1). INTRODUCCIÓN

Desmodium adscendens (SW.) DC. (Fabaceae) es una planta perenne que ocurre comúnmente en las áreas tropicales de África, América del sur, Australia y Oceanía. Se ha utilizado durante muchos años debido a sus propiedades farmacológicas y se ha valorado en las prácticas de medicina popular [1]. D. adscendens se acredita con muchas propiedades beneficiosas, pero su uso difiere según la región donde se cultiva [2]. En Camerún, el jugo de las hojas jóvenes, aplicado por vía tópica, sirve como un antídoto para el veneno de la serpiente [3]. Tiene un uso similar en Nicaragua, pero en este caso las infusiones y decocciones se administran por vía oral [4]. En la región de la selva, las preparaciones de D. adscendens se usa para tratar trastornos del sistema digestivo o abdominal y dolor de espalda [5]. En la medicina tradicional ghanés se utiliza comúnmente para aliviar condiciones asociadas con la contracción excesiva del músculo liso, especialmente el asma. Sin embargo, en el Congo, D. adscendens se valora principalmente por sus propiedades analgésica, Antipirética y anticonvulsivo.

Debido a la gran variedad de actividades farmacológicas, D. adscedens ha sido objeto de numerosos estudios in vitro y experimentos con animales, verificar la validez de su uso, especialmente en el tratamiento de: (i) las enfermedades causadas por el estrés oxidativo [7-9], (ii) Estados de aumento de la actividad del SNC (epilepsia, dolor) [10], (iii) hígada disfunción causada por envenenamiento [11] y (iv) trastornos asociados con la contracción del músculo liso (asma) [12, 17]. Como se mencionó anteriormente, una de las bien documentadas propiedades de D. adscendens, que sin duda contribuye a su efecto farmacológico, es la actividad antioxidante. En una investigación reciente Muanda et al [9] evaluaron las propiedades de depuración radical del agua y los extractos de metanol/agua (50/50; v/v) de D. adscendens en Nigeria. Los resultados confirmaron que la planta discutida es una fuente importante de antioxidantes naturales.

Publicaciones sobre D. adscendens se centran principalmente en la actividad farmacológica de sus diversas preparaciones (p. ej., decocciones, infusiones, extractos y tinturas). Relativamente poco se sabe sobre los compuestos químicos responsables de su actividad biológica. Basado en cromatografía en capa fina (TLC), se ha encontrado que los principales metabolitos secundarios en D. adscendens incluyen triterpenos saponinas, flavonoides y alcaloides, aminas. Saponinas se encuentran principalmente en hojas y flavonoides – flores, alcaloides, en hojas y tallos [18].

2.2) Reactivos analíticos.

Metanol y acetonitrilo grado cromatográfico fueron adquiridos de Merck (Darmstadt, Alemania). Agua se purificó con el sistema de simplicidad de Millipore (Millipore Corp., Bedford, MA, USA). Todos los otros productos químicos utilizados para los procedimientos experimentales fueron de grado analítico. Metanol, etanol, cloruro de aluminio, ftalato de anilina, cloruro de cobre (II), carbonato de potasio, nitrito de sodio, ácido fórmico, acetato de etilo y ácido trifluoroacético fueron comprados de POCH (Gliwice, Polonia). Disolventes deuterados (DMSO-d6, MeOD) para el análisis de NMR se adquirieron en Glazer (Basilea, Suiza). Luminol, f-MLP (formil-met-leu-fenilalanina), radical 1, 1-difenil-2-picrylhydrazyl (DPPH•), ácido ascórbico, xantina oxidasa, xantina, solución salina equilibrada de Hanks (HSSB) se adquirieron en Sigma-Aldrich Chemie

GmbH (Munich, Alemania). Hierro (II) sulfato, ácido linoleico, nitrobluetetrazolium (NBT), ácido tiobarbituric, tris (hidroximetil) aminometano (TRIS) se adquirieron en Sigma-Aldrich de Fluka Chemie GmbH (Munich, Alemania). Ácido gálico fue adquirido a ChromaDex (Santa Ana, Estados Unidos). Normas para HPLC-DAD medidas cualitativas así como análisis de TLC (apigenina, luteolina, keampferol, quercetina, vitexina, isovitexin, vitexina 2-O-rhamnoside, 7-O-glucósido de apigenina, apigenina 7-O-diglucoside y apigenina 7-O-rhamnoglucoside, l-xilosa, d-xilosa, d-arabinosa, l-arabinosa, d-glucosa, d-ramnosa, d-galactosa) se adquirieron en Sigma-Aldrich de Fluka Chemie GmbH (Munich, Alemania).

2.3) Extracción, fraccionamiento y aislamiento de los componentes químicos de D. adscendens.

Las hojas secas y en polvo de D. adscendens (200 g) fueron extraídas con una solución de etanol: agua (v/v) de 60% (700 mL × 3, durante 5 h, 90◦C). Después de la filtración, se obtuvo el extracto etanólico seco (EE, 20 g) eliminando el solvente con evaporador rotatorio. El extracto fue disuelto con 500 mL de agua caliente y mantener en nevera durante 24 h para quitar la clorofila. El agua fue filtrada la fracción soluble y lyophilizated a 10,2 g de residuo. Después de la disolución, la fracción acuosa sucesivamente fue repartida en RP-18 (40 m, Merck; Darmstadt, Alemania) columna preparativa (Ø 50 mm × 50 m m) con 250 mL de soluciones de metanol, producción (después de la liofilización): F1 (0% MeOH) – 1.0 g, F2 (20% MeOH) – 1,8 g, F3 (50% MeOH) – 1,5 g y F4 (100% MeOH) – fracciones solubles 1.2 g. Repite la cromatografía en columna (Ø 30 mm × 500 m m) en Sephadex LH-20 (Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Suecia) de la fracción F3 (50% MeOH) con 100%, 50% y 20% MeOH permitió el aislamiento de cuatro compuestos: 1 (135 mg), 2 (102 mg), 3 (27 mg) y 4 (14 mg). Proceso de aislamiento fue supervisado por la cromatografía en capa fina y la pureza de los compuestos > 95%) fue probado por el análisis HPLC. Todo aislado compuestos (1, 2, 3 y 4) fueron identificados luego por H, C y 2D NMR, análisis de HPLC-DAD. Los compuestos aislados fueron almacenados en 4°C.

2.5) Análisis cualitativo y cuantitativo de HPLC-DAD

2.5.1) Sistema HPLC-DAD

Se realizó análisis de HPLC de fase inversa en un Dionex (Sunnyvale, Estados Unidos) sistema consistió en la bomba de gradiente 7580, detector de UVD 340S y JetStream II plus termostato de columna (Electrónica Industrial WO) fue controlado por el software Chromeleon. En orden de separación cromatográfica que logramos en una analítica C18 Luna reversa columna de fase (Phenomenex, 4.6 × 250 mm, 5 µm) con C-18 precolumn (Phenomenex, 3 × 4 m m, 5 µm). Inyección de la muestra se realizó a través de la válvula del inyector Rheodyne con un bucle de muestra de 20 µL.

2.5.2) Condiciones cromatográficas de HPLC-DAD

La Resolución cromatográfica adecuada se logró en el móvil fase que consiste en agua 0,1% TFA (v/v) (solvente A) y acetonitrilo, 0.1% TFA (v/v) (solvente B). El sistema de gradiente de 15% isocrática disolvente B (0-10 min), 15 – 20% disolvente B (10 – 20 min), 20% isocrática disolvente B (20-25 min), 20-90% solvente B (25-45 min), 90% isocrática disolvente B (45 a 55 minutos), 90 – 15% disolvente B (55-65 min) con un caudal de 0,75 mL/min temperatura de la columna se ha fijado en 30◦C. Después de la filtración a través de filtro de membrana Millipore (Millex LCR PTFE hydrophill 0,45 m) 20 L de muestra se inyectó. La longitud de onda de detección UV fue monitoreado a 214 nm, 224 nm, 270 nm y 336 nm.

2.5.3) Preparación de soluciones estándar y muestra para el análisis de HPLC-DAD

3 mg del crudo etanólico 60% extracto (después de la liofilización) así como de fracciones particulares (0% MeOH, 20% MeOH, 50% MeOH y 100% MeOH; después de la liofilización) se disolvió en metanol (2 mL) y filtrada a través de filtro de membrana Millipore antes de la inyección directa al sistema de HPLC.

Las soluciones individuales se prepararon disolviendo 2.0 mg de cada compuesto puro con precisión ponderada (1, 2, 3, 4) en 10 mL de solución de metanol 50% (v/v). Las cantidades apropiadas de las soluciones madre se diluyeron en 100% metanol para obtener las soluciones estándar que contienen 50 g/mL, 25 g/mL, 12,5 g/mL, 6,25 g/mL, 3,125 g/mL y 1 g/mL de cada uno de ellos.

3.2) Aislamiento y purificación de compuestos fenólicos principales

El análisis realizado por el método de HPLC-DAD demostró que F3 contiene al menos cuatro principales compuestos con los espectros Ultravioleta típicos de flavonoides (figs. 3 y 4). Para determinar las estructuras de estas sustancias, se llevó a cabo su aislamiento en columna de Sephadex LH20 usando mezclas de metanol: agua en diferentes concentraciones como se ilustra en la figura 5. Como resultado, rindió la cromatografía de columna líquida multi-step: flavonoide 1 (135 mg, Rt = 20.11), Flavonoide 2 (102 mg, Rt = 20,63), Flavonoide 3 (27 mg, Rt = 22.02) y flavonoides 4 (14 mg, Rt = 22.72). Se presentan los cromatogramas de los compuestos purificados.

3.3) Identificación de flavonoides aislados

Análisis preliminar realizado por el método de HPLC-DAD mostró que los espectros UV de los pares de compuestos 1 y 4, 2 y 3 areidentical (Fig. 4). Debido a que la mayoría de los azúcares pertenece a los cromóforos débiles, la posición de máximos de la absorción depende principalmente de la parte de la aglicona. Los valores de los máximos de la banda de la longitud de onda en la gama de 267.9 – 270.5 nm (correspondiente al anillo A) y en la gama de 335.7 – 338.1 nm (correspondiente al anillo C) indican que las agliconas de los compuestos analizados pertenecen a flavonas o flavonoles [25]. Para determinarlo exactamente, los espectros Ultravioleta obtenidos fueron comparados con los derivados de estándares comercialmente disponibles, incluyendo: apigenina, luteolina, kaempferol y

quercetina. Se encontró que los espectros UV de los compuestos 2 y 3 instalado perfectamente en el espectro de apigenina, mientras que los derivan de los compuestos 1 y 4 son muy similares a la aglicona mencionado. Basado en estos resultados se concluyó que los flavonoides analizados comprenden la apigenina como aglicona. La mayor polaridad de los compuestos probados en comparación con apigenina (como fue evidenciado por su tiempo mucho más corto de la retención en columna RP18) indica su estructura glicosídico.

3.2) Aislamiento y purificación de compuestos fenólicos principales

El análisis realizado por el método de HPLC-DAD demostró que F3 contiene al menos cuatro principales compuestos con los espectros Ultravioleta típicos de flavonoides (figs. 3 y 4). Para determinar las estructuras de estas sustancias, se llevó a cabo su aislamiento en columna de Sephadex LH20 usando mezclas de metanol: agua en diferentes concentraciones como se ilustra en la figura 5. Como resultado, rindió la cromatografía de columna líquida multi-step: flavonoide 1 (135 mg, Rt = 20.11), Flavonoide 2 (102 mg, Rt = 20,63), Flavonoide 3 (27 mg, Rt = 22.02) y flavonoides 4 (14 mg, Rt = 22.72). Se presentan los cromatogramas de los compuestos purificados.

3.3) Identificación de flavonoides aislados

Análisis preliminar realizado por el método de HPLC-DAD mostró que los espectros UV de los pares de compuestos 1 y 4, 2 y 3 areidentical (Fig. 4). Debido a que la mayoría de los azúcares pertenece a los cromóforos débiles, la posición de máximos de la absorción depende principalmente de la parte de la aglicona. Los valores de los máximos de la banda de la longitud de onda en la gama de 267.9 – 270.5 nm (correspondiente al anillo A) y en la gama de 335.7 – 338.1 nm (correspondiente al anillo C) indican que las agliconas de los compuestos analizados pertenecen a flavonas o flavonoles [25]. Para determinarlo exactamente, los espectros Ultravioleta obtenidos fueron comparados con los derivados de estándares comercialmente disponibles, incluyendo: apigenina, luteolina, kaempferol y quercetina. Se encontró que los espectros UV de los compuestos 2 y 3 instalado perfectamente en el espectro de apigenina, mientras que los derivan de los compuestos 1 y 4 son muy similares a la aglicona mencionado. Basado en estos resultados se concluyó que los flavonoides analizados comprenden la apigenina como aglicona. La mayor polaridad de los compuestos probados en comparación con apigenina (como fue evidenciado por su tiempo mucho más corto de la retención en columna RP18) indica su estructura glicosídico.

Para determinar el número de azúcares ligados, los tiempos de retención de los flavonoides aislados entonces fueron comparados con un conjunto de varios apigenina O - y C-glicósidos, a saber: apigenina-7-O-glucósido de apigenina-7-O-diglucoside, apigenina-7-O-rhamnoglucoside, apigenina-8-C-glucósido (vitexina), apigenina-6-C-glucósido (isovitexin) y apigenina-8-C-rhamnoglucoside (vitexina 2-O-rhamnoside). Basado en estos resultados, compuestos de 3 y 4 han sido identificados como vitexina y isovitexin, respectivamente. Los datos obtenidos para los compuestos 1 y 2 no cupo en cualquiera de los estándares disponibles. Sus espectros UV eran idénticos a isovitexin (flavonoides 4) y vitexina (flavonoide 3), pero los tiempos de retención eran ligeramente más cortos (∼2.5 min y 1,5 min, respectivamente). Según Puodziunene et al [26] el tiempo de retención de

monoglucoside de apigenina (glicosilada en la posición C-8), es más corto que el de apigenina sustituido, aproximadamente 15,7 min mientras que la diferencia entre los tiempos de retención de monoglicoside y diglicoside es sólo unos minutos. El compuesto 2 fue eluida de la columna en casi el mismo tiempo como apigenina-2-O-rhamnoglucoside, que conducen a la conclusión de que probablemente es disacárido.

3.4) Cuantificación de flavonoides identificados

Análisis de contenido se realizó para determinar la concentración de compuestos 1, 4 en EE y F3 por HPLC-DAD. Como estándares se utilizaron los flavonoides aislados y purificados 1 – 4

3.4.1) Validación del método de cuantificación

Linealidad del método desarrollado fue validado mediante el análisis de las cinco concentraciones de cada analito que oscilan entre 1 y 50 µg/mL. El rango de concentración generalmente fue elegido según las directrices de la ICH (Conferencia Internacional de armonización) [35] es decir, 70% y 130% de la concentración nominal. La acción apropiada y soluciones estándar se prepararon como se describe en la sección 2.5.3. Las ecuaciones de regresión, coeficientes de correlación como límites de detección (LOD) y cuantificación (LOQ) de cada uno de ellos fueron dados en la tabla 2. Se realizó el análisis por triplicado para cada solución estándar. Se construyeron las curvas de calibración por regresión lineal de la relación de área de pico (y) de cada analito, versus las concentraciones (x). Se calcularon los límites de detección (LOD) y cuantificación (LOQ) por el uso de ecuaciones LOD = 3.3SD / a y LOQ = 10SD/a, respectivamente, donde SD es la desviación estándar de la intercepción de la respuesta (y) y a es la pendiente de la curva de calibración según las directrices de la ICH [35]. Se observaron buenos coeficientes de correlación entre 0.9998 y 0.9999. Las curvas de calibración estándar eran todo lineales en las gamas de prueba. Los LODs y LOQs de compuestos 1, 4 eran 0.4924 – 0.5749 y 1.4921 – 1.7420 µg/mL, respectivamente (tabla 2), indicando que el método desarrollado exhibió buena sensibilidad.

Las precisiones días inter y intra-día, expresadas como las desviaciones estándar relativas (RSD) para el tiempo de retención y pico área determinaron todo aislado compuestos por análisis por triplicado de mezcla de soluciones estándar durante el día y en tres días consecutivos. Las variaciones intra y entre días de tiempos de retención y concentración expresada en % RSD se enumeran en la tabla 3. Los valores de % RSD de tiempos de retención y áreas de pico de los cuatro flavonoides fueron encontradas en el rango de 1.02 – 1.30% y 1.04 – 1,92%, respectivamente en la prueba de precisión intra-día. Se obtuvieron resultados similares (1.55-1.82% para la variación del tiempo de retención) y 1,72 – 2.15% para la variación del área pico en ensayo de precisión. Estos resultados representan buena precisión del método desarrollado.

La exactitud se determinó en la prueba de recuperación por el método de adición estándar. Tres concentración de cada solución estándar del compuesto (1 µg/mL, 12,5 µg/mL y 50 µg/mL) fueron agregados a la muestra de extracto crudo (0.5 mg/mL) y los

análisis se realizaron por triplicado según el procedimiento descrito en la sección 2.5.3. La recuperación media se calculó según la fórmula siguiente: recuperación (%) = [(cantidad fundada – cantidad original)/cantidad con picos] × 100%. Las tasas de recuperación de los analitos entre 98.7 ± 1,91 y 103.23 ± 1.78 con desviaciones estándar relativas en el rango de 1.14 – 1.98% lo que indica alta precisión del método desarrollado (tabla 4).

3.4.2) Cuantificación de los flavonoides identificados en etanol 60% Extracto de D. adscendens (EE) y 50% fracción metanólica (F3)

Los tiempos de retención de los picos esperados de compuestos 1, 4 en EE y F3 fueron igual a la de los compuestos aislados estándar. Isovitexin-2-O-xyloside (1) y vitexina-2-O-xyloside (2) fueron los principales flavonoides en ambos EE (21.428 y 12,188 mg/g respectivamente) y F3 (206.020 y 142,026 mg/g, respectivamente) (tabla 5). Los dos compuestos de este último, vitexina (3) y isovitexin (4), se encontraron en menor concentración: 3.328 y 1,635 mg/g en EE y 17.443 y 6,363 mg/g en F3. Los valores RSD % entre 0.5 a 2.6% confirman la buena repetibilidad del método propuesto de cuantificación. La comparación de cantidades de flavonoides por 1 g de EE y F3 permite para monitorear el proceso de concentración. El contenido total de flavonoides fue cerca de diez veces mayor en F3 que en EE. Por otro lado, la estimación de la cantidad de flavonoides (en EE y F3) en relación a 100 g de material vegetal permitió para evaluar la pérdida de las sustancias bioactivas durante la purificación. Sobre esta base la pérdida de dos compuestos principales (1 y 2) se ha determinado como 28% y 14%, respectivamente. En el caso de dos compuestos menores (3 y 4), la reducción de las cantidades fue mayor y equivalían a aproximadamente el 60% y 75%.

Los perfiles de HPLC-DAD de la EE y F3 indicaron que isovitexin-2-O-xyloside (1) y vitexina-2-O-xyloside (2), como los componentes principales (>85% de la cantidad total de flavonoides), podrían jugar papeles cruciales en su acción antioxidante. Nuestros resultados sugieren que los extractos de D. adscendens que contiene estos dos flavonoides podrían ser una útil fuente natural de antioxidantes.

Le desmodium est une herbacée sauvage très répandue en afrique tropicale. De la famille des Fabacées, elle mesure environ 50 cm de haut, avec de nombreuses ramifications qui se terminent par des fleurs blanches, roses or mauves. Les feuilles sont composées de trois foloiles ovales, un peu comme celles du trèfle. Elle est peu parfumèe, avec un goϋt fade. Il existe plusieurs espèces de desmodium (canadense, repandum, gangeticum, pulchellum ou encore penduliflorum, etc.); aucune n´a les vertus thérapeutiques du desmodium, plus concentré en principes actifs. (Lacoste Sophie, 2014)

Lacoste Sophie. (2014). Ma bible de la phytothérapie: Le guide de référence pour se soigner avec les plantes. Quotidiem Malin Éditions.

3.1) Medición de la actividad antioxidante y la actividad de fraccionamiento del extracto etanólico de D. adscendens

Como un potente neutralizador de especies reactivas del oxígeno (ROS), D. adscendens puede servir como una posible intervención preventiva para enfermedades mediadas por radicales libres (asma, artritis reumatoide, skinaging, etc.) [23,24]. por lo tanto, las propiedades antioxidantes del extracto etanólico 60% (EA) de D. adscendens fueron evaluadas para su radical libre acción de rebuscar por interacción con radicales 1, 1-difenil-2-picrylhydrazyl (DPPH). Actividad antioxidante del extracto examinado también fue probada mediante la inhibición de la actividad de xantina/xantina oxidasa y la inhibición de las pruebas de la peroxidación de ácido linoleico. Se realizaron mediciones adicionales de la producción de especies reactivas de oxígeno por quimioluminiscencia dependiente de luminol en neutrófilos humanos activados. Efectos inhibitorios del extracto etanólico 60% (EE) y fracciones (F1 – 0% MeOH; F2 – 20% MeOH; F3 – 50% MeOH; F4 – 100% MeOH) se evaluaron en comparación con el ácido gálico (GA) en concentración de 50 g/mL. Los datos se expresaron como media ± SD; n = 3, analizadas por triplicado. La reducción de la quimioluminescencia por fracciones de extracto probados fue demostrada en la luminiscencia máxima de células estimuladas. Se realizaron experimentos utilizando células de donantes distintos; α = 0.05 vs. No células estimuladas, *p = < 0.05 vs. Células estimuladas.

El EE de D. adscendens (5 – 100 g/mL) mostró significativa, pero más débil que el ácido gálico (33,4 ± 2.5 – 86,4 ± 5.4 vs 43.4 ± 4.0 – 90,8 ± 3.2, respectivamente), actividad antioxidante en pruebas libre de células (cuadro 1). Por el contrario, la reducción de la producción de especies reactivas de oxígeno por los neutrófilos estimulados (10 – 50 g/mL) fue comparable con el ácido gálico de control positivo (Fig. 1). El análisis de HPLC-DAD reveló que el crudo adscendens EE de D. contiene tres principales grupos de metabolitos secundarios: flavonoides, ácidos fenólicos y saponinas (Fig. 2). Con el fin de determinar cuál de ellos tiene la mayor contribución a la actividad antioxidante biológico, el extracto fue fraccionado con diferentes porcentajes de metanol como se describe en la sección 2.3. Se encontró que 0% MeOH fracción (F1) compuesta principalmente por azúcares, 20% MeOH fracción (F2) compuesta principalmente por compuestos no flavonoidal (ácidos fenólicos), 50% MeOH fracción (F3) contiene flavonoides y 100% MeOH (F4) principalmente saponinas.

En todo análisis libre de la célula, así como en el estallido oxidativo de neutrófilos modelo, fracción F2 y F3 mostró la mayor actividad (tabla 1, Fig. 1). Sin embargo la actividad de la fracción MeOH de 50% (F3) fue ligeramente superior (45,8 ± 4.5 – 80.2 ± 1,5 vs 32,8 ± 2.5 – 78,3 ± 1.4), especialmente en la prueba de la peroxidación de ácido linoleico y la producción de ROS por modelo de neutrófilos. Así partiendo de los resultados, se puede concluir que la fracción MeOH de 50% (F3) poseyó la actividad antioxidante más potente en comparación con otras fracciones (0% MeOH, 20% MeOH, 100% MeOH) y por lo tanto, ser objeto de otro estudio.