histocompatibilidad trasplante

Anticuerpos Anti-HLA en el trasplante renal:

detección y significado

RIICG MADRID MIER EDUARDO

INSTITUTO MEXICANO DEL SEGURO SOCIALCMN MANUEL AVILA CAMACHO

PUEBLA, PUEBLA

UN POCO DE HISTORIA

• El trasplante de órganos y tejidos humanos es uno de los avance más importantes de la medicina moderna.

• Alexis Carrel, 1914, implantó varias de las técnicas vasculares para trasplantes.

Demostró que el autoinjerto puede sobrevivir indefinidamentePero el aloinjerto rápidamente cesa en sus funciones Postula que el organismo elimina el tejido extraño

• 1933 se efectuó el primer trasplante renal de humano a humano por el cirujano ucraniano Yu Yu Voronoy.

– Injerto nunca funcionó y el receptor falleció a los pocos días de la operación.

de-Leo-Cervantes C. Pruebas de histocompatibilidad en el Programa de Trasplantes. Rev Invest Clin 2005; 57 (2): 142-146

UN POCO DE HISTORIA• En 1940 Peter Medawar estableció las bases inmunológicas del rechazo y

tolerancia.

• 1952, cuando Jean Dausset describe el complejo de genes de histocompatibilidad en los humanos (HLA)

• Primer trasplante renal con éxito absoluto, en 1954, en el Hospital Peter Bent Brigham de Boston, por Joseph Murray

– Trasplantar un riñón entre gemelos univitelinos, documentando con esto que el sistema inmunitario era la clave para el trasplante óptimo de órganos y tejidos.

TRASPLANTE

• Colocar células, tejidos u órganos (injerto) a un individuo (Rc) provenientes de otro individuo (Do) de la misma especie o no.

– VIVO– CADAVERICO

EFI. European Federation for Immunogenetics. Standards for histocompatibilitytesting. http://www.efiweb.eu/. Último acceso: mayo de 2010.

SENSIBILIZACION

• Persona que experimenta eventos sensibilizantes previos.

• 10-30% de los pacientes en lista de espera están “sensibilizados”


Paciente sensibilizado

• Fuentes de sensibilización:


RECHAZO

• La respuesta inmune del receptor frente al tejido del donante, limita el éxito del trasplante.


MECANISMO DE RECHAZO• “El trasplante de un órgano implica que el sistema inmunitario del

receptor se enfrentará a células vivas con moléculas HLA distintas de las suyas propias y por tanto susceptibles de ser reconocidas como extrañas.”

• Este reconocimiento puede realizarse por tres vías diferentes:

– Las moléculas del sistema HLA del donante, debido a su función de moléculas presentadoras.

– Las moléculas HLA del donante pueden ser procesadas por las APC del receptor

– Aún poco conocida es el reconocimiento por KIR, (killer Inhibitory Receptor)

• El reconocimiento alogénico induce la activación de diferentes tipos celulares:

– Los linfocitos T colaboradores o TH1, IL-2 e IFNγ

– Los linfocitos T colaboradores o TH2, que secretan mayoritariamente IL-4, IL-5, IL-6 e IL-10

– Los linfocitos T citotóxicos (CTL), generalmente CD8 y también CD4

– Y en ocasiones, los linfocitos B aloantígenos específicos que producen Ig.

OBJETIVOS• El grado de compatibilidad HLA representa un efecto positivo en el

trasplante renal y en la disminución de los episodios de rechazo.

• El objetivo del estudio consiste en evaluar el riesgo de pérdida del injerto.

• Deben identificarse en el receptor los aloanticuerpos donante-específicos y determinarse las incompatibilidades HLA entre receptor y donante.

• El riesgo de pérdida del injerto puede pronosticarse pretrasplante y postrasplante mediante el uso de diversas determinaciones inmunológicas


PRUEBAS DE HISTOCOMPATIBILIDAD PARATRANSPLANTE RENAL

DIAGRAMA DE FLUJO

A) Evaluación Inmunitaria preliminar

1.- Paciente:- Tipificación HLA Clase I y Clase II.- Tipificación ABO / Rh.- Cross-match (anticuerpos reactivos en suero contra antígenos HLA).

2.- Donantes vivos relacionados (padres, hermanos)- Tipificación HLA Clase I y Clase II.- Tipificación ABO / Rh.- Cross-match (células de donantes c/ suero del receptor buscando anticuerpos anti - HLA).


PRUEBAS DE HISTOCOMPATIBILIDAD PARATRANSPLANTE RENAL

DIAGRAMA DE FLUJO

B) Seleccionar donante vivo relacionado

- Compatibilidad ABO.- Mejor "match" para antígenos HLA.- Cross-match previo negativo.

C) Si no existe un donante vivo relacionado, inscribir al paciente en lista de espera para riñón con donante cadavérico.

• Cross-match contra panel celular mensual o trimestral.


PRUEBAS DE HISTOCOMPATIBILIDAD

• La histocompatibilidad (HLA) sigue siendo muy importante en el trasplante renal, ya que, el resultado del mismo se correlaciona con el numero de incompatibilidades HLA.

• La incompatibilidad HLA puede provocar una proliferacion y activacion de

los linfocitos T CD4+ y CD8+ del receptor, con activacion concomitante de la produccion de aloanticuerpos de linfocitos B.

• Esto da lugar a un rechazo celular y humoral del injerto.

• Los antigenos HLA muestran un polimorfismo notable.

EFI European Federation for Immunogenetics. Standards for histocompatibility testing. http://www.efiweb.eu/ [access date January 2010]

El sistema más conocido es el complejo principal de histocompatibilidad (MHC ó HLA en el hombre), cuya característica fundamental es su alto grado de polimorfismo.

Antígenos del sistema ABO de los grupossanguíneos

• Los antígenos de los grupos eritrocitarios humanos ABO (descubiertos por Karl Landsteiner) son antígenos potentes en los trasplantes de órganos y tejidos.

• Presentes en los endotelios vasculares de diversos órganos.

• Acs naturales llamados isoaglutininas Anti A y/o Anti B del receptor producen una lesión tisular en el órgano trasplantado, lo que conduce al rechazo.

• Grupo sanguíneo del receptor y el donador debe ser establecido antes de realizar cualquier trasplante


Antígenos del complejomayor de histocompatibilidad (MHC)

• Aquellos que al ser expresados por las células marcan la diferencia entre lo propio y lo extraño.

• Constituido por un grupo de genes que se encuentra en el brazo corto del cromosoma 6 humano, consta de 4 millones de pares de bases, habiéndose

identificado unos 400 genes en el MHC humano (segmento 6p21.3).


• La incompatibilidad es el problema principal.

– El riesgo de alorechazo depende del grado de disparidad genética entre donante y receptor con respecto a las moléculas HLA.

• La producción de anticuerpos frente a moléculas HLA requiere de un estimulo antigénico previo.

– El sistema inmune de un individuo entra en contacto con células procedentes de otro individuo cuya moléculas HLA sean diferentes.


• Clase I– HLA A, B y C.

– Expresadas en casi todas las células nucleadas del organismo (Ausente en eritrocitos y trofoblastos).

– Constituyen los blancos mayores para las reacciones inmunes contra tejidos y órganos trasplantados.

– Presentan antígenos peptídicos a linfocitos T CD8+ induciendo apoptosis o liberación de citotoxinas.

The British Transplantation Society. Towards standards for organ and tissue transplantation in the United Kingdom. http://www.bts.org.uk/Forms/Towards%20standards.pdf [access date January 2010]

• Clase I– (Moléculas MHC no Clásicas)

• Limitado Polimorfismo.• Baja expresión en la superficie celular.• Son reconocidas por receptores NK (RNK).• HLA G :

– expresado en trofoblasto fetal y células epitelio tímico.– Inducción de tolerancia materno-fetal.

• HLA E :– Actividad NK y de ciertos LT.

• HLA F :– Se expresa en amígdalas, bazo y timo. – Se unen a LIR 1 y LIR 2 e inhiben linfocitos


• Clase II:

– HLA-DR, HLA-DQ y HLA-DP.

– Expresados constitutivamente en células B, células dendríticas y monocitos.

– Unen péptidos derivados de proteínas extracelulares.

– Presentan antígenos a Linfocitos T CD4+.


• Clase III

– No contiene ningun gen del HLA, pero codifica genes de importancia en la respuesta inmune:

• Complemento (C2, C4 y factor B).• Factor de Necrosis tumoral.


• La función normal de los antígenos HLA propios es presentar antígenos extraños al linfocito T e iniciar de este modo la

respuesta inmune.

• Este tipo de reconocimiento forma la base para agrupar a los linfocitos T en dos grandes subpoblaciones:

– 1. CD8(+) citotóxicos que reconocen antígenos en asociación con HLA clase I.

– 2. CD4(+) que reconocen antígenos en asociación con HLA clase II.


TÉCNICAS DE DETECCIÓN DE ANTICUERPOS ANTI-HLA

1.- Técnicas de tipificación HLA• Microlinfocitotoxicidad o test NHI.

• Linfocitos viables (T-B) de la persona en estudio son expuestos a un panel de antisueros debidamente caracterizados en donde están incluidos los distintos tipos de HLA.

• La identidad entre receptor-donador es de cero disparidades o seis antígenos iguales se habla de una alta compatibilidad.

• Seis disparidades o seis antígenos diferentes la compatibilidad es nula.

• A mayor compatibilidad es mejor también la sobrevida esperada del trasplante

2.-Crossmatch (XM)• Busca anticuerpos anti-HLA preformados en el suero del receptor

que reaccionen con los Antígenos HLA del donante.

• Alto valor pronóstico positivo sobre la pérdida del injerto (80%)

• Suero del receptor + Células del donante

– XM + : Presencia de anticuerpos en el suero del receptor dirigidos contra las células del donante → contraindica el trasplante.

– XM - : Ausencia de anticuerpos en el suero del receptor dirigidos contra las células del donante → permite el trasplante.

Amico P, Hönger G, Mayr M, Steiger J, Hopfer H, et al. Clinical relevanceof pretransplant donor-specific HLA antibodies detected bysingle-antigen flow-beads. Transplantation 2009;87(11):1681-8

Utilidad• 1. Permite conocer la probabilidad de supervivencia del injerto a largo plazo.

– Supervivencia a 10 años de los injertos HLA idénticos: 73%;– Supervivencia de injertos no idénticos del 64% (una incompatibilidad) a 53% (seis

incompatibilidades)

• 2. Permite evaluar las probabilidades de que una prueba cruzada resulte negativa, conociendo la especificidad de los anticuerpos del receptor.

• 4. Facilita la identificación de aloanticuerpos donante-específicos en el postrasplante utilizando técnicas de fase sólida.

• 5. Hace posible evitar la repetición de las mismas incompatibilidades de trasplantes previos o futuros


POSITIVIDADCausas:

• Transfusiones pre-injerto.• Embarazos.• Rechazo de un primer injerto incompatible (favorece la

hiperinmunización con más de 80 % de células de panel).

• En los casos de una prueba cruzada positiva es importante descartar la presencia de autoanticuerpos no-HLA, los cuales son irrelevantes para

trasplantar y se traducen como resultados falsos positivos.


Crossmatch (XM)

• Variantes:– Contra panel PRA (Panel Reactive Antibodies) pre y post

trasplante. • CDC, ELISA, CF, LUMINEX

– Contra donante vivo (DV) pre y post trasplante.• CDC-AHG en LT y LB, CF, LUMINEX

– Contra donante cadavérico (DC) • CDC-AHG en LT y LB, CF

CTS Collaborative Transplant Study. http://ctstransplant.org/protected/dataR/html_all/K-21111-0207.html Last accessed October 19, 2008.

3.- Porcentaje de reactividad de anticuerpos (%PRA).

• Porcentaje de reactividad del suero del paciente frente a un panel de células (antígenos) Se enfrenta el suero del paciente con un panel de células provenientes de individuos no relacionados.

• El monitorear periódicamente la presencia de anticuerpos anti-HLA en los sueros de los pacientes que se encuentran en lista de espera para trasplante

• Indica el grado de sensibilización y la probabilidad que tiene de encontrarse un individuo al azar que pueda ser donante para él.

• Medida del grado de sensibilización– Pacientes bajo riesgo : PRA < 20% – Pacientes elevado riesgo : PRA > 30%– Pacientes hipersensibizados : PRA > 70%


• Mediante la prueba PRA-CDC se obtienen tres tipos de información:

• 1. Si el receptor tiene o no tiene aloanticuerpos.

• 2. El porcentaje de reactividad, que permite predecir la probabilidad de una prueba cruzada linfocitaria positiva.

• 3. Identificar, en algunos casos, contra qué antígenos reaccionan estos aloanticuerpos.

• Valor pronostico, sobre la pérdida del injerto en las primeras 48 h del 80%,


Citotoxicidad dependiente de C’ (CDC)

• Reacción antígeno-anticuerpo con fijación de complemento y visualización de la reacción con un colorante.

• Se pueden utilizar células (linfocitos T y/o B) aislados de sangre periférica, ganglio linfático o bazo

• La reacción se cuantifica según el porcentaje de células muertas.

• Prueba cruzada pretrasplante positiva frente a células T contraindica el trasplante (Patel y Terasaki 1969).

De Meester J, Doxiadis II, Persijn GG, Claas FH. Renal transplantation of highly sensitised patients via prioritised renal allocation programs. Shorter waiting time and above-average graft survival. Nephron 2002 Sep; 92(1):111-9.http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/12187093


• Diacetato de Fluoresceína: colorante vital capaz de atravesar la membrana intacta• de las células.• Bromuro de etidio: se incorpora al ADN; las membranas intactas lo excluyen.


Incrementaprobabilidad

de unión de C’

*Cantidad de anticuerpos anti-HLA menor al umbral de detección por método estándar.*Anticuerpos no fijadores de C’.

Agregado de Inmunoglobulina Humana →Mayor sensibilidad


• Reacción CDC


• Score de las reacciones de CDC

% cel muertas Valor asignado Interpretación0 – 1011 – 2021 -5051 – 8080 – 100Unreadable

124680

NegativoBorderline negativoPositivo débilPositivoPositivo fuerteSin cel, contaminación


• Técnicas empleadas para medir y detectar estos anticuerpos circulantes tenemos:

• Ensayo de linfocitotoxicidad dependiente de complemento CDC

• Métodos por ELISA.

• Ensayo basado en técnicas de equipo fluoroanalizador (Luminex).

• Citometría de flujo (método de elección por sensibilidad y especificidad).

Sensibilidad en detección de Anticuerpos anti-HLA



• Limitaciones:– Determinamos presencia de anticuerpos citotóxicos

(fijadores de complemento: IgM e IgG)

– No permite distinguir entre la presencia de anticuerpos relevantes en el trasplante (anti-HLA) y anticuerpos no relevantes en el trasplante (por ejemplo, autoanticuerpos, generalmente IgM).

– Para la determinación del grado de PRA se necesita ensayar cada suero con un panel amplio de células (alrededor de 40), por lo que este tipo de determinaciones tiene una demora considerable



• Ventajas

– No se necesita utilizar equipos de difícil manejo y calibración para la interpretación de los resultados.

– En la prueba cruzada pre-trasplante es la técnica de referencia.


ELISA

• Ventajas:– Determinación rápida y específica– Cubren todas las especificidades– No se requieren cel. viables– Detecta sólo IgG (se usa para screening de ac anti-HLA:

IgG)– Detecta Ac contra Ag de clase I y II– Detecta Ac HLA específicos y Ac HLA que no unen

complemento (IgG2,IgG4)


Citometría de Flujo

• Reacción antígeno-anticuerpo sobre la superficie celular visualizada mediante la utilización de un segundo anticuerpo marcado con un fluorocromo y el uso de un citómetro de flujo.

• Es hasta cien veces más sensibles que el método de CDC en la detección de anticuerpos en linfocitos y además no requiere fijación del complemento (Stites y cols., 1997).



Superficie celular

Antígeno


• Ventajas:

– Mayor sensibilidad que CDC.

– Permite diferenciar anticuerpos IgG de IgM



• Limitaciones de la técnica

– Se requiere de un aparataje sofisticado y calibración óptima del citómetro.

– Determinamos es la presencia de anticuerpos pero no permite distinguir entre la presencia de anticuerpos relevantes y no relevantes en el trasplante.


Elementos que pueden interferir en las determinaciones

• Citotoxicidad dependiente de complemento PRA y crossmatch

Autoanticuerpos linfocitotóxicos. Más frecuentes en pacientes con enfermedades autoinmunes (lupus eritematoso sistémico; artritis reumatoide, cirrosis biliar primaria, etc.)

Tratamiento reciente con suero antilinfocitario.

• Aloanticuerpos por fase sólida

Tratamientos recientes con inmunoglobulina intravenosa. Inciden sobre el resultado y los controles, debe conocerse para la validación del resultado.

• Crossmatch por citometría

Tratamientos con monoclonales humanizados. Por ejemplo anti-CD20Tratamientos recientes con inmunoglobulina intravenosa.

Amézaga N, Crespo M, López-Cobos M, Millán MA, Viñas O, et al. Relevance of MICA antibodies in acute humoral rejection in renal transplant patients. Transpl Immunol 2006;17:39-42.

SIGNIFICACIÓN CLÍNICA

• Estudio prospectivo. 8 años de seguimiento.• Objetivo:

– Analizar influencia de HLA preformados identificados por ELISA en la sobrevida del injerto.

– Evaluar incidencia de rechazo mediado por anticuerpos (AMR) en pacientes con y sin desensibilización pre injerto.

• 237 trasplantes renales ABO compatibles (221 cadavéricos y 16 donantes vivos).

• CDCXM cel T y B negativos.• Screening retrospectivo con ELISA.• Episodios de rechazo confirmados por biopsia.

• 308 pacientes trasplantados renales.• CDCXM T y B negativos.• Se excluyeron 2 pacientes que estaban con terapia de

desensibilización.

• 69 pacientes (22%) desarrollaron CXM preoperatorio positivo.• Seguimiento con CXM trimestral.• Dos grupos:

– I: pacientes que negativizaron XM– II: pacientes que no negativizaron XM

• Igual esquema de inmunosupresión: Metilprednisolona + Tacrolimus + Micofenolato mofetil.

• Rechazo confirmado por biopsia según criterios Banff 97.

• Estudio prospectivo, unicéntrico.

• Diseñado para determinar si la presencia de anticuerpos contra panel anti-HLA clase I y/o II son predictivos de pérdida de injerto.

• 512 trasplantados, 91 (17.8%) con anticuerpos anti-HLA +– 55 (10.7%) anti-HLA class II– 20 (3.9%) anti-HLA class I– 16 (3.1%) anti-HLA class I and class II

MUCHAS GRACIAS!

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