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HUELLAS MOLECULARES DE LA EVOLUCIÓN CELULAR, LA TEORÍA ENDOSIMBIÓTICA

Carlos de Paz Villasenín y Luís José Míguez Rodríguez1

RESUMEN: Se presenta una actividad destinada al alumnado de la asignatura Biología de 2º de Bachillerato. Se pretende introducir los procedimientos básicos de la investigación biológica a través de herramientas bioinformáticas, utilizando como escenario la demostración de la teoría endosimbiótica mediante secuencias disponibles en bases de datos moleculares reales. PALABRAS CLAVE: Biología, 2º Bachillerato, Bioinformática, Biology Workbench, SIB, Teoría Endosimbiótica. SUMMARY: A biology high education oriented activity is presented. Using real available molecular database evidences of endosymbiotic theory, it try to introduce several basic aspects in the field of biology research thorught bioinformatics tools. KEY WORDS: Biology, high education, bioinformatics, Biology workbench, SIB, Endosymbiotic theory. 1. INTRODUCCIÓN Con la presente actividad se pretende poner en manos de los docentes nuevos métodos para mostrar los mecanismos evolutivos que apoyan la teoría endosimbiótica, como modelo de evolución celular. En el currículo de secundaria el estudio del origen de las células aparece con dimensión y profundidad en cuarto curso de ESO, y se retoma con mayor profundidad en la materia de Biología de segundo de Bachillerato. Manteniéndose en el currículo de las enseñanzas mínimas de dicha asignatura de la nueva Ley de Educación (LOE), tal y como se recoge tanto en los Contenidos como en los Criterios de Evaluación en el R.D 1467/2007, de 2 de noviembre (BOE, 06.11.2007), en concreto en la primera unidad (La base molecular, y fisicoquímica de la vida), dentro de la “La célula: unidad de estructura y función. La teoría celular”.

1 IES “A Sardiñeira”. Avda. A Sariñeira, s/n, 15007-A Coruña (Galicia, Spain)

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Hay que añadir que este tipo de actividades son necesarias para conseguir uno de los objetivos de la Biología (“Utilizar información procedente de distintas fuentes incluidas las tecnologías de la información y comunicación, para formarse una opinión crítica…”), y que constituyen para la enseñanza y el aprendizaje por investigación una excelente herramienta (Pozuelos & Travé, 2007). Con este trabajo ofrece la posibilidad de experimentar con nuevas aportaciones obtenidas en diferentes campos, mediante la utilización de las nuevas tecnologías, aproximando a los alumnos a la metodología científica y a los nuevos descubrimientos, y de utilizar una actividad práctica, cuya necesidad didáctica está ampliamente constatada (Cano & Cañal, 2006), ya que ofrece la posibilidad de contrastar hipótesis, desarrollar habilidades y poner en juego destrezas e integrar a los alumnos en las nuevas tecnologías (Caamaño, 2007), todo ello con el propósito de acercarlos a los temas científicos actuales, y los personajes que los protagonizan, en este caso Lynn Margulis, como parte de la cultura actual. El trabajo que se propone elude la utilización del formato cerrado, que impide a los alumnos identificar con claridad cuál es el problema que están abordando (Caamaño & Corominas, 2004). 2. ANTECEDENTES Y ENTORNO DE TRABAJO La Teoría Endosimbiótica de la Evolución presentada por Lynn Margulis en 1970 propone que las mitocondrias y los cloroplastos de células eucariotas eran originalmente procariotas que fueron “engullidos” por otros procariotas. Es esta línea, ciertos procariotas adquirieron la habilidad de utilizar el oxígeno acumulado en la atmósfera en procesos más eficientes de oxidación de compuestos orgánicos, proporcionando cantidades de energía sin precedente. Esto proporcionaría una gran ventaja a un organismo hospedador que, en lugar de digerirlo, estableciese con él una relación de simbiosis en la que uno proporciona nutrientes y protección, mientras el otro produce energía suficiente para ambos. Aunque hoy en día está generalmente aceptada, fue duramente criticada cuando Margulis la propuso. Muchos científicos sólo aceptaron sus postulados cuando años después, en 1981, Lynn obtuvo evidencias moleculares que apoyaban su teoría a través del uso de herramientas bioinformáticas. Actualmente los libros de texto no reflejan en modo alguno esta vía de aceptación. La teoría se apoya, a nivel didáctico, en aspectos de tipo celular como el tamaño relativo de células eucariotas y orgánulos en relación a procariotas actuales, presencia de doble membrana, características

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ribosomales, naturaleza del ADN de cloroplastos y mitocondrias a nivel macromolecular, etc). Se decidió así adaptar la propuesta de RADOMIR y otros (ver direcciones de Internet al final) para justificar la teoría endosimbiótica a nivel molecular en el marco de una actividad con marcado carácter constructivista en la que el alumnado además se familiarice con la investigación bioinformática. En un breve espacio de tiempo, las herramientas bioinformáticas han crecido de forma espectacular en velocidad, fiabilidad y disponibilidad, hasta el punto de estar a disposición de cualquiera que disponga de un terminal conectado a Internet. En esta actividad se siguen los pasos necesarios para obtener evidencias que apoyan la Teoría Endosimbiótica, usando el “Biology Student Workbench” (SIB) de la Universidad de Illinois. Se ha tratado de minimizar las desviaciones de atención, debidas al uso de entornos en inglés, a través de una colaboración con los responsables del SIB que resultó en la traducción del entorno para transformarlo en el “Entorno Educativo del ‘Biology Workbench’ (SIB) que facilita en gran medida el acceso a las herramientas más habituales en bioinformática por parte del alumnado de bachillerato de habla hispana. El SIB es una colección de herramientas bioinformáticas que, entre otras cosas, permite a los usuarios:

• La búsqueda de secuencias moleculares en diferentes bases de datos moleculares.

• El análisis de esas secuencias, incluyendo el alineamiento múltiple y la comparación cuantitativa.

3. FUNDAMENTO

Para generar datos que soporten la Teoría Endosimbiótica, se han buscado secuencias con alto grado de similitud (homología) con genes mitocondriales y cloroplásticos de dos organismos eucariotas simples. El problema radica en que las secuencias de genes eucariotas y procariotas a comparar han evolucionado de forma independiente durante 2 billones de años. Una solución a este problema consiste en escoger la secuencia de un gen que sea absolutamente indispensable para la supervivencia de la célula. Así, la probabilidad de que haya sido altamente conservado es muy alta, ya que cualquier cambio importante en relación a su función, habría sido letal para la célula.

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Se han usado por lo tanto secuencias mitocondriales y cloroplásticas de eucariotas simples y las correspondientes de diferentes procariotas para construir árboles filogenéticos. Si cuanto antes divergen dos organismos a partir de un antecesor común, más diferentes serán sus secuencias entre sí, la construcción de árboles filogenéticos debe permitir determinar que las secuencias mitocondriales y cloroplásticas son más próximas a ciertos tipos de procariotas. 4. DESARROLLO Se estructuró el estudio para facilitar el entendimiento de la secuencia de pasos y de la finalidad de cada uno de ellos: 4.1. APERTURA DE CUENTAS DE USUARIO Y CREACIÓN DE UNA SESIÓN DE TRABAJO Los primeros 10 minutos de la práctica se utilizan para presentar el entorno a los alumnos e indicarles la necesidad de que se registren. El paso siguiente es abrir una sesión de trabajo. Este es el sistema que el SIB utiliza para organizar las acciones en función del estudio en curso. 4.2. BÚSQUEDA DE SECUENCIAS EN BASES DE DATOS El inicio del estudio pasa por realizar la búsqueda de una secuencia determinada en bases de datos moleculares (herramienta ‘Njinn’). Las enzimas que intervienen en la respiración celular, muchos de los cuales son mitocondriales, han sido altamente conservados y son óptimos para este fin. Se seleccionó la secuencia del gen de la enzima succinato deshidrogenasa (succinato-deH) de Reclinomonas americana. R. americana es un eucariota muy simple que se supone que no ha cambiado mucho desde su forma original. La enzima succinato-deH participa en el ciclo de Krebs y es crucial para la supervivencia celular. Podemos especular que el gen codificador de la misma ha cambiado de forma mínima durante los billones de años de divergencia evolutiva, porque cualquier mutación que alterase dramáticamente este gen resultaría en muerte celular. Se estableció como motivo de búsqueda: “Reclinomonas americana succinate dehydrogenase”. De entre las bases de datos disponibles se seleccionó GenBank Invertebrate Sequences. Esta base de datos contiene únicamente secuencias de ADN de organismos invertebrados. Como resultado se obtuvo “GBINV:2258325 Reclinomonas americana mitochondrion, complete genome”. A partir de esta resultado se hizo necesario localizar, y aislar para su uso, la secuencia del gen de la succinato-deH.

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4.3. LOCALIZACIÓN DE SECUENCIAS HOMÓLOGAS (SIMILARES) El paso siguiente consistió en la búsqueda de secuencias homólogas al gen de la succinato-deH mitocondrial (subunidad 2) de R. americana (herramienta BLASTP). En este caso, interesa comparar la secuencia problema con otras de organismos tanto eucariotas como procariotas. La mejor base de datos en ese caso es “SwissProt”. Observando los resultados, se observan, entre otros, registros de bacterias. Dicho de otro modo, seleccionando la secuencia de un gen mitocondrial eucariota y, buscando similitudes, se localizan secuencias, tanto de procariotas como de eucariotas, que responden a una posible homología. Observando en detalle se constata que:

• el primer registro de la página de resultados corresponde al ADN mitocondrial de la propia Reclinomonas americana.

• Las secuencias de procariotas que muestran mayor grado de similitud con la de R. americana son: Rickettsia prowazekii, Rickettsia conorii y Paracoccus denitrificans. Más importante que sus nombres es el hecho de que todas ellas se enmarcan dentro del grupo de las alpha-Proteobacterias. Esto sugiere que las células procariotas que habrían sido endocitadas hace millones de años, y que presuntamente habrían dado lugar a las mitocondrias, estarían relacionadas con las alfa-Proteobacterias actuales.

4.4. COMPARACIÓN DE SECUENCIAS MEDIANTE ALINEAMIENTO A continuación se determinó en qué grado se parece la secuencia problema a la de una alfa-proteobacteria mediante el alineamiento de secuencias (herramienta CLUSTALW) a través de la localización de regiones comunes entre ellas. De este modo se puso en evidencia la existencia de una extensa región homóloga entre ambas. Un alto nivel de homología entre secuencias mitocondriales eucariotas y bacterianas, especialmente considerando que procariotas y eucariotas tomaron caminos evolutivos divergentes hace unos dos billones de años, aporta pruebas evidentes que apoyan la teoría de que las mitocondrias son productos evolutivos de formas bacterianas.

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4.5. BÚSQUEDA DE SECUENCIAS HOMÓLOGAS A LA DEL GEN DE LA SUBUNIDAD 8

DEL NADH-DEH MITOCONDRIAL Seguidamente se repitió el mismo procedimiento usando un gen mitocondrial diferente de R. americana. Esto permitió, en primer lugar, revisar el procedimiento de búsqueda, importación y alineamiento de secuencias. En segundo lugar, sirvió para mostrar que la homología observada entre genes de bacterias y de mitocondrias no se limitan a un único gen. Los resultados revelaron secuencias de procariotas entre las mejores puntuaciones de similitud. Todas ellas (Rhodobacter capsulatus, Rickettsia conorii, Rickettsia prowazekii, Rickettsia tiphi y Paracoccus denitrificans) son alfa-proteobacterias. Una vez más, esto sugiere que este grupo bacteriano es el origen probable de las mitocondrias. Ahora veremos cuanto se parecen la secuencia del gen de la NADH-deH mitocondrial de R. americana (subunidad 8) y una de las de alfa-proteobacterias. Los análisis de los genes de la succinato-deH y NADH-deH sugieren que R. americana, un eucariota simple, posee genes mitocondriales homólogos a los de alfa-proteobacterias, posibles predecesores evolutivos de las mitocondrias. 4.6. CENTRÁNDONOS EN LOS CLOROPLASTOS Una vez demostrada la evidente relación entre genes bacterianos y genes mitocondriales, sugiriendo un origen bacteriano para las mitocondrias, se buscó hacer algo similar con los cloroplastos. El gen cloroplástico con el que se trabajó codifica una proteína ribosómica altamente conservada en el alga Porphyra purpurea. Se usó como motivo de búsqueda “Porphyra purpurea ribosomal protein S12” sobre la base de datos “SwissProt” y se siguió el mismo esquema de trabajo que en lo indicado más arriba para las secuencias mitocondriales. Una vez más, la secuencia con mejor puntuación es, evidentemente, la misma que usamos como motivo de búsqueda. Entre los resultados con mejores puntuaciones, se encuentran algunas secuencias bacterianas. Esto indica que la secuencia de la proteína ribosómica S12 del cloroplasto de P. purpurea es más próxima a las secuencias de proteínas ribosómicas S12 de algunas bacterias que a las de otras plantas. Las secuencias bacterianas con mayor similitud (Synechococcus, Synechocystis, y Spirulina platensis) pertenecen a la clase de las Cyanobacteria.2 Se estudió la similitud,

2 Del mismo modo que los genes de R. americana con lo que hemos trabajado mostraban una especial homología con las secuencias de alpha-Proteobacteria, el de la proteína ribosómica

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mediante alineamiento, con la mejor de las puntuaciones, Synechococcus para poner de manifiesto el elevado grado de conservación. Llegados este punto, el uso de varias herramientas bioinformáticas de uso corriente por los investigadores, permitieron obtener evidencias que apoyan la teoría endosimbiótica. A lo largo de la construcción del argumento, se constata que:

• Las secuencias mitocondriales son más próximas a las de alfa-Proteobacterias que a las de otras clases bacterianas.

• Las secuencias cloroplásticas son más próximas a las de Cianobacterias que a las de otras clases de bacterias.

4.7. CREACIÓN DE ÁRBOLES FILOGENÉTICOS Para completar el análisis de las relaciones de mitocondrias y cloroplastos con determinados tipos de bacterias, se usó el mismo Entorno Educativo de Biology Workbench para crear árboles filogenéticos (herramienta DRAWGRAM) que mostrasen gráficamente las relaciones de proximidad entre estos grupos a diferencia de otros. Aquí se hace evidente la necesidad de usar secuencias altamente conservadas porque, entre los microorganismos, la tasa de mutación es muy alta de modo que en otro tipo de secuencias no aparecerían similitudes adecuadas. 4.7.1. ÁRBOL FILOGENÉTICO BASADO EN EL GEN DE LA SUCCINATO-DEH

(SUBUNIDAD 2) Se usó la secuencia de la succinato-deH (subunidad 2) previamente utilizada. Basándonos en ella, se realizó la búsqueda de secuencias similares y se seleccionaron organismos que representasen las diferentes clases de bacterias3.

cloroplástica S12 de P. purpurea, muestra una alta homología con los correspondientes a genes de bacterias del grupo Cyanobacteria. 3 Incluimos alfa-, beta- y gamma-proteobacterias. El SIB nos limita al no permite modular el número de resultados de una búsqueda, estableciendo de forma predeterminada el máximo en 100. Con un máximo de 250 resultados (posible con Biology Workbench 3.2), el listado resultante de esta búsqueda incluiría también arqueobacterias, Bacillus y otros grupos. El listado aquí propuesto es el resultado de analizar dos filogenias obtenidas, cada una, con 50 de los 100 resultados de la búsqueda con BLASTP, con el objetivo didáctico de obtener un buen agrupamiento ilustrativo del objetivo perseguido.

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El SIB proporciona un gráfico en el que las diferentes secuencias se indican con códigos, poco significativos a primera vista. La edición del mismo cambiando códigos por nombres y usando un código de colores según grupo taxonómico revela en un solo golpe de vista la evidencia de las relaciones:

Así, se hace evidente el agrupamiento según las diferentes clases de bacterias. Más importante es el hecho de que R. americana se agrupa con las alpha-Proteobacteria, indicando, definitivamente, la estrecha relación con este grupo concreto de procariotas. 4.7.2. ÁRBOL FILOGENÉTICO BASADO EN LA SECUENCIA GÉNICA DE LA PROTEÍNA

RIBOSÓMICA CLOROPLÁSTICA S12 Se usó otra secuencia ya familiar para los alumnos, la de la proteína ribosómica cloroplástica S12 de Porphyra purpurea. Como en el caso anterior, este gen está presente en todos los organismos con elevado grado de conservación. También en este caso, con las limitaciones impuestas por el entorno, se trató de incluir el mayor número de divisiones o clases de bacterias posible. Se muestra a continuación el árbol obtenido y la versión reeditada, incluyendo nombres y código de colores de grupos taxonómicos, el el que se puede apreciar un claro patrón de agrupamiento. Según dicho patrón, la secuencia de la proteína S12 del eucariota Porphyra purpurea se agrupa con los miembros del grupo Cianobacterias como resultado de la estrecha relación evolutiva existente entre ambos:

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5. CONCLUSIÓN El reducido número de alumnos cursando 2º de Bachillerato en los dos últimos cursos aportan datos que carecen de significación estadística. Se ha evaluado el nivel de comprensión a través de un cuestionario en el que se instaba al alumno a reproducir sobre el papel el diseño de la experiencia individualizando claramente la hipótesis de partida, la secuencia metodológica detallada y la conclusión alcanzada. Así, se ha constatado que, usando varias herramientas bioinformáticas, reunidas en el Entorno Educativo de Biology Workbench, los alumnos han podido comprobar que los genes mitocondriales y cloroplásticos de eucariotas simples presentan secuencias con alta homología con ciertos grupos de bacterias. Este tipo de evidencia es un apoyo firme a la teoría endosimbiótica, según la cual las células eucariotas proceden de células procariotas que, tras un proceso de endocitosis, establecieron una relación simbiótica con otros procariotas. En concreto, se encontraron de que las mitocondrias podría haber evolucionado a partir de alfa-proteobacterias y los cloroplastos a partir de Cianobacterias. La experiencia ha permitido una aproximación práctica y real al concepto teórico planteado, integrando las TIC en un contexto en el que la enseñanza tradicional manifiesta evidentes carencias (López García et al., 2007) y utilizando una metodología en la que prima más la actividad y la construcción del conocimiento que la mera recepción pasiva del mismo (Area Moreira, 2003). La integración de la bioinformática en el plan de estudios de Bachillerato mejorará la enseñanza de la biología. Se demuestra que la aplicación de las Tecnologías de la Información y la comunicación en entornos educativos adecuados genera conocimiento, aproxima a los estudiantes a la

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metodología científica reduciendo considerablemente la distancia que separa la realidad de los centros escolares y la de los centros de investigación. Esta característica es patente para los estudiantes que, en nuestro caso, han manifestado un alto grado de motivación, requiriendo en contadas ocasiones la intervención del profesor, siempre en el sentido de confirmar relaciones entre los aspectos concretos de la práctica y los contenidos curriculares abordados. Por último, se ha contribuido a ampliar las posibilidades de investigación escolar en lengua castellana, al haber contribuido, como base para esta experiencia, con la traducción del entorno SIB (ver direcciones de internet al final). REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

• AREA, M. (2003). Guía Didáctica: creación y uso de webs para docencia universitaria. Edullab: Laboratorio de Educación y Nuevas Tecnologías de la Univ. de La Laguna. http://www.edullab.org/

• CAAMAÑO, A & COROMINAS, J. (2004). ¿Cómo abordar con los estudiantes la planificación y realización de trabajos prácticos investigativos?. Alambique, 39: 52-63.

• CANO, M & CAÑAL, P. (2006). Las actividades prácticas en la práctica: ¿Qué opina el profesorado?. Alambique, 47: 9-22.

• LÓPEZ, M y J.G. MORCILLO (2007). Las TIC en la enseñanza de la Biología en la educación Secundaria: los laboratorios virtuales. Revista Electrónica de Enseñanza de las Ciencias, 6 (3): 562-576. En http://www.saum.uvigo.es/reec/volumenes/volumen6/ART5_Vol6_N3.pdf

• MARGULIS, L. (1981). Symbiosis in cell evolution. W.H. Freeman, New York. Ed.1993. 452pp.

• POZUELOS, F.J. & TRAVÉ, G. (2007). Las TIC y la investigación escolar actual. Alambique, 52: 20-27.

• JIMÉNEZ, P.; CAAMAÑO, A.; PEDRINACI, E., y De PRO, A. (2007). Enseñar ciencias. 176: 95-118.

DIRECCIONES DE INTERNET

• Biology Student Workbench: http://bighorn.animal.uiuc.edu/cgi-bin/sib.py

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• Entorno Educativo de “Biology Workbench” (castellano): http://bighorn.animal.uiuc.edu/cgi-bin/esib.py

• Guión de la práctica detallada con imágenes del proceso paso a paso:

• http://centros.edu.xunta.es/iesasardineira/moodle/mod/resource/view.php?id=603

• RADOMIR, S., J. ELDERKIN, M.J. DARCY, J. SABO, and D.M. RAINERI. Understanding the Evolution of the Eukaryotic Cell: The Endosymbiotic Theory. Department of Microbiology, University of Illinois at Urbana-Champaign.

En http://bsw-uiuc.net/tutorials_current/Endosys/endosys.pdf