidii
1506 100% 98% 0.0
Fuente: Autor
4.5 PRUEBAS DE PATOGENICIDAD DE HONGOS Y BACTERIAS EN PLANTAS DE
Gmelina arbórea Roxb.
Los postulados de Koch evaluados en plantas de G. arborea, inoculadas con las siete
cepas fúngicas provenientes del tejido vascular de fustes enfermos después de 30 días
48
de inoculación, permitieron observar que solo dos de los hongos, L. theobromae y C.
geniculata, causaron pudrición en los fustes jóvenes de esta especie. Las plantas
inoculadas con los demás hongos y el control permanecieron saludables (Tabla 6).
Tabla 6. Resultados pruebas de patogenicidad de diez microorganismos inoculados en
Plántulas de G. arborea.
Microorganismo Órgano
inoculado
Cantidad del Inóculo Repetición Incidencia
promedio
(%)
Medio PDA Tallo Disco de micelio 5mm (0ᵃ/4ᵇ) 0
Lasiodiplodia
theobromae
Tallo Disco de micelio 5mm (3/4) 75
Coniothyrium aleuritis Tallo Disco de micelio 5mm (0/4) 0
Curvularia geniculata Tallo Disco de micelio 5mm (2/4) 50
Dothideomycetes sp Tallo Disco de micelio 5mm (0/4) 0
Chaetomium globosum Tallo Disco de micelio 5mm (0/4) 0
Phomopsis columnaris Tallo Disco de micelio 5mm (0/4) 0
Dhiporthe sp Tallo Disco de micelio 5mm (0/4) 0
Agua Destilada Estéril Hojas 9,0 x 10⁸ ufc.mL-1 (0/4) 0
Bacilus cereus Hojas 9,0 x 10⁸ ufc.mL-1 (0/4) 0
Pseudomonas
alcaligenes
Hojas 9,0 x 10⁸ ufc.mL-1 (0/4) 0
Pantoea dispersa Hojas 9,0 x 10⁸ ufc.mL-1 (0/4) 0
Fuente: Autor
ᵃ Número de plantas con síntomas
ᵇ Número de plantas inoculadas
Los hongos L. theobromae y C. geniculata, causan patogenicidad en plántulas de cuatro
meses de edad, con una incidencia del 75% y 50% respectivamente, se evidencio
crecimiento micelial y pudrición en el tejido vascular de los tallos inoculados con estos
dos microorganismos. Se evaluó la presencia de síntomas en plántulas inoculadas con
49
las demás cepas fúngias y el tejido se encontró sano; por lo tanto se afirma que los
hongos C. aleuritis, Dothideomycetes sp, C. globosum, P. columnaris y Diaporthe sp no
causan patogenicidad en tallos de plántulas de cuatro meses edad de G. arborea.
Los postulados de Köch se confirmaron al realizar el re-aislamiento de los tejidos que
presentaban crecimiento micelial y pudrición, en medio PDA durante 7 días a 27ºC y en
oscuridad. Se logró obtener colonias y cuerpos reproductores típicos de L. theobromae
y C. geniculata (Figura 8 y 9).
Plántulas de dos meses de edad, inoculadas en sus hojas con las bacterias B. cereus,
P. alcaligenes, y P. dispersa, posterior a los 20 días de inoculación, no evidenciaron
lesiones en ninguno de los individuos infectados. La ausencia de crecimiento bacteriano
después de 24 horas en el re-aislamiento de tejidos en medio AN, permitió confirmar que
estas bacterias no causan patogenicidad en plántulas de Melina.
Figura 8. Pruebas de patogenicidad para L. theobromae, en G. arborea; se evidencia
pudrición del tejido vascular (A), colonias resultantes de la siembra del tejido (B), hongo
en medio PDA/7 días/27ºC (C), hifas septadas, microconidias agrupadas (D).
Fuente: Autor
50
Figura 9. Pruebas de patogenicidad para C. geniculata, en G. arbórea; se evidencia
pudrición del tejido vascular (A), colonias resultantes de la siembra del tejido (B), hongo
en medio PDA/7 días/27ºC (C), Conidióforo corto, con conidios septados en forma de
bumerang (D).
Fuente: Autor
51
5 DISCUSIÓN
La presente investigación permitió describir siete especies de hongos asociados al tejido
vascular en plantaciones de G. arborea en el departamento del Tolima. Las especies
identificadas fueron: Lasiodiplodia theobromae, Coniothyrium. aleuritis, y Curvularia
geniculata; Chaetomium globosum, Phomopsis columnaris, Diaporthe sp., y
Dothideomycetes de las cuales solo L. theobromae y C. geniculata, mostraron
patogenicidad en plántulas de cuatro meses de edad al realizar los postulados de Köch.
De las cepas aisladas los géneros Lasiodiplodia y Phomopsis, han sido reportados
previamente como fitopatógenos en G. arborea. Las especies Lasiodiplodia
pseudotheobromae, y Phomopsis gmelinae, se han encontrado como causantes de
enfermedades en el fuste, causando sintomatología de pudrición y muerte de este. Otras
especies como Phomopsis sp y Phomopsis micheliae se registran como causantes de
enfermedades en plántulas y en hojas de árboles establecidos (Alves, A., Crous, P.W.,
Correia, A., Phillips, 2008; Arguedas, 2004).
Aunque Lasiodiplodia theobromae no se ha reportado como hongo patógeno del tejido
vascular de Melina, si se caracteriza por ocasionar grandes pérdidas en la producción de
madera tanto en plantaciones de Acacia mangium en el Brasil (Halfeld-Vieira, Mourão,
Tonini, & Nechet, 2006) como de Eucalipto sp. en Uganda (Roux, Coutinho, Mujuni, &
Wingfield, 2001). Lasiodiplodia theobromae es causante de la mancha azul en maderas
de Pinos oocarpa y azadirachta en Venezuela (Mohali, Encinas, & Mora, 2002), pudrición
de fuste del melocotón en China (Gao et al., 2016), pudrición en ramas y tallo de la yuca
en Brasil (Lopes, Campos, Santos, Freitas, & Alano, 2008), pudrición del pedúnculo y
muerte descendente del mango (Sandoval-sánchez et al., 2013), marchitamiento foliar
de Bauhinia purpurea, en la India (Sreerama Kumar, Singh, & Kumar Sreerama, 2009),
y pudrición de tallo y raíz de Citrus sinensis en Estados Unidos (Zhao, Bai, McCollum, &
Baldwin, 2015). Por lo tanto el efecto de L. theobromae como patógeno de plantas
jóvenes de G. arborea reportado en la presente investigación, puede ser el primer
52
registro de esta especie, al confirmarse a través de los postulados de Köch una incidencia
del 75%.
Otro de los hongos que mostraron patogenicidad en plántulas de esta especie fue C.
geniculata con una incidencia del 50%; y aunque no se ha registrado como causante de
enfermedades en el fuste de Melina, si genera pudrición basal del estípite en Palmas de
aceite (Mestizo et al., 2012) y patógeno de semillas de G. arborea, Tectona grandis y
Acacia mangium (Álvarez, Paternina-Paternina, Espitia-Camacho, Campo-Arana, &
Urango, 2012), también produce enfermedades en algunas especies agrícolas como el
trigo, el arroz, palma africana, ñame, maíz y sorgo (Estrada & Sandoval, 2004; Kimati,
Amorim, Bergamin, Camargo, & Rezende, 1997). Otras especies de Curvularia como C.
lunata provoca lesiones necroticas en las hojas de Tabebuia rosae, Tabebuia chrysantha,
Ceiba sp., Tectona grandis y Cupresus lindleyi en México (Cibrián, García, & Macias,
2008), y C. eragrostides causa pudrición en las semillas de Digitaria sanguinalis en China
(Wang, Wang, Yuan, & Qiang, 2013).
Otro de los hongos que mostraron patogenicidad en plántulas de esta especie fue C.
geniculata con una incidencia del 50%; y aunque no ha registrado como causante de
enfermedades en el fuste de Melina, si genera pudrición basal del estípite en Palmas de
aceite (Mestizo et al., 2012) y ha sido reportado como patógeno de semillas de G.
arborea, Tectona grandis y Acacia mangium (Álvarez et al., 2012). El hongo C. geniculata
también produce enfermedades en algunas especies agrícolas como el trigo, el arroz,
palma africana, ñame, maíz y sorgo (Estrada & Sandoval, 2004; Kimati et al., 1997).
Otras especies de Curvularia como C. lunata provoca lesiones necroticas en las hojas
de Tabebuia rosae, Tabebuia chrysantha, Ceiba sp., Tectona grandis y Cupresus lindleyi
en México (Cibrián et al., 2008), mientras que C. eragrostides causa pudrición en las
semillas de Digitaria sanguinalis en China (Wang et al., 2013).
El género Phomopsis sp, ha sido registrado como patógeno de plántulas de Melina
(Arguedas, 2004), este hongo afecta los brotes de árboles jóvenes de Acacia acuminata
y Tectona grandis en Costa Rica (Macías, Arquedas, Hilje, & Cola, 2005), y genera
53
cancros en el fuste de Cedrela odorata en México (Cibrián et al., 2008). Dentro del género
Phomopsis, P. gmelinae se encuentra como causante del cancro basal en los fustes de
Melina (Sankaran, Maria Florence, & Sharma, 1987). La especie P. columnaris no ha
sido registrada como causante de pudrición en fustes jóvenes de G. arborea, al no
encontrase reportes en las referencias consultadas; se confirma la información ya que
en el presente estudio no se evidencio un efecto sobre el tallo de plántulas.
Para el caso de C. aleuritis, C. globosum, Diaporthe sp., y el hongo de la familia
Dothideomycetes se verificó que no causan enfermedades en el fuste de plantas jóvenes
de Melina, sin embargo algunos de estos géneros son patógenos de árboles forestales,
como es el caso de Coniothyrium zuluense., hongo agresivo de algunas especies de
Eucalyptus, que produce un cancro en el fuste y causa ruptura de la corteza, ocasionando
la muerte del árbol (Balmelli, Marroni, Altier, & Garcia, 2004; Gezahgne, Cortinas,
Wingfield, & Roux, 2005; Marraro Acuña & Garran, 2004; Pérez-Vera, Yánez-Morales,
Alvarado-Rosales, Cibrian-Tovar, & García-Diaz, 2005; Wingfield, Crous, & Coutinho,
1997). Chaetomium globosum., ha sido reportado como hongo asociado a la pudrición
de raíz y estípite en la palma de aceite (Chavarriaga, 2011), también se encuentra
asociado a lesiones foliares de Eucalyptus grandis en plantaciones ubicadas en México
(Pérez-Vera et al., 2005). Diaporthe sp., está reportado como causante del cancro en
fustes de Eucalyptus en Brasil (Hodges, Reis, & Henfling, 1976) y en el tallo de plantas
de arándano en México (Elfar et al., 2013). Algunas especies de la clase
Dothideomycetes son patógenos de plantas, como es el caso de Mycosphaerella sp que
ataca especies de árboles económicamente importantes como Quercus spp (Schoch et
al., 2009; Moreno et al., 2010).
Algunas especies de los géneros mencionados anteriormente se caracterizan por ser
controladores biológicos de importantes hongos fitopatógenos; por ejemplo Coniothyrium
minitans es reportado como controlador de Sclerotinia sclerotiorum hongo que genera
pudrición en el tallo en plantas de Brassica napus (L. Yang, Li, Zhang, Jiang, & Chen,
2011; Zeng, Wang, Kirk, & Hao, 2012). C. globosum de Phytophthora nicotianae,
Phytophthora infestans, Magnaporthe grisea y Puccinia recóndita, hongos causantes de
54
pudrición en raíz y tallo de algunas especies vegetales (Hung, Wattanachai, Kasem, &
Poeaim, 2015; Park et al., 2005; Shanthiyaa et al., 2013; H. J. Yang, Cha, Kim, & Choi,
2016).
No se encontraron reportes sobre investigaciones que evalúen la patogenicidad o el
efecto antagonista de C. aleuritis, C. globosum y Diaporthe sp en G. arborea; y aunque
se encuentran asociados a la pudrición del tejido vascular de fustes de Melina, la
presente investigación, permitió exponer que no son causantes de enfermedades en
plantas de cuatro meses de edad bajo condiciones controladas, ya que en las pruebas
de patogenicidad, las plantas inoculadas con estos microorganismos no evidenciaron
síntomas de enfermedad.
Así mismo el presente trabajo muestra que el deterioro en los fustes de Melina en las
plantaciones evaluadas en el departamento del Tolima, se asoció a hongos y no a
bacterias, ya que B. cereus, P.alcaligenes y P.dispersa, no mostraron patogenicidad en
plántulas de G. arborea, además de no haber sido registradas como causantes de
enfermedades en Melina en las referencias consultadas. Algunas investigaciones
reportan que las bacterias identificadas en este estudio, encontradas en el tejido vascular
de Melina, son controladoras biológicas de hongos, es el caso de B. cereus que se
considera controladora (Heydrich-Pérez, Rojas, & Tejera-Hernandéz, 2011), de
Phytophthora megasperma, hongo que causa pudrición de la raíz en cultivos de alfalfa
(Handelsman, Raffel, Mester, Wunderlich, & Grau, 1990); Macrophomina phaseolina,
Sclerotina minor, Fusarium oxysporum, Fusarium solani, Phythium ultimum, hongos
patógenos aislados del cultivo de soya (León et al., 2009); además de ser registrada
como promotora de crecimiento de plantas de tabaco en la India (Dutta, Rani, & Podile,
2013). Otras especies de este mismo género como B. subtilis y B. amyloliquefacens, son
consideradas controladoras biológicas de Rizoctonia solani hongo que generalmente
afecta los cultivos de papa en diferentes regiones del mundo (Chowdhury et al., 2013;
Zavaleta-Mejía, 1999) .
55
La bacteria Pseudomonas alcaligenes, también se registra como controlador biológico
de hongos y producción de fitohormonas en plantas de arroz (Rives, Acebo, &
Hernández, 2007), siendo utilizada en un consorcio bacteriano que genera un efecto
antagonista sobre Rhizoctonia solani en cultivos de esta misma especie en Venezuela
(Amaíz, Vargas, Medina, Izzeddin, & Valbuena, 2015); otras especies de Pseudomonas
además de producir un efecto antagonista sobre diferentes hongos, se ha confirmado
que estimulan el crecimiento de algunas plantas: P. pseudoalcaligenes estimula el
crecimiento en plantas de arroz y ayuda a eliminar la infección causada por hongos
patógenos mediante la producción de b-1, 3-glucanasas y quitinasas (Jha &
Subramanian, 2014). Sin embargo algunas especies de Pseudomonas se consideran
patógenas de plantas, por ejemplo Pseudomonas cichorii genera canceres y muerte del
tejido en ramas de Prosopis grandulosa en la ciudad de Saltillo, México (Valdez, 2014),
y Pseudomonas sp, es patogena de plantas jóvenes de Tectona grandis (Chavarriaga,
2011).
Pantoea dispersa se reporta como controladora biológica de Xanthomonas albilideans
(Zhang & Birch, 1997), y promotora del crecimiento de plántulas de trigo en invernadero
(Selvakumar et al., 2008); algunas especies del género Pantoea son registradas como
controladoras biológicas de microorganismos, P. ananitis., y P. agglomarans reducen la
incidencia de la enfermedad (fuego bacteriano) generada por Erwinia amylovora, gracias
a la producción de antibióticos (Walterson, Smith, & Stavrinides, 2014; Wright, Zumoff,
Schneider, & Beer, 2001). Otras especies de Pantoea son patógenas de plantas: P.
rodasii sp. nov., P. rwandensis sp. nov., P. wallisii sp. nov., estan asociadas al síntoma
de tizón bacteriano y muerte regresiva de Eucalyptus, en Colombia, Ruanda y Sudáfrica
(Brady et al., 2012), y P. stewartii es causante de la marchitez de plántulas de maíz dulce
en Estados unidos (Wensing, Zimmermann, & Geider, 2010).
56
6 CONCLUSIONES
El análisis de muestras de tejido vascular con síntomas de enfermedades en fustes
provenientes de cuatro plantaciones de G. arborea en el departamento del Tolima,
permitió concluir que los hongos asociados a estas plantaciones son: Lasiodiplodia
theobromae, Coniothyrium aleuritis, Curvularia geniculata, Chaetomium globosum,
Phomopsis columnaris, Diaporthe sp., y Dothideomycetes; de los cuales solo L.
theobromae y C. geniculata, mostraron patogenicidad en plántulas de cuatro meses de
edad al realizar los postulados de Köch.
Las bacterias asociadas a G.arborea fueron: Bacillus cereus, Pseudomonas alcaligenes
y Pantoea dispersa, las cuales no causaron patogenicidad en plántulas de Melina de dos
meses de edad.
L. theobromae y C. geniculata, se reportan como nuevas especies patógenas, causantes
de pudrición de fustes jóvenes de G. arborea, para las zonas evaluadas.
Las investigaciones fitopatológicas son importantes en el sector forestal, porque se
carece de información actualizada sobre los principales microorganismos causantes de
enfermedades en especies forestales en Colombia, y la innovación en pro de aumentar
la productividad forestal, requiere acompañarse de ciencias como la fitopatología para
prevenir riesgos de pérdidas ecológicas y económicas significativas en este sector.
57
RECOMENDACIONES
Los microorganismos identificados en esta investigación, deben ser sometidos a pruebas
de patogenicidad en arboles de la misma edad y condiciones ambientales similares
(temperatura, humedad relativa, suelo y precipitación); si es posible en plantaciones de
G. arborea con fines experimentales.
Se recomienda realizar investigaciones que verifiquen si los hongos C. aleuritis, C.
globosum y Diaporthe sp; y las bacterias Bacillus cereus, Pseudomonas alcaligenes y
Pantoea dispersa, provocan un efecto antagonista sobre los otros hongos aislados, o
entre sí, pues algunos trabajos de investigación los reportan como controladores
biológicos de importantes hongos fitopatógenos.
Se propone realizar más trabajos de investigación en el área, para evitar el riesgo de
pérdidas en la productividad forestal.
58
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68
ANEXOS
69
Anexo A. Descripción de síntomas de enfermedades por plantación de G. arborea.
Plantaciones Ubicación Árbol Sintomatología
Guamo 4º11’30,6” –
74º57’49,5”
1 Necrosis, pudrición en la parte basal del fuste y
muerte parcial del tejido vascular
2 Necrosis, pudrición en la parte basal del fuste y
muerte parcial del tejido vascular
3 Necrosis, pudrición en la parte basal del fuste y
muerte parcial del tejido vascular
Armero 5º00’12,6” –
74º54’34,2”
1 Escarificación de la corteza, Cancros pequeños en la
corteza
2 Cancro basal del fuste
3 Escarificación de la corteza
Espinal 4º00’06,7” –
75º03’04,7”
1 Pudrición en los entrenudos de las ramas
2 Pudrición en los entrenudos de las ramas
3 Pudrición en los entrenudos de las ramas
Venadillo 4º46’27,8” –
74º57’11,4”
1 Descortezamiento basal
2 Descortezamiento basal
3 Descortezamiento basal
Fuente: Autor, (2016).
70
Anexo B. Árboles de G. arborea en el municipio de Venadillo con descortezamiento
basal.
Fuente: Autor, (2016).
71
Anexo C. Consolidado de los resultados de las pruebas bioquímicas para Bacillus cereus. Bastones gram positivos (A);
Crecimiento en YDC (B); Metabolismo oxidativo en OF (C); Catalasa negativa (D); Crecimiento en King B (E); No
crecimiento en MacConkey (F); Reacción (A/K) en TSI (G).
Fuente: Autor, (2016).
72
Anexo D. Consolidado de los resultados de las pruebas bioquímicas para Pseudomonas alcaligenes. Bastones gram
negativos (A); crecimiento en YDC (B); metabolismo oxidativo en OF (C); catalasa positiva (D); crecimiento fluorescente
en King B (E); no crecimiento en MacConkey (F); reacción (K/K) en TSI (G).
Fuente: Autor, (2016).
73
Anexo E. Consolidado de los resultados de las pruebas bioquímicas para Pantoea dispersa. Bastones gram negativos (A);
crecimiento en YDC (B); metabolismo fermentativo en OF (C); catalasa positiva (D); crecimiento en King B (E); crecimiento
en MacConkey (F); Reacción (A/A) en TSI (G); Hidrólisis de almidón negativa (H).
Fuente: Autor
74
75
76